BG98643A - Нов биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефало- споринова киселина (7-аdса) - Google Patents
Нов биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефало- споринова киселина (7-аdса) Download PDFInfo
- Publication number
- BG98643A BG98643A BG98643A BG9864394A BG98643A BG 98643 A BG98643 A BG 98643A BG 98643 A BG98643 A BG 98643A BG 9864394 A BG9864394 A BG 9864394A BG 98643 A BG98643 A BG 98643A
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- acid
- adipoyl
- dna
- enzyme
- promoter
- Prior art date
Links
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims abstract description 125
- 238000010170 biological method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 61
- 101710104123 Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims abstract description 32
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 28
- 125000003651 hexanedioyl group Chemical group C(CCCCC(=O)*)(=O)* 0.000 claims abstract description 25
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 126
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 126
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 53
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 44
- MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N Isopenicillin N Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 25
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 16
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 claims description 13
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 13
- 108010012172 isopenicillin N synthetase Proteins 0.000 claims description 13
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L adipate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC([O-])=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 241000424942 Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 Species 0.000 claims description 7
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 5
- 229930191709 Isopenicillin Natural products 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 3
- KYKFCSHPTAVNJD-UHFFFAOYSA-L sodium adipate Chemical group [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCCCC([O-])=O KYKFCSHPTAVNJD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 235000011049 sodium adipate Nutrition 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims 3
- 108030003691 Isopenicillin-N synthases Proteins 0.000 claims 1
- 210000003109 clavicle Anatomy 0.000 claims 1
- MIFYHUACUWQUKT-QSKNDCFUSA-N isopenicillin n Chemical compound OC(=O)[C@@H]1C(C)(C)S[C@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-QSKNDCFUSA-N 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract description 5
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 abstract description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 117
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 37
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 30
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 23
- MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N isopenicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N 0.000 description 20
- -1 penicillin compound Chemical class 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 16
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 13
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 11
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 10
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 8
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 8
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 8
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 8
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 7
- MIFYHUACUWQUKT-GPUHXXMPSA-N penicillin N Chemical group OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GPUHXXMPSA-N 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N Asn-Pro Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O GADKFYNESXNRLC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 6
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- 241000228417 Sarocladium strictum Species 0.000 description 5
- 229950008644 adicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N Cephalosporin C Natural products S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 description 4
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M cephalosporin C(1-) Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H]([NH3+])C([O-])=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-M 0.000 description 4
- 108010031946 deacetoxycephalosporin C hydroxylase Proteins 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 3
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 3
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 3
- 108010069020 alanyl-prolyl-glycine Proteins 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 108010034416 glutarylamidocephalosporanic acid acylase Proteins 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- JPSKCQCQZUGWNM-UHFFFAOYSA-N 2,7-Oxepanedione Chemical compound O=C1CCCCC(=O)O1 JPSKCQCQZUGWNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FTMQFOCEVZLEJU-LURJTMIESA-N 6-[[(1S)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-6-oxohexanoic acid Chemical compound C(CCCCC(=O)O)(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O FTMQFOCEVZLEJU-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000193417 Brevibacillus laterosporus Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 2
- 229930191961 Deacetylcephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N L-alanyl-L-prolylglycine zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UGTHTQWIQKEDEH-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 241000589746 Pseudomonas sp. SE83 Species 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asn-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RDFQNDHEHVSONI-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 2
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 2
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 2
- NNQIJOYQWYKBOW-JWKOBGCHSA-N deacetoxycephalosporin C Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 NNQIJOYQWYKBOW-JWKOBGCHSA-N 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N diethyl pyrocarbonate Chemical compound CCOC(=O)OC(=O)OCC FFYPMLJYZAEMQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 2
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001601 sodium adipate Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- DILISPNYIVRDBP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[2-(2-hydroxypropylamino)pyrimidin-4-yl]-2-naphthalen-2-ylimidazol-4-yl]acetonitrile Chemical compound OC(CNC1=NC=CC(=N1)N1C(=NC=C1CC#N)C1=CC2=CC=CC=C2C=C1)C DILISPNYIVRDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO MLONYBFKXHEPCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 1
- KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 2-oxoglutaric acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)C(O)=O KPGXRSRHYNQIFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 241000187390 Amycolatopsis lactamdurans Species 0.000 description 1
- 235000017060 Arachis glabrata Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 235000010777 Arachis hypogaea Nutrition 0.000 description 1
- 235000018262 Arachis monticola Nutrition 0.000 description 1
- ASQKVGRCKOFKIU-KZVJFYERSA-N Arg-Thr-Ala Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O ASQKVGRCKOFKIU-KZVJFYERSA-N 0.000 description 1
- 241000186063 Arthrobacter Species 0.000 description 1
- DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N Asn-Gly-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DXVMJJNAOVECBA-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 241000228257 Aspergillus sp. Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100136727 Caenorhabditis elegans psd-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 description 1
- 241000135254 Cephalosporium sp. Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000019265 Cytochrome c1 Human genes 0.000 description 1
- 108010007528 Cytochromes c1 Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 208000006558 Dental Calculus Diseases 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 241000190562 Emericellopsis Species 0.000 description 1
- CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N Fe2+ Chemical compound [Fe+2] CWYNVVGOOAEACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXJHNZODTMHWRD-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UXJHNZODTMHWRD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N Leu-Ala-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O WNGVUZWBXZKQES-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- PLOUVAYOMTYJRG-JXUBOQSCSA-N Lys-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PLOUVAYOMTYJRG-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- 241001531966 Lysobacter lactamgenus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000721603 Mycoplana Species 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910004616 Na2MoO4.2H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N Phenylacetyl coenzyme A Natural products S(C(=O)Cc1ccccc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N Pro-Gly-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O DMKWYMWNEKIPFC-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N Pro-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 UIMCLYYSUCIUJM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000122799 Scopulariopsis Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000203615 Streptoalloteichus Species 0.000 description 1
- 241001147855 Streptomyces cattleya Species 0.000 description 1
- 241000936757 Streptomyces filipinensis Species 0.000 description 1
- 241000187392 Streptomyces griseus Species 0.000 description 1
- 241000913723 Streptomyces heteromorphus Species 0.000 description 1
- 241000913724 Streptomyces panayensis Species 0.000 description 1
- 241001248020 Streptomyces wadayamensis Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N Thr-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DFTCYYILCSQGIZ-GCJQMDKQSA-N 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 150000001278 adipic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229950008560 almecillin Drugs 0.000 description 1
- 108010049411 alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940072049 amyl acetate Drugs 0.000 description 1
- PGMYKACGEOXYJE-UHFFFAOYSA-N anhydrous amyl acetate Natural products CCCCCOC(C)=O PGMYKACGEOXYJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 101150091913 cefE gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007376 cm-medium Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 108010093176 deacetoxycephalosporin C synthetase Proteins 0.000 description 1
- NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N desacetoxycephalosphorin G Natural products S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C12 NNQIJOYQWYKBOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 150000008049 diazo compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002845 discoloration Methods 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001952 enzyme assay Methods 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000417 fungicide Substances 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001475 halogen functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-M heptanoate Chemical compound CCCCCCC([O-])=O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N n-phenylnitramide Chemical compound [O-][N+](=O)NC1=CC=CC=C1 VBEGHXKAFSLLGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000006902 nitrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- QULKGELYPOJSLP-WCABBAIRSA-N penicillin O Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CSCC=C)C(=O)N21 QULKGELYPOJSLP-WCABBAIRSA-N 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N phenylacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC1=CC=CC=C1 ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M sodium;3-(n-ethyl-3,5-dimethoxyanilino)-2-hydroxypropane-1-sulfonate Chemical compound [Na+].[O-]S(=O)(=O)CC(O)CN(CC)C1=CC(OC)=CC(OC)=C1 HDARHUHTZKLJET-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QPILZZVXGUNELN-UHFFFAOYSA-M sodium;4-amino-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonate;hydron Chemical class [Na+].OS(=O)(=O)C1=CC(O)=C2C(N)=CC(S([O-])(=O)=O)=CC2=C1 QPILZZVXGUNELN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 125000001874 trioxidanyl group Chemical group [*]OOO[H] 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/02—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by desacylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
- Y10S435/933—Penicillium
- Y10S435/935—Penicillium chrysogenum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Cephalosporin Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Синтезът се провежда при използване на съответни биологични методи. Той е ефективен и икономичен. По метода трансформиран щам на реniсilliuм снrysоgеnuм се култивира в присъствие на адипатна хранителна среда до получаването на адипоил-6-аминопеницилинова киселина. Експресията in siтu на експандазния ген, получен например от sтrертомyсеs сlаvuligеrus, с който се трансформира щамът на реniсilliuм снrysоgеnuм, превръща адипоил-6-аминопеницилиноватакиселина чрез разширяване на пръстена и в адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. 7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се получава чрез отцепване на адипоиловата странична верига при използване на адипоилацилаза.
Description
Настоящето изобретение е в областта на синтезните методи за получаване на търговски продукти цефалоспоринови антибиотици, от които в момента съществува голям брой - тези терапевпгичи агенти се явяват четвърто поколение. От гледна точка на голямото разнообразие на страничните вериги, които се откриват в тьрговскте продуки, както и голямата икономическо значение на цефалоспорините, от особена важност е създаването на по-ефективни и икономични методи за получаването на ключови междинни продукти, които дават възможност за синтезиране на редица цефалоспорини.
Един от тези междинни продукти е
7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина (7-ADCA), която може да бъде • · · · • · ····· β представена със следната формула:
Η2Ν
СН3
По настящем 7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се получава от пеницилин G, като се изисква пет-степенна химическа реакция, за да се разшири
5-членния пръстен на пеницилина в 6-степенен пръстен, характеризиращ цефалоспорините. Както е характерно за всичките химически синтези, този метод има сериозни недостатъци. Между тях са необходиостта от многостепенен и комплексен метод, скъпите реагенти, значителното количество странични продукти, които създават проблеми при обработката, и пречистването на силно онечистените изходни материали преди започване на химическите реакции. Освен това съществува едно непрекъснато търсене на микробиологичен или ферментационен метод, който да доведе до разширение на пръстена и отцепване на страничната верига по ферментен път за получаване на 7-аминодезацетоксицефалослоринова киселина на по-икономична основа в сравнение с използваните по настоящем химични методи.
И така, настоящето изобретение се отнася до получаване на ключовия цефалоспоринов междинен продукт 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, и още по-точно - до биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
До сега търсенето на удачен биологичен метод за получаване 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина до голяма степен се оказва неуспешно, разбира се става въпрос за метод, съответстващ на промишленотърговски мащаби. Например, докато е възможно да се получи 6-аминопеницилинова киселина (б-АРА) чрез директна ферментация и/или чрез ензимна обработка на • 9
99 9 • · • · ····· · ·· ······· • · ····· ·· ·· · · ·· ·· ·· · пеницилин G, като се остави само необходимото за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина разширение на пръстена, установено е за съжаление, че ензимите на Cephatosporiumww Streptomyces, които предизвикват разширение на пръстена при нормалните пътища на метаболизъм на тези микроорганизми, не възприемат 6-аминопеницилиновата киселина като субстрат. Тези ензими, които колективно са отнесени към групата на DAOCS или експандазни ензими, са дефинирани като ензими, които катализират разширеното на фенамните пръстенни структури, открити в пеницилино-подобниге молекули до цеф-3-ем пръстени, които са открита в цефалоспорините. Оттук нататък тези ензими се наричат „разширяващи пръстена ензими или „експандазни ензими“.
Субстратът, върху който ще действа ензимът е пеницилин N който наред с разширение на пръстена дава деацетокцицефалоспорин С (DAOC). Tyke необходимо само да се отцепи (О)-агаминоадипоиловата странична верига, за да се получи 7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, но тази странична верига има доказана устойчивост към действието на ензима, поради което реакцията протича с много нисък добив.
В съответвие с настоящето изобретение е възможно да се осъществи биологичен процес, при който по нов ферментационен метод се получава пеницилиново съединение (с адипоилова странична верига) с висок татьр, като пеницилиновото съединение се явява приемлив субстрат за разширяващата пръстена ензимна система, получена in situ със същите микроорганизми, които произвеждат пеницилиновото съединение, което се преобразува в посочената разширяваща пръстена ензимна система. Разширяващата пръстена ензимна система впоследствие действа за разширяване на пръстена на пеницилиновото съединение до получаването и то с висок добив на цефалоспориново съединение. И което е особено важно, във втората критична степен на реакцията тази странична • · • · · · верига на пеницилиновото съединение - вече цефалоспориново съединение - може да се отцепи и то с учудващо голям ефект посредством друга ензимна система
Неочакваният резултат от този уникален биологичен метод, обект на настоящето изобретение, е получаването с висок добив на
7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА
Cantwell et al., в Curr Genet (1990) 17:213-221 предлагат биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина чрез разширяване на пръстена на пеницилин V и следваща ензимна хидролиза на получения деацетоксицефалоспорин V до образуването на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Предложеният метод ое основава на наличието на клониран N-пеницилинов експандазен ген (cefE) от Streptomyoes clavuligerus, Kovacevic et al., j. Bacteriol, (1989) 171:754-780 и U.S. 5,070,020. Тъй като обаче, експандазата действа върху пеницилин N - нейния естествен субстрат, но не действа върху пеницилин V, предложеният метод изисква генна технология за получаване на модифициран експандазен ген, който да предизвика разширяване на пръстена на пеницилин V. Необходимото модифициране, обаче, не е постигнато от Cantwell etal. Те постигат успех само в превръщането на Penicilinum chrysogenum с cef Е ген от Streptomyoes clavuligerus и получаването с нисък добив на ензима DAOCS (експандаза).
Ензимът експандаза е е изследван пълно както по отношение на неговата активност, така и по отношение на неговата генетична последователност. Например във Wolfe U.S. 4,510,246 и 4,536,476, за да се осигурят стабилни ензимни реагенти, цикпазата, епимеразата и и разширяващите пръстена ензими се изолират разделени от свободен от клетки екстракт от прокариотинов β-лактам, като се получават • · · · · · • · · • · · · ·· · · · · · • · ··· · · · · · ··· ···· ·· · ···· · · ·· ·· ·· ·· ·· · микроорганизми, включително Slreptomyces clavuHgerus. В ΕΡ-Α-0 366 354 се описва изолиран от Streptomyoes davuHgerus и пречистен разширяващ пръстена ензим, който е охарактеризиран, включително чрез крайните му групи и аминокиселинен състав и е посочено, че има молекулна маса около 34 900 Daltons. Тази молекулна маса обаче, е в противоречие с молекулната маса 29 000 на съединението, което се явява същия ензим според U.S. 4,536,476. ЕР-А-0 233 715 показва изолирането и рестрикционната ендонуклеазна характеристика на ензима експандаза, получен от S. clavoligerus, преобразуването му и действието му в среда на посочения ензим и разширяване на пръстена на субстрат от пеницилин N при използване на същия ензим. U.S. 5,070,020 показва последователността на дезоксинуклеиновата киселина (ДНК), кодираща ензима експандаза, получен от Streptomyoes davuligerus и описва трансформацията на щама на Penicillium chrysogenum с експресионния вектор, съдържащ цитираната последователност на ДНК, като с това се получава и експресия на ензима експандаза. Въпреки че ензимът се предлага като удачен за разширяване на пръстена и на други субстрати освен пеницилин N, в същност не е показано такова разширяване.
