BR102019018389A2

BR102019018389A2 - adesivo para coleta de dna e método de extração, purificação e sequenciamento e kit para obter dna humano para análise genético ou diagnóstico.

Info

Publication number: BR102019018389A2
Application number: BR102019018389-6A
Authority: BR
Inventors: Blanco Sergio Mario; Ortega Gabriel Edgardo
Original assignee: Blanco Sergio Mario; Ortega Gabriel Edgardo
Priority date: 2018-10-10
Filing date: 2019-09-04
Publication date: 2021-02-23
Also published as: EP3842541A4; US20200113551A1; AR115004A1; CL2021000867A1; WO2020073140A1; EP3842541A1; MA52904A

Abstract

Um adesivo e método de obtenção de DNA humano para análise genética, compreendendo a etapa de extração de DNA de uma região da epiderme com folha adesiva, em que a epiderme é retirada de uma pessoa a ser estudada por meio de folha adesiva. O método de extração de dedos polegares permite a obtenção de DNA de muito boa qualidade para manipulações subsequentes com utilidade diagnóstica.

Description

ADESIVO PARA COLETA DE DNA E MÉTODO DE EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAMENTO E KIT PARA OBTER DNA HUMANO PARA ANÁLISE GENÉTICO OU DIAGNÓSTICO.

REFERÊNCIA CRUZADA AO PEDIDO RELACIONADO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se a uma extração das amostras de DNA, e mais especificamente, a uma folha de cola ou adesivo e método associado para extração de amostras de DNA e sequenciamento usando resíduos epidérmicos humanos para realizar estudos biomédicos incluindo a técnica de PCR para a amplificação das sequências de DNA, com quantidade suficiente para obter DNA de codificação e não codificação usando kits comerciais.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[002] O DNA de material genético (ácido desoxirribonucleico) constitui o material genético que codifica a síntese dos componentes celulares e o metabolismo de todos os seres vivos. Diferentes dispositivos e métodos de identificação genética foram desenvolvidos para identificação e filiação de pessoas e uso em ciências forenses, o DNA é obtido das amostras de sangue ou técnicas de esfregaço onde as células epiteliais da boca são usadas, com as desvantagens que cada um desses processos traz de acordo com a idade, estado de saúde, religião ou regulamentações legais (EUA "Guidelines for a quality assurance program for DNA analysis", CrimeLaboratoryDigest 22, 21-43, 1995). Com a finalidade de superar essas desvantagens, diferentes dispositivos adesivos foram desenvolvidos, tais como, fitas adesivas para medicina forense publicadas em diversas publicações cientificas; "Applicability of DNA Analysis on Adhesive Tape in Forensic Casework", autor Zech, WD | Malik, N | Thali, M; Univ Bern Organization | University of Bern | Univ Zurich | University of Zurich | Inst Forens Med I Univ Bern University of Bern Inst Forens Med Univ Zurich University of Zurich Inst Forens Med, Fonte "Journal of Forensic Sciences | 57 (4): 1036-1041 Jul 2012; Título "The Use of Adhesive Tape for Recovery of DNA from Crime Scene Items"; Autor Barash, M I Reshef, A | Brauner, P; Organization Israel Police Natl Headquarters | DIFS | Forens Biol Lab | Israel Police Natl Headquarters DIFS Forens Biol Lab; Fonte JOURNAL OF FORENSIC SCIENCES | 55 (4): 1058-1064 JUL 2010; "Direct PCR amplification of forensic touch and other challenging DNA samples": A review; Autor Cavanaugh, SE | Bathrick, AS, Org. Bode Cellmark Forensics Inc, fonte; FORENSIC SCIENCE INTERNATIONAL-GENETICS, Publication January 2018 e Título "Rapid multiplex DNA amplification on an inexpensive microdevice for human identification via short tandem repeat analysis"; Autor DuVall, JA | You Roux, D | Thompson, BL | Birch, C | Nelson, DA I Li, JY I Mills, DL | Tsuei, A | Ensenberger, MG | Sprecher, C | Storts, DR | Root, BE | Landers, JP; Univ Virginia Organization | University of Virginia | TeGrex Technol | Promega Corp | Dept Chem | Dept Mech & Aerosp Engn | Hlth Sci Ctr | Dept Pathol | Appl Res Inst | Univ Virginia University of Virginia Dept Chem Univ Virginia University of Virginia Dept Mech & Aerosp Engn Univ Virginia University of Virginia Hlth Sci Ctr Dept Pathol TeGrex Technol Promega Corp Univ Virginia University of Virginia Appl Res Inst; Fonte ANALYTICA CHIMICA ACTA | 980: 41-49 AUG 8 2017. "Analysis of fingerprint samples, testing various conditions, for forensic DNA identification" autor Ostojic, L | Wurmbach, E; organization Off Chief Med Examiner | Dept Forens Biol | Off Chief Med Examiner Dept Forens Biol; SCIENCE & JUSTICE font | 57 (1): 35-40 JAN 2017.

