RS57471B1

RS57471B1 - Nova probiotička starter kultura za humanu i animalnu primenu

Info

Publication number: RS57471B1
Application number: RS20150852A
Authority: RS
Inventors: Nataša Golić; Amarela Terzić-Vidojević; Katarina Veljović; Igor Mrvaljević
Original assignee: Institut Za Molekularnu Genetiku I Geneticko Inzenjerstvo Univerzitet U Beogradu; Veterinarska Stanica Koker Doo
Priority date: 2015-12-17
Filing date: 2015-12-17
Publication date: 2018-09-28
Also published as: RS20150852A1; WO2017105267A1; TR201808116T1

Abstract

Predmetni pronalazak se odnosi na novu probiotičku starter kulturu koja se sastoji od tri termofilna prirodna izolata bakterija mlečne kiseline (BMK): Streptococcus thermophilus LMG P-28585 (BGVLJ1-44), Lactobacillusfermentum LMG P-28583 (BGHI14) i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 (BGRA43), u specifičnim odnosima. Starter kultura prema predmetnom pronalasku ispoljava proteolitičku i antimikrobnu aktivnost, kao i imunomodulatorno dejstvo. Odnosi se i na njenu upotrebu u prevenciji i/ili tretiranju intestinalnih infekcija kod sisara, odnosno ljudi i životinja i upotrebu kao imunomodulator.

Description

Oblast tehnike

Predmetni pronalazak pripada oblasti biotehnologije i odnosi se na novu probiotičku starter kulturu sa jedinstvenom kombinacijom tri bakterijska soja u okviru vrsta Streptococcus thermophilus, Lactobacillus fermentum i Lactobacillus helveticus. Opisana je i njena upotreba u prevenciji i/ili tretiranju intestinalnih infekcija kod sisara, odnosno ljudi i životinja i upotreba kao imunomodulator.

Tehnički problem

Tehnički problem koji se rešava predmetnim pronalaskom, možemo definisati kao obezbeđivanje nove poboljšane probiotičke kulture kao alternative upotrebi antibiotika za prevenciju i/ili terapiju crevnih infekcija kod ljudi i životinja, a čime se postiže poboljšanje zdravstvenog stanja jedinke.

Poznato je da probiotičko svojstvo potiče od svojstva soja, a na vrste. Shodno ovom, probiotička starter kultura prema predmetnom pronalasku je bazirana na optimalnom odnosu tri jasno definisana bakterijska soja: Streptococcus thermophilus LMG P-28585 (BGVLJl-44), Lactobacillus fermentum LMG P-28583 (BGHI14) i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 (BGRA43), okarakterisanih do nivoa soja sekvenciranjem 16S rDNA i metodom “pulse-field gel electrophoresis” (PFGE), i za koju se pokazalo da ispoljava proteolitičku i antimikrobnu aktivnost, kao i imunomodulatorno dejstvo.

Dalje, opisana je upotreba ove starter kulture za dobijanje probiotika i kompozicija namenjenih za profilaksu i/ili tretman poremećaja koji su povezani sa kolonizacijom gastrointestinalnog trakta sisara patogenim mikroorganizmima kao i za dobijanje probiotika i kompozicija za kolonizaciju gastrointestinalnog trakta sisara posle antibiotske terapije.

Predmetni pronalazak se odnosi i na probiotik i kompoziciju baziranu na ovoj probiotičkoj starter kulturi i njihovu upotrebu u prevenciji i/ili tretmanu intestinalnih infekcija kod ljudi i životinja i primenu kao imunomodulator u održavanju prirodnog balansa imunskog sistema i regulaciji

imunskog odgovora ljudi i životinja, uključujući novorođenčad i mladunce.

Dalje, predmetni pronalazak se odnosi i na probiotičku kombinaciju baziranu na ovoj probiotičkoj starter kulturi u prevenciji i/ili tretmanu upalnih bolesti creva kod ljudi i životinja.

Detaljnije, predmetni pronalazak koji se odnosi na novu probiotičku starter kulturu se sastoji od tri termofilna prirodna izolata bakterija mlečne kiseline (BMK): Streptococcus thermophilus LMG P-28585 (BGVLJl-44), Lactobacillus fermentum LMG P-28583 (BGHI14) i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 (BGRA43), u specifičnim odnosima, njenu upotrebu u prevenciji i/ili tretiranju intestinalnih infekcija kod sisara i upotrebu kao imunomodulator.

Stanje tehnike

Probiotički preparati zasnovani na korišćenju različitih sojeva bakterija mlečne kiseline, bacilusa

i/ili kvasaca su dobro poznati u tehnici. U tehnici su poznati probiotici kao mono- ili kombinovane kulture živih mikroorganizama koje prilikom upotrebe imaju povoljno delovanje na domaćina

sisara (ljude ili životinje) poboljšavajući osobine postojeće mikroflore.

Probiotske bakterije imaju niz terapeutskih efekata, između ostalih, u prevenciji i terapiji dijareja, povoljno deluju na imunitet (probiotički mikroorganizmi formiraju intestinalni ekosistem koji

inhibira rast patogenih i oportunističkih bakterija (E. coli, Salmonella typhimurium, Clostridium perfringens, Clostridium difficile, Pseudonomas sp., Listeria sp., Staphylococcus aureus...), u

prevenciji kandidijaze itd.

Trenutno dostupni preparati za tretiranje intestinalnih infekcija kod domaćih životinja su predviđeni za hranjenje novorođenih životinja ( Method for correction o f immunobiologi in period o f weaning - RU2471359 (C1) — 2 dodatkom različitih aktivnih supstanci kao što je npr. zeolit (Complex probiotic preparation for beef strains - RU20115364(A) — 2013-07-10), medicinske biljke ( herbal medicine

composite probiotic feed additivefor pigs andpreparation method o f additive - CN103549141 (A)

- 2014-02-05), prebiotici (Feed additive for veterinary drug solid fermentation and preparation method o f feed additive - CN103039700 (A) — 2013-04-17), vitamini ( capable o f preventing piglets from diarrhea and traditional Chinese medicine composition - CN102835609 (A) — 2012-12-26) i sl.

Američki patent US 5,656,268 opisuje postupak dobijanja biološkog proizvoda u tečnom obliku ili u obliku krema, a koji se sastoji od čistog mleka ili mlečnog sastojka i agenasa za fermenataciju ili sledećih bakterijskih sojeva Lactobilus fermentum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacilus helveticus, Lactobacillus casei i Ovaj pronalazak se može smatrati najbližim stanjem tehnike, budući da u sastav biološkog proizvoda ulaze mleko i najmanje dva bakterijska soja od navedenih. Opisanim postupkom dobija se proizvod definisane kiselosti koji može da sadrži i ulje (maslinovo, biljno i aromatično ulje) kao i voće, povrće, biljke ili med, a koji baziran na mleku ili surutki nalazi primenu kao dodatak za poboljšanje opšteg zdravlja korisnika posebno kada je u suvom sublimisanom obliku. Dalje, proizvod nalazi primenu kao kozmetička krema, kreme i tečnosti za telo i masažu, kao krema za negu desni i kao dodatak kupkama.