<3 Описаната по-горе работа е фокусирана върху ензима експандаза, получен от прокариотов Streptomyoes davuligerus. Същият този ензим или ензим с приблизително същата активност по отношение на разширяване на пръстена с експресиран също така чрез щамовете на еукариотовия Cephalosporiumacremoniurn (назоваван също Acremonlum chrisogenum). В тези щамове, обаче, активността на експандазата е експресирана посредством бифункционален ген (cef EF), който експресира също и активността на хидроксилазата (DACS), чиято естествена функция е да превръща дезацетоксицефалоспориновата киселина (DAOC) на ензима експандаза в даацетилцефалоспорин С (DAC). Като резултат се получава един ензим, който, обаче, е бифункционален - ензимът експандазаЛсидроксилаза. Въпреки че • · • · • · · · ···· ·· · · · * • · · · · · · · * • · ····· » ·· ··»»··· ·· ····· * * ·· ·· ·· · · ·· * б
са правени опити да се разделят активностите на тези два генни продукта, досега никой не е имал успех. Например, ЕР-А-0 281 391 описва изолирането и идентифицирането на последователността на гена DAOCS/DACS, получен от С. acremonium АТСС 11550, заедно със съответстващата последователност на аминокиселините на ензимите. Трансформиран е Penicillium и са експресирани ензимите, обаче изобщо не е демонстриран опит за превръщане на пеницилини G и V в съответните им цефалоспорини. Освен това, независимо от изказаното мнение, че генната инженерна техника предлага готов начин за разделяне на кодиращите “ генетична информация DAOCS и DAOS и от това, че са експресирани поотделно, не е демонстрирано такова разделяне.
Ензимът DAOCS/DACS (експандаза/хидроксилаза) на е изследван много пълно както по отношение на неговата активност, така и по отношение на неговите характеристики и генетична последователност. Например в Domain U.S. 4,178,210, 4,248,966 и 4,307,192 редица изходни материали от пеницилинов тип са обработени със свободен от клетки екстракт от С. acremonium, който епимеризира и разширява пръстена до получаването на цефалоспориново антибиотиково съединение. WuKuang Yeh U.S. 4,753,881 описва ензимът на С. Acremonium от гледна точка на неговата изоелектрична точка, на молекулната му маса, на аминокиселинните остатъци, на отношението между активностите на ехпандазата и хидроксилазата и на пептидните фрагменти.
Предишната работа дискутира нещата само в един от аспектите на настоящето изобретение, т.е. трансформацията на щама на Р. chrisoqenum чрез генна експресия на ензима експандаза и чрез получаване на експресията на този ензим. В тази работа, обаче, експресираният ензим се използва само за разширяване на пръстена на пеницилин N, но не и на пеницилин G и V. Дори в този случай пеницилин N има странична верига на седмо място, която не може да бъде отцепена ензимно, така • · • · • · · · • · ···· · · · · · · • · · · · · · · » р · • · ·«· · · · · · ··* *··· ·· ····· · ♦ ·· ·· · · ·* ·· · че да се получи 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, както е според метода на настоящето изобретение. Настоящето изобретение се основава на изненадващото откритие, че адипоилова странична верига може да бъде ефективно присъединена към щам на Р. chrisogenum, че ензимът експандаза, експресиран in situ може да използва ефективно това съединение като субстрат за разширяване на пръстена до адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина и че адипоиловата странична верига след това може да бъде отделена ефективно чрез друг ензим до получаването на 7-аминодезацетоксицефалоспсринова киселина. Тъй като редица отделни фрагменти от настоящето изобретение могат да бъдат открити в предишната работа, не е внушение, че те могат да бъдат съчетани така, че да дадат неочакваните резултати, получени по метода на настоящето изобретение.
Например известно е получаването на б-адипоилпеншдоиновата киселина (виж Ballio et al., Nature (1960) 185, 97-99). Ензимното разширяване на 6адипоилпеницилиновата киселина върху бази in vitro също е известно - виж Baldwin et al., Tetrahedron (1987) 43, 3009-3014 и ΕΡ-Α-0 268 343. Известно е и ензимното отцепване на адипоиловата странична верига - виж Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820. Адипоиловата странична верига има следната формула: СООН-(СН_) СО-, докато страничната веригана тясно свързаната структура е тази на глутарила, имащ следната формула: СООН-(СН2)3-СО-. Ензимното отцепване на глутариловата странична верига е известно - виж Shibuya et al., Agric. Biol. Chem. (1981) 45,1561 1567; Matsuda and Komatsu, J. Bact. (1985) 163,1222-1228; Matsuda et al., J. Bact. (1987) 169, 5815-5820; Jap. 53-086084 (1987 - Banyu Pharmaceutical Co. Ltd; Jap. 52-128293 (1977 -Banyu Pharmaceutical Co Ltd.).
EPA-A-0 453 048 също описва методи за повишаване на активността към адипоилово отцепване на глутарилацилазата, полученас Pseudomonas SY-77-1. Чрез заместване на различни аминокиселини с определено разположение с алфа • · • · · · • · субединици се наблюдава στ три до пет пъти по-висока скорост на отцепване на адипоила (от адипоилсерина). Трябва да се отбележи, че въпреки че ЕР-А-0 463 048 очевидно демонстрира една ацилаза с повишена активност към адипоиловите странични вериги, той не описва някакви начини (или химични или чрез биопроцес, аналогичен на метода, описан в настоящето изобретение), по които на първо място да се получи адипоилцефалоспорин.
Известно е, че когато е на лице (D)- а -аминоадипоилова странична верига, ензимно с (0)-аминоацидоксидаза се отцепва първо една аминогрупа и се скъсява страничната верига, като остава глугарилова (GL-7) странична верига. С втория ензим (глутарилацилаза) се отцепва глутариловета странична верига. Това двустепенно отцепване е описано от Matsuda U.S. 3,960,662; EP-A-0 275 901; Jap. 61 218057(1988 -Komatsu, Asahi Chemical Industry Co.); WO 90/12110 (1990-Wong, Biopure Corp.); Isogai et al., Bio/Technology (1991) 9,188-191.
Справка със заявка, намираща се в процес на едновременно разглеждане
Направена е справка със заявка, намираща се в процес на едновременно разглеждане №.........., публикувана.............(Включена в списъка за разглеждане под Νβ 18572IA), която описва биологичен метод за получаване на 7-аминопеницилинова киселина чрез експресиране на активността на ензима експанцаза в трансформиран PenicHlium chrysogenum по същия начин както при описания тук биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. В биологичния метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина обаче, са необходими допълнителни трансформации, за да се експресира допълнителна ензимна активност с цел да се получи напълно различен рекомбинативен метаболитен път към специалния краен продукт, като нито един от тях не е предложен в цитираната спесификация.
f
C цел да се улесни по-доброто разбиране на метода от настоящето изобретение и на включените по-горе техники от предшестващите работи в тази област, непосредствено след този текст са представени различните етапи в метаболитните пътища, водещи до пеницилин G и цефалоспорин С, до междинните продукти и до ензимите, които осъществяват включените трансформации.
•Шйл-’
L-алфа - аминоадипинова киселина + L-цистеин + L-валин
ACV СИНТЕТАЗА
(L) ноос h2n
О
LLD - ACV
ИЗОПЕНИЦИЛИН N СИНТЕТАЗА (IPNS) (L)
НООС h2n
ИЗОПЕНИЦИЛИН N (IPN)
IPN АМИДОЛИАЗА • · • · • · · ·
АЦИЛ СоА: 6 - АРА
V АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗА
ФЕНИЛАЦЕТИЛ СоА
ПЕНИЦИЛИН G (Ц
Н
ZN \ 0 соон
ИЗОПЕНИЦИЛИН N (IPN) • · • · • · • · · · ···· · · · · ¢-1• · ····· · ·· ···»·*· • · ····· «и
ИЗОПЕНИЦИЛИН N (IPN)
IPN ЕПИМЕРАЗА ν
ФЕНИЛАЦЕТИЛ СоА
(D) h2n ноос
ПЕНИЦИЛИН N
РЕНИЦИЛИН N
I ЕКСПАНДАЗА • · • · • · · · • · · ··«· · · · · · · · • · ····· · ·· ·····♦· • · ····· ··
Ο Η
| h2n | II I | ||
| HOOC | ζχ^/С-N x | V4 | |
| J | |||
| Ό | T | XCHc | |
| COOH |
ДЕЗАЦЕТОКСИ ЦЕФАЛОСПОРИНОВА КИСЕЛИНА (DAOC)
DAOC3’ -ХИДРОКСИЛАЗА • · • · • · • · · · • · ··«» ·· ♦ · · · · • · ····· · ·· ······· ·· ····· ·· (D)
H2N
HOOC
CH2OH
ДЕЗАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРИНОВА КИСЕЛИНА (DAOC)
DAOC АЦЕТИЛТРАНОФЕРАЗА • · • · • · • · · · • · 9 · ♦ · · · · · · • · ····· · · · ······« ·· ····· · · (D)
HaN
HOOC
CH2OOCH3
OOOH
ЦЕФАЛОСПОРИН C • · · ·
ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Настоящето изобретение се отнася до нов биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, включващ следните етапи:
1) култивиране в хранителна среда, способна да осигури неговото израстване, щам на Penicillium chryaogenum, който произвежда изопеницилин N, и добавяне към посочената среда на адипатна хранителна среда, съдържаща адипиноеа киселина или една или повече от нейните соли и естери, които могат да бъдат асимилирани и използвани от споменатия щам на Penicillium chrysogenum за получаването на адипоил-6-аминопеницилинова киселина, чрез който е полужчена цитираната адипоил-6-аминопеницилинова киселина;
в който щамът на Penicillium chrysogenum се трансформира чрез ДНК кодиране на активността на ензима експандаза, даващ възможност за приемане на адипоил-6-аминопеницилиновага киселина като субстрат, след което в резултат на неговата експресия същата тази адипоил-6-аминопеницилиновага киселина, получена от посочения щам, разширява пръстена си in sttu до образуване наадипоил7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина; и
2) Свързване на получената адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина с адипоиласилаза, чрез която адипоиловата странична верига се отстранява и се получава 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, която след това бива изолирана.
Кактоса използвани, следните термини имат съответните определени значения: „адипоил-6-АРА“ означава (2S-(2 α , 5 α , 6 β )]-3,3-диметил-7-окси-6[(хексан-1,6-диоил)амино]-4-тио-1-азабицикло-[3.2.0]хвптан-2-карбонова киселина; и „адипоил-7-ADCA“ означава 7-[(хексан-1,6-диоил)амино]-3-метил-8-оксиб-тио-1 -азабицикло-(4.2.0)-<жт-2-ен-2-карбонова киселина.
По-специално, настоящето изобретение се отнася до нов метод за получаване на7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), цитирани по-горе, при който адипатната хранителна среда е динагриев адипат, кодиращата активността • · · · • · ···· ·· · · · · · • · ····· · ·· ······· ·· ····· ·· ·· ·« ·· · · ·· · на ензима експандаза ДНК е получена от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и при които адипоилацилазата е получена от вида Pseudomonas.
Освен това настоящето изобретение се отнася до рекомбинативен ДНК експресионен вектор, съдържащ кодираща активността на ензима експандаза ДН К, получена от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, и промотор, които стимулира експресията на кодиращата експандазната активност НКА, съдържаща плазмиден pPenFTSO, както е описано в следващата част.
Настоящето изобретение се отнася и до клетката на гостоприемника Peniciliurn chrysogenum, трансформирана с рекомбинативен ДНК експресивен вектор, w съдържащ ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, получен от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и промотор, който стимулира експресията на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, съдържаща промотор на синтатазния ген на Penyciffium ohrisogenum изопеницилин N (IPNS).
По-специално, настоящето изобретение се отнася до клетката на гостоприемника PenicHBum chrysogenum, трансформирана с рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ плазмиден pPenFTSO, както е описано в следващата част.
Настоящето изобретение се отнася също така и до метод, съдържащ етап на .. култивиране на клетка на гостоприемника -рекомбинативен Perdcillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при който метод клетката на рекомбинативния гостоприемник съдържа рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, получен ст Streptomyces clavuligerus ATCC 27064 и промотор, който стимулира експресията на ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, съдържащ промотор на ген на Perricillium chrysogenum IPNS. По-специално, настоящето изобретение се отнася до метод на култивиране на клетка на гостоприемника - рекомбинативен Penicillium chrysogenum при условия, подходящи за генна експресия, при който метод клетката на рекомбинативния гостоприемник съдържа рекомбинативен ДНК експресивен вектор, съдържащ плазмиден pPenFTSO, както е описано в следващата част.
• · · · · · • · ·
Главният аспект на настоящето изобретение е създаването на един нов метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), която е ключово междинно съединение при получаването на синтетичен цефалоопорин търговски продукт, който може да бъде преставен със следната структурна формула.
СНз
Освен цефалоопориновите ядра, отличителни черти на
7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина са 7-еминогрупатаи З-метиловата група. 7-аминогрупата е група, която може да се превръща във всяка една производна странична верига и това е основата на синтеза на различните търговски продукти цефалоспорини. Обикновено, но не винаги, З-метиловата група трябва (както е в случая с цефалексина) да се превърне в някаква друга странична верига, за да се синтезира търговски продукт цефалоопорин.
Полученият по този метод 7-DDNA може да се различава от цефалосорин С друго ключово междинно цефалоспориново съединение, което може да бъде представено със следната структурна формула: О
HgN
ноос
3-ацетоксиметиловата странична верига на това съединение може да се яви приемлива за търговските цефалоспоринови продукти.
7-(0)-о>аминоадапоиловата странична верига, обаче, не е приемлива за следващите • · · · • · · · ·· · ··· ···· ·· · ···· • · ··· · · · · · ······· • · ····· · · синтезни производни и трябва да се отцепи, за да се получи приемливата 7-аминогрупа. За съжаление, 7-(0)-а-аминоадипоиловата странична верига създава винаги затруднения с отцепването си, както по химичен, така и по биологичен път. Дефиниции
В смисъла, в който са използвани в настоящата спесификация, следващите термини имат съответните определени значения:
| 7-ADCA | 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина |
| 6-АРА | 6-аминопеницилинова киселина |
| DAOC | Дезацетоксицефалоспоринова киселина |
| DAOCS | DAOC синтетаза |
| DAC | Деацетилцефалоспорин |
| DACS | DAC синтетаза |
| IPNS | Изопеницилин N синтетаза |
| Tris | Tris [хидроксиметил]аминометан |
| EDTA | Етилендиаминтетраоцетна киселина |
| DEPC | Диетилпирокарбонат |
| ТЕ | Буфер Tris/Етилендиаминтетраоцетна киселина |
| SSC | Буфер сол (натриевхлорид), натриев цитрат |
| SDS | Натриев додецилсулфат |
| PEG | Полиетиленгликол |
Култивиране на PeniciMum chrysogenum
Първият етап от метода на настоящето изобретение се състои в етап на култивиране в хранителна среда, способна да осигури неговото израстване, на щам на PeniciHium chrysogenum, който произвежда изопеницилин N, и добавяне към посочената културна среда на адипатна хранителна среда, съдържаща адипинова киселина или нейни соли и естери. Адипатната хранителна среда може да бъде прибавена към културата след инокулация с PeniciHium chrysogenum. но за • · · · • ·
• · · предпочитане е тя да присъства в културната среда по времето, когато се извършва инокулацията. Адипиноеата киселина или нейните соли или естери трябва да бъдат такива, че да могат да бъдат асимилирани и преработени от посочения щам на Peniclllium chrysogenum. така че да се получи адипоил-6-аминопеницилиноеа киселина; в която щамът на PenlcilWum chrysogenum се трансформира посредством кодираща активността на ензима експандаза ДНК, при което като резултат на неговата експресия въпросната адипоил-6-аминопенииилинова киселина разширява пръстена си In stu до получаване на 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
Други видове от гените Peridium. наред с вида chrysogenum също произвеждат изопеницилин N. До сега, обаче, най-продуктивният щам на изопеницилин N винаги е получаван чрез добре познатата техника на преобразувания в щама от вида chrysogenum. От практическа гледна точка настоящето изобретение се ограничава до щамове на РепюИМит chrysogenum, но неговата приложимост към други видове е очевидна. Всеки наличен щам на Peridium chrysogenum или друг наличен източник на такъв щам са подходяща изходна точка за изпълнение на метода на настоящето изобретение.