[003] Os métodos associados estão descritos em diversos documentos encontrados, conforme revelados no Documento KR326937B1, de Jeong Yeon-bo | Kim Eun-young, publicado em 13 de março de 2002 e denominado "Um método para obter amostras de DNA de pele humana com uma folha de cola"; que consiste em "uso de gravar uma imagem visualizada compreendendo tingir a superfície da folha de cola com vidro violeta"; no documento WO2003046210A1 denominado "Método de amostragem" da AGRESEARCH LIMITED | LINGARD LABEL COMPANY LIMITED Publicação 06/05/2003, no documento KR2004006621A denominado "Método para isolar DNA usando terra diatomácea da pele humana coletada por folha de cola" revela "Um método para isolar DNA usando terra diatomácea da pele humana coletada por uma folha de cola" da I.D. GENE INC. Publicação de 24 de janeiro de 2004 ; semelhante ao documento EP1115883B1 denominado "Método para obter amostras de DNA de pele humana com uma folha de cola", da I.D. Gene Inc., publicação de 28 de julho de 2004 , e finalmente o documento EP2395338A1 denominado "Dispositivo para obter amostras de DNA" da Gentras S.r.l, publicação de 14 de dezembro de 2011.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[004] É portanto objetivo da presente invenção proporcionar um adesivo ou folha cola associada à obtenção de DNA humano para análise genética; O adesivo compreende 6 folhas dispostas uma sobre a outra, sendo a primeira folha superior um BOOP de 50 mícrons, transparente do tipo de vidro, a segunda folha com tratamento de silicone, uma camada de adesivo de acrilato, uma terceira folha outro BOOP de 60 mícrons, colorido Branco; uma quarta folha transparente, uma quinta folha tratada com silicone e uma sexta folha BOOP transparente semelhante a vidro de 50 mícrons, o método associado compreende extrair as amostras um esfregaço foi embebido com 50ml de solução de extração de um kit de DNA comercialmente disponível; porque a eluição final do DNA em 100 ml do tampão de eluição fornecido pelo kit, após quantificação por biologia molecular; o programa de PCR utilizado: desnaturação, 3 minutos 94 graus centígrados; 40 ciclos de 30 segundos 92 graus centígrados, 30 segundos 58 graus centígrados, 30 segundos, 72 graus centígrados e a técnica de PCR foi usada amplificando o exon 17 do app usando os seguintes primers: 5'_ ATAACCTCATCCAAPTGTCCCC-3' e 5'-GTAACCCAAGCATCATGGAAG-3'.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[005] Para maior clareza e entendimento do objeto da presente invenção, foi ilustrado em diversas figuras, nas quais foi representada uma das formas preferidas das realizações, tudo por meio de exemplo, em que:

[006] Figura 1 é uma imagem que mostra a visualização em gel de agarose de DNA purificado de múltiplas amostras de dedo. Em gel de agarose Visualização de DNA purificado de múltiplas impressões digitais. Pistas 1 a 10, amostras de DNA de adesivos com múltiplas impressões digitais de acordo com o código detalhado na Tabela. M; marcador de peso molecular com o detalhe de três valores de referência. Um marcador de ácido nucleico contínuo é observado acima da banda de 5000 bases (*). (+), Controle positivo da reação de PCR, aproximadamente 400 bases -arrow-. (-), controle negativo da reação de PCR, com banda difusa de baixíssimo peso, correspondente à mistura dos primers da reação.

