BRPI0007600B1 - composição multienzimática que apresenta atividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica, processo de produção da composição, e, utilização da mesma - Google Patents

Abstract

"produto multienzimático que apresenta atividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica, processo de produção do mesmo e utilização do produto". produto multienzimático que apresenta atividades glicoamilásica, proteolitica e xilanásica, caracterizado pelo fato de que ele é constituído de farelo de trigo fermentado com uma cepa de aspergillus niger, as ditas atividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica estando presentes em valores mínimos a seguir: glicoamilásica: pelo menos 100 ug por grama de matéria seca; proteolítica: pelo menos 100 up por grama de matéria seca; xilanásica: pelo menos 100 ux por grama de matéria seca; com a condição de que a atividade glicoamilásica seja de pelo menos 750 ug por grama de matéria seca e/ou a atividade xilanásica seja de pelo menos 300 ux por grama de matéria seca. utilização na produção de etanol ou de alimentos para animais monogástricos.

Description

“COMPOSIÇÃO MULTIENZIMÁTICA QUE APRESENTA ATIVIDADES GLICOAMILÁSICA, PROTEOLÍTICA E XILANÁSICA, PROCESSO DE PRODUÇÃO DA COMPOSIÇÃO, E, UTILIZAÇÃO DA MESMA”. A invenção refere-se a um produto multienzimático com atividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica e a um processo para a produção do mesmo por fermentação no estado sólido de farelo de trigo com Aspergillus niger. r E sabido produzir etanol partindo de amido de milho por um processo enzimático que compreende uma etapa de liquefação do amido por uma alfa-amilase que visa hidrolisar o amido a dextrinas, depois uma etapa de sacarificação por uma glicoamilase (também chamada amiloglicosidase) que visa hidrolisar as dextrinas a glicose e enfim uma etapa de fermentação mesta última em etanol. O emprego das enzimas alfa-amilase e glicoamilase é geralmente satisfatório quando se parte de leites de amido relativamente puros obtidos por moagem por via úmida do milho, porém quando se deseja substituir amidos de trigo ou farinhas de trigo pelo amido de milho, não se obtêm resultados satisfatórios com estas duas únicas enzimas em virtude da presença de hemiceluloses que aumentam a viscosidade dos mostos de farinha sacarificados ao ponto que isto cria um problema para a execução do r processo. E preciso utilizar na etapa de sacarificação enzimas auxiliares como celulases e hemicelulases para reduzir a viscosidade e remediar este problema. Além disso, é desejável utilizar igualmente proteases durante a sacarificação a fim de hidrolisar as proteínas da farinha e enriquecer assim o mosto com nitrogênio solúvel em previsão da etapa ulterior de fermentação alcoólica. A adição de fonte nitrogenada necessária ao crescimento das leveduras tradicionalmente efetuada durante esta fermentação também pode ser reduzida.

Todas estas enzimas estão individualmente disponíveis no comércio sob forma purificada, porém têm o inconveniente de serem relativamente caras e, portanto, de onerar, conseqüentemente, o custo da produção do etanol de trigo. Além disso, é preciso formular composições partindo das enzimas individuais, o que complica o processo.

Existe portanto uma necessidade de um produto multienzimático, de preço accessível, que combine atividades glicoamilásica, proteolítica e hemicelulásica a fim de poder produzir o etanol partindo de farinhas de trigo a um custo reduzido. A invenção visa satisfazer esta necessidade. A presente invenção refere-se a um produto multienzimático que apresenta atividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica, caracterizado pelo fato de que ele é constituído de farelo de trigo fermentado com uma cepa de Aspergillus Niger, as ditas atividades glicoamilásica, proteolítica e xilanásica estando presentes em valores mínimos a seguir: - glicoamilásica: pelo menos 100 UG por grama de matéria seca, - proteolítica: pelo menos 100 UP por grama de matéria seca, - xilanásica: pelo menos 100 UX por grama de matéria seca, com a condição de que a atividade glicoamilásica seja de pelo menos 750 UG por grama de matéria seca e/ou a atividade xilanásica seja de pelo menos 300 UX por grama de matéria seca.

De preferência, a atividade glicoamilásica é de pelo menos 1.500 UG por grama de matéria seca e/ou a atividade xilanásica é de pelo menos 400 UX por grama de matéria seca.

De preferência igualmente, a atividade proteolítica é de pelo menos 400 UP por grama de matéria seca. A invenção refere-se também a um processo de produção deste produto multienzimático caracterizado pelo fato de que ele compreende as etapas que consistem em (a) tomar farelo de trigo; (b) umidificar e tratar termicamente o dito farelo de maneira a pasteurizá-lo ou esterilizá-lo, (c) inocular o farelo de trigo resultante por uma cepa de Aspergillus Niger, (d) o farelo estando sob a forma de uma camada de pelo menos 10 cm de espessura, fazê-lo fermentar no estado sólido em um reator aerado e agitado periodicamente durante um período de 1 a 3 dias, a uma temperatura de 28-38 °C, de preferência de 32 a 36 °C, o farelo estando regulado a um teor de umidade inicial de 50 a 60% em peso sensivelmente mantido durante o período da fermentação, em condições de aeração apropriadas para evitar um acúmulo de dióxido de carbono prejudicial à fermentação no reator e uma elevação da temperatura em virtude da fermentação além da faixa indicada, até que o produto de fermentação apresente os valores mínimos a seguir de atividades enzimáticas: - glicoamilásica: pelo menos 100 UG por grama de matéria seca, - proteolítica: pelo menos 100 UP por grama de matéria seca, - xilanásica: pelo menos 100 UX por grama de matéria seca, com a condição de que a atividade glicoamilásica seja de pelo menos 750 UG por grama de matéria seca e/ou a atividade xilanásica seja de pelo menos 300 UX por grama de matéria seca.