Хранителната среда, годна да осигури израстването на щама на Penicillium chrysogenum, който произвежда изопеницилин N, е от типа среди, с които работещите в тази област са добре запознати. Например, култивирането може да се проведе чрез метода на субмаргинална аеробна ферментация, като използваната среда може да бъде избрана измежду многото налични подходящи среди. Една типична среда използва като източници на въглерод захароза, глюкоза и нишесте; като източници на азот соево брашно или трици, памуково масло, фъстъчено брашно и различни аминокиселини, смеси от тях и пептони. Производството изисква висок добив и лесно изолиране на съединението. Предпочитана среда, която отговаря на тези изисквания, е съдържащата меласа - като източник на въглерод и соево брашно и аминокиселини - като източник на азот.
Обикновено към културната среда се прибавят хранителни неорганични соли. Те включват соли, които предоставят следните йонни компоненти, натриеви, калиеви, • · • · • · · · • · · ···· ·· · · · · · • · ····· · ·· ······· • · ····· · · ·· ·· ·· · · · · · амониеви, калциеви, фосфатни, сулфатни, хлоридни, бромидни, нитратни, карбонапгни, феро-, фери-, магнезиеви, манганови и др. Микроелементите обикновено също са от значение за растежа, развитието и метаболизма на PenlcIHIum chrysogenum и могат да бъдат прибавяни директно към хранителната среда, освен ако вече не са налични под формата на онечиствания на другите съставки на хранителната среда.
Когато се изисква да бъде произведено само малко количество 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, щамът на Penlcllllum chrysogenum може да се култивира в съоръжение с малък обем, например кпатачна колба с обем 1 I. Когато е необходимо да се произведат по-големи количества адипоил-7аминодезацетокоицефалоспсринова киселина, обаче, се използват годямогабаригни ферментационни съдове в условията на субмаргинална аеробна ферментация.
При получаване на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, в голям мащаб, спорите на щама на Penicilium chrysogenun се хранят върху поставен под наклон агар. Остърганите от агара спори се използват за инокулиранв на вегетативна среда с малък обем. Вегетативната среда се инкубира, за получаването на обилна, свежа, активно размножаваща се култура от микроорганизми. Това вегетативно образувание след това се използва за инокулиране на ферментационна среда в голям мащаб. В определени случаи може да е необходимо да се включи допълнителна вегетативна среда като инокулант за ферментационната среда. Включването на втора вегетативна среда обикновено се прилага, когато обемът на ферментационната среда е значително по-голям от обема на първата вегетативна среда. В този случай спорите на микроорганизмите първо се култивират в малък обем вегетативна среда за получаването на инокулант за големия обем вегетативна среда. По-големият обем вегетативна среда впоследствие осигурява достатъчна концентрация микроорганизми за инициране набързо започване на ферментацията в голямогабаритния ферментационен съд. Вегетативната среда може да има същия състав както ферментационната среда или може да съдържа допълнителни съставки, които да стимулират растежа и развитието на микроорганизмите в малък мащаб.
· · · · • ·
Щамовете на Penicillium chrysogenum, използвани в метода на настоящето изобретение, най-ефективно се култивират при температури межда 2СРС и ЗОРС, като оптимални добиви се получават, когато температурата е между 22°С и 28°С, и за предпочитане - около 25°С.
Максимална продукция на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се получава, когато щамът на Penicillium chrysogenum е култивиран в голямогабаритни вани за период между 10 и 30 дни, за предпочитане στ 15 до 25 дни. Когато се култивира, обаче, в съоръжение с малък обем, например клатачни колби с обем 250 ml, растежът на микроорганизмите е много бърз и адипоил-7аминодезацетокоицефалоспоринова киселина се произвежда за много по-кратък период от време, например от 4 до 15 дни и най-често - от 5 до 7 дни.
Ако крайното pH в голямо габаритните ферментационни вани достигне 8.0 или по-висока стойност, добивът на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина може да се повлияе неблагоприятно. При такава ситуация е желателно да се регистрират стойностите на pH на културната среда по време на ферментацията. В случай, че pH достигне тази стойност преди времето на максимален добив на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, pH трябва да се понижи чрез добавяне на подходяща киселина или буферен агент към ферментационната среда. Получаването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина може да бъде последвано отхроматографски анализ на образци от ферментиралата среда.
Както при повечето субмаргинални аеробни ферментации през културната среда се пропуска стерилен въздух, за да се постигне по-ефективен растеж на щама на Penicillium chrysogenum и за да се увеличи добивът на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Обемът на пропускания през културната среда въздух е приблизително поне 0.2 обем въздух на минута на един обем културна среда. Едно увеличение на скоростта на преминаващия въздах, обаче, влияе благоприятно върху добива на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
···· ·· · · · · · • · ··· · · · · · ··· ···· ·· ····· ··
Обикновено щамът на Penicillium chrysogenum наред с адипоил=7= аминодезацетоксицефалоспоринова киселина произвежда редица странични продукти и метаболити. Тъй като някои от тях са киселинно неустойчиви, желателно е при възстановяването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина от ферментационната среда цялата ферментащюнна среда да се обработи за кратко време при едно кисело pH, с цел да се разградят някои от успоредно получените онечиствания. ферментното съединение адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се възстановява от филтруванага и обработена ферментационна среда и при желание може да бъде отделен от останалите компоненти на ферментационната среда чрез йонообменна хроматография и ако е необходимо, може допълнително да се пречисти хроматотрафски преди следващия етап на отцепване на адипоиловата странична верига. Възможно е след отцепването на страничната верига да се направи също разделяне чрез йонообменнахроматография. Един от главните странични продукти, представляващ проблем по отношение на разделянето, е адипоил-6аминопеницилинова киселина. За да се облекчи разделянето, възможно е този страничен продукт да се разгради по химичен или по ензимен път. Първоначално филтруваният ферментационен продукт се подлага на предварителна процедура на пречистване, която включва първа екстракция с несъвместим с вода органичен разтворител, например n-бутанол или амилацвтат, с цел да се отстранят онечистванията. След това екстрахираната среда може да се пречисти по предишния начин чрез екстракция и чрез хроматография върху активиран въглен.
Добавяне на адипатна хранителна среда
За предпочитане, в момента, в който ферментационната култура за Penicillium chrysogenum е установена по гореописания начин, т.е. преди инокулацията, към останалите компоненти на ферментационната културна среда се добавя адипатна хранителна среда При желание адипатнагахранигелна среда може да бъде добавена • · • · ···· ·· · · » * · • · ··· · · · ·· ···«··· • · ····· · · и в някой момент след инокулацията - например 1,2 или 3 дни след инокулацията.
Адипатната хранителна среда се дефинира като адипинова киселина или една или повече от нейните соли или естери, които да могат да бъдат асимилирани и преработени от щама на Penicillium chrysogenum, култивиран, за да произведе адипоил-6-аминопеницилинова киселина. Адипиновата киселина, солите и естерите и могат да бъдат използвани поотделно или във всяка една комбинации. Динагриевага сол е предпочитана, но подходящи са и калиевата сол и смесените соли с натриевата сол. Може да се използва метиловия естер, но неразтворим във вода е етиловият естер. Адипиновата киселинна сол или естер трябва да бъдат такива, че да могат да бъдат асимилирани и преработени от щама на Penicillium chrysogenum, култивиран, за да произведе адипоил-6-аминопеницилинова киселина. Например, адипиновата киселина сама за себе си може да бъде подходяща, още повече че тя е неразтворима във вода, в случай, че при правилно подържани условия по отношение на pH, се образува асимилируема сол.
Подходящи експандазни ензими
Щамът на Penicillium chrysogenum, култивиран и осигурен с адипатна хранителна среда, съгласно описания по-горе начин, така че да произведе адипоил-
6-аминопеницилинова киселина, етози, който трябва да бъде трансформиран в ДНК, кодираща активността на ензима експандаза, при което в резултат на неговата експресия едипоед-6-аминопеницилиновата киселина in stu разширява пръстена си, при което се образува адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориноеа киселина.
Адипоил-б-аминопеницилиновата киселина е произведена вътрешноклетъчно от култивиран с адипатна хранителна среда Penicillium chrysogenum. При това вътрешноклетъчно образуване, т.е. in situ, трансформираният Penicillium chrysogenum също експресира кодиращата активността на ензимаекспаедаза ДНК, при което ензимът действа върху адипоил-6-аминопеницилинова киселина като субстрат и разширява пръстена и до адипоил-7-аминодезацет<жсицефалоспоринова • · · · • · ····· · · · ··«···· ·· ····· ·· киселина.
Новият биологичен метод от настоящето изобретение включва в своя обсег трансформацията на щама на Penlollllum chrvsogenum по описания по-горе начин с всяка кодираща активността на експандазния ензим ДНК, при което в резултат на неговата експресия адипоил-в-аминопеницилиновата киселина In situ разширява разширява пръстена си до образуване на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. ДНК, посредством която е трансформиран PenlcHHum chrysogenum, трябва да експресира ензим, който има • не само активността на експандазен ензим, т.е. да може да разшири пръстена на изопеницилин N до дезацетоксицефалоспоринова киселина, но да е в състояние и да разшири пръстена на адипоил-6-аминопеницилинова киселина до адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Очаква се, обче, че в случай че има аналогична страничната верига, всеки експандазен ензим може да бъде използван в новия биологичен метод на настоящето изобретение.
При описанието на предшестващите работи вече бе отбелязано, че ензимът експандаза, получен от Streptomyces ciavuligerus ATCC 27064, има пълна последователност и е охарактеризиран чрез създаване на ендонуклеазна рестрикционна карта. Ензимът, получен от Streptomyces ciavuligerus NRRL 3585, може да бъде взет за същия ензим, но за него се съобщава различно молекулно тегло и той не е подреден последователно.
Разширяващите пръстена ензими, посочени в предшестващите работи, могат да бъдат използвани в новия метод на настоящето изобретение. Други неспецифицирани досега разширяващи пръстена ензими, получени от различни щамове на Streptomyces ciavuligerus, а дори и от микроорганизми от различни генерации, могат също да се окажат подходящи за осъществяване на новия метод на настоящето изобретение. Процедурите по специфицирането на тези нови щамове и видове полезни микроорганизми, както и за изолирането на предполагаемите експандазни ензими и оценяване на тяхната приложимост в метода на настоящето изобретение, са прости и добре известни на работещите в тази област. Изолирането • · • · · · • · · • · · · · · · ··· ···· · · « е « « · • · · · · · · · · · »···»·· • · ····· · е на свободни от клетки екстракти от тези нови щамове и видове полезни микроорганизми може да стане по изпитан и възпроизводим начин чрез добавяне на екстрактите към субстрат от адипоил-6-аминопеницилинова киселина в присъствието на известни ко-фактори - DAOCS, които съдържат феройони (Fe2*), аскорбат, а -кетоглутарат и аденозинтрифосфат (АТР). Субстратът от адипоил-6аминопеницилинова киселина може да бъде изготвен в достатъчно количество чрез захранване с адипагна хранителна среда на Penicillium chrysogenum по начин, аналогичен на описания подробно по-долу. Желаният експандазен ензим е наличен в случай, че се образува адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, чието наличие се установява похромагографски път.
Възможно е също така при използване на добре известната рекомбинативна техника да се получат образци от ДНК, основаващи се на експандазната последователност на Streptomyces clavullgerus и на Cephalosporlum acremonium, например, за да се отдели съдържащата се в микроорганизмите ДНК, както и да се произведе експандаза, подходяща за използване в метода на настоящето изобретение.
Потенциални източници на експандазни ензими
Разширяващите пръстена ензими (експандазни ензими), са ензими, които катализират разширяването на петчленните пръстенни структури (открити в молекулите на съединения от пеницилинов тип) до cef-3-em пръстени (открити във цефалоспориновите съединения). Всеки организъм, произвеждащ метаболити, съдържащи cef-em пръстени, следователно, е потенциален източник за една кодираща експацдазата ДНК. По-долу са изброени примери за такива организми, но този списък е примерен и не трябва да се счита за изчерпателен:
·· · •* ·· ·· ···· ···· ·· · ··« ···· ·· · ·-«· • * ··· · · · · · ··» ···· • · е · · · · β «
...........
фунгициди:
Cephalosporium acremonium
Cephalosporium sp.
Emericellopsis
PaecHomyces
Scopulariopsis
Diheterospora
Spiroidium
Anoxiopsis w
Актиномицети:
Streptomyces clavuliqerus
Streptomyces Upmanii
Streptomyces wadayamensis
Streptomyces todorominensts
Streptomyces filipinensis cephamycini
Streptomyces heteromorphus
Streptomyces panayensis
Streptomyces griseus
Streptomyces cattleya
Nocardia lactamdurans
Други бактерии:
Havobacterium sp.
Alcaliqenes denitrificans
Mycoplana bulata
Prwidencia rettgeri
Lysobacter lactamgenus
Експандазите на изброените по-горе организми са само кандидати за допълнителни изследвания и е възможно не всичките да са подходящи по отношение на новия метод на настоящето изобретение. Например, използването на ензими.
• · · · · · които притежават едновременно експандазна и хидролазна активност, например ензимът Cephalosporlum acremonlum, може да доведе до синтезиране на хидроксилирана адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, т.е. до деацетилцефалоспорин с адипоилова странична верига.
Изолиране на фрагменти от ДНК, кодиращи активността на експандазата
След като се установи по описания по-горе начин наличието на разширяващия пръстена ензим, процедурите за изолиране на кодиращата експандазната активност ДНК са прости и добре известни на работещите в тази област. Конструирани са образци от ДНК, основаващи се на известната последователност или на частичната последователност на гените, кодиращи експандазните ензими, които се хибридизират към желаната комбинация ензим-кодираща ДНК, за да бъдат изолирани. Конструкцията на тези образци се основава на познанията върху аминокиселините и на нуклеотидните последователности, кодиращи ензима експандаза, както и на предимствата на кодона на допълнително включените микроорганизми. По-долу са описани подробно типичните процедури от този тип, приложени върху геномната ДНК на Streptomyces clavuHgerus AT CO 27064.