[007] A Figura 2 é uma imagem que mostra um gel de agarose mostrando reações de PCR de amostras de múltiplos dedos. A imagem de gel de agarose mostrando reações de PCR de múltiplas amostras de dedos é vista. Pistas 1 a 10, reações de PCR usando amostras de extração de DNA de adesivos com várias impressões digitais (de acordo com o código detalhado na Tabela 1). (+), controle positivo da reação de PCR, utilizando DNA genômico purificado de sangue venoso como branco. (-), controle de PCR negativo usando um adesivo sem amostra como branco. A banda superior de 400 bases (seta) corresponde ao produto de PCR esperado, enquanto a banda difusa menor corresponde aos primers (ponta de seta).

[008] A Figura 3 é uma imagem que mostra géis de agarose mostrando reações de PCR de amostras de polegar de um único dígito, em que o painel superior corresponde ao polegar direito e o painel inferior corresponde ao polegar esquerdo. Os géis de agarose são observados mostrando reações de PCR de amostras de um dedo polegar. Painel superior, polegar direito e painel inferior, polegar esquerdo. Para ambos os géis, Calles; 1 a 10, reações de PCR usando amostras de extração de DNA de adesivos com amostras exclusivas do polegar (de acordo com o código detalhado na Tabela 1). (+), controle positivo da reação de PCR, utilizando DNA genômico purificado de sangue venoso como branco. (-), controle de PCR negativo usando um adesivo sem amostra como branco. Ambos os grupos de reações apresentam reações positivas no tamanho esperado (400 bases, seta), sendo a banda difusa de menor tamanho correspondendo aos primers (ponta de seta).

[009] A Figura 4 é um detalhe das folhas adesivas que compõem o adesivo.

[010] A Figura 5 são imagens dos testes realizados em laboratório, sendo um exemplo representativo das sequências relatadas pela Macrogen. Perfis de leitura de intensidade de cada base (eletroferogramas) de excelente resolução são observados em todos os casos.

[011] A Figura 6 são imagens dos testes realizados em laboratório, sendo um perfil genético por polimorfismo de DNA por análise de loci STR da amostra 5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[012] A descrição do adesivo ou folha adesiva é composta por várias camadas:

1. BOOP de 50 mícrons - vidro.
2. Silicone - (aparado para fácil acesso)
3. Adesivo.
4. Outro BOOP de 60 mícrons - branco
5. Revestimento transparente (para dividir a aba)
6. Silicone
7. boop de 50 mícrons - cristal.

[013] É incorporado no corte longitudinal ao meio branco boop e preso ao transparente de forma que quando usado na etiqueta é retirado para descobri-lo com uma aba que facilita facilmente a tampa superior para uma posição de palma ou dedo da mão ou pé de qualquer indivíduo para tirar a epiderme e seu posterior estudo genérico.

[014] As folhas adesivas são à base de água, compostas por um polímero utilizado para estabilizar emulsões fluidas e suspensões estáveis à base de água, cujas dispersões são muito transparentes e apresentam baixa sensibilidade a agentes iônicos, com alta tolerância a eletrólitos.

[015] Em ocasiões em que quantidades limitadas de DNA estão disponíveis, como é o caso em amostras da epiderme do dedo, a técnica de amplificação em cadeia da polimerase de DNA (PCR) pode ser usada para gerar cópias idênticas de uma amostra de uma sequência específica e assim proceder ao seu sequenciamento, a partir do procedimento que codifica o DNA pode ser obtido para determinar uma patologia e estudos genéticos de patologias específicas e não codificantes de DNA que são em quantidades baixas, mas são suficientes para fazer análise de identidade para uso filiatório. A extração de DNA do adesivo de referência é realizada na forma de uma zaragatoa e com um reagente fornecido por um kit de investigação de DNA QIAamp disponível comercialmente (QIAGEN).

[016] Na arte foram usados os seguintes materiais e kit de uso comercial;

A) Folhas adesivas ou adesivo
B) Cotonetes estéreis (Tecnon)
C) Microbubos 0,2 e 1 ml (Labnet e Axygen)
D) Dicas (Delatalab)
E) Micro-pinos P2, P20, P200, P1000 (Gilson)
F) Kit QIAamp DNA Invetigator (QIAGEN)
G) Tabela de fluxo laminar (MiLab)
H) Mini centrifugadora Spin (Ependor)
I) Bio TDB-100
J) Termostato de bloco seco (BioSan)
K) NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)
L) Veriti 96well thermail cicler (Applied Biosystems)

[017] Nas propriedades químicas do DNA, inclui a verticalidade do sequenciador sendo amplificado pelo sistema pcr com reação em cadeia da polimerase, o comportamento da hidratação é elementar, sendo ativado pelo reagente comercial (QIAamp DNA invetigator kit (QIAGEN) causando a Mobilidade eletroforética e sequencial dos nucleotídeos, dispensando a revelação das características do licitante epidérmico para evitar sua identificação.

