BR122020004385B1

BR122020004385B1 - Método para aumentar o teor de glicoforma de alta manose de uma glicoproteína recombinante e método de produção de uma glicoproteína recombinante

Info

Publication number: BR122020004385B1
Application number: BR122020004385-7A
Authority: BR
Inventors: Sohye Kang; Chung-Jr HUANG; Hedieh BARKHORDARIAN; Pavel Bondarenko; Zhongqi ZHANG
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2014-01-13
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2022-10-04
Also published as: CN112481337A; WO2015105609A1; CN112481337B; AU2018226416C1; AU2014376225C1; CA2936104A1; JP2017501749A; AU2020260443B2; CN106029896B; MX2016009084A; EA202191909A1; CL2016001786A1; AU2018226416B2; MX376230B; EP3094735A1; AU2014376225A1; EA201691426A1; EA039141B1; BR112016015797B1; US10513723B2

Abstract

A presente invenção refere-se a um método para manipular o teor de glicoforma de alta manose de glicoproteínas recombinantes por regulação do metabolismo da ornitina durante a cultura celular.

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 61/926.481 depositado 13 de janeiro de 2014, que é aqui incorporada na sua totalidade por referência.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] Uma variedade de modificações pós-traducionais, incluindo a metilação, sulfatação, fosforilação, glicosilação e adição de lipídeos são realizadas por eucariotas superiores. Muitas das proteínas secretadas, proteínas de membrana e proteínas direcionadas para vesículas ou certos organelos intracelulares são conhecidos para serem glicosilados. A glicosilação, ligação covalente de porções de açúcar de aminoácidos específicos, é uma das mais comuns, ainda importantes modificações, pós-traducionais das proteínas recombinantes. Glicosilação de proteínas tem múltiplas funções da célula, incluindo o seu papel essencial na dobragem de proteínas e de controle de qualidade, o tráfico molecular e triagem, e interação com o receptor da superfície celular.

[003] Glicosilação N ligada envolve a adição de oligossacarídeos para um resíduo asparagina encontrados em certas sequências de reconhecimento de proteínas (por exemplo, Asn-X-Ser/Thr). Glicoproteínas ligadas a N contêm estruturas ramificadas padrão que são compostas de manose (Man), galactose, N-acetilglucosamina e ácidos neurâmicos. Oligossacarídeos ricos em manose incluem tipicamente duas N- acetil glucosamines com vários resíduos de manose (5 ou mais). Glicoproteínas produzidas em culturas de células de mamíferos podem conter níveis variados desta manose elevada (HM ou HMN) glicoformas como Manose5 (Man5), Manose6 (Man6), Manose7 (Man7), Manose8 (Man8) e Manose9 (Man9).

[004] Enquanto as glicoformas de uma glicoproteína recombinante expressa por célula hospedeira ovário de hamster chinês (CHO) são largamente determinadas por fatores genéticos intrínsecos, elevado teor de glicoforma manose também pode ser afetada pelas condições de cultura de células (Pacis, et al., (2011) Biotechnol Bioeng 108, 2348-2358).

[005] A glicosilação pode afetar a eficácia terapêutica dos fármacos de proteína recombinante. A influência de glicosilação na bioatividade, a farmacocinética, a imunogenicidade, a solubilidade e in vivo apuramento de glicoproteínas terapêuticas têm feito monitoramento e controle de glicosilação um parâmetro crítico para a fabricação biofarmacêutica. O teor de glicoforma de alta manose de proteínas terapêuticas é um atributo à qualidade crítica que foi encontrado para afetar as propriedades farmacocinéticas de certos anticorpos terapêuticos (Goetze, et al., (2011) Glycobiology 21, 949-59; Yu, et al., (2012) MAbs 4, 475-87). Portanto, métodos para controlar o elevado teor de glicoforma manose de proteínas terapêuticas seriam benéficos.

[006] Existe uma necessidade na indústria farmacêutica para manipular e controlar o teor de glicoforma de alta manose de glicoproteínas terapêuticas recombinantes e métodos para fazer tais seriam úteis. A invenção proporciona um método para manipular o elevado teor de glicoforma manose de glicoproteínas recombinantes por regulação do metabolismo da ornitina nas células hospedeiras.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[007] A invenção fornece o método para manipular o teor de glicoforma de alta manose de uma proteína recombinante caracterizada pelo fato de que compreende a cultura de uma célula hospedeira que expressa a proteína recombinante numa cultura de células sob condições que regulam o metabolismo de ornitina na célula hospedeira.

[008] Em uma modalidade o metabolismo de ornitina na célula hospedeira é regulado pela diminuição da acumulação de ornitina na célula hospedeira. Numa modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é regulada pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor da arginase ou espermina. Numa outra modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é regulada através da adição de um inibidor da arginase de meio de cultura celular. Noutra modalidade relacionada, o inibidor arginase é BEC (S- (2-boronoetil) -L-cisteína) ou DL-a-difluorometilornitina. Noutra modalidade relacionada, o inibidor arginase é BEC (S- (2-boronoetil) -L-cisteína). Noutra modalidade relacionada, o inibidor da arginase é DL-a-difluorometilornitina. Numa outra modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de pelo menos 10 μM. Numa outra modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de 10 μM a 2 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de 10 μM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de 0.5 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de 1 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de 2 mM.

[009] Numa outra modalidade de acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulada pela adição de 35 μM ou menos da espermina com o meio de cultura celular. Numa modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 7 μM a 35 μM. Numa outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 17 μM a 35 μM. Numa modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 7 μM a 17 μM. Numa outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 35 μM. Numa outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 17 μM. Numa modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 7 μM.

[0010] Noutra modalidade o metabolismo de ornitina na célula hospedeira é regulado pelo aumento da acumulação de ornitina na célula hospedeira. Em uma modalidade relacionada a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulada pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo ornitina, arginina, um inibidor da ornitina- descarboxilase, um inibidor de ornitina aminotransferase, um inibidor de sintase de óxido nítrico ou um inibidor de arginina da descarboxilase. Em ainda outra modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é regulada pela adição de ornitina, pelo menos, 0,6 mM, para o meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 0,6-14,8 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 6-14,8 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 0,6 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 6 mM.

[0011] Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 14,8 mM. Numa outra modalidade de acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulada por meio da adição de pelo menos 8,7 mM de arginina para meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de arginina é de 8,7 mM a 17,5 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de arginina é de 8,7 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de arginina é de 17,5 mM.

[0012] Numa outra modalidade a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulada através da adição de um inibidor da ornitina descarboxilase, um inibidor da sintase de óxido nítrico, um inibidor de ornitina aminotransferase, ou um inibidor da descarboxilase de arginina para o meio de cultura celular. Numa modalidade relacionada a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulado através da adição de um inibidor de descarboxilase da ornitina para o meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de descarboxilase da ornitina é alfa-defluorometilornitina (DMFO). Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de descarboxilase da ornitina é butóxido de piperonil (PBO).

[0013] Em outra modalidade relacionada a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulado através da adição de um inibidor de ornitina aminotransferase para o meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de ornitina aminotransferase é 5-fluorometilornitina (F-FMOrn). Em ainda outra modalidade relacionada, a célula hospedeira é regulada através da adição de um inibidor de sintase de óxido nítrico para o meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor da sintase de óxido nítrico é 2-etil-2-tiopseudoureia ou N-nitro-L-arginina e LG- Monometil-L-arginina. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor da sintase de óxido nítrico é N-nitro-L-arginina e LG-Monometil-L-arginina.

[0014] Em outra modalidade relacionada a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulado através da adição de um inibidor de descarboxilase da arginina para o meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de decarboxilase de arginina é arginina dimetil assimétrica (ADMA).

[0015] A invenção fornece o método de produção de uma proteína recombinante, caracterizado pelo fato de que o teor de glicoforma de alta manose é reduzido compreendendo a cultura de uma célula hospedeira que expressa a proteína recombinante numa cultura celular, em que o metabolismo da ornitina é regulado por redução da acumulação de ornitina na célula hospedeira. Numa modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é reduzida pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor da arginase ou espermina.

[0016] Numa modalidade relacionada a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é reduzida através da adição de um inibidor da arginase de meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor arginase é BEC (S- (2- boronoetil) -L-cisteína) ou DL-a-difluorometilornitina. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor arginase é BEC (S- (2-boronoetil) -L-cisteína). Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor da arginase é DL-a- difluorometilornitina. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é de pelo menos 10 μM. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é de 10 μM a 2 mM. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é de 10 μM a 20 μM. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é 10 μM. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é de 0.5 mM. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é de 1 mM. Em ainda outra modalidade relacionada ao inibidor de arginase é de 2 mM.

[0017] Numa outra modalidade a acumulação da ornitina na célula hospedeira é reduzida pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células que contém 35 μM ou menos de espermina no meio de cultura celular. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 7 μM a 35 μM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 17 μM a 35 μM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 0,07 mL/L para 0,17 mL/L. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 35 μM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 17 μM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de espermina é de 7 μM.

[0018] A invenção fornece o método de produção de uma proteína recombinante, caracterizado pelo fato de que o teor de glicoforma de alta manose é aumentado compreendendo a cultura de uma célula hospedeira que expressa a proteína recombinante numa cultura celular, em que o metabolismo da ornitina é regulado pelo aumento da acumulação de ornitina na célula hospedeira. Numa modalidade relacionada a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é aumentada pela adição de ornitina, arginina, um inibidor de descarboxilase da ornitina, uma aminotransferase ornitina, um inibidor de sintase de óxido nítrico ou um inibidor da descarboxilase de arginina para o meio de cultura celular.

[0019] Numa outra modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é aumentada pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo de ornitina, pelo menos, 0,6 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 0.6-14,8 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 6-14,8 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 0.6 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 6 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de ornitina é 14,8 mM.

[0020] Numa outra modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é aumentada pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo, pelo menos, 8.7 mM de arginina. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de arginina é de 8,7 mM a 17,5 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de arginina é de 8,7 mM. Em ainda outra modalidade relacionada, a concentração de arginina é de 17,5 mM.

[0021] Numa outra modalidade relacionada, a acumulação de ornitina é aumentada na célula hospedeira através da cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor de descarboxilase da ornitina, um inibidor da sintase de óxido nítrico, um inibidor de ornitina aminotransferase, arginina ou um inibidor da descarboxilase. Numa outra modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula-célula hospedeira é aumentada por cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor de descarboxilase da ornitina. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de descarboxilase da ornitina é alfa- defluorometilornitina (DMFO). Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de descarboxilase da ornitina é butóxido de piperonil (PBO).

[0022] Numa outra modalidade a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é aumentada por cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor de ornitina aminotransferase. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de ornitina aminotransferase é 5- fluorometilornitina (F-FMOrn).

[0023] Numa outra modalidade a acumulação de ornitina relacionada numa célula hospedeira é aumentada por cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor de sintase de óxido nítrico. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor da sintase de óxido nítrico é 2-etil- 2-tiopseudoureia ou N-nitro-L-arginina e LG-Monometil-L- arginina.

[0024] Numa outra modalidade relacionada a acumulação de ornitina ligada na célula hospedeira é aumentada por cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor de descarboxilase da arginina. Em ainda outra modalidade relacionada, o inibidor de decarboxilase de arginina é arginina dimetil assimétrica (ADMA).

[0025] Noutra modalidade, a célula hospedeira que expressa a proteína recombinante é cultivada numa cultura em lote, cultura em lote alimentada, perfusão de cultura, ou as suas combinações. Em ainda outra modalidade relacionada, a cultura é uma cultura de perfusão. Em ainda outra modalidade de perfusão relacionada compreende perfusão contínua. Em ainda outra modalidade relacionada a taxa de perfusão é constante. Em ainda outra modalidade relacionada, a perfusão é realizada a uma taxa de menos do que ou igual a 1,0 volume de trabalho por dia. Em ainda outra modalidade relacionada, a perfusão é conseguida por uma alternância de fluxo tangencial.

[0026] Noutra modalidade, a célula hospedeira que expressa a proteína recombinante é cultivada num biorreator. Em ainda outra modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de, pelo menos, 500L. Em ainda outra modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de, pelo menos, 500L a 2000L. Em ainda outra modalidade relacionada, o biorreator tem uma capacidade de, pelo menos, 1000L a 2000L. Em ainda outra modalidade relacionada, o biorreator é inoculado com pelo menos 0,5 x 106 células / mL.

[0027] Noutra modalidade, a célula hospedeira que expressa a proteína recombinante é cultivada num meio de cultura de células sem soro. Noutra modalidade relacionada, o meio de cultura isento de soro é um meio de cultura de células de perfusão. Em ainda outra modalidade relacionada, as células hospedeiras são células de mamífero. Em ainda outra modalidade relacionada, as células hospedeiras são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0028] Numa outra modalidade a proteína recombinante é uma glicoproteína. Em outra modalidade a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante, ou uma citocina.

[0029] Numa outra modalidade dos métodos acima compreendem ainda uma etapa de colheita da proteína recombinante produzida pela célula hospedeira.

[0030] Em outra modalidade a proteína recombinante produzida pela célula hospedeira seja purificada e formulada numa formulação farmaceuticamente aceitável.

[0031] Numa outra modalidade é fornecida uma proteína recombinante produzida por qualquer um dos métodos acima. Numa modalidade relacionada, a proteína recombinante é purificada. Numa outra modalidade a proteína recombinante é formulada numa formulação farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0032] A Figura 1 Visão geral do metabolismo de ornitina. ARG, Arginase; AZ, Antizyme; Azin, inibidor de Antizyme; P5C, Pirrolina-5-carboxilato; ASP, aspartato; ORNT, transportador de ornitina; GATM, amidinotransferase de glicina; NOS, sintase de óxido nítrico; OAT, aminotransferase de ornitina; ODC, descarboxilase de ornitina; OTC, transcarbamilase de ornitina; SMS, sintase de espermina; SRS, sintase de espermidina.

[0033] A Figura 2 Identificação de ornitina como um marcador metabólico associado com níveis de glicano de alta manose. Níveis de glicano de alta manose (% HM) dos anticorpos monoclonais recombinantes segregados a partir de oito linhas de células diferentes (linha celular A até H) detectado no dia 8 (D8, barras brancas), dia 9 (D9, barras cinzentas) e dia 10 (D10 , barras pretas) do processo alimentação em lote avaliado sob Média# 1 (A) ou Média# 2 (B). Correlação entre níveis de glicano de alta manose e níveis de ornitina extracelulares detectadas nos meios gastos (C). No dia 9 de nível médio da ornitina e nível de glicano de alta manose a partir das oito linhas celulares foram comparadas. R-valor de Pearson, R = 0,83.

[0034] A Figura 3 Correlação entre os níveis de teor de alta manose e ornitina extracelulares: A) o teor de glicoforma de alta manose detectado quando a linha celular H foi exposta a oito condições de produção diferentes (# 1 a # 8). B) Correspondente níveis de ornitina relativas extracelulares. C) Correlação entre a % do teor de glicoforma de alta manose e os níveis de ornitina relativos extracelulares. R-valor de Pearson, R = 0,78.

[0035] A Figura 4 Os níveis de expressão de mRNA relativas de arginase 1 de peletes das células coletadas de oito linhas celulares diferentes nos dias 3, 6, 8, 9 e 10. O correspondente teor de glicoforma de alta manose também é mostrado.

[0036] A Figura 5 Teor de glicoforma de alta manose em glicoproteínas recombinantes expressas por células cultivadas em meio de cultura celular contendo tetracloridrato de espermina em concentrações de 0, 7, 17, 35 e 100 μM. As amostras foram coletadas no dia 5 do ensaio de perfusão simulada. A amostra 35 μM serviu como um controle.

[0037] A Figura 6 Concentração de ornitina extracelular (mg/L) produzido endogenamente por culturas de células expostas a tetracloridrato de espermina nas concentrações de 0, 7, 17, 35 e 100 μM. As amostras foram coletadas no dia 5 do ensaio de perfusão simulada. A amostra 35 μM serviu como um controle.

[0038] A Figura 7 Teor de glicoforma de alta manose em glicoproteínas recombinantes expressas por células cultivadas em meio de cultura celular contendo monocloridrato de L- ornitina em concentrações de 0, 0,6, 6 e 14,8 mM. As amostras foram coletadas no dia 5 do ensaio de perfusão simulada. A amostra 0 mM serviu como um controle.

[0039] A Figura 8 Teor de glicoforma de alta manose em glicoproteínas recombinantes expressas pela linha celular "I" cultivadas em meio de cultura celular contendo 0,1 g/L de monocloridrato de L-ornitina (barras pretas) ou cultura de células de controle que não continha exogenamente ornitina adicionada (barras brancas). As amostras foram coletadas nos dias 6, 8 e 12.

[0040] A Figura 9 Teor de glicoforma de alta manose m glicoproteínas recombinantes expressas por células cultivadas em meio de cultura celular contendo monocloridrato de arginina em concentrações de 2,2, 4,4, 6,5, 8,7 e 17,5 mM. A amostra 8,7 mM atuou como controle. As amostras foram coletadas no dia 4 do ensaio de perfusão simulada.

[0041] A Figura 10 Teor de glicoforma de alta manose em glicoproteínas recombinantes expressas por células cultivadas em meio de cultura celular suplementado com vários inibidores de arginase: Cloridrato de BEC (BEC), DL-α, Cloridrato de Diflourometilornitina (DL-a), NG-Hidroxi-L-arginina de sal monoacetato (NG) e Nw-Hidroxi-nor-arginina de sal diacetato (Nw) em concentrações de 1, 10 e 20 μM. Controle não continha qualquer inibidor. As amostras foram coletadas no dia 4 do ensaio de perfusão simulada.

[0042] A Figura 11 Teor de glicoforma de alta manose em glicoproteínas recombinantes expressas por células cultivadas em meio de cultura de células que contêm o inibidor da arginase de Cloridrato de BEC (BEC) em concentrações de 0,0 a 0,01 e 0,5 mM e, DL-α, Cloridrato de Diflourometilornitina (DL-a), em concentrações de 0,0, 0,01, 1,0 e 2,0 mM. As amostras foram coletadas no dia 4 do ensaio de perfusão simulada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0043] Verificou-se que o teor de glicoforma de alta manose de uma glicoproteína recombinante expressa foi influenciado pela acumulação de ornitina na célula hospedeira e, como resultado poderia ser manipulada através do controle do metabolismo da ornitina na célula hospedeira.

[0044] Ornitina é um aminoácido não codificante da proteína envolvida no ciclo da ureia, síntese de poliamina e metabolismo da arginina. Ornitina é também um precursor de glutamato e prolina através das atividades de ornitina-δ-aminotransferase (OAT), ver Figura 1. Nos seres humanos, a deficiência de resultados OAT em atrofia girata da coroide e retina (Ga), uma doença caracterizada pela degeneração da retina e a acumulação de ornitina no plasma (Takki K et al., Br J Ophthalmol. 1974; 58(11): 907-16). Num modelo de rato de aveia-deficiência, arginina restrita diet tem mostrado reduzir os níveis plasmáticos de ornitina e prevenir a degeneração da retina (Wang T et al., PNAS 2000; 97(3): 1224-1229). Descarboxilase da ornitina (ODC), que catalisa a conversão da ornitina em putrescina, é a enzima limitante da velocidade da via de biossíntese de poliamina (Pegg A, JBC. 2006; 281(21): 1452914532). Síntese e estabilidade ODC, bem como a atividade do transportador de poliamina, é afetada por condições ambientais osmóticos (Munro G et al., BBA 1975; 411(2): 263-281; Tohyama et al., Eur J Biochem. 1991; 202(3):1327-1331; Michell J et al., 1998; 329:453-459). O aumento da biossíntese de poliamina tem sido associado com o aumento da resistência ao stress osmótico em plantas (Alcazar R et al., Biotechnol Lett 2006; 28:1867-1876). Conversão de ornitina em citrulina é catalisada por transcarbamilase da ornitina (OTC) como parte do ciclo da ureia. Deficiência de OTC nos seres humanos provoca acúmulo de amônia no sangue (Hopkins et al., Arch.Dis.Childh., 1969 44:143-148). Metabolismo da ornitina ocorre no citoplasma e nas mitocôndrias, com OTC e OAT etapas metabólicas catalisadas que ocorrem na mitocôndria. Transportador da ornitina mitocondrial ORNT1 é exigido para a importação de ornitina na mitocôndria. Nos seres humanos, as mutações em ORNT1 são responsáveis por síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia- homocitrulinuria (HHH) que é caracterizada por níveis plasmáticos elevados de ornitina e amoníaco (Camacho et al., Nat Genet (1999); 22:151-158); (Valle D et al, 2001, 18571896).

[0045] Tal como aqui descrito, o grau de acumulação da ornitina na célula hospedeira, tal como medido pelos níveis extracelulares de ornitina em meio de cultura de células, foi encontrada uma correlação com teor de glicoforma de alta manose de glicoproteínas recombinantes expressas. Manipulando o teor de alta manose pode ser conseguida através do controle do metabolismo da ornitina na célula hospedeira. A invenção fornece o método para manipular o teor de glicoforma de alta manose de uma proteína recombinante caracterizada pelo fato de que compreende a cultura de uma célula hospedeira que expressa a proteína recombinante numa cultura de células sob condições que regulam o metabolismo de ornitina na célula hospedeira. Metabolismo da ornitina pode ser regulada por redução ou aumento da acumulação da ornitina na célula hospedeira. Métodos são aqui fornecidos para a produção de proteínas recombinantes em que o teor de glicoforma de alta manose é reduzida ou aumentada, que compreende a cultura de uma célula hospedeira que expressa a proteína recombinante numa cultura celular, em que a acumulação da ornitina na célula hospedeira é regulada.

[0046] Metabolismo da ornitina refere-se a reações e vias químicas ou enzimáticas envolvidas na biossíntese da ornitina, transporte, processo catabólico e conversões metabólicas. O ciclo da ureia, sínteses de poliaminas, sínteses de creatina, e as vias de catabolismo da ornitina de mitocondriais são os exemplos de metabolismo da ornitina. Uma descrição geral é fornecida na Figura 1.

[0047] Acumulação da ornitina em uma célula hospedeira é a consequência do metabolismo da ornitina alterada. A extensão da acumulação da ornitina na célula hospedeira pode ser modulada por regulação do metabolismo da ornitina. Níveis de metabolitos intracelulares podem ser refletidos em níveis extracelulares (ou seja, detectado no meio de cultura celular). Um indicador da acumulação da acumulação de ornitina numa célula hospedeira pode ser feita através da medição da quantidade de ornitina segregada para o meio de cultura celular. Tal como aqui descrito, o tempo de curso dependente aumentado nos níveis da ornitina foram encontrados em meios de cultura celular faltando ornitina exógena.

[0048] "Teor de glicoforma de alta manose", "nível de glicanos de alta manose" e "níveis de espécies de alta manose" são usados alternadamente e designado pelas siglas "HM", "% HM", "HMN" ou "% HMN" e referem-se à percentagem relativa de espécies de glicano combinados de manose 5 (Man5), manose 6 (Man6), manose 7 (Man7), manose 8 (Man8) e manose 9 (Man9).

[0049] Verificou-se que o nível de ornitina segregada no meio de cultura celular está relacionada com teor de glicoforma de alta manose das glicoproteínas recombinantes expressas por células hospedeiras em cultura de células. Quando a acumulação da ornitina numa célula hospedeira foi diminuída pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor da arginase ou espermina, o teor de glicoforma de alta manose as glicoproteínas expressas foram diminuídas. Quando a acumulação de ornitina na célula hospedeira foi aumentada por cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo ornitina ou arginina, foi aumentado o teor de glicoforma de alta manose das glicoproteínas expressas.

[0050] A invenção proporciona um método para regular a acumulação de ornitina numa célula hospedeira através da cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo um inibidor da arginase.

[0051] A arginina é o precursor metabólico da ornitina e arginase é uma enzima que catalisa a conversão de arginina em ornitina. Observou-se que os níveis de expressão de mRNA de arginase correlacionados com a quantidade de acumulação de ornitina quando os perfis metabólicos e expressão de diferentes linhas celulares foram comparados. O bloqueio da atividade da arginase com um inibidor da arginase poderia potencialmente reduzir os níveis de produção de ornitina. No entanto, a eficácia de inibidores da arginase pode ser comprometida devido ao elevado nível de arginina no meio de cultura celular. Além disso, existe outros precursores metabólicos de ornitina (isto é glutamato e prolina, ver Figura 1) que podem contribuir para acumulação de ornitina.

[0052] Tal como aqui descrito, verificou-se que o teor de glicoforma de alta manose de uma proteína recombinante expressa pela célula hospedeira cultivada pode ser modulada pela adição de um inibidor da arginase para o meio de cultura celular. O bloqueio da atividade da arginase reduziu a quantidade de produção de ornitina nas células hospedeiras, reduziu o nível de glicano de alta manose das glicoproteínas recombinantes expressas.

[0053] Arginase também inibe transcarbamilase da ornitina (OTC) (Vissers et al., (1982) J. Gen. Microbio. 128:1235-1247). O bloqueio da atividade da arginase não só reduz a produção de ornitina de arginina mas pode potencialmente aliviar a repressão da atividade de OTC, permitindo a conversão da ornitina em citrulina, permitindo uma redução adicional da acumulação de ornitina (ver Figura 1).

[0054] Em pacientes com deficiência de OTC, os níveis de amônia são aumentados. Se a expressão ou atividade de arginase aumentada nas linhas de células hospedeiras que expressam as proteínas recombinantes com elevados níveis de glicanos de alta manose induz a inibição de OTC, este m também resultar no aumento do nível de amoníaco. Aumento nos níveis intracelulares de amoníaco poderia potencialmente alterar gradiente de pH no aparelho de Golgi e induzir relocalização sub-óptima de glicosiltransferases, resultando em níveis mais elevados de glicanos de altas manose devido a ramificação de glicano incompleto no complexo de Golgi (Campbell et al, (1973) NJM 288 (1 ):. 1-6; Hopkins et al, (1969) Archive of Disease in Childhood 44(234):143-148; Mühling et al, (2001)Amino Acids 21(3):303-318; Park et al., (2000) J. Biotechnol 81(2):129- 140; Rivinoja et al., (2009) J. Cell Physiol. 220(1):144-154; and Axelsson et al., (2001) Glycobiology 11(8):633-644).

[0055] Inibidores da arginase úteis são conhecidos na técnica e estão disponíveis a partir de fontes comerciais. Tais inibidores incluem arginase, cloridrato de BEC; DL-α, cloridrato de Diflourometilornitina; NG-Hidroxi-L-arginina e Nw- Hidroxi-nor-arginina. Em uma modalidade, o inibidor arginase é BEC (S- (2-boronoetil) -L-cisteína) ou DL-a- difluorometilornitina. Em uma modalidade da invenção, o inibidor de arginase é BEC (S- (2-boronoetil) -I-cisteína). Em uma modalidade da invenção, o inibidor da arginase é DL-a- difluorometilornitina.

[0056] Inibidores da arginase podem ser adicionados ao meio de cultura das células a concentrações de pelo menos 10 μM para diminuir níveis de glicano de alta manose de proteínas recombinantes expressas, sem afetarem significativamente a produtividade. Em uma modalidade relacionada, a concentração do inibidor de arginase é de 10 μM a 2 mM. Em outra modalidade, a concentração do inibidor de arginase é de 10 μM. Em outra modalidade, a concentração do inibidor de arginase é de 0.5 mM. Em outra modalidade, a concentração do inibidor de arginase é de 1 mM. Em outra modalidade, a concentração do inibidor de arginase é de 2 mM.

[0057] Acumulação de ornitina na célula hospedeira também pode ser regulada por cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo espermina, tal como descrito nos Exemplos abaixo. Ornitina, através da ação de descarboxilase da ornitina (ODC), é o ponto de partida para a via de síntese de poliamina e poliaminas da putrescina, espermidina e espermina. Exogenamente adicionado espermina pode ser utilizada para inativar ODC diretamente, ou através de antizime, ver Figura 1. Inativação da ODC pode levar à acumulação de ornitina como descrito abaixo. Ao limitar a quantidade de espermina adicionada exogenamente, a supressão de atividade da ODC pode ser aliviada e a ornitina pode ser metabolizada através da via de poliamina, reduzindo assim a acumulação de ornitina global na célula hospedeira.

[0058] A espermina pode ser adicionada ao meio de cultura de células a concentrações de menos do que ou igual a 35 μM para diminuir níveis de glicano de alta manose de proteínas recombinantes expressas, sem afetar significativamente a produtividade. Em uma modalidade da concentração de espermina é de 7 μM a 35 μM. Em uma modalidade da concentração de espermina é de 17 μM a 35 μM. Em uma modalidade da concentração de espermina é de 7 μM a 17 μM. Numa outra modalidade, a concentração de espermina é de 35 μM. Numa outra modalidade, a concentração de espermina é de 17 μM. Numa outra modalidade, a concentração de espermina é de 7 μM.

[0059] Um outro método para regular o metabolismo da ornitina é a de aumentar a acumulação de ornitina. Em uma modalidade a invenção fornece a regulação da acumulação de ornitina na célula hospedeira pela cultura da célula hospedeira num meio de cultura de células contendo ornitina, arginina, um inibidor da ornitina-descarboxilase, uma aminotransferase ornitina, um inibidor de sintase de óxido nítrico ou um inibidor de arginina da descarboxilase.

[0060] Como aqui descrito, os níveis de ornitina extracelular em meio de cultura das células condicionadas foram encontrados para correlacionar os níveis glicano de alta manose nas glicoproteínas recombinantes. Verificou-se que as células hospedeiras de cultivo que expressam proteínas recombinantes num meio de cultura celular contendo ornitina resultaram em glicoproteínas recombinantes que têm níveis aumentados de glicanos de manose elevada.

[0061] Como descrito acima, a acumulação de ornitina em meio de cultura celular provavelmente reflete as alterações no metabolismo da ornitina, que pode conduzir a uma acumulação de amoníaco, semelhante aos pacientes transportadores de genes defeituosos do metabolismo da ornitina (por exemplo, deficiência de OTC ou mutação ORNT1). Enquanto o mecanismo celular induzido por trás amoníaco induziu o aumento elevado de manose não é conhecido, tem sido sugerido que alterações no gradiente de pH no Golgi pode levar a relocalização sub-óptima de glicosiltransferases. Estas alterações podem conduzir a uma diminuição da disponibilidade de enzimas de glicosilação para completar a ramificação de glicano, e, portanto, resultar em níveis mais elevados de níveis de glicano de manose elevada.

[0062] Outra possibilidade é que a acumulação de ornitina potencialmente induz perturbações da homeostase redox (Zanatta et al., (2013) Life sciences 93(4): 161-168). Ornitina correlaciona-se positivamente com teor de alta manose sugerindo a possibilidade de que o teor de glicoforma de alta manose é regulada pelo estado redutor celular. A ornitina pode aumentar os níveis de oxidação de lipídeos. Uma vez que muitas das enzimas de regulação da glicosilação são membranas lipídicas ligadas, alterações na oxidação lipídica causadas pelo acúmulo da ornitina pode potencialmente alterar a integridade e a atividade das enzimas de regulação da glicosilação no Golgi e ER, e afetar posteriormente teores de glicoformas de alta manose.

[0063] A ornitina pode ser adicionada ao meio de cultura de células a concentrações de pelo menos 0,6 mM, para aumentar os níveis de glicano de alta manose de proteínas recombinantes expressas, sem afetar significativamente a produtividade. Em uma modalidade da concentração da ornitina é de 0,6 mM a 14,8 mM. Em uma modalidade da concentração da ornitina é a partir de 6 mM a 14,8 mM. Em outra modalidade, a concentração de ornitina é de 0,6 mm. Em outra modalidade, a concentração de ornitina é 6 mM. Em outra modalidade, a concentração de ornitina é 14,8 mM.

[0064] A arginina é o precursor metabólico da ornitina. Verificou-se que níveis de glicano de alta manose foram aumentados em proteínas recombinantes expressas em células hospedeiras cultivadas em meio de cultura celular contendo arginina exógena. Aumentando a quantidade de arginina exógena aumentou a quantidade de precursor metabólico disponíveis para a síntese de ornitina, aumentando assim os níveis de ornitina em células hospedeiras.

[0065] A invenção proporciona a regulação da acumulação de ornitina em células hospedeiras através da adição de arginina em concentrações de pelo menos 8,7 mM para aumentar níveis de glicano de alta manose de proteínas recombinantes expressas, sem afetar significativamente a produtividade. Em uma modalidade da concentração de arginina é 8,7-17,5 mM. Em outra modalidade, a concentração de arginina é de 8,7 mM. Em outra modalidade, a concentração de arginina é de 17,5 mM.

[0066] Acumulação da ornitina pode ser regulada através da adição ao meio de cultura de células de inibidores de descarboxilase da ornitina (ODC), aminotransferase de ornitina (OAT), sintase de óxido nítrico (NOS) ou descarboxilase de arginina (ADC), proporcionando assim uma forma de regular o metabolismo da ornitina e a acumulação de ornitina na célula hospedeira para manipular o teor de glicoforma de alta manose de uma proteína recombinante.

[0067] Acumulação de ornitina pode ser aumentada por bloquear a atividade de enzimas metabolizadoras de ornitina, tais como ODC e OAT (ver Figura 1). Inibidores de pequenas moléculas específicas para ODC como alfa-difluorometilornitina (DFMO) e butóxido de piperonil (PBO) encontram-se comercialmente disponíveis. OAT está bloqueado por 5- fluorometilornitina (5-FMOrn) T (Daune et al., 1988, Biochem J. 253:481-488). A invenção proporciona suplementação numa cultura de células com estes inibidores para aumentar a acumulação de ornitina nas células hospedeiras para manipular o teor de glicoforma de alta manose de uma proteína recombinante.

[0068] Acumulação de ornitina pode ser regulada por bloquear a atividade das enzimas que regulam a acumulação de arginina (Figura 1). A inibição da atividade da sintase do óxido nítrico por inibidores de moléculas pequenas, tais como 2-etil-2-tiopseudoureia e N-nitro-L-arginina e LGmonometil-L- arginina e/ou atividade de descarboxilase da arginina pela dimetil-arginina assimétrica (ADMA) pode melhorar a fluxo da conversão da ornitina a partir da arginina. A invenção proporciona suplementação numa cultura de células com estes inibidores para aumentar a acumulação de ornitina nas células hospedeiras para manipular o teor de glicoforma de alta manose de uma proteína recombinante.

[0069] Em uma modalidade da invenção está previsto que o meio de cultura de células é um meio de cultura de células sem soro. Numa modalidade o meio de cultura de células é um meio de cultura de células de perfusão.

[0070] Tal como aqui utilizados, os termos "meio de cultura de células" (também denominado "meio de cultura", "meios de cultura celular", "meios de cultura de tecidos,") referem-se a qualquer solução nutritiva utilizada para as células em crescimento, por exemplo, células animais ou de mamífero, e que proporcionam geralmente, pelo menos, um ou mais componentes a partir do seguinte: uma fonte de energia (geralmente sob a forma de um carboidrato tal como glucose); um ou mais de todos os aminoácidos essenciais, e, geralmente, os vinte aminoácidos de base, além de cisteína; vitaminas e/ou outros compostos orgânicos tipicamente necessários em concentrações baixas; lipídeos ou dos ácidos graxos livres; e oligoelementos, por exemplo, compostos inorgânicos ou elementos de ocorrência natural que são requeridos tipicamente em concentrações muito baixas, normalmente na gama micromolar.

[0071] A solução nutriente pode, opcionalmente, ser suplementada com componentes adicionais para otimizar o crescimento de células, tais como hormonas e outros fatores de crescimento, por exemplo, insulina, transferrina, fator de crescimento epidérmico, soro, e semelhantes; sais, por exemplo, cálcio, magnésio e fosfato, e tampões, por exemplo, HEPES; nucleosídeos e bases, por exemplo, adenosina, timidina, hipoxantina; e proteína e hidrolisados de tecido, por exemplo, proteína de animal hidrolisado (peptona ou misturas de peptona, que pode ser obtido a partir de subprodutos animais, gelatina purificada ou material de planta); antibióticos, por exemplo, gentamicina; todos protetores ou surfactantes, por exemplo, Pluronic® F68; poliaminas, por exemplo, putrescina, espermidina ou espermina (veja por exemplo, Publicação WIPO No. WO 2008/154014) e piruvato (ver por exemplo a Patente US No. 8053238) de acordo com os requisitos das células a serem cultivadas e/ou os parâmetros de cultura das células desejadas.

[0072] Meio de cultura de células incluem as que são tipicamente empregues em e/ou são conhecidos para utilização com qualquer processo de cultura celular, tais como, mas não se limitando a, em lote, lote estendida, alimentação em lote e/ou a perfusão ou de cultura de células contínua.

[0073] Os componentes do meio de cultura celular podem ser completamente moídos em um meio de formulação de pó; parcialmente moído com suplementos líquidos adicionados ao meio de cultura de células, conforme necessário; ou nutrientes podem ser adicionados na forma de um líquido completamente para a cultura de células.

[0074] A "base" (ou em lotes), meio de cultura celular refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente usado para iniciar uma cultura de células e são suficientemente completas para suportar a cultura de células.

[0075] Um meio de cultura celular "crescimento" refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente utilizado em culturas de células durante um período de crescimento exponencial, uma "fase de crescimento", e são suficientemente completas para suportar a cultura das células durante esta fase. Um meio de cultura de células de crescimento também pode conter agentes de seleção que conferem resistência ou a sobrevivência de marcadores selecionáveis incorporados na linha celular hospedeira. Tais agentes de seleção incluem, mas não estão limitados a geneticina (G4118), neomicina, higromicina B, a puromicina, zeocina, sulfoximina de metionina, metotrexato, meio de cultura de células sem glutamina, meio de cultura celular sem glicina, hipoxantina e timidina, ou timidina sozinha.

[0076] Um meio de cultura celular "de produção" refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente utilizado em culturas de células durante as fases de transição e de produção, quando o crescimento exponencial está terminando e a produção de proteína assume, e é suficientemente completo para manter uma desejada densidade celular, viabilidade e/ou de título de produtos dessas fases.

[0077] Um meio de cultura celular "perfusão" refere-se a um meio de cultura de células que é tipicamente utilizado em culturas de células que são mantidas por meio de métodos de perfusão contínua ou cultura e são suficientemente completas para suportar a cultura de células durante este processo. Formulações de meio de cultura celular de perfusão podem ser enriquecido ou mais concentrado do que formulações de meio de cultura celular de base para acomodar o método usado para remover o meio gasto. Meio de cultura de células de perfusão pode ser utilizado em ambas as fases de crescimento e de produção.

[0078] Meio de cultura celular concentrado pode conter alguns ou todos os nutrientes necessários para a manutenção da cultura de células; em particular, a forma concentrada pode conter nutrientes identificados ou como conhecidas para ser consumida durante o decurso da fase de produção da cultura de células. Meio concentrado pode basear-se em apenas cerca de qualquer formulação dos meios da cultura celular. Um meio de alimentação tal concentrado pode conter alguns ou todos os componentes do meio de cultura celular em, por exemplo, cerca de 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 12X, 14X, 16X, 20X, 30X, 50X, 100X, 200X, 400X, 600X, 800X, ou mesmo cerca de 1000X do seu valor normal.

[0079] As culturas celulares também podem ser suplementadas com rações concentradas independentes de nutrientes particulares que podem ser difíceis de formular e são rapidamente esgotadas em culturas de células. Esses nutrientes podem ser aminoácidos tais como tirosina, cisteína e/ou cistina (ver, por exemplo, Publicação WIPO No. 2012/145682). Numa modalidade, uma solução concentrada de tirosina é alimentada de forma independente para uma cultura de células cultivadas num meio de cultura de células contendo tirosina, de tal modo que a concentração de tirosina na cultura de células não seja superior a 8 mM. Numa outra modalidade, uma solução concentrada de tirosina e cistina é alimentada de forma independente para a cultura de células a serem cultivadas num meio de cultura celular a que falta tirosina, cistina ou cisteína. As alimentações independentes podem começar antes de ou no início da fase de produção. As alimentações independentes podem ser realizadas por lotes alimentados ao meio de cultura de células no mesmo ou em diferentes dias, como o meio de alimentação concentrada. As alimentações independentes também podem ser perfundidas no mesmo ou em diferentes dias, como o meio perfundido.

[0080] Meio de cultura celular, em certas modalidades, é livre de soro e/ou livre de produtos ou ingredientes de origem animal. Meio de cultura celular, em certas modalidades, é quimicamente definido, em que todos os componentes químicos são conhecidos.

[0081] Como é apreciado pelo profissional de células de mamíferos ou animais são cultivadas num meio adequado para as células particulares a serem cultivadas e que pode ser determinada pelo versado na técnica sem experimentação indevida. Os meios comercialmente disponíveis podem ser utilizados incluem, mas não se limitam ao Meio de Modificação de Dulbecco de Iscove, RPMI 1640, Meio Essencial Mínimo-alfa. (MEM-alfa), Meio de Eagle da Modificação Dulbecco (DMEM), DME/F12, alfa-MEM, Meio Basal de Eagle com Earle BSS, glicose alta DMEM, com glutamina, glicose alta DMEM, sem glutamina, DMEM baixa glicose, sem glutamina, DMEM:F12 1:1, com glutamina, GMEM (Glasgow MEM), GMEM com glutamina, meio de inseto completo de Grace, meio de inseto de Grace, sem FBS, F-10 de Ham, com glutamina, F-12 de Ham, com glutamina, IMDM com HEPES e glutamina, IMDM com HEPES e sem glutamina, meio de inseto IP41, 15 (Leibovitz)(2X), sem glutamina ou vermelho de fenol, 15 (Leibovitz), sem meio de glutamina, 5A meio modificado de McCoy, 199, Eagle MEM, sem glutamina ou vermelho de fenol (2X), Eagle MEM -Earle BSS, com glutamina, Eagle MEM-Earle BSS, sem glutamina, Eagle MEM-Hanks BSS, sem glutamina, NCTC-109, com glutamina, meio de Richter CM, com glutamina, RPMI 1640 com HEPES , Glutamina e/ou estreptomicina-penicilina-RPMI 1640, com glutamina, RPMI 1640, sem glutamina, meio de inseto de Schneider ou qualquer outro meio conhecido por um versado na técnica, que são formulados para os tipos de célula específicos. Para os meios exemplares anteriores podem ser adicionados componentes ou ingredientes adicionais, incluindo componentes opcionais, em concentrações ou quantidades apropriadas, como necessário ou desejado, e como será conhecido e praticado por aqueles versados na técnica utilizando conhecimentos de rotina.

[0082] Em uma modalidade da invenção está previsto que as células hospedeiras são células de mamífero. Numa modalidade as células hospedeiras são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

[0083] As linhas das células (também referidas como "células hospedeiras") utilizadas na presente invenção são geneticamente modificadas para expressar um polipeptídeo de interesse comercial ou científico. Linhascelulares são tipicamente derivados de uma linhagem proveniente de uma cultura primária que pode ser mantido em cultura durante um tempo ilimitado. As células podem conter introduções, por exemplo, através de transformação, transfecção, infecção, ou de injeção, vetores de expressão (construções), tais como plasmídeos e semelhantes, que sequências de codificação de porto, ou porções das mesmas, que codificam as proteínas para a expressão e produção no processo de cultura. Tais vetores de expressão contêm os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação inserida. Os métodos que são bem conhecidos e praticados pelos versados na técnica pode ser utilizado para construir vetores de expressão contendo sequências que codificam as proteínas e polipeptídeos produzidos, bem como os elementos de controle transcricionais e translacionais adequados. Esses métodos incluem, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. Tais técnicas são descritas em J. Sambrook et al., 2012, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th edition Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. or any of the previous editions; F. M. Ausubel et al., 2013, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, or any of the previous editions; Kaufman, R.J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, todas as quais são aqui incorporadas para qualquer finalidade.

[0084] As células animais, células de mamífero, células de cultura, células de animais ou hospedeiras de mamífero, células hospedeiras, células recombinantes, células hospedeiras recombinantes, e semelhantes, todos os termos são para as células que podem ser cultivadas de acordo com os processos da presente invenção. Tais células são tipicamente linhas celulares obtidas ou derivadas de mamíferos e são capazes de crescer e sobreviver quando colocadas em qualquer cultura em monocamada ou em suspensão em meio de cultura contendo nutrientes adequados e/ou outros fatores, tais como aqueles aqui descritos. As células são tipicamente selecionadas que podem expressar e segregar proteínas, ou que podem ser molecularmente manipuladas para expressar e segregar, grandes quantidades de uma proteína específica, mais particularmente, uma glicoproteína de interesse, em meio de cultura. Devem entender-se que a proteína produzida por uma célula hospedeira pode ser endógena ou homóloga para a célula hospedeira. Alternativamente, a proteína heteróloga é, isto é, estrangeira, para a célula hospedeira, por exemplo, uma proteína humana produzida e segregada por uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO). Além disso, as proteínas de mamífero, isto é, aquelas originalmente obtidas ou derivadas de um organismo de mamífero, são alcançados através dos métodos da presente invenção e podem ser segregadas pelas células para o meio de cultura.

[0085] Os métodos da presente invenção podem ser utilizados na cultura de uma variedade de células. Numa modalidade, as células cultivadas são células eucarióticas, tais como células vegetais e/ou animais. As células podem ser células de mamífero, células de peixes, células de insetos, células de anfíbios ou de células aviárias. Umas amplas variedades de linhas de células de mamífero adequadas para crescimento em cultura estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection (Manassas, Va.) e outros depósitos, bem como vendedores comerciais. Célula que pode ser utilizada nos processos da invenção incluem, mas não se limitando a, células MK2.7, células PER-C6, células de ovário de hamster chinês (CHO), tais como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin et al., 1986, Som. Cell Molec. Genet., 12:555-556; Kolkekar et al., 1997, Biochemistry, 36:10901-10909; and WO 01/92337 A2), dihydrofolate reductase negative CHO cells (CHO/-DHFR, Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216), and dp12.CHO cells (U.S. Pat. No. 5.721.121); células de rim de macaco (CV1, ATCC CCL-70); células de rim de macaco CV1 transformadas por SV40 (COS, células COS-7, ATCC CRL-1651); células HEK 293 e células SP2/0, células de hibridoma 5L8, células Daudi, células EL4, células HeLa, células HL-60, células K562, células de Jurkat, células THP-1, células SP2/0, células epiteliais primárias (por exemplo, queratinócitos, células epiteliais do colo do útero, células epiteliais dos brônquios, células epiteliais da traqueia, células epiteliais renais e células epiteliais da retina) e linhas de células estabelecidas e as suas estirpes (por exemplo, células de rim embrionário humano (por exemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol., 36:59); células de rim de hamster bebês (BHK, ATCC CCL-10); células de Sertoli de camundongos (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL-2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (Hep-G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL- 51); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Anais NY Acad. Sci., 383:44-68); células MCR 5; células FS4; células da retina PER-C6, células MDBK (NBL-1), células 911 , células CRFK, células MDCK, células BeWo, células Chang, células de Detroit 562, células HeLa 229, células HeLa S3, células Hep-2, células KB, células 180 LS, células de 174T LS, células NCI-H-548, células RPMI 2650, células SW-13, células T24, WI-28 VA13, células 2RA, células de WISH, células BS-C-l, células de LLC-MK2, células do Clone M-3, células 1-10, Células de RAG TCMK-1, células Y-1, células de LLC-PK1 , células PK(15), células de GH1, células GH3, células L2, células LLC-RC 256, células de MH 1C1 , células XC, células MDOK, células VSW e TH-I, células B1 ou seus derivados), células de fibroblastos de qualquer tecido ou órgão (incluindo mas não limitado ao coração, fígado, rim, cólon, intestino, esôfago, estômago, tecido neural (cérebro da medula espinhal), pulmão, tecido vascular (artéria, veia, capilar), tecido linfoide (gânglios, adenoide, amígdala, medula óssea e sangue), baço e fibroblastos e linhas de células de fibroblastos, como (por exemplo, células TRG-2, células IMR- 33, células Don, células GHK-21, células Citrulinemia, células Dempsey, células Detroit 551, células de Detroit 510, células Detroit 525, células Detroit 529, células Detroit 532, células Detroit 539, células de Detroit 548, células Detroit 573, células HEL 299, células IMR-90, células MRC-5, células WI-38, células WI-26, células MiCl1 , células CV-1, células COS-1, células COS-3, células COS-7, células de rim de macaco verde africano (VERO-76 , ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células DBS-FrhL-2, células BALB/3T3, células F9, células SV-T2, células M-MSV-BALB/3T3, células BALB-K, células BLO-11, células NOR-10, células C3H/IOTI/2, células HSDM1C3 , células KLN205, células de McCoy, células L Mouse, células de estirpe 2071 (Camundongo L), células de tensão (Camundongo L) L-M, células L-MTK (Camundongo L), células clones NCTC 2472 e 2555, SCC-PSA1, células suíças/3T3, células de muntjac da Índia, células SIRC, as células CII e células de Jensen ou seus derivados) ou qualquer outro tipo de célula conhecida a um versado na técnica.

[0086] As células podem ser adequadas para cultura aderente, monocamada ou em suspensão, transfecção e expressão de proteínas, por exemplo, anticorpos. As células podem ser utilizadas com lote, em fed batch e perfusão ou métodos de cultura contínua.

[0087] Em uma forma de realização da invenção, a célula hospedeira que expressa a proteína recombinante é cultivada num biorreator. Numa outra forma de realização da invenção, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500 litros. Numa concretização relacionada, o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500 L a 2000L. Em ainda outra concretização relacionada, a biorreator tem uma capacidade de, pelo menos, 1000L a 2000L. Em uma forma de realização da invenção, a cultura celular é estabelecida por inoculação do biorreator com, pelo menos, 0,5 x 106 células/ml num meio de cultura isento de soro. Numa forma de realização, a invenção compreende ainda um passo de colheita da proteína recombinante produzida pela célula hospedeira. Em uma forma de realização a invenção prevê que a proteína recombinante produzida pela célula hospedeira seja purificada e formulada numa formulação farmaceuticamente aceitável.

[0088] Para os fins de compreensão, mas sem limitação, será apreciado por aqueles versados na técnica que as culturas de células e execuções de cultura para produção de proteínas podem incluir três tipos gerais; isto é, cultura em lote, lote estendido, a cultura fed batch, a cultura de perfusão, ou combinações dos mesmos. Na cultura em lote, as células são inicialmente cultivadas em meio e este meio não é removido, substituído ou suplementado, isto é, as células não são "alimentadas" com meio fresco, durante ou antes do final da execução de cultura. O produto desejado é recolhido no final da execução de cultura.

[0089] Para as culturas fed batch, o tempo de execução de cultura é aumentado completando o meio de cultura uma ou mais vezes ao dia (ou continuamente) com meio fresco durante a execução, ou seja, as células são "alimentadas" com novo meio ("meio alimentado") durante o período de cultura. Culturas fed-batch podem incluir os vários regimes de alimentação e tempos como descrito acima, por exemplo, diariamente, em dias alternados, de dois em dois dias, etc., mais do que uma vez por dia, ou menos do que uma vez por dia, e assim por diante. Além disso, as culturas “fed batch” podem ser alimentadas continuamente com meio de alimentação. O produto desejado é então recolhido no final da execução de cultura/produção.

[0090] Cultura de perfusão é uma em que a cultura de células recebe meio de perfusão fresco e o meio gasto é removido. Perfusão de meio fresco para a cultura de células e remoção dos meios gastos podem ser contínuos, passo a passo, intermitentes, ou uma combinação de qualquer ou de todos estes. Taxas de perfusão podem variar de menos de um volume de trabalho por dia para muitos volumes de trabalho por dia. De preferência, as células são mantidas em cultura e o meio gasto que é removida é substancialmente livre de células ou células tem um número significativamente menor do que a cultura. As proteínas recombinantes expressas pela cultura de células também podem ser retidas na cultura ou removidas com o meio gasto. A remoção do meio gasto pode ser conseguida por uma série de meios, incluindo centrifugação, decantação, ou filtração, ver, por exemplo Voisard et al., (2003), Biotechnology and Bioengineering 82:751-65. Um método de filtração preferido é alternar filtração de fluxo tangencial. O fluxo tangencial alternado é mantida por meio de bombagem através de módulos de filtração de fibra oca utilizando um dispositivo de ATF. Ver, p. ex., a Patente US No. 6,544,424; Furey (2002) Gen. Eng. News. 22 (7), 62-63. Os filtros separam as partículas com base no tamanho ou peso molecular. Dependendo da aplicação, os filtros podem ser escolhidos com base no tamanho dos poros ou um valor de corte de peso molecular (MWCO). Os filtros incluem filtros de membrana, filtros cerâmicos e os filtros de metal e podem estar em qualquer forma, incluindo enrolados em espiral ou tubulares, ou sob a forma de uma lâmina.

[0091] O termo "taxa de fluxo de perfusão" é a quantidade de material que é passada através de (adicionada e removida) um biorreator, normalmente expressa como uma parte de ou um múltiplo do volume de trabalho, em um determinado momento. "Volume de trabalho" refere-se à quantidade de volume de biorreator utilizada para cultura de células. Numa forma de realização a taxa de fluxo de perfusão é um volume de trabalho ou menos por dia.

[0092] A cultura celular pode ser levada a cabo sob condições de produção pequena a larga em escala de proteínas recombinantes utilizando recipientes de cultura e/ou aparelhos de cultura que são convencionalmente utilizados para cultura de células de animal ou de mamífero. Como é apreciado pelos versados na técnica, placas de cultura de tecidos, frascos-T e frascos rotativos são tipicamente usados em escala de bancada de laboratório. Para a cultura em um equipamento de maior escala, tais como, mas não limitado a dispositivos de cultura de tipo tanque fermentador, dispositivos de cultura do tipo air lift, biorreatores de leito fluidificado, biorreatores de fibra oca, culturas em frascos rotativos, sistemas de biorreator de tanque agitado, dispositivos embalados tipo leito de cultura, e bolsas descartáveis de uso único ou qualquer outro dispositivo adequado conhecido daqueles versados na técnica podem ser utilizados. Os microtransportadores podem ou não podem ser utilizados com a garrafa de rolo ou sistemas de tanque de biorreator agitados. Os sistemas podem ser operados em um lote, fed-batch ou modo de perfusão/modo contínuo. Além disso, o aparelho ou sistema de cultura pode ser equipado com aparelhos adicionais, tais como separadores de células usando filtros, gravidade, a força centrífuga, e semelhantes.

[0093] A produção de proteínas recombinantes pode ser feita em vários processos de cultura de fase. Em um processo de fases múltiplas, as células são cultivadas em duas ou mais fases distintas. Por exemplo, as células podem ser cultivadas em primeiro lugar em uma ou mais fases de crescimento, sob condições ambientais que maximizam a proliferação e viabilidade celular, em seguida, transferidas para uma fase de produção, em condições que maximizem a produção de proteína. Num processo comercial para a produção de proteínas recombinantes por células de mamíferos, há normalmente várias, por exemplo, pelo menos cerca de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais fases de crescimento que ocorrem em diferentes recipientes de cultura (N-x para N-1) que precedem uma cultura de produção final. As fases de crescimento e de produção pode ser precedida por, ou separada por uma ou mais fases de transição. A fase de produção pode ser conduzida em larga escala.

[0094] O termo "fase de crescimento" de uma cultura celular refere-se ao período de crescimento celular exponencial (isto é, a fase log), onde as células geralmente se dividem rapidamente. As células são mantidas na fase de crescimento durante um período de cerca de um dia, ou cerca de dois dias, ou cerca de três dias, ou cerca de quatro dias, ou mais do que quatro dias. A duração de tempo durante o qual as células são mantidas em fase de crescimento vai variar com base no tipo de células e taxa de crescimento das células e as condições de cultura, por exemplo.

[0095] O termo "fase de transição" refere-se a um período de tempo entre a fase de crescimento e a fase de produção. Geralmente, a fase de transição é o tempo durante o qual as condições de cultura podem ser controladas para suportar uma mudança de fase de crescimento para a fase de produção. Vários parâmetros de cultura de células que podem ser controlados incluem, mas não estão limitados a um ou mais de temperatura, pressão osmótica, vitaminas, aminoácidos, açúcares, peptonas e sais de amónio.

[0096] O termo "fase de produção" de uma cultura celular refere-se ao período de tempo em que o crescimento celular estagnou. O crescimento celular logarítmico normalmente termina antes ou durante esta fase e produção de proteína assume. Processos de cultura de células de perfusão e fed batch suplementam o meio de cultura celular ou fornecem meio fresco de modo a alcançar e manter a densidade celular desejada, a viabilidade e o título do produto nesta fase. A fase de produção pode ser conduzida em larga escala. Culturas de células em larga escala podem ser mantidas em um volume de pelo menos cerca de 100, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 7000, 8000, 10000, 15000, 20000 litros. Numa forma de realização preferida, a fase de produção é conduzida de biorreatores de 500L, 1000L e/ou 2000L.

[0097] Normalmente, as culturas de células que antecedem uma cultura de produção final passam por duas fases antecedentes, cultivos celulares e de inóculo. A fase de cultivo celular (N-X) ocorre em pequena escala, onde as células são expandidas rapidamente em número. Na fase de cultivo de inóculos (N-1), as células são ainda mais expandidas para gerar o inóculo para o biorreator de produção, tal como um inóculo de pelo menos 0,5 x 106 células/mL. Cultivos celulares e de N- 1 podem ser produzidos por qualquer método de cultura, tipicamente culturas de células em lotes. Densidades de células N-1 de > 15 x 106 células/mL são típicas para semear biorreatores de produção. As maiores densidades celulares de N-1 podem diminuir ou mesmo eliminar o tempo necessário para atingir uma densidade de células desejada no biorreator de produção. Um método preferido para atingir mais elevadas densidades celulares de N-1 é a cultura de perfusão utilizando filtração de fluxo tangencial alternada. Uma cultura de células de N-1 cultivadas por meio de um processo de perfusão utilizando filtração de fluxo tangencial alternada pode fornecer células em qualquer densidade desejada, tais como densidade de > 90 x 106 células/ml ou mais. A cultura de células de N-1 pode ser utilizada para gerar um único bolus de cultura de inoculação ou pode ser utilizada como uma cultura de semente de rolamento que é mantida para inocular biorreatores múltiplos de produção. A densidade de inoculação pode ter um impacto positivo sobre o nível de proteína recombinante produzida. Níveis do produto tendem a aumentar com o aumento da densidade de inoculação. Melhoria em título está ligada não só a uma maior densidade de inoculação, mas é susceptível de ser influenciada pelo estado metabólico e do ciclo celular das células que são postas em produção.

[0098] O termo "densidade celular" refere-se ao número de células num dado volume de meio de cultura. "Densidade de células viáveis" refere-se ao número de células vivas em um dado volume de meio de cultura, tal como determinado por ensaios de viabilidade padrão (como método de exclusão de corante azul tripano). O termo "hematócrito" (PCV), também referido como "percentagem de hematócrito" (% PCV), é a razão entre o volume ocupado pelas células e o volume total de cultura de células expresso como uma percentagem (veja Stettler, et al., (2006) Biotechnol Bioeng. Dez 20:95(6):1228- 33). Volume de células embaladas é uma função da densidade celular e o diâmetro da célula; aumentos do hematócrito podem surgir a partir de aumentos tanto na densidade celular ou diâmetro das células, ou ambos. Hematócrito é uma medida do nível de sólidos na cultura de células.

[0099] Durante a produção, uma fase de crescimento pode ocorrer a uma temperatura mais alta do que uma fase de produção. Por exemplo, uma fase de crescimento pode ocorrer em um ponto fixo de primeira temperatura de cerca de 35 °C a cerca de 38 °C, e uma fase de produção pode ocorrer a uma set-point segunda temperatura de cerca de 29 °C a cerca de 37 °C, opcionalmente desde cerca de 30 °C a cerca de 36 °C ou entre cerca de 30 °C a cerca de 34 °C.

[00100] Além disso, indutores químicos de produção de proteína, tais como a cafeína, butirato, e/ou hexametileno bisacetamida (HMBA), podem ser adicionados ao mesmo tempo que, antes, ou após uma mudança de temperatura. Se indutores são adicionados após uma mudança de temperatura, eles podem ser adicionados a partir de uma hora até cinco dias depois da mudança de temperatura, opcionalmente, de um a dois dias após a mudança de temperatura. As culturas de células podem ser mantidas por vários dias ou mesmo semanas, enquanto, que as células produzem a(s) proteína desejada.

[00101] Outro método para manter as células em um estado fisiológico desejado é o de induzir parada de crescimento de células por exposição da cultura de células a condições de baixa L-asparagina (ver por exemplo, Publicação WIPO No. WO2013/006479). Parada de crescimento celular pode ser obtida e mantida através de um meio de cultura que contém uma concentração limitante de L-asparagina e manutenção de uma baixa concentração de L-asparagina na cultura de células. Manter a concentração de L-asparagina em 5 mM ou menos pode ser usado para manter as células em um estado de parada de crescimento em que a produtividade aumentou.

[00102] Inibidores do ciclo celular, composto conhecido ou suspeito de regular a progressão do ciclo celular e os processos associados de transcrição, reparação de DNA, diferenciação, senescência e apoptose relacionados com isto também são úteis para induzir a parada de crescimento de células. Inibidores do ciclo celular que interagem com a maquinaria do ciclo, tais como quinases dependentes de ciclina (CDKs), são úteis como também são aquelas moléculas que interagem com as proteínas a partir de outras vias, tais como AKT, mTOR, e outras vias que afetam, direta ou indiretamente, o ciclo de célula.

[00103] Condições de cultura de células adequadas para os métodos da presente invenção são aquelas que são normalmente utilizadas e conhecidos por lote, fed batch ou perfusão (contínua) de cultura de células ou qualquer combinação destes métodos, com especial atenção ao pH, o oxigénio dissolvido (O2), e dióxido de carbono (CO2), agitação e umidade e temperatura.

[00104] Os métodos da invenção podem ser utilizados para cultura de células que expressam proteínas recombinantes de interesse. As proteínas recombinantes expressas podem ser secretadas para o meio de cultura a partir do qual elas podem ser recuperadas e/ou recolhidas. Além disso, as proteínas podem ser purificadas ou parcialmente purificadas a partir de tal cultura ou componente (por exemplo, a partir de meio de cultura) utilizando processos conhecidos e os produtos conhecidos na técnica e/ou disponíveis a partir de vendedores comerciais. As proteínas purificadas podem então ser "formuladas", significando trocada de tampão para uma formulação farmaceuticamente aceitável, esterilizada, embalada a granel e/ou embalada para o usuário final. As formulações farmaceuticamente aceitáveis podem incluir diluentes, transportadores, solubilizantes, emulsionantes, conservantes e/ou adjuvantes. Preparação de formulações farmaceuticamente aceitáveis estão dentro da perícia daqueles versados na técnica e inclui as descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. ed. 1995, Mack Publishing Company, Easton, PA.

[00105] Em uma forma de realização da invenção está previsto que a proteína recombinante é uma glicoproteína. Em uma forma de realização da invenção está previsto que a proteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste de um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma proteína de fusão recombinante, ou uma citocina. Também é fornecida uma proteína recombinante produzida pelo método da invenção. Numa concretização a proteína recombinante de acordo é formulada numa formulação farmaceuticamente aceitável.

[00106] Tal como aqui utilizado "peptídeo"," polipeptídio "e" proteína "são utilizados alternadamente e referem-se a uma molécula compreendendo dois ou mais resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros por ligações peptídicas. Peptídeos, polipeptídios e proteínas também são inclusive de modificações incluindo, mas não se limitando a glicosilação, resultando em glicoproteínas, ligação de lipídios, sulfatação, gama- carboxilação de resíduos de ácido glutâmico, hidroxilação e ADP-ribosilação.

[00107] Tal como aqui utilizado, o termo "glicoproteína" refere-se a peptídeos e proteínas, incluindo os anticorpos, tendo pelo menos uma cadeia lateral de oligossacarídeo, incluindo resíduos de manose. As glicoproteínas podem ser homólogas à célula hospedeira, ou podem ser heterólogas, ou seja, estranhas à célula hospedeira utilizada, tal como, por exemplo, uma glicoproteína humana produzida por uma célula hospedeira de ovário de hamster chinês (CHO). Tais glicoproteínas são geralmente referidas como "glicoproteínas recombinantes." Em certas formas de realização, glicoproteínas expressas por uma célula hospedeira são diretamente secretadas no meio.

[00108] As proteínas podem ser de interesse científico ou comercial, incluindo drogas à base de proteínas. As proteínas incluem, entre outras coisas, anticorpos, proteínas de fusão e citocinas. Peptídeos, polipeptídios e proteínas podem ser produzidos por linhagens de células de origem animal recombinante, utilizando métodos de cultura de células e podem ser referidos como "peptídeo recombinante", "polipeptídio recombinante" e "proteína recombinante". A(s) proteína expressa pode ser produzida intracelularmente ou secretada no meio de cultura a partir do qual podem ser recuperadas e/ou recolhidas.

[00109] Os exemplos não limitativos de proteínas de mamíferos que podem ser vantajosamente produzidas pelos métodos desta invenção incluem proteínas compreendendo sequências de aminoácidos idênticas ou substancialmente semelhante à totalidade ou a parte de uma das seguintes proteínas: fator de necrose tumoral (TNF), ligante de FLT3 (documento WO 94/28391), eritropoietina, trombopoietina, calcitonina, IL-2, angiopoietina-2 (Maisonpierre et al. (1997), Science 277(5322): 55-60), ligante para ativador de receptor de NF-kapa B (RANKL, WO 01/36637), fator de necrose tumoral (TNF) relacionado com o ligante indutor de apoptose (TRAIL, WO 97/01633), linfopoietina derivada de estroma tímica, fator de estimulação de colónias de granulócitos, fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF, Patente australiana N° 588,819), fator de crescimento de mastócitos, fator de crescimento de célula-tronco (Patente US No.6,204,363), fator de crescimento epidérmico, fator de crescimento de queratinócitos, fator de crescimento e desenvolvimento de megacariote, RANTES, proteína tipo fribrinogene 2 humano (FGL2; acesso NCBI no. NM_00682; Rüegg e Pytela (1995), Gene 160: 257-62) hormônio de crescimento, insulina, insulinotropina, fatores de crescimento do tipo insulina, hormônio de paratireoide, interferões incluindo os a-interferões, Y—interferões, e interferões de consenso (Patentes US Nos. 4,695,623 e 4,897471), fator de crescimento dos nervos, fator neurotrófico derivado do cérebro, proteínas tipo sinaptotagmina (SLP 1-5), neurotrofina-3, glucagon, interleucinas, fatores estimuladores de colónias, linfotoxina- p, fator inibidor de leucemia, e oncostatina-M. As descrições de proteínas que podem ser produzidas de acordo com os métodos da invenção podem ser encontradas em, por exemplo, Human Cytokines: Handbook for Basic and Clinical Research, todos os volumes (Aggarwal and Gutterman, eds. Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998); Growth Factors: A Practical Approach (McKay e Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); e The Cytokine Handbook, Vols. 1 e 2 (Thompson e Lotze eds., Academic Press, San Diego, CA, 2003).

[00110] Além disso, os métodos da invenção seriam úteis para a produção de proteínas compreendendo a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos de um receptor para qualquer uma das proteínas acima mencionadas, um antagonista para um receptor deste tipo, ou qualquer uma das proteínas acima mencionadas, e/ou proteínas substancialmente semelhantes a estes receptores ou antagonistas. Estes receptores e antagonistas incluem: ambas as formas de receptor do fator de necrose tumoral (TNFR, referido como p55 e p75, Patente US No. 5.395.760 e Patente US No. 5,610,279) Receptores de Interleucina-1 (IL-1) (tipos I e II; Patente EP N° 0460846, Patente US No. 4968607, e Patente US No. 5,767,064,), antagonistas do receptor de IL-1 (Patente US No. 6.337.072), antagonistas de IL-1 ou inibidores (Patentes US Nos. 5,981,713, 6.096.728, e 5,075,222) receptores de IL- 2, receptores de IL-4 (Patente EP n° 0 367 566 e Patente US N° 5856296), receptores de IL-15, receptores de IL-17, receptores de IL-18, receptores de Fc, receptor do fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos, receptor do fator de estimulação de colónias de granulócitos, receptores para oncostatina-M e fator inibidor de leucemia, receptor ativador de NF-kB kappa B (RANK, WO 01/36637 e Patente US No. 6.271.349), osteoprotegerina (Pat. US N° 6.015.938), receptores para TRAIL (incluindo receptores de TRAIL 1, 2, 3 e 4) e os receptores que compreendem os domínios de morte, como receptores de Fas ou do Indutor de Apoptose (AIR).

[00111] Outras proteínas que podem ser produzidas utilizando a presente invenção incluem proteínas que compreendem toda ou parte das sequências de aminoácidos de antígenos de diferenciação (referidas como proteínas CD) ou seus ligantes ou proteínas substancialmente semelhantes a qualquer uma dessas. Tais antígenos são descritos em Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutani et al., eds., Kobe, Japão, 1996). As proteínas CD semelhantes são divulgadas nos seminários subsequentes. Exemplos de tais antígenos incluem CD22, CD27, CD30, CD39, CD40 e ligantes dos mesmos (ligante de CD27, ligante de CD30, etc.). Vários dos antígenos CD são membros da família do receptor do TNF, que também inclui 41BB e OX40. Os ligantes são frequentemente membros da família do TNF, como são o ligante 41BB e o ligante OX40.

[00112] As proteínas enzimaticamente ativas ou seus ligantes também podem ser produzidos utilizando a presente invenção. Exemplos incluem proteínas compreendendo a totalidade ou parte de uma das seguintes proteínas ou os seus ligantes ou uma proteína substancialmente semelhante a um dos seguintes: uma desintegrina e membros da família domínio metaloproteinase, incluindo a Enzima Conversora de TNF-alfa, várias quinases, glucocerebrosidase, superóxido-dismutase, ativador de plasminogênio tissular, fator VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, globinas, um antagonista de IL-2, alfa- 1 antitripsina, ligantes para quaisquer das enzimas supramencionadas e muitas outras enzimas e respectivos ligantes.

[00113] O termo "anticorpo" inclui a referência a ambas as imunoglobulinas glicosiladas e não glicosiladas de qualquer isotipo ou subclasse ou a uma região de ligação de antígeno destas que compete com o anticorpo intacto pela ligação específica, a menos que especificado o contrário, incluindo humano, humanizado, quimérico, multiespecífico, monoclonal, policlonal e oligômeros ou seus fragmentos de ligação de antígeno. Também estão incluídas as proteínas tendo um fragmento ou região de ligação de antígeno, como o Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, diacorpos, Fd,dAb, maxicorpos, moléculas de anticorpo de cadeia única, fragmentos da região determinante de complementaridade (CDR), scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e polipeptídios que contêm pelo menos uma porção de uma imunoglobulina que seja suficiente para conferir uma ligação de antígeno específica a um polipeptídio alvo. O termo "anticorpo" é inclusivo de, mas não está limitado a aqueles que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transfectada para expressar o anticorpo.

[00114] Exemplos de anticorpos incluem, mas não estão limitados àqueles que reconhecem qualquer uma ou uma combinação de proteínas incluindo, mas não limitadas às proteínas acima mencionadas e/ou os seguintes antígenos: CD2, CD3, CD4, CD8, CD11a, CD14, CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD147, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL- 3, IL-7, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor de IL-2, receptor de IL-4, receptor de IL-6, receptor de IL-13, subunidades do receptor de IL-18, FGL2, PDGF-β e seus análogos (ver Patentes US Nos. 5.272.064 e 5.149.792), VEGF, TGF, TGF-β2, TGF-β1, receptor de EGF (ver Patente US 6.235.883) receptor de VEGF, fator de crescimento de hepatócitos, ligante de osteoprotegerina, interferão gama, estimulador de linfócitos B (BLyS, também conhecido como BAFF, THANK, TALL-1, e ztnf4; ver Do e Chen-Kiang (2002), Cytokine Growth Factor Rev. 13 (1) : 19-25), complemento C5, IgE, antígeno tumoral de CA125, antígeno do tumor de MUC1, antígeno de PEM, LCG (que é um produto do gene que é expresso em associação com câncer do pulmão), HER-2, HER-3, um tumor associado a glicoproteína de TAG-72, antígeno de SK-1, epítopos associados a tumores que estão presentes em níveis elevados nos soros de pacientes com câncer de cólon e/ou do pâncreas, epítopos associados a câncer ou proteínas expressas na mama, cólon, células escamosas, próstata , pâncreas, pulmão, e/ou células de câncer do rim e/ou no melanoma, glioma, ou as células de neuroblastoma, o núcleo necrótico de um tumor, integrina alfa 4 beta 7, a integrina VLA-4, integrinas B2, receptores de TRAIL 1, 2 , 3, e 4, RANK, ligante de RANK, TNF-α, molécula de adesão de VAP- 1, molécula de adesão da célula epitelial (EpCAM), molécula-3 de adesão intercelular (ICAM-3), leucointegrina adesina, glicoproteína plaquetária de Ilb GP/IIIa, cadeia pesada de miosina cardíaca, hormônio de paratireoide, rNAPc2 (que é um inibidor do fator de fator VIIa do tecido), MHC I, antígeno carcinoembrionário (CEA), alfa-fetoproteína (AFP), fator de necrose tumoral (TNF), CTLA-4 (que é um antígeno associado a linfócitos T citotóxicos), receptor de Fc—Y—1, HLA-DR 10 beta, antígeno de HLA-DR, esclerostina, L-selectina, vírus respiratório sincicial, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da hepatite B (VHB), Streptococcus mutans, e Staphlycoccus aureus. Exemplos específicos de anticorpos conhecidos que podem ser produzidos usando os métodos da invenção incluem, mas não estão limitados a adalimumabe, bevacizumabe, infliximabe, abciximabe, alemtuzumabe, bapineuzumabe, basiliximabe, belimumabe, briakinumabe, canakinumabe, certolizumabe pegol, cetuximabe, conatumumabe, denosumabe, eculizumabe, gemtuzumabe ozogamicina, golimumabe, ibritumomabe tiuxetano, labetuzumabe, mapatumumabe, matuzumabe, mepolizumabe, motavizumabe, muromonabe-CD3, natalizumabe, nimotuzumabe, ofatumumabe, omalizumabe, oregovomabe, palivizumabe, panitumumabe, pemtumomabe, pertuzumabe, ranibizumabe, rituximabe, rovelizumabe, tocilizumabe, tositumomabe, trastuzumabe, ustekinumabe, vedolizomabe, zalutumumabe e zanolimumabe.

[00115] A invenção também pode ser usada para produzir proteínas recombinantes de fusão que compreendem, por exemplo, qualquer das proteínas acima mencionadas. Por exemplo, proteínas de fusão recombinantes que compreendem uma das proteínas acima mencionadas, além de um domínio de multimerização, tais como um zíper de leucina, uma espiral enrolada, uma porção de Fc de uma imunoglobulina, ou uma proteína substancialmente semelhante, podem ser produzidos utilizando os métodos da invenção. Ver, por exemplo, WO94/10308; Lovejoy et al. (1993), Science 259:1288-1293; Harbury et al. (1993), Science 262:1401-05; Harbury et al. (1994), Nature 371:80-83; Hâkansson et al.(1999), Structure 7:255-64. Especificamente incluídas entre tais proteínas de fusão recombinantes são proteínas em que uma porção de um receptor está fundida a uma porção Fc de um anticorpo como etanercepte (um p75 TNFR:Fc) e belatacepte (CTLA4:Fc). As proteínas quiméricas e polipeptídios, bem como fragmentos ou porções, ou mutantes, variantes ou análogos de qualquer uma das proteínas e polipeptídios acima mencionados também estão incluídos entre as proteínas adequadas, polipeptídios e peptídeos que podem ser produzidos pelos métodos da presente invenção.

[00116] Embora a terminologia utilizada neste pedido seja padrão na técnica, as definições de certos termos são aqui fornecidas para assegurar a clareza e definição do significado das reivindicações. Unidades, prefixos e símbolos podem ser denotados em sua forma aceita de SI. Intervalos numéricos recitados aqui são inclusivos dos números que definem o alcance e incluem e são de suporte a cada número inteiro dentro do intervalo definido. Os métodos e técnicas aqui descritos são geralmente realizadas de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na arte e tal como descrito em várias referências gerais e mais específicos que são citadas e discutidas ao longo da presente especificação, a menos que indicado de outra forma. Ver, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), e Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Todos os documentos, ou partes de documentos, citados neste pedido, incluindo, mas não limitado a patentes, pedidos de patente, artigos, livros, e tratados, são expressamente incorporados por referência. O que é descrito numa forma de realização da invenção pode ser combinado com outras formas de realização da invenção.

[00117] A presente invenção não deve ser limitada pelas encarnações específicas descritas neste documento, que se destinam como simples ilustrações dos aspectos individuais da invenção, e componentes e métodos funcionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção. De fato, as várias modificações da invenção além daquelas mostradas e descritas nisto serão aparentes para àquelas pessoas versadas na técnica a partir da descrição antecedente e desenhos que acompanham. Tais modificações são destinadas a estar dentro do escopo das reivindicações anexas.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00118] Níveis de ornitina extracelulares foram correlacionados com altos teores de glicoformas de manose. Oito linhagens de células CHO que expressam anticorpos recombinantes com elevado teor de glicoforma de manose variando de <5% a> 20% foram escolhidas para esta experiência (linhagem celular A - linhagem celular H). As células foram cultivadas em uma cultura fed-batch de 10 dia em frascos de agitação utilizando dois meios de cultura de células proprietários diferentes, cada um contendo nenhuma ornitina (Mídia # 1 e 2 Mídia #). Amostras de mídia gastas foram tomadas nos dias 8, 9 e 10 da cultura e foram submetidas a uma análise metabolômica em grande escala. HM% foi determinado utilizando um método de Endo-H rCE-SDS, depois substituído pelo método descrito abaixo de HILIC. Níveis relativos de ornitina no meio gasto foram determinados por análise metabolômica em grande escala em que componentes dos meios foram separados por cromatografia líquida e detectados por espectrometria de alta resolução. Os componentes foram identificados combinando os seus espectros de fragmentação a uma biblioteca de espectros de compostos conhecidos. A abundância relativa de cada componente foi determinada a partir da área do pico dos seus sinais de espectrometria de massa. Os altos níveis de glicano de manose (% HM) dos anticorpos monoclonais secretados de linhagens celulares A-H nos dias 8, 9 e 10 na Mídia # 1 e Mídia # 2 são mostrados nas Figuras 2A e B. Figura 2C mostra a correlação entre a % de alta manose e os níveis de ornitina extracelulares. A correlação foi determinada pela comparação de todas as 8 linhagens celulares (representadas pelos quadrados) usando dados de amostras do dia 9. Os resultados sugeriram uma forte correlação entre o teor de glicoforma de manose e níveis extracelulares de ornitina.

[00119] Em seguida, a linhagem celular H foi cultivada em cultura fed batch num biorreator de 3L. Duração da cultura foi de 12 dias. Quatro alimentações de bolus de 7%, 9%, 9% e 9% foram feitas nos dias 3, 5, 7 e 9. Além disso, a solução de glicose a 50% foi adicionada diariamente, começando no dia 3, conforme o necessário para manter uma concentração de glicose superior a 2 g/L. Biorreatores de produção foram inoculados com 15 x 105 células/mL após 4 dias de crescimento. As células foram mantidas em meio de crescimento até se ter iniciado uma fase de produção. Foram então comparadas oito condições de processos diferentes. Condição # 1 funcionou como controle. Nenhuma alteração foi feita para a mídia de alimentação de produção.

[00120] Na Condição # 2, betaína foi complementada nos meios de alimentação de produção a uma concentração de 24 mM no dia 0. Mais suplementos betaína não foram fornecidos. Quatro alimentações de bolus de 7%, 9%, 9% e 9% foram feitas nos dias 3, 5, 7 e 9. Além disso, a solução de glicose a 50% foi adicionada diariamente, começando no dia 3, conforme o necessário para manter uma concentração de glicose superior a 2 g/L.

[00121] Em condições # 3 e # 4, a remoção de sulfato de cobre foi testada. O sulfato de cobre foi removido a partir do pó de mídia de base de produção. Condição # 3 serviu como um controle, uma solução padrão de sulfato de cobre foi adicionada ao meio de base. Em Condição # 4, nenhum sulfato de cobre foi adicionado a qualquer meio, criando um ambiente de cultura com deficiência de cobre. Para ambas Condição # 3 e # 4, ambos foram tratados com os mesmos meios de bolus "feed" que contêm cobre.

[00122] Em condições # 5 # 8, alta e baixa osmolaridade foram testadas. Em condições # 5 e # 6, as células foram alimentadas com meio de produção de lote de 90%, isto é, 10% a menos de nutrientes foram fornecidos, o que se traduz em que as células experimentam osmolaridade reduzida. Na Condição # 6, os meios de cultura celular foram trazidos de volta para o nível de controle, ~300 mOsm, por titulação com NaCl. Na Condição # 7 e # 8 as células foram alimentadas com meio de alimentação de 85%, com o meio na Condição # 8 sendo trazido de volta para o nível de controle por titulação com NaCl.

[00123] Amostras de mídia gastas foram tomadas nos dias 3, 6, 8, 9 e 10 da cultura e foram submetidas a uma análise metabolômica em grande escala.

[00124] Mais uma vez, houve uma correlação significativa entre ornitina extracelular e altos teores de glicoforma de manose. Figuras 3A mostram os níveis de glicano de manose altos em porcentagem detectados quando a linhagem celular H foi exposta às 8 condições de biorreator diferentes (# 1 a # 8). A Figura 3B mostra os níveis extracelulares de ornitina correspondentes. A Figura 3C mostra a correlação entre a % de alta manose e os níveis de ornitina extracelulares. A correlação foi determinada pela comparação de todas as 8 condições (representadas pelos quadrados) usando dados de amostras do dia 9.

Exemplo 2

[00125] Os níveis de expressão de mRNA de Arginase 1 foram medidos nos dias selecionados durante a cultura de produção fed-batch de 10 dias utilizando as oito linhagens celulares descritas no Exemplo 1.

[00126] Os níveis de expressão de mRNA foram avaliados usando um kit de Ensaio QuantiGene Multiplex, (Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

[00127] Arginase 1, a enzima que catalisa a conversão de arginina para ornitina, verificou-se ser regulada para cima em linhagens de células com níveis mais elevados de alta manose, de um modo dependente do curso de tempo, ver Figura 4. Isto sugere que o direcionamento específico com inibidores da arginase para bloquear a atividade da arginase e reduzir a quantidade de produção de ornitina poderia ser usado para diminuir os níveis elevados de manose glicano.

Exemplo 3

[00128] Este exemplo demonstra que a manipulação de teor de glicoforma de alta manose de glicoproteínas recombinantes, regulando a acumulação de ornitina na célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante é endereçada. Linhagens de células, cultura de células e mídia

[00129] As linhagens celulares H foram utilizadas neste estudo. As células foram mantidas em frascos de agitação de 3L Erlenmeyer (Corning Life Sciences, Lowell, MA) com 1L de volume de trabalho e cultivadas sob condição umidificada padrão a 36 ° C, 5% de CO2, e agitadas a 70 rpm numa incubadora automática CO2 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). As células foram sub-cultivadas num meio de crescimento seletivo contendo uma concentração de 500 nM de metotrexato (MTX) de quatro em quatro dias, e, subsequentemente transferidas, inoculadas e cultivadas num meio de crescimento durante quatro dias antes de serem semeadas numa placa de 24 poços para as experiências descritas abaixo. Pequena escala de perfusão simulada

[00130] Uma perfusão simulada modificada numa placa de 24 poços profundos (Axygen, Union City, CA) foi utilizada para avaliar os efeitos de concentrações de espermina, arginina, ornitina e arginase no elevado teor de modulação de manose (HMN). Uma formulação livre de arginina de uma mídia de perfusão foi utilizada para pequena escala de perfusão simulada Experimento #3 (estudos de concentração de arginina) de acordo com o projeto experimental. Em pequena escala de perfusão simulada de Experiência # 4 todos os inibidores de arginase foram adicionados a um meio de perfusão. Os quatro inibidores da arginase, cloridrato de BEC, DL-ct, cloridrato de diflourometilornitina, sal de monoacetato de NGAr-Hidroxi-L- arginina e sal de diacetato de Nw-Hidroxi-nor-arginina, foram adquiridos da Merck Millipore Corporation (Billerica, MA).

[00131] Resumidamente, as células de CHO foram semeadas em placa a uma densidade alvo variando de 10-20 X 106 células/mL com 3 mL de volume de trabalho para cada poço. As células foram cultivadas a 36 ° C, 5% de CO2, 85% de umidade relativa e agitadas a 225 rpm numa incubadora de 50-mm de diâmetro orbital Kuhner (Kuhner AG, Basel, Suíça) durante 3 ou 4 dias. A cada 24 horas, as células foram centrifugadas a 200 x g durante 5 minutos (Beckman Coulter, Brea, CA), para recolher os meios gastos e cada poço foi em seguida reabastecido com 3 mL de meio fresco. Os meios gastos recolhidos foram analisados para determinação do título, os metabolitos principais e elevado teor de manose % (% HMN) (quando necessário). As células foram então colhidas e as contagens de células e a viabilidade foram medidos. O crescimento celular, metabolitos e análise de título de anticorpos

[00132] Densidade de células viáveis e a viabilidade foram determinados utilizando um contador de células Cedex (Roche Innovative, Beilefed, Alemanha). Os metabolitos incluindo a glicose, lactato, amoníaco, glutamina, glutamato foram obtidos a partir de NovaBioprofile Flex (Nova Biomedical, Waltham, MA). Concentração de anticorpos no meio gasto foi determinada utilizando um ensaio por cromatografia líquida de Ultra Performance (UPLC) (Waters Corporation, Milford, MA) de Proteína A de Afinidade equipado com uma coluna de 50 milímetros x 4,6 mm i.d. POROS A/20 de proteína A (Life Technologies, Carlsbad, CA). Depois que a amostra foi injetada, a coluna foi lavada com fosfato salino tamponado (PBS) pH = 7,1 para remover as proteínas da célula hospedeira CHO. Anticorpos ligados foram, em seguida, eluídos em tampão de PBS acídico (pH = 1,9) e detectados por absorbância de UV a 280 nm para quantificar a concentração de anticorpo.

Mapa de HILIC Glicano

[00133] Diferentes espécies de N-glicano de anticorpos foram analisadas por cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC). Os anticorpos purificados foram digeridos por N- glicosidase F (New England Biolabs, Ipswich, MA) a 37 ° C durante 2 horas para liberar os glicanos. Os glicanos liberados foram marcados com o ácido 2-aminobenzóico e limpos utilizando cartuchos GlycoClean S (Prozyme, Heyward, CA). Glicanos purificados foram então dessalinizados e reconstituídos em água para ensaio. Cromatografia de HILIC foi realizada com uma coluna de Glicano de 100 mm Dl x 2,1 milímetros BEH usando UPLC (Waters Corporation, Milford, MA) e os glicanos eluídos foram detectados, identificados e qualificados por um detector de fluorescência com base em diferentes tempos de eluição de diferentes glicanos.

Experimento #1 de perfusão simulada de pequena escala: Estudo de Concentração de Espermina

[00134] Cinco concentrações diferentes de espermina foram testadas neste estudo. Meios de cultura de células de perfusão contendo 0, 7, 17, 35 e 100 uM de tetracloridrato de espermina (espermina 4HCl) foram testados. O meio de perfusão contendo 35 μM de espermina atuou como controle. Os resultados a partir de amostras de 5 dias mostram que a medida que a concentração de espermina foi reduzida, HMN% diminuiu, veja a Figura 5. Título não foi afetada pela redução/depleção de espermina. Redução do nível de HM foi conseguida através da redução do nível de ornitina quando a quantidade de espermina foi reduzida na mídia. Como mostrado na Figura 6, a quantidade de ornitina diminuiu com a diminuição da concentração de espermina.

Experimento #2 de perfusão simulada de pequena escala: Estudo de Concentração de Ornitina

[00135] Quatro concentrações diferentes de monocloridrato de L-ornitina foram testados. Meios de cultura de células de perfusão contendo 14.8, 6, 0.6 e 0 (controle) mM de monocloridrato de L-ornitina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram usados. Os resultados mostraram que à medida que a concentração de ornitina foi aumentada, aumentou HMN%, ver Figura 7. Uma segunda experiência foi efetuada usando a linhagem celular I em biorreatores de 2 litros. Linhagem de células I que expressa um anticorpo de IgG2 e foi cultivada em condições fed-batch. Em um biorreator, os meios receberam um único suplemento de 0,1 g/L de monocloridrato de L-ornitina no dia 0 de cultura, o segundo biorreator atuou como um controle livre de ornitina. As culturas foram mantidas a partir de 12 dias em meio de cultura celular contendo soja-hidrolisados. Meio de alimentação de bolus contendo hidrolisados de soja foi alimentado nos dias 4 e 8.

[00136] Perfilagem de glicano foi efetuada por mapeamento de peptídeo. O anticorpo foi digerido por tripsina com um método semelhante ao descrito por Ren et al. (2009) Anal. Biochem. 392 12-21). Especificamente, cerca de 50-70 μg de cada anticorpo foram desnaturados e reduzidos com 7,0 M de guanidina'HCl, 6 mM de ditiotreitol (DTT) em 0,2 M de tampão tris (pH 7,5) a 37 ° C durante 30 minutos. Cada amostra reduzida/desnaturada foi alquilada com ácido iodoacético a 14 mM a 25 °C durante 25 minutos, seguido de paragem da reação por adição de DTT a 8 mM. As amostras de anticorpo alquiladas/reduzidas foram então trocadas em um tampão de 0,1 M de Tris a pH 7,5 com uma coluna de centrifugação de remoção de detergente Pierce (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. A amostra permutada com tampão foi incubada a 37 °C com 3,5 μg de tripsina durante 60 minutos. A digestão foi extinta pela adição de 2,2 μl de ácido acético a 10%. Cerca de 12-17 μg de anticorpo digerido foram injetados para análise.

[00137] O anticorpo digerido foi analisado utilizando um sistema de HPLC Agilent 1260 conectado diretamente a um espectrómetro de massa Thermo Scientific LTQ-Orbitrap Elite (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Peptídeos proteolíticos foram separados numa coluna Waters 300 BEH C18 (Waters Corporation, Milford, MA) de 2,1 x 150 mm, partícula de 1.7μ a 40 ° C com uma taxa de fluxo de 0,2 mL/min. A fase móvel A foi de 0,02% TFA em água e a fase móvel B foi de 0,018% de TFA em acetonitrilo. Os peptídeos foram eluídos com um gradiente de 0,5-40% de B em 90 minutos, seguido por lavagem da coluna e re-equilibração. Espectrômetro de massa foi criado para uma varredura completa MS em orbitrap com 120.000 de resolução seguido por cinco varreduras dados-dependentes CID MS/MS na armadilha linear com exclusão dinâmica. Análise de dados automatizada para criação de perfis de glicano foi realizada utilizando MassAnalyzer (ver Zhang, (2009) Analytical Chemistry 81: 8354-8364).

[00138] Os resultados novamente mostram que a medida que a concentração é aumentada a ornitina HMN% aumentou, ver Figura 8.

Experimento #3 de perfusão simulada de pequena escala: Estudo de concentração de arginina

[00139] Cinco concentrações diferentes de arginina foram testadas neste estudo. Meios de cultura de células de perfusão contendo 3,686, 1,38, 0,92 e 0,46 g/l de arginina foram testados. O meio de perfusão contendo 1,843 g/L de arginina foi utilizado como um controle. Os resultados mostram que conforme a concentração de arginina aumenta a % de HM aumentou, ver Figura 9.

Experimento #4 de perfusão simulada de pequena escala: Estudos de Inibidor de Arginase

[00140] Foram realizadas duas séries de experiências de inibidor da arginase. Na primeira série de experiências, quatro inibidores de arginase disponíveis comercialmente, BEC- cloridrato, DL-α, diflourometilornitina-cloridrato, sal de monoacetato de NGAr-Hidroxi-L-arginina e sal de diacetato de Na-Hidroxi-nor-arginina foram adicionados às culturas de células em três concentrações diferentes, 1, 10 e 20 μM. O controle era livre de inibidor. A partir desta experiência concluiu-se os inibidores de BEC e DL-α foram mais eficazes na diminuição de HM% (Figura 10).

[00141] Uma segunda série de experiências foi realizada usando os inibidores de BEC e DL-α. O inibidor de BEC foi testado a concentrações de 0 (controle), 10 μM e de 0,5 mM em meio de cultura de células de perfusão. Os inibidores de DL-α foram testados a concentrações de 0 (controle), 10 μM, 1,0 mM e de 2,0 mM em meio de cultura de perfusão. Demonstrou-se que a HM% foi reduzida conforme ambas concentrações de inibidor aumentaram, ver Figura 11.

Claims

1. Método para aumentar o teor de glicoforma de alta manose de uma glicoproteína recombinante caracterizado pelo fato de que compreende a cultura de uma célula de mamífero hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante numa cultura de células compreendendo uma selecionada do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina aminotransferase, um inibidor de sintase de óxido nítrico, um inibidor de ornitina de descarboxilase, e um inibidor de arginina de descarboxilase, em que a produção de ornitina na célula hospedeira é aumentada, quando comparada à célula hospedeira expressa a glicoproteína recombinante cultivada numa cultura de célula isenta de um selecionado do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina aminotransferase, um inibidor de sintase de óxido nítrico, um inibidor de ornitina de descarboxilase, e um inibidor de arginina de descarboxilase, e a glicoproteína recombinante tem um maior teor de glicoforma de alta manose de glicoproteínas do que quando a glicoproteína recombinante é expressa na cultura de células isenta de um selecionado do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina aminotransferase, um inibidor de sintase de óxido nítrico, um inibidor de ornitina de descarboxilase, e um inibidor de arginina de descarboxilase.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de ornitina aminotransferase é 5- fluorometilornitina; o inibidor de sintase de óxido nítrico é selecionado do grupo que consiste em 2-etil-2-tiopseudoureia ou N-nitro- L-arginina e LG-Monometil-L-arginina; ou o inibidor de ornitina de descarboxilase é arginina dimetil assimétrica.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulada pela adição de ornitina, pelo menos, 0,6 mM ao meio de cultura de células.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de ornitina é selecionada do grupo que consiste em 0,6 a 14,8 mM; 6 a 14,8 mM; 0,6 mM; 6 mM; e 14,8 mM.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a acumulação de ornitina na célula hospedeira é regulada pela adição de arginina, pelo menos, 8,7 mM ao meio de cultura de células.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a concentração de arginina é selecionada do grupo que consiste em 8,7 mM a 17,5 mM; 8,7 mM; e 17,5 mM.

7. Método de produção de uma glicoproteína recombinante, caracterizado pelo fato de que o teor de glicoforma de alta manose é aumentado compreendendo a cultura de uma célula de mamífero hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante numa cultura celular, compreendendo uma selecionada do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina aminotransferase, inibidor de sintase de óxido nítrico, inibidor de ornitina de descarboxilase, e um inibidor de arginina de descarboxilase, em que a produção de ornitina na célula hospedeira é aumentada quando comparada à célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante é cultivada numa cultura de célula isenta de um selecionado do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina aminotransferase, um inibidor de sintase de óxido nítrico, e um inibidor de ornitina de descarboxilase, quando comparada à célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante é cultivada numa cultura de célula isenta de um selecionado do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina aminotransferase, um inibidor de sintase de óxido nítrico, um inibidor de ornitina de descarboxilase, e um inibidor de arginina de descarboxilase, em que a glicoproteína recombinante tem um aumentado teor de glicoforma de alta manose quando comparada à glicoproteína recombinante expressada na cultura celular isenta de um selecionado do grupo que consiste em ornitina, arginina, um inibidor de ornitina de descarboxilase, um inibidor da sintase de óxido nítrico, e um inibidor de descarboxilase da arginina.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que: o inibidor de ornitina aminotransferase é 5- fluorometilornitina; o inibidor da sintase de óxido nítrico é selecionado do grupo que consiste em 2-etil-2-tiopseudoureia e N-nitro-L-arginina e LG-Monometil-L-arginina; ou inibidor de decarboxilase de arginina é dimetil-arginina assimétrica.

9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante é cultivada numa cultura em lote, cultura fed-batch, cultura de perfusão, ou as suas combinações.

10. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a cultura é uma cultura de perfusão.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a perfusão compreende perfusão contínua.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que a taxa de perfusão é constante.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a perfusão é realizada a uma taxa de menos do que ou igual a 1,0 volume de trabalho por dia; ou conseguida por alternância de fluxo tangencial.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante é cultivada num biorreator.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o biorreator tem uma capacidade de pelo menos 500L; 500L a 2000l; e 1000L a 2000L.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a célula hospedeira que expressa a glicoproteína recombinante é cultivada num meio de cultura de células sem soro.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura isento de soro é um meio de cultura de células de perfusão.

18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que as células hospedeiras são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína recombinante é selecionada a partir do grupo que consiste em um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico, uma glicoproteína de fusão recombinante ou uma citocina.

20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um passo de colheita da glicoproteína recombinante produzida pela célula hospedeira.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que a glicoproteína recombinante produzida pela célula hospedeira é purificada e formulada numa formulação farmaceuticamente aceitável.

22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o inibidor de descarboxilase da ornitina é alfadefluorometilornitina ou butóxido de piperonil.