Изолирането на кодиращата активността на експацдазния ензим ДНК, се осъществява чрез използване на процедури на рестрикция и лигиране, които са добре известни в технологията на рекомбинация на НДК. Необходимо е да има ендонуклеазна рестрикционна карта на на генома на включените микроорганизми, така че да бъде получен и изолиран подходящият рестрикционен фрагмент. Вече съществуват рестрикционни карти на Streptomyces clavuHgerus и на Cephalosporium acremonium; рестрикционните ензими Bam HI и Sal I по-рано са използвани и чрез електрофореза са получени желаните фрагменти с размери 1.8 до 2.2 kb. Трансформация на щамът на Penicillium chrysogenum
След като веднъж са получени фрагментите на ДНК, кодиращи експандазната активност, те могат да бъдат вградени в плазмид или в друг експресионен вектор заедно с фрагменти от ДНК, съдържащи активиращи транслацията последователности, устойчиви сигнални гени, регулаторни последователности, • · · · · · • · · · • · ·· • · ·· • · · · · · • ·· • · · ·
• ·· • ·· • · ·· • · · · · · · образуващи козмиди и всякакви други последователности, които разрешават или стимулират трансформацията, подпомагат експресията на генния продукт и улесняват изолирането на трансформантите. Така конструираният експресионен вектор след това се използва за извършване на трансформацията на щама на PenicMIium chrvsoqenum и вътрешноклетъчната експресия на активността на експандазния ензим. Техниката, използвана за осъществяване на трансформацията и на експресията е добре известна По-долу допълнително е дадено подробно описание на типичните за нея процедури.
Както вече беше показано по-горе, трансформираният щам на Penlcllllum chrysogenum експресира вътрешноклетъчно активността на експандазния ензим, който след това действа in situ върху адипоил-6-аминопеницилинова киселина, разширявайки пръстена и до получаването на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
Нов трансформант
Специфичният трансформант Penlcllllum chrysogenum, експресиращ активността на експандазния ген, който е предпочитаният обект на настоящето изобретение, е нов по отношение на съществуващите в предишните работи конструкции, например в Cantwell et al. (1990) Current Genetic, 17,213-221. И в двете конструкции мутагенезата е използвана in vitro за свързване на промотора с експандазния ген. В конструкцията на Cantwell се въвежда Ndel място при ATG на експандазния ген, който е свързан към Xbal място при 3' края на изопеницилин N сингетазкге промотор чрез Xbal/Ndel връзка. В конструкцията от настоящето изобретение се създава Ncol място при 3* края на изопеницилин N синтетазната връзка. Това създава следната последователност около връзката промотор-ген в тези конструкции;
• · · · · ·
Xbal Ncol
IFNSrpoMorop • ··· • · ·· • · ·· • · · · · • ·· • ·· ·
5’ TCTAGAGACCATGG 3’ • 9 · • · • · · • · · · · · · • ·
ПОСПДОВАТЕЛНОСТ
ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:1
Streptomfces
5’ GTGAGAGTTGATGGAC 3*
П0СЛД01
ЗАТЕЛНОСТ
ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:2 експандаза
| Cartwdl | 5’ | TCTAGACACTATGGAC | З1 |
| Настоящо изобретение | 5’ | TCTAGACACCATGGAC | 3* |
ПОСПДОВАТЕЛНОСТ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:3 ПОСПДОВАТЕЛНОСТ ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:4
Конструкцията на Cantwell замества С с Т, докато в конструкцията на настоящето изобретение С се запазва; последоватерността на промотора на изопеницилинсинтетаза N се ориентира незабавно към началния кодон ATG, което точно съответства на това, което се открива в природния изопеницилин N синтетазен ген. Възможно е, промоторзт от предишната работа, въпреки че се различава само по единичната нуклеотидна база, да води до по-слаба транслационната ефективност и с това - до по-ниско ниво на експресия на експандазния ген.
Другите разлики са в областта на промотора и гена, включени в конструкциите. Конструкцията на Cantwell съдържа областите 5’ Bam HI до Xbal З’на изопеницилин N синтетазкгз промотор, докато векторът според настоящето изобретение съдържа областите 5’ Ncol до Ncol 3' на промотора [Diezq et dl., (1990), J. Biol. Chem. 265, 16358-16365]. Това води до приблизително 250 bps допълнително на 5’ края на промотора в конструкцията на Cantwell. Тази област, обаче е в отворената рамка на разчитане на синтетазния ген ACV нагоре по продължение на гена на изопеницилин N синтетазата.
Конструкцията на Cantwell съдържа също така и ген на Streptomyoes от ATG нъм Bam HI място 3’ на гена, докато векторът съгласно настоящето изобретение съдържа ATG към Sall място 3* на гена [Kovacevic et al., (1990), J. Bacterid., 171,754760]. Това води до приблизително 1000 bps от допълнителна 3’ крайна
• · • · · ·
• ·· • ·· ♦ · ·· • · · · · · · последователност в конструкцията на Cantwell. Конструкцията от настоящето изобретение съдържа участък upstream от експандазния ген на място BamHI 5’ на ATG; тя, обаче, е разделена от рамката на разчитане на експандазния ген чрез изопеницилин N синтетазния промотор.
Друга разлика в построяването на настоящето изобретение и описаното в предишните работи се отнася до използването на селективен маркер. Използването на смес промотор-Penicillium изопеницилин N синтетаза:флеомицинов ген в конструкцията на настоящето изобретение спомага за избора на интегриране на многобройни копия или интегриране на местата, което дава високо ниво на w експресията, а с това може да доведе и до по-висок процент трансформанги, с което експресира експандазния ген на високо ниво.
Нов трансформант от описания по-горе тип е Penicllium chrysogenum, означаван като РС100. Неговата характеристика обикновено включва производството на широко разпространени колонии - синьо-зелени до зелени на цвят гладки като кадифе с жълти точки; променят цвета си в жълт при дифундиране в агар; разклонени конидиални глави, като всичките им части са гладки; елиптична до кръгла конидия с дължина 3-4 mm. Приемливите условия за култивиране на Penicillium chrysogenum включват използване на твърда среда, съдържаща монохидрирана лактоза -1.5% (тегло/обем); разтвор за накисване на зърното - 0,5% (обем/обем); пептон - 0.5% (тегло/обем); NaCI -0.4% (тегло/обем); MgSO4.7 Н2О -0.05% (тегло/обем); КН2РО4 0.06% (тегло/обем); ΡθΟζ.θΗ,,Ο -0.0005% (тегло/обем); CuSO4.5H2O - 0.0002% (тегло/ обем); агар -3% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода, pH 4.8. Току що описаният Penicillium chrysogenum и означен с РС100 е депозиран с Американска типова колекция на култури (АТСС), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, под каталожен номер АТСС 74182 (дата на депозита: приет на 21.08.1992 г., потвърдена валидност на 27.08.1992 г.).
Отцепване на адипоиловата странична верига
Следващият етап на новия биологичен метод от настоящето изобретение е отцепването на адипоиловата странична верига от адипоил-732 аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, което изисква обработка на съед инението, получено в предишния етап садипоилоеа ацилазна ензимна система. Както вече беше отбелязано по-горе, едно от значителните постижения на настоящето изобретение е възможността всичките етапи, водещи до образуването на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, да се извършат в една единствена ферментационна култура. Това постижение осигурява изключително повишена ефективност стова, че не трябва да се изолират и пречистват междинните продукти от отделни етапи на процеса. В този последен етап, обаче, не присъства адипоилова ацилазна ензимна система, т.е. не се образува in situ в оригиналната ферментационна култура.
Ако новият биологичен метод от настоящето изобретение се реализира в затворена система (на отделни партиди), тогава ще бъде необходимо да се изолира и частично да се пречиства съединението, получено в предишния етап, като предварителните процедури за това са вече описани по-горе.
Въпреки всичко, методът от настоящето изобретение може да се реализира по всеки от начините, който ефективно води до взаимодействие на адипоилаиртлазага с адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновета киселина, така че да протече ензимно превръщане на съединението в 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. Терминът „взаимодействие“ тук се използува в неговия най-широк смисъл. Възможно е да се използва свободна от клетки среда от непречистена адипоил-7аминодезацетоксицефалоспориноеа киселина като хранителен поток и да се обработи в затворена сисгемас адипоилацилазен бульон. По този начин се постига известна ефективност, тъй като не е необходимо доплнително първоначално пречистване на реагентите. Разбира се, възможни са модификации. Например, реагентите могат да бъдат пречистени до някакво желано ниво преди да се приведат в контакт помежду им. Също така, възможно е методът да се реализира в непрекъснат режим вместо на отделни партиди. Взаимодействието между реагентите може да се модифицира по различни начини при запазване на предимствата на технологията на процеса. Така например, може да бъде използван • · · · несвързан ензим, например под формата колона, съдържаща едипоилацилаза, с преминаване на аднпоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина през колоната. Несвързаният ензим може да бъде прибавен към адипоил-7аминодезацетоксицефалоспориновата киселина под формата на суспензия. Такава свободна ензимна система предлага предимствата на лесно освобождаване на ензима и многократното му използване. Друга реализация на тази технология е свързана с използването на мембранни реактори. Предпочитаният метод за осъществяване на взаимодействие между реагентите е използването на колона с несвързан (свободен) ензим.
Адипоилацилазни ензими, използваеми в етапа на отцепване
Съществуват редица ензими с известна специфичност към адипоиловата странична верига. Получените резултати с адипоилацилаза -търговски продукт на RAEV Corp., са описани в следващите работни примери. В литературата са цитирани 7 други ензима, отцепващи адипоиловата странична верига от молекули от цефалоспоринов тип. Шест от тези седем ензима са от вада Pseudomonas, а седмият е от вада Bacillus· Съществува известна прилика между ензимите от Pseudomonas, но и седемте ензима се различават в известна степен по своите физично/биологични свойства. Някои от техните характеристики са обобщени по-долу:
• · · ·
| ЕНЗИМ (щамове на Pseudomonas и Baccilus) | УКАЗАНИЕ | ПРИБЛИЗИТЕЛНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО (субединици) |
| Pseudomonas SY-77-1 | Shibuya, et al. | Приблизително |
| (Toyo Jozo) | (1981) | като HaGK16 |
| Pseudomonas GK16 | Matsuda, Komatsu | 16 000 |
| (Asahi) | (1985) | 54 000 |
| Pseudomonas SE83 (acyl) | Matsuda, et al. | 38 200 |
| (Asahi) | (1987) | 19 900 |
| Pseudomonas SE83 (acvli) | Matsuda, et al. | 25 400 |
| (Asahi) | (1987) | 58 200 |
| Pseudomonas dlmlnuta N176 | Aramorl, et al. | 58 000 |
| (Fujisawa) | (1991a)* | 26 000 |
| Pseudomonas dlmlnuta V22 | Aramorl, et al. | ? |
| (Fujisawa) | (1991a)* | ? |
| Bacillus laterosporus J1 | Aramori, et al. (мономерен) | 70 000 (1991b)** |
| Pseudomonas sp. | 16 000 | |
| (RAEV Corp.) | 54 000 |
* Aramorl, at al., J. Ferment. Bioeng. (1991) 72: 232-243.
** Aramori, et al. J. Bacterid. (1991) 173: 7848-7855.
Всичките изброени по-горе адипоиладалазни ензими могат да бъдат използвани в новия биологичен метод на настоящето изобретение. И други адипоилацилази, използваеми в метода на настоящето изобретение, могат да бъдат лесно открити посредством тестване на даден ензим спрямо адипоил-7аминодезацетоксицефалоспориновата киселина - действителният субстрат, върху който ензимът трябва да действа. Един положителен резултат би дал надежден и възпроизводим метод за определяне на използваемостта нададен ензим в метода на настоящето изобретение. Субстратът може да бъде изготвен по лесен начин чрез реакция на адипинов анхидрид със 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина • · · · при използване на една модификация на методиката, предложена от Szewczuk и Wellman-Bednawska в CHn. Chim. Acta (1978), 84,19-26. Адипиновият анхидрид може да бъде получен в съответствие с метода на Albertson и Lundmark, описан в J. Macromol. Sci. Chem. (1990) А27, 397-412. 7-аминсдезацетоксицефалоспоринова киселина се доставя от редица търговски фирми, в това число и E.R. Squibb & Sons, Ltd., New York и Interchem Corp., New York.
Ако е желателно да се направи грубо пресяване на ензима, който ще се използва, чрез използване на бърз колориметричен метод, субстратът от адипоил7^аминодезацетоксицефалоспоринова киселина може да бъде заместен временно с един колориметричен субстрат, например адипоил-РАВА (пара-аминобензоена киселина) или адипоил-PNA (пара-нитроанилин). Отцепването на страничната верига води до получаване на оцветени образци, чието присъствие и концентрацията им се определят с помощта на колориметър. За по-подробна информация относно този и други подходящи колориметрични методи виж Marelli, L.P. (1968) J. Pharm. Sci. 57: 2172-2173; Szasz, G. (1969) Clin. Chem. 15: 124-136; Szewczuk, A. et al. (1980) Anal. Biochem. 103:166-169; и Reyes, F. et al. (1989) J. Pharma. Pharmacol. 41:136-137.
Направено е сравнение между N-крайни аминокиселинни последователности на ензима на RAEV с високомолекулните ензими acyll и GK16, посочени в предшестващата таблица. Резултатите от сравняването са показани по-долу (където кръглите скоби показват по-малко решаващото отнасяне).
RAEV - ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:5:
S N (S) (G) A V A PG КТ AN G N A L (L) LQN (Р)
GK16 - ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:6:
SNS WAVAPG KTANGNALLLQN Р acyll - ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:7:
SNN WAVAPGRTATGRPILAGDP
От показаните последователности е очевидно, че тези пептиди са свързани. Протеин, имащ N-крайна последователност, аналогична на показаната по-горе, 35обаче, не трябва задължително да притежава адипоилацилазна активност, както • · • · · · е в случая с пеницилин-О^ацилазата, получена от щама на Arthrobacter. От друга страна, съществуват адипоилацилази, използваеми в метода от настоящето изобретение, които не притежават значителна прилика с горепосочената N-крайна последователност. Например, ацилазните ензими acyl на Asahi и Bacillus laterosporus Л на Fujisawa, описани в предшестващата таблица, които показват известна адопоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина-ацилазна активност, не споделят еднаква последователност с другите описани по-горе ензими. Освен това, обсегът на настоящето изобретение по отношение на адипоилацилазага, използвана във втория етап на новия биологичен метод, се определя от това, дали даден ензим е или не е в състояние да отцепи адипоиловата странична верига от адипоил-7аминодезацетоксицефалоспориновата киселина, факт, който може да бъде определян лесно и възпроизводимо, както е описано по-горе.
Възможни са и други подходи за намиране на подходящи адипоилацилази. Например, ЕРА-А-О 453 048 описва методи за повишаване на активността по отношение на отцепване на адипоиловата верига от страна на глутарилацилаза, получена с Pseudomonas SY-77-1. Чрез заместване на различни аминокиселини със съответни лакгони вътре в алфа-субединицата се наблюдава три до пет пъти поголяма скорост на отцепване на адипоиловата верига (от адипоил-серина). Такива усъвършенствани ензими са подходящи да бъдат използвани в настоящето изобретение. Трябва да се отбележи, че въпреки че ЕР-А-О-453 048 недвусмислено показва една ацилаза с повишена активност към адипоиловата странична верига, той не показва никакви намини (химични или чрез биологичен метод в някакъв смисъл аналогичен на описания в настоящето изобретение), по които на първо място трябва да се получи адипоил-цефалоспорин.