De preferência, a atividade glicoamilásica é de pelo menos 1.500 UG por grama de matéria seca e/ou a atividade xilanásica é de pelo menos 400 UX por grama de matéria seca.

De preferência igualmente, a atividade proteolítica é de pelo menos 400 UP por grama de matéria seca.

De preferência, a cepa de Aspergillus Niger é escolhida entre a cepa NRRL 3112, a cepa ATCC 76061 e as cepas obtidas partindo das ditas cepas por eliminação ou mutação quando se procura uma atividade glicoamilásica elevada. A cepa ATCC 76061 é particularmente preferida.

Quando se procura uma atividade glicoamilásica elevada, o farelo de trigo utilizado como matéria de partida deve ser um farelo desamidonado. A parte esta restrição pode-se utilizar um farelo qualquer. De preferência, todavia, o farelo envolve uma proporção significativa (pelo menos 40% em peso) de partículas inferiores a 1 mm.

Fomece-se aqui a seguir, a título ilustrativo e não limitativo, as características dos dois farelos convenientes.

Características Farelo A Farelo B

Umidade (%) 12,3 19,5 Teor de proteínas (% MH*) 13,8 14,8 Teor de amido (% MH*) 24,6 24,3 Granulometria >1,25 mm 53,9 0,7 entre 1,0 e 1,25 mm 8,1 1,3 entre 0,5 e 1,0 mm 33,3 68,2 entre 0,25 e 0,5 mm 3,7 24,6 entre 0,16 e 0,25 mm 0,3 2,6 <0,16 mm 0,7 2,6 % MH = % em relação à matéria úmida. O farelo de trigo deve ser umidificado e tratado termicamente para pasteurizá-lo ou esterilizá-lo. É vantajoso que o tratamento térmico não preceda à uxnidificação, pois foram observados resultados de fermentação medíocres no caso em que se trata termicamente o farelo antes de umidificá-lo. O tratamento térmico pode consistir de um aquecimento por exemplo em uma autoclave. Um tratamento em autoclave de 20 minutos a 120-121 °C verificou-se ser muito satisfatório, porém condições menos rigorosas (pasteurização a 105 °C, durante 15 minutos em uma estufa) também são convenientes. É possível igualmente operar o tratamento térmico do farelo injetando-se vapor d'água, o que pode permitir operar simultaneamente a umidificação do farelo.

Vantajosamente, pode-se regular o pH por ocasião da umidifícação na faixa de 4 a 5,5 a fim de melhorar o efeito pasteurizante do tratamento térmico e o início da fermentação desejada.