[018] A sequência de DNA amplificada pela reação em cadeia da polimerase compreende o locus de repetições em tandem (str). Acrilatos: resina sintética à base de água com troca iônica mista, proteases e fibra em que uma das faces do suporte é recoberta por um filme insolúvel.

[019] A zaragatoa é feita com um tampão do tipo comercial denominado tris com solução de cloreto de sódio e, em seguida, é realizada a peneiração molecular. O resultado mostra que métodos tradicionais de DNA extraído da pele pela folha adesiva podem ser utilizados para a obtenção de DNA codificador e não codificante, sendo os poligênicos utilizados diversas amplificações por tandem pcr para posterior leitura de risco da referida patologia, sendo esta, um método que permite a leitura.

Técnica

[020] Primeiramente, foi determinada a eficiência e reprodutibilidade do método descrito de coleta de DNA latente do adesivo, analisando a quantidade e qualidade do mesmo para análise gênica e, em seguida, foi determinada a utilidade desse DNA para o diagnóstico genético neste caso específico da doença de Alzheimer.

[021] Utilizou swabs estéreis (tecnon), microtubos de 0,2 e 1 ml (labnet e axygen), pontas (deltalab).

[022] Fase de extração e caracterização do conteúdo de DNA das impressões digitais, utilizando as folhas adesivas (adesivo) descritas acima com um kit comercial do tipo (QIAamp DNA invetigator kit (QIAGEN) foram utilizadas com impressões latentes de 10 sujeitos (5 mulheres e 5 homens). Antes de aceitar a licitante, os sujeitos procederam à lavagem das mãos com água e sabão, foram secas com papel e o material biológico foi imediatamente captado conforme as regras descritas das impressões latentes. Cada indivíduo sobrepôs as impressões de cada mão no adesivo. em um adesivo e também o único take em um único adesivo do polegar de cada mão, e as amostras foram codificadas para preservar a identidade.

[023] Para a extração do DNA, o swab foi embebido com 50 ul da solução extratora do kit (kit Qiamp.ADNinvetigator), seguindo as instruções de uso do fabricante. Eluição final do DNA em 100 ul do tampão de eluição fornecido pelo kit, após quantificação por biologia molecular.

[024] O sistema padrão de quantificação de DNA nano drop TM foi usado para medir a concentração de DNA nas amostras. Os dados obtidos estão incluídos na tabela a seguir.

[025] As amostras também foram analisadas em géis de agarose, o que indica que os níveis de DNA estão abaixo da sensibilidade de detecção do aparelho.

[026] A Figura 1 mostra o perfil da corrida de cada amostra, emergindo níveis baixos de DNA, mas de muito boa qualidade, uma vez que cada amostra se resolve em uma marca contínua de até aproximadamente 5 k bases, sugerindo DNA não degradado.

[027] A fim de comprovar a concentração de DNA com precisão, as amostras RMP-968 (4) e EZ-800 (5) foram analisadas por RT-PCR para isso, as amostras foram enviadas ao laboratório. O relatório fornecido mostra uma quantificação usando RT-PCR usando um ciclador AppliedBiosystem 7500 e o kit Quantifier Human DNA. As determinações indicam concentração de DNA de 0,1066 e 0,0815 ng/μl para as amostras 4 e 5, respectivamente. Esses dados são muito consistentes.

[028] Análise da qualidade do DNA extraído do adesivo; adequação para uso em reação em PCR. A técnica de "reação em cadeia da polimerase" ou PCR (polimerasechainreaction) permite a geração de um número de cópias exponencial de fragmentos de DNA específicos usando DNA de qualquer origem como modelo de cópia. Um requisito essencial para tal amplificação é que o DNA molde não seja danificado ou degradado, portanto, a técnica pode ser usada para determinar a quantidade de DNA desconhecido. Para tanto, foi utilizada a técnica de PCR, amplificando o exon 17 do app com os seguintes primers: 5'_ ATAACCTCATCCAAATGTCCCC-3 'e 5'-GTAACCCAAGCATCATGGAAG-3' (chartierHarlin. Col. 1991).

[029] O programa de PCR utilizado: desnaturação, 3 minutos 94 graus centígrados; 40 ciclos de 30 segundos, 92 graus centígrados, 30 segundos, 58 graus centígrados, 30 segundos, 72 graus centígrados.

[030] Os resultados da referida amplificação para amostras de dedo são mostrados na Figura 2 e para amostras de dedo único na Figura 3. Em ambos os casos, o fragmento amplificado corresponde ao tamanho esperado (399 bp). Nas amostras de dedo único, os polegares foram amplificados em 9 amostras de 10, combinando ambas as mãos, enquanto para amostras de dedo múltiplo à amplificação foi de 100% dos casos.

[031] Na figura 3 está uma imagem mostrando géis de agarose mostrando reações de PCR de amostras de polegar de um único dígito, em que o painel superior corresponde ao polegar direito e o painel inferior corresponde ao polegar esquerdo.

[032] Em conjunto, os dados dessas análises indicam que o método de extração dos dedos polegares permite a obtenção de um DNA de muito boa qualidade para realizar manipulações subsequentes com utilidade diagnóstica.

[033] Para verificar a identidade dos fragmentos gerados pela PCR e verificar sua aptidão para a realização de um diagnóstico genético da doença de Alzheimer, os mesmos foram sequenciados. Para isso, os materiais foram amplificados por PCR do exon 17 do app (chartierHarlin. Col.1991). foram encaminhados para laboratório especializado. A leitura das sequências de cada amostra corresponde à forma selvagem do gene em todos os casos. A sequência relatada está anexada (consulte a figura 5). Perfis de leitura e intensidade de cada base (eletroencefalogramas) de excelente resolução são observados em todos os casos.

[034] Para confirmar se as amostras vêm de um único DNA, o perfil genético das amostras JDP-557 (1; F7898 / 1), EAB-392 (3; F7898 / 3). RPM-968 (4; F7898 / 4) e EZ-800 (5; F7898 / 5) foram analisados por PCR para estudo de polimorfismo de DNA por análise de loci STR, em laboratório. Os eletroencefalogramas fornecidos estão anexados (ver figura 6) e são compatíveis com a presença majoritária de um único DNA em cada amostra. Um perfil parcial da amostra 3 também é relatado.

[035] Os dados deste estudo indicam que as folhas adesivas (adesivo) e o método utilizado são adequados para a coleta de DNA em quantidade suficiente para ser extraído e purificado, permitindo sua amplificação e sequenciamento por PCR, utilizando-se um kit comercial que pode ser utilizado para diagnóstico genético e estudo da Perfil genético por polimorfismo de DNA por análise de loci STR.

[036] As células aranhadas capturadas nas folhas adesivas são desidratadas para que seu DNA permaneça inalterado para armazenamento.

Claims

ADESIVO DE DNA PARA OBTER DNA HUMANO PARA ANÁLISE GENÉTICA OU DIAGNÓSTICO", caracterizado por adesivo (10) de DNA compreender 6 folhas dispostas uma em cima da outra compreendendo:
- - sendo a primeira folha superior de polipropileno orientado biaxialmente (a BOOP) de 50 mícrons, transparente do tipo de cristal,
- - uma segunda folha com tratamento de silicone,
- - uma camada de adesivo de acrilato,
- - uma terceira folha outra de BOOP de 60 microns, branca;
- - uma quarta folha transparente,
- - uma quinta folha com tratamento de silicone e
- - uma sexta folha Boop cristalina de 50 mícrons.
"ADESIVO" de acordo com a reivindicação 1, para análise genética, caracterizado por adesivo compreender um corte longitudinal no meio da terceira folha branca de boop e preso à quarta folha transparente.
"MÉTODO PARA OBTER DNA HUMANO PARA ANÁLISE GENÉTICO", caracterizado por método compreender as etapas de:
- - fornecer o adesivo de DNA de acordo com a reivindicação 1;
- - extrair uma amostra de um usuário ao usar o adesivo de DNA humano;
- - mergulhe o adesivo com folha adesiva com um cotonete contendo 50 μ! de solução de extração de um kit de DNA disponível no mercado, seguindo posteriormente as instruções de uso do fabricante.