Следва детайлно описание на предпочитаните реализации на настоящето изобретение, които претендират само за илюстративен характер и по никакъв начин не ограничава настоящето изобретение.
• ·
ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
ПРИМЕР 1
Условия за получаване на култура на Peniciium chrysogenum
Щамът на Penicillium chrysogenum, използван в този метод, се поставя върху плочки, съдържащи среда LCSB, състояща се от монохидрирана лактоза 1.5% (тегло/обем); разтвор за накисване на зърното - 0,5% (обем/обем); пептон 0.5% (тегло/обем); NaCI Ό.4% (тегло/обем); MgSO4.7 Н20-0.0б% (тегло/обем); КН2РО4 -0.06% (тегло/обем); FeC^.6H2O -0.0005% (тегло/обем); CuSO45H2O -0.0002% (тегло/ обем); arap - 3.0% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода, pH 4.8. След престоянане в продължение на 12 дни при 25 °C и 65% относителна влажност, единичните колонии се отделят и се добавят към 2 ml стерилна вода в затваряща се на винт тръбичка, съдържаща стъклени перли. След умокряне на израстналата култура чрез създаване на вихрово движение натечността, суспензията се използва за инокулация на колби, съдържащи оризови зърна. Те съдържат 25 g на 250 ml колба преработен ориз Uncle Ben’s със зърна с естествена дължина, измит с три до четири обема дестилирана веда за около 7 минути при разбъркване всеки 30 секунда, след което ведата е отцедена, така че в ориза да остане около 25% от нея. След 12 дни при 25 °C и 65% относителна влажност спорите се измиват от ориза с 50 ml стерилна вода. Суспензията от спори се използва заинокулиране на течни култури, а също и за осигуряване на лиофили от култури за съхраняване при 4 °C. Спорите се прибавят към равен обем 5% обезмаслено мляко и се лиофилизират в стерилни ампули.
За получаване на пеницилини или за получаване на мицели като източници на дезоксинуклеинова и на рибонуклеинова киселина е използвана двустепенна ферментация на щама в клатачни колби. Зародашообразуването се инициира чрез ···· ·· · ···· • · ··· · · · · · ······· ·· ····· · · добавяне на 1 х 10* спори към 50 ml (в колба с обем 500 ml) среда, състояща се от глюкоза -3.0% (тегло/обем); фармацевтична среда -1.0 (тегло/обем); разтвор за накисване на зърното - 3.0% (обем/обем); амониев сулфат - 0.2 (тегло/обем); СаСО3 0.5% (тегло/обем); монокалиев анхидрофосфат -0.05% (тегло/обем); лактоза -1.0% (тегло/обем); първични сухи дрожди -1.0% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода. Инкубацията е при 25°С и 65% относителна влажност върху ротационна клатачна установка с амплитуда с диаметър 70 mm при 220 mirr1 . След 48 часова инкубация процесът се инициира чрез прехвърляне на 2 ml от вегетативния зародиш към 35 ml (в колба с обем 500 ml) среда със следния състав: КН2РО4 -0.05% (тегло/ обем); КН2РО4-0.5% (тегло/обем); (NH4)2SO4 -1.0% (тегло/обем); лактоза-12% (тегло/ обем); фармацетична среда - 2.75% (тегло/обем); СаСО3 (преципитат) -1.0% (тегло/ обем); свинска мас -1.0% (тегло/обем); в един литър дестилирана вода, pH 6.6. След поставяне в автоклав, но преди инокулирането, се прибавя стерилен 25% натриев адипат (pH 6.6), така че да се получи крайна концентрация на натриев адипат 2.5%. Инкубацията и следващатая инокулация след това продължават при същите условия както в етапа на зародишообразуване още 5 до 7 дни.
Когато са необходими мицели за получаване на протопласти за трансформацията или като източници на ДНК, щамът се отглежда в 50 ml (в колба с обем 250 ml) експериментална хранителна среда, съставена от: 50 ml от 20Х соли на Clutterbuck (120 g NaNO3 -10.4 g MgSO4.7H2O, 30.4 g KHjPOJ, 2.0 ml 2.0 ml микроелементи на Vogel (,3M лимонена киселина, 0.2M ZnSO4,25mM FeflNHJ^SOJg.e H20,10mM CuSO4, 3mM MnSO4, 8mM борна киселина, 2mM Na2MoO4.2H2O), 5 g тритгон, 5 g екстракт от мая, 10 g глюкоза в един литър вода. Инкубацията е при 25°С върху ротационна клатачна установка при 220 mirr'.
ПРИМЕР 2
Изолиране на Penicillium геномна ДНК и цялостна РНК
Вегетативният мицел, израстнал за 48 часа от култура, получена според описания по-горе начин, се събира чрез филтруване през марля, замръзява се в азот и се лиофилизира в продължение на една нощ. Изсушените мицели се раздробяват с пясък в хаван с пестик и се суспендират отново в 25 ml 100тМ Lid, г 50тМ етилендиаминтетраоцетна киселина, ЮтМ Tris pH 8.0, 4% натриев дсдецилсулфат. След загряване на суспензията до 50-55°С на водна баня с температура ДОС, сместа се екстрахира първо с буфериран с 1М Tris (pH 8) фенол, а след това с буферирана с Tris смес фенол:хлороформ (1:1 ,обем:обем) и накрая с хлороформ. РНК се утаява от водната фаза чрез добавяне на равен обем студен 6М Ud и оставяне на сместа да престои при -20РС в продължение на 2-3 часа. След центрофугиране 20 минути при 12 000 хд и при 4°С, към избистрения разтвор се добавя етанол, така че да се получи концентрация на етанола 66% (обем/обем), и се охлажда до -20 °C в продължение на 15 минути, за да се утаи ДНК. След центрофугирането по описания по-горе начин сбитата утайка се промива със 70% етанол, изсушава се и се суспендира отново в Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина (10mM Tris-HCI, pH 7.5, 1тМ етилендиаминтетраоцетна киселина). Концентрацията на ДН К се оценява чрез сравняване с познати еталони от ДН К при електрофореза в агарен гел и оцветяване с етидиев бромид. Култури на Penicillium chrysogenum, както са описани в Пример 1, се култивират 96 часа в 35 ml ферментационна среда (съгласно описаните преди това условия) при 25°С върху ротационна клатачна установка при 220 mirr*. Мицелите се събират чрез вакуумно филтруване през филтър тип Whatman, и се промиват с приблизително 50 ml вода. Мицелите се остъргват незабавно от филтъра, суспендират се отново в 5 ml „прекъсващ буфер“ (50mM Tris-HCI pH 7.4, 150тМ NaCI, 5тМ етилендиаминтетраоцетна киселина pH 8.0,5% натриев додецилсулфат),
* · · · · ·· · ···· замрьзяване в течен азот и лиофилизиране. След лиофилизиране в продължение на една нощ се добавят 5 ml вода, съдържаща 0.1% диетилпирокарбонат и 5 ml буфериран с 1М Tris (pH 8) фенол:хлороформ:изоамилов алкохол (50:50:1) и сместа се затопля до 37°С с разклащане в продължение на 20 минути. Сместа се центрофугира с 12 000 хд в продължение на 10 минути при 4°С, след което водният разтвор се екстрахира отново - първо с 1М Tris (pH 8)-наситен фенол:хлороформ: изоамилое алкохол (50:50:1), след това с буфериран с 1М Tris (pH 8) фенол и накрая с хлороформ. Равен обем 6М Lid се смесва с крайния воден слой и разтворът се оставя при -20 °C минимум 4 часа. Цялостната РНК се изолира под формата на уплътнена утайка чрез центрофугиране 20 минути при 12 000 хд при 4°С. Утайката се разтваря в 0.3 mi буфер ТЕ (Тпз-етилендиаминтетраоцетна киселина) плюс 0.03 ml ЗМ натриев ацетат и се прибавят 2.5 обема етанол, за да утаи РНК. Крайната утайка се разтваря в 0.1 ml Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина и се определя спектрофотометрично при отчитане на абсорбцията при 260 nm.
ПРИМЕР 3
Условия за получаване на култура на Sreptomyces clavuligerus
Използваният в тази методика щам на Streptomyces clavuligerus е АТСС 27064. Щамът се поставя върху плочки, състоящи се от дрожден екстракт - 4 д; малцов екстракт -10 д; глюкоза - 4 д; агар - 20 д; в един литър дестилирана вода, pH 7.2. След култивиране в продължение на 5 дни при ЗО*С към плочките се добавят 2 mi стерилна вода и порастналата култура се остъргва от повърхността на плочките. Получената суспензия се прехвърля в стерилна тръбичка със затваряне на винт, съдържаща стъклени перли. След умокряне на израстналата култура (чрез създаване на вихрово движение на течността), суспензията се използва за инокулация на течни култури. Чрез прибавяне на глицерол до концентрация 15% в крайния обем, суспензията може да се използва за продължително съхраняване на културата при
-70 °C.
Когато са необходими мицели за получаване на протопласти за трансформацията или като източници на ДНК, щамът се отглежда в 200 ml (в колба с обем 11) среда YEME, съставена от дрожден екстракт - 3 д; пептон - 5 д; малцов екстракт - 3 д; глюкоза -10 д; захароза - 340 д; МдЦ.бНз -1.02 д; глицин - 5 д; агар 18 д; в един литър дестилирана вода. Инкубацията се извършва при 28°С върху ротационна клатачна установка при 220 mlrr’.
ζ; ПРИМЕР 4
Изолиране на Streptomyces геномна ДНК
Вегетативният мицел, израстнал за 48 часа от култура, получена според описания по-горе начин, се събира чрез центрофугиране 10 минути при 22 100 хд. Клетките се суспендират отново в 10 ml буфер Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина, прибавят се 10 mg лизоцим и сместа се инкубира 15 минути при 30 °C. След това се прибавя 1 ml натриев додецилсулфат и веднага след него -10 ml буфериран с Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина (pH 8) наситен фенол и 1.5 ml dp&b'··
5М Nad Сместа се разклаща леко в продължение на 20 минути, фазите се разделят чрез центрофугиране в продължение на 10 минути, след което водният слой се отделя и прехвърля в пресна тръбичка. Прибавя се равен обем хлороформ и сместа се разклаща леко 10 минути. Фазите отново се разделят чрез центрофугиране 10 минути при 12 000 хд. Водният слой се отделя и отново прехвърля в пресна тръбичка. Внимателно се прибавят два обема изопропанол и утаената ДН К се разтваря отново в минимално количество Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина Добавя се RNAse А до получаване на крайна концентрация 20 mg/ml, заедно със 100 mM NaCI и 0.4% натриев додецилсулфат и сместа се инкубира един час при 37°С. Разтворът се екстрахира отново с равен обем буфериран с Tris-етилендиаминтетраоцетна киселина (pH 8) фенол, а след това и с хлороформ. ДНК, получена при последната • · екстракция, се отделя след прибавяне на два обема изопропанол и концентрацията и се определя спектроскопски при отчитане на абсорбцията при 260 nm.
ПРИМЕР 5
Конструиране на генна банка и изолиране на фрагменти от ДНК, съдържащи експандазен ген на Streptomyces clavuligerus
Streptomyces clavdtgerus геномна киселина, получена по гореописания начин, се смила с рестрикционните ензими Bam HI и Sai I. Смляната ДНК се подлага на електрофореза върху 0.8% агарозен гел и фрагментите с размер 1.8 до 2.2 kb се елуираг и лигираг към pUC18 ДНК, предаарително смляна с Bam HI и Sal I. Разтворите на лигиранета смес се използват за трансформиране на подготвени компетентни клетки JM109 при използване на елекгропорация (Gene Pulser, Bio-Rad, Richmond, СА). Подготвянето на компетентните клетки и условията на електропорацията са съгласно предписанията на производителя. Трансформационната смес се разстила върху плочки LB, съдържащи 100 mg/ml ампицилин и 75 ml 2% X-Gal. След инкубация при 37 °C в продължение на една нощ рекомбинантните колонии се идентифицират по тяхното обезцветяване, причинено от активността на плазмидния векторна бетагалакгозидазния ген. Безцветните колонии се остъргват и пренасят върху плочки, съдържащи 100 mg/ml ампицилин. След култивиране в продължение на една нощ при 37°С колониите се пренасят върху нитроцелулоза и се хибридизират с проба, получена чрез верижна реакция с пслимераза, която съответства на публикуваната експандазна генна последователност на Streptomyces clavdigerus от бази 52-918 [Kovacevic et al. (1989) J. Bacterid. 171: 754-760; и U.S. 5,070, 020]. Белязянето на продукта от полимеразната верижна реакция се извършва последством екстензионна реакция на произволен праймер с (32 Р) dCTP и с олигобележещ кит съгласно инструкциите на производителя (Pharmacia, Piscataway, New Jersey). Хибридизационната реакция се извършва в присъствието на 1CFCPM от белязаната с радиоактивен елемент проба, 30% формамид, 5Х SSC (0.15М NaCI, 0.015М натриев • · • · · • · цитрат, pH 7), 0.1% натриев додецилсулфат, 5Х Denhardt’s (5 g фикол, 5 g поливинилпиролидон и 5 g говежди серумен албумин за 500 ml на 50Х линия) и 100 mg/mi телешка тимусна ДНК, при 37°С в продължение на една нощ. Към пробата се хибридизират здраво редица трансформанти. Чрез рестрикционен ензимен анализ е установено, че една от колониите съдържа вектор, носещ експандазния ген и този плазмид е означен като pFTSO-1.
ПРИМЕР6
Изолиране наплазмидна ДНК
Култури от E.coli, съдържащи плазмид, се култивират в 500 ml базова бактериологична среда LB [20 g/l Broth Base (Gibco, Paisley, Scotland)] c 15 mg/ml тетрациклин върху ротационна клатачна установка при 220 mirr' в продължение на 12-16 часа при 37°С. Клетките се уплътняват чрез 10 минутно центрофугиране при 4000 хд и при 4°С. Уплътнените клетки се ресуспендират в 18 ml глюкозен буфер (50тМ глюкоза, 25тМ Tris pH 8.0,10тМ етилендиаминтетраоцетна киселина) и 2 mi 40 mg/ml лизозим (Sigma, St. Louis, МО), сместа се хомогенизира и се инкубира 15 минути при стайна температура. Добавят се 40 ml прясно приготвен разтвор на 0.2N NaOH и 1 % натриев додецилсулфат, сместа се разклаща внимателно (така че да се получи вихрово движение) и се поставя за 10 минути върху лед. Добавят се 30 ml 5М калиев ацетат, pH 4.8, разбърква се добре и получената смес се оставя да престои още 10 минути върху лед. Клетъчните остатъци се уплътняват чрез центрофугиране при 4000 хд в продължение на 10 минути при 4 °C. Полученият избистрен разтвор се филтрува през марлен филтър. Към бистрия разтвор се добавя изопропанол (0.6 обема), за да утаи плазмидната ДНК. Утайката се получава по време на инкубация при стайна температура в продължение на 20 минути. Плазмидната ДН Ксе уплътнява при центрофугиране 20 минути при 4°С и 4000 хд, след което се измива със 70% етанол и се изсушава за кратко време. Уплътнената утайка се ресуспендира в 9 ml • · a··· ·· · > * · ·
Z . ..· ....... ····
·..· ..· ·..··..· ..· ·
Trls-етилендиаминтетраоцетна киселина и към суспензията се добавят 10 g Csd и 0.387 ml 10mg/ml разтвор на етидиев бромид. Разтворът се центрофугира 24 часа при 313100 хд. Плазмидният слой, разположен в разтвора с градираща концентрация нацезиевия хлорид, се визуализира с помощта на ултравиолетова светлина, изолира се, след което етидиевият бромид се отделя чрез екстрахирано е наситен воден разтвор на бутанол. Използваният при получаването наплазмида CeCIce отстранява чрез диализа срещу Тг1з-етилендиаминтетраоцетна киселина. Накрая ДНК се концентрира при използване на полиетиленгликол (молекулна маса 8000). Концентрацията на ДНК се определя спектрофотометрично като се отчита адсорбцията при 260 nm.
