BG66937B1 - Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти - Google Patents

Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти Download PDF

Info

Publication number
BG66937B1
BG66937B1 BG111161A BG11116112A BG66937B1 BG 66937 B1 BG66937 B1 BG 66937B1 BG 111161 A BG111161 A BG 111161A BG 11116112 A BG11116112 A BG 11116112A BG 66937 B1 BG66937 B1 BG 66937B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
ccm
registered
strain
cfu
association
Prior art date
Application number
BG111161A
Other languages
English (en)
Other versions
BG111161A (bg
Inventor
Никола Александров
Петрова Пенева Даниела
Даниела ПЕНЕВА
Георгиев Александров Никола
Original Assignee
"Дафлорн" Оод
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by "Дафлорн" Оод filed Critical "Дафлорн" Оод
Priority to BG111161A priority Critical patent/BG66937B1/bg
Priority to US13/557,597 priority patent/US9131708B2/en
Publication of BG111161A publication Critical patent/BG111161A/bg
Publication of BG66937B1 publication Critical patent/BG66937B1/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; PREPARATION THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/127—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using microorganisms of the genus lactobacteriaceae and other microorganisms or enzymes, e.g. kefir, koumiss
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/137—Delbrueckii
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/11—Lactobacillus
    • A23V2400/147—Helveticus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
    • A23V2400/21—Streptococcus, lactococcus
    • A23V2400/249—Thermophilus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Abstract

Изобретението се отнася до асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти, по-специално до асоциация от щамове на пробиотични млечнокисели микроорганизми, изолирана такава каквато е, от природен водоизточник в Северна България - изворна вода от извор в Стара планина, регион Централен, включваща: щам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DWT1, регистриран в ССМ с № 7992 щам Lactobacillus helveticus DWT2, регистриран в ССМ с № 7993 щам Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis DWT3, регистриран в ССМ с № 7994 щам Streptococcus thermophillus DWT4, регистриран в ССМ с № 7992 щам Streptococcus thermophillus DWT5, регистриран в ССМ с № 7993 щам Streptococcus thermophillus DWT6, регистриран в ССМ с № 7994 щам Streptococcus thermophillus DWT7, регистриран в ССМ с № 7995 и щам Streptococcus thermophillus DWT8, регистриран в ССМ с № 7996. Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на диетичен млечен продукт за здравословно хранене на хората с участието на пробиотичната асоциация от щамове на млечнокисели микроорганизми, изолирани от изворна вода, до диетичен млечен продукт с доказана антимикробна активност, който след лиофилизация и при съхранение на стайна температура от 18°С до 24°С в продължение на повече от 22 месеца съдържа концентрация на живи клетки от асоциацията пробиотични млечнокисели микроорганизми в границите от 8,0 х 107 cfu/g до 1,2 х 108 cfu/g, a след рехидратация и при експериментални екстремални условия на стомашно-чревния тракт съдържа концентрация на живи клетки от пробиотичната асоциация не по-малко от 1,1 х 107 cfu/g. Изобретението се отнася още и до хранителна добавка за здравословно хранене на хора, включваща диетичният млечен продукт, получен с участието на асоциацията от пробиотични микроорганизми, изолирана такава каквато е, от природен водоизточник в Северна България - изворна вода от извор в Стара планина, в комбинация с инстантно кафе и/или какао и/или сух екстракт на черна боровинка и/или сух екстракт на папая и/или масла и/или сухи добавки, избрани от групата, включваща растителни екстракти, фибри, ензими и мед.

Description

Област на изобретението
Изобретението се отнася до асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти за здравословно хранене на хората.
Предшестващо състояние
Известно е, че продукти, получени чрез млечнокиселата ферментация се произвеждат от хората от векове. Те са здравословна храна, която голяма част от хората приемат ежедневно още от ранна детска възраст.
За получаването на тези храни се използват както самостоятелно, така и в комбинация различни щамове млечнокисели микроорганизми, в това число Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus и други, проявяващи доказани пробиотични свойства.
Известно е също, че Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus е специфичен вид микроорганизъм, различаващ се съществено от другите пробиотични бактерии. Счита се, че тази бактерия е с растителен произход, която в естествени условия се развива само в определена географска територия, съвпадаща с територията на България и отговаряща до голяма степен на територията на древна Тракия /1/. Извън тази географска територия микроорганизмът мутира и не се развива. Известно е също, че Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus може да се кооперира само със Streptococcus thermophilus при млечнокиселата ферментация и в организма на хората и животните. При тази уникална кооперация те взаимно се подпомагат един друг, което довежда до многократно засилване на полезните и до балансиране на страничните им ефекти. Тези благоприятни ефекти включват позитивен ефект върху естествената микрофлора на човека, конкурентно изключване на патогени и стимулиране/модулация на мукозния имунитет и познанията за това са използвани в редица разработки за получаване на пробиотични продукти (заявки за патент ЕР 2281870 А1 и PCT/BG 2010/000021, BG 106827, патенти BG 63961, BG 65652 и др.).
Основавайки се на знанието, че Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus може да се кооперира със Streptococcus thermophilus при млечнокиселата ферментация и в организма на хората и животните, към настоящия момент като основен източник за търсене на нови щамове пробиотични млечнокисели микроорганизми се използват традиционните млечнокисели продукти или изолати от човешки и/или животински и/или растителен произход.
За Lactobacillus helveticus и Streptococcus thermophillus също е известно, че се изолират от растения, мляко и млечни продукти. Известно е също, че Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis е подвид на Lactobacillus delbrueckii, като за него е установена 86% хомоложност с тази на Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus /2/.
Същност на изобретението
Настоящото изобретение се отнася до асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми, по-специално до асоциация от щамове на пробиотични млечнокисели микроорганизми, изолирана такава каквато е, от природен водоизточник в Северна България - изворна вода от извор в Стара планина, регион Централен. Тази асоциация включва оригинални щамове на Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis и Streptococcus thermophillus. По-специално, щамовете, изолирани от изворна вода, съгласно изобретението са:
щам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DWT1, регистриран в CCM с № 7992 щам Lactobacillus helveticus DWT2, регистриран в ССМ с № 7993 щам Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis DWT3, регистриран в ССМ с № 7994 щам Streptococcus thermophillus DWT4 регистриран в ССМ с № 7992 щам Streptococcus thermophillus DWT5 регистриран в ССМ с № 7993 щам Streptococcus thermophillus DWT6 регистриран в ССМ с № 7994 щам Streptococcus thermophillus DWT7 регистриран в ССМ с № 7995 и
135
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 щам Streptococcus thermophillus DWT8 регистриран в ССМ с № 7996
Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на диетични млечни продукти за здравословно хранене на хората, с участието на пробиотичната асоциация от щамове на млечнокисели микроорганизми, изолирани от изворна вода, съгласно изобретението.
Още един аспект на настоящото изобретение се отнася до диетичен млечен продукт, който след лиофилизация съдържа живи клетки от пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, в концентрация от 8,0 х 107 cfu/g до 1,2 х 108 cfu/g, по-специално концентрация на живи клетки от щамовете Streptococcus thermophilus от 4,6 х 107 cfu/g до 5,9 х 107 cfu/g, в това число щам Streptococcus thermophillus DWT4 регистриран в ССМ с № 7992, щам Streptococcus thermophillus DWT5 регистриран в ССМ с № 7993, щам Streptococcus thermophillus DWT6 регистриран в ССМ с № 7994, щам Streptococcus thermophillus DWT7 регистриран в ССМ с № 7995 и щам Streptococcus thermophillus DWT8 регистриран в ССМ с № 7996, а така също и концентрация на живи клетки от щам Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, регистриран в ССМ с № 7994 от 6,1 х 106 cfu/g до 7,8 х 106 cfu/g, концентрация на живи клетки от щам Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, регистриран в ССМ с № 7992 от 1,4 х 107 cfu/g до 2,9 х 107 cfu/g и концентрация на живи клетки от щам Lactobacillus helveticus регистриран в ССМ с № 7993 от 1,4 х 107 до 2,8 х 107 cfu/g.
Освен това, друг аспект на настоящото изобретение се отнася до хранителна добавка за здравословно хранене на хората с участието на асоциацията от пробиотични щамове на млечнокисели микроорганизми, съгласно изобретението.
Определения
1. Пробиотик - Живи микроорганизми, които при приемане в подходящи количества като част от храната, влияят благоприятно върху здравето на консуматора /10/.
2. Пробиотици - Пробиотиците (Lactobacillus) са функционални съставки, съдържащи се в киселото мляко и други млечни продукти и подобряващи здравословното състояние на гастроинтестиналния тракт /3/.
3. Препоръчително количество живи микроорганизми в пробиотичен продукт - най-малко 107 живи микроорганизми за грам или за милилитър /4/.
4. Минимална необходима концентрация на живи клетки на грам продукт - количество от 106 до 109 към момента на консумация с оглед получаване на благоприятен резултат /5/.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1 представя макрорестрикционните профили на изолати на Streptococcus thermophillus, съдържащи се в проба от пробиотичната асоциация, съгласно изобретението;
Фигура 2 представя макрорестрикционните профили на изолатите Lactobacillus helveticus, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus и Lb. delbrueckii ssp. Lactis;
Фигура 3 представя рестрикционен фрагмент за изолат на Streptococcus thermophilus, съответстващ на щам Streptococcus thermophillus DWT5 регистриран в ССМ с № 7993;
Фигура 4 представя рестрикционен фрагмент за изолат на Streptococcus thermophilus, съответстващ на щам Streptococcus thermophillus DWT4 регистриран в ССМ с № 7992;
Фигура 5 представя рестрикционен фрагмент за изолат на Streptococcus thermophilus, съответстващ на щам Streptococcus thermophillus DWT6 регистриран в ССМ с № 7994;
Фигура 6 представя рестрикционен фрагмент за изолат на Streptococcus thermophilus, съответстващ на щам Streptococcus thermophillus DWT8 регистриран в ССМ с № 7996;
Фигура 7 представя рестрикционен фрагмент за изолат на Streptococcus thermophilus, съответстващ на щам Streptococcus thermophillus DWT7 регистриран в ССМ с № 7995;
Фигура 8 - макрорестрикционен профил на геномна ДНК на изолат Lactobacillus helveticus, съответстващ на щам Lactobacillus helveticus DWT2, регистриран в ССМ с № 7993;
Фигура 9 - макрорестрикционен профил на геномна ДНК на изолат от Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, съответстващ на щам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DWT1, регистриран в CCM c № 7992;
Фигура 10 - макрорестрикционен профил на геномна ДНК на изолат от Lactobacilliclus delbrueckii subsp.
136
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 lactis, съответстващ на щам Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis DWT3, регистриран в ССМ с № 7994;
Фигура 11 - генетичен профил на изолати от Streptococcus thermophillus от проби в близост до водоизточника (мъха от дървото и от тревата до водата);
Фигура 12 - генетичен профил на изолати от Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis от проби в близост до водоизточника (от тревата до водата и от водораслите вътре във водата);
Фигура 13 - генетичен профил на изолати от Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis от проби в близост до водоизточника (от тревата до водата и от водораслите вътре във водата) сравнени с генетичен профил на изолат от изворната вода.
Подробно описание на изобретението
Образци от щамовете микроорганизми, съдържащи се в пробиотичната асоциация млечнокисели микроорганизми, изолирана такава каквато е, от природен водоизточник в Северна България - изворна вода от извор в Стара планина, регион Централен, съгласно изобретението, са депозирани на 20.02.2012 в Чешката колекция за микроорганизми (ССМ) при условията на Будапещенския договор за международно признаване депозирането на микроорганизмите във връзка с процедурата по патентоване. Съответно, всеки от тях има регистрационен номер както следва:
Щам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DWT1, регистриран в ССМ с № 7992;
Щам Lactobacillus helveticus DWT2, регистриран в ССМ с № 7993;
Щам Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis DWT3, регистриран в ССМ с № 7994;
Щам Streptococcus thermophillus DWT4 регистриран в ССМ с № 7992;
Щам Streptococcus thermophillus DWT5 регистриран в ССМ с № 7993;
Щам Streptococcus thermophillus DWT6 регистриран в ССМ с № 7994;
Щам Streptococcus thermophillus DWT7 регистриран в ССМ с № 7995 и
Щам Streptococcus thermophillus DWT8 регистриран в ССМ с № 7996
Както е показано в Пример 1 по-долу, видовата принадлежност на пръчките е установена посредством метода ARDRA (рестрикционен анализ на амплифицирана рибозомална ДНК) по Giraffa et al. /6/. Видовата принадлежност на коковите форми е установена с видово/родово специфичен PCR по Lick et al. /7/, Nomura et al. /8/ и Ke et al. /9/. Като референтни култури са използвани Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus АТСС 11842, Lactobacillus helveticus DSM20075, L. delbrueckii ssp. lactis DSM 20072, Streptococcus thermophilus DSM 20617; Lactococcus lactis ssp. lactis DSM 20481 и Enterococcus faecalis LMG 2937.
Резултатите от броя на прерасналите колонии на среди Ml7 и MRS показват, че всички изолати коки принадлежат към вида Streptococcus thermophilus и достигат количество от 4,6 х 107 efu/g до 5,9 х 107 efu/g, докато пръчките достигат до количество от 3,5 х 107 efu/g до 6,5 х 107 efu/g и се разделят по видова принадлежност на Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus и L. delbrueckii ssp. lactis.
Видовият състав и числеността на отделните групи микроорганизми, съдържащи се в пробиотичната асоциация съгласно изобретението, са представени на Таблица 1 по-долу.
Тв&пица1
Общо количество микроорганшми fit aCOnLismtHTfi 9,01 10т-1,гя io1
5lr. iharmaphilkiS 4,E k1DT-6,3x 1Of
3,5 X 10 V 6,5 Ji Ifl'
LactnbStiiluS sp. 47? bu.'jjm'tjLj tf
¢,1 tc 10^7,0 *10’ 1,4 X 10N 2r9 k 1DJ 1.4 x10r-2,8x 10r
137
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019
Разграничаването на отделните щамове микроорганизми в проби от пробиотичната асоциация, както е показано в Пример 1 от настоящето изобретение, е извършено с макрорестрикционен анализ с Пулсова електрофореза на апарат CHEF-DR II BioRad. За рестрикционен анализ на геномна ДНК са използвани ензимите Smal и Xhol съответно за коките и пръчките.
Резултатите, показващи макрорестрикционните профили на седем изолата на Streptococcus thermophilus са представени на Фигура 1 и показват общо пет генетични профила, съответстващи на най- малко пет щама Streptococcus thermophilus, като две двойки изолати показват еднакви профили, а останалите три изолата имат самостоятелни профили. Размерът на получените рестрикционни фрагменти за изолатите на Streptococcus thermophilus са представени на Фигури 3-7.
За същата проба е определен и генетичният профил на два изолата Lactobacillus helveticus, два изолата Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus и два изолата Lb. delbrueckii ssp. lactis. Получени са общо три профила, съответстващи на всяка двойка изолати от един от трите вида лактобацили. Макрорестрикционните профили на изолатите лактобацили са представени на Фигура 2, а размерът на получените рестрикционни фрагменти е представен на Фигури 8-10.
За доказване отсъствието на контаминация от източници в близост до изворите, паралелно с експериментите за доказване на видова принадлежност, численост и щамово разнообразие в пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, са направени изследвания на микробиалния състав на проби, получени от мъха от дървото до извора (проба П1), от тревата до водата (проба П2) и от водораслите вътре във водата (Проба ПЗ), показващи категорично, че щамовото разнообразие е различно от това в изворната вода. По-специално, както подробно е описано в Пример 2 по-долу, установена е наличност на щамове от вида Streptococcus thermophillus и Lactobacillus lactis, които са различни от тези, намиращи се в асоциацията, изолирана от изворна вода, а щамове, принадлежащи към вида Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Lactobacillus helveticus не са установени в нито една от изследваните проби.
Установеното при паралелните изследвания безспорно доказва, че щамовете от пробиотичната асоциация млечнокисели микроорганизми, съгласно изобретението, могат да живеят и в изворна вода, поставяйки на дневен ред въпроса за ревизия на общоприетото схващане, че видовете млечнокисели бактерии, към които принадлежат тези щамове, могат да бъдат изолирани само от млечни продукти и растения.
Друг важен аспект от настоящото изобретение е метод за получаване на диетични млечни продукти за здравословно хранене, включващ операциите заквасване на мляко със стартерна култура от асоциацията от пробиотични щамове на млечнокисели микроорганизми, изолирани от изворна вода, съгласно изобретението, ферментация и лиофилизация.
За получаване на стартерна култура от пробиотичната асоциация от щамове на млечнокисели микроорганизми, съгласно изобретението, най-напред се пристъпва към улавяне и намножаване на микроорганизмите, съдържащи се във водата от извор в Стара планина, с оглед получаване на биомаса. За целта, стандартизирано и пастьоризирано мляко се заквасва с изворна вода в съотношение 2:1. Сместа се поставя в затворен стъклен стерилен съд и се третира на водна баня при температура от 42°С до 45°С за 38 до 40 h. В края на този период на повърхността на сместа се отделя бяла на цвят биомаса с мека консистенция.
Непосредствено след това, към предварително приготвен 10%-ен воден разтвор на сухо стандартизирано пълномаслено или обезмаслено мляко стерилизирано при 121 °C за 15 min и охладено до температура 45°С, се прибавя биомаса в съотношение съответно 10:0,3 и сместа се оставя да ферментира в продължение на 12 h при температура от 43°С до 45°С. Полученият продукт представлява течна закваска от изворна вода. Следва повторно приготвяне на 10%-ен воден разтвор на сухо стандартизирано пълномаслено или обезмаслено мляко, стерилизация на млякото при 121 °C за 15 min и охлаждане до 45 °C, след което сместа се неутрализира с 10%-ен разтвор на натриева основа до достигане на оптимално pH 4.6 до 4.7. Към този разтвор се прибавя течна закваска в съотношение разтвор на мляко:течна закваска 60:1. Следва ферментация в продължение на 10 до 12 h при температура 43°С до 45°С, след което се добавя предварително приготвен криопротектор, представляващ 15%-ен воден разтвор на захар в съотношение ферментирал млечен разтвор към криопротектор 30:1, сместа се разбърква и се
138
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 подлага на лиофилизация в продължение на 48 h. Така получената суха стартерна култура се използва за получаване на диетични млечни продукти.
Методът за получаването на диетични млечни продукти с помощта на стартерната култура от щамовете млечнокисели микроорганизми, съгласно изобретението, включва предварително приготвяне на 10%-ен воден разтвор на сухо стандартизирано пълномаслено или обезмаслено мляко, което след това се подлага на стерилизация при 95°С-96°С за 30 min с последващо охлаждане до 45°С и неутрализация с 10%- ен разтвор на натриева основа до достигане на pH 6,6- 6,7. Следва приготвяне на воден захарен разтвор в съотношение 1:1, който се загрява до кипване. Така приготвения воден захарен разтвор се прибавя към водния разтвор на млякото в съотношение 10:1 и към така получената смес се добавя сухата стартерна култура, съгласно изобретението, в съотношение млечна смес:стартерна култура 5:0,003. Следва ферментация в продължение на 12 h при 43°С до 45°С и така полученият продукт се подлага на лиофилизация в продължение на 48 h.
Методът за получаване на диетични продукти, съгласно изобретението, както е описан в детайли в Пример 3 по-долу, позволява на микроорганизмите, съдържащи се в изворната вода, след това в биомасата и в стартерната култура, да се размножават заедно, което води до получаване на изключително богати на живи микроорганизми продукти, с което си качество са особено ценни за здравословното хранене на човека.
Изследванията за преживяемост на микроорганизмите от асоциацията, съгласно изобретението, проведени с оглед количеството на живи клетки пробиотични бактерии в течна и суха проба съответно преди и след лиофилизация на продуктите, описани в детайли в Пример 4 по-долу показват, че технологичния процес на замразяване и лиофилизационно сушене е протекъл успешно и лактобацилите и коките са запазени живи в количества, отговарящи на изискванията за пробиотичен продукт. Преживяемостта на микроорганизмите от асоциацията при съхранение на стайна температура (20°С - 24°С), е доказана и подробно описана в Пример 5 по-долу, а така също и след рехидратация при екстремални експериментални условия на преминаване през гастроинтестиналния тракт, описана и доказана в детайли в Пример 6 по-долу. Получените по метода, съгласно изобретението, продукти са с доказан здравословен ефект, подробно описан и доказан в Пример 7 по-долу.
Още един аспект на изобретението е да се предложат хранителни добавки за здравословно хранене на хора на основата на асоциацията от пробиотични щамове млечнокисели микроорганизми, съгласно изобретението. Тези хранителни добавки включват диетичният продукт, получен по метода, съгласно изобретението, в комбинация с инстантно кафе и/или какао и/или сух екстракт на черна боровинка и/или сух екстракт на папая и/или масла и/или сухи добавки, избрани от групата, включваща растителни екстракти, фибри, ензими и мед.
Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват. Пример 1. Характеристика на пробиотичната асоциация
Всички анализи по отношение на видовия и щамов състав на симбиотичната асоциация пробиотични микроорганизми, резултатите от които са изложени по-долу, са извършени в Лаборатория , ДНК-анализ” на ЕЛБИ Булгарикум ЕАД, София, България. Изпитванията са проведени за две проби, условно обозначени като ИН1 и ИС1.
Установяване на видовия състав
Видовата принадлежност на съдържащите се пръчки в пробиотичната асоциация микроорганизми, изолирана от изворна вода от извор в Стара планина, е установена посредством метода ARDRA (рестрикционен анализ на амплифицирана рибозомална ДНК) по Giraffa et al. /6/. Видовата принадлежност на коковите форми в същата пробиотична асоциация е установена с видово/родово специфичен PCR по Lick et al. /7/, Nomura et al. /8/ и Ke et al. /9/. Като референтни култури са използвани Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus АТСС 11842, Lactobacillus helveticus DSM20075, L. delbrueckii ssp. lactis DSM 20072, Streptococcus thermophilus DSM 20617; Lactococcus lactis ssp. lactis DSM 20481 и Enterococcus faecalis LMG 2937.
Установяване на щамовия състав на пробите
Разграничаването на отделните щамове сред изолатите от пробите е осъществено с макрорестрик139
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 ционен анализ с Пулсова електрофореза на апарат CHEF-DR II BioRad. За рестрикционен анализ на геномна ДНК са използвани ензимите Smal и Xhol съответно за коките и пръчките.
Количествени стойности на коки и пръчки в Проба ИН1: Оценката за броя на коките и на пръчките за проба ИН1, взета от изворна вода през Април 2011, е направена на база брой прораснали колонии от проба ИН1 на среди Ml7 и MRS; броят на коките и пръчките е оценен съответно на 4,6 х 107 cfu/g и 3,5 х 107 cfu/g. Всички изолати коки са отнесени към вида Streptococcus thermophilus, докато пръчките са разделени по видова принадлежност на Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis.
Щамов състав на проба ИН1: От проба ИН1 е определен генетичния профил на седем изолата Streptococcus thermophilus, означени служебно като i21, i22, i24, i26, i31, i32 и i34. Установени са общо пет генетични профила, съответстващи на най-малко пет щама Str. thermophilus в тази проба. Еднакви профили са получени за двойките (121 и 124) и (132 и 134), изолатите 122,126 и 131 имат самостоятелни профили. Макрорестрикгните профили на тези изолати са представени на Фигура 1, а размера на получените рестрикционни фрагменти е представен на Фигури 3-7.
За същата проба е определен и генетичният профил на изолати, служебно означени като Lactobacillus helveticus ilm и i5m, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus i2m и i4s и Lactobacillus, delbrueckii ssp. lactis i3L и i7L. Получени са общо три профила, съответстващи на всяка двойка изолати от един от трите вида лактобацили. Макрорестрикционните профили на изолатите лактобацили от проба ИН1 са представени на Фигура 2, а размера на получените рестриктни фрагменти е детайлно описан на Фигури 8-10.
Количествени стойности на коки и пръчки в Проба ИС1: За потвърждаване на микробиалния състав на Проба ИС1, взета от изворна вода през март 2010, оценката за броя на коките и на пръчките е направена на база брой прораснали колонии от проба ИС1 на среди М17 и MRS, както за проба ИН1 по-горе; броят на коките и на пръчките са оценени съответно на 4,9 х 107 cfu/g и 5,6 х 107 cfu/g. Всички изолати коки са отнесени към вида Streptococcus thermophilus, докато пръчките са разделени по видова принадлежност на Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii ssp. bulgaricus и L delbrueckii ssp. lactis.
Щамов състав на проба ИС1: От проба ИС1 е определен генетичния профил на шест изолата Streptococcus thermophilus. Установени са общо пет генетични профила, съответстващи на пет щама Str. thermophilus, които са идентични е генетичните профили на изолатите 121, 122, 126, 131 и 132 на Str. thermophilus в проба ИНЕ За проба ИС1 е определен и генетичният профил на шест изолата Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis. Получени са общо три генетични профила, идентични е генетичните профили на изолатите ilm на Lactobacillus helveticus, i2m на Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus и i3L на Lactobacillus delbrueckii ssp. Lactis в пробата ИН1.
Идентичните резултати по отношение състава на пробиотичната асоциация, получени при изследване на двете различни проби, взети в интервал от една година от един и същ природен водоизточник извор в Стара планина, показват недвусмислено, че конкретните щамове пробиотични микроорганизми могат да живеят самостоятелно в изворната вода и да се размножават заедно.
Пример 2. Доказване на водния произход на асоциацията
За доказване отсъствието на контаминация от източници в близост до изворите, са направени паралелни изследвания на микробиалния състав на проби, изолирани от мъха от дървото на 4 m от извора (Проба П1), от тревата непосредствено до извора (проба П2) и от водораслите вътре в извора (Проба ПЗ) през Септември 2011.
Методите за установяване броя на млечнокиселите бактерии, видовият и щамов състав на пробите са идентични е методите, използвани при анализ на проба ИН1 както в Пример 1.
Видов състав на пробите Ш, П2 и ПЗ
Видовият състав на отделните проби и числеността на отделните групи микроорганизми е представен в Таблица 2. От групата на коките в пробите е установено присъствието на Enterococcus sp. и
Streptococcus thermophilus, а от лактобацилите - единствено на Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis. В пробите не е установено присъствие на Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Lactobacillus helveticus.
140
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019
Таблици 2. бадое състав и чнспеност на микроорганизмите (cfu/g} в анализи раните проби
ПроБв Ч>- Sir. ehiinnqphiVirs LadottatJHus daiimrtcMi sb₽. JmITj ffpyrtt различим or MntHHiAXOtrflH 0МТ4РИИ Lettabacffl UI
П1 7,2 ΧΊΟ* З.Ь х «Г - -
П2 1,9я 10ь ' 5PBx 10* 2,3 Ji 10*
ПЗ е.ахю* 2,0 ϊ itf 1.6 X 10” 3,5 K lO* -
Щамов състав на пробите
Щамове Streptococcus thermophilus
В проба П1 е установено присъствието на най-малко два щама Str. thermophilus според генетичният им профил, представени от изолати Пк1/1 иПк1/2 (Пк1/3 е идентичен е Пк1/1) (Фигура 11, пътеки 7-9). Два щама S. thermophilus са определени и за проба П2, представени от изолати Пк2/1 и Пк2/2 (Фигура 11, пътеки 5 и 6). В проба ПЗ са анализирани четири изолата Str. thermophilus, всички показващи профил, идентичен с промишления щам LBB.TN1 (щамът е собственост на „ЕЛБИ Булгарикум” ЕАД и профилът не е представен). Проби П1 и П2 споделят щам Str. thermophilus с общ профил, представен съответно от изолати Пк1/2 и Пк2/1 (Фигура 11, пътеки 8 и 5). Сравнени с профилите на изолати от Str. thermophilus от проба ИН1, както е показано по-горе в Пример 1, изолатите от проби Ш, П2 и ПЗ са различни и не съвпадат с по-рано изолираните.
Щамове Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis
В проби П2 и ПЗ е установено присъствието на най-малко два щама Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, които са общи и за двете проби. Единият профил е ясно разграничим и включва изолати ПпЗ/1, ПпЗ/З, ПпЗ/5, Пп2/2, Пп2/4 и Пп2/5 (Фигура 12). Профилът на втория щам L. delbrueckii ssp. lactis е по-добре охарактеризиран при втори анализ, който показа идентичността на изолати ПпЗ/6 и Пп2/3 (Фигура 13, пътеки 1 и 2). Нито един от двата профила на щамове L. delbrueckii ssp. lactis не съвпадна с профила на L. delbrueckii ssp. lactis i3L от проба ИН1, както е показано в Пример 1 (Фигура 13, пътека 5), което показва, че съдържащите се в проби П2 и ПЗ щамове са различни от щама, изолиран от изворната вода.
Резултатите от изследванията на микроорганизмите, установени в мъха от дървото, тревата около извора и водораслите вътре в извора са различни от тези, установени в изворната вода и представляват още едно доказателство, че пробиотичната асоциация микроорганизми, изолирана от природен водоизточник, съгласно изобретението, не е резултат от контаминация.
Пример 3. Получаване на диетичен млечен продукт, съдържащ пробиотичната асоциация
За получаване на диетичен млечен продукт със стартерна култура, съдържаща пробиотичната асоциация, описана в детайли в Примери 1 и 2 по-горе, най-напред микроорганизмите, изолирани от изворна вода се улавят и намножават с оглед получаване на биомаса. За целта, 1,0 1 стандартизирано и пастьоризирано краве мляко с масленост 3.6% се заквасва с 0.5 1 вода, взета непосредствено от извора. Съдът с мляко и изворна вода се поставя на водна баня при температура 43°С за период от 40 h, в края на който на повърхността на сместа се отделя бяла на цвят биомаса с мека консистенция.
От така получената биомаса след това се пристъпва към получаване на стартерна култура, като за целта 10%-ен воден разтвор на сухо стандартизирано пълномаслено краве мляко се подлага на стерилизация при 121°Сза15 min и се охлажда до 45°C и към 10,01 от него се добавят 3,0 g от получената както по-горе биомаса. Сместа ферментира в продължение на 12 h при температура 43°С за получаване на течна закваска. Следва приготвяне на нов 10%-ен воден разтвор на сухо стандартизирано пълномаслено краве мляко, който се подлага на стерилизация при 121°С за 15 min с последващо охлаждане до 45°С и
141
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 към 6,01 от този разтвор се прибавя 0,11 от течната закваска с изворна вода. Сместа се неутрализира с 10%-ен разтвор на натриева основа до достигане на оптимално pH от 4.6 до 4.7 и полученият ферментационен продукт се подлага на лиофилизация в продължение на 48 h. Този сух продукт представлява стартерната култура за получаване на диетични млечни продукти.
За получаване на сух диетичен млечен продукт, 10%-ен воден разтвор на сухо стандартизирано пълномаслено или обезмаслено краве мляко се подлага на стерилизация 95°С- 96°С за 30 min, след което се охлаждадо 45°С исе неутрализира с 10%-енразтвор на натриева основа до достигане нарН 6,6-6,7. Следва приготвяне на воден захарен разтвор в съотношение 1:1, който се загрява до кипване, оставя се да се охлади и се прибавя към водния разтвор на млякото в съотношение мляко: захарен разтвор 10:1.
Към 5,01 от така получената смес се добавят 3,0 g суха стартерна култура, получена както в Пример 3 по-горе. Следва ферментация за 12 h при 43°С-45°С и полученият продукт се подлага на лиофилизация за 48 h. Последната включва замразяване при температура -41 °C и сублимация до достигане на температура 31°С. Така получените продукти се съхраняват при стайна температура.
Пример 4. Преживяемост след лиофилизация
Изследването на преживяемостта на пробиотичната асоциация от щамовете млечнокисели микроорганизми след лиофилизация, е проведено в Лаборатория „ДНК Анализ” на ЕЛБИ Булгарикум ЕАД, при което са използвани същите методи за определяне на видовия състав и числеността на микроорганизмите в пробите, както в Пример 1.
Преживяемостта при лиофилизация е показана чрез изследване на броя на млечнокиселите бактерии и видовия състав в течна проба (ТИ) и суха проба (ВИ). Проба ТИ представлява ферментационния продукт за получаване на пробиотични продукти, непосредствено преди тяхната лиофилизация. Пробата е произведена през октомври 2011 година от суха стартерна култура, получена от изворна вода, взета през Април 2011 година. От своя страна, проба ВИ е получена непосредствено след лиофилизация на проба ТИ.
Състав на пробите
Данните за видовия състав и числеността на отделните групи микроорганизми във всяка от пробите са обобщени на Таблица 3 по-долу. От групата на коките в пробите са установени Streptococcus thermophilus, а от лактобацилите - Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus u Lactobacillus helveticus.
ТаБлмца 3
Прсйв J/ie/mcpriJuff detbfiKKliif fdcffi I sdniracmiis rteriiruecfiw 5-ър. b ultra ли us LaMKIfTM
ТЯ - течна (cfu/ml} 9,6x10' 2,2 x 6.1 л 105 3,5 xltF
ВЙ - суха (сЬУд) 16x10' 6.1 x 1.4 ΧΙΟ' 1,4 x 107
Както е видно от Таблица 3, числеността на лактобацилите в течната проба е значителна с превес на Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, който в млечна среда може да достигне и леко надмине численост от 109 cfu/ml. Числеността на Streptococcus thermophilus е близка до 108 cfu/ml, което е обичайна стойност за млечна среда, но е по-ниска от обичайно постиганите при култивиране при контролирано pH (над 109 cfu/ml). В сухата проба съдържанието на пръчки и коки е леко намаляло, но е запазено достатъчно високо. Имайки предвид високата чувствителност на тези видове лактобацили към лиофилизация, резултатите от изследванията недвусмислено доказват, че технологичния процес на замразяване и лиофилизационно сушене е протекъл успешно и лактобацилите и коките са запазени живи в количества, отговарящи на изискванията за пробиотичен продукт.
Пример 5. Преживяемост във времето при съхранение на стайна температура (20°-24°С)
За доказване преживяемостта на микроорганизмите във времето са изследвани броят и видовия
142
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 състав на млечнокиселите бактерии в проби ИН1, ИВ1 и ИС1 от сухи диетични продукти, получени по метода, съгласно изобретението. Проба ИН1 е произведена през Май2011 година от суха стартерна култура, получена от изворната вода взета през Април 2011 година; Проба ИВ1 е произведена през Ноември 2011 година от суха стартерна култура, получена от изворната вода взета през Април 2011 година и Проба ИС1 е произведена през Март 2010 година от суха стартерна култура, получена от изворната вода взета през Март 2010 година. Всички проби след производството им са съхранявани при стайна температура 18°С-24°С.
Видов състав на проби ИН1, ИВ1 и ИС1
И при трите проби преценката за численост е направена по броя на прерасналите колонии след посявка на десетократни разреждания от сух препарат върху среди М17 и MRS. Броят на коките и на пръчките е оценен както следва:
Проба ИН1 - 4,6 х 107 cfu/g коки и 3,5 х 107 cfu/g пръчки.
Проба ИВ1 - 5 ,9 х 107 cfu/g коки и 6,5 х 107 cfu/g пръчки.
Проба ИС1 - 4,9 х 107 cfu/g коки и 5,6 х 107 cfu/g пръчки.
Всички изолати коки са отнесени към вида Streptococcus thermophilus, докато пръчките са разделени по видова принадлежност на Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus и Lactobacillus delbrueckii ssp. Lactis.
Видовият състав на пробите и числеността на отделните групи микроорганизми в тях (cfu/g), както и съотношението на отделните бактериални видове в пробите е представен в Таблица 4 по-долу.
ТнБлмца 4
ΠίΧΛί ihcrnHjptikluJ tfetOnfacKAt sip. taclis UcfUdaeJNirs «ШЪгаКЙД вар. Еча^ rriiJi rjsfrWcu? СИущ бран мвчмкмздпи p га 11 юи и
ИН1 4,6 X 10' 5.1 X 10’ 1,4 Ji ιοτ 1,4 :< IO' 8 x 10r
ИВ1 5.9 κ 141' 7,Ex 10“ 2.9 X 10' 2,4 x 1(? 1.2 Jt 1Q’
ИС1 4,a xio' H e,5xic^ 2,7x10' 2,6*10'' 1,1 я 10“
Резултатите от анализите, проведени в Лаборатория „ДНК-анализ“ на ЕЛБИ Булгарикум показват, че асоциацията от пробиотични щамове на млечнокисели микроорганизми, изолирана от изворна вода, съхранявана 22 месеца в проба ИС 1 (от Март 2010 доЯнуари2012) при температура 20°С-24°С, съдържа живи микроорганизми в количество, близко до тези, съдържащи се в пробата, произведена сравнително най-късно - проба ИВ1. Следователно пробиотичната асоциация от щамове на млечнокисели микроорганизми, изолирана от изворна вода запазва жизнеността си при продължително съхранение на стайна температура. Последното е от особено значение с оглед предлагането в търговската мрежа на диетичните продукти, произведени по технологията, съгласно изобретението.
Пример 6. Преживяемост в гастроинтестиналния тракт
Преживяемостта на микроорганизмите, съгласно изобретението е установена чрез третиране на рехидратирани продукти, произведени със стартерна култура, съгласно изобретението, с изкуствен стомашен и чревен сок. Този експериментален метод, с който се цели наподобяване преминаването на микроорганизмите през гастроинтестиналния тракт на човека при екстремални условия, включва етапи както следва:
Стъпка 1. Приготвя се изкуствен стомашен сок със състав: Pepsin (Sigma, Р7000) - 0.175 % (w/v);
NaCl - 0.2% (w/v); pH 2,5 и в 9 ml от него се поставя 1 ml от воден разтвор на Проба ИВ1 (разреждане
1:1). Получената проба, условно означена GJ, се инкубира при 37°С в анаеробна среда в продължение на 2 h. Отчитането на броя млечнокисели микроорганизми (cfu/ml) в проба GJ става към 0 h; 0,5 h;
h и 2 h.
143
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019
Стъпка 2. 1 ml от проба GJ, инкубирана в продължение на 2 h, означена условно като проба GJ-2, се поставя в 9 ml чревен сок със състав NaCl - 0.2% (w/v); NaHCO3 - l.l%(w/v); Trypsin (Sigma, T7409) 0.20.2% (w/v); bile salts (Oxoid, Code L55) - 0.9% и pH 8.0. Получената проба, условно означена като IJ, се инкубира при 37°С в анаеробна среда в продължение на 5 h. Броят на микроорганизмите в проба IJ се отчита към 0 h; 2.5 h и 5 h. Прагът на детекция на млечнокиселите микроорганизми при този анализ е 103 cfu/ml.
Резултатите за преживяемостта на пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, в лабораторно приготвени храносмилателни сокове са обобщени на Таблици 5 и 6 по-долу. По-специално на Таблица 5 са представени резултатите за преживяемостта на отделните групи млечнокисели бактерии в продукт ИВ1 в изкуствен стомашен сок (проба GJ).
Таблица 6
брой мн, в гцхЛя Време Hi4··, инкубирана и· StmptWOCCLS ifinnyicpfalftfi dMraacrtii asp· Lectobacffltra iftltwrSii ssp iietveflrtui □бщбрОЙ ш&чнашсап μ иивртсрг
Очасз Six 10' 7,3 x Hf 2,а И ID' 2,8x10' 1,2 X itf1
0,5 час 4.0 X 10' Б.1 x nr 2,4x 10f 2,5 s 1Qr 1 хЮ₽
1 час 3.7 х 10r 5.7 яИ}” 1.3x10·· 2,1 x 10' 0.2 л 10r
2 чяса t.3 s Iff 2,5 x1СГ 10“ 1 1 110^ 3.6 X 1Or
От получените резултати, описани в Таблица 5 става ясно, че млечнокиселите бактерии в пробиотичен продукт ИВ1 преживяват в условията на изкуствен стомашен сок както следва: 83% преживяват 30 min; 68% преживяват 1 h, а 30% от тях преживяват 2 h.
Резултатите за преживяемостта на отделните групи млечнокисели бактерии в продукт ИВ1 в изкуствен чревен сок (проба IJ) е представено на Таблица 6 по-долу.
Таблицаβ
mk. ь np<№-a 1 N. thofmopMIus сШЬлмиДиг j cWbruecAH A due curs Ο4«ι0ρ«α млечнокисел
iSp. iaM'S BBp. tKJfrJATjObLi riUHMDOOpr.
Време наХ
0 чдс 1,3 ϊ 1(У ?,5 S 1(f Sill? 1.1 x 11/ 3fix 10f
2.3 чвса 1,9 х 10' 1,8 x Iff· 5,2 jt ICT 4,5 X 11/ 3.1 x 10'
1 5 часа «,7χ 10?* в,&л itf· 9,2 Л 10* s.iiio1’ 1,1 x 1D;
Резултатите, систематизирани в Таблица 6 показват, че около 10 % от млечнокиселите бактерии в рехидратирания пробиотичен продукт ИВ 1 преживяват при екстремални експериментални условия и двете последователни стъпки на анализа - 2 h в изкуствен стомашен сок и след това 5 h в изкуствен чревен сок. Към седмия час на изследването в проба ИВ1 се съдържат живи пробиотични микроор144
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 ганизми в количество над 107. От видовете млечнокисели бактерии, съдържащи се в проба ИВ1, с най-добра преживяемост е Lactobacillus helveticus.
Резултатите показват, че пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, проявява много добра преживяемост и е устойчива след рехидратация в екстремални експериментални условия на стомаха и червата на човека. Микроорганизмите, съдържащи се в диетичните продукти, съгласно изобретението, поставени в екстремални експериментални условия остават в количество над 1 х 107, което е достатъчно, за да се адхезират към стените на червата и да се размножават.
Пример 7. Доказване на антимикробна активност на пробиотичната асоциация
Антимикробната активност на пробиотичната асоциация е доказана чрез установяване на бактериостатичен и бактерициден ефект на проба от сух продукт (проба ИВ1) посредством ямков дифузионен метод. Изследвани са взаимоотношенията между лиофилизпрания продукт и патогенни микроорганизми - еталонни култури, клинични изолати (чревни/фекални) и изолирани от храни патогени от следните видове: Escherichia coli серотипове 06, 044 и 0127, Salmonella групи С, В, D; Shigella flexneri, Listeria monocytogenes, Proteus mirabilis, Enterobacter sakazakii и Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes.
За целта, патогенните микроорганизми се посяват върху Nutrient agar (MERCK, 1.00427.0500), към който са добавени 0,5% жлъчни соли в концентрация 105 cfu/ml, а продукта предварително е рехидратиран със стерилна дестилирана вода в съотношение 1:3. Ямките, в които се накапва продукта са с обем 50 μΐ. Посевките се инкубират за 24 h в анаеробна среда. Резултатите от експерименталното изследване спрямо патогенни микроорганизми, при които е наблюдаван бактерициден (БЦ) и/или бактериостатичен (БС) ефект, са отчетени като милиметри стерилна зона или зона на потискане и са обобщени на Таблица 7 по-долу и показват, че продукта проявява добра антимикробна активност, включваща забележителен бактериостатичен ефект и умерен бактерициден ефект.
Таблица 7
ИВ1РрН5,9
Пзткхен БЦ (mm) EC |πιπΊ)
Р. mraJMfe 1 3
Srugetfa ,ιϊθτπειπ' ΰ 3
S. SnruuS 3B1 5 5
Б. auretrs 74& г 4
SsCrjtcvwia gr. B ϋ 2
E. coli 0-44 D 2
Заедно с това, изследванията за безопасност на продукта, представени на Таблица 8 по-долу показват, че продуктите, съдържащи пробиотичната асоциация от млечнокисели микроорганизми, съгласно изобретението, са безопасни за прием от човека.
145
Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019
Таблица G
ПОКАЗАТЕЛИ ЧБТФДИ ЗА АнАПРЬ ХАРАКТЕРИСТИКА И МОРНИ РЕЗУЛТАТИ
Т«Я1Н |*ЬТ.кЛИ И ДруГИ ТМС*Г<14< ήΜΐ^κΤπ. mg.Vp. nd ΓΰΛ?'* w АрсънгсВДСЕМ ИМ&ИОС Слом. и и ад па БДС fcN 14И4 2ύύ3 5&ийЧ» БПСЕМ ЯЗВМЯИЗ 1.0. арсен ?.l·: чш“нй-t.i. кткчк -ОСИ, ОГНфйрп
О&дБроа на кзоЗмтъяпе и φΑιγΤΪΊΗΒιΙΡ йнййрй&м нйиПйчнШн^ЯП|л Свиерин. CFU.4J. н« ΙΗ.ΙΗΥ-ΚΙ^Ί ЕИК SQМЮ КЙОр.О 1<П ОII·™
Юопифлрил в· 1.0 р <тт прсщуктв: 6ДС Й0й»11 ДВ HUCH-rcldi-ctiHrti СИГОМрР
ПЛСйСпл и дрооди 0 1.0 д йТ прпяцтп·.!· БДС· SO 6611 Д а на се устонсояват СППВфЯ
Оорн на птички rktHMiH 1 Oq dt -pm у™ ЕДь ISO Θ&11 Дв на са ^стамяяьат Отлйь^м
ijEnrrwOl u (J.Zb д CT тсдртгз: ЩС ΙΜΪ57& Дн НИ Св yCTjHjtlfltlHl ΟΡΰΒίμ
KCd Гр nuj ΤΟΠΟΪΟΠϋΓΜΊ |Ξ.aurcua] в 1Ω д στ БЦСВОМ8Й-1 Ϊ. 3 Да μο ад ^craiuiaa- Chrceapu
Lirlefia пшлиДОшелм’ в Ζϊ.ϋ д БДС Ι5ΐι 1 Да he ct устансслва* Опсоврп
Ml rr®Vq Нв ПС-Мгн;· ι?Τ 0.5 Отговаря _
Пример 8. Хранителна добавка за здравословно хранене на хора с кафе
За получаване на хранителна добавка за здравословно хранене на хора с кафе, към 4 g диетичен млечен продукт на основата на пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, получен както в Пример 3, се добавят 2 g инстантно кофеиново или безкофеиново кафе, 2 g суха сметана и 2 g декстроза монохидрат, сместа се хомогенизира и се опакова в алуминиево фолио.
Така полученият продукт има тонизиращ и здравословен ефект.
Пример 9. Хранителна добавка за здравословно хранене с екстракт на черна боровинка
За получаване на капсулна форма на диетичен продукт с екстракт на черна боровинка, към 240 mg продукт на основата на пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, получен както в Пример 5 се добавят 10 mg сух екстракт на черна боровинка, стандартизиран към 25 %-но съдържание на антоцианиди и 20 mg декстроза монохидрат Получената смес се хомогенизира и се поставя в растителна капсула.
Продуктът се използва като хранителна добавка за поддържане на общото здравословно състояние на хората и очното им здраве.
Пример 10. Хранителна добавка с екстракт на папая
За получаване на капсулна форма на диетичен продукт с екстракт на папая, към 250 mg продукт на основата на пробиотичната асоциация, съгласно изобретението, получен както в Пример 5 се добавят 15 mg сух екстракт на папая и 20 mg декстроза монохидрат. Получената смес се хомогенизира и се поставя в желатинова капсула. Продуктът е приложим за поддържане и оптимизиране на телесното тегло.

Claims (10)

  1. Патентни претенции
    1. Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми, изолирана от природен водоизточник, включваща щамовете млечнокисели микроорганизми, депозирани в Чешката колекция за микроорганизми (ССМ) както следва:
    щам Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus DWT1, регистриран в ССМ с № 7992;
    щам Lactobacillus helveticus DWT2, регистриран в ССМ с № 7993;
    щам Lactobacilliclus delbrueckii subsp. lactis DWT3, регистриран в ССМ с № 7994;
    щам Streptococcus thermophillus DWT4, регистриран в ССМ с № 7992; щам Streptococcus thermophillus DWT5, регистриран в ССМ с № 7993; щам Streptococcus thermophillus DWT6, регистриран в ССМ с № 7994; щам Streptococcus thermophillus DWT7, регистриран в ССМ с № 7995 и щам Streptococcus thermophillus DWT8, регистриран в ССМ е № 7996.
  2. 2. Метод за получаване на диетичен млечен продукт от пробиотичната асоциация съгласно претенция 1, посредством заквасване със стартерна култура, ферментация и лиофилизация, характеризиращ се с това, че за получаване на стартерната култура, изолираните от природен водоизточник щамове млечнокисели микроорганизми се улавят и намножават чрез заквасване на стандартизирано и пастьоризирано мляко с изворна вода в съотношение 2:1, а получената биомаса се влага в стандартизирано и пастьоризирано мляко в съотношение 10:0,3 с последваща ферментация и лиофилизация.
  3. 3. Диетичен млечен продукт съгласно претенции 1 и 2, характеризиращ се с това, че след лиофилизация съдържа живи клетки от пробиотичната асоциация в концентрация от 8,0 х 107 cfu/g до 1,2 х 108 cfu/g, от които концентрацията на живи клетки от щамовете Streptococcus thermophilus е в границите от 4,6 х 107 cfu/g до 5,9 х 107 cfu/g, в това число щам Streptococcus thermophillus DWT4, регистриран в ССМ с № 7992, щам Streptococcus thermophillus DWT5, регистриран в ССМ с № 7993, щам Streptococcus thermophillus DWT6, регистриран в ССМ с № 7994, щам Streptococcus thermophillus DWT7, регистриран в ССМ с № 7995 и щам Streptococcus thermophillus DWT8, регистриран в ССМ с № 7996, а концентрацията на живи клетки от щам Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, регистриран в ССМ с № 7994 е в границите от 6,1 х 106 cfu/g до 7,8 х 106 cfu/g, концентрацията на живи клетки от щам Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, регистриран в ССМ с № 7992 е в границите от 1,4 х 107 cfu/g до 2,9 х 107 cfu/g и концентрацията на живи клетки от щам Lactobacillus helveticus, регистриран в ССМ с № 7993 е в границите от 1,4 х 107до 2,8 х 107 cfu/g.
  4. 4. Диетичен млечен продукт съгласно претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че след съхранение на температура от 20°С до 24°С в продължение на повече от 22 месеца съдържа концентрация на живи клетки от пробиотичната асоциация от 8,0 х 107 cfu/g до 1,2 х 108 cfu/g, от които концентрацията на живи клетки от щамовете Streptococcus thermophilus е в границите от 4,6 х 107 cfu/g до 5,9 х 107 cfu/g, в това число щам Streptococcus thermophillus DWT4, регистриран в ССМ с № 7992, щам Streptococcus thermophillus DWT5, регистриран в ССМ с № 7993, щам Streptococcus thermophillus DWT6, регистриран в ССМ с № 7994, щам Streptococcus thermophillus DWT7, регистриран в ССМ с № 7995 и щам Streptococcus thermophillus DWT8, регистриран в ССМ с № 7996, а концентрацията на живи клетки от щам Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, регистриран в ССМ с № 7994 е в границите от 6,1 х 106 cfu/g до 7,8 х 106 cfu/g, концентрацията на живи клетки от щам Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, регистриран в ССМ с № 7992 е в границите от 1,4 х 107 cfu/g до 2,9 х 107 cfu/g и концентрацията на живи клетки от щам Lactobacillus helveticus, регистриран в ССМ с № 7993 е в границите от 1,4 х 107до 2,8 х 107 cfu/g.
  5. 5. Диетичен млечен продукт съгласно претенции от 1 до 4, характеризиращ се с това, че след рехидратация и при експериментални екстремални условия на стомашно-чревния тракт съдържа концентрация на живи клетки от пробиотичната асоциация не по-малко от 1,1 х 107 cfu/g.
  6. 6. Хранителна добавка за здравословно хранене на хора, характеризираща се с това, че включва диетичният млечен продукт съгласно претенции от 3 до 5 в комбинация с инстантно кафе и/или какао и/или сух екстракт на черна боровинка и/или сух екстракт на папая и/или масла и/или сухи
    147
    Описания на издадени патенти за изобретения № 09.1/16.09.2019 добавки, избрани от групата, включваща растителни екстракти, фибри, ензими и мед.
    Приложение: 13 фигури
    Литература
    1. Чомаков, X., „Пробиотици - Минало, настояще и бъдеще“, стр. 31-41, изд. Ес Принт, С, 2007.
    2. Simonds, J. Hansen Р, A. Laikshmanan S (1971) J. Bacteriol. 107, 382-384.
    3. Clare M. Hasler, Functional foods for Health Program. University of Illinois, Urbana, Illinois, “The Changing Face of Functional Foods”, published by the American College of Nutrition.
    4. Ishibashi N, Shimamura S. Bifidobacteria: research and development in Japan. Food Technol. 1993; 46: 126-135.
    5. Gomes et al., 1995; Rybka and Kailasapathy, 1995; Blanchette et al., 1996; Gomes and Malcata, 1999; Vinderola et al., 2000.
    6. Giraffa G., De Vecchi P. and Rosetti L, Note: Identification of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus and subspecies lactis dairy isolates by amplified rDNA restriction analysis, J. Appl. Microbiol. 1998, 85,918-924.
  7. 7. Lick S., Keller M., Bockelmann W., Heller K. J., Rapid identification of Streptococcus thermophilus by primer specific PCR amplification based on its lacZ gene, System. Appl. Microbiol. 1996, 19, 74-77.
  8. 8. Nomura M., Kobayashi M., Okamoto T., Rapid PCR - based method which can determine both phenotype and genotype of Lactococcus lactis subspecies, Appl. Eviron. Microbiol. 2002, 68(5), 2209-2213.
  9. 9. Ke D. J., Picard F. J., Martineau E, Menard C., Roy P. H., Ouelette M & Bergeron M. G. Development of a PCR assay for rapid detection of enterococci. J. Clin. Microbiol. 1999, 37, 3497-3503.
  10. 10. Probiotics in food, Report of a Joint FAO/WHO experts on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food including Powder Milk with Live Lactic Acid bacteria, Cordoba, Argentina, 1-3 October, 2001, FAO Food and Nutritional Paper 85.
BG111161A 2012-03-07 2012-03-07 Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти BG66937B1 (bg)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG111161A BG66937B1 (bg) 2012-03-07 2012-03-07 Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти
US13/557,597 US9131708B2 (en) 2012-03-07 2012-07-25 Probiotics for dietary dairy product

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
BG111161A BG66937B1 (bg) 2012-03-07 2012-03-07 Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG111161A BG111161A (bg) 2013-09-30
BG66937B1 true BG66937B1 (bg) 2019-08-15

Family

ID=49114339

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG111161A BG66937B1 (bg) 2012-03-07 2012-03-07 Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9131708B2 (bg)
BG (1) BG66937B1 (bg)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3172973B1 (en) * 2015-11-27 2020-04-08 DAFLORN Ltd. Probiotic formula, process of its preparation and use
JP7079447B2 (ja) * 2016-02-24 2022-06-02 天野エンザイム株式会社 微生物の酵素生産性を制御する方法
JP7065589B2 (ja) * 2017-10-31 2022-05-12 株式会社明治 ＩＬ－１β血清濃度低下用発酵乳、ＣＸＣＬ１血清濃度低下用発酵乳、癌に伴うＩＬ－１βの過度な血清濃度上昇の抑制用発酵乳、または、癌に伴うＣＸＣＬ１の過度な血清濃度上昇の抑制用発酵乳
CN107988106B (zh) * 2017-12-17 2021-01-08 石家庄君乐宝乳业有限公司 一种酸奶发酵剂、其制备方法及应用
CN109287748A (zh) * 2018-09-06 2019-02-01 善恩康生物科技（苏州）有限公司 一种可在常温条件下长期保藏的直投式酸奶发酵剂及其制备方法
CN113755357A (zh) * 2020-06-04 2021-12-07 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 一种乳杆菌制剂及其用途
CN112336753A (zh) * 2020-11-20 2021-02-09 深圳市融思生物科技有限公司 一种肠道菌群胶囊及其制备方法和应用
TR2022020871A2 (tr) * 2022-12-28 2024-07-22 Chivalric Regulus Biyoteknoloji Anonim Sirketi Probi̇yoti̇k mi̇kroorgani̇zma i̇çeri̇kli̇ ve mi̇kroenkapsüle edi̇lmi̇ş bi̇r takvi̇ye edi̇ci̇ gida
CN116769655B (zh) * 2023-06-15 2025-10-28 厦门元之道生物科技有限公司 一种唾液链球菌嗜热亚种jian+及其应用
BG67798B1 (bg) 2023-07-28 2025-09-30 Владимирович Родиновский Олег Производство на ябълков пектин и диетични фибри по метода на кавитационната екстракция

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6787348B1 (en) * 1998-08-26 2004-09-07 Chr. Hansen Liquid starter cultures having improved storage stability and use thereof
BG108449A (bg) * 2003-12-15 2005-06-30 АЛЕКСАНДРОВ Никола Синбиотичен продукт и приложението му като носител на природни биоактивни вещества във функционални хранителни добавки
FR2895877B1 (fr) * 2006-01-06 2012-06-22 Gervais Danone Sa Poudre de lait fermente ou yaourt a haute densite en ferments lactiques

Also Published As

Publication number Publication date
US20130236600A1 (en) 2013-09-12
US9131708B2 (en) 2015-09-15
BG111161A (bg) 2013-09-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG66937B1 (bg) Асоциация от пробиотични млечнокисели микроорганизми за получаване на диетични млечни продукти
CN106399162B (zh) 一种新型干酪乳杆菌及其应用
KR101355770B1 (ko) 면역조절 활성이 높은 유산균의 배양법
WO2011141762A1 (en) Synergistic fermentation of lactobacillus rhamnosus and lactobacillus paracasei subsp paracasei
Zacarías et al. Preliminary technological and potential probiotic characterisation of bifidobacteria isolated from breast milk for use in dairy products
CN106417594B (zh) 一种复合益生菌饮料及其应用
RU2451067C2 (ru) Способ повышения жизнеспособности бифидобактерий в процессе хранения свежего ферментированного пищевого продукта
RU2270248C1 (ru) Штамм бифидобактерий bifidobacterium lactis 668, используемый для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, бактериальных препаратов и косметических средств
CN111635875A (zh) 一种长双歧杆菌cz70及其制备活菌型黑莓果浆的方法
Hosny et al. Nutrient composition and microbiological quality of three unifloral honeys with emphasis on processing of honey probiotic youghurt
Anggraeni et al. Viability of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus pentosus isolated from solid waste of soy milk as candidate probiotic for poultry
JP2019187251A (ja) 発酵物の製造方法及び発酵物
RU2326938C2 (ru) Консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе препарата, используемого в качестве биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов
RS57471B1 (sr) Nova probiotička starter kultura za humanu i animalnu primenu
RU2376366C2 (ru) Консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов
Shirisha et al. Isolation and characterization of probiotics from different curd samples
JP2022157465A (ja) 乳幼児用排便促進剤
Golban Microbial probiotics–the action mechanism and the use of them
EP4508988A1 (en) Fermented dietary product, process for its preparation and use
Nezami et al. Optimization of Lactobacillus acidophilus La-5, feta cheese starters and salt content in Iranian ultrafiltered soft cheese formula
Tzugkiev et al. The Characteristic of Lactic Acid Bacteria Isolated in North Ossetia-Alania
RU2301828C1 (ru) Штамм bifidobacterium gallinarum гб, испосльзуемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы
RU2752891C1 (ru) Консорциум бифидобактерий, используемый для приготовления бифидосодержащих продуктов, и штаммы, входящие в состав консорциума
US12582681B2 (en) Fermented milk product for administration in canids such as dogs, and uses thereof
SK502019A3 (sk) Spôsob výroby mlieka a mliečnych doplnkov s unikátnym zložením mastných kyselín obnovovaním komenzálnej prirodzenej mikrobioty