Além de sua função de esterilização, o tratamento térmico tem por efeito favorecer a gelatinização do amido contido no farelo de trigo e, cuja disponibilidade deste substrato para o fungo Aspergillus niger, o que permite fermentações mais eficazes. A umidifícação do farelo é importante pois o teor de água inclui no desempenho da fermentação. O teor de água inicial do farelo é regulado inicialmente a 50-60 %, de preferência 50-55%, da massa total do farelo e d água e mantém-se o mesmo sensivelmente neste intervalo durante a fermentação, por exemplo, procedendo-se periodicamente a quantidades de água adicionadas para compensar a perda de água do meio. A expressão "sensivelmente mantida" quer dizer que é tolerável que a taxa de umidade assuma um valor que se desvia um pouco (+ 5 unidades %) do intervalo de 50-60% durante um período relativamente breve entre dois ajustes sucessivos r da taxa de umidade ou no final da fermentação. E vantajoso, em todo caso, não alcançar abaixo de uma taxa de umidade de 45%. A taxa de umidade do meio de cultura tende a abaixar durante a cultura por evaporação sob o efeito do aumento de temperatura gerado pelo crescimento füngico, o dito meio sendo um mal condutor de calor. A qualidade da água utilizada representa também um papel não negligenciável. Pode-se utilizar uma água corrente de boa qualidade ou água destilada. A inoculação do farelo de trigo pode ser praticada com qualquer inóculo apropriado. O perito na técnica conhece múltiplas maneiras de preparar um inóculo conveniente partindo de uma cepa selecionada. A dose de inoculação é vantajosamente de pelo menos 1x10 esporos / grama de matéria seca inicial. A fermentação pode ser conduzida em qualquer reator apropriado. Exemplos de reator que pode ser utilizado são aqueles descritos no artigo de A. DURAND e col. publicado em Agro-Food-Industry Hi-Tech (Maio-Junho 1997, páginas 39-42). A fermentação pode ser conduzida durante um período de 1 a 3 dias, de preferência de 30 a 60 horas. Abaixo de 1 dia, a fermentação é de longe incompleta. No final de 3 dias a fermentação é terminada ou quase terminada de sorte que seria antieconômico prolongá-la ainda mais. A temperatura do meio é tipicamente mantida entre 28 e 38 °C, de preferência entre 32 e 36 °C, o que corresponde ao domínio de atividade ótimo conhecido das cepas de Aspergillus niger a serem utilizadas na invenção. Vantajosamente, para esta finalidade, a temperatura do ar é regulada a 34-38 °C durante as primeiras horas da fermentação para favorecer a germinação dos esporos, depois reduzida a 28-32 °C para o resto da fermentação para contribuir para a regulagem da temperatura do meio. O pH do meio de fermentação não é regulado habitualmente. Se o seu valor de partida estiver próximo de 6,0-6,4, o pH desce até 3,8-4,2, durante a cultura, depois sobe de novo até o fim. Este retomo está geralmente correlacionado com a fase de esporulação do fungo. O acompanhamento da evolução do pH constitui um bom indicador do estado da cultura. O fermentador deve ser aerado, de preferência continuamente, a fim de adicionar o oxigênio necessário à fermentação e evitar o acúmulo excessivo de dióxido de carbono produzido pela fermentação. Além disso, a aeração toma parte no controle da temperatura e da umidade do meio de cultura. O ar será, de preferência, sensivelmente saturado com água para limitar a tendência ao ressecamento do meio. É difícil fornecer indicações quantitativas sobre a vazão de aeração, pois múltiplas variáveis, em particular o tamanho e a geometria do reator, a quantidade de seu carregamento etc... intervém. Simples ensaios de rotina permitirão, todavia, que o perito na técnica determine facilmente uma vazão de aeração conveniente em cada caso prático. A carga de farelo no fermentador deve ser periodicamente adicionada com a ajuda de meios de agitação, tais como pás, lâminas ou espátulas para agitação ou parafusos sem fim durante a fermentação para evitar a formação de massas impermeáveis e a fim que a aeração interesse da maneira mais homogênea possível toda a massa de farelo. É preciso, entretanto, evitar uma agitação demasiadamente vigorosa que podería prejudicar o fungo. O produto da invenção é um produto sólido que é útil especialmente para a produção de etanol partindo do trigo. Ele pode ser diretamente adicionado ao amido liquefeito (dextrinas) obtido na etapa de liquefação, a fim de proceder à sacarificação. Para esta aplicação, é a atividade glicoamilásica que é o fator mais importante. Será utilizado portanto, de preferência um produto da invenção que tenha uma atividade glicoamilásica, por exemplo de pelo menos 750 UG, de preferência de pelo menos 1500 UG por grama de matéria seca.

Uma outra utilização possível do produto daJnvenção refere-se à produção de alimentos para animais monogástricos, por exemplo, aves e porcos, à base de trigo. Nesta aplicação, é a atividade xilanásica que constitui o fator mais importante. Será utilizado portanto, de preferência, nesta aplicação, um produto que tenha uma atividade xilanásica elevada, por exemplo de pelo menos 400 UX por grama de matéria seca. O produto da invenção pode ser seco e congelado para sua conservação, se desejado. A secagem deve ser realizada a uma temperatura moderada para não afetar a atividade enzimática. Um aquecimento em estufa a 40 °C revelou-se apropriado, por exemplo. O congelamento, de seu lado, pode ser realizado sobre o produto úmido à baixa temperatura, por exemplo a -20 °C.

Nos exemplos, as diversas atividades enzimáticas foram medidas pelos métodos a seguir: a) Atividade glicoamilásicas A ação de uma preparação da glicoamilase (GA) sobre uma solução de amido acarreta a liberação de açúcares redutores. Aquecidos a 100 °C na presença de ácido 3,5-dinitrossalicílico (DNS), estas composições assumem uma cor castanho medida no espetrofotômetro (Kontron Instruments, Milão, Itália) a 540 nm. O meio da reação contém • Solução de amido a 1%: 500 μΐ • Tampão citrato 0,1 a pH 4,5 450 μΐ • Solução enzimática: 50 μΐ A reação se desenvolve durante 30 minutos a 60 °C (55 °C para as GA de Alorizae). São realizadas retiradas de amostra de 5 em 5 minutos, misturadas com DNS e colocadas em um banho gelado. Eles são em seguida aquecidos durante 5 minutos a 100 °Cm resfriados ràpidamente depois dosados a 540 nm.