ПРИМЕР 7
Конструиране на трансформационен вектор на PenlcWium pPenFTSO
Конструира се трансформационен вектор на Penicillium с флеомицинов устойчив ген като доминантен селективен маркер. Това се изпълнява първо като чрез електрофореза и следващо елуиране от агарозния гел се изолира фрагмент 660 Ьр, съдържащ флеомицинов устойчив ген (протеинов ген от Streptoalloteichus hlndustanus, свързващ флеомицин) и куплиран към дрожден цитохромен С1 терминагор, от смлян с Bam Hl/Bg1 II плазмид pUT713 (CAYLA, Toulouse Cedex, France). Изолираният фрагмент се лигира в Bam HI място на вектора pSELECT* 1 (Promega Corporation) и ориентацията на гена се определя чрез рестрикционен ензимен анализ. След това се лигира фрагмент 550 bp Pst I, съдържащ ламбда cosмясто, което дава възможност векторът да бъде използван за образуване на козмид при положение, че във вектора е включен фрагмент на ДНК с подходящ размер. Впоследствие от един смлян с Neo l/Bam HI геномен клон, съдържащ синтатазния ген на Penycllllum chrlsogenum изопеницилин N се изолира (чрез електрофореза върху агарозен гел и елуиране от него) фрагмент 1.5 kb Neo l/Bam HI, съдържащ • · промоторния участък на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N. Изолираният промоторен фрагмент на синтатазния ген на Penycillium chrlsogenum изопеницилин N се лигира в Neo l/Bam HI отделения вектор. Мястото Neo I се намира върху стартовия кодон ATG на флеомициновия устойчив ген. Този вектор се обозначава като pUTZ-2.
фрагментът (1.645 kb), съдържащ експандазният ген на Streptomyces clavuligerus, се пречиства от Bam HI и Sai I на pFTSO-1 (векторът, описан преди това) чрез електрофореза и следващо елуиране от 0.8% агарозен гел. Изолираният фрагмент се лигира във вектора pSELECT (Promega Corporation), също смлян c Bam
J#*»..
**** HI и Sal I. Този вектор се обозначава като pFTSO-8. Върху началния кодон ATG на експандазния ген се създава ново Neo l-място чрез насочена мутагенеза на pFTSO8, при използване на променящя местата in vitro мутагенна система Altered Sites * (Promega Corporation). Мутагенезата се провежда при предписаните от производителя условия. За да се допълни кодиращата последователност на участъка от ДНК върху началния кодон ATG от публикуваната последователност на експандазния ген на Streptomyces, се изгражда един олигонуклеотид [Kovacevic et al., (1990) Journal of Bacterloiogyq 171. p. 3952-3958], Олигонуклеотидът се синтезира по химически път от цианоетилфосфоамидит (Pharmacia Gene Assembler Instrumentation) и има следната последователност:
ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:8;
3‘ CGAGAGGATCAGTGAGAGTCCATGGACACGACGG 5’
Мутагенезата се потвърждава чрез ензимен рестрикционен анализ. След това фрагмент (1.2 kb Neo I), съдържащ промоторния участък на синтатазния ген на Penycillium chrlsogenum изопеницилин N,ce изолира (чрез алектофорезаи елуиране от агарозния гел) от Neo l/Bam HI отрязъка на геномен клон, съдържащ синтатазния ген на К изопеницилин N. Промоторната част на синтатазния ген на Penycillium chrlsogenum изопеницилин N се лигира във вектора pFTSO на ново Neo I място, създадено чрез мутагенеза върху началния кодон ATG на експандазния ген. Ориентирането на промотора към експандазния ген се определя чрез • · • · · · рестрикционен ензимен анализ. Тази касета - промотор на синтатазния ген на Penycillium chrisogenum изопеницилин N: експацдазен ген след това се отделя под формата на фрагмент Bam Hl/Sal I в Ват Hl/Sal I отрязъка на трансформационния вектор pUTZ-2 на PenicNHum, описан по-горе. Крайната конструкция е обозначена като pPenFTSO.
ПРИМЕР 8
Клониране на промотора на Penicillium β* -тубулин
Генът на Penicillium β* -тубулин се клонира от ламбда геномната банка на Penicillium при използване на ген на Aspergillus niger β-тубулин като хибридационна проба. Определянето на последователността на аминокиселините остатъци и сравняването с познатата аминокиселинна последователност на β-тубулиновия ген на Aspergillus niger показва област с 91% хомоложност, започваща с началния кодон ATG. Изолирани са последователности, съдържащи функционален промотор между началния кодон и Bam HI мястото 1.4 kb upstream.
Конструиране на трансформационния вектор, носещ промотора на Penicillium β -тубулин фрагмент 2.0 kb Xba l/HInd III, съдържащ промотор на Penicillium β -тубулин се литра във вектора pSELECT (PrcmegaCorporation) също смлян с Xba l/Hind HI. Върху стартовия кодон се въвежда ново Neo I място чрез насочена мутагенеза при използване на променяща местата in vitro мутагенна система (Promega Corporation). Мутагенезата се провежда при предписаните от производителя условия. Допълнително е изграден олигонуклеотид към ATG началното място, но това е свързано с редица промени, за да се създаде Neo I място, което да бъде използвано за мутагенезата. Олигонуклеотидът е синтезиран с помощта на цианоетилфосфоамидит (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) и има следната последователност:
• 4 • · • · · · • · • · · · · · • ·· ······· • · · · · • · · · ·
ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:9:
5’ ATCTCTTTTCTAATACCTTCACCATGGGTGAGATTGTACGTGATCCC 3’.
Мутагенезата се потвърждава чрез ензимен рестрикционен анализ. След това фрагмент 1.4 kb Bam H|/Nco I, съдържащ промоторна PenicWium β -тубулин се лигира към създадено Neo I място върху ATG на експандазния ген на Streptomyces в Ват Hl/Nco I digested вектор pFTSO-8 (вече описан в пример 7). Този вектор се обозначава с btFTSO-8. фрагмент 1.4 kb Bam Hl/Nco I, съдържащ β-тубулинов промотор също се лигира в Bam Hl/Nco I digested вектор pUTZ-2 (вектор, описан вече в пример 7). Вграждането позиционира β-турболиновия промотор директно на предната страна на флеомициновия резистентен ген. Този вектор се обозначава с pCI-в. След това фрагмент 2.4 kb Bam Hl/Hind III от вектора btFTSO-8, съдържащ β-турбулинов промоторна експандазна генна касета се лигира към Bam HI/HInd III digested вектор pCi-6, с цел да се получи крайният трансформационен вектор на Penicilllum, в който експандазният ген на Streptomyces и флеомициновия резистентен маркер се експресират от β-тубулиновия промотор. Този вектор се означава с pTS-2.
ПРИМЕР 9
Клониране на промотора на Penicilllum глицериналдехид-З-ФосФатдехидрогеназа (GAP)
Генът на Penlcillium глицериналдехид-З-ФосФатдехидрогеназа се клонира от Penicilllum ламбда геномната банка при използване на глицериналдехид-3фосфагдехидрогеназен ген на Aspergillus niger катохибридизаиионна проба. Четири потенциални позитива допълнително са изпробвани с продукта от полимеразната верижна реакция (PCR), получен от праймери за 5’ участъка на Cephalosporium глицериналдехид-З-фосфатдехидрогеназния ген [Kimura, Н. et al., (1991), J. Ferm, and Bloeng., 71, 145-150]. Олигонуклеотидите, използвани за праймерите на полимеразната верижна реакция (PCR) се синтезират с помощта на цианоетилфосфорамццит (PharmaciaGene Assembler instrumentation) и има следната • · · ·· · ··♦· • ····· · ·· ······· • ····· · · ·· · · · · ·· · последователност:
ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:10:
5’ CGCGGATCCCGGCATCAACGGCTTCGGTCGTAT 3’
ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:11:
5’ CGCGGATCCGGGCACGCGCATGGACATGCCAGTG 3’
Един от четирите предполагаеми позитива е напречно хибридизиран към продукта на полимеразната верижна реакция. За определяне на последователността на аминокиселинните остатъци фрагмент 4 kb Bam HI от този геномен клон се лигира в digested вектор pSELECT (Promega Corporation). Този вектор се означава с pTS-O. w Идентифицирането на инициращия кодон ATG става чрез сравняване на последователността на този фрагмент с познатата последователност на цефалоспориновия глицериналдехид-З-фосфатдехидрогеназен ген.
Конструиране на трансформационния вектор, носещ промотор на Penicillium глицериналдехид-З-фосфатдехидрогеназа (GAP)
За конструиране на промотор на Penicillium глицериналдехид-3фосфатдехидрогеназа (GAP) със Streptomyoes експандазния ген се създава ново Neo I масто в ATG на PenicHium глицеринапдехидЗ-ФосФатдехидрогеназния ген чрез ————— насочена мутагеназа In vitro при използване на вектор pTS-O. Мутагенезата се провежда съгласно инструкциите на производителя. Конструира се алигонукпеотид, комплементарен на кодиращата част на ДНК при ATG началния кодон на глицериналдехид-З-фосфатдехидрогеназния ген, но се включват промени на базата, които да създадат Neo I място. Олигонуклеотидите се получават чрез цианоетилфосфорамидитна синтеза. (Pharmacia Gene Assembler instrumentation) и имат следната последователност:
ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:12:
5’ CAGTAAACGCAACCATGGTTGTCCAG 3’
Мутагенезата се потвърждава чрез ензимен рестрикционен анализ. След това • · • · · · • · • · · · • · · ···· ·· · ···· • · ····· · ·· ······· ·· ····· ·· • · « · · · · · · · · фрагмент 1.9 kb Neo l/Bam HI от pTS-O, съдържащ глицериналдехид-3фосфатдехидрогеназен промотор се лигира в Neo l/Bam HI digested вектор pFTSO-8 (вектор, описан в пример 7) за установяване на мястото на глицериналдехид-Зфосфатдехидрогеназния промотор със Streptomyces експандазния ген. Този вектор се означава с pTS-O-1. Следва лигиране на фрагмент 3.0 kb Bam HI/HInd III от вектора pTS-0-1, съдържащ глицериналдехид-3-фосфатдехидрогеназен промотор.експавдазна касета, към Bam HI/HInd III digested вектор pl-6 (описан в пример 7), при което се получава крайният PeniciHium трансформационен вектор pSD-1, в който Streptomyces експандазния ген се експресира от глицериналдехид-
3-фосфатдехидрогеназния промотор.
ПРИМЕР 10
Трансформация на PenyciHium chrlsogenum
Описаните по-горе протопласти на щам на PenycHllum chrlsogenum се получават чрез инокулиране на 50 ml хранителна среда СМ с 1 X107 спори в продължение на 67 часа при 25°С върху ротационна клатачна установка при 220 mln1. Мицелът се събира чрез филтруване през марлен филтър, прехвърля се в колба с обем 500 ml, w ресуспендира се в 25 ml буфер КМР (0.75 KCL, О.ВМ манитол, 0.02М К>РО4 - pH 6.3), съдържащ 100 mg Novozyme 234 (Novo BioLabs, Bagsvaerd, Denmark), и се оставя за инкубация при 30₽С при 100 miir1. Сферопластите се отделят чрез филтруване през филтри от марля и стъклено влакно и се уплътняват чрез центрофугиране при350 хд в продължение на 10 минути. След това сферопластите се промиват трикратно с 10 ml буфер КМР.ресуспендфат се в буфер КМ PC (KMPcSOmM СаЦ) до концентрация 5 X107 клетки/ml и се оставят 20 минути при стайна температура. За да се извърши трансформация на PenycHllum, 200 ml от суспензията от сферопласти се добавят към ДНК (5 mg вектор ДНК в 6.2 ml КМРС в 5 mg/ml хепарин) заедно с 50 ml РРС (40% полиетиленгликол с молекулна маса 3500,20 mM Κ,ΡΟ*. pH 6.3,5% СаО2, • · · ·
прибавен непосредствено преди използване). Трансформационната смес се инкубира върху лед в продължение на 30 минути. Добавя се 1 ml прясно приготвен РРС и сместа се прехвърля към 50 ml стопен (50РС) регенериран агар (СМ + 1 ,ЗМ манитол и 3% агар). Трансформационната смес след това се разпределя в 5 блюда „петри“. След регенериране 24 часа при 25°С плочките се покриват с OL (1 % пептон и 1 % агар), съдържащ 100 mg/50ml OL на флеомицин. Количеството на OL е равно на количеството на регенерирания агар. Плочките се инкубират при 25°С за 7-14 дни и се наблюдават за образуване на трасформантни колонии.
w ПРИМЕРИ
Високоефективен течен хроматографски (HPLC) анализ на ферментационните продукти адипоил-6-аминопеницилинова киселина и адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина
Използва се високоефективна течна хроматография за анализ на получаването на адипоил-6-аминопеницилинова киселина в използвания нетрансформиран щам на Penycillium chrisogenum и на получаването на адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина в използвания трансформиран щам на Penycilium chrisogenum. Анализът е проведен на система Waters със захранваща с разтворители система 625, детектор на вълни с променлива дължина490Е, настроен на 220 nm и 254 пт, система за данни 825 Maxima и колона Novo-C18 като стационарна фаза. Подвижната фаза (при скорост на потока 1 ml/min) се състои от: за 5 минути - изократна (непроменяща се) смес от 2% метанол/98% 0.01 ОМ КН2РО4, pH 7.0; и 15 минути - 2 до 40% линеен градиент на метанол/O.OIOM КН2РО4, pH 7.0. За количествено определяне на адипоил-баминопеницилиновага киселина е използвана стандартната крива на пеницилин N-стандарт при 220 nm, а за количествено определяне на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина стандартната крива на стандартен деацетоксицефалоспорин С при 254 nm.
• · • · · ·
Анализите на чувствителността на адипоил-6-аминопеницилиновата киселина и на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина към обработки с пеницилаза се извършват чрез добавяне на 1 единица/ml пеницилаза I или пеницилаза III към съответните филтрати и инкубиране при стайна температура в продължение на 10-30 минути. Получените образци се подлагат на високоефективен течен хроматографски анализ при описаните по-горе условия.
Ултравиолетовият спектрален анализ на адипоил-6-аминопеницилиновата киселина и на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се провежда при използване на Waters система с 510 захранваща с разтворители система, 990 фотодиоден лъчев детектор, 990 система данни и Novo 18 колона като стационарна фаза. Използваната подвижна фаза е идентична на описаната по-горе.