Probiotička starter kultura predmetnog pronalaska bitno se razlikuje od navedenog patenta između ostalog po tome što je bazirana na optimalnim odnosima isključivo tri jasno definisana bakterijska soja u okviru vrsta Streptocus hermophilus,

pomenutih u navedenom patentu i to: Streptococcus thermophilus LMG P-28585 (BGVLJl-44), Lactobacillus fermentum LMG P-28583 (BGHI14) i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 (BGRA43), od čega i zavisi njena upotreba kod ljudi i životinja. U dokumentu iz stanja tehnike, nije definisan odnos komponenti koje ulaze u sastav biološkog proizvoda, već samo postupak dobijanja proizvoda, koji se bitno razlikuje od postupka dobijanja probiotičke starter kulture predmetnog pronalaska.

Dalje, kao što je opisano u daljem tekstu, probiotička starter kultura ispoljava proteolitičku i antimikrobnu aktivnost i imunomodulatorno dejstvo, za razliku od dokumenta iz stanja tehnike, kod kojeg aktivnosti nisu dokazane ni na koji način. Probiotička starter kultura predmetnog pronalaska ne sadrži ulja, niti ostale sastojke navedene u datom dokumentu, a razlikuje se i prema oblicima za upotrebu. Poznato je daje probiotičko svojstvo - svojstvo soja, a ne vrste. U tom smislu, kombinacija sojeva predmetnog pronalaska ispoljava svoja probiotička svojstva, što je podržano tekstom opisa i kao takva nalazi primenu, za razliku od proizvoda opisanog u stanju tehnike koji se odnosi na vrstu koja obuhvata šire (sve sojeve), ali je biološki potpuno neupotrebljiva.

Evropski patent EP1359816, odnosi se na kombinaciju probiotika koja sadrži različite kombinacije laktobacila, bakterije propionske kiseline i bifidobakterije. Ovaj probiotik može da se kombinuje sa prebiotikom dajući tako sinbiotik. Kombinacija pronalaska može se konzumirati kao takva ili sa odgovarajućim prehrambrenim proizvodima kao što su mlečni proizvodi, pića, sokovi, supe ili hrana za decu ili sa farmaceutskim proizvodima i korisna je u terapiji stimulacije imunskog sistema i za opšte poboljšanje zdravlja. Data kombinacija je pripremljena u jediničnom doznom obliku, tačnije u obliku kapsule.

Evropski patent EP1541673 opisuje bakterije mlečne kiseline, tačnije prirodne izolate roda Lactobacillus, Bifidobacterium i Streptococcus (Enterococcus) i njihovu upotrebu za dobijanje kompozicije za ishranu kućnih ljubimaca (prevashodno pasa i mačaka). Dobijene kompozicije namenjene su za regulaciju imunskog odgovora životinja prvenstveno tako što kolonizuju gastrointestinalni trakt životinje i ispoljavaju blagotvorno probiotičko dejstvo na zdravlje životinja.

Dalje, evropski patent EP2219658 odnosi se na kompoziciju zasnovanu na probiotskim bakterijama i supstance sa prebiotičkim osobinama i njihovu upotrebu u lečenju respiratornih patologija i/ili infekcija uz istovremeno poboljšanje intestinalne funkcije. Simbiotička kompozicija sadrži kombinaciju sledećih bakterijskih sojeva: Lactobacillus plantarum (LMG P-21020), Lactobacillus plantarum (LMG P-21021), Lactobacillus rhamnosus (DSM 16605), Lactobacillus rhamnosus (DSM 19739), Bifidobacterium lactis (LMG P-21384 i prebiotske komponente tj. fruktooligosaharide ili galaktosaharide.

Evropski patent EP2101796 otkriva soj mikroorganizma Bacillus smithii TBMI12 MSCL P737 i kompozicije koje sadrže ovaj soj, kompozicije za upotrebu kao probiotik u antibakterijske svrhe, za kolonizaciju gastrointestinalnog trakta i za stimulaciju imunskog sistema kao i upotrebu ovog soja kao dodatak hrani i kao komponenta u terapeutskoj i neterapeutskoj probiotskoj kompoziciji.

Evropski patent EP0856259 opisuje kompoziciju za primenu koja sadrži liofilizovane žive aktivne bakterije mlečne kiseline u kombinaciji sa oligosaharidima, za upotrebu kao dodatak hrani, a u cilju balansiranja intestinalne fl ore. Naznačen liofilizat sadrži sojeve rodova Bifidobacterium, Lactobacillus, Streptococcus. Dalje, pronalazak se odnosi na komplet koji se sastoji od dva spreminka, pri čemu se u jednom nalazi hrana koja može da bude tečna, kremasta ili konzistencije testa, a u drugom naznačena kompozicija koja se dodaje hrani neposredno pre konzumiranja. Hrana u ovom slučaju može da bude mleko, jogurt, druga vrsta fermentisanog mleka, mlečni dezert, mlečni napitak ili napitak baziran na mlečnom serumu ili mleku koje je obogaćeno voćem, voćni sok, sok od paradajza, sok od šargarepe, čaj ili napitak baziran na biljnim ekstraktima.

Prema tome, poznat je veliki broj različitih probiotičkih starter kultura i probiotika, kako mono kultura tako i kao kombinacija različitih bakterijskih sojeva. Kao što se vidi između ostalog i iz ovih izdvojenih dokumenata iz patentne i nepatentne dokumentacije date u tekstu opisa, poznate su kombinacije različitih sojeva mikroorganizama koje se mogu primeniti u različitim oblicima, a koje imaju širok opseg različitih dejstava kako na ljude tako i na životinje. Međutim, prema našim saznanjima, do sada nije opisan ni jedan probiotički proizvod za sisare koji sadrži predloženu kombinaciju bakterijskih sojeva u datom odnosu i sa ovakvim probiotičkim potencijalom.

Kratak opis pronalaska

Unošenje mikroorganizama putem hrane ima pozitivan efekat na zdravlje ljudi i životinja. Dok je upotreba probiotika za ljude široko rasprostranjena, upotreba probiotika u stočarstvu je zanemarljiva. Najnovija istraživanja se intenzivno bave razvijanjem probiotičkih preparata za životinje, baziranih na upotrebi bakterija mlečne kiseline (BMK), bakterija vrsta roda Bacillus ili kvasaca. Povećan interes u korišćenju probiotika u stočarstvu je nastao usled sve rigoroznijih evropskih regulativa o upotrebi antibiotika u stočarskoj proizvodnji. Stoga se probiotici smatraju adekvatnom alternativom kada su u pitanju crevne infekcije kod životinja, naročito kod mladunaca. Uspostavljanje dobre mikroflore naseljavanjem BMK u crevima novorođenih životinja neposredno po rođenju ima za rezultat zdravije životinje.

Životinje se u prvim danima po rođenju inficiraju bakterijama iz okruženja u kome se nalaze, što je izuzetno važno za razvoj njihovog imuniteta. Međutim, često se događa da se novorođene životinje u tom razdoblju inficiraju i patogenim crevnim bakterijama (Enterobacteriaceae), što dovodi do crevnih infekcija praćenih dijarejom, gubitkom na težini, a ne retko i uginućem životinja, što predstavlja značajan ekonomski gubitak za stočarsku industriju. S obzirom da se u tom slučaju pribegava upotrebi antibiotika u terapiji crevnih infekcija, to predstavlja dodatni problem u stočarskoj i prehrambenoj industriji.

Fermentisani proizvodi od mleka sa probiotskim bakterijama su proizvodi dobijeni fermentacijom mleka delovanjem probiotskih starter kultura ili kombinacijom starter kultura sa drugim bakterijama mlečne kiseline.

Detaljan opis pronalaska

Pronalazak konkretno otkriva novu probiotičku starter kulturu za humanu i animalnu primenu, tehnološki postupak za njenu pripremu kao i upotrebu ove probiotičke kulture u prevenciji i/ili tretiranju intestinalnih infekcija različite etiologije kod ljudi i životinja i upotrebu kao imunomodulator.

Osnovna jedinica proizvoda je probiotička kultura, koja predstavlja jedinstvenu kombinaciju bakterija sa specifičnim probiotskim potencijalom za prevenciju i/ili tretman intestinalnih infekcija i upalnih bolesti creva ljudi i životinja. Probiotička kultura je izuzetno efikasna u terapiji intestinalnih infekcija različite etiologije i redukuje broj patogenih bakterija sa jedinstvenim spektrom delovanja na patogene bakterije.

Probiotička kultura ima izuzetno veliki probiotički potencijal, ima sposobnost imunomodulacije, kao i specifično antimikrobno dejstvo na veliki broj bakterijskih vrsta. Nova probiotička kultura predstavlja alternativu upotrebi antibiotika u terapiji crevnih infekcija bazirana na širokom spektru antimikrobne aktivnosti, naročito u slučaju teško izlečivih infekcija, a čime se postiže poboljšanje zdravstvenog stanja ljudi i životinja.

U jednoj realizaciji, predmetni pronalazak se odnosi na novu probiotičku starter kulturu koja se sastoji od tri termofilna prirodna izolata BMK: Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u specifičnom odnosu koji daje željene rezultate, njenu upotrebu za dobijanje probiotika i kompozicija namenjenih za prevenciju i/ili tretman poremećaja koji su povezani sa kolonizacijom gastrointestinalnog trakta sisara patogenim mikroorganizmima i koje imaju i imunomodulatorno dejstvo.

U narednoj realizaciji, probiotička starter kultura predmetnog pronalaska se sastoji od tri termofilna prirodna izolata BMK: Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u optimalnom odnosu. Njihov specifičan odnos je važan faktor dejstva ove starter kulture u prevenciji i/ili terapiji intestinalnih infekcija kod sisara, kako ljudi tako i životinja, a biće detaljno opisan u daljem tekstu.

U in vitro eksperimentima testirane su različite kombinacije sojeva: Streptococcus thermophilus LMG P-28585 u iznosu od 10% do 40%, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 u iznosu od 10% do 50% i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u iznosu od 40% do 80%. Rezultati su pokazali da u svim testiranim kombinacijama ispoljavaju probiotički potencijal.

Pokazalo se da je u tehnološkom smislu za pripremu fermentisanog mlečnog probiotičkog proizvoda optimalni odnos sojeva Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u probiotičkoj starter kulturi 30%:30%:40% (3:3:4), kao i odnos 30%:20%:50 (3:2:5). Ovi odnosi obezbeđuju dovoljan broj svih probiotičkih sojeva u kulturi, a pri tom ne snižavaju pH fermentisanog proizvoda ispod 4,2-4,3 (prag tolerancije kiselog ukusa).

Dalje, u jednoj realizaciji poželjni odnos sojeva je Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 10%:10%:80% (1:1:8) ili 10%:20%:70% (1:2:7). Taj odnos obezbeđuje veći broj bakterija soja

helveticus LMG P-24226 za koji je pokazano da ima širok antimikrobni spektar delovanja na teško izlečive patogene bakterije uključujući Staphylococcus aureus ATCC25923, Staphylococcus sp. ATCC MetR (klinički izolat) kolekcija Torlak, Yersinia enterocolitica 03 (klinički izolat) kolekcija Torlak, Shigella sonnei (Hamburg 105) kolekcija Torlak, Shigella flexneri (London 9950) kolekcija Torlak, Shigella dysenteriae (serotip 5 i 7) kolekcija Torlak, Streptococcus pneumoniae ATCC276, Streptococcus pneumoniae ATCC496, Pseudomonas sp., Escherichia coli C600, Escherichia coli ATCC25922, Clostridium sporogenes kolekcija Torlak i Clostridium difficile (klinički izolat).

Odnos, Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-2422640%:20%:40% (4:2:4) ima potencijalnu primenu kod imuno kompromitovanih osoba, s obzirom da je u ovoj kombinaciji najmanje zastupljen soj Lactobacillus fermentum LMG P-28583, za koji je pokazano da ispoljava blago proinflamatorno dejstvo.

U narednoj realizaciji, probiotička starter kultura predmetnog pronalaska se sastoji od Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u odnosu 30%:40%:30% (3:4:3). U ovom odnosu najviše je zastupljen soj Lactobacillus fermentum LMG P-28583 koji svojim svojstvima utiče na povećanje imunskog odgovora.

Kao što je opisano u tekstu opisa, zavisno od navedenih odnosa datih bakterijskih izolata u probiotičkoj starter kulturi, ista će ispoljavati svoju proteolitičku (acidifikacija) i antimikrobnu aktivnost, kao i imunomodulatorno dejstvo.

Navedene kombinacije daju izuzetne rezultate u tretmanu intestinalnih infekcija kod sisara, posebno životinja. Tačnije, ova starter kultura daje odlične rezultate u tretmanu infekcija izavanih bakterijama Clostridium perfringens i Clostridium difficile, kao i bakterijama familije Enterobacteriaceae kada je broj živih bakterija u opsegu Streptococcus thermophilus LMG P-28585 od 6xl07 do l,25xl011, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 od 1,1 xl08 do l,25xl011 i Lactobacillus helveticus LMG P-242264xl06 do 2,5x109.

Poznato je da unošenje određenih mikroorganizama putem hrane ima pozitivan efekat na zdravlje ljudi i životinja. Naime, mladunci se u prvim danima života inficiraju bakterijama iz okruženja u kome se nalaze, što je izuzetno važno za razvoj imuniteta. Međutim, često se dešava da se mladunci u tom periodu inficiraju i patogenim crevnim bakterijama (Enterobacteriaceae), što dovodi do crevnih infekcija praćenih dijarejom, gubitkom na težini, a ne retko i uginućem. S obzirom da se u tom slučaju pribegava upotrebi antibiotika u terapiji crevnih infekcija, to predstavlja dodatni problem u stočarskoj i prehrambenoj industriji. Stoga ova probiotička kultura pored rešavanja problema crevnih infekcija kod domaćih životinja, doprinosi smanjenju upotrebe antibiotika.

Dalje, većina probiotika opisanih u stanju tehnike je predviđena za hranjenje mladunaca, dok je ova probiotička kultura (zbog bezbednog statusa bakterija koje ulaze u njen sastav) u jednoj realizaciji namenjena bremenitim životinjama pri čemu mladunci dobijaju pasivan imunitet od majke i imunizovani su već u prvim danima života. Takođe, tokom poslednjih 15 dana bremenitosti dolazi do pada imuniteta i povećava se broj enterobakterija u crevima majke koje se nakon porođaja prenose na mladunce koji se tim putem inficiraju. Tretmanom bremenitih životinja novom probiotičkom kulturom ne dolazi do povećanja broja enteropatogena u crevima majke i ne dolazi do inficiranja tek rođenih životinja.

U sledećoj realizaciji, probiotička starter kultura koja se sastoji od Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 kada je broj živih bakterija u opsegu Streptococcus thermophilus LMG P-28585 od 4xl09 do 8xl010, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 od 3xl09 do lx l010 i Lactobacillus helveticus LMG P-242264xl06 do 9xl08 CFU/ml.

Nova probiotička kultura predmetnog pronalaska se u vivo eksperimentima u uslovima farme pokazala izuzetno efikasna u terapiji intestinalnih infekcija različite etiologije, a specifično je pokazano da uspešno redukuje (ispod nivoa detekcije) broj bakterija vrste Clostridium perfringens, kao i bakterija familije Enterobacteriaceae.

Sve navedene kombinacije mogu se pripremiti u obliku mlečnog fermentisanog probiotičkog proizvoda, suspenzije, liofilizata, premiksa, spray-dry obliku, u obliku tableta, kapsula i svih ostalih oblika koji su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti tehnike i kao takvi nalaze humanu i animalnu primenu. Svi ovi oblici koji sadrže probiotičku starter kulturu predmetnog pronalaska dobijeni su prema opšte poznatim postupcima.

Postupak pripreme probiotičke starter kulture podrazumeva: 1) Kultivaciju prirodnih izolata koji ulaze u sastav probiotičke starter kulture u optimalnim uslovima za rast ovih bakterija; 2) Kombinaciju prirodnih izolata koji ulaze u sastav probiotičke starter kulture u optimalnom odnosu.

Zahvaljujući prisustvu soja Streptococcus thermophilus LMG P-28585 u probiotičkoj kulturi, ova kultura može da se koristi i za pripremu mlečnog fermentisanog proizvoda koji može da se koristi za prevenciju intestinalnih infekcija sisara nepreživara uključujući ljude i životinje (svinje, pse, mačke i sl.).

Postupak pripreme fermentisanog probiotičkog proizvoda za ljude i životinje (nepreživare) podrazumeva fermentaciju mleka definisanim starterima i probiotičkim bakterijama koja se odvija u sledećim fazama: 1) Predkultivacija prirodnih izolata koji ulaze u sastav probiotičke starter kulture u optimalnim uslovima za rast ovih bakterija; 2) Inokulacija mleka prirodnim izolatima pripremljenih u fazi 1 u optimalnom odnosu; 3) Inkubacija mleka inokulisanog u fazi 2 u optimalnim uslovima za fermentaciju.

Ovako pripremljen fermentisani proizvod je stabilan, broj živih probiotičkih bakterija je reproducibilan, a tehnologija proizvodnje lako primenjiva na industrijskoj skali. Osim toga, ovakav proizvod ima poboljšan probiotički efekat verovatno zbog prisustva specifičnih bioaktivnih peptida nastalih degradacijom proteina mleka proteolitičkim enzimima bakterija u sastavu probiotičke kulture.

Primena probiotičke kulture kod drugih sisara (preživara), kao i drugih životinja podrazumeva korišćenje probiotičke kulture pripremljene bez mleka.

Kratak opis slika

Slika 1. Genotipizacija sojeva iz sastava probiotičke kulture metodom “puls-field gel electrophoresis” (PFGE).

● Rezultati su pokazali da bakterije koje ulaze u sastav probiotičke kulture predstavljaju jedinstvene sojeve u okviru navedenih vrsta.

Slika 2. Antimikrobna aktivnost pojedinačnih sojeva iz sastava probiotičke kulture i probiotičke kombinacije (sinergizam) na Clostridium difficile. 1. Kontrola C. difficile MRS; 2. C. difficile LMG P-28585; 3. C. difficile LMG P-28583; 4. C. difficile LMG P-24226; 5. C. difficile probiotička kombinacija.

● Testiranjem pojedinačnih kultura i probiotičke kombinacije jasno se uočava da kombinacija (sinergizam) uspešno suzbija rast C. difficile - nema

oslobađanja gasa ni pucanja hranljive podloge, dok u slučaju pojedinačnih kultura rast C. difficile je samo delimično suzbijen - m delimično pucanje hranljive podloge. Kontrola - rast C. difficile uzrokuje produkciju gasa i pucanje hranljive podloge.

Slika 3. Preživljavanje sojeva A) LMG P-28585, B) LMG P-28583 i C) LMG P-24226 u simuliranim uslovima gastrointestinalnog trakta u rastvoru NaCl i u mlečnom

matriksu.

● Svi testirani sojevi uspešno preživljavaju uslove simuliranog

gastrointestinalnog trakta.

Slika 4. Adhezija za epitelijalne intestinalne ćelije Caco-2. A) Adhezija sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226. B) Adhezija E. coli ATCC25922 u prisustvu i odsustvu sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226. C) Adhezija

Salmonella 654/7E (veterinarski izolat) u prisustvu i odsustvu sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226. Vrednosti na grafiku predstavljaju srednje vrednosti 3 merenja izražene u procentima. Statistički značajne vrednosti u odnosu na kontrolu su označene zvezdicama (* p<0,5; ** p<0,l).

● Slika 4A: procenat adhezije pokazuje uspešnost vezivanja pojedinačnih sojeva

za epitelijalne intestinalne ćelije.

● Slika 4B: procenat adhezije E. coli ATCC25922 u prisustvu pojedinačnih sojeva i probiotičke kombinacije pokazuje da probiotička kombinacija (sinergizam) najbolje sprečava vezivanje E. coli ATCC25922 za epitelijalne intestinalne ćelije.

● Slika 4C: procenat adhezije Salmonella 654/7E u prisustvu pojedinačnih sojeva i probiotičke kombinacije pokazuje da soj LMG P-28585 najbolje sprečava vezivanje Salmonella 654/7E za epitelijalne intestinalne ćelije.

Slika 5. Proliferacija GALT ćelija pacova u prisustvu sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i

LMG P-24226 umrtvljenih UV zracima, živih sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 u mleku i probiotičke kulture pripremljene u mleku. Vrednosti na

grafiku predstavljaju srednje vrednosti 4 merenja izražene u procentima. Statistički značajne vrednosti u odnosu na kontrolu su označene zvezdicama (* p<0,5; ** P<0,1).

● Rezultati pokazuju da živi sojevi znatno povećavaju proliferaciju GALT limfocita u odnosu na kontrolu.

Slika 6. Redukcija broja patogenih bakterija nakon tretmana životinja u uslovima farme.

A) Redukcija broja bakterija familije Enterobacteriaceae kod novorođenih prasića nakon tretmana suprasnih krmača mlečnim probiotičkim fermentisanim proizvodom; B) Redukcija broja bakterija Clostridium perfringens kod koza nakon tretmana probiotičkom kulturom pripremljenom bez mleka.

● Slika 6A: Rezulati pokazuju da broj bakterija familije Enterobacteriaceae znatno opada nakon tretmana životinja probiotikom, dok se broj istih bakterija kod netretiranih životinja povećava.

● Slika 6B: Rezulati pokazuju da se broj bakterija Clostridium perfringens smanjuje ispod praga detekcije nakon tretmana životinja probiotikom.

Slika 7. Telesna masa oglednih životinja.

● Podaci pokazuju da pojedinačni sojevi delimično utiču na povećanje apetita oglednih životinja, što utiče na povećanje njihove telesne mase.

Prirodni izolati koji ulaze u sastav probiotičke kulture

U sastav probiotičke starter kulture ulaze 3 termofilna prirodna izolata BMK: Streptococcus thermophilus BGVLJl-44 (prirodni izolat iz autohtonog, tradicionalno proizvedenog jogurta od nekuvanog kravljeg mleka, soj iz laboratorijske kolekcije Laboratorije za molekularnu mikrobiologiju, Instituta za molekularnu genetiku i genetičko inženjerstvo, Univerziteta u Beogradu LMM-IMGGI), Lactobacillus fermentum BGHI14 (prirodni izolat iz fecesa novorođenčeta, soj iz laboratorijske kolekcije LMM-IMGGI) i Lactobacillus helveticus BGRA43 (prirodni izolat iz humanog gastrointestinalnog trakta, soj iz laboratorijske kolekcije LMM-IMGGI).

Sojevi su izolovani klasičnim mikrobiološkim metodama opisanim u radu Terzic-Vidojevic i sar. (2007). Za kultivaciju soja BGVLJ1-44 se koristi tečni i čvrsti M17 medium (Merck, GmbH, Darmstadt, Germany) uz dodatak 0,5% glukoze (GM17), a za kultivaciju sojeva BGHI14 i BGRA43 se koristi tečni i čvrsti MRS medijum (Merck, GmbH). Kulture se čuvaju na -80°C u kriovaljicama u odgovarajućem tečnom GM17, odnosno MRS medijumu uz dodatak 15% glicerola.

Podaci o deponovanju biološkog materijala

Svi sojevi su deponovani u bakterijsku kolekciju pri Belgian Co-ordinated Collection of Microorganisms (BCCM) Laboratory for Microbiology, University of Gent, Belgium, K.L.

Ledegancstraat 35, Gent, Belgija.

Soj Lactobacillus helveticus BGRA43 je deponovan 08.05.2007. godine; Soj ima depozitni broj LMG P-24226. Deponent Ljubiša Topisirović, rukovodilac Laboratorije za molekularnu genetiku industrijskih mikroorganizama (prethodni naziv Laboratorije za molekularnu mikrobiologiju), IMGGI, Beograd, Srbija.

Soj Streptococcus thermophilus BGVLJ1-44 je deponovan pod brojem LMG P-28585, dana 28.10.2014. godine. Deponent Dr.Milan Kojić, rukovodilac Laboratorije za molekularnu mikrobiologiju, IMGGI, Beograd, Srbija.

Soj Lactobacillus fermentum BGHI14 je deponovan pod brojem LMG P-28583, dana 28.10.2014. Deponent Dr. Milan Kojić, rukovodilac Laboratorije za molekularnu mikrobiologiju, IMGGI, Beograd, Srbija.

Karakterizacija i identifikacija LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 sojeva Prirodni izolati Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 su detaljno biohemijski i molekularno genetički okarakterisani.

Fenotipske karakteristike prirodnih izolata LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 su prikazane u Tabeli 1.

Identifikacija LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 sojeva do nivoa vrste je rađena sekvenciranjem 16S rDNK (Jovcic i sar., 2009).

Dodatna identifikacija do nivoa soja je urađena PFGE (“puls-field gel electrophoresis”) fmgerprint metodom (Slika 1). Totalne DNK sojeva Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus helveticus LMG P-24226 i Lactobacillus fermentum LMG P-28583 su situ sečene NotI

restrikcionim enzimom. Dobijeni restrikcioni profili predstavljaju jedinstvene fingerprint profile analiziranih sojeva.

Proteolitička aktivnost

S obzirom da je proteolitička aktivnost bitna za proces pripreme mlečnog fermentisanog proizvoda, testirana je proteolitička aktivnost sojeva Strepocus hermophilus LMG P-28585, L helveticus LMG P-24226 i Lactobacillus fermentum LMG P-28583 po metodi koju su opisali Kojic i sar. (1991). Testirana je sposobnosti degradacije a-, B- i κ-kazeina, proteina mleka.

Sojevi LMG P-28585 i LMG P-24226 u potpunosti seku a-, B- i κ-kazein, dok soj Lactobacillus fermentum LMG P-28583 ne pokazuje proteolitičku aktivnost ni prema jednom tipu kazeina

(Tabela 1).

Antimikrobna aktivnost

Antimikrobna aktivnost je testirana po metodi odloženog antagonizma koristeći prekonoćne kulture sojeva Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus helveticus LMG P-24226 i Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i različitih sojeva indikatora. Ukratko, soft agar

odgovarajućeg medijuma (0,7% w/v) za rast indikator sojeva, koji sadrži indikator sojeve je

preliven preko GM17 ili MRS petri šolje sa bunarčićima u koje je dodato po 50 μl analiziranog

soja. Petri šolje su inkubirane preko noći na 37°C. Zone inhibicije rasta indikator soja oko

bunarčića predstavljaju pozitivan signal za antimikrobnu aktivnost.

U slučaju anaerobnih bakterija ( Clostridum sp.) antimikrobna aktivnost je testirana na s način: Prekonoćna kultura Clostridium sporogenes ili Clostridium difficile (1 ml) je sipana u

epruvetu, a preko toga soft agar za rast C. difcle, i preko njega soft G kulture Streptococcus thermophilus LMG P-28585, odnosno MRS sa 200 μl prekonoćne kulture Lactobacillus helveticus LMG P-24226 ili Lactobacillus fermentum LMG P-28583 ili 200 μl mešane probiotičke kulture. Produkcija gasa od strane sojeva Clostridium sporogenes ili Clostridium difficile koja se manifestuje u vidu pucanja agara predstavlja rast sojeva Clostridium sporogenes ili Clostridium difficile tj. odsustvo antimikrobne aktivnosti. Antimikrobna aktivnost probiotičkih sojeva na Clostridium sporogenes ili Clostridium difficile se manifestuje odsustvom proizvodnje gasa, tj. agar ostaje intaktan.

L. helveticus LMG P-24226 ispoljava antimikrobnu aktivnost na različite sojeve rodova Lactococcus sp. i Lactobacillus sp., na Bacillus subtilis ATCC8, Bacillus cereus ATCCl 1778, Bacillus mycoides, kao i na patogene bakterije Staphylococcus aureus ATCC25923, Staphylococcus sp. ATCC MetR (klinički izolat) kolekcija Torlak, Yersinia enterocolitica 03 (klinički izolat) kolekcija Torlak, Shigella sonnei (Hamburg IO5) kolekcija Torlak, Shigella flexneri (London 9950) kolekcija Torlak, Shigella dysenteriae (serotip 5 i 7) kolekcija Torlak, Streptococcus pneumoniae ATCC276, Streptococcus pneumoniae ATCC496, Pseudomonas sp., Escherichia coli C600, Escherichia coli ATCC25922, Clostridium sporogenes kolekcija Torlak i Clostridium difficile (klinički izolat).

Sojevi Streptococcus thermophilus LMG P-28585 i Lactobacillus fermentum LMG P-28583 ispoljavaju slabiju antimikrobnu aktivnost na Clostridium difficile, dok probiotička kombinacija pokazuje sinergistički efekat i ispoljava najjači antimikrobni efekat na Clostridium sporogenes i Clostridium difficile (Slika 2).

Antibiotska rezistencija

Rezistencija na antibiotike je testirana metodama propisanim od strane European Food Safety Authority (EFSA, 2012).

Testiranjem rezistencije na antibiotike je utvrđeno da su sojevi LMG P-24226, LMG P-28583 i LMG P-28585 senzitivni na preporučene koncentracije antibiotika odabranih na osnovu preporuke EFSA (2012).

Preživljavanje prirodnih izolata u simuliranim uslovima gastrointestinalnog trakta (GIT). Preživljavanje probiotika u gastrointestinalnom traktu je od ključne važnosti za njegovo delovanje. Preživljavanje prirodnih izolata u simuliranim uslovima GIT je rađeno po metodi koju su prethodno opisali Uroić i saradnici (Uroić et al., 2014). Simulirani uslovi GIT podrazumevaju rast bakterija u veštačkom želudačnom soku (NaCl [7,31 g/1], KCl [0,52 g/l], NaHCO3 [3,78 g/l], pH 2 korišćenjem koncentrovane HCl; posle sterilizacije je dodat filtriran pepsin [3 g/1]) i crevnim sokovima A (simulacija uslova u dvanaestopalačnom crevu: 0,6% (z/z) žučnih soli, pH 8,0 korišćenjem 10 N NaOH) i B (simulacija uslova u ileumu: 0,3% (z/z) žučnih soli i pankreatin [1 g/l]). Uzorci su uzimani u periodu od: t=0 min - CFU/ml prekonoćne kulture; t=90 min - CFU/ml kulture inkubirane 90 min u želudačnom soku; t=l00 min - CFU/ml kulture inkubirane 10 min u crevnom soku A, t=160 min i t=220 - CFU/ml kulture inkubirane 60 i 120 min u crevnom soku B.

Rezultati su pokazali da soj LMG P-28585 uspešno preživljava u simuliranim uslovima gastrointestinalnog trakta u rastvoru NaCl, dok sojevi LMG P-28583 i LMG P-24226 uspešno preživljavaju simulirane uslove GIT u slučaju kada se apliciraju u mlečnom matriksu (Slika 3).

Adhezija sojeva u sastavu probiotičke kulture i patogena za Caco-2 intestinalne ćelijske linije Adhezija za epitelijalne intestinalne ćelijske (EIĆ) linije je bitan preduslov da bi probiotički soj ispoljio pozitivne efekte na zdravlje domaćina u dužem vremenskom periodu. S jedne strane veći procenat adhezije obezbeđuje bolju antagonističku aktivnost protiv enteropatogena kompeticijom za ista mesta za vezivanje za EIĆ (Coconnier i sar., 1993). S druge strane soj koji ispoljava veći stepen adhezije za EIĆ ima sposobnost kolonizacije gastrointestinalnog trakta i duže opstaje u gastrointestinalnom traktu i ostvaruje bolji kontakt sa EIĆ preko kojih vrši stimulaciju imunskog sistema domaćina (Schiffrin i sar., 1995).

Eksperiment adhezije za EIĆ Caco-2 je rađen po metodi koju su prethodno opisali Nikolić i saradnici (2012).

Test je pokazao da najveći stepen adhezije ispoljava soj LMG P-24226, dok sojevi LMG P-28583 i LMG P-28585 ispoljavaju nešto niži stepen adhezije za Caco-2 ćelije (Slika 4A).

Osim toga testirana je i adhezija sojeva Escherichia coli ATCC25922 (Slika 4B) i Salmonella 654/7E (veterinarski izolat, kolekcija Naučnog instituta za veterinarstvo, Novi Sad) (Slika 4C) za Caco-2 ćelije u prisustvu bakterija koje ulaze u sastav probiotičke kulture i u prisustvu mlečnog fermentisanog probiotičkog proizvoda.

Rezultati su pokazali da soj LMG P-24226 značajno redukuje broj vezanih bakterija E. coli ATCC25922 (p<0,5) dok probiotička kombinacija u mleku ispoljava sinergistički efekat i još značajnije (p<0,l) redukuje broj vezanih bakterija E. coli ATCC25922. Takođe, sojevi LMG P-28585 (p<0,l) i LMG P-24226 (p<0,5) značajno redukuju broj vezanih bakterija Salmonella 654/7E.

Proliferacija GALT (“gut associated lymphoid tissue”) ćelija pacova u prisustvu pojedinačnih sojeva i probiotičke kulture

Praćenje probiotički efekat sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 umrtvljenih UV zracima, živih sojeva LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 u mleku i probiotičke kulture pripremljene u mleku na primarnoj kulturi GALT ćelija pacova u cilju determinacije imunoloških parametara koji se aktiviraju delovanjem probiotičkih bakterija i kombinacija. Izolacija i proliferacija GALT ćelija pacova je rađena po metodi opisanoj od strane Hidalgo-Cantabrana i saradnika (2014).

Rezultati su pokazali da živi sojevi LMG P-28585, LMG P-28583 i LMG P-24226 gajeni u mleku i probiotička kultura pripremljena u mleku (sinergizam) deluju stimulatorno na proliferaciju limfocita, ukazujući da sojevi i probiotička kombinacija imaju imunomodulatorni efekat (Slika 5).

Testiranje probiotičkih kombinacija in vivo u uslovima farme

Efekat probiotičke kombinacije na poboljšanje zdravstvenog stanja životinja je praćen vivo u uslovima farme. Praćeno je 50 suprasnih krmača od kojih je 25 tretirano mlečnim fermentisanim probiotičkim proizvodom tokom 7-15 dana pre prašenja (u periodu kada prirodno dolazi do pada imuniteta). Suprasne krmače su dobijale probiotik svaki dan tokom prvog jutarnjeg hranjenja. Dvadeset pet kontrolnih suprasnih krmača nije tretirano probiotikom. Pre i po završetku tretmana probiotikom, praćeno je opšte zdravstveno stanje suprasnih krmača, kao i ukupan broj bakterija (BMK i Enterobacteriaceae) u fecesu svinja prema prethodno opisanim procedurama (TerzicVidojevic i sar., 2007; Anonymous, 1996). Nakon prašenja praćeno je opšte zdravstveno stanje i imunološki status prasića, kao i ukupan broj bakterija (BMK i ) u fecesu prasića. Kao kontrola, istovremeno je praćeno opšte zdravstveno stanje i imunološki status krmača koje nisu tretirane probiotikom i njihovih prasića, kao i ukupan broj bakterija (BMK i Enterobacteriaceae) u fecesu kontrolne grupe krmača i prasića (Slika 5a).

Rezultati su pokazali da je nakon tretmana probiotikom broj enteropatogenih bakterija u fecesu prasića značajno niži u odnosu na broj istih bakterija u fecesu krmača pre početka tretmana, dok je broj enteropatogenih bakterija u kontrolnom uzorku veći u fecesu prasića nego u fecesu suprasnih krmača pre prašenja (Slika 6a). Takođe, uočeno je da prasići čije su majke bile tretirane probiotičkom kombinacijom nisu imali dijareju, dok se u kontrolnoj grupi dijareja javljala sporadično kod većeg broja prasića.

Paralelno, testiran je efekat probiotičke kulture na koze zaražene Clostridium perfringens. Deset koza spontano zaraženih bakterijom Clostridium perfringens je tretirano 10 dana pre jarenja (u periodu kada prirodno dolazi do pada imuniteta) probiotičkom kulturom.

Rezultati su pokazali da probiotička kultura uspešno redukuje broj bakterija vrste Clostridium perfringens na nivo ispod nivoa detekcije (Slika 6b). Osim toga, primećeno je da je i broj ostalih sporogenih bakterija snižen nakon tretmana probiotičkom kulturom, a opšte zdravstveno stanje koza je poboljšano.

Toksikološka analiza

U cilju bezbednog korišćenja probiotičke kombinacije na ljudima i životinjama urađene su akutna i subakutna toksikološka analiza pojedinačnih sojeva i probiotičke kombinacije. Akutna i subakutna toksikološka analiza su urađene na 12 miševa soja NMRI HAN. Analiza je urađena u skladu sa Smernicama Dobre laboratorijske prakse (Službeni Glasnik br. 28/2008) uz poštovanje opštih zahteva za izvođenje testa navedenih u smernici OECD GUIDELINES FOR TESTING OF CHEMICALS NO 423.

Rezultati su pokazali da nijedan soj, kao ni probiotička kombinacija ne ispoljavaju toksični efekat (Tabela 2-6, Slika 7).

Tabela 1

Fenotipske karakteristike sojeva Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226.

1A-stvaranje kiseline (crveni prsten); 2C-stvaranje gruša (mleko koagulisalo usled fermentacije laktoze); 3R-redukcija vodonikovih jona (bela boja).

pozitivna reakcija; - negativna reakcija; ± slaba reakcija.

Tabela 2:

Zbirni rezultati kliničke opservacije životinja (miš) tretiranih probiotskim sojem Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u dozi od 0,5 ml/mišu za period od 14.09.2015. do 28.09.2015.

Legenda: C - normalan odgovor

1 - neznatne promene

21 - izražene promene

3 i - terminalni stadijum promena

Tabela 3:

Zbirni rezultati kliničke opservacije životinja (miš) tretiranih probiotskim sojem Streptococcus thermophilus LMG P-28585 u dozi od 0,5 ml/mišu za period od 14.09.2015. do 28.09.2015.

Legenda: 0 - normalan odgovor

1 - neznatne promene

2 - izražene promene

3 - terminalni stadijum promena

Tabela 4:

Zbirni rezultati kliničke opservacije životinja (miš) tretiranih probiotskim sojem Lactobacillus fermentum LMG P-28583 u dozi od 0,5 ml/mišu za period od 14.09.2015. do 28.09.2015.

Legenda: C - norm alan odgovor

1 - neznatne prom ene

21 - izražene prom ene

33 - term inalni stadijum prom ena

Tabela 5:

Zbirni rezultati kliničke opservacije životinja (miš) tretiranih probiotskom smešom u dozi od 1 ml/mišu za period od 14.09.2015. do 28.09.2015.