Estabelecemos estas condições de dosagem após ter estudado a influência da temperatura e do pH sobre a atividade de nossas preparações de GA. Amido solúvel Merck (Darmstadt, Alemanha) foi empregado como substrato desta hidrólise enzimática. O DNS é preparado de acordo com o protocolo proposto por P. Bemfeld, Methods in enzymology, 1, 149-158 (1955) que é o seguinte: => Dissolver com antecedência: * 10 g de ácido 3,5-dinitrossalicílico * 200 ml de soda 2 molar * 200 ml de água destilada. => Adicionar em seguida: * 300 g de tartarato duplo de sódio e de potássio. => Completar o volume até 1 litro com água destilada após dissolução total: Uma vez preparado, este reagente deve ser conservado ao abrigo da luz. As curvas de calibração foram estabelecidas com glicose como produto de referência para a dosagem da atividade da glicoamilase ou para o acompanhamento das reações de liquefação - sacarifícação e com xilose para medir a atividade da xilanase.

Uma unidade de atividade da glicoamilase (UG) corresponde à quantidade de enzima necessária à liberação de um micromol de extremidades redutoras por minuto nas condições da dosagem com a glicose como referência. A atividade da glicoamilase, calculada com a ajuda da fórmula indicada a seguir, está relacionada à quantidade de matéria seca inicial (MSI): A = (P/V enz)*(Vferm/Mferm) * A corresponde à atividade GA expressa em UG.g de MSI'1 (pmol.min1, g de MSI'1), * P corresponde à velocidade de liberação de equivalentes de glicose em pmol.min1, * Venz representa o volume da solução de enzimas dosada em ml, * Vferm é o volume total de água destilada utilizado para extrair a solução de enzimas em ml, * Mferm, expressa em g de MSI, corresponde à massa inicial de produto seco do qual foi extraída a solução de enzimas. b) Atividade da protease Esta dosagem foi ajustada em relação à azocaseína de acordo com o método de Beinon, descrito na obra "Proteins Purification Methods - a Practical Approach", Harris E.L.V. e Angal, S (Editores). IRL-Press, Oxford University Press, 1-66 (1989). A degradação deste substrato por proteases acarreta a liberação de grupamentos azo que absorvem no UV a 340 nm. A evolução da absorbância durante a cinética de hidrólise desta proteína indica a importância da reação. O meio da reação contém: * Solução de azocaseína a 1%, pH 5,0: 1000 μΐ * Solução enzimática: 200 μΐ A azocaseína (Sigma, Saint-Louis, EUA) é dissolvida em um tampão de acetato 0,1 M a pH 5,0. Foram dosadas as atividades de proteases neste pH pois a azocaseína é insolúvel no tampão de acetato a pHs inferiores. A reação enzimática é realizada a 60 °C. São realizadas retiradas de amostras de 5 em 5 minutos durante 20 minutos e misturadas com o ácido tricloroacético (TCA) a 5% para interromper a reação.

Uma unidade de atividade de protease (UP) corresponde à quantidade de enzimas necessária ao aumento de 0,01 unidade A340rim por minuto, gerado pela liberação de grupos azo nas condições citadas anteriormente. Esta atividade, calculada de acordo com a fórmula indicada a seguir, está relacionada à matéria seca inicial (UP.G'1 de MSI) ou a atividade de glicoamilase (UP.UG'1): A - (P/Venz)*(Vferm/Mferm) * A corresponde à atividade de protease expressa em UP.g de MSI'1, * P corresponde à velocidade de liberação dos grupamentos azo expressa em aumento de 0,01 unidade Aa^nm.rnin'1, * Venz representa o volume da solução de enzimas dosada em ml, * Vferm é o volume total de água destilada utilizado para extrair a solução de enzimas em ml, * Mferm, expressa em g de MSI, corresponde à massa inicial de produto seco do qual foi extraída a solução de enzimas. c) Atividade da xilanase Para por em evidência esta atividade enzimática, faz-se agir as preparações de GA sobre uma solução de xilano solúvel e foram medidos os açúcares redutores liberados pelo método com DNS. O meio da reação é composto de: * Solução de xilano a 1%, pH 4,5: 900 μΐ * Solução enzimática: 100 μΐ A solução de xileno de larício (Sigma a 1% é preparada em tampão de citrato a pH 4,5 e a reação de desenvolve a 60 °C. São efetuadas retiradas de amostra de 5 em 5 minutos, durante 20 minutos, misturadas com DNS e colocadas em um banho gelado. Elas são em seguida dosadas de acordo com um protocolo idêntico ao exposto para a medida das atividades GA com a xilose como referência.

Uma unidade de atividade de xilanase (UX) corresponde à quantidade de enzimas necessária à liberação de um micromol de açúcares redutores por minuto. Esta atividade está relacionada à matéria seca inicial (UX.g"1 de MSI) ou à atividade da glicoamilase (UX.UG'1). Para calcular esta atividade, retomou-se a fórmula definida para o cálculo das atividades GA na qual: * A corresponde à atividade de xilanase expressa em UX.g de Μ8Γ1 (pmol.mmg de MSI'1), * P corresponde à velocidade de liberação de equivalentes de xilose em pmol.min'1, * Os outros termos da fórmula não são modificados.

Os exemplos não limitativos a seguir são fornecidos para ilustrar a invenção. EXEMPLO 1 - Seleção de cepas de Aspersillus Foi estudada de maneira comparativa a capacidade que têm sete cepas diferentes de Aspergillus disponíveis no comércio de produzirem glicoamilase por fermentação em meio sólido de farelo de trigo.

Os ensaios foram efetuados em 50 g de meio de fermentação em um pequeno frasco de Erlenmeyer. O meio era constituído de 21^5 g de iarfila-de trigo, de 27,5 g de água e de 1 g de farelo de trigo. O pH inicial do meio era de 6,0-6,5. O meio foi esterilizado durante 20 minutos em uma autoclave a 120 °C.

Cada meio foi inoculado com 2.107 esporos da cepa a ser testada por grama de matéria seca inicial. A idade dos esporos era de 3 dias. Deixou-se desenvolver a fermentação durante 40 ou 50 horas, os pequenos frascos de Erlenmeyer sendo colocados em uma estufa a 35 °C. No final da fermentação misturou-se o meio fermentado com 150 ml de água destilada a fim de por as enzimas produzidas em solução, depois filtrou-se para recuperar a solução enzimática. A solução foi centrifugada para eliminar os esporos e as partículas residuais, depois a solução foi condicionada em frascos de 100 ml que foram conservados a -20 °C até a análise da atividade glicoamilásica.

As cepas testadas e os resultados obtidos são recapitulados na Tabela 1 a seguir: Observa-se que as cepas A. niger NRRL 3112, A. niger ATCC 76061 e A. oryzae ATCC 22788 têm as melhores atividades em termo de produção de glicoamilase.

Uma outra propriedade importante a ser tomada em consideração, todavia, é a estabilidade da glicoamilase produzida. Procedeu-se portanto a ensaios de termoestabilidade efetuando-se tratamentos térmicos das soluções enzimáticas a 55 e 60 °C durante 30 minutos e medindo-se a atividade da glicoamilase no final deste período de tempo. Estes tratamentos se aproximam das condições de utilização para a sacarificação do amido. Foi descoberto que as cepas A. niger ATCC 76061 e Á. niger NRRL 3112 forneciam as glicoamilases mais estáveis (100% de atividade residual após 30 minutos a 55 °C e aproximadamente 50% de atividade residual após 30 minutos a 60 °C) ao passo que as cepas A. oryzae ATCC 22788 e ATCC 42149 forneciam glicoamilases tendo 0% de atividade residual após 30 minutos a 60 °C e 46% de atividade residual após 30 minutos a 55 °C. Isto nos conduz portanto a selecionar as cepas ATCC 76061 e NRRL 3112 de A. niger. Aliás verificou-se que a cepa A. niger NRRL 3112 é geneticamente bastante instável (perda de atividade após alguns ciclos de reprodução) de forma que a cepa mais preferida é a cepa ATCC 76061 de A. niger. Portanto é esta cepa que foi utilizada nos exemplos a seguir. EXEMPLO 2 - Produção de glicoamilases em cubas piloto fornecidas pelo INRA de 50 litros não estéreis: importância do pré-tratamento do farelo de trigo.

Os ensaios foram realizados com um fermentador não estéril de 50 litros de acordo com aquele descrito no artigo de A. DURAND e colaboradores citado antes (Figura 1) e do farelo de trigo BCE (fornecido pela destilaria Brie Champagne Ethanol, Provins, França). Foram empregados dois modos de preparação de farelo para obter 5 kg de meio de cultura a 55% de umidade: * farelo seco: o farelo é autoclavado durante 1 hora a 105 °C depois misturado com água (ensaio F4C3); * farelo úmido: o farelo é umidificado a 45% em uma amassadeira e autoclavado 20 minutos a 121 °C (ensaio F4C4).

Nos dois casos, efetua-se uma inoculação com 2.107 esporos.g' 1 MS e regula-se o teor de água dos meios até aproximadamente 55%. Eles são em seguida fermentados sobre 10 cm de altura de camada nas cubas aeradas. Durante estas culturas, o meio é estriado por intermitência com a ajuda de uma espátula para reduzir a sua temperatura. Durante a fermentação, a atmosfera é renovada permanentemente por um ar condicionado cuja temperatura, a umidade e a vazão são tais como indicados nas Tabelas.

Os resultados são apresentados nas Tabelas 2 (ensaio F4C3) e 3 (ensaio F4C4).

Estes dados permitem tirar diversas conclusões: - A umidificação do farelo de trigo, previamente ao tratamento térmico é necessário a uma produção eficaz de glicoamilases. Além da descontaminação, o tratamento térmico do farelo de trigo favorece verdadeiramente a gelatinização do amido; - O pH surge como um bom indicador qualitativo da evolução do crescimento e da produção de GA fungicos, sem que para tanto permitir avaliar a quantidade de GA obtida: - Uma leve agitação do meio (estriagem) não altera a produção de enzimas; - A evolução do teor de água durante estas duas fermentações indica uma secagem considerável do meio de cultura que podia ser prejudicial ao crescimento dos fungos. EXEMPLO 3 - Produção de glicoamilases em fermentador piloto fornecido pela Sociedade FUJIWARA: importância da manutenção da umidade do meio durante a fermentação.

Este ensaio foi realizado com um fermentador piloto comercializado pela Sociedade FUJIWARA, Okayama, Japão e farelo de trigo BCE. Este difere especialmente do fermentador utilizado no exemplo 2 pelo diâmetro da cuba que é de 0,66 mm contra 0,35 mm para as cubas INRA. Neste fermentador, 20 kg de meio a 55% de água preparados de acordo com o modo do farelo úmido descrito no exemplo 2 são necessários para realizar uma cultura sobre 12 cm de espessura. A agitação é garantida por três parafusos sem fim verticais com rotação constante que vêm misturar o meio na cuba em rotação (5-10 minutos / volta). Durante a fermentação, como para as cubas INRA do exemplo 2, a atmosfera gasosa é renovada permanentemente por um ar condicionado cuja temperatura, a umidade e a vazão são tais como indicados na Tabela 4.

Durante este ensaio denominado FII, foi estudada a oportunidade de uma regulagem da umidade. Medidas pontuais da umidade da cultura, efetuadas com um aparelho de infravermelho e da massa do meio são utilizadas para determinar a quantidade de água a ser adicionada para manter o teor de água do meio acima de 50%.

Os ensaios deste ensaio FII são apresentados na Tabela 4. Os resultados obtidos requerem os comentários a seguir: - FII indica claramente que a manutenção do teor de água entre 50 e 55% favorece a produção de enzimas com 1600 UG/g de MS liberadas após 44 horas de fermentação, seja mais do dobro da atividade obtida durante o ensaio F4C2 do exemplo 2 que não tinha se beneficiado desta regulagem; - a estabilização da produção de enzimas desde 44 horas de cultura correlacionado ao aparecimento de esporos fungicos mostra que não é necessário fazer prosseguir a cultura além desta fase; - uma regulagem satisfatória da temperatura do meio em tomo de 35 °C pode ser obtida por uma boa combinação do condicionamento do ar e da agitação do meio; - a cultura aguenta sem danos a misturação intermitente realizada pelo sistema de agitação do fermentador FUJIWARA. EXEMPLO 4 - Produção de glicoamilases em fermentador piloto INRA agitado de 50 litros: utilidade de um tratamento térmico do farelo com vapor e de uma cultura em "condições estéreis".

Este fermentador é semelhante àquele apresentado em WO-A-94 18306 e na figura 4 do artigo de A. DURAND e Colaboradores pré-citado. Esta ferramenta permite tratar o farelo com vapor diretamente no fermentador, modo de preparação preferido em escala industrial. A cultura é igualmente preparada, inoculada e realizada em condições estéreis com exceção das retiradas de amostras, o que confere uma semi-esterilidade a este ensaio e difere dos dois exemplos anteriores. A) Condições experimentais 9 kg de farelo BCE são introduzidos no fermentador, pré-umidificados por 1,5 litro de água, depois esterilizados no local durante 20 minutos a 121 °C, com uma agitação periódica de 5 segundos de 5 em 5 minutos. Este tratamento permite alcançar uma taxa de umidade de 46%, ajustada em seguida até 55% por ocasião da inoculação. O farelo é inoculado por uma preparação do tipo koji: 180 g de farelo BCE (55% de umidade inicial) fermentados durante 4 dias a 35 °C são misturados a 3 litros de água esterilizada de maneira a obter uma suspensão de esporos que constitui o inóculo.

As condições iniciais da fermentação são as seguintes: 18,3 kg de cultura com 55% de umidade e um pH inicial de 5,7; 40 cm de altura de camada;

Vazão de aeração: 314 l.min"1;

Tar de entrada· 35 C, Umidade relativa do ar na entrada: 95%. B) Acompanhamento da fermentação Além da medida do pH, da temperatura do meio, da percentagem de matéria seca e da produção de GA, a evolução da massa da cultura é registrada continuamente sobre o fermentador de 50 litros agitado, enquanto que, para o reator não estéril, são efetuadas pesagens da cultura a 21 horas e a 42 horas de fermentação.

Estas medidas da massa apresentam um duplo interesse: Manutenção da umidade durante a cultura nor estimativa da percentagem de MS.

Durante a fermentação dois fenômenos contribuem para a diminuição da massa da cultura, trata-se: - da secagem do meio por um lado que se deseja compensar por uma adição de água, - da perda da matéria seca por outro lado, ligada ao crescimento do fungo.

Esta perda de matéria seca não é negligenciável, 20% de MS estando perdidos em 40 horas de cultura, seja 0,5% de MS por hora se faz-se a aproximação de uma perda linear. A partir dali, conhecendo-se em cada instante a massa da cultura (M^), é possível deduzir a percentagem de MS teórica no tempo t, pela relação: % MS teórico (t) - MSI ("MSI. 0.5%U em que MSI é a quantidade de matéria seca inicial. M(t) Quando esta % de MS assim calculada ultrapassa 50%, é efetuada uma adição de água esterilizada de maneira a trazer esta percentagem até 45%.

Expressões dos resultado por grama de MS inicial As evoluções da massa e aquelas da percentagem de MS medida permitem calcular a perda de matéria seca real (PMS expressa em %) durante a cultura. Assim, a quantidade de GA expressa até ali em UG.g'1 MS pode ser expressa em UG.g'1 MS inicial graças à relação a seguir: (UG.g'1 de MSI) = (UG.g1 MS).(100 - PMS)/100 O Resultados As Tabelas 5 e 6 recapitulam as condições de operação e os resultados obtidos em reator agitado sobre seu vapor.

Apesar da aeração da cultura por um ar saturado em umidade, a secagem do meio é tal que foi necessário por duas vezes reajustar o seu teor de água quando este diminuía até abaixo de 50% como indicado na Tabela 5. A temperatura do meio pode ser mantida a um valor médio de 35 °C graças ao abaixamento do ar de entrada, porém sobretudo por uma agitação intermitente.

Nestas condições de cultura, o crescimento do fungo, do qual se segue a evolução pela medida do pH, é mantido durante 60 horas e permite alcançar uma produção de 1436 UG.g'1 MS em 44 horas e de 1990 UG.g'1 MS em 63 horas. Em relação à MS inicial, a quantidade de GA produzida é respectivamente de 1160 e 1540 UG.g’1 de MSI. Para comparação, foram obtidos no quadro do exemplo 3 em 44 horas de cultura 1605 UG.g'1 MS equivalentes a 1067 UG.g"1 de MSI. Esta informação é interessante pois ela indica que a produtividade destes dois ensaios é idêntica, mas que as condições experimentais do exemplo 4 permitiram prolongar a produção de enzimas mesmo com 40 cm de altura de camada. O tratamento do farelo com vapor depois a sua fermentação no reator INRA de 50 litros prolonga portanto a cultura de fungos e a produção de enzimas.

Em relação à MS inicial, a quantidade de GA produzida é de 1540 UG.g'1 de MSI.

Nas mesmas amostras, foram efetuadas dosagens de atividades de xilanases e de proteases. Os resultados obtidos são muito satisfatórios com um máximo, em média, a 50 horas de fermentação de 350 UX.g'1 de MSI para as xilanases; 400 UP.g'1 de MSI para as proteases.

Graças ao registro contínuo da massa, foi possível calcular a perda de matéria seca durante a cultura. Ela é desde aproximadamente 23% no final de 60 horas de cultura (a 2% aproximadamente levando em conta a precisão das pesagens). EXEMPLO 5 : Utilização de farelos fermentados produzidos no Exemplo 4 para a hidrólise de farinhas de trigo Foi conduzida uma série de sacarificações com os farelos fermentados obtidos no exemplo 4 sobre farinhas de trigo previamente submetidas a um tratamento de liquefação enzimática clássica. A preparação de glicoamilases AMG 300 L R comercializadas pela Sociedade NOVO serviu de testemunha. Estes ensaios foram realizados com uma farinha de trigo convencional tipo 45. As condições de operação são recapituladas na Tabela 7 para 750 g de mosto. ___________________________TABELA 7________________________________ Durante estas hidrólises de farinha de trigo, retiramos três amostras de meio cada vez. Os resultados de concentrações em açúcares redutores (S.R.) a diferentes momentos da sacarifícação apresentados na Tabela 8 são a média destas três amostras retiradas. Estas dosagens, efetuadas de acordo com a técnica com DNS, foram realizadas sobre os sobrenadantes das amostras retiradas centrifugadas. Foi igualmente medida a viscosidade final dos produtos sacarificados. ___________________________TABELA 8______________________________ Além disso, foi constatado um aumento do teor de nitrogênio solúvel dos mostos após sacarificação devida à ação proteolítica de farelo fermentado.

Estes resultados indicam que os farelos fermentados produzidos no Exemplo 4 são capazes de hidrolisar a farinha de trigo com a mesma eficiência que uma preparação padronizada de GA, qualquer que seja o seu modo de estocagem. A hidrólise da farinha com farelo fermentado acarreta igualmente uma notável redução da viscosidade comparada a uma preparação enzímática convencional.

Exemplo 6 Este exemplo ilustra a possibilidade de produzir uma quantidade considerável de xilanases e poucas glicoamilases com a cepa de Aspergillus niger.

Este ensaio foi empregado no fermentador piloto Fujiwara com farelo BCE e uma cepa de A. niger Ref. ATCC 201202 conhecida por sua capacidade de produzir xilanases. O funcionamento do fermentador piloto está detalhado no Exemplo 3. 20 kg de meio com 55% de umidade, preparados como no exemplo 2, durante a fermentação, a umidade do meio foi mantida superior a 50% e a temperatura do meio regulada em tomo de 35 °C.

No final, a cepa A. niger ATCC 201202 produziu, após 37 horas nestas condições de fermentação, um farelo fermentado que tem 727 UX / g de MS e 162 UG / g de MS.

Exemplo 7: Interesse da incorporação de farelo fermentado de acordo com a invenção em um alimento avícola à base de trigo destinado a aves para servir de alimento. r E sabido que as hemicelulases das farinhas de trigo são parcialmente solúveis em água e aumentam a viscosidade do conteúdo do intestino, reduzindo assim a liberação e a absorção de nutrimentos Foi demonstrado que a adição de hemicelulases gera uma degradação das hemicelulases, que permitem assim reduzir a viscosidade do conteúdo do intestino e melhorar o desempenho zootécnico de animais monogástricos tais como produtos para servir de alimento, nutridos com alimentos dos quais o único cereal é o trigo.