Изолиране на адипоил-7-аминодезацетоксицвфалоспоринова киселина в голям мащаб от цялата ферментационна среда се провежда при използване на Waters система с 510 захранваща с разтворители система, 990 фотодиоден лъчев детектор, 990 система данни и mBondapak С18 препаративна колона като стационарна фаза. Подвижната фаза (при скорост на потока 5ml/min) се състои от изократен 0.01 ОМ КН2РО4, pH 7.0 в интервал на35 минути. Абсорбционният пик, отговарящ на времето на задържане на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспориновата киселина се получава при използване на фракционен колектор.
ПРИМЕР 12
Анализ на биоактивност
За определяне на антибиотиковата активност на изолираните чрез високоефективна течна хроматография адипоил-6-аминопеницилинова киселина и адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина се използва агардифузионен биоанализ. 20 ml от изолираното съединение се нанасят под формата на дискче с диаметър 5 mm върху плочки от LB агар [20 g/l LB базова бактериологична среда с 3% arap (Gibco, Paisley, Scotland), със зародиши на Bacillus subtilus ATCC 33677 или особено чувствителния щам на E.coli (доставян от Prof. Arnold L. Domain, MIT). Bacillus subtilus се използва като индикаторен щам за анализиране на адипоил-
6-аминопеницилинова киселина, а суперактивния щам на Е. coll се използва като индикаторен щам за анализ на адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. След 15 часа инкубация при 37°С появата на ореол от индикаторни бактерии със забавен растеж около дискчето показва,че съединението проявява биоактивност. Контролните опити в този ексеримент включват деацетоксицефалоспорин С, цефалоспорин С, пеницилин V и arap, съдържащ и несъдържащ пеницилиназа - като контролен опит за потвърждаване на β-лактамната структура.
ПРИМЕР 13
Анализ на ензим на RAEV
Пречистен адипоил-7-аминодезацетоксицефапоспоринова киселина от цялата бактериологична ферментационна среда се използва като субстрат за определяне на специфичната активност на ензима на RAEV (доставян като търговски продукт от фирмата RAEV Corp.) Реакционната смес съдържа ЮМт субстрат, 1 mg ензим на RAEV, 5% глицерол, в 0.16М КН2 РО4, в общ обем 50 ml. Сместа се инкубира при 37°С. Взимат се аликвотни проби от по 5 ml през следните интервали от време: 0,1, 3,5,10,20 и 30 минути, разреждат се с 35 ml 0.01 ОМ КН2 РО4 pH 3.5 и се замразяват при -70РС преда да се подложат на високоефективен течен хроматографски анализ при описаните по-горе условия.
Активността на ензима на RAEV към колориметричния субстрат от адапоил-Раминобензоена киселина се определя при използване на 5тМ субстрат, 8.25 mg ензим на RAEV, 10% глицерол в 0.065 КН2 РО4 pH 7.0, в общ обем50 ml в продължение на 30 минути при 37°С. Реакцията се извършва в чашка за микротитруване. Прибавят • · • · • · · · ·· · · ♦ ♦ · • · ····· · ·· ······· ·· ····· · · ·· ·· · · ·· · · · се 50 ml разтвор на 1М NaNO2 в 025М оцетна киселина, за да се прекъсне реакцията и реакционната смес се оставя 3 минути при стайна температура. Поставят се 100 ml от разредена с вода в съотношение 1/100 10 mg/ml 4-амино-5-хидрокси-2,7нафталендисулфонова киселина, мононагриева сол-хидрат в 5М NaHCO3. Появата на оцветяване се отчита незабавно при 515 nm, като се използва EL 312 Bio-kinetics Rate Reader (BloTek Instr merits).
ПРИМЕР 14
Високоефективен течен хроматографски анализ на реакционните продукти на ензима на RAEV
Всички ензими на RAEV (търговски продукти на RAEV Corp.) се изследват при използване на субстрат от адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина, чийто течен хроматографски анализ е проведен на система Waters със захранваща с разтворители система 625, детектор на вълни с променлива дължина 490Е, настроен на 220 nm и 254 nm, система за данни 825 Maxima и колона Novo-C18 като стационарна фаза. Подвижната фаза (при скорост на потока 1 ml/min) се състои от: w за 5 минути - изократна (непроменящ се) смес от 2% метанол/98% 0.01 ОМ КН2РО4, pH 7.0; и 15 минути - 2 до 40% линеен градиент на метанол/O.OIOM КН2РО4, pH 3.5. За определяне на времето на задържане на реакционния продукт е използван 7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина. За количествено определяне на реакционния продукт е използвана стандартна крива на стандартен 7аминсдезацетоксицефалоспоринова киселина при 254 nm.
ПРИМЕР 15
13С-ЯМР анализи на ферментационния продукт адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина
13С-ядреномагнитният резонансен (широка ивица на освободения протон) спектър се получава при 75.4 MHz (7.1 Т) на IBM-AF-350 спектрофотометър във версия Fourier Transform. Пробите съдържат 50 mg адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина от ферментационната бактериална среда в 0.5 ml D20 (99.8% D, Aldrich) или 0.5 ml DMSO-de (99.0% D, Aldrich) в 5 mm тръбички при 350PK. Данните от ЯМР потвърждават, че продуктът е така нареченият адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
ПРИМЕР16
Оценка на алтернативния адипоилацилазен ензим
В допълнение на изследванията на ензима на RRAEV отцепването на / адипоиловата странична верига от адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (и от други адипоилови съединения) се демонстрира с ензими, получени от различни микробиологични източници. В едно начално изследване щамовете на Pseudomonas sp. SE-83 и SE-495 (депозирани от Fermentation Research Institute под добавени номера съответно FERM ВР-817 и FERM ВР-818) и щамът Pseudomonas SY-77-1 (депозиран от Northern Regional Research Laboratory под добавен номер NNRL Θ-8Ο7Ο) се култивират в продължение наа 72 часа в среда, съдържаща HyCase SF, 2.0% (тегло/обем); мононатриев глутамат, 0.5% (тегло/обем); екстракт от дрожди, 0.5% (тегло/обем); умокрено брашно,0.2% (тегло/обем); памуково масло, 0.5% (тегло/ обем); и глугарова киселина 0.1% (тегло/обем).
Клетките се събират чрез центрофугиране и промиване с 50 тМ фосфатен буфер, pH 8.0, след което се ресуспендират в буфер и външните им мембрани се правят пропускливи чрез добавка на малко количество хлороформ. Смесват се равни количества от суспензията от клетки и адипоил-лара-нитроанилин (ad-PNA) и се инкубират при ЗОРС в продължение на 2 до 18 часа. След инкубацията сместа се подкислява чрез добавка на 10% (обемни) оцетна киселина. Освободеният рнитроанилин се доказва по колориметричен начин въз основа на неговото превръщане в диазосъединение под действието на доставените под формата на китове реагенти на Sigma Chemical Company за анализ на гама-глутамилтрансфераза (Sigma продукт номер 545-А). Относителната активност на трите щама е съответно 100%, 85.5%, и 48% съответно за SE-495, SE-83 и SY-77-1. При използване на аналогични ензими на описаните при анализа на ензима на RAEV, се определя и активността на SE-83 и на SE-495 върху адипоил-7аминодезацетоксицефалоспоринова киселина Получаването на бета-лактамаза при използването на SY-77-1 пречи на определянето на деацилиращата активност на този щам върху адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина.
По аналогичен начин се демонстрира получаването на адипоил-ацилаза и за два гъбични щама (Alternarla sp. МА-133, ATCC No. 20491; Aspergillus sp. МА-13, ATCC No. 20491 ;виж U.S. 4,141,790 на Melji Selka Kaisha Ltd.) и за три допълнителни бактериални щама (Brevibacterlum, ATCC No. 14, 649 Achromobacterlum, ATCC No. 14,648 и Flavobacterium, ATCC No. 14,650), описани като производители на цефалоспорин С ацилаза в U.S. 3,239,394 на Merck & Co., Inc.
• · • · · ·
ЛИСТИНГ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ (1) ОБЩА ИНФОРМАЦИЯ (I) ЗАЯВИТЕЛ: Conder, Michael J.
McAda, Phyllis и
Rambosek, John (ii) НАИМЕНОВАНИЕ HA ИЗОБРЕТЕНИЕТО: HOB БИОЛОГИЧЕН МЕТОД ЗА ПОЛУЧАВАНЕ НА 7-АМИН0ДЕЗАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРИНОВА КИСЕЛИНА (Hi) БРОЙ НА ИДЕНТИФИЦИРАНИТЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИ: 12 (iv) АДРЕС ЗА КОРЕСПОНДЕНЦИЯ:
(A) АДРЕС: Merck & Co., Inc.
(B) УЛИЦА: 126 Е. Lincoln Avenue (C) ГРАД: Rahway (О)ЩАТ: NewYersey (Е) ДЪРЖАВА: USA (F) КОД: 07065 (v) КОМПЮТЪРНА СИСТЕМА:
(A) Магнитна записваща среда: Гъвкав диск (B) Кьмпютър: IBM PC съвместим (C) Операционна система: PC-DOS/MS-DOS (D) Програма: Pajentln Release#1.0, Version #1.25 (vi) ДАННИ ЗА ПАТЕНТНАТА ЗАЯВКА:
(A) НОМЕР НА ЗАЯВКАТА: US 07/757,879 (B) ДАТА НА ЗАЯВЯВАНЕ: 11 СЕПТЕМВРИ 1991 (C) КЛАСИФИКАЦИЯ (vlll) ИНФОРМАЦИЯ, ОТНАСЯЩА СЕ ЗА ПАТЕНТНИЯ ПОСРЕДНИК (A) ИМЕ: Speer, Raymond Μ.
(B) РЕГИСТРАЦИОНЕН НОМЕР: 26,810 (C) СПИСЪЧЕН НОМЕР:[07/757,879] 18532 • · · ♦ · · · ·· · (ix) ТЕЛЕКОМУНИКАЦИОННА ИНФОРМАЦИЯ:
(A) ТЕЛЕФОН: (908) 594-4481 (B) ТЕЛЕФАКС: (908) 594-4720 (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:1:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА.
(A) ДЪЛЖИНА: 14 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (Н) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (х!) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:1:
TCTAGACACC ATGC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:2:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна € (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (х!) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:2:
GTGAGAGTTG ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No;3;
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна • · · · (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:3:
TCTAGACACT ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:4:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 16 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Двойна (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:4:
TCTAGACACC ATGGAC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:5:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: Аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пептид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:5:
Ser Asn Ser Gly Ala Vai Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala
10 15
Leu Leu Leu Gin Asn Pro • · • · · · • · ·· • · ·« • · · · » · • ·* • · · · (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:6:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: Аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пегтгид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:6:
Ser Asn Ser Trp Ala Vai Ala Pro Gly Lys Thr Ala Asn Gly Asn Ala
Leu Leu Leu Gin Asn Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:7:
(ί) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 22 аминокиселини (B) ТИП: Аминокиселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: пегтгид (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:7: Ser Asn Asn Trp Ala Vai Ala Pro Gly Arg Thr Ala Thr Gly Arg Pro
10 15 lie Leu Ala Gly Asp Pro (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:8:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ HA ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 34 базови части (B) ТИП; Нуклеинова киселина • · a a a a a a
(C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК(геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:8:
CGAGAGGATC AGTGAGAGTC CATGGACACG ACGG (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:9:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 47 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (ii) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК(геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:9:
АТСТСТТТТС ТААТАССТТС ACCATGGGTTG AGATTGTACG TGATCCC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:10:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 33 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (Н) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК(геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:10:
CGCGGATCCC GGCA TCAACG GCTTCGGTCG TAT (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:11:
(i) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
• · · · · · • * · · · · · · · ·*· ·· · · · · ······ · · · ··· · • · · · · · · (A) ДЪЛЖИНА: 34 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (xi) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:11:
CGVGGATCCG GGCACGCGCA TGGACATGCC AGTC (2) ИНФОРМАЦИЯ ЗА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТ, ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:12:
(I) ХАРАКТЕРИСТИКИ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА:
(A) ДЪЛЖИНА: 26 базови части (B) ТИП: Нуклеинова киселина (C) ВЕРИЖНОСТ: Единична (D) ТОПОЛОГИЯ: Линейна (II) МОЛЕКУЛЕН ТИП: ДНК (геномна) (XI) ОПИСАНИЕ НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТТА: ИДЕНТИФИКАЦИОНЕН No:12;
CAGTAAACGC AACCATGGTT GTCCAG
Claims (7)
1 0. Метод съгласно претенция 9, характеризиращ се с това, че рекомбинантнага гостоприемна клетка съдържа рекомбинантен ДНК експресионен вектор, съдържащ плазмид pPenFTSO.
• · · · ·· е · е ··· · ···· · 1 · ·· · ···« · · · · * ·· • · ····· · ·· ·♦♦·*·· ·· · · · · · · · ·· ·· ·· · ··· ·
ПРЕРАБОТЕНИ ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ [получени от Международното бюро на 29 Март 1993 (29.03.93); отпадат оригиналните претенции 6,8 и 10; оригиналните претенции 5,7 и 9 са преработени и преномерирани; останалите претенции остават непроменени]
1. Нов биологичен метод за получаване на 7аминсдезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), характеризиращ сес това, че се състои от следните етапи:
- култивиране в хранителна среда, годна да осигури растежа, на щам на Peniciilium chrysogenum, който произвежда изопеницилин N, и добавяне към тази среда на адипатна хранителна среда, съдържаща адипинова киселина или една или повече нейни соли и естери, които могат да бъдат асимилирани и използвани от посочения щам на Peniciilium chrysogenum за получаване на адипоил-6аминопеницилинова киселина (адипоил-6-АРА), при което цитираната адипоил-6аминопеницилинова киселина се получава:
като въпросният щам на Penicillium chrysogenum се трансформира от ДН К, кодираща активността на експандазния ензим, способен да приеме посочената адипоил-6-аминопеницилинова киселина като субстрат, при което като резултат на ензимната експресия адипоил-6-аминопеницилиновата киселина, получена от този щам, впоследствие също разширява пръстена си In situ до получаването на адипоил-
7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (адипоил-7-ADCA);
- взаимодействие на получената 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина с адипоилацилаза, при което адипоиловата странична верига се отцепва и се получава 7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-ADCA), и следващо изолиране на полученото съединение.
2 адипоилацилазата е получена от вида Pseudomonas.
2. Биологичен метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че адипатната хранителна среда е динатриев адипат.
3. Биологичен метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че кодиращата активността на експандазния ензим ДНК се получава от Streptomyces clavullgerus ATCC 27064.
4. Метод съгласно претенция 1 .характеризиращ се с това, че адипоилацилазяга е получена сит вида Pseudomonas.
4. Биологичен метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че • ·99
9 9 9 9 ·· · 9 99
9 9 9 9 · · · · · *· • · ····· · 99 ·»»···9
99 9 999999 •9 99 99 99 999
5. Рекомбинантен ДНК експресионен вектор, характеризиращ се с това, че плазмидьт му pPenFTSO може да бъде интегриран в хромозомната ДНК на рекомбинантния щам на Penicillium chrysogenum, означен с РС100, АТСС 74182, състоящ се главно от ДНК, кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и промотор, който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК, съдържаща главно промотор на изопеницилин N синтатазния ген на Penicillium chrysogenum.