Legenda: C - norm alan odgovor

1 - neznatne prom ene

2 - izražene prom ene

3 - term inalni stadijum prom ena

Tabela 6:

Zbirni rezultati kliničke opservacije životinja (miš) tretiranih svakodnevno probiotskom smešom u dozi od 0,5 ml/mišu za period od 14.09.2015. do 28.09.2015.

Legenda: 01- normalan odgovor

1 - neznatne promene

2 - izražene promene

3 - terminalni stadijum promena

Postupak pripreme mlečnog fermentisanog probiotičkog proizvoda

U pasterizovano mleko se dodaje prekonoćna kultura pojedinačno nagajenih prirodnih izolata u mleku u ukupnoj količini od 3% poželjno u odnosu LMG P-28585 : LMG P-28583 : LMG P-24226 = 1 : 0,5 : 1, optimalno 1 : 1 : 1,3. Inokulisano mleko se inkubira u optimalnim uslovima za rast bakterija dok ukupan broj bakterija ne bude 108-1010 CFU/ml, nakon čega dobijeni fermentisani proizvod može da se čuva u frižideru na 4-6°C do 28 dana, a da ne izgubi aktivnost i da ukupan broj živih bakterija ostane isti kao neposredno nakon pripreme.

Industrijska primena

Probiotička starter kultura predmetnog pronalaska će shodno međusobnom odnosu bakterijskih izolata koji ulaze u sastav probiotičke kulture, ispoljavati svoju proteolitičku aktivnost, antimikrobnu i/ ili imunomodulatornu aktivnost. Znači, prema potrebama i namenama ova probiotička starter kultura nalazi humanu i animalnu primenu u prevenciji i/ili tretiranju intestinalnih patologija različite etiologije i kao imunomodulator.

Ova probiotička starter kultura može se pripremiti kao takva i u oblicima koji su pogodni za ciljanu grupu sisara, odnosno čoveka ili životinje. Posebna namena probiotičke starter kulture je kao dodatak hrani za ljude i životinje.

Za veterinarsku primenu, probiotička starter kultura može se pripremiti u obliku standardnih farmaceutskih oblika koji se primenjuju u veterini, ali ne isključivo, u obliku fermentisanog probiotičkog proizvoda, liofilizata, premiksa, odnosno granula, spray-dry obliku (poprskan po hrani), praškova koji se mešaju sa vodom i hranom, suspenzije, tableta, kapsula i svih ostalih oblika koji su poznati prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti tehnike. Zavisno od slučaja, probiotička starter kultura može da se primeni posebno kao dodatak stočnoj hrani, a posebno poželjno u spray dryobliku (poprskan po hrani).

Za humanu primenu, probiotička starter kultura/probiotik/kompozicija predmetnog pronalaska koja sadrži tri termofilna prirodna izolata bakterija predmetnog pronalaska, kako je prethodno navedeno, može se dobiti u obliku mlečnog fermentisanog probiotičkog proizvoda, liofilizata, praškastog oblika, oralne suspenzije, pastila i tableta koje se žvaću, tableta, kapsula i ostalih oblika koji su poznati prosečnom stručnjaku iz ove oblasti tehnike.

Listing sekvenci

u

Claims

Patentni zahtevi

1. Probiotička starter kultura, naznačena time, što se sastoji od sledećih termofilnih prirodnih izolata bakterija mlečne kiseline (BMK): Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226.

2. Probiotička starter kultura prema zahtevu 1, naznačena time, što sadrži Streptococcus thermophilus LMG P-28585 u iznosu od 10% do 40%, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 u iznosu od 10% do 50% i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 u iznosu od 40% do 80%.

3. Probiotička starter kultura prema zahtevu 1, naznačena time, što odnos između Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 iznosi 30%:30%:40%.

4. Probiotička starter kultura prema zahtevu 1, naznačena time, što odnos između Streptococcus thermophilus LMG P-28585, Lactobacillus fermentum LMG P-28583 i Lactobacillus helveticus LMG P-24226 iznosi

10%: 10%:80%, odnosno 10%:20%:70%, bolje 30%:20%:50%, a bolje 30%:40%:30% i još bolje 40%:20%:40%.

5. Probiotička starter kultura prema zahtevu 1, naznačena time, što je broj živih bakterija: Streptococcus thermophilus LMG P-28585 od 6x107 do 1,25x101 , Lactobacillus fermentum LMG P-28583 od l,lx l08 do l,25xl011 i Lactobacillus helveticus LMG P-242264xl06 do 2,5x109.

6. Probiotička starter kultura prema jednom od prethodnih zahteva za upotrebu u prevenciji i/ili tretiranju bakterijskih infekcija gastrointestinalnog trakta, poremećaja koji su povezani sa kolonizacijom gastrointestinalnog trakta, sporednih efekata izazvanih upotrebom antibiotika, kao imunomodulator u održavanju prirodnog balansa imunskog sistema i kao zamena za upotrebu antibiotika kod ljudi i životinja.

7. Probiotička starter kultura prema zahtevu 6, naznačena time, što su infekcije izazvane bakterijama vrste Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, bakterijama familije Enterobacteriaceae, bakterijama vrsta Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. MetR, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Streptococcus pneumoniae i Pseudomonas sp., kod ljudi i životinja.

8. Probiotička starter kultura prema jednom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je u spray-dry obliku (poprskan po hrani), obliku liofilizata, suspenzija i mlečnih fermentisanih probiotičkih proizvoda.

9. Probiotička starter kultura prema zahtevima 1-8 za upotrebu kao probiotik kao dodatak hrani za ljude i životinje

10. Kompozicija, naznačena time, što sadrži probiotičku starter kulturu prema jednom od prethodnih zahteva i farmaceutski prihvatljiv nosač i što je u obliku kapsula, tableta, liofilizata, spray-dry obliku, suspenzija, mlečnih fermentisanih probiotičkih proizvoda.

11. Kompozicija prema zahtevu 10 za upotrebu u prevenciji i/ili tretiranju bakterijskih infekcija gastrointestinalnog trakta, poremećaja koji su povezani sa kolonizacijom gastrointestinalnog trakta, sporednih efekata izazvanih upotrebom antibiotika, kao imunomodulator u održavanju prirodnog balansa imunskog sistema i kao zamena za upotrebu antibiotika kod ljudi i životinja.

12. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 11, naznačena time, što su infekcije izazvane bakterijama vrste Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium difficile, bakterijama familije Enterobacteriaceae, bakterijama vrsta Escherichia coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. MetR, Yersinia enterocolitica, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Shigella dysenteriae, Streptococcus pneumoniae i Pseudomonas sp., kod ljudi i životinja.