Foi conduzida uma experimentação em 1.200 aves Ross para servir de alimento para mostrar o interesse da utilização de farelo fermentado portador de atividade da hemicelulase (xilanase), em comparação de um alimento sem enzima e de um alimento que contém uma fonte de xilanase padronizada, o produto Avizyme. Foram preparados alimentos com ou sem enzima de maneira a nutrir 4 lotes de 300 pintos. Sua composição está detalhada na Tabela 9. Os alimentos de crescimento (AL CR) foram utilizados para os 21 dias primeiros dias de criação depois foram substituídos por alimentos de acabamento (AL FI) durante 18 dias. TABELA 9 O alimento 1 não recebeu enzima alguma. Aos alimentos foram adicionados 3 e 5 kg, respectivamente, de farelo fermentado por tonelada de alimento. Ao alimento 4 foi adicionado 0,6 kg de Avizyme R por tonelada de alimento.

Os resultados deste teste no final de 39 dias de criação estão resumidos na Tabela 10. TABELA 10 a. este farelo apresentava uma atividade glicoamilásica de 1000 UG / g de matéria seca, uma atividade proteolítica de 125 UP / g de matéria seca e uma atividade xilanásica de 600 UX / g de matéria seca; b. O Avizyme R é fornecido pela sociedade Finfeed, Finlândia; c. proporção peso de alimento consumido / ganho de peso; d. é a redução em % do peso de alimento consumido em relação ao peso de alimento (sem enzima) consumido. A incorporação de farelo fermentado a um alimento avícola (3 ou 5 kg / tonelada) permitiu reduzir significativamente o índice de consumo. Nas condições do ensaio, a utilização de uma dose de farelo fermentado superior a 3 kg / tonelada parece sem interesse prático. As melhorias observadas são comparáveis àquelas obtidas com o produto comercial de referência Avizyme (0,6 kg / tonelada). A utilização do farelo fermentado apresenta, todavia, a vantagem de ser menos onerosa do que a utilização do produto enzimático do comércio.

Deduz-se que os modos de realização descritos são apenas exemplos e estes podiam ser modificados, especialmente por substituição de equivalentes técnicos, sem sair para isto do panorama da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. Processo de produção de uma composição multienzimáiica caracterizado pelo fato de compreender as etapas que consistem em (a) tomar farelo de trigo; (b) umtdifiear e tratar termicamente o farelo de maneira a pasteurizá-lo ou esterilizá-lo; (c) inocular o farelo de trigo resultante por uma cepa de Aspergillus niger selecionada do grupo consistindo das cepas ATCC 201202, ATCC 76060, ATCC 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112, ou com uma cepa de Aspergillus oryzcte selecionada do grupo consistindo das cepas ATCC 22788 e ATCC 42149; (d) o farelo estando sob a forma de uma camada de pelo menos 10 cm. de espessura, fazê-lo fermentar no estado sólido em um. reator aerado e agitado periodicamente durante um período de 1 a 3 dias, a urna temperatura de 28 a 38°C, o farelo estando regulado a um teor de umidade inicial de 50 a 60% em peso sensivelmente mantido durante o período da fermentação, em condições de aeraçao apropriadas para evitar um acúmulo de dióxido de carbono prejudicial à fermentação no reator e uma elevação da temperatura em virtude da fermentação além da faixa indicada, até que o produto de fermentação apresente os três valores mínimos a seguir de atividades enzímãticas: - glicoamtlãsiea: pelo menos 100 UG por grama de matéria seca - proteolítica: pelo menos 100 UP por grama de matéria seca - xílanãsica: pelo menos 100 UX por grama de matéria seca, com a condição de que a atividade glicoamilãsica seja de pelo menos 750 UG por grama de matéria seca e a atividade xilanásica seja de pelo menos 300 UX por grama de matéria seca.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cepa de Aspergillus niger é escolhida entre a cepa NRRL 3112 e a cepa ATCC 76061.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a cepa de Aspergitíus niger é a cepa ATCC 76061.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de se evitar que a taxa de umidade do farelo diminua até abaixo de 45% durante a fermentação.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de envolver a etapa suplementar que consiste em congelar ou em secar o produto obtido na etapa (d).

6. Composição multienzimática caracterizada pelo fato de ser obtida por uni processo conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 5.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de apresentar uma ati vidade glicoainilásíca de pelo menos 750 UG/g de matéria seca.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de apresentar uma atividade glicoainilásíca de pelo menos 1.500 UG/g de matéria seca.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de apresentar uma atividade xilanásica de pelo menos 300 UX por grama de matéria seca.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de apresentar uma atividade xilanásica de pelo menos 400 UX por grama de matéria seca.

11. Uso de uma composição como definida em qualquer uma reivindicações 6 a 10 caracterizada pelo fato de ser na produção de etanol a partir do trigo.

12. Uso de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 6 a 10 caracterizada pelo fato de ser como aditivo para um alimento para animais monogástricos.