5. Рекомбинантен ДНК експресионен вектор, характеризиращ се с това, че съдържа ДНК, кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuHgerus ATCC 27064, и промотор, който стимулира експресията на кодиращата експандазната активност ДНК, съдържаща промотор на изопеницилин N синтетазния ген на Penicillium chrysogenum.
6. Гостоприемна клетка на Penicillium chrysogenum, означен с РС100, АТСС 74182, характеризираща се с това, че е трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор на ДНК, че плазмидьт PenFTSO е интегриран в хромозомната ДНК на тази гостоприемна клетка и че се състои главно от ДНК, кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuligerus АТСС 27064, и промотор, който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК, състоящ се главно от промотор на изопеницилин N синтетазния ген на Penicillium chrysogenum.
6. Експресионен вектор съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че съдържа плазмид pPenFTSO.
7. Гостоприемна клетка на Penicillium chrysogenum трансформирана с рекомбинантен експресионен вектор на ДН К, характеризиращ се с това, че съдържа ДНК, кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuHgerus ATCC 27064, и промотор, който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДН К, съдържаща промотор на изопеницилин N синтетазния ген на Penicillium chrysogenum.
8. Трансформирана гостоприемна клетка съгласно претенция 7 .характеризираща се с това, че експресионния вектор съдаржа плазмид pPenFTSO и който е РС100, АТСС яяяя.
9. Метод, съдържащ етап на култивиране при подходящи за генна експресия условия на рекомбинантна гостоприемна клетка на Peniciillum chrysogenum, характеризираща се с това, че рекомбинантнага гостоприемна клетка съдържа рекомбинантен ДНК експресионен вектор, съдържащ ДНК, кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuHgerus ATCC 27064, и промотор, който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК, съдържаща промотор на изопеницилин N синтетазния ген на Peniciillum chrysogenum.
7. Метод, характеризиращ се с това, че съдържа етап на култивиране при подходящи за генна експресия условия на рекомбинантна гостоприемна клетка на Penicillium chrysogenum, означена с РС100, АТСС 74182, при което рекомбинантната гостоприемна клетка съдържа рекомбинантен ДНК експресионен вектор, плазмид pPenFTSO, интегриран в хромозомната ДНК на гостоприемната клетка и състоящ се главно от ДНК, кодираща активността на експандазния ензим, получен от Streptomyces clavuligerus ATCC 27064, и промотор, който стимулира експресията на тази кодираща експандазната активност ДНК, състоящ се главно от промотор на изопаницилин N синтетазния ген на Penicillium chrysogenum.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US75787991A | 1991-09-11 | 1991-09-11 | |
| US07/933,469 US5318896A (en) | 1991-09-11 | 1992-08-28 | Recombinant expandase bioprocess for preparing 7-aminodesacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA) |
| PCT/US1992/007711 WO1993005158A1 (en) | 1991-09-11 | 1992-09-11 | Novel bioprocess for preparing 7-adca |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG98643A true BG98643A (bg) | 1995-03-31 |
| BG62177B1 BG62177B1 (bg) | 1999-04-30 |
Family
ID=27116462
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG98643A BG62177B1 (bg) | 1991-09-11 | 1994-03-09 | Нов биологичен метод за получаване на7-аминодезацетоксицефалоспоринова киселина (7-adca) |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5318896A (bg) |
| EP (2) | EP0532341B1 (bg) |
| JP (2) | JP3027847B2 (bg) |
| KR (2) | KR940702544A (bg) |
| CN (2) | CN1066488C (bg) |
| AT (1) | ATE173017T1 (bg) |
| AU (1) | AU657787B2 (bg) |
| BG (1) | BG62177B1 (bg) |
| CA (1) | CA2077921C (bg) |
| CZ (1) | CZ287357B6 (bg) |
| DE (1) | DE69227494T2 (bg) |
| DK (1) | DK0532341T3 (bg) |
| ES (1) | ES2126588T3 (bg) |
| FI (1) | FI108148B (bg) |
| HU (1) | HU217171B (bg) |
| IL (1) | IL103076A (bg) |
| MX (1) | MX9205175A (bg) |
| NO (1) | NO316742B1 (bg) |
| NZ (1) | NZ244236A (bg) |
| RO (1) | RO115886B1 (bg) |
| RU (1) | RU2178808C2 (bg) |
| SK (1) | SK282387B6 (bg) |
| TW (1) | TW270149B (bg) |
| UA (1) | UA41292C2 (bg) |
| WO (1) | WO1993005158A1 (bg) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3789880T2 (de) * | 1986-01-31 | 1994-09-08 | Beecham Group Plc | Isolierung und Expression von bei der Biosynthese von Beta-Laktamen beteiligten Genen. |
| US6709859B1 (en) | 1986-01-31 | 2004-03-23 | Beecham Group P.L.C. | Chromosomal DNA Fragments Encoding Enzymes for Encoding B-Lactam Biosynthesis Enzymes, and Vector and Transformants for Their Expression |
| KR100227711B1 (ko) * | 1991-10-15 | 1999-12-01 | 한스 발터 라벤 | 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 |
| ES2194873T3 (es) * | 1993-07-30 | 2003-12-01 | Dsm Ip Assets Bv | Procedimiento para la produccion eficaz de 7-adca a traves de 3-(carboxietil)propionil-7-adca. |
| RU2139350C1 (ru) * | 1993-07-30 | 1999-10-10 | Гист-Брокейдс Б.В. | Способ эффективного производства 7-адцк через 3-(карбоксиэтилтио)пропионил-7-адцк |
| RU2139349C1 (ru) * | 1993-07-30 | 1999-10-10 | Гист-Брокейдс Б.В. | Способ эффективного производства 7-адцк через 2-(карбоксиэтилтио) ацетил-7-адцк и 3-(карбоксиметилтио)пропионил-7-адцк |
| BR9407108A (pt) * | 1993-07-30 | 1996-08-27 | Gist Brocades Nv | Processo para a preparação e recuperação de ácido 7-amino desacetoxi cefalosporânico (7-adca) vetor de ADN recombinante e célula hospedeira transformada com um vetor definido |
| US5731165A (en) * | 1995-06-02 | 1998-03-24 | Gist-Brocades, B.V. | Process for the production of 7-ADCA via expandase activity on penicillin G |
| GB2323361A (en) * | 1995-11-27 | 1998-09-23 | Gist Brocades Bv | Improved process for the production of semi-synthetic cephalosporins via expandase activity on penicillin G |
| WO1997038107A1 (en) * | 1996-04-04 | 1997-10-16 | Gist-Brocades B.V. | An enzyme with high adipoyl-coenzyme a synthetase activity and uses thereof |
| WO1998000382A1 (en) | 1996-07-02 | 1998-01-08 | Toray Industries, Inc. | Processes for the preparation of optically active ketones |
| EP0914463A2 (en) | 1996-07-16 | 1999-05-12 | Gist-Brocades B.V. | NOVEL PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEPHALOSPORINS USING $i(ACREMONIUM CHRYSOGENUM) |
| CZ299290B6 (cs) * | 1997-02-20 | 2008-06-11 | Dsm Ip Assets B.V. | Zpusob výroby beta-laktamové slouceniny, zpusob prípravy a/nebo zlepšení vláknitého mikrobiálního kmene a použití chemicky definovaného fermentacníhomédia |
| PL330760A1 (en) * | 1997-04-22 | 1999-05-24 | Gist Brocades Bv | Method of obatining decylated cephalosporins by fermentation process |
| KR20000022108A (ko) * | 1997-04-22 | 2000-04-25 | 한스 발터 라벤 | 탈아실화된 세팔로스포린의 발효제조방법 |
| US6319684B1 (en) | 1997-04-22 | 2001-11-20 | Dms N.V. | Process for the fermentative production of cephalosporin |
| WO1998048037A1 (en) * | 1997-04-22 | 1998-10-29 | Dsm N.V. | A METHOD FOR CONTROLLING THE SOLUBILITY OF A β-LACTAM NUCLEUS |
| EP0918879A1 (en) * | 1997-04-22 | 1999-06-02 | Gist-Brocades B.V. | A METHOD FOR PREPARING A $g(b)-LACTAM ANTIBIOTIC |
| WO1999033994A1 (en) * | 1997-12-24 | 1999-07-08 | Isis Innovation Limited | Modified deacetoxycephalosporin c synthase (daocs) and x-ray structure |
| ATE226954T1 (de) * | 1998-03-27 | 2002-11-15 | Dsm Nv | Verfahren zur fermentativen herstellung von cephalosporin |
| US6383773B2 (en) | 1998-04-23 | 2002-05-07 | Massachusetts Institute Of Technology | Penicillin conversion |
| CN100390285C (zh) * | 1998-05-19 | 2008-05-28 | Dsm公司 | 体内生产头孢菌素的改良 |
| ES2165276B1 (es) * | 1999-06-18 | 2003-03-01 | Antibioticos Sau | Procedimiento biotecnologico para la produccion de acido 7-aminocefal osporanico (7-adca) y compuestos de sintesis intermedios particularmente penicilina n y desacetoxicefalosporina c (daoc) |
| IL152643A0 (en) | 2000-05-13 | 2003-06-24 | Smithkline Beecham Plc | Process for the purification of a salt of clavulanic acid |
| EP1974029A2 (en) | 2005-12-28 | 2008-10-01 | DSMIP Assets B.V. | Mutant acylases |
| CN101389635B (zh) * | 2006-02-23 | 2013-03-06 | 中化帝斯曼制药有限公司荷兰公司 | 改进的头孢菌素生产 |
| EP2123772A1 (en) | 2008-04-29 | 2009-11-25 | DSM IP Assets B.V. | Beta-lactam antibiotic producing strains |
| CN102131917A (zh) * | 2008-08-05 | 2011-07-20 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 生产己二酰基-7-adca的菌株 |
| EP2310488B1 (en) * | 2008-08-05 | 2012-09-19 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Adipoyl-7-adca producing strains |
| EP2310487A2 (en) | 2008-08-05 | 2011-04-20 | DSM IP Assets B.V. | Adipoyl-7-adca producing strains |
| CN102369290A (zh) | 2009-04-03 | 2012-03-07 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 发酵工艺 |
| WO2011161004A1 (en) | 2010-06-22 | 2011-12-29 | Dsm Ip Assets B.V. | Air bubble fermentation process |
| EP2614066B1 (en) | 2010-09-07 | 2017-11-29 | DSM Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Process for the production of cephalosporins |
| WO2012117038A1 (en) | 2011-03-03 | 2012-09-07 | Dsm Sinochem Pharmaceuticals Netherlands B.V. | Degradation of penicillin compounds |
| WO2015091455A1 (en) | 2013-12-17 | 2015-06-25 | Dpx Holdings B.V. | Bioreactor |
| CN113699209B (zh) * | 2021-08-30 | 2023-05-02 | 浙江昂利康制药股份有限公司 | 一种7-adca回收方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR1270852A (fr) * | 1960-09-20 | 1961-09-01 | Bayer Ag | Procédé d'acylation enzymatique d'acide 6-aminopénicillanique |
| DE3789880T2 (de) * | 1986-01-31 | 1994-09-08 | Beecham Group Plc | Isolierung und Expression von bei der Biosynthese von Beta-Laktamen beteiligten Genen. |
| IL81555A0 (en) * | 1986-11-17 | 1987-09-16 | Baldwin Jack Edward | Enzymatic process for 3-substituted cephalosporins |
| ATE90382T1 (de) * | 1987-01-17 | 1993-06-15 | Hoechst Ag | Verwendung von gamma-glutamyl-transpeptidase. |
| US5070020A (en) * | 1988-05-09 | 1991-12-03 | Eli Lilly And Company | Recombinant dna expression vectors and dna compounds that encode deacetoxycephalosporin c synthetase |
| US5108918A (en) * | 1988-08-11 | 1992-04-28 | Gist-Brocades | Method for identifying and using biosynthetic genes for enhanced production of secondary metabolites |
| IL95766A (en) * | 1989-09-27 | 1996-12-05 | Lilly Co Eli | Recombinant DNA expression vectors And DNA compounds. Which encode Aspergillus acyltransferase activity |
| KR0171897B1 (ko) * | 1989-12-27 | 1999-02-01 | 후지사와 도모끼찌로 | 7-아미노세펨 화합물 또는 그 염류의 제조 방법 |
| KR100227711B1 (ko) * | 1991-10-15 | 1999-12-01 | 한스 발터 라벤 | 7-아미노세팔로스포란산 및 7-아미노데아세틸세팔로스포란산 제조를 위한 신규한 생물학적 공정 |
-
1992
- 1992-08-28 US US07/933,469 patent/US5318896A/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-07 NZ NZ244236A patent/NZ244236A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-09-07 IL IL10307692A patent/IL103076A/en not_active IP Right Cessation
- 1992-09-10 MX MX9205175A patent/MX9205175A/es unknown
- 1992-09-10 CA CA002077921A patent/CA2077921C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-10 CN CN92112278A patent/CN1066488C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-11 RU RU94017674/13A patent/RU2178808C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 AT AT92308286T patent/ATE173017T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 UA UA94005434A patent/UA41292C2/uk unknown
- 1992-09-11 AU AU23542/92A patent/AU657787B2/en not_active Ceased
- 1992-09-11 KR KR1019940700777A patent/KR940702544A/ko active Granted
- 1992-09-11 EP EP92308286A patent/EP0532341B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-11 JP JP5505516A patent/JP3027847B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-11 WO PCT/US1992/007711 patent/WO1993005158A1/en not_active Ceased
- 1992-09-11 ES ES92308286T patent/ES2126588T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-09-11 DE DE69227494T patent/DE69227494T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-11 SK SK288-94A patent/SK282387B6/sk unknown
- 1992-09-11 CZ CZ1994532A patent/CZ287357B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 DK DK92308286T patent/DK0532341T3/da active
- 1992-09-11 EP EP97203374A patent/EP0843013A3/en not_active Withdrawn
- 1992-09-11 KR KR1019940700777A patent/KR0132440B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1992-09-11 HU HU9400715A patent/HU217171B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-09-11 RO RO94-00380A patent/RO115886B1/ro unknown
- 1992-09-19 TW TW081107399A patent/TW270149B/zh active
-
1994
- 1994-03-09 BG BG98643A patent/BG62177B1/bg unknown
- 1994-03-10 FI FI941135A patent/FI108148B/fi active
- 1994-03-10 NO NO19940848A patent/NO316742B1/no unknown
-
1999
- 1999-08-26 JP JP11239731A patent/JP3072101B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-08-31 CN CN00126889A patent/CN1332247A/zh active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| BG98643A (bg) | Нов биологичен метод за получаване на 7-аминодезацетоксицефало- споринова киселина (7-аdса) | |
| FI106965B (fi) | Uusia biologisia menetelmiä 7-ACA:n ja 7-ADAC:n valmistamiseksi | |
| RU2202616C2 (ru) | Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты, вектор экспрессии, рекомбинантный штамм | |
| PL174984B1 (pl) | Nowy proces biologiczny wytwarzania kwasu 7-aminodezacetoksycefalosporanowego (kwasu 7-ADC) | |
| PL172155B1 (pl) | Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego |