BRPI0014115B1

BRPI0014115B1 - Métodos de produzir um panto-composto, pantotenato e beta-alanina, de aumentar a produção de um panto-composto e de edentificar compostos que modulam a atividade da pantotenato cinase, micro-organismo recombinante, vetor recombinante, e, vetor

Info

Publication number: BRPI0014115B1
Application number: BRPI0014115-1A
Authority: BR
Inventors: R Rogers Yocum; Thomas A Patterson; Theron Hermann; Janice G Pero
Original assignee: Basf Ag
Priority date: 1999-09-21
Filing date: 2000-09-21
Publication date: 2015-05-05
Also published as: CN1420931A; CA2385497A1; HU230509B1; NO20021382D0; EP1214420A2; IL148786A0; MXPA02003017A; BR0014115A; EP2163629A3; EP1214420B1; WO2001021772A2; NO20021382L; TR200200751T2; BRPI0014115B8; EP2163629A2; CZ20021013A3; HUP0202705A3; HUP0202705A2; JP2003527828A; KR20020092912A

Description

“MÉTODOS DE PRODUZIR UM PANTO-COMPOSTO, PANTOTENATO E BETA-ALANINA, DE AUMENTAR A PRODUÇÃO DE UM PANTO- COMPOSTO E DE IDENTIFICAR COMPOSTOS QUE MODULAM A

ATIVIDADE DA PANTOTENATO CINASE, MICRO-ORGANISMO RECOMBINANTE, VETOR RECOMBINANTE, E, VETOR”.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O pantotenato, também conhecido como ácido pantotênico ou vitamina B5, é um membro do complexo B de vitaminas e é uma exigência nutricional para os mamíferos, incluindo gado e seres humanos (por exemplo, de fontes alimentícias, como um suplemento vitamínico solúvel em água ou como um aditivo alimentício). Nas células, o pantotenato é usado primariamente para a biossíntese da coenzima A (CoA) e da proteína carregadora de acila (ACP). Estas coenzimas funcionam no metabolismo de porções de acila que formam tioésteres com o grupo sulfidrila da parte 4’- fosfopanteteína destas moléculas. Estas coenzimas são essenciais em todas as células, participando em mais do que 100 reações intermediárias diferentes no metabolismo celular.

Os meios convencionais de sintetizar pantotenato (em particular, o isômero bioativo D) é pela síntese química a partir de produtos químicos volumosos, um processo que é impedido pelo custo excessivo do substrato bem como a exigência para a resolução ótica de intermediários racêmicos (por exemplo, a resolução de DL-pantolactona para se obter D- pantolactona pela condensação química com β-alanina). Consequentemente, os pesquisadores examinaram recentemente para sistemas bacterianos ou microbianos que produzem enzimas úteis em processos de biossíntese de pantotenato (visto que as próprias bactérias são capazes de sintetizar pantotenato). Em particular, os processos de bioconversão foram avaliados como um meio de favorecer a produção do isômero D do ácido pantotênico, por exemplo, usando micro-organismos que seletivamente hidrolisam um éster do ácido DL-pantotênico ao ácido D-pantotênico; micro-organismos que seletivamente decompõe a L-pantolactona resultando apenas em D- pantolactona; e micro-organismos que seletivamente hidrolisam a DL- pantolactona ao ácido D-pantóico.

Existe ainda, entretanto, significante necessidade para processos de produção de pantotenato melhorados, em particular, para processos que requeiram quantidades reduzidas de substratos e/ou substratos menos caros. Para esta finalidade, os métodos de síntese microbiana direta têm sido recentemente examinados como um meio de melhorar a produção de D-pantotenato. Nos micróbios, biossíntese de pantotenato é um caminho de etapas múltiplas resultando na condensação de pantoato (derivado de a-ceto- isovalerato) e β-alanina para formar D-pantotenato. As enzimas biossintéticas do caminho de isoleucina-valina (ilv), aceto-hidroxi-ácido sintetase (o produto de gene ilvBN ou alsS), aceto-hidroxi-ácido isomero-reductase (o produto de gene ilvC) e di-hidróxi-ácido desidratase (o produto de gene ilvD) catalisam a conversão de piruvato para α-ceto-isovalerato. As reações são ainda catalisadas pelas enzimas biossintéticas do caminho do pantotenato (pan), cetopantoato hidróxi-metil-transferase (o produto de gene panB), cetopantoato reductase (o produto de gene panE), aspartato-a-descarboxilase (o produto de gene panD) e pantotenato sintetase (o produto de gene panQ.

Os genes que codificam as enzimas envolvidas na biossíntese de ácido pantotênico em Salmonella typhimurium e Escherichia coli foram recentemente identificadas e caracterizadas (Frodyma e Downs (1998) J.

Biol. Chem. 273: 5572 a 5576 e Jackowski (1996) pp. 687 a 694, Em Neidhardt et al. (ed.) Escherichia coli e Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2a ed. Am. Soc. Microbiol. Wash, D.C). Na E. coli, por exemplo, a biossíntese de ácido pantotênico consiste em quatro etapas chave. A primeira reação é catalisada pelo produto de gene panB, a cetopantoato hidróxi-metil- transferase, e usa o intermediário da L-valina, o α-ceto-isovalerato para gerar cetopantoato, que é subsequentemente reduzido a pantoato pelo produto de gene panE, a cetopantoato reductase. O produto de gene panD, a aspartato-a- descarboxilase, gera β-alanina a partir de aspartato. O produto de gene panC, a pantotenato sintetase, subsequentemente liga a β-alanina com pantoato para produzir D-pantotenato.

Os autores Dusch et al. descreveram a identificação do gene panD da Corynebacterium glutamicum e relataram que a expressão do gene panD da C. glutamicum na E. coli produziu uma cepa que produz pantotenato com uma produtividade específica de 140 ng de pantotenato por mg (peso seco) por hora. (Dusch et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 1530 a 1539).

Os autores Sahm e Eggeling identificaram ainda os genes panB e panC da Corynebacterium glutamicum e descreveram uma cepa geneticamente engendrada de C. glutamicum que superexpressa os genes panBC (Sahm e Eggeling (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65:1973 a 1979). A cepa engendrada produz pantotenato, entretanto, foi necessário superexpressar os genes responsáveis pela produção de α-ceto-isovalerato no organismo hospedeiro de modo que a produção de ácido pantotênico pudesse ser detectada. Além disso, sem a adição de β-alanina, nenhuma quantidade substancial de pantotenato acumulou com a cepa construída.

Do mesmo modo, um método de produzir ácido D-pantotênico foi descrito o qual leva a vantagem de uma cepa mutante resistente ao salicilato de sódio da E. coli que produz ácido D-pantotênico quando cultivada na presença de β-alanina (Patente US 5.518.906). A geração de cepas E. coli resistentes ao ácido α-ceto-isovalérico e/ou ácido a-cetobutírico, e/ou ácido α-aminobutírico, e/ou ácido β-hidróxi-aspártico e/ou O-metil- treonina, além do ácido salicílico, aumentou ainda mais a produção de ácido pantotênico. Além disso, a transformação de um DNA plasmídico que carrega os genes panB, panC e panD na cepa mutante resistente ao ácido salicílico resultou na produção de pantotenato aumentada, entretanto, até 20 g/litro de β-alanina ou mais foram alimentados nos exemplos dados. Os genes panB- panC-panD estão agrupados no cromossoma da E. coli.

Finalmente, um método de produzir o ácido D-pantotênico foi descrito o qual utiliza uma cepa da E. coli resistente ao ácido salicílico, resistente ao α-ceto-isovalerato, resistente ao α-cetobutirato, resistente ao β- hidróxi-aspartato, resistente à o-metil-treonina, transformada com fragmentos de DNA contendo o gene da biossíntese de pantotenato e/ou fragmentos de DNA contendo o gene da biossíntese de aminoácido ramificado e cultivada na presença de β-alanina (Patente US 5.932.457). A produção de pantotenato nas bactérias resulta da condensação de pantoato e β-alanina e envolve as enzimas biossintéticas do pantotenato cetopantoato hidróxi-metil-transferase (o produto de gene panB), cetopantoato reductase (o produto de gene panE), aspartato-a-descarboxilase (o produto de gene panD) e pantotenato sintetase (o produto de gene panC).

Embora o pantotenato seja biologicamente ativo como uma vitamina, é ainda metabolizado em todas as células para a Coenzima A (CoA) que participa como um carregador do grupo acila no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA), o metabolismo de ácido graxo e numerosas outras reações de metabolismo intermediário. A etapa inicial (e possivelmente o controle da taxa) na conversão de pantotenato à Coenzima A (CoA) é a fosforilação do pantotenato pela pantotenato cinase. Uma atividade da pantotenato cinase foi primeiro identificada na Salmonella typhimurium pela avaliação quanto a mutantes sensíveis à temperatura que sintetizaram CoA em temperaturas permissíveis mas excretaram pantotenato em temperaturas não permissíveis.

As mutações foram mapeadas no cromossoma da Salmonella e o local genético foi designado coaA. O gene codifica a enzima que catalisa a primeira etapa na biossíntese da coenzima A de pantotenato (Dunn e Snell (1979) J. Bacteriol. 140: 805 a 808). Os mutantes sensíveis à temperatura da Escherichia coli também foram isolados e caracterizados (Vallari e Rock (1987) 1 Bacteriol. 169: 5795 a 5800). Estes mutantes (denominados coaA15(Tsj) são defeituosos na conversão de pantotenato à CoA e ainda exibem um fenótipo de desenvolvimento sensível à temperatura, indicando que a atividade da pantotenato cinase é essencial para o desenvolvimento.

Além disso, foi observado que a CoA inibiu a atividade da pantotenato cinase no mesmo grau no mutante quando comparado à enzima do tipo selvagem.

Os mutantes da E. coli resistente à realimentação (denominados coaA16(Fr)) também foram isolados os quais possuem uma atividade da pantotenato cinase que é reffatária à inibição de realimentação pela CoA (Vallari e Jackowski (1988) J Bacteriol 170: 3961 a 3966). A mutação responsável pela reversão, surpreendentemente, não é geneticamente ligada ao gene coaA pela transdução. Os dados adicionais descritos nesta sustentam o ponto de vista de que o teor de CoA celular total seja controlado tanto pela modulação da biossíntese na etapa da pantotenato cinase quanto possivelmente pela degradação de CoA à 4’-fosfopanteteína. O gene coaA da E. coli do tipo selvagem foi clonado pela complementação funcional de mutantes sensíveis à temperatura da E. coli. A sequência do gene do tipo selvagem foi determinada (Song e Jackowski (1992) J. Bacteriol. 174:6411 a 6417 e Flamm et al. (1988) Gene (Amst.) 74: 555 a 558). As cepas contendo cópias múltiplas do gene coaA possuem atividade específica 76 vezes mais alta de pantotenato cinase, entretanto, houve apenas um aumento de 2,7 vezes no nível de estado constante de CoA (Song e Jackowski, acima). Foi ainda relatado que a enzima procariótica (codificada pelo coaA na E. coli e em uma variedade doutros micro- organismos) é inibida em realimentação pela CoA tanto in vivo quanto in vitro com a CoA sendo cerca de cinco vezes mais potente do que a acetil- CoA na inibição da enzima (Song e Jackowski, acima e Vallari et al., acima).

Além disso, foi relatado que o produto de gene panB na E. coli é inibido pela CoA (Powers e Snell (1976) J. Biol. Chem. 251: 3786 a 3793). Estes dados ainda sustentam o ponto de vista de que a inibição de realimentação da atividade da pantotenato cinase seja um fator crítico no controle da concentração intracelular de CoA.

Usando as ferramentas de procura e alinhamento padrão, homólogos de coaA foram identificados na Hemophilus influenzae, Mycobacterium tuberculosis, Vibrio cholerae, Streptococcus pyogenes e Bacillus subtilis. Ao contrário, as proteínas com similaridade significante não puderam ser identificadas em células eucarióticas incluindo Saccharomyces cerevisiae ou em banco de dados de rótulo da sequência expressa em de mamífero (EST). Usando uma estratégia de seleção genética, um cDNA que codifica a atividade da pantotenato cinase foi recentemente identificado da Aspergillus nidulans (Calder et al. (1999) J Biol Chem. 274: 2014 a 2020). O gene eucariótico da pantotenato cinase gene (panK) tem estrutura primária distinta e propriedades reguladoras únicas que claramente o distingue da sua contraparte procariótica. Um gene da pantotenato cinase de mamífero (;mpanKla) também foi isolado o qual codifica uma proteína tendo homologia com a proteína PanK da A. nidulans e com o produto de gene prognosticado do GenBank® Número de Acesso 927798 identificados no genoma da S. cerevisiae (Rock et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 1377 a 1383).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção está fundamentada, pelo menos em parte, na descoberta dos genes que codificam a enzima chave do caminho biossintético do pantotenato no Bacillus subtilis. Em particular, os presentes inventores identificaram o gene panE do B. subtilis. A superexpressão ou desregulagem do gene panE no B. subtilis resulta na produção realçada do produto de gene panE, a cetopantoato reductase, resultando ainda na produção aumentada de pantotenato. Do mesmo modo, as mutações neste gene reduzem a produção de pantotenato na B. subtilis em > 90%. Os presentes inventores identificaram ainda o operon panBCD presumível na B. subtilis, a superexpressão ou a desregulagem do qual resulta na produção de pantotenato aumentada. Os presentes inventores demonstraram ainda que a superexpressão ou a desregulagem do gene panD na B. subtilis (resultando na produção realçada do produto de gene panD, aspartato-a-descarboxilase) resulta ainda na produção aumentada de pantotenato, em particular, em combinação com a desregulagem dos genes que codificam as enzimas chave do caminho biossintético da isoleucina-valina (z/v).

Consequentemente, a presente invenção retrata métodos de produzir pantotenato, bem como outros compostos do caminho biossintético do pantotenato (por exemplo, cetopantoato, pantoato e β-alanina), denominados aqui de “panto-compostos”, usando micro-organismos nos quais o caminho biossintético do pantotenato e/ou o caminho biossintético da isoleucina-valina foram manipulados tal que o pantotenato ou outros panto- compostos desejados são produzidos. Em uma forma de realização, a invenção retrata um método de produzir um panto-composto (por exemplo, pantotenato ou pantoato) que envolve cultivar um micro-organismo que superexpresse o produto de gene panE, a cetopantoato reductase, também aludido aqui como um micro-organismo que superexpressa a cetopantoato reductase ou “KPAR-O”, sob condições tais que o panto-composto (por exemplo, pantotenato ou pantoato) seja produzido. Em uma outra forma de realização, a presente invenção retrata um método de produzir panto- compostos (por exemplo, pantotenato ou pantoato) que inclui cultivar um micro-organismo que superexpresse pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato (por exemplo, pelo menos um dos produtos de gene panB, panC ou panD), preferivelmente em um micro-organismo KPAR-O, sob condições tais que o panto-composto (por exemplo, pantotenato ou pantoato) seja produzido. Já um outro aspecto da invenção retrata métodos de produzir panto-compostos que sejam independentes da necessidade de precursores de alimentação (por exemplo, β-alanina ou aspartato e/ou α-ceto-isovalerato ou valina). Em uma forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente de alimentação precursora que inclui cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato-a-descarboxilase (AaD-O) tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente de alimentação precursora que inclui cultivar um micro-organismo AaD-0 tendo um caminho de pantotenato {pan) desregulado e um caminho de isoleucina-valina {ilv) desregulado, sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação de aspartato ou β- alanina que inclui cultivar um micro-organismo AaD-0 sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação de valina ou α-ceto-isovalerato que inclui cultivar um micro-organismo tendo um caminho biossintético de isoleucina- valina {ilv) desregulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Já em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento para produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um rendimento signifícantemente alto (por exemplo, em um nível maior do que 10 g/litro, 20 g/litro, 30 g/litro ou 40 g/litro).

Os métodos da presente invenção ainda retratam micro- organismos que superexpressem a aceto-hidróxi-ácido sintetase ou aceto- hidróxi-ácido isômero-reductase (por exemplo, micro-organismos transformados com um vetor que inclui uma sequência de ácido nucleico de ilvBNQ, micro-organismos que superexpressem a di-hidróxi-ácido desidratase (por exemplo, micro-organismos transformados com um vetor que inclui uma sequência de ácido nucleico de ilvD), micro-organismos que superexpressem a aspartato-a-descarboxilase (por exemplo, micro- organismos transformados com um vetor que inclui uma sequência de ácido nucleico de panD), micro-organismos tendo um caminho biossintético de isoleucina-valina (ilv) desregulado e micro-organismos tendo um caminho biossintético do pantotenato desregulado (por exemplo, micro-organismos que superexpressem qualquer uma das cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase e aspartato-a-descarboxilase, por exemplo, micro-organismos transformados com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panBCD ou um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panEl). Em uma forma de realização, o micro-organismo recombinante é Gram, positivo (por exemplo, micro- organismos pertencentes aos gêneros Bacillus, Corynebacterium, Lacíobacilos, Lactococci ou Streptomyces). Em uma outra forma de realização, o micro-organismo recombinante é Gram negativo.

Particularmente preferido é um micro-organismo recombinante de Bacillus (por exemplo, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus halodurans, e outros). Os vetores recombinantes que contêm os genes que codificam as enzimas biossintéticas de pantotenato e/ou isoleucina-valina de Bacillus (por exemplo, enzimas biossintéticas de pantotenato e/ou isoleucina-valina de B. subtilis) também estão descritos.

Também retratados estão os métodos de produzir β-alanina que incluem cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato-a- descarboxilase (AaD-O) sob condições tais que a β-alanina seja produzida e métodos de produzir β-alanina que envolve contactar uma composição compreendendo aspartato com uma enzima de aspartato-a-descarboxilase de Bacillus isolada sob condições tais que a β-alanina seja produzida.

Os métodos de produção da presente invenção ainda podem incluir a recuperação do panto-composto (por exemplo, pantotenato ou pantoato). A presente invenção ainda retrata micro-organismos recombinantes (por exemplo, micro-organismos AaD-O, micro-organismos tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado, micro-organismos que superexpressem pelo menos uma de cetopantoato hidróxi-metil- transferase (o produto de gene panB), pantotenato sintetase (o produto de gene panC), aspartato-a-descarboxilase (o produto de gene panD), cetopantoato reductase (o produto de gene panEX) e micro-organismos tendo um operon de panBCD desregulado. Também são retratadas moléculas de ácido nucleico de panB, panC, panD, panE, ilvB, HvN, alsS, ilvC, e/ou ilvD, bem como vetores incluindo tais moléculas de ácido nucleico e produtos de gene codificados pelas tais moléculas de ácido nucleico. A metodologia da presente invenção ainda inclui, por exemplo além de superexpressar pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato, suprimir ou mutar uma segunda enzima biossintética de pantotenato, a dita segunda enzima biossintética de pantotenato estando preferivelmente à jusante do produto desejado no caminho biossintético do pantotenato. Por exemplo, mutar panC, além de superexpressar o produto de gene panE, resulta na produção de pantoato ainda mais realçada ou aumentada.

Consequentemente, em uma forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantoato que inclui cultivar um micro-organismo que superexpresse o produto de gene panE e que tenha uma supressão no gene panC. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantoato que inclui cultivar um micro-organismo que superexpresse o produto de gene panE e/ou o produto de gene panB e que tenha uma supressão no gene panC. Outras formas exemplares de realização incluem um método de produzir cetopantoato que inclui cultivar um micro-organismo que superexpresse o produto de gene panB e que tenha uma supressão no gene panE e um método de produzir β-alanina que inclui cultivar um micro- organismo que superexpresse o produto de gene panD e que tenha uma supressão no gene panC. Também estão incluídos métodos de produzir panto-compostos que incluem superexpressar pelo menos uma enzima biossintética de valina em um micro-organismo que tenha pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato suprimida. A presente invenção também está fundamentada pelo menos em parte, na identificação e caracterização de um gene da pantotenato cinase microbiana não identificado anteriormente, coaX. O coaX foi primeiro identificado na Bacillus subtilis e corresponde a uma matriz de leitura aberta em uma parte do DNA cromossômico que inclui a extremidade 5’ do gene ftsH, e todos os genes yacB, yacC, yacD, cisK e pabB. Os presentes inventores demonstraram que a matriz de leitura aberta de yacB codifica uma nova atividade da pantotenato cinase, o gene não estando relacionado pela homologia a nenhum gene da pantotenato cinase anteriormente conhecido. O gene foi Renomeado coaX, visto que codifica a enzima que catalisa a primeira etapa no caminho do pantotenato para CoaA.

Consequentemente, a presente invenção retrata métodos novos e melhorados de produzir pantotenato e outros compostos chave do caminho biossintético do pantotenato (por exemplo, panto-compostos) utilizando micro-organismos tendo a atividade da pantotenato cinase modificada. Em particular, a presente invenção retrata micro-organismos recombinantes que contêm o gene coaX ou que contêm um mutante do gene coaX, tendo atividade da pantotenato cinase reduzida. Em uma forma de realização, a invenção retrata tais micro-organismos recombinantes tendo ainda um caminho biossintético do pantotenato desregulado. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata tais micro-organismos recombinantes tendo ainda um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado. Em uma forma de realização preferida, os micro-organismos pertencem ao gênero Bacillus (por exemplo, B. subtilis). A presente invenção também retrata micro-organismos recombinantes (por exemplo, micro-organismos pertencentes aos gêneros Bacillus, por exemplo, B. subtilis) que contêm o gene coaA ou que contêm um gene coaA mutante, opcionalmente incluindo um gene coaX ou um mutante deste, tendo atividade da pantotenato cinase reduzida. Em uma forma de realização, a invenção retrata tais micro-organismos recombinantes tendo ainda um caminho biossintético do pantotenato desregulado ou tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado.

Também são retratados vetores que contêm genes coaX ou coaAs isolados bem como genes coaX e/ou coaAs mutantes. As moléculas de ácido nucleico isoladas que contêm genes coaX isolados ou genes coaX mutantes são retratados além das proteínas CoaX isoladas e das proteínas CoaX mutantes.

Os ácidos nucleicos, vetores e micro-organismos recombinantes descritos acima são particularmente úteis nas metodologias da presente invenção. Em particular, a invenção retrata métodos de realçar a produção de panto-composto (por exemplo, cetopantoato, pantoato e/ou a produção de pantotenato) que incluem cultivar um micro-organismo recombinante tendo um gene coaX mutante sob condições tais que a produção de panto-composto seja realçada. Em uma forma de realização, o micro-organismo recombinante ainda inclui um gene coaA mutante. Em uma outra forma de realização, o micro-organismo recombinante ainda inclui um gene avtA mutante e/ou gene ilvE mutante e/ou gene ansB mutante e/ou gene alsD mutante. Também são retratados métodos para identificar moduladores de pantotenato que utilizam os micro-organismos recombinantes e as proteínas CoaXpurificadas da presente invenção.

Outras características e vantagens da invenção estarão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações seguintes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação esquemática do caminho biossintético do pantotenato. A Figura 2 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN240, contendo sequências ligadas à montante do cassete P26panBCD, equivalente à versão integrada na cepa PA221. A Figura 3A é uma representação esquemática do plasmídeo pAN004, contendo o operon pcmBCD expresso a partir do P26 e RBS1. A Figura 3B é uma representação esquemática do plasmídeo pANOOó, contendo operonpanBCD expresso a partir do P26 e RBS2. A Figura 4 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN236, contendo um cassete de expressão P26-RBS2-p<2«£l integrável e amplifícável. A Figura 5 é uma representação esquemática da construção do plasmídeo pAN423. A Figura 6 é uma representação esquemática da construção dos plasmídeos pAN426 e pAN427. A Figura 7 é uma representação esquemática da construção dos plasmídeos pAN428 e pAN429. A Figura 8 é uma representação esquemática da construção do plasmídeo pAN431. A Figura 9 é uma representação esquemática da construção do plasmídeo pAN441. A Figura 10 é uma representação esquemática da construção do plasmídeo pAN440. A Figura 11 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN251 planejado para integrar uma única cópia de um cassete P26-panEl no local panEl por cruzamento duplo. A Figura 12 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN267 planejado para integrar uma única cópia de um cassete P26- ilvBNC no local amiE. A Figura 13 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN257, um clone de Bacillus subtilis ilvD em um vetor de cópia inferior. A Figura 14 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN263, planejado para integrar uma única cópia de um cassete ?2e-ilvD no local ilvD. A Figura 15 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN261, planejado para romper 0 gene ilvD da Bacillus subtilis com 0 gene cat. A Figura 16 é uma representação esquemática do caminho biossintético da coenzima A na E. coli. A Figura 17 é uma representação esquemática da estrutura de pAN296, um plasmídeo planejado para suprimir a maior parte do gene coaA da B. subtilis e substituir um gene de resistência ao cloranfenicol. A Figura 18 é uma representação esquemática da estrutura do genoma da Bacillus subtilis na região do gene coaA. A escala é em pares de base e as matrizes de leitura aberta significantes são mostradas pelas setas abertas. A Figura 19 é uma representação esquemática do plasmídeo pAN281, um plasmídeo para expressar a Bacillus subtilis coaA depois da integração no local bpr.

As Figuras 20A-B representam um alinhamento da sequência múltiplo (MSA) das sequências de aminoácido codificadas pelos seis genes coaA microbianos conhecidos ou prognosticados. As SEQ ID NOs: 4 a 6 e 1 a 3 correspondem às sequências de aminoácido da Mycobacterium leprae (SwissProt® Acesso N2 Q9X795), Mycobacterium tuberculosis (SwissProt8 Acesso N2 053440), Streptomyces coelicolor (SwissProt® Acesso N2 086799), Haemophilus influenzae (SwissProt® Acesso N2 P44793), Escherichia coli (SwissProt® Acesso N2 PI5044) e Bacillus subtilis (SwissProt® Acesso N2 P54556), respectivamente. O alinhamento foi gerado usando o software Clustal W MSA no GenomeNet CLUSTALW Server no Institute for Chemical Research, Kyoto University. Os seguintes parâmetros foram usados: Alinhamento pelo Modo de Pares, tamanho K-tuple (palavra) = 1, Tamanho da janela = 5, Penalidade de Intervalo = 3, Número de Diagonais de Topo = 5, Método de Pontuação = Porcentagem; Alinhamento Múltiplo, Penalidade Aberta de Intervalo = 10, Penalidade de Extensão de Intervalo = 0,0, Transição de Peso = Nenhuma, Resíduos Hidrofílicos = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg e Lys, Resíduos Hidrofóbicos = Yes; e Matriz de Pontuação = BLOSUM. A Figura 21 é uma representação esquemática da estrutura do genoma da Bacillus subtilis na região do gene coaX (yacB). A escala é em pares de base, as matrizes de leitura aberta signifícantes são mostradas pelas setas abertas e certos fragmentos de restrição prognosticados são indicados por barras espessas. A Figura 22 é uma representação esquemática da estrutura de pAN341 e pAN342, dois clones derivados de PCR independentes da B. subtilis yacB (renomeados aqui como coaX).

As Figuras 23A-D representam um alinhamento da sequência múltiplo (MSA) das sequências de aminoácido codificadas pelos catorze genes coaX microbianos conhecidos ou prognosticados. As SEQ ID NOs: 9, 74, 7-8, 75, 11, 10 e 12-18 correspondem às sequências de aminoácido de Bacillus subtilis (SwissProt® Acesso N2 P37564), Clostridium acetobulyticum (WIT® Acesso N2 RCA03301, Argonne National Laboratories), Streptomyces coelicolor (PIR® Acesso N2 T36391), Mycobacterium tuberculosis (SwissProt® Acesso N2 006282), Rhodobacter capsulatus (WIT® Acesso N2 RRC02473), Desulfovibrio vulgaris (DBJ® Acesso N2 BAA21476.1), Deinococcus radiodurans (SwissProt® Acesso N2 Q9RX54), Thermotoga marítima (GenBank® Acesso N2 AAD35964.1), Treponema pallidum (SwissProt® Acesso N2 083446), Borrelia burgdorferi (SwissProt® Acesso N2 051477), Aquifex aeolicus (SwissProt® Acesso N2 067753), Synechocystis sp. (SwissProt® Acesso N2 P74045), Helicobacter pylori (SwissProt® Acesso N2 025533), e Bordetella pertussis (SwissProt® Acesso N2 Q45338), respectivamente. O alinhamento foi gerado usando o software ClustalW MSA no GenomeNet CLUSTALW Server no Institute for Chemical Research, Kyoto University. Os seguintes parâmetros foram usados: Alinhamento pelo Modo de Pares, tamanho K-tuple (palavra) = 1, Tamanho da janela = 5, Penalidade de Intervalo = 3, Número de Diagonais de Topo = 5, Método de Pontuação = Porcentagem; Alinhamento Múltiplo, Penalidade de Intervalo Aberto = 10, Penalidade de Extensão de Intervalo = 0,0, Transição de Peso = Nenhuma, Resíduos Hidrofílicos = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gin, Glu, Arg e Lys, Resíduos Hidrofóbicos = Yes; e Matriz de Pontuação = BLOSUM. A Figura 24 representa um alinhamento da sequência múltiplo de uma parte das sequências de proteína do produtos de gene coaA dos seguintes micro-organismos: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, e Streptomyces coelicolor. Os resíduos que são mutados no E. coli coaA15(Ts) e B. subtilis coaA282A são indicados abaixo e acima do alinhamento, respectivamente. As porções correspondem aos resíduos de aminoácido 168 a 187 da SEQ ID NO: 3, 167 a 186 da SEQ ID NO: 2, 165 a 184 da SEQ ID NO: 1,169 a 188 da SEQ ID NO: 4,169 a 188 da SEQ ID NO: 5 e 179 a 198 da SEQ ID NO: 6, respectivamente. A Figura 25 é uma representação esquemática da estrutura de pAN294, um plasmídeo para integrar coaA da B. subtilis mutagenizado no seu local nativo. A Figura 26 é uma representação esquemática da estrutura de pAN336, um plasmídeo planejado para suprimir o coaXda B. subtilis do seu local cromossômico e substituí-lo com um gene de resistência à canamicina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção retrata métodos novos e melhorados de produzir pantotenato e outros compostos chave do caminho biossintético do pantotenato (aludidos aqui como “panto-compostos”, por exemplo, pantotenato, cetopantoato, pantoato e β-alanina) usando micro-organismos nos quais o caminho biossintético do pantotenato foi manipulado tal que o pantotenato ou outros panto-compostos desejados sejam produzidos.

As novas e melhoradas metodologias da presente invenção incluem métodos de produzir panto-compostos (por exemplo, pantotenato) em micro-organismos tendo pelo menos uma enzima do caminho biossintético do pantotenato manipulado tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos (por exemplo, produzidos em um nível aumentado). Por exemplo, a invenção retrata métodos de produzir panto-compostos (por exemplo, pantotenato) em micro-organismos tendo pelo menos uma de cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase ou aspartato-a-descarboxilase manipuladas tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos. As metodologias da presente invenção também incluem métodos de produzir panto-compostos (por exemplo, pantotenato) em micro- organismos tendo pelo menos uma enzima biossintética de valina-isoleucina, aqui descrita, manipulada tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos. Por exemplo, a invenção retrata métodos de produzir panto-compostos (por exemplo, pantotenato) em micro-organismos tendo pelo menos uma de aceto-hidróxi-ácido sintetase, aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase ou di-hidróxi-ácido desidratase manipuladas tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos. A invenção também retrata métodos de produzir panto- compostos que envolve cultivar um micro-organismo que superexpresse a cetopantoato reductase (KPAR-O) sob condições tais que o panto-composto seja produzido. A invenção também retrata métodos de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação precursora que envolve cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato-a-descarboxilase (AaD- 0) sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Também são retratados métodos de produção de pantotenato de alto rendimento independentes da β-alanina bem como métodos de produzir β-alanina. A presente invenção também retrata métodos for realçar um produto de panto- compostos que envolve cultivar mutantes da pantotenato cinase. Em particular, a presente invenção retrata métodos novos e melhorados de produzir pantotenato e outros compostos chave do caminho biossintético do pantotenato (por exemplo, panto-compostos) que utilizam micro-organismos tendo atividade modificada da pantotenato cinase, por exemplo, micro- organismos que incluem o gene coaX ou que incluem um mutante do gene coaX, tendo atividade reduzida da pantotenato cinase. A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, certos termos são primeiro aqui definidos. 0 termo “caminho biossintético do pantotenato” inclui o caminho biossintético que envolvem as enzimas biossintéticas do pantotenato (por exemplo, polipeptídeos codificados pelos genes que codificam enzima biossintética), compostos (por exemplo, precursores, substratos, intermediários ou produtos), cofatores e outros utilizados na formação ou na síntese de pantotenato. 0 termo “caminho biossintético do pantotenato” inclui o caminho biossintético que leva à síntese de pantotenato em um micro-organismo (por exemplo, in vivo) bem como o caminho biossintético que leva à síntese de pantotenato in vitro. A Figura 1 inclui uma representação esquemática do caminho biossintético do pantotenato. As enzimas biossintéticas do pantotenato estão representadas em negrito e seus genes correspondentes indicados em itálicos. 0 termo “enzima biossintética de pantotenato” inclui qualquer enzima utilizada na formação de um composto (por exemplo, intermediário ou produto) do caminho biossintético do pantotenato. De acordo com a Figura 1, a síntese de pantoato a partir de α-ceto-isovalerato (a-KIV) processa-se por intermédio do intermediário, cetopantoato. A formação de cetopantoato é catalisada pela enzima biossintética de pantotenato cetopantoato hidróxi-metil-transferase (o produto de gene panB). A formação de pantoato é catalisada pela enzima biossintética de pantotenato cetopantoato reductase (o produto de gene panE). A síntese de β-alanina a partir do aspartato é catalisada pela enzima biossintética de pantotenato aspartato-a-descarboxilase (o produto de gene panD). A formação de pantotenato a partir do pantoato e β-alanina (por exemplo, condensação) é catalisada pela enzima biossintética de pantotenato, a pantotenato sintetase (o produto de gene panC). O termo “o caminho biossintético da isoleucina-valina” inclui o caminho biossintético que envolve as enzimas biossintéticas isoleucina- valina (por exemplo, polipeptídeos codificados pelo genes que codificam a enzima biossintética), os compostos (por exemplo, precursores, substratos, intermediários ou produtos), cofatores e outros utilizados na formação ou síntese de conversão do piruvato em valina ou isoleucina. O termo “o caminho biossintético da isoleucina-valina” inclui o caminho biossintético que leva à síntese de valina ou isoleucina em um micro-organismo (por exemplo, in vivo) bem como o caminho biossintético que leva à síntese de valina ou isoleucina in vitro. A figura 1 inclui uma representação esquemática do caminho biossintético da isoleucina-valina. As enzimas biossintéticas isoleucina-valina estão representadas em itálicos em negrito e seus genes correspondentes indicados em itálicos. 0 termo “enzima biossintética de isoleucina-valina” inclui qualquer enzima utilizada na formação de um composto (por exemplo, intermediário ou produto) do caminho biossintético da isoleucina-valina. De acordo com a Figura 1, a síntese de valina a partir de piruvato processa-se por intermédio do intermediários, acetolactato, α,β-di-hidróxi-isovalerato (α,β- DHIV) e a-ceto-isovalerato (α-KIV). A formação de acetolactato a partir de piruvato é catalisada pela enzima biossintética de isoleucina-valina, a aceto- hidróxi-ácido sintetase (o produto de gene ilvBN ou altemativamente, o produto de gene alsS). A formação de α,β-DHIV a partir de acetolactato é catalisada pela enzima biossintética de isoleucina-valina, a aceto-hidróxi- ácido isômero-reductase (o produto de gene ilvC). A síntese de α-KIV a partir de α,β-DHIV é catalisada pela enzima biossintética de isoleucina-valina, a di- hidróxi-ácido desidratase (o produto de gene ilvD). Além disso, a valina e a isoleucina podem ser interconvertidas pelas transaminases de aminoácido de cadeia ramificada.

Como aqui usado, cada um de cetopantoato, pantoato, β- alanina e pantotenato são “panto-compostos”. O termo “panto-composto” inclui um composto (por exemplo, um substrato, intermediário ou produto) no caminho biossintético do pantotenato que está à jusante de uma enzima biossintética particular de pantotenato. Em um exemplo, um panto-composto está à jusante da enzima biossintética de pantotenato cetopantoato hidróxi- metil-transferase (o produto de gene panB) e pode incluir o cetopantoato, pantoato e/ou pantotenato. Em um outro exemplo, um panto-composto está à jusante da enzima biossintética de pantotenato cetopantoato reductase (o produto de gene panE) e pode incluir pantoato e/ou pantotenato. Já em um outro exemplo, um panto-composto está à jusante da enzima biossintética de pantotenato sintetase (o produto de gene panC) e pode incluir o pantotenato. Já em um outro exemplo, um panto-composto está à jusante da enzima biossintética de pantotenato aspartato-a-descarboxilase (o produto de gene panD) e pode incluir a β-alanina e/ou o pantotenato.

Os panto-compostos preferidos incluem pantotenato e pantoato. O termo “pantotenato” inclui a forma de ácido livre de pantotenato, também chamada de “ácido pantotênico” bem como qualquer sal deste (por exemplo, derivado da substituição do hidrogênio ácido de pantotenato ou ácido pantotênico com um cátion, por exemplo, cálcio, sódio, potássio, amônio), também aludido como um “sal de pantotenato”. O termo “panto- composto” também inclui derivados alcoólicos de pantotenato. Os sais de pantotenato preferidos são o pantotenato de cálcio ou o pantotenato de sódio.

Um derivado alcoólico preferido é o pantotenol. Os sais de pantotenato e/ou de álcoois da presente invenção incluem sais e/ou álcoois preparados pelos métodos convencionais dos ácidos livres aqui descritos. Em uma outra forma de realização, o pantotenato de cálcio é sintetizado diretamente por um micro-organismo da presente invenção. Um sal de pantotenato da presente invenção pode ser do mesmo modo convertido a uma forma de ácido livre de pantotenato ou ácido pantotênico por metodologias convencionais. O termo “pantoato” inclui a forma de ácido livre de pantoato, também aludido como “ácido pantóico” bem como qualquer sal deste (por exemplo, derivado pela substituição do hidrogênio ácido do pantoato ou ácido pantóico com um cátion, por exemplo, cálcio, sódio, potássio, amônio), também aludido como um “sal de pantoato”. Os sais de pantoato preferidos são pantoato de cálcio ou pantoato de sódio. Os sais de pantoato da presente invenção incluem os sais preparados por intermédio de métodos convencionais a partir de ácidos livres aqui descritos. Um sal de pantoato da presente invenção pode ser do mesmo modo convertido a uma forma de ácido livre de pantoato ou ácido pantóico pela metodologias convencional. Além disso, uma forma de ácido livre de pantoato ou ácido pantóico pode ser convertida à pantolactona por metodologia convencional. O termo “o caminho biossintético de CoA” inclui o caminho biossintético que envolve as enzimas biossintéticas de CoA (por exemplo, polipeptídeos codificados pelo genes que codificam enzima biossintética), compostos (por exemplo, precursores, substratos, intermediários ou produtos), cofatores e outros utilizados na formação ou síntese de CoA a partir de pantotenato. Uma representação esquemática do caminho biossintético do CoA no E. coli é apresentada como na Figura 16. (O caminho representado também é presumido ser aquele utilizado pelos outros micro-organismos). O termo “caminho biossintético de CoA” inclui o caminho biossintético que leva à síntese de CoA em micro-organismos (por exemplo, in vivo) bem como o caminho biossintético que leva à síntese de CoA in vitro. O termo “Coenzima A ou enzima biossintética CoA” inclui qualquer enzima utilizada na formação de um composto (por exemplo, intermediário ou produto) do caminho biossintético CoA, por exemplo, o produto de gene coaA, panK ou coaX que catalisa a fosforilação de pantotenato para formar 4’-fosfopantotenato ou o produto de gene coaD que catalisa a conversão de 4’-fosfopanteteína para desfosfocoenzima A. I. Micro-organismos recombinantes e Métodos para Cultivar Micro- organismos Tal Que os Panto-Compostos sejam Produzidos As metodologias da presente invenção retratam micro- organismos, por exemplo, micro-organismos recombinantes, preferivelmente incluindo vetores ou genes (por exemplo, genes do tipo selvagem e/ou mutados) como aqui descritos e/ou cultivados de uma maneira que resulta na produção de um produto desejado (por exemplo um panto-composto ou panto-compostos). O termo micro-organismo “recombinante” inclui um micro-organismo (por exemplo, bactérias, célula de levedura, célula de fungica, etc.) que foi geneticamente alterada, modificada ou engendrada (por exemplo, geneticamente engendrada) tal que exiba um genótipo e/ou fenótipo alterado, modificado ou diferente (por exemplo, quando a modificação genética afeta as sequências de ácido nucleico codificadoras do micro- organismo) quando comparado ao micro-organismo que ocorre naturalmente do qual este foi derivado. Preferivelmente, um micro-organismo “recombinante” da presente invenção foi geneticamente engendrado tal que superexpresse pelo menos um gene ou produto de gene bacterianos (por exemplo, um gene que codifica a enzima biossintética de pantotenato ou de isoleucina-valina) como aqui descritos, preferivelmente um gene que codifique enzima biossintética incluído dentro de um vetor recombinante como aqui descrito e/ou uma enzima biossintética expressa a partir de um vetor recombinante. O especialista avaliará que um micro-organismo que expresse ou que superexpresse um produto de gene produz ou superproduz o produto de gene como um resultado da expressão ou da superexpressão de sequências de ácido nucleico e/ou genes que codificam o produto de gene. O termo “micro-organismo manipulado” inclui um micro- organismo que foi engendrado (por exemplo, geneticamente engendrado) ou modificado tal que o micro-organismo tenha pelo menos uma enzima do caminho biossintético do pantotenato e/ou pelo menos uma enzima do caminho biossintético da isoleucina-valina modificadas tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos. A modificação ou o engendramento de tais micro-organismos podem ser de acordo com qualquer metodologia aqui descrita incluindo, mas não limitado a, desregulagem de um caminho biossintético e/ou a superexpressão de pelo menos uma enzima biossintética. Uma enzima “manipulada” (por exemplo, uma enzima biossintética “manipulada”) inclui uma enzima, a expressão ou a produção da qual foram alteradas ou modificadas tal que pelo menos um precursor, substrato ou produto à montante ou à jusante da enzima seja alterado ou modificado, por exemplo, quando comparado a uma enzima correspondente do tipo selvagem ou que ocorra naturalmente. 0 termo “superexpresso” ou “superexpressão” inclui a expressão de um produto de gene (por exemplo, uma enzima biossintética de pantotenato ou enzima biossintética de isoleucina-valina) em um nível maior do que aquele expresso antes da manipulação do micro-organismo ou em um micro-organismo comparável que não tenha sido manipulado. Em uma forma de realização, o micro-organismo pode ser geneticamente manipulado (por exemplo, geneticamente engendrado) para superexpressar um nível de produto de gene maior do que aquele expresso antes da manipulação do micro-organismo ou em um micro-organismo comparável que não tenha sido manipulado. A manipulação genética pode incluir, mas não é limitada a, alterar ou modificar sequências ou sítios reguladores associados com a expressão de um gene particular (por exemplo, pela adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou pela remoção de sequências reguladoras tal que a expressão seja constitutiva), modificar a localização cromossômica de um gene particular, alterar sequências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular tal como um sítio de ligação de ribossoma ou terminador de transcrição, aumentar o número de cópia de um gene particular, modificar proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressores, realçadores, ativadores transcricionais e outros) envolvidos na transcrição de um gene particular e/ou tradução de um produto de gene particular ou quaisquer outros meios convencionais de desregular a expressão de um gene particular rotineiro na técnica (incluindo mas não limitado ao uso de moléculas de ácido nucleico anti-sentido, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras).

Em uma outra forma de realização, o micro-organismo pode ser física ou ambientalmente manipulado para superexpressar um nível de produto de gene maior do que aquele expresso antes da manipulação do micro-organismo ou em um micro-organismo comparável que não tenha sido manipulado. Por exemplo, um micro-organismo pode ser tratado com um agente ou cultivado na sua presença, conhecido ou suspeito de aumentar a transcrição de um gene particular e/ou a tradução de um produto de gene particular tal que a transcrição e/ou a tradução sejam realçadas ou aumentadas. Altemativamente, um micro-organismo pode ser cultivado em uma temperatura selecionada para aumentar a transcrição de um gene particular e/ou a tradução de um produto de gene particular tal que a transcrição e/ou a tradução sejam realçadas ou aumentadas. O termo “desregulado” ou “desregulagem” inclui a alteração ou modificação de pelo menos um gene em um micro-organismo que codifique uma enzima em um caminho biossintético, tal que o nível ou a atividade da enzima biossintética no micro-organismo sejam alterados ou modificados. Preferivelmente, pelo menos um gene que codifica uma enzima em um caminho biossintético é alterado ou modificado tal que o produto de gene seja realçado ou aumentado. A frase “caminho desregulado” também pode incluir um caminho biossintético em que mais do que um gene que codifica uma enzima em um caminho biossintético é alterado ou modificado tal que o nível ou a atividade de mais do que uma enzima biossintética sejam alterados ou modificados. A capacidade para “desregular” um caminho (por exemplo, para desregular simultaneamente mais do que um gene em um dado caminho biossintético) em um micro-organismo origina-se do fenômeno particular de micro-organismos em que mais do que uma enzima (por exemplo, duas ou três enzimas biossintéticas) são codificadas pelo genes que ocorrem adjacentes a um outro em um pedaço contíguo de material genético denominado um “operon”. O termo “operon” inclui uma unidade coordenada de expressão de gene que contém um promotor e possivelmente um elemento regulador associados com um ou mais, preferivelmente pelo menos dois, genes estruturais (por exemplo, genes que codificam enzimas, por exemplo, enzimas biossintéticas). A expressão dos genes estruturais pode ser coordenadamente regulada, por exemplo, pelas proteínas reguladoras que se ligam ao elemento regulador ou pela anti-terminação de transcrição. Os genes estruturais podem ser transcritos para dar um único mRNA que codifica todas as proteínas estruturais. Devido à regulagem coordenada de genes incluídos em um operon, a alteração ou modificação do promotor e/ou elemento regulador únicos pode resultar na alteração ou modificação de cada produto de gene codificado pelo operon. A alteração ou modificação do elemento regulador pode incluir, mas não é limitado à remoção do promotor e/ou elemento(s) regulador(es) endógenos, adição de promotores fortes, promotores indutíveis ou promotores múltiplos ou à remoção de sequências reguladoras tal que a expressão dos produtos de gene seja modificada, modificar a localização cromossômica do operon, alterar as sequências de ácido nucleico adjacentes ao operon ou dentro do operon tal como um sítio de ligação de ribossoma, aumentar o número de cópia de operon, modificar proteínas (por exemplo, proteínas reguladoras, supressores, realçadores, ativadores transcricionais e outros) envolvidas na transcrição do operon e/ou tradução dos produtos de gene do operon ou quaisquer outros meios convencionais de desregular a expressão de genes de rotina na técnica (incluindo mas não limitado ao uso de moléculas de ácido nucleico anti- sentido, por exemplo, para bloquear a expressão de proteínas repressoras). A desregulagem também pode envolver alterar a região codificadora de um ou mais genes para produzir, por exemplo, uma enzima que seja resistente à realimentação ou tenha uma atividade específica mais alta ou mais baixa.

Um micro-organismo “recombinante” particularmente preferido da presente invenção foi geneticamente engendrado para superexpressar um gene ou produto de gene bacterianamente derivados. O termo “bacterianamente derivado” ou “derivado de”, por exemplo bactérias, inclui um gene que seja naturalmente encontrado nas bactérias ou um produto de gene (por exemplo, cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase, aspartato-a-descarboxilato, aceto-hidróxi ácido sintetase, aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase ou di-hidróxi-ácido desidratase) que sejam codificados por um gene bacteriano (por exemplo, codificados pelo panB,panE,panC,panD, ilvB, ilvN, alsS, ilvC ou ilvD).

As metodologias da presente invenção retratam micro- organismos recombinantes que superexpressam pelo menos uma de cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase ou aspartato-a-descarboxilase. Um micro-organismo recombinante particularmente preferido da presente invenção foi geneticamente engendrado para superexpressar uma enzima biossintética de Bacillus (por exemplo, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, e Bacillus pumilus, etc.) (por exemplo, foi engendrada para superexpressar pelo menos uma de cetopantoato reductase de B. subtilis (o produto de gene panE) (por exemplo, cetopantoato reductase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 30 ou codificada pela sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 29), cetopantoato hidróxi-metil-transferase de B. subtilis (o produto de gene panB) (por exemplo, cetopantoato hidróxi- metil-transferase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24 ou codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23), pantotenato sintetase de B. subtilis (o produto de gene panC) (por exemplo, pantotenato sintetase tendo a sequência de aminoácido da SEQ Π) NO: 26 ou codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25) e/ou aspartato-a-descarboxilase de B. subtilis (o produto de gene panD) (por exemplo, aspartato-a-descarboxilase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28 ou codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 27).

Em uma forma de realização exemplar, a invenção retrata um micro-organismo (por exemplo, um micro-organismo KPAR-O) que foi transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico panE (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico panE como apresentada na SEQ ID NO: 29). Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um micro-organismo que foi transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico panB (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico panB como apresentada na SEQ ID NO: 23), um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico panC (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico panC como apresentada na SEQ ID NO: 25) ou um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panD (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de panD como apresentado na SEQ ID NO: 27). Já em uma outra forma de realização, a invenção retrata um micro-organismo tendo um operon de panBCD desregulado (por exemplo, SEQ ID NO: 59).

Outros micro-organismos “recombinantes” preferidos da presente invenção têm um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado. A frase “micro-organismo tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado” inclui um micro-organismo tendo uma alteração ou modificação em pelo menos um gene que codifica uma enzima do caminho de isoleucina- valina (ilv) ou tendo uma alteração ou modificação em um operon incluindo mais do que um gene que codifica uma enzima do caminho de isoleucina- valina (ilv). Um “micro-organismo tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado” preferido foi geneticamente engendrado para superexpressar uma enzima biossintética ilv de Bacillus (por exemplo, B. subtilis) (por exemplo, foi engendrada para superexpressar pelo menos uma de aceto-hidróxi-ácido sintetase (o produto de gene ilvBN ou o produto de gene alsS) (por exemplo, aceto-hidróxi-ácido sintetase tendo subunidades que tenham as sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 34 ou codificadas pelas moléculas de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33 ou a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 58 dos nucleotídeos 1 a 2246 ou aceto-hidróxi- ácido sintetase codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 86), aceto-hidróxi-ácido isômero- reductase (o produto de gene ilvQ (por exemplo, aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36 ou codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 35), di-hidróxi-ácido desidratase (o produto de gene ilvD) (por exemplo, di-hidróxi-ácido desidratase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 38 ou codificada por uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 37), e/ou foi transformada com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico de ilvBNC (SEQ ID NO: 58, regiões codificadoras dos nucleotídeos 1 a 1725, 1722 a 2246 e 2263 a 3291) e/ou a sequência de ácido nucleico de ilvD (SEQ ID NO: 37).

Em uma outra forma de realização preferida, um micro- organismo recombinante é planejado ou engendrado tal que uma enzima biossintética CoaA e/ou CoaX mutante seja expressa e pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato e/ou pelo menos uma enzima biossintética de isoleucina-valina seja superexpressa ou desregulada.

Em uma outra forma de realização preferida, um micro- organismo da presente invenção superexpressa ou é mutado quanto a um gene ou enzima biossintética (por exemplo,, uma enzima biossintética CoA, enzima biossintética de pantotenato ou enzima biossintética de isoleucina- valina) que seja bacterianamente derivada. O termo “bacterianamente derivada” ou “derivada de”, por exemplo bactérias, inclui um produto de gene (por exemplo, cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase, aspartato-a-descarboxilato, aceto-hidróxi- ácido sintetase, aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase, di-hidróxi-ácido desidratase ou pantotenato cinase) que seja codificado por um gene bacteriano (por exemplo, panB, panE, panC, panD, ilvBN (ou alsS], ilvC, ilvD ou codificado pelo coaA ou coaX).

Todavia outros micro-organismos recombinantes preferidos da presente invenção são micro-organismos mutantes. Como aqui usado, o termo “micro-organismo mutante” inclui um micro-organismo recombinante que foi geneticamente engendrado para expressar um gene ou proteína mutados que sejam normal ou naturalmente expressos pelo micro-organismo.

Preferivelmente, um micro-organismo mutante expressa um gene ou proteína mutados tal que o micro-organismo exiba um fenótipo alterado, modificado ou diferente (por exemplo, foram engendrados para expressar uma enzima biossintética CoaA mutada, por exemplo, pantotenato cinase). Em uma forma de realização, um micro-organismo mutante é planejado ou engendrado tal que inclua um gene mutante coaX, como aqui definido. Em uma outra forma de realização, um micro-organismo recombinante é planejado ou engendrado tal que inclua um gene coaA mutante, como aqui definido. Em uma outra forma de realização, um micro-organismo mutante é planejado ou engendrado tal que um gene coaX tenha sido suprimido (isto é, a proteína codificada pelo gene coaX não é produzida). Em uma outra forma de realização, um micro- organismo mutante é planejado ou engendrado tal que um gene coaA tenha sido suprimido (isto é, a proteína codificada pelo gene coaA não é produzida). Preferivelmente, um micro-organismo mutante tem um gene coaX mutante ou um gene coaA mutante ou foi engendrado para ter um gene coaX e/ou coaA suprimidos, tal que aquele micro-organismo mutante codifique uma “atividade da pantotenato cinase reduzida”. No contexto de um micro-organismo inteiro, uma “atividade da pantotenato cinase reduzida” pode ser determinada medindo-se ou ensaiando-se quanto a uma diminuição em um intermediário ou produto do caminho biossintético de CoA, por exemplo, medindo-se ou ensaiando-se quanto ao 4’-fosfopantotenato, 4’- fosfopantotenil-cisteína, 4’-fosfopanteteína, desfosfocoenzima A, Coenzima A, apo-proteína carregadora de acila (apo-ACP) ou holo-proteina carregadora de acila (ACP) no micro-organismo (por exemplo, em um lisado isolado ou derivado do micro-organismo) ou no meio em que o micro-organismo é cultivado (ver por exemplo, a Figura 16). Altemativamente, uma “atividade da pantotenato cinase reduzida” pode ser determinada medindo-se ou ensaiando-se quanto ao desenvolvimento diminuído do micro-organismo.

Altemativamente, uma “atividade da pantotenato cinase reduzida” pode ser determinada medindo-se ou ensaiando-se quanto a um aumento em um panto- composto (por exemplo, pantotenato) no micro-organismo ou meio circundante, visto que os panto-compostos situam-se à montante do caminho biossintético CoA, a primeira etapa da qual é catalisada pela pantotenato cinase. A invenção também retrata micro-organismos recombinantes que, além de terem atividade da pantotenato cinase reduzida (por exemplo, que expressa os genes mutante coaA e/ou o mutante coaXs) têm um caminho de biossíntese de pantotenato desregulado e/ou um caminho biossintético de isoleucina-valina (//v) desregulado.

Em uma forma de realização, um micro-organismo recombinante da presente invenção é um organismo Gram positivo (por exemplo, um micro-organismo que retém pigmento básico, por exemplo, violeta cristal, devido à presença de uma parede Gram-positiva que circunda o micro-organismo). Em uma forma de realização preferida, o micro- organismo recombinante é um micro-organismo pertencente a um gênero selecionado do grupo que consiste em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci e Streptomyces. Em uma forma de realização mais preferida, o micro-organismo recombinante é do gênero Bacillus. Em uma outra forma de realização preferida, o micro-organismo recombinante é selecionado do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, e outras espécies de Bacillus do Grupo 1, por exemplo, como caracterizados pelo tipo 16S rRNA (Priest (1993) em Bacillus subtilis and Others Gram-Positive Bacteria eds. Sonenshein et al., ASM, Washington, D.C., p. 6). Em uma outra forma de realização preferida, o micro-organismo recombinante é a Bacillus brevis ou Bacillus stearothermophilus. Em uma outra forma de realização preferida, o micro-organismo recombinante é selecionado do grupo que consiste em Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefadens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis e Bacillus pumilus.

Em uma outra forma de realização, o micro-organismo recombinante é um organismo Gram negativo (exclui pigmento básico). Em uma forma de realização preferida, o micro-organismo recombinante é um micro-organismo pertencente a um gênero selecionado do grupo que consiste em Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia e Proteus. Em uma forma de realização mais preferida, o micro-organismo recombinante é do gênero Escherichia. Em uma forma de realização ainda mais preferida, o micro- organismo recombinante é Escherichia coli. Em uma outra forma de realização, o micro-organismo recombinante é Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae).

Um aspecto importante da presente invenção envolve cultivar os micro-organismos recombinantes aqui descritos, tal que um composto desejado (por exemplo, um panto-composto desejado) seja produzido. O termo “cultivar” inclui manter e/ou desenvolver um micro-organismo vivo da presente invenção (por exemplo, manter e/ou desenvolver uma cultura ou cepa). Em uma forma de realização, um micro-organismo da invenção é cultivado em meios líquidos. Em uma outra forma de realização, um micro- organismo da invenção é cultivado em meios sólidos ou meios semi-sólidos.

Em uma forma de realização preferida, um micro-organismo da invenção é cultivado em meios (por exemplo, meios líquidos, estéreis) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou desenvolvimento do micro-organismo (por exemplo, fontes de carbono ou substrato de carbono, por exemplo carboidratos complexos tais como farinha de feijão ou cereal, amidos, açúcares, álcoois de açúcar, hidrocarbonetos, óleos, gorduras, ácidos graxos, ácidos orgânicos e álcoois; fontes de nitrogênio, por exemplo, proteínas vegetais, peptonas, peptídeos e aminoácidos derivados de cereais, feijões e tubérculos, proteínas, peptídeos e aminoácidos derivados de fontes animal tais como carne, leite e subprodutos animal tais como peptonas, extratos de carne e hidrolisados de caseína; fontes de nitrogênio inorgânico tais como uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, ácido fosfórico, seus sais de sódio e potássio; elementos traço, por exemplo, sais de magnésio, ferro, manganês, cálcio, cobre, zinco, boro, molibdênio, e/ou cobalto; bem como fatores de desenvolvimento tais como aminoácidos, vitaminas, promotores de desenvolvimento e outros).

Preferivelmente, os micro-organismos da presente invenção são cultivados sob pH controlado. O termo “pH controlado” inclui qualquer pH que resulta na produção do produto desejado (por exemplo, um panto- composto). Em uma forma de realização, os micro-organismos são cultivados em um pH de cerca de 7. Em uma outra forma de realização, os micro- organismos são cultivados em um pH entre 6,0 e 8,5. O pH desejado pode ser mantido por qualquer número de métodos conhecidos por aqueles habilitados na técnica.

Também preferivelmente, os micro-organismos da presente invenção são cultivados sob aeração controlada. O termo “aeração controlada” inclui aeração suficiente (por exemplo, oxigênio) para resultar na produção do produto desejado (por exemplo, o panto-composto). Em uma forma de realização, a aeração é controlada regulando-se os níveis de oxigênio na cultura, por exemplo, regulando-se a quantidade de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Preferivelmente, a aeração da cultura e controlada agitando-se a cultura. A agitação pode ser fornecida por um propulsor ou equipamento de agitação mecânica similar, revolvendo-se ou agitando-se o vaso de desenvolvimento (por exemplo, fermentador) ou por vários equipamentos de bombeamento. A aeração pode ser ainda controlada pela passagem de ar ou oxigênio estéreis através do meio (por exemplo, através da mistura de fermentação). Também preferivelmente, os micro- organismos da presente invenção são cultivados sem espumação em excesso (por exemplo, pela adição de agentes antiespumantes).

Além disso, os micro-organismos da presente invenção podem ser cultivados sob temperaturas controladas. O termo “temperatura controlada” inclui qualquer temperatura que resulta na produção do produto desejado (por exemplo, um panto-composto). Em uma forma de realização, as temperaturas controladas incluem temperaturas entre 15°C e 95°C. Em uma outra forma de realização, as temperatura controladas incluem temperaturas entre 15°C e 70°C. As temperaturas preferidas estão entre 20°C e 55°C, mais preferivelmente entre 30°C e 45°C ou entre 30°C e 50°C.

Os micro-organismos podem ser cultivados (por exemplo, mantidos e/ou desenvolvidos) em meios líquidos e preferivelmente são cultivados, contínua ou intermitentemente, por métodos convencionais de cultivo tais como cultura fixa, cultura em tubo de teste, cultura sob agitação (por exemplo, cultura sob agitação rotativa, cultura em frasco agitado, etc.), cultura de aeração giratória ou fermentação. Em uma forma de realização preferida, os micro-organismos são cultivados em frascos agitados. Em uma forma de realização mais preferida, os micro-organismos são cultivados em um fermentador (por exemplo, um processo de fermentação). Os processos de fermentação da presente invenção incluem, mas não são limitados a, batelada, batelada alimentada e métodos contínuos de fermentação. A frase “processo por batelada” ou “fermentação por batelada” refere-se a um sistema fechado em que a composição dos meios, nutrientes, aditivos de suplemento e outros são ajustados no início da fermentação e não sujeito a alteração durante a fermentação, entretanto, tentativas podem ser feitas para controlar fatores tais como o pH e a concentração de oxigênio para impedir o excesso de acidifícação dos meios e/ou a morte do micro-organismo. A frase “processo de batelada alimentada” ou fermentação de “batelada alimentada” refere-se a uma fermentação em batelada com a exceção de que um ou mais dos substratos ou suplementos são adicionados (por exemplo, adicionados em incrementos ou continuamente) conforme a fermentação progride. A frase “processo contínuo” ou “fermentação contínua” refere-se a um sistema em que um meio de fermentação definido é adicionado continuamente a um fermentador e uma quantidade igual de meio usado ou “condicionado” é simultaneamente removido, preferivelmente para a recuperação do produto desejado (por exemplo, o panto-composto). Uma variedade de tais processos foram desenvolvidos e são bem conhecidos na técnica. A frase “cultivar sob condições tais que um composto desejado (por exemplo, um panto-composto, por exemplo, o pantotenato) seja produzido” inclui manter e/ou desenvolver micro-organismos sob condições (por exemplo, temperatura, pressão, pH, duração, etc.) apropriadas ou suficientes para se obter a produção do composto desejado ou para se obter os rendimentos desejados do composto particular que é produzido. Por exemplo, o cultivo é continuado por um tempo suficiente para produzir a quantidade desejada de um panto-composto (por exemplo, pantotenato, pantoato ou β-alanina). Preferivelmente, o cultivo é continuado por um tempo suficiente para atingir substancialmente a produção máxima do panto- composto. Em uma forma de realização, o cultivo é continuado por cerca de 12 a 24 horas. Em uma outra forma de realização, o cultivo é continuado por cerca de 24 a 36 horas, 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, 120 a 144 horas ou mais do que 144 horas. Em uma outra forma de realização, o cultivo é continuado por um tempo suficiente para atingir rendimentos de produção de panto-composto, por exemplo, as células são cultivada tal que pelo menos cerca de 15 a 20 g/litro de panto-composto sejam produzidos, pelo menos cerca de 20 a 25 g/litro de panto-composto sejam produzidos, pelo menos cerca de 25 a 30 g/litro de panto-composto sejam produzidos, pelo menos cerca de 30 a 35 g/litro de panto-composto sejam produzidos, pelo menos cerca de 35 a 40 g/litro de panto-composto sejam produzidos (por exemplo, pelo menos cerca de 37 g/litro de panto- composto) ou pelo menos cerca de 40 a 50 g/litro de panto composto sejam produzidos. Já em uma outra forma de realização, os micro-organismos são cultivados sob condições tais que um rendimento preferido de panto- composto, por exemplo, um rendimento dentro de uma faixa apresentada acima, seja produzido em cerca de 24 horas, em cerca de 36 horas, em cerca de 48 horas, em cerca de 72 horas ou em cerca de 96 horas. A metodologia da presente invenção pode ainda incluir uma etapa de recuperação de um composto desejado (por exemplo, um panto- composto). O termo “recuperar” um composto desejado (por exemplo, um panto-composto) inclui extrair, colher, isolar ou purificar o composto a partir dos meios de cultura. A recuperação do composto pode ser realizada de acordo com qualquer metodologia de isolação ou de purificação convencionais conhecidas na técnica incluindo, mas não limitado a, tratamento com uma resina convencional (por exemplo, resina de troca aniônica ou catiônica, resina de absorção não iônica, etc.), tratamento com um absorvente convencional (por exemplo, carvão vegetal ativado, ácido silícico, gel de silica, celulose, alumina, etc.), alteração de pH, extração com solvente (por exemplo, com um solvente convencional tal como um álcool, acetato de etila, hexano e outros), diálise, filtração, concentração, cristalização, recristalização, ajuste de pH, liofilização e outros. Por exemplo, um composto (por exemplo, um panto-composto) pode ser recuperado a partir dos meios de cultura removendo-se primeiro os micro-organismos da cultura.

Os meios são então passados através ou sobre uma resina de troca catiônica para remover cátions não desejados e depois através ou sobre uma resina de troca aniônica para remover ânions inorgânicos não desejados e ácidos orgânicos tendo acidez mais forte do que o panto-composto de interesse (por exemplo, o pantotenato). O panto-composto resultante (por exemplo, o pantotenato) pode ser subsequentemente convertido a um sal de pantotenato (por exemplo, o pantotenato de cálcio) como aqui descrito.

Preferivelmente, um composto desejado da presente invenção é “extraído”, “isolado” ou “purificado” tal que a preparação resultante seja substancialmente livre de outros componentes (por exemplo, livre de componentes dos meios e/ou dos subprodutos de fermentação). A linguagem “substancialmente livre de outros componentes” inclui preparações do composto desejado em que o composto é separado (por exemplo, purificado ou parcialmente purificado) dos componentes dos meios ou dos subprodutos de fermentação da cultura a partir dos quais o mesmo seja produzido. Em uma forma de realização, a preparação tem mais do que cerca de 80% (em peso seco) do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 20% dos outros componentes dos meios ou dos subprodutos de fermentação), mais preferivelmente mais do que cerca de 90% do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 10% de outros componentes dos meios ou dos subprodutos de fermentação), ainda mais preferivelmente mais do que cerca de 95% do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 5 % de outros componentes dos meios ou dos subprodutos de fermentação), e o mais preferivelmente mais do que cerca de 98 a 99% do composto desejado (por exemplo, menos do que cerca de 1 a 2% de outros componentes dos meios ou dos subprodutos de fermentação). Quando o composto desejado é um panto-composto que foi derivatizado a um sal (por exemplo um sal de pantotenato ou um sal de pantoato), o panto-composto é ainda preferivelmente livre (por exemplo, substancialmente livre) de contaminantes químicos associados com a formação do sal. Quando o composto desejado é um panto-composto que foi derivatizado a um álcool, o panto-composto é ainda preferivelmente livre (por exemplo, substancialmente livre) de contaminantes químicos associados com a formação do álcool.

Em uma forma de realização alternativa, o panto-composto desejado não é purificado a partir do micro-organismo, por exemplo, quando o micro-organismo é biologicamente não nocivo (por exemplo, seguro). Por exemplo, a cultura inteira (ou sobrenadante da cultura) pode ser usada como uma fonte de produto (por exemplo, produto bruto). Em uma forma de realização, o sobrenadante da cultura (ou o sobrenadante da cultura) é usado sem modificação. Em uma outra forma de realização, a cultura (ou o sobrenadante da cultura) é concentrada. Já em uma outra forma de realização, a cultura (ou o sobrenadante da cultura) é secada ou liofilizada. II. Metodologias de Produção de Panto-Composto Retratando Micro- organismos Que Superexpressam a Cetopantoato Reductase Um aspecto da invenção retrata métodos de produzir um panto-composto que envolve cultivar um micro-organismo que superexpresse a cetopantoato reductase (KPAR-O) sob condições tais que o panto-composto seja produzido. O termo “micro-organismo que superexpressa a cetopantoato reductase (KPAR-O)” inclui um micro-organismo que foi manipulado tal que a cetopantoato reductase seja superexpressa (por exemplo, uma proteína de cetopantoato reductase de B. subtüis tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 30) e/ou que tenha sido transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panEl (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico panEl de B. subtüis como apresentado na SEQ ID NO: 29). Em uma forma de realização, o panto-composto é o pantotenato. Em uma outra forma de realização, o panto-composto é o pantoato. Em uma outra forma de realização, a cetopantoato reductase é derivada d bactérias. Em uma outra forma de realização, a cetopantoato reductase é derivada de Bacillus (por exemplo, é derivada do Bacillus subtilis). Já em uma outra forma de realização, o micro-organismo KPAR-0 é Gram positivo. Já em uma outra forma de realização, o micro-organismo KPAR-0 é um micro-organismo pertencente a um gênero selecionado do grupo que consiste em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci e Streptomyces. Em uma forma de realização preferida, o micro-organismo KPAR-0 é do gênero Bacillus. Em uma forma de realização mais preferida, o micro-organismo KPAR-0 é selecionado do grupo que consiste em Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefadens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis e Bacillus pumilus. Em uma forma de realização particularmente preferida, o micro-organismo KPAR-0 é o Bacillus subtilis.

Ainda em outras formas de realização, o micro-organismo KPAR-0 ainda superexpressa pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato além da cetopantoato reductase. Em uma forma de realização exemplar, o micro-organismo KPAR-0 ainda superexpressa pelo menos uma de cetopantoato hidróxi-metil-transferase, pantotenato sintetase e aspartato-a- descarboxilase. Também são retratados métodos de produzir panto- compostos, por exemplo, métodos que envolvem cultivar um micro- organismo KPAR-O, que ainda incluem a etapa de recuperar o panto- composto. III. Métodos de Produzir Panto-Compostos Independentes das Exigências de Alimentação Precursora Dependendo da enzima biossintética ou da combinação de enzimas biossintéticas manipuladas, pode ser desejável ou necessário fornecer (por exemplo, alimentar) aos micro-organismos da presente invenção pelo menos um precursor biossintético de pantotenato tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos. O termo “precursor biossintético de pantotenato” ou “precursor” inclui um agente ou composto que, quando fornecidos, levados em contato com ou incluídos no meio de cultura de um micro-organismo, serve para realçar ou aumentar a biossíntese de pantotenato. Em uma forma de realização, o precursor biossintético de pantotenato ou o precursor é o aspartato. Em uma outra forma de realização, o precursor biossintético de pantotenato ou o precursor é a β-alanina. A quantidade de aspartato ou de β-alanina adicionada é preferivelmente uma quantidade que resulte em uma concentração no meio de cultura suficiente para realçar a produtividade do micro-organismo (por exemplo, uma concentração suficiente para realçar a produção de um panto- composto, por exemplo, β-alanina, cetopantoato, pantoato ou pantotenato).

Os precursores biossintéticos de pantotenato da presente invenção pode ser adicionado na forma de uma solução ou suspensão concentradas (por exemplo, em um solvente adequado tal como água ou tampão) ou na forma de um sólido (por exemplo, na forma de um pó). Além disso, os precursores biossintéticos de pantotenato da presente invenção podem ser adicionados como uma alíquota única, contínua ou intermitentemente em um dado período de tempo. Já em uma outra forma de realização, o precursor biossintético de pantotenato é a valina, ver por exemplo, o Exemplo III. Já em uma outra forma de realização, o precursor biossintético de pantotenato é o a-ceto- isovalerato. Preferivelmente, a valina ou o α-ceto-isovalerato são adicionados em uma quantidade que resulte em uma concentração no meio suficiente para que a produção do produto desejado (por exemplo, o panto-composto) ocorra.

Os precursores biossintéticos de pantotenato também são aludidos aqui como “substratos biossintéticos de pantotenato suplementais”. O fornecimento de precursores biossintéticos de pantotenato nas metodologias biossintéticas de pantotenato da presente invenção, pode estar associado com custos altos, por exemplo, quando as metodologias são usadas para produzir rendimentos altos de panto-compostos.

Consequentemente, as metodologias preferidas da presente invenção retratam micro-organismos tendo pelo menos uma enzima biossintética ou uma combinação de enzimas biossintéticas (por exemplo, pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato e/ou uma enzima biossintética de valina- isoleucina) manipulados tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos de uma maneira independente da alimentação precursora. A frase “uma maneira independente de alimentação precursora”, por exemplo, quando se refere a um método para produzir um composto desejado (por exemplo, um panto-composto), inclui um método ou um modo de produzir o composto desejado que não dependa ou conte com precursores que sejam fornecidos (por exemplo, alimentados) ao micro-organismo que é utilizado para produzir o composto desejado. Por exemplo, os micro- organismos retratados nas metodologias da presente invenção podem ser usados para produzir panto-compostos de uma maneira que não requeira nenhuma alimentação dos precursores aspartato, β-alanina, valina e/ou a- KIV.

As metodologias alternativas preferidas da presente invenção retratam micro-organismos tendo pelo menos uma enzima biossintética ou combinação de enzimas biossintéticas manipuladas tal que o pantotenato ou os outros panto-compostos desejados sejam produzidos de uma maneira substancialmente independente da alimentação precursora. A frase “uma maneira substancialmente independente de alimentação precursora” inclui uma maneira de tratar ou um método de produzir o composto desejado que dependa ou conte em um grau menor dos precursores que são fornecidos (por exemplo, alimentados) ao micro-organismo que é utilizado. Por exemplo, os micro-organismos retratados nas metodologias da presente invenção podem ser usados para produzir panto-compostos de uma maneira que requeira a alimentação de quantidades substancialmente reduzidas dos precursores aspartato, β-alanina, valina e/ou α-KIV. Em uma forma de realização, a invenção retrata métodos de produzir panto-compostos (por exemplo, pantotenato) de uma maneira que requeira a alimentação de menos do que 5% a 10% da quantidade de precursor requerida por um micro-organismo de controle (por exemplo, um micro-organismo que seja dependente, por exemplo seja totalmente dependente, da alimentação precursora para produzir eficientemente o composto desejado). Em uma outra forma de realização, a invenção retrata métodos de produzir panto-compostos de uma maneira que requeira alimentar menos do que 15 a 20% da quantidade de precursor requerida por um micro-organismo de controle. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata métodos de produzir panto-compostos de uma maneira que requeira alimentar menos do que 25 a 30%, 35 a 40%, 45 a 50% ou 55 a 60% da quantidade de precursor requerida por um micro-organismo de controle. Como descrito nos Exemplos I a III neste, os micro-organismos particulares retratados nas metodologias da presente invenção requerem, por exemplo, 5 g/litro de aspartato, β-alanina, valina ou α-KIV (por exemplo, nas culturas de tubo de teste ou nas de frasco agitado). Consequentemente, em uma forma de realização preferida, a presente invenção retrata métodos de produzir panto-compostos (por exemplo, pantotenato) de uma maneira que requer alimentar menos do que 0,25 g/litro, 0,5 g/litro, 0,75 g/litro, 1 g/litro, 1,25 g/litro, 1,5 g/litro, 1,75 g/litro, 2 g/litro, 2,25 g/litro, 2,5 g/litro, 2,75 g/litro ou 3 g/litro.

Os métodos preferidos de produzir os compostos desejados (por exemplo, os panto-compostos) de uma maneira independente da alimentação precursora ou altemativamente, de uma maneira substancialmente independente da alimentação precursora, envolve cultivar micro-organismos que foram manipulados (por exemplo, planejados ou engendrados, por exemplo, geneticamente engendrados) tal que a expressão de pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato, e/ou pelo menos uma enzima biossintética de isoleucina-valina sejam modificadas. Por exemplo, em uma forma de realização, um micro-organismo é manipulado (por exemplo, planejado ou engendrado) tal que a produção de pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato, e/ou pelo menos uma enzima biossintética de isoleucina/valina sejam desreguladas. Em uma forma de realização preferida, um micro-organismo é manipulado (por exemplo, planejado ou engendrado) tal que tenha um caminho biossintético desregulado, por exemplo, um caminho da biossíntese de pantotenato desregulado e/ou um caminho biossintético da isoleucina-valina desregulado, como aqui definido. Em uma outra forma de realização preferida, um micro- organismo é manipulado (por exemplo, planejado ou engendrado) tal que pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato, e/ou pelo menos uma enzima biossintética de isoleucina-valina seja superexpressa.

Os métodos preferidos de produzir os composto desejados (por exemplo, os panto-compostos) de uma maneira independente da alimentação precursora ou altemativamente, de uma maneira substancialmente independente da alimentação precursora, são como segue.

Em uma forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação precursora compreendendo cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato- α-descarboxilase (AaD-O) tendo um caminho de isoleucina-valina (üv) desregulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação precursora compreendendo cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato- α-descarboxilase (AaD-O) tendo um caminho de pantotenato (pan) desregulado e um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado, sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação de aspartato ou β-alanina compreendendo cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato- α-descarboxilase (AaD-O) sob condições tais que o pantotenato seja produzido. Já em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir pantotenato de uma maneira independente da alimentação de valina ou α-ceto-isovalerato compreendendo cultivar um micro-organismo tendo um caminho biossintético de isoleucina-valina (ilv) desregulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido. O termo “micro-organismo que superexpresse a aspartato-a- descarboxilase (AaD-O)” inclui um micro-organismo que foi manipulado tal que a aspartato-a-descarboxilase seja superexpressa. Um “micro-organismo que superexpressa a aspartato-a-descarboxilase (AaD-O)” preferido foi transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico panD da B. subtilis (por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de panD que codifique uma proteína de aspartato-a-descarboxilase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28, por exemplo, uma sequência de ácido nucleico de panD como apresentada na SEQ ID NO: 27). A frase “micro-organismo tendo um caminho de isoleucina- valina (ilv) desregulado” inclui um micro-organismo tendo uma alteração ou modificação em pelo menos um gene que codifica uma enzima do caminho de isoleucina-valina (ilv) ou tendo uma alteração ou modificação em um operon incluindo mais do que um gene que codifiquem uma enzima do caminho de isoleucina-valina (ilv). Um “micro-organismo tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado” preferido superexpressa a aceto- hidróxi-ácido sintetase (por exemplo, a aceto-hidróxi-ácido sintetase tendo subunidades que tenham as sequências de aminoácido da SEQ ID NO: 32 e da SEQ ID NO: 34 ou aceto-hidróxi-ácido sintetase tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 87), a aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36) ou a di-hidróxi-ácido desidratase (tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 38) e/ou que tenham sido transformadas com um vetor que compreenda as sequências de ácido nucleico de ilvB, ilvN, tivC, ilvBN, ilvBNC ou alsS (SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, os nucleotídeos de 1 a 2246 da SEQ ID NO: 58, a SEQ ID NO: 58 tendo as regiões codificadoras dos nucleotídeos de 1 a 1725,1722 a 2246 e 2263 a 3291 ou a SEQ ID NO: 86, respectivamente) e/ou a sequência de ácido nucleico de UvD (SEQ ID NO: 37). IV. Metodologias de Produção de Alto Rendimento Uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção é um método de produção de alto rendimento para produzir pantotenato compreendendo cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um rendimento significantemente alto. A frase “método de produção de alto rendimento”, por exemplo, um método de produção de alto rendimento para produzir um composto desejado (por exemplo, para produzir um panto-composto) inclui um método que resulta na produção do composto desejado a um nível que seja elevado ou acima daquele que seja usual para métodos de produção comparáveis. Preferivelmente, um método de produção de alto rendimento resulta na produção do composto desejado em um rendimento significantemente alto. A frase “rendimento significantemente alto” inclui um nível de produção ou rendimento que seja suficientemente elevado ou acima daquele que seja usual para os métodos de produção comparáveis, por exemplo, que seja elevado a um nível suficiente para a produção comercial do produto desejado (por exemplo, a produção do produto a um custo comercialmente praticável). Em uma forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 2 g/litro. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 10 g/litro. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 20 g/litro. Já em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 30 g/litro. Já em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 40 g/litro. A invenção ainda retrata um método de produção de alto rendimento para produzir um composto desejado (por exemplo, para produzir um panto-composto) que envolve cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que um nível suficientemente elevado de composto seja produzido dentro de um período de tempo comercialmente desejável. Em uma forma de realização exemplar, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 15 a 20 g/litro em 36 horas. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 25 a 30 g/litro em 48 horas. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 35 a 40 g/litro em 72 horas, por exemplo, maior do que 37 g/litro em 72 horas.

Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produção de alto rendimento de produzir pantotenato que inclui cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um nível maior do que 30 a 40 g/litro em 60 horas, por exemplo, maior do que 30, 35 ou 40 g/litro em 60 horas. Os Valores e faixas incluídas e/ou intermediárias dentro das faixas aqui apresentadas também são intencionadas a estarem dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, a produção de pantotenato em níveis de pelo menos 31,32,33,34,35,36,37, 38 e 39 g/litro em 60 horas é intencionada a estar incluída dentro da faixa de 30 a 40 g/litro em 60 horas. Em um outro exemplo, faixas de 30 a 35 g/litro ou 35 a 40 g/litro são intencionadas a estarem incluídas dentro da faixa de 30 a 40 g/litro em 60 horas. Além disso, o técnico habilitado avaliará que cultivar um micro-organismo manipulado para se obter um nível de produção de, por exemplo, “30 a 40 g/litro em 60 horas” inclui cultivar o micro- organismo por períodos de tempo adicionais (por exemplo, períodos de tempo mais longos do que 60 horas), opcionalmente resultando em rendimentos ainda maiores do pantotenato que é produzido. V. Metodologias de Produção de Panto-Composto Que Retrata Micro- organismos mutantes da Pantotenato Cinase A presente invenção diz respeito a métodos de produzir pantotenato usando micro-organismos engendrados para produzir rendimentos altos de pantotenato bem como outros panto-compostos. As células que superproduzem pantotenato resultam em níveis de pantotenato intracelular altos que podem superar a inibição da realimentação de pantotenato cinase pelo CoA, levando à superprodução de CoA. Além de consumir pantotenato, a síntese aumentada de CoA pode causar a inibição aumentada da realimentação da reação de PanB, PanD, PanE ou PanC, limitando deste modo a produção de pantotenato. Consequentemente, uma redução na atividade da pantotenato cinase pode levar a uma diminuição nos níveis de CoA com aumentos resultantes na atividade de PanB, PanD, PanE ou PanC e na produção de pantotenato.

Assim, certas metodologias da presente invenção são fundamentadas, pelo menos em parte, na identificação e na caracterização do gene coaA da B. subtilis e na demonstração de que o gene não é essencial para o desenvolvimento de B. subtilis (isto é, a supressão do gene coaA do cromossoma de B. subtilis não é um evento letal) nem para a atividade da pantotenato cinase na B. subtilis. Um segundo gene que codifica a pantotenato cinase foi identificado e caracterizado no B. subtilis, e é denominado ucoaX\ Este gene complementa um mutante da E. coli que contém uma pantotenato cinase sensível à temperatura e não é relacionado pela homologia a qualquer gene anteriormente conhecido da pantotenato cinase.

Em uma aspecto, as metodologias da invenção retratam micro- organismos recombinantes que incluem o gene coaX ou que incluem um gene coaX mutante, tendo atividade da pantotenato cinase reduzida. Em uma forma de realização, as metodologias retratam tais micro-organismos recombinantes tendo ainda um caminho biossintético do pantotenato desregulado. Em uma outra forma de realização, as metodologias retratam tais micro-organismos recombinantes tendo ainda um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado. Em uma forma de realização preferida, o micro-organismos pertencem ao gênero Bacillus (por exemplo, B. subtilis).

As metodologias da invenção também retratam micro- organismos recombinantes (por exemplo, micro-organismos que pertencem ao gênero Bacillus, por exemplo, B. subtilis) que incluem o gene coaA ou que incluem um gene coaA mutante, opcionalmente incluindo um gene coaX ou um mutante deste, tendo atividade da pantotenato cinase reduzida. Em uma forma de realização, as metodologias retratam tais micro-organismos recombinantes tendo ainda um caminho biossintético do pantotenato desregulado ou tendo um caminho de isoleucina-valina (ilv) desregulado.

Também são retratados vetores que incluem os genes coaX ou coaA isolados bem como os genes coaX e/ou coaAs mutantes. As moléculas de ácido nucleico isoladas que incluem os genes coaX ou os genes coaX mutantes isolados são retratados, além das proteínas CoaX e das proteínas CoaX mutantes isoladas.

As moléculas de ácido nucleico acima descritas (por exemplo, os genes), proteínas, vetores, e micro-organismos recombinantes (por exemplo, micro-organismo mutantes), são particularmente adaptados para o uso nos métodos de produzir panto-compostos e/ou nos métodos de realçar a produção de panto-composto. Em uma forma de realização, a invenção retrata um método para produzir um panto-composto (por exemplo, pantotenato) que inclui cultivar uma pantotenato cinase mutante (por exemplo, um micro- organismo recombinante que expresse de modo incorreto, por exemplo, seja mutado pela, pantotenato cinase, como aqui definido) sob condições tais que o panto-composto seja produzido. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método para realçar a produção de um panto-composto (por exemplo, pantotenato) que inclui cultivar uma pantotenato cinase mutante (por exemplo, um micro-organismo recombinante que expresse de modo incorreto, por exemplo, seja mutado pela, pantotenato cinase, como aqui definido) sob condições tais que a produção do panto-composto seja produzida. Como aqui usado, o termo “realçar” (por exemplo, no contexto da frase “realçar a produção”) inclui aumentar o nível ou a taxa de produção de panto-composto (por exemplo, pantotenato) quando comparado ao nível ou taxa de produção em um micro-organismo não mutante (por exemplo, um micro-organismo tendo um gene ou genes da pantotenato cinase normais e/ou tendo taxas e/ou níveis de produção de pantotenato normais.

Preferivelmente, o nível de panto-composto produzido nas metodologias que retratam os mutantes da pantotenato cinase da presente invenção é aumentado em pelo menos 5% quando comparado ao nível produzido por um não mutante (por exemplo, um micro-organismo recombinante que expresse a pantotenato cinase não mutado). Ainda mais preferivelmente, o nível de panto-composto é aumentado em 10% quando comparado com as metodologias que retratam não mutantes. Ainda mais preferivelmente, os níveis de panto-composto (por exemplo, níveis de pantotenato) são aumentados em 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, são aumentados em 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou mais quando comparados a metodologias que retratam não mutantes. VI. Mutações Adicionais Resultando na Produção Realçada de Panto- Composto As metodologias da presente invenção ainda podem incluir, por exemplo, além de superexpressar ou desregular uma enzima biossintética de pantotenato e/ou uma enzima biossintética de isoleucina-valina ou além de mutar um gene que codifica a pantotenato cinase, suprimir ou mutar uma enzima que catalise a conversão dos substratos ou precursores chave da biossíntese de pantotenato para produtos não procurados ou indesejáveis. Por exemplo, mutar o gene ilvE (Kuramitsu et al. (1985) J. Biochem. 97: 993 a 999) ou um homólogo deste (SEQ ID NO: 62 ou SEQ ID NO: 64), limitando deste modo a conversão de α-ceto-isovalerato para valina, além de mutar uma enzima que codifica a pantotenato cinase, é prognosticado resultar em produção ainda mais realçada ou aumentada de panto-composto.

Altemativamente, mutar o gene ansB (Sun e Seflow (1991) J. Bacteriol. 173: 3831 a 3845) ou um homólogo deste (SEQ ID NO: 66), limitando deste modo a degradação de aspartato, além de mutar uma enzima que codifica a pantotenato cinase, é prognosticado resultar em produção ainda mais realçada ou aumentada de panto-composto. Altemativamente, mutar o gene alsD (Renna et al. (1993) J. Bacteriol. 175: 3863 a 3875) ou um homólogo deste (SEQ ID NO: 68), limitando deste modo a conversão de acetolactato a acetoína, além de mutar uma enzima que codifica a pantotenato cinase, é prognosticado resultar em produção ainda mais realçada ou aumentada de panto-composto. Altemativamente, mutar o gene avtA que codifica a alanina- valina transaminase ou um homólogo desta, limitando deste modo a conversão de α-ceto-isovalerato para valina, além de mutar uma enzima que codifica a pantotenato cinase, é prognosticado resultar em produção ainda mais realçada ou aumentada de panto-composto. Mutar o gene avtA pode incluir mutar, por exemplo, um gene avtA tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 70 (por exemplo, o gene avtA da E. coli) ou um homólogo estrutural deste (por exemplo, um homólogo que codifica uma proteína tendo 30 a 40%, 40 a 50%, 50 a 60%, 60 a 70%, 70 a 80%, 80 a 90%, 90 a 95% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 71) ou um homólogo funcional (por exemplo, um gene que codifique uma proteína estruturalmente não relacionada tendo atividade de alanina-valina transaminase. Tais mutações podem ser realizadas usando-se as metodologias como exemplificadas nos Exemplos (por exemplo, Exemplos XIII, XV, XVI e XVII).

Consequentemente, em uma forma de realização, a invenção retrata um método de produzir um panto-composto que inclui cultivar um micro-organismo tendo um gene que codifica a pantotenato cinase mutante e que ainda tem uma supressão ou mutação em um gene avtA, ilvE, ansB, e/ou alsD ou homólogo deste. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir um panto-composto que inclui cultivar um micro-organismo tendo um gene que codifica a pantotenato cinase mutante e uma enzima do caminho biossintético do pantotenato desregulada e que ainda tem uma supressão ou mutação em um gene avtA, ilvE, ansB, e/ou alsD ou homólogo deste. Em uma outra forma de realização, a invenção retrata um método de produzir um panto-composto que inclui cultivar um micro- organismo tendo um gene que codifica a pantotenato cinase mutante e uma enzima do caminho biossintético da isoleucina-valina desregulada e que ainda tem uma supressão ou mutação em um gene avtA, ilvE, ansB, e/ou alsD ou homólogo deste.

Mutar o gene alsD pode ser particularmente útil quando realizado em conjunção com a superexpressão ou desregulagem do gene alsS, por exemplo, para impedir que o carbono (por exemplo, acetolactato) de ser removido da combinação precursora utilizada para a produção de a-KIV.

Consequentemente, para maximizar a contribuição do local ais na produção de panto-composto, é desejável romper o gene alsD além de superexpressar o gene alsS. Para romper o gene alsD, fragmentos apropriados do operon ais, que flanqueiam o gene alsD, são amplificados pela PCR e clonados para fornecer a homologia para criar os rompimentos. Um gene de resistência a medicamento, tal como o gene cat, é clonado entre os fragmentos flanqueadores de DNA no lugar do gene alsD, e o DNA linearizado é transformado em uma cepa de produção de pantotenato tal como a PA824, selecionando quanto a resistência a medicamento. Para superexpressar o alsS, a sequência codificadora do alsS (por exemplo, uma sequência codificadora do alsS que foi engendrada pela PCR quanto a expressão) é clonada em um vetor de expressão. Os vetores que expressam o alsS (ou altemativamente, os vetores que expressam o alsS mais o ilvC) são os introduzidos nas cepas de produção de panto-composto (por exemplo, a cepa PA824 que produz o pantotenato).

As metodologias da presente invenção ainda podem incluir, por exemplo além de superexpressar ou desregular uma enzima biossintética de pantotenato e/ou uma enzima biossintética de isoleucina-valina ou além de mutar um gene que codifica a pantotenato cinase, suprimir ou mutar uma enzima que catalisa a conversão de panto-compostos desejados para produtos a jusante não procurados ou não desejados. VII. Moléculas e Genes de Ácido Nucleico Isolados Um outro aspecto da presente invenção retrata as moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam as proteínas de Bacillus (por exemplo, proteínas de B. subtilis), por exemplo, enzimas biossintéticas do pantotenato de Bacillus (por exemplo, enzimas biossintéticas do pantotenato de B. subtilis) ou enzimas biossintéticas de valina-isoleucina de Bacillus (por exemplo, enzimas biossintéticas de valina-isoleucina de B. subtilis). Também são retratadas moléculas de ácido nucleico coaX e/ou coaA isoladas (por exemplo, genes coaX e/ou coaA isolados) bem como as moléculas de ácido nucleico isoladas que incluem tais moléculas de ácido nucleico ou genes coaX e/ou coaA. O termo “molécula de ácido nucleico” inclui moléculas de DNA (por exemplo, lineares, circulares, cDNA ou DNA cromossômico) e moléculas de RNA (por exemplo, tRNA, rRNA, mRNA) e os análogos do DNA ou RNA gerados usando-se análogos de nucleotídeos. A molécula de ácido nucleico pode ser de filamento único ou de filamento duplo, mas preferivelmente é DNA de filamento duplo. O termo molécula de ácido nucleico “isolada” inclui uma molécula de ácido nucleico que é livre das sequências que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico (isto é, as sequências localizadas nas extremidades 5' e 3' da molécula de ácido nucleico) no DNA cromossômico do organismo do qual o ácido nucleico é derivado. Em várias formas de realização, uma molécula isolada de ácido nucleico pode conter menos do que cerca de 10 kb, 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp ou 10 bp de sequências de nucleotídeo que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucleico no DNA cromossômico do micro-organismo do qual a molécula de ácido nucleico é derivada. Além disso, uma molécula de ácido nucleico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente livre de outros materiais celulares quando produzidos pelas técnicas recombinantes ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizados. O termo “gene”, como aqui usado, inclui uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de DNA ou segmento desta), por exemplo, uma proteína ou molécula de ácido nucleico que codifica o RNA, que em um organismo, são separadas de outro gene ou outros genes, pelo DNA intergênico (isto é, DNA interventor ou espaçador que naturalmente flanqueia o gene e/ou separa os genes no DNA cromossômico do organismo).

Um gene pode direcionar a síntese de uma enzima ou de outra molécula de proteína (por exemplo, pode compreender sequências codificadoras, por exemplo, uma matriz de leitura aberta (ORF) contígua que codifica uma proteína) ou pode ele próprio ser funcional no organismo. Um gene em um organismo, pode ser agrupado em um operon, como aqui definido, o dito operon sendo separado dos outros genes e/ou operons pelo DNA intergênico.

Os genes individuais contidos dentro de um operon podem sobrepor-se sem o DNA intergênico entre os ditos genes individuais. Um “gene isolado”, como aqui usado, inclui um gene que é essencialmente livre das sequências que naturalmente flanqueiam o gene no DNA cromossômico do organismo do qual o gene é derivado (isto é, é livre de sequências codificadoras adjacentes que codificam uma segunda proteína ou proteína diferente ou molécula de RNA, sequências estruturais adjacentes ou coisa parecida) e opcionalmente inclui sequências reguladoras 5' e 3', por exemplo sequências promotoras e/ou sequências terminadoras. Em uma forma de realização, um gene isolado inclui predominantemente sequências codificadoras para uma proteína (por exemplo, sequências que codificam proteínas de Bacillus). Em uma outra forma de realização, um gene isolado inclui sequências codificadoras para uma proteína (por exemplo, para uma proteína de Bacillus) e adjacentes às sequências reguladoras 5’ e/ou 3’ do DNA cromossômico do organismo do qual o gene é derivado (por exemplo, sequências reguladoras de Bacillus adjacentes a 5’ e/ou 3’). Preferivelmente, um gene isolado contém menos do que cerca de 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,2 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp ou 10 bp de sequências de nucleotídeo que naturalmente flanqueiam o gene no DNA cromossômico de organismo do qual o gene é derivado.

Em um aspecto, a presente invenção retrata sequências de ácido nucleico ou genes panB isolados, sequências de ácido nucleico ou genes panC isolados, sequências de ácido nucleico ou genes panD isolados, sequências de ácido nucleico ou genes panE isolados, sequências de ácido nucleico ou genes ilvB, ilvN, ilvBN isolados, sequências de ácido nucleico ou genes alsS isolados, sequências de ácido nucleico ou genes ilvC isolados e/ou sequências de ácido nucleico ou genes ilvD isolados.

Em uma forma de realização preferida, o ácido nucleico ou o gene são derivados de Bacillus (por exemplo, são derivados de Bacillus). O termo “derivado de Bacillus” ou “derivado de Bacillus'’ inclui um ácido nucleico ou gene que seja naturalmente encontrado em micro-organismos do gênero Bacillus. Preferivelmente, o ácido nucleico ou gene são derivados de um micro-organismo selecionado do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus paníothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, e outras espécies de Bacillus do Grupo 1, por exemplo, como caracterizadas pelo tipo 16S rRNA (Priest, acima). Em uma outra forma de realização preferida, o ácido nucleico ou o gene são derivados do Bacillus brevis ou Bacillus stearothermophilus. Em uma outra forma de realização preferida, as moléculas de ácido nucleico e/ou os genes da presente invenção são derivados de um micro-organismo selecionado do grupo que consiste em Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis, e Bacillus pumilus.

Em uma forma de realização particularmente preferida, o ácido nucleico ou o gene são derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, são derivados de Bacillus subtilis). 0 termo “derivado de Bacillus subtilis” ou “derivado de Bacillus subtilis” inclui um ácido nucleico ou gene que sejam naturalmente encontrados em Bacillus subtilis. Já em uma outra forma de realização preferida, o ácido nucleico ou o gene é um gene homólogo de Bacillus (por exemplo, são derivados de uma espécie distinta de Bacillus mas tendo homologia significante a um gene de Bacillus da presente invenção, por exemplo, um gene pan de Bacillus ou gene ilv de Bacillus).

Incluídos dentro do escopo da presente invenção estão moléculas de ácido nucleico ou genes derivados de bactérias e/ou moléculas de ácido nucleico ou genes derivados de Bacillus (por exemplo, moléculas de ácido nucleico ou genes derivados de B. subtilis), por exemplo, os genes identificados pelos presentes inventores, por exemplo, os genes coaX, os genes coaA, os genes pan e/ou os genes ilv de Bacillus ou de B. subtilis.

Ainda incluídos dentro do escopo da presente invenção estão as moléculas de ácido nucleico ou genes derivados de bactéria e/ou moléculas de ácido nucleico ou genes derivados de Bacillus (por exemplo, moléculas de ácido nucleico ou genes derivados de B. subtilis) (por exemplo, moléculas de ácido nucleico ou genes de B. subtilis) que diferem das moléculas de ácido nucleico ou genes bacterianos e/ou de Bacillus que ocorrem naturalmente (por exemplo, moléculas de ácido nucleico ou genes de B. subtilis), por exemplo, moléculas de ácido nucleico ou genes que têm ácidos nucleicos que são substituídos, inseridos ou suprimidos, mas que codificam proteínas substancialmente similares aos produtos de gene que ocorre naturalmente da presente invenção. Em uma forma de realização, uma molécula isolada de ácido nucleico compreende pelo menos uma das sequências de nucleotídeo apresentadas como a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ Π) NO: 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37. Em uma outra forma de realização preferida, uma molécula isolada de ácido nucleico compreende pelo menos duas, três ou quatro das sequências de nucleotídeo apresentadas como SEQ ID NO: 23 SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada preferida da presente invenção pode incluir as sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27, preferivelmente ligadas tal que as proteínas codificadas pelas sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27 sejam cada uma produzidas quando a molécula de ácido nucleico isolada é expressa em um micro-organismo (por exemplo, a SEQ ID NO: 59).

Em um outro exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada preferida da presente invenção pode incluir as sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33, preferivelmente ligadas tal que as proteínas codificadas pelas sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31 e SEQ ID NO: 33 sejam cada uma produzida quando a molécula de ácido nucleico isolada é expressa em um micro-organismo (por exemplo, os nucleotídeos de 1 a 2246 da SEQ ID NO: 58). Em um outro exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada preferida da presente invenção pode incluir a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 86. Em um outro exemplo, uma molécula de ácido nucleico isolada preferida da presente invenção pode incluir as sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 35, preferivelmente ligadas tal que as proteínas codificadas pelas sequências de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 35 sejam cada uma produzidas quando a molécula de ácido nucleico isolada é expressa em um micro-organismo (por exemplo, a SEQ ID NO: 58).

Em uma outra forma de realização, uma molécula isolada de ácido nucleico da presente invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos cerca de 60 a 65%, preferivelmente pelo menos cerca de 70 a 75%, mais preferível pelo menos cerca de 80 a 85%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 a 95% ou mais idêntica a uma sequência de nucleotídeo apresentada como a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37. Em uma outra forma de realização, uma molécula isolada de ácido nucleico hibridiza sob condições severas a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeo apresentada como a SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35 ou SEQ D NO: 37. Tais condições severas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 a 6.3.6. Um exemplo não limitante de condições de hibridização severas, preferidas (por exemplo, severidade alta) é a hibridização em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45° C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2 X SSC, 0,1% SDS entre 50 e 65°C. Preferivelmente, uma molécula isolada de ácido nucleico da invenção que hibridiza sob condições severas com a sequência da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37 corresponde a uma molécula de ácido nucleico que ocorre naturalmente. Como aqui usado, uma molécula de ácido nucleico “que ocorre naturalmente” refere-se a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma sequência de nucleotídeo que ocorra na natureza.

Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ

ID NO 31, SEQ Π) NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37) pode ser isolada usando-se técnicas de biologia molecular padrão e a informação de sequência aqui fornecida. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico podem ser isoladas usando-se técnicas de hibridização e clonagem padrão (por exemplo, como descritas em Sambrook, J,, Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ou podem ser isolados pela reação de cadeia de polimerase usando-se iniciadores de oligonucleotídeo sintético planejados com base na sequência da SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35 ou SEQ ID NO: 37. Um ácido nucleico da invenção pode ser amplificado usando-se cDNA, mRNA ou altemativamente, DNA genômico, como um padrão e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com técnicas padrão de amplificação por PCR. Em uma outra forma de realização preferida, uma molécula isolada de ácido nucleico da invenção compreende uma molécula de ácido nucleico que é um complemento da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ED NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 35.

As sequências de ácido nucleico panC adicionais incluem aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 26 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 26 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 25 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 26 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo panC como aqui apresentado.

As sequências de ácido nucleico panD adicionais incluem aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 27 codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 28 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 28 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 27 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 28 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo panD como aqui apresentada.

As sequências de ácido nucleico panE adicionais incluem aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 29, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 30 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 30 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 29 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 30 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo panE como aqui apresentado.

As sequências de ácido nucleico ilvB adicionais são aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 32 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 32 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 31 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 32 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo ilvB como aqui apresentado.

As sequências de ácido nucleico ilvN adicionais são aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 33, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 34 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 34 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 33 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 34 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo ilvN como aqui apresentado.

As sequências de ácido nucleico ilvC adicionais incluem aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ DD NO: 35, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 36 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 36 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 35 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 36 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo ilvC como aqui apresentado.

As sequências de ácido nucleico ilvD adicionais incluem aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 37, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 38 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 38 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 37 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 38 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo ilvD como aqui apresentado.

As sequências de ácido nucleico alsS adicionais incluem aquelas que compreendem a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 86, codificam um homólogo do polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO: 87 (por exemplo, codificam um polipeptídeo tendo pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais identidade ao polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 87 e uma atividade substancialmente idêntica à do dito polipeptídeo), hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 86 ou a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 87 ou são complementares a uma sequência de nucleotídeo alsS como aqui apresentado.

Em uma outra forma de realização, uma molécula isolada de ácido nucleico é ou inclui um gene coaX ou parte ou fragmento deste. Em uma forma de realização, uma molécula de ácido nucleico ou gene coaX

isolado compreendem a sequência de nucleotídeo como apresentado na SEQ ID NO: 19 (por exemplo, compreendem a sequência de nucleotídeo coaX de B. subtilis). Em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico ou gene coaX isolados compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 9 (por exemplo, codificam a sequência de aminoácido CoaX de B. subtilis). Já em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico ou gene coaX isolado codificam um homólogo da proteína CoaX tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 9. Como aqui usado, o termo “homólogo” inclui uma proteína ou polipeptídeo que compartilha pelo menos cerca de 30 a 35%, preferivelmente pelo menos cerca de 35 a 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40 a 50%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de identidade com a sequência de aminoácido de uma das proteínas ou polipeptídeo do tipo selvagem aqui descritos e tendo uma atividade biologia ou funcional substancialmente equivalente como a dita da proteína ou polipeptídeo do tipo selvagem. Por exemplo, um homólogo de CoaX compartilha pelo menos cerca de 30 a 35%, preferivelmente pelo menos cerca de 35 a 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40 a 50%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de identidade com a proteína tendo a sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 9 e tem uma atividade funcional ou biológica substancialmente equivalente (isto é, é um equivalente funcional) da proteína tendo a sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 9 (por exemplo, tem uma atividade da pantotenato cinase substancialmente equivalente). Em uma forma de realização preferida, uma molécula de ácido nucleico ou gene coaX isolados compreendem uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 74 ou SEQ ID NO: 75. Em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico coaX isolada hibridiza a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 19 ou hibridiza a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido de qualquer uma das SEQ ID NOs: 7 a 18,74 ou 75. Tais condições de hibridização são conhecidas por aqueles habilitados na técnica e podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), seções 2, 4 e 6. As condições severas adicionais podem ser encontradas em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), capítulos 7, 9 e 11. Um exemplo não limitante de condições severas de hibridização preferido inclui a hibridização em 4X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC), a cerca de 65 a 70° C (ou hibridização em 4X SSC mais 50% de formamida a cerca de 42 a 50°C) seguida por uma ou mais lavagens com IX SSC, a cerca de 65 a 70°C.

Um exemplo não limitante preferido de condições de hibridização altamente severas inclui a hibridização em IX SSC, a cerca de 65 a 70°C (ou hibridização em IX SSC mais 50 % de formamida a cerca de 42 a 50°C) seguida por uma ou mais lavagens com 0,3 X SSC, a cerca de 65 a 70°C. Um exemplo não limitante preferido de reduzir as condições de severidade de hibridização inclui a hibridização em 4X SSC, a cerca de 50 a 60°C (ou altemativamente a hibridização em 6X SSC mais 50% de formamida a cerca de 40 a 45°C) seguida por uma ou mais lavagens com 2X SSC, a cerca de 50 a 60°C. As faixas intermediárias dos valores acima declarados, por exemplo, entre 65 e 70°C ou entre 42 e 50°C também são intencionados a estarem abrangidos pela presente invenção. O SSPE (IX SSPE é NaCl 0,15 M, lOmM de NaH2P04, e 1,25 mM de EDTA, pH 7,4) pode ser substituído no lugar do SSC (IX SSC é NaCl 0,15 M e 15 mM de citrato de sódio) na hibridização e tampões de lavagem; as lavagens são realizadas durante 15 minutos cada uma depois que a hibridização está completa. A temperatura de hibridização para híbridos prognosticados serem menores do que 50 pares de base no comprimento deve ser de 5 a 10°C menor do que a temperatura de fusão (Tm) do híbrido, onde a Tm é determinada de acordo com as seguintes equações.

Para híbridos menores do que 18 pares de base no comprimento, Tm(°C) = 2(# de bases A + T) + 4(# de bases G + C). Para híbridos entre 18 e 49 pares de base no comprimento, Tm(°C) = 81,5 + 16,6(logi0[Na ]) + 0,41(% G + C) - (600/N), onde N é o número de bases no híbrido, e [Na+] é a concentração de íons sódio no tampão de hibridização ([Na+] para IX SSC = 0,165 M).

Também será reconhecido pelo técnico habilitado que reagentes adicionais podem ser adicionados aos tampões de hibridização e/ou lavagem para diminuir a hibridização não específica de moléculas de ácido nucleico para as membranas, por exemplo, membranas de nitrocelulose ou nylon, incluindo mas não limitado a agentes bloqueadores (por exemplo, BSA ou DNA carregador de esperma de salmão ou de arenque), detergentes (por exemplo, SDS), agentes queladores (por exemplo, EDTA), Ficoll, PVP e outros.

Quando do uso de membranas de nylon, em particular, um exemplo não limitante adicional preferido, de condições severas de hibridização é a hibridização em 0,25 a 0,5 M de NaH2P04, 7% de SDS a cerca de 65°C, seguida por um ou mais lavagens a 0,02 M de NaH2P04,1% de SDS a 65°C, ver por exemplo, Church e Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1991 a 1995, (ou, altemativamente, 0,2X de SSC, 1 % de SDS). Em uma outra forma de realização preferida, uma molécula isolada de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo que seja complementar a uma sequência de nucleotídeo coaX como aqui apresentado (por exemplo, é o complemento completo da sequência de nucleotídeo apresentada como a SEQ ID NO: 19).

Em uma outra forma de realização preferida, uma molécula isolada de ácido nucleico é ou inclui um gene coaA, por exemplo, um gene coaA de Bacillus (por exemplo, B. subtilis) ou parte ou fragmento deste.

Moléculas de ácido nucleico e/ou genes coaA exemplares, isolados incluem (1) uma molécula de ácido nucleico ou gene coaA isolados compreendendo a sequência de nucleotídeo como apresentada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 20 a 22; (2) uma molécula de ácido nucleico ou gene coaA isolados compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 3; (3) uma molécula de ácido nucleico ou gene coaA isolados compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um homólogo de CoaA (por exemplo, um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de pelo menos cerca de 30 a 35%, preferivelmente pelo menos cerca de 35 a 40%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40 a 50%, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90% ou mais idêntica à sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 3 e tendo uma atividade enzimática substancialmente equivalente; (4) uma molécula de ácido nucleico ou gene coaA isolados compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo como apresentado em qualquer uma das SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6; (5) uma molécula isolada de ácido nucleico que hibridiza sob condições severas a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22 ou hibridiza a toda ou a uma parte de uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3; e (6) uma molécula isolada de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que seja complementar a uma sequência de nucleotídeo coaA como aqui apresentada (por exemplo, é o complemento completo da sequência de nucleotídeo apresentada na SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 ou SEQ ID NO: 22).

Uma molécula de ácido nucleico da presente invenção (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico ou gene coaX ou uma molécula de ácido nucleico ou gene coaA), podem ser isoladas usando-se técnicas de biologia molecular padrão e a informação de sequência aqui fornecida. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico podem ser isoladas usando-se técnicas de hibridização e clonagem padrão (por exemplo, como descritas em Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) ou podem ser isoladas pela reação de cadeia de polimerase usando-se iniciadores de oligonucleotídeo sintético planejados com base nas sequências de nucleotídeo coaX ou coaA aqui apresentada ou que flanqueiam as suas sequências. Um ácido nucleico da invenção (por exemplo, uma molécula de ácido nucleico ou gene coaX ou uma molécula de ácido nucleico ou gene coaA), pode ser amplificado usando- se cDNA, mRNA ou altemativamente, DNA cromossômico, como um padrão e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados de acordo com as técnicas padrão de amplificação por PCR. Já uma outra forma de realização da presente invenção retrata moléculas de ácido nucleico ou genes coaX e coaA mutantes. A frase “molécula de ácido nucleico mutante” ou “gene mutante” como aqui usado, inclui uma molécula de ácido nucleico ou gene tendo uma sequência de nucleotídeo que inclui pelo menos uma alteração (por exemplo, substituição, inserção, supressão) tal que o polipeptídeo ou a proteína que pode ser codificada pelo dito mutante exiba uma atividade que difere do polipeptídeo ou proteína codificada pela molécula de ácido nucleico ou gene do tipo selvagem. Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico mutante ou gene mutante (por exemplo, um gene coaA ou coaX mutante) codifica um polipeptídeo ou proteína tendo uma atividade reduzida (por exemplo, tendo uma atividade da pantotenato cinase reduzida) quando comparado ao polipeptídeo ou proteína codificados pela molécula de ácido nucleico ou gene do tipo selvagem, por exemplo, quando ensaiados sob condições similar (por exemplo, ensaiados em micro-organismos cultivados na mesma temperatura).

Um gene mutante também pode não codificar nenhum polipeptídeo ou têm um nível de produção reduzido do polipeptídeo do tipo selvagem.

Como aqui usado, uma “atividade reduzida” ou “atividade enzimática reduzida” é uma que seja pelo menos 5 % menor do que aquela do polipeptídeo ou proteína codificada pela molécula de ácido nucleico ou gene do tipo selvagem, preferivelmente pelo menos 5 a 10% menor, mais preferivelmente pelo menos 10 a 25% menor e ainda mais preferivelmente pelo menos 25 a 50%, 50 a 75% ou 75 a 100% menor do que aquela do polipeptídeo ou proteína codificada pela molécula de ácido nucleico ou gene do tipo selvagem. As faixas intermediárias aos valores declarados acima, por exemplo, 75 a 85%, 85 a 90%, 90 a 95%, são também intencionados a serem abrangidos pela presente invenção. Como aqui usado, uma “atividade reduzida” ou “atividade enzimática reduzida” também inclui uma atividade que foi suprimida ou “knocked out” (por exemplo, aproximadamente 100% menos atividade do que aquela do polipeptídeo ou proteína codificados pela molécula de ácido nucleico ou gene do tipo selvagem). A atividade pode ser determinada de acordo com qualquer ensaio bem aceito para medir a atividade de uma proteína particular de interesse. A atividade pode ser medida ou ensaiada diretamente, por exemplo, medindo-se uma atividade de uma proteína isolada ou purificada de uma célula. Altemativamente, uma atividade pode ser medida ou ensaiada dentro de uma célula ou em um meio extracelular. Por exemplo, ensaiar quanto um gene coaA mutante ou um gene coaX mutante (isto é, o dito mutante codificando uma atividade reduzida da pantotenato cinase) pode ser realizado expressando-se o gene mutado em um micro-organismo, por exemplo, um micro-organismo mutante que expresse a pantotenato cinase em uma maneira sensível à temperatura, ensaiando-se o gene mutante quanto a capacidade para complementar um mutante sensível à temperatura (Ts) quanto a atividade da pantotenato cinase. Um gene mutante coaX ou gene mutante coaA que codifica uma “atividade reduzida da pantotenato cinase” é um que complementa o mutante Ts menos eficazmente do que, por exemplo, um gene coaX ou gene coaA correspondentes do tipo selvagem.

Será avaliado pelo técnico habilitado que até uma substituição única em uma sequência de ácido nucleico ou gene (por exemplo, uma substituição de base que codifica uma mudança de aminoácido na sequência de aminoácido correspondente) pode afetar dramaticamente a atividade de um polipeptídeo ou proteína codificados quando comparado ao polipeptídeo ou proteína correspondentes do tipo selvagem. Um ácido nucleico mutante ou gene mutante (por exemplo, que codificam um polipeptídeo ou proteína mutantes), como aqui definido, são facilmente distinguíveis de um ácido nucleico ou gene que codificam uma proteína homóloga, como descrito acima, in que um ácido nucleico mutante ou gene mutante codificam uma proteína ou polipeptídeo tendo uma atividade alterada, opcionalmente observável como um fenótipo diferente ou distinto em um micro-organismo que expressa os ditos gene ou ácido nucleico mutantes ou que produz a dita proteína ou polipeptídeo mutantes (isto é, um micro-organismo mutante) quando comparado a um micro-organismo correspondente que expresse o gene ou ácido nucleico do tipo selvagem ou que produza a dita proteína ou polipeptídeo mutantes. Ao contrário, um homólogo de proteína tem uma atividade idêntica ou substancialmente similar, opcionalmente fenotipicamente indiscemível quando produzida em um micro-organismo, quando comparado a um micro-organismo correspondente que expresse o gene ou ácido nucleico do tipo selvagem. Consequentemente não é, por exemplo, o grau de identidade de sequência entre moléculas de ácido nucleico, genes, proteína ou polipeptídeos que serve para distinguir entre homólogos e mutantes, ao invés é a atividade da proteína ou polipeptídeo codificados que distingue entre homólogos e mutantes: os homólogos tendo, por exemplo, identidade de sequência baixa (por exemplo, 30 a 50% de identidade de sequência) apesar disso tendo atividades funcionais substancialmente equivalentes, e mutantes, por exemplo compartilhando 99% de identidade de sequência tendo apesar disso atividades funcionais dramaticamente diferentes ou alteradas. Os homólogos exemplares estão apresentados na Figura 20 (isto é, homólogos Coa A) e na Figura 23 (isto é, homólogos CoaX). Os mutantes exemplares estão descritos nos Exemplos XV e XVIII neste. VIII. Moléculas e Vetores de Ácido Nucleico Recombinante A presente invenção ainda retrata moléculas de ácido nucleico recombinantes (por exemplo, moléculas de DNA recombinantes) que incluem as moléculas de ácido nucleico e/ou os genes aqui descritos (por exemplo, as moléculas de ácido nucleico e/ou genes isolados), preferivelmente genes de Bacillus, mais preferivelmente genes de Bacillus subtilis, ainda mais preferivelmente genes da pantotenato cinase de Bacillus subtilis (por exemplo, gene coaXs ou gene coaAs), genes biossintéticos de pantotenato (por exemplo, genes que codificam enzimas biossintéticas de pantotenato, por exemplo, genes panB que codificam a cetopantoato hidróxi-metil-transferase, genes panE que codificam a cetopantoato reductase, genes panC que codificam a pantotenato sintetase, e/ou genes panD que codificam a aspartato-a-descarboxilase) e/ou genes biossintéticos da isoleucina-valina (ilv) (por exemplo, genes ilvBN ou alsS que codificam a aceto-hidróxi-ácido sintetase, genes ilvC que codificam a aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase e/ou genes ilvD que codificam a di-hidróxi-ácido desidratase). A presente invenção ainda retrata vetores (por exemplo, vetores recombinantes) que incluem moléculas de ácido nucleico (por exemplo, moléculas de ácido nucleico e/ou genes isolados ou recombinantes) aqui descritos. Em particular, os vetores recombinantes são retratados que incluem sequências de ácido nucleico que codificam produtos de gene bacterianos como aqui descrito, preferivelmente produtos de gene de Bacillus, mais preferivelmente produtos de gene de Bacillus subtilis, ainda mais preferivelmente produtos de gene biossintéticos de pantotenato de Bacillus subtilis (por exemplo, enzimas biossintéticas do pantotenato, por exemplo, cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase, e/ou aspartato-a-descarboxilase) e/ou produtos de gene biossintéticos de isoleucina-valina (por exemplo, aceto-hidróxi-ácido sintetase, aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase e/ou di-hidróxi-ácido desidratase). O termo “molécula de ácido nucleico recombinante” inclui uma molécula de ácido nucleico (por exemplo, uma molécula de DNA) que foi alterada, modificada ou engendrada tal que difere em sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico nativa ou natural da qual a molécula de ácido nucleico recombinante foi derivada (por exemplo, pela adição, supressão ou substituição de um ou mais nucleotídeos).

Preferivelmente, uma molécula de ácido nucleico recombinante (por exemplo, uma molécula de DNA recombinante) inclui uma molécula isolada de ácido nucleico ou gene da presente invenção (por exemplo, um gene coaX, coaA, pan ou ilv isolados) operacionalmente ligados a sequências reguladoras. O termo “vetor recombinante” inclui um vetor (por exemplo, plasmídeo, fago, fasmídeo, vírus, cosmídeo ou outros vetores de ácido nucleico purificados) que foram alterados, modificados ou engendrados tal que contivessem sequências de ácido nucleico maiores, menos ou diferentes do que aquelas incluídas na molécula de ácido nucleico nativa ou natural do qual o vetor recombinante foi derivada. Preferivelmente, o vetor recombinante inclui um gene coaX, coaA, pan ou ilv ou molécula de ácido nucleico recombinante incluindo tal gene coaX, coaA, pan ou ilv, operacionalmente ligada a sequências reguladoras, por exemplo, sequências promotoras, sequências terminadoras e/ou sítio de ligação de ribossomas artificial (RBSs), como aqui definido. A frase “operacionalmente ligada a sequência(s) reguladora(s)” significa que a sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico ou o gene de interesse estão ligados à(s) sequência(s) reguladora(s) de uma maneira que permita a expressão (por exemplo, expressão realçada, aumentada, constitutiva, basal, atenuada, diminuída ou reprimida) da sequência de nucleotídeo, preferivelmente a expressão de um produto de gene codificado pela sequência de nucleotídeo (por exemplo, quando a molécula de ácido nucleico recombinante está incluída em um vetor recombinante, como aqui definido, e é introduzido em um micro-organismo). O termo “sequência reguladora” inclui sequências de ácido nucleico que afetam (por exemplo, modulam ou regulam) a expressão de outras sequências de ácido nucleico. Em uma forma de realização, uma sequência reguladora está incluída em uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante em uma posição e/ou orientação similar ou idêntica em relação a um gene particular de interesse como é observado para a sequência reguladora e para o gene de interesse como aparecem na natureza, por exemplo, em uma posição e/ou orientação nativa. Por exemplo, um gene de interesse pode ser incluído em uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante operacionalmente ligado a uma sequência reguladora que acompanha ou é adjacente ao gene de interesse no organismo natural (por exemplo, operacionalmente ligado às sequências reguladoras “nativas”, por exemplo, ao promotor “nativo”). Altemativamente, um gene de interesse pode ser incluído em uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante operacionalmente ligados a uma sequência reguladora que acompanha ou é adjacente a um outro gene (por exemplo, um diferente) no organismo natural. Altemativamente, um gene de interesse pode ser incluído em uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante operacionalmente ligados a uma sequência reguladora de outro organismo. Por exemplo, sequências reguladoras de outros micróbios (por exemplo outras sequências reguladoras bacterianas, sequências reguladoras de bacteriofago e outras) podem ser operacionalmente ligadas a um gene particular de interesse.

Em uma forma de realização, uma sequência reguladora é uma não nativa ou que não ocorra naturalmente na sequência (por exemplo, uma sequência que foi modificada, mutada, substituída, derivatizada, suprimida incluindo sequências que são quimicamente sintetizadas). As sequências reguladoras preferidas incluem promotores, realçadores, sinais de terminação, sinais de anti-terminação e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sequências às quais repressores ou indutores ligam-se e/ou sítios de ligação para proteínas reguladoras transcricionais e/ou traducionais, por exemplo, no mRNA transcrito). Tais sequências reguladoras são descritas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. As sequências reguladoras incluem aquelas que direcionam a expressão constitutiva de uma sequência de nucleotídeo em um micro-organismo (por exemplo, promotores constitutivos e promotores constitutivos fortes), aquelas que direcionam a expressão indutível de uma sequência de nucleotídeo em um micro-organismo (por exemplo, promotores indutíveis, por exemplo, promotores indutíveis de xilose) e aquelas que atenuam ou reprimem a expressão de uma sequência de nucleotídeo em um micro-organismo (por exemplo, sinais de atenuação ou sequências repressoras). Também está dentro do escopo da presente invenção regular a expressão de um gene de interesse removendo-se ou suprimindo-se sequências reguladoras. Por exemplo, as sequências envolvidas na regulagem negativa da transcrição podem ser removidas tal que a expressão de um gene de interesse seja realçada.

Em uma forma de realização, uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante da presente invenção inclui uma sequência de ácido nucleico ou gene que codifica pelo menos um produto de gene bacteriano (por exemplo, uma enzima biossintética de pantotenato, uma enzima biossintética de isoleucina-valina ou uma enzima biossintética de CoaA, por exemplo CoaA ou CoaX) operacionalmente ligadas a um promotor ou sequência promotora. Os promotores preferidos da presente invenção incluem promotores de Bacillus e/ou promotores de bacteriofago (por exemplo, bacteriofago que infeta a Bacillus). Em uma forma de realização, um promotor é um promotor de Bacillus, preferivelmente um promotor de Bacillus forte (por exemplo, um promotor associado com um gene de administração interna bioquímica no Bacillus ou um promotor associado com um gene do caminho glicolítico no Bacillus). Em uma outra forma de realização, um promotor é um promotor de bacteriofago. Em uma forma de realização preferida, o promotor é do bacteriofago SPOT Em uma forma de realização particularmente preferida, um promotor é selecionado do grupo que consiste em Pi5, P26 ou Pveg, por exemplo, os promotores apresentados nas SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 ou SEQ ID NO: 41. Os promotores adicionais preferidos incluem tef (o promotor do fator de alongamento traducional (TEF)) e pyc (o promotor da piruvato carboxilase (PIC)), que promovem altos níveis de expressão em Bacillus (por exemplo, na Bacillus subtilis). Os promotores adicionais preferidos, por exemplo, para o uso em micro-organismos Gram positivos incluem, mas não são limitados ao promotor amyE ou aos promotores de fago SP02. Os promotores adicionais preferidos, por exemplo, para o uso em micro-organismos Gram negativos incluem, mas não são limitados ao tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, l-PR ou Â-PL.

Em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante da presente invenção inclui uma sequência terminadora ou sequências terminadoras (por exemplo, sequências terminadoras de transcrição). O termo “sequências terminadoras” inclui sequências reguladoras que servem para terminar a transcrição de um gene. As sequências terminadoras (ou terminadoras de transcrição em tandem) podem servir ainda para estabilizar o mRNA (por exemplo, pela adição de estrutura ao mRNA), por exemplo, contra nucleases. Já em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante da presente invenção inclui sequências que permitem a detecção do vetor contendo as ditas sequências (isto é, marcadores detectáveis e/ou selecionáveis), por exemplo, sequências que superam mutações auxotróficas, por exemplo, ura3 ou ilvE, marcadores fluorescentes, e/ou marcadores colorimétricos (por exemplo, lacZ/β- galactosidase), e/ou genes de resistência a antibióticos (por exemplo, amp ou tet). Já em uma outra forma de realização, uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor recombinante da presente invenção inclui um sítio de ligação de ribossoma (RBS) artificial. O termo “sítio de ligação de ribossoma (RBS) artificial” inclui um local dentro de uma molécula de mRNA (por exemplo, codificada dentro do DNA) à qual um ribossoma se liga (por exemplo, para iniciar a tradução) que difere de um RBS nativo (por exemplo, um RBS encontrado em um gene que ocorre naturalmente) em pelo menos um nucleotídeo. Os RBSs artificiais preferidos incluem cerca de 5 a 6, 7 a 8,9 a 10,11 a 12,13 a 14,15 a 16,17 a 18,19 a 20,21 a22,23 a 24,25 a 26,27 a 28,29 a 30 ou mais nucleotídeos dos quais cerca de 1 a 2, 3 a 4,5 a 6, 7 a 8, 9 a 10, 11 a 12, 13 a 15 ou mais diferem do RBS nativo (por exemplo, o RBS nativo de um gene de interesse). Preferivelmente, os nucleotídeos que diferem são substituídos tal que sejam idênticos a um ou mais nucleotídeos de um RBS ideal (por exemplo, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48), quando otimamente alinhados para comparação. Os RBSs artificiais podem ser usados para substituir o RBS que ocorre naturalmente ou nativo associado com um gene particular. Os RBSs artificiais preferivelmente aumentam a tradução de um gene particular. Os RBSs artificiais preferidos (por exemplo, RBSs para aumentar a tradução de panB, por exemplo, de panB de B. subtilís) estão representados na Tabela IA (por exemplo, SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50).

Os RBSs artificiais adicionais preferidos (por exemplo, os RBSs para aumentar a tradução de panD, por exemplo, de panD de B. subtilis) estão representados na Tabela 1B (por exemplo, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 e SEQ ID NO: 54). 10 20 CTAGAAAAGGAGGAATTTAAATG RBS pAN423 (SEQ ID NO: 88) TTAAGAAAGGAGGTGANNNNATG RBS ideal (SEQ ID NO: 45) TTAGAAAGGAGGA77TAAATATG novo projeto A (SEQ ID NO: 51) TTAG AAAGGAGGT 7TAATT A AT G novo projeto B (SEQ ID NO: 52) TTAGAAAGGAGGTGATTTAAATG novo projeto Cl (SEQ ID NO: 53) TTAGAAAGGAGGTGTTTAAAATG novo projeto C2 (SEQ ID NO: 54) TTAGAAAGGAGGTGANNNNNATG RBS ideal (SEQ ID NO: 46) Os RBSs artificiais adicionais preferidos (por exemplo, RBSs para aumentar a tradução de panD, por exemplo, de panD de B. subtilis) estão representados na Tabela 1C (por exemplo, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57). A sequência de aminoácido prognosticada no término C da proteína PanC é mostrada. O códon de início para a tradução de PanD está sublinhada.

Consequentemente, em uma forma de realização, um vetor da presente invenção inclui um RBS artificial como apresentado na SEQ ID NO: 49 ou na SEQ ID NO: 50. Em uma outra forma de realização, um vetor da presente invenção inclui um RBS artificial como apresentado na SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 ou SEQ ID NO: 54. Já em uma outra forma de realização, um vetor da presente invenção inclui um RBS artificial como apresentado na SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 ou SEQ DD NO: 57.

Em uma outra forma de realização, um vetor recombinante da presente invenção inclui sequências que realçam a replicação nas bactérias (por exemplo, sequências realçadoras de replicação). Em uma forma de realização, as sequências realçadoras de replicação são derivadas da E. coli.

Em uma outra forma de realização, as sequências realçadoras de replicação são derivadas de pBR322 (por exemplo, sequências incluídas dentro da parte derivada pBR322 de qualquer dos vetores pan como apresentado nas Figuras, isto é, as sequências Not I-Not I de cerca de 5,0 kB a 9,0 kB do vetor representado na Figura 3A). Já em uma outra forma de realização, um vetor recombinante da presente invenção inclui genes de resistência a antibióticos. O termo “genes de resistência a antibióticos” inclui sequências que promovem ou conferem resistência a antibióticos no organismo hospedeiro (por exemplo, Bacillus). Em uma forma de realização, os genes de resistência a antibióticos são selecionados do grupo que consiste em genes cat (resistência ao cloranfenicol), genes tet (resistência à tetraciclina), genes erm (resistência à eritromicina), genes neo (resistência à neomicina) e genes spec (resistência à espectinomicina). Os vetores recombinantes da presente invenção pode ainda incluir sequências de recombinação homólogas (por exemplo, sequências planejada para permitir a recombinação do gene de interesse no cromossoma do organismo hospedeiro). Por exemplo, as sequências amiE podem ser usadas como alvos de homologia para a recombinação no cromossoma hospedeiro.

Os vetores preferidos da presente invenção incluem, mas não são limitado aos vetores apresentados nas Figuras 2 a 15,17,19,22,25 e 26.

Será ainda avaliado por uma pessoa de habilidade na técnica que o planejamento de um vetor pode ser feito dependendo de fatores tais como a escolha do micro-organismo a ser geneticamente engendrado, o nível de expressão de produto de gene desejado e outros. IX. Proteínas Isoladas Um outro aspecto da presente invenção retrata proteínas isoladas (por exemplo, enzimas biossintéticas isoladas do pantotenato e/ou enzimas biossintéticas de valina-isoleucina e/ou enzimas biossintéticas de CoA isoladas, por exemplo CoaA ou CoaX isolados). Em uma forma de realização, as proteínas (por exemplo, enzimas biossintéticas do pantotenato isoladas e/ou enzimas biossintéticas de valina-isoleucina e/ou enzimas biossintéticas de CoaA isoladas, por exemplo CoaA ou CoaX isolados) sejam produzidas pelas técnicas de DNA recombinantes e podem ser isoladas a partir de micro-organismos da presente invenção por um esquema de purificação apropriado usando-se técnicas de purificação de proteína padrão.

Em uma outra forma de realização, as proteínas são quimicamente sintetizadas usando-se técnicas de síntese de peptídeo padrão.

Uma proteína “isolada” ou “purificada” (por exemplo, uma enzima biossintética isolada ou purificada) é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes do micro-organismo do qual a proteína é derivada ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizadas. Em uma forma de realização, uma proteína isolada ou purificada tem menos do que cerca de 30% (em peso seco) de proteína contaminante ou produtos químicos, mais preferivelmente menos do que cerca de 20% de proteína contaminante ou produtos químicos, ainda mais preferivelmente menos do que cerca de 10% de proteína contaminante ou produtos químicos, e o mais preferivelmente menos do que cerca de 5% de proteína contaminante ou produtos químicos.

Em uma forma de realização preferida, a proteína ou o produto de gene são derivados de Bacillus (por exemplo, são derivados de Bacillus). O termo “derivado de Bacillus” ou “derivado de Bacillus” inclui uma proteína ou produto de gene que são codificados por um gene de Bacillus.

Preferivelmente, o produto de gene é derivado de um micro-organismo selecionado do grupo que consiste em Bacillus subíilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, e outras espécies de Bacillus do Grupo 1, por exemplo, como caracterizadas pelo tipo 16S rRNA (Priest, acima). Em uma outra forma de realização preferida, a proteína ou produto de gene é derivada de Bacillus brevis ou Bacillus stearothermophilus. Em uma outra forma de realização preferida, a proteína ou produto de gene são derivados de um micro- organismo selecionado do grupo que consiste em Bacillus lichenifomis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halodurans, Bacillus subtilis e Bacillus pumilus. Em uma forma de realização particularmente preferida, a proteína ou produto de gene são derivados de Bacillus subtilis (por exemplo, são derivados de Bacillus subtilis). O termo “derivado de Bacillus subtilis” ou “derivado de Bacillus subtilis” inclui uma proteína ou produto de gene que são codificados pelo gene de Bacillus subtilis. Já em uma outra forma de realização preferida, a proteína ou produto de gene são codificados pelo gene de Bacillus homólogo (por exemplo, um gene derivado de uma espécie distinta da Bacillus mas tendo homologia significante a um gene Bacillus da presente invenção, por exemplo, um gene pan de Bacillus ou gene ilv de Bacillus).

Incluídos dentro do escopo da presente invenção estão proteínas ou produtos de gene derivados de bactérias e/ou proteínas ou produtos de gene derivados de Bacillus (por exemplo, produtos de gene derivados de B. subtilis) que são codificados pelos genes bacterianos e/ou genes de Bacillus (por exemplo, genes de B. subtilis) que ocorrem naturalmente, por exemplo, os genes identificados pelos presentes inventores, por exemplo, genes coaX, genes coaA, genes pan e/ou genes ilv de Bacillus ou B. subtilis. Ainda incluídos dentro do escopo da presente invenção estão as proteínas derivadas de bactérias ou produtos de gene e/ou proteínas ou produtos de gene derivados de Bacillus (por exemplo, produtos de gene derivados de B. subtilis) que são genes bacterianos e/ou de Bacillus codificados (por exemplo, genes de B. subtilis) que diferem dos genes bacterianos e/ou de Bacillus que ocorrem naturalmente (por exemplo, genes de B. subtilis), por exemplo, genes que têm ácidos nucleicos que são mutados, inseridos ou suprimidos, mas que codificam proteínas substancialmente similares aos produtos de gene que ocorre naturalmente da presente invenção. Por exemplo, é bem entendido que uma pessoa de habilidade na técnica pode mutar (por exemplo, substituir) ácidos nucleicos que, devido à degenerescência do código genético, codificam um aminoácido idêntico como aquele codificado pelo gene que ocorre naturalmente. Além disso, é bem entendido que uma pessoa de habilidade na técnica pode mutar (por exemplo, substituir) ácidos nucleicos que codificam substituições de aminoácido conservativas. E ainda bem entendido que uma pessoa de habilidade na técnica pode substituir, adicionar ou suprimir aminoácidos até um certo grau sem afetar substancialmente a função de um produto de gene quando comparado com um produto de gene que ocorre naturalmente, cada instância do qual é intencionado a estar incluída dentro do escopo da presente invenção.

Em uma forma de realização preferida, uma proteína isolada da presente invenção (por exemplo, uma enzima biossintética isolada de pantotenato e/ou uma enzima biossintética isolada de isoleucina-valina d ou uma enzima biossintética isolada de CoaA, por exemplo CoaA ou CoaX

isolados) tem uma sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ LD NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 87. Em outras formas de realização, uma proteína isolada da presente invenção é um homólogo de pelo menos uma das proteínas apresentadas como SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 87 (por exemplo, compreende uma sequência de aminoácido pelo menos cerca de 30 a 40% idêntica, preferivelmente cerca de 40 a 50% idêntica, mais preferivelmente cerca de 50 a 60 % idêntica, e ainda mais preferivelmente cerca de 60 a 70 %, 70 a 80%, 80 a 90%, 90 a 95% ou mais idêntica à sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 87, e tem uma atividade que é substancialmente similar àquela da proteína codificada pela sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38 ou SEQ ID NO: 87, respectivamente.

Para determinar a porcentagem de homologia de duas sequências de aminoácido ou de dois ácidos nucleicos, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótimos (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos na sequência de um primeiro aminoácido ou sequência de ácido nucleico para o alinhamento ótimo com um segundo sequência de aminoácido ou ácido nucleico). Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nesta posição. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idêntica compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade % = # de posições idênticas/# total de posições x 100), preferivelmente levando-se em conta o número de intervalos e o tamanho dos ditos intervalos necessários para produzir um alinhamento ótimo. A comparação das sequências e a determinação da homologia percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando-se um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2264 a 2268, modificado como em Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl, Acad. Sei. USA 90: 5873 a 5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 a 410.

As procuras de nucleotídeo por BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12, para se obter sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nuclei co da invenção. As procuras de proteína por BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para se obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da invenção. Para se obter alinhamentos com intervalos com propósitos de comparação, BLAST com Intervalos pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Research 25 (17): 3389 a 3402. Quando da utilização de programas BLAST e BLAST com Intervalos, os parâmetros de penalidade dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Um outro exemplo não limitante preferido de um algoritmo matemático utilizado para a comparação das sequências é o algoritmo de Myers e Miller (1988) Comput Appl Biosci. 4: 11 a 17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN

disponível, por exemplo, no servidor da rede GENESTREAM, IGH

Montpellier, FRANCE (http://vega.igh.cnrs.fr) ou no servidor ISREC (http://www.ch.embnet.org). Quando da utilização do programa ALIGN para comparação de sequências de aminoácido, uma Tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12, e uma Penalidade de Intervalo de 4 podem ser usados.

Em uma outra forma de realização preferida, a'homologia percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando-se o programa GAP no pacote de software (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 2, 3 ou 4. Já em uma outra forma de realização preferida, a homologia percentual entre duas sequências de ácido nucleico pode ser realizada usando-se o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando um peso de intervalo de 50 e um peso de comprimento de 3. X. Biotransformacões e Bioconversões Um outro aspecto da presente invenção inclui processos de biotransformação que retratam micro-organismos recombinantes (por exemplo, micro-organismo mutantes) e/ou enzimas biossintéticas isoladas de CoA, pantotenato ou isoleucina-valina aqui descritas. O termo “processo de biotransformação”, também aludido aqui como “processos de bioconversão”, inclui processos biológicos que resultam na produção (por exemplo, transformação ou conversão) de qualquer composto (por exemplo, intermediário ou produto) que esteja à montante de uma enzima biossintética de CoA, pantotenato ou de isoleucina-valina em relação a um composto (por exemplo, substrato, intermediário ou produto) que esteja à jusante da dita enzima biossintética de CoA, pantotenato ou de isoleucina-valina.

Em uma forma de realização, a invenção retrata um processo de biotransformação para a produção de um panto-composto compreendendo contactar um micro-organismo que superexpressa pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato com pelo menos um substrato ou precursor apropriados sob condições tais que o dito panto-composto seja produzido e a recuperação do dito panto-composto. Em uma forma de realização preferida, a invenção retrata um processo de biotransformação para a produção de pantoato compreendendo contactar um micro-organismo que superexpressa a cetopantoato reductase (o produto de gene panE) com um substrato apropriado (por exemplo, cetopantoato) sob condições tais que o pantoato seja produzido e a recuperação do dito pantoato. Em uma outra forma de realização preferida, a invenção retrata um processo de biotransformação para a produção de pantotenato compreendendo contactar um micro-organismo que superexpressa a cetopantoato reductase e a pantotenato sintetase com substratos apropriados (por exemplo, cetopantoato e β-alanina) sob condições tais que o pantotenato seja produzido e a recuperação do dito pantotenato. Já em uma outra forma de realização preferida, a invenção retrata um processo de biotransformação para a produção de pantotenato compreendendo contactar um micro-organismo que superexpressa a cetopantoato hidróxi- metil-transferase, a cetopantoato reductase e a pantotenato sintetase com substratos apropriados (por exemplo, α-ceto-isovalerato e β-alanina) sob condições tais que o pantotenato seja produzido e a recuperação do dito pantotenato. Os micro-organismos recombinantes preferidos para realizar as biotransformações acima descritas incluem os mutantes da pantotenato cinase. As condições sob as quais o pantoato ou pantotenato sejam produzidos podem incluir quaisquer condições que resultem na produção desejada de pantoato ou pantotenato, respectivamente. Já em uma outra forma de realização, a presente invenção inclui um método de produzir β-alanina que inclui cultivar um micro- organismo que superexpressa a aspartato-a-descarboxilase sob condições tais que a β-alanina seja produzida. Preferivelmente, o micro-organismo que superexpressa a aspartato-a-descarboxilase tem uma mutação em uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima biossintética de pantotenato selecionada do grupo que consiste em cetopantoato hidróxi- metil-transferase, cetopantoato reductase e pantotenato sintetase. A invenção ainda retrata um método de produzir β-alanina que inclui contactar uma composição compreendendo aspartato com uma enzima da aspartato-a-descarboxilase de Bacillus isolada sob condições tais que a β- alanina seja produzida (por exemplo, um método de síntese in vitro). O(s) micro-organismo(s) e/ou as enzimas usadas nas reações de biotransformação estão em uma forma que as permitam realizar a sua função intencionada (por exemplo, produzindo um composto desejado). Os micro-organismos podem ser células inteiras ou podem ser apenas aquelas partes das células necessárias para se obter o resultado final desejado. Os micro-organismos podem ser colocados em suspensão (por exemplo, em uma solução apropriada tal como soluções ou meios tamponizados), enxaguados (por exemplo, enxaguados até livres do meio de cultivo do micro-organismo), secados em acetona, imobilizados (por exemplo, com gel de poliacrilamida ou carragenina K ou em suportes sintéticos, por exemplo, pérolas, matrizes e outros), fixados, reticulados ou permeabilizados (por exemplo, possuem membranas e/ou paredes permeabilizadas tais que os compostos, por exemplo, os substratos, intermediários ou produtos possam passar mais facilmente através da dita membrana ou parede). A(s) enzima(s) biossintética(s) de CoA purificada(s) ou não purificada(s) (por exemplo, CoaA e/ou CoaX), a(s) enzima(s) biossintética(s) de pantotenato e/ou a(s) enzima(s) biossintética(s) de valina-isoleucina também podem ser usadas nas reações de biotransformação. A enzima podem estar em uma forma que a permita realizar a sua função intencionada (por exemplo, a obtenção do composto desejado). Por exemplo, a enzima pode estar na forma livre ou imobilizada. A(s) enzima(s) biossintética(s) de CoA, a(s) enzima(s) biossintética(s) de pantotenato e/ou enzima(s) biossintética(s) de valina-isoleucina purificadas ou não purificadas podem ser contatadas em uma ou mais reações in vitro com o(s) substrato(s) apropriado(s) tal que o produto desejado seja produzido.

Com respeito a pelo menos as metodologias acima descritas (por exemplo, as metodologias de produção da presente invenção), pelo menos um aspecto da invenção retrata o seguinte: formas de realização nas quais os métodos não usam micro-organismos do gênero Corynebacterium e/ou micro-organismos do gênero Escherichia; formas de realização nas quais os métodos não usam micro-organismos selecionados do grupo que consistem de Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum; formas de realização nas quais os métodos não usam micro-organismos gram negativos; formas de realização nas quais os micro-organismos utilizados não incluem, expressam ou produzem moléculas de ácido nucleico, genes ou proteínas (por exemplo, enzimas biossintéticas) derivadas de micro-organismos do gênero Corynebacterium e/ou micro-organismos do gênero Escherichia; formas de realização nas quais os micro-organismos não incluem, expressam ou produzem moléculas de ácido nucleico, genes ou proteínas (por exemplo, enzimas biossintéticas) derivadas de micro-organismos selecionados do grupo que consiste em Escherichia coli e Corynebacterium glutamicum. XL Ensaios de Avaliação Porque o CoA é um fator essencial nas bactérias, proteínas (por exemplo, enzimas) envolvidas na biossíntese de CoA fornece ferramentas valiosas na procura por novos antibióticos. Em particular, a proteína CoaX é um alvo valioso para identificar compostos bactericidas porque não carrega nenhuma semelhança na sequência primária às enzimas de pantotenato cinase de mamífero. Consequentemente, a presente invenção também fornece um método (também aludido aqui como um “ensaio de avaliação”) para identificar moduladores, isto é, candidatos ou compostos ou agentes de teste (por exemplo, peptídeos, peptidomiméticos, moléculas pequenas ou outros medicamentos) que se ligam ao CoaX ou têm um efeito estimulador ou inibidor, por exemplo, sobre a expressão de coaX ou atividade de CoaX.

Em uma forma de realização, a invenção fornece ensaios para avaliar candidatos ou compostos de teste que sejam capazes de ligarem-se às proteínas CoaX ou uma parte biologicamente ativa destas. Em uma outra forma de realização, a invenção fornece ensaios para avaliar candidatos ou compostos de teste que modulem a atividade das proteínas CoaX ou partes biologicamente ativas destas. Os compostos de teste da presente invenção podem ser obtidos usando-se qualquer um dos numerosos métodos nos métodos de biblioteca combinatorial conhecidos na técnica, incluindo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase sólida ou de fase de solução paralelas espacialmente endereçáveis; métodos de bibliotecas sintéticas que requerem a desconvolução; o método de biblioteca de ‘uma pérola um composto’; e métodos de bibliotecas sintéticas usando a seleção por cromatografia de afinidade. O método de biblioteca biológica é limitado às bibliotecas peptídicas, enquanto os outros quatro métodos são aplicáveis a peptídeo, oligômero não peptídico ou bibliotecas de molécula pequena de compostos (Lam, K. S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Os exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA 91:11422; Zuckermann etal. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew.

Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed.

Engl. 33: 2061; e em Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233. As bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução (por exemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412 a 421) ou em pérolas (Lam (1991) Nature 354: 82 a 84), lascas (Fodor (1993) Nature 364: 555 e 556), bactérias (Ladner USP 5.223.409), esporos (Ladner USP '409), plasmídeos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sei USA 89: 1865 a 1869) ou em fago (Scott e Smith (1990) Science 249: 386 a 390); (Devlin (1990) Science 249: 404 a 406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 6378 a 6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301 a 310); (Ladner acima.).

Em uma forma de realização, um ensaio é um ensaio com base em micro-organismo em que um micro-organismo recombinante que expresse uma proteína CoaX ou parte desta biologicamente ativa é contactada com um composto de teste e a capacidade do composto de teste para modular a atividade de CoaX é determinada. A determinação da capacidade do composto de teste para modular a atividade de CoaX podem ser realizada monitorando-se, por exemplo, as concentrações intracelulares de fosfopantoato ou CoA ou as concentrações de pantotenato secretado (como compostos que inibem CoaX resultaram em uma formação de pantotenato no micro-organismo de teste). O substrato CoaX pode ser rotulado com um radioisótopo ou rótulo enzimático tal que a modulação da atividade de CoaX possa ser determinada detectando-se uma conversão do substrato rotulado para o intermediário ou produto. Por exemplo, os substratos CoaX podem ser rotulados com 32p? 14ç ou 3η, direta ou indiretamente, e o radioisótopo detectado pela contagem direta de radioemissão ou pela contagem de cintilação. A determinação da capacidade de um composto para modular a atividade de CoaX pode ser altemativamente determinada detectando-se a indução de um gene repórter (compreendendo um elemento regulador responsivo ao CoA operativamente ligado a um ácido nucleico que codifica um marcador detectável, por exemplo, luciferase) ou detectando-se uma resposta celular regulada pelo CoA. Já em uma outra forma de realização, um ensaio de avaliação da presente invenção é uma ensaio isento de célula em que uma proteína de CoaX ou parte desta biologicamente ativa é contactada com um composto de teste in vitro e a capacidade do composto de teste para ligar-se à proteína CoaX ou parte desta biologicamente ativa ou modular a sua atividade é determinada. Em uma forma de realização preferida, o ensaio inclui contactar a proteína CoaX ou parte desta biologicamente ativa com substratos conhecidos para formar uma mistura de ensaio, contactar a mistura de ensaio com um composto de teste e determinar a capacidade do composto de teste para modular a atividade enzimática do CoaX nos seus substratos.

Os ensaios de avaliação podem ser realizados em qualquer vaso adequado para conter os micro-organismos, proteínas, e/ou reagentes.

Os exemplos de tais vasos incluem placas de microtítulo, tubos de teste, e tubos de microcentrífugas. Em mais do que uma forma de realização dos métodos de ensaio acima da presente invenção, pode ser desejável imobilizar a proteína CoaX ou um micro-organismo recombinante que expresse a proteína CoaX para facilitar a separação de produtos e/ou substratos, bem como para acomodar a automação do ensaio. Por exemplo, as proteínas de fusão de glutationa-S-transferase/CoflJ podem ser absorvidas em pérolas de glutationa sefarose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ou placas de microtítulo derivadas de glutationa. Outras técnicas para imobilizar proteínas em matrizes (por exemplo, conjugação de biotina e imobilização de estreptavidina ou conjugação de anticorpo) também podem ser usadas nos ensaios de avaliação da invenção.

Em uma outra forma de realização, moduladores da expressão de CoaX são identificados em um método em que uma célula é contactada com um composto candidato e a expressão de mRNA de coaX ou polipeptídeo de CoaX na célula são determinados. O nível de expressão na presença do composto candidato é comparado ao nível de expressão na ausência do composto candidato (ou a um controle adequado, por exemplo, um tampão de controle ou padrão). O composto candidato pode ser então identificado como um modulador de expressão de mRNA de coaX ou polipeptídeo de CoaX com base nesta comparação.

Esta invenção ainda diz respeito a novos agentes identificados pelos ensaios de avaliação acima descritos. Consequentemente, está dentro do escopo desta invenção usar ainda um agente identificado como aqui descrito em um modelo animal apropriado. Por exemplo, um agente modulador de CoaX identificado como aqui descrito (por exemplo, um composto anti- bactericida) pode ser usado em um modelo animal infeccioso para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos colaterais do tratamento com tal agente.

Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser interpretados como limitantes. Os conteúdos de todas as referências, patentes, pedidos de patente (incluindo o Pedido de Patente US Série N2 09/400.494, depositado em 21 de Setembro de 1999 (pendente), Pedido Provisório de Patente US Série N2 60/210.072, depositado em 7 de junho de 2000, Pedido Provisório de Patente US Série N2 60/221.938, depositado em 28 de julho de 2000 e Pedido Provisório de Patente US Série N- 60/227.860, depositado em 24 de Agosto de 2000, aos quais este pedido diz respeito) e os pedidos de patente publicados citados em todo este pedido são aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS

Metodologia Geral: CEPAS. As cepas de Bacillus subtilis da presente invenção são no geral derivadas de duas cepas. A primeira é variadamente denominada “168”, “1ΑΓ ou “RL-1”. O genótipo é trpC2. Esta cepa foi derivada da cepa “Marburg” do tipo selvagem pela mutagênese e foi a base de muitos dos trabalhos de biologia molecular feitos no B. subtilis. A segunda cepa é a PY79, um derivado prototrófico da 168 que foi feito Trp+pela transdução da cepa W23 do tipo selvagem. MEIOS. O meio mínimo padrão para B. subtilis é compreendido de 1 x sais de Spizizen e 0,5% de glicose. O “meio rico” sólido padrão é o Caldo de Triptona Sangue Ágar (Difco), e o “meio rico” líquido padrão é o VY, uma mistura de caldo de infusão de carne de vitela e extrato de levedura. Para testar a produção de pantotenato em culturas em tubo de teste líquidas, uma forma enriquecida de VY, chamada de “VY Especial” ou “SVY” é usada. Para fermentações em batelada, SVYG e PFMG são usados.

As composições destes meios são dadas abaixo. VY, um meio líquido rico: 25 g de Caldo de Infusão de carne de Vitela Difco, 5 g de Extrato de Levedura Difco, 1 litro de água (autoclave). TBAB, um meio sólido rico: 33 g de Caldo de Triptona Sangue Ágar Difco, 1 litro de água (autoclave). MIN, um meio mínimo: 100 ml de 10 x sais de Spizizen; 10 ml de glicose a 50%; 2 ml de arginina HC1* a 10 %; 10 ml de triptofano** a 0,%; água para 1 litro. (*Em alguns casos, a arginina é omitida ou substituída pelo glutamato de sódio a uma concentração final de 0,04%. No geral, a B. subtilis se desenvolve mais rápido em meio mínimo quando certos aminoácidos, tais como arginina, glutamina, glutamato ou prolina, são adicionados como uma fonte de nitrogênio auxiliar). (**Para cepas que são auxotróficas por triptofano, o triptofano é rotineiramente adicionado à maioria dos meios mínimos). 10 x Sais de Spizizen: 174 g de K2FIP04-3FI20; 20 g de (NH4)2S04; 60 g de KH2P04; 10 g de Na3Citrato-2H20; 2 g de MgS04-7H20; água até 993 ml; depois adicionar 3,5 ml de solução de FeCl3 e 3,5 ml solução de Elementos Traço.

Solução de FeCl3: 4 g de FeCl3-6H20; 197 g de Na3Citrato-2H20; água até 1 litro (esterilizar com filtração) Solução de Elementos Traço: 0,15 g de Na2Mo04-2H20; 2,5 g de H3B03; 0,7 g de CoC12-6H20; 0,25 g de CuS04-5H20; 1,6 g de MnCl2-4H20; 0,3 g de ZnS04-7H20; água até 1 litro (esterilização por filtração). SVY, VY Especial, um meio rico suplementado* para testar a produção de pantotenato em culturas de tubo de teste: 25 g de Caldo de Infusão de Carne de Vitela Dfico; 5 g de extrato de levedura Difco; 5 g de glutamato de sódio; 2,7 g de sulfato de amônio; 740 ml de água (autoclave); adicionar 200 ml de fosfato de potássio 1 M, pH 7,0; 60 ml de glicose a 50%.

(*Para testar a produção de pantotenato em culturas em tubo de teste em SVY líquido, α-ceto-isovalerato de Na e/ou β-alanina podem ser adicionados a uma concentração de 5 g/litro de estoques esterilizados por filtração). PFMG, um meio com base em extrato de levedura usado em fermentadores: 20 g de extrato de levedura Amberex 1003®; 5 g de glutamato de sódio, 2 g de sulfato de amônio; 5 g de triptofano; 10 g de KH2P04; 20 g de Κ2ΗΡ04·3Η20; 1 g de MgCl2-6H20; 0,1 g de CaCl2-2H20; 1 g de citrato de sódio; 0,01 g de FeS04-7H20; 1 ml de solução de elementos traço; 20 g de glicose; adicionar água até 1 litro. A glicose ou outros açúcares são alimentados como necessários. As soluções de alimentação podem conter minerais, nutrientes definidos ou grau alimentício. PF, um meio isento de pantotenato quimicamente definido para testar a auxotrofia do pantotenato: 100 ml de 10 x Sais de Spizizen; 100 ml de 1 x Meio de Ensaio de Pantotenato Difco; 10 ml de glicose a 50%; água até 1 litro.

Para os auxótrofos de pantotenato, 1 mM de pantotenato de Na é adicionado tanto ao meio mínimo quanto ao rico, visto que não existe no geral pantotenato bastante no meio rico para sustentar os mutantes pan de B. subtilis. Os aminoácidos são a 100 mg por litro, quando usados. A seleção quanto à resistência a antibiótico é feita com 5 mg/litro de cloranfenicol, 100 mg/litro de espectinomicina HC1, 15 mg/litro de tetraciclina HC1 ou 1 mg/litro de eritromicina mais 25 mg/litro lincomicina.

Ensaios de Pantotenato: Ensaio Biológico. O organismo indicador, Lactobacillus plantarum, requer pantotenato para o desenvolvimento, e responde a baixas concentrações (pg/litro). Assim, usando-se diluições em série, uma ampla faixa de concentrações podem ser ensaiadas. Meio comercialmente disponível (por exemplo, Meio de Ensaio de Pantotenato (PAM), Difco), pode ser usado. Entretanto, o PAM Difco suplementado com pantotenato não sustenta o desenvolvimento ao mesmo nível como o obtenível usando-se uma versão recém misturada de Meio de Ensaio de Pantotenato (FM-PAM), elaborada a partir de componentes individuais como especificado pela Difco, que é consequentemente, rotineiramente usado no lugar do produto comercial.

Antes de ensaiar os sobrenadantes da cultura de B. subtilis, as células de B. subtilis devem ser removidas ou mortas. Os sobrenadantes da cultura dão aproximadamente o mesmo título de pantotenato quando os sobrenadantes são submetidos à autoclave como quando são filtrados estéreis.

Consequentemente, os procedimentos de rotina envolvem autoclavar as amostras durante 5 minutos antes do ensaio biológico.

Ensaios de Pantotenato: Ensaio de HPLC. A produção de ácido pantotênico é medida pela HPLC com um detector de comprimento de onda de 197 nm e uma referência a 450 nm. O procedimento é uma modificação feita recomendada pela Hewlett-Packard para vitaminas solúveis em água. As amostras de caldo de cultura são diluídas em um volume igual de 60% de acetronitrila (ACN), centrifugadas e filtradas. Tipicamente uma outra diluição de 10 vezes antes da análise leva à diluição final a 20 vezes.

Concentrações superiores de produto são ainda mais diluídas. Os compostos são separados em uma coluna Cl8 Phenomenex 5μ Aqua 250 x 4,6 mm com 5% de acetronitrila (ACN) em 50 mM de tampão de fosfato de Na no pH 2,5.

Um gradiente de ACN de 5 % a 95% lava a coluna entre cada amostra. A área do pico de pantotenato é proporcional à concentração entre 5 a 1000 mg/litro.

Outros panto-compostos também são separados e quantificados por este método.

Análise de Aminoácido: Ensaio de HPLC. Os aminoácidos presentes no meio de fermentação e por toda a fermentação são medidos pela HPLC com um detector de comprimento de onda de 338 nm e uma referência a 390 nm. O procedimento é uma modificação feita recomendada pela Hewlett-Packard para a análise de aminoácido. As amostras de caldo de cultura são preparadas de modo idêntico como para a análise de panto- composto. Os compostos são separados em uma coluna Cl 8 Hypersil 5μ ODS 200 x 2,1 mm. O solvente A é tampão de acetato de Na a 20 mM no pH 7,2. O solvente B contém 40% de ACN e 40% de metanol. Um gradiente de 100% do Solvente A a 100% do Solvente B separa os aminoácidos e as lavagens da coluna entre cada amostra.

Fermentações de Batelada. As cepas que produzem pantotenato são cultivadas em fermentadores de tanque agitados, por exemplo, em vasos de 14 litros CF3000 Chemap com volumes de trabalho de 10 litros. O controle computadorizado e a coleta de dados são pelo software comercial, por exemplo, o software B. Braun Biotech MFCS. As fermentações podem ser processos de batelada mas são preferivelmente processos de batelada alimentados limitados a açúcar. Alguns componentes dos meios (por exemplo de SVIG e PMFG) são adicionados ao fermentador e esterilizados no lugar. Porções dos meios são esterilizados separadamente e adicionados aos fermentadores assepticamente. Este procedimento é bem conhecido àqueles familiarizados com a técnica. Fontes de nitrogênio adicionais nas alimentações são esterilizadas separadamente e adicionadas à fonte de carbono depois de esfriar. O açúcar inicial no meio é consumido em aproximadamente 6 horas. Em seguida, a glicose ou outros açúcares são alimentados com a adição possível de minerais, e nutrientes definidos ou de grau alimentício.

Altemativamente, as alimentações são programadas com base em um perfil de consenso das exigências nutricionais das amostras coletadas de fermentações anteriores.

Depois da inoculação, a agitação é ajustada a uma velocidade relativamente baixa, por exemplo 200 rpm. Quando o oxigênio dissolvido (p02) cai a 30%, o controle computadorizado automaticamente ajusta a agitação para manter uma concentração de oxigênio dissolvido entre 25 e 30 % de p02. EXEMPLO I: Produção Realçada de um Panto-Composto Usando Bactérias Que Superexpressam Produtos de GenepanBCD.

Este exemplo descreve a clonagem do operon panBCD do B. subtilis e a geração de micro-organismos que superexpressam os produtos de gene panBCD.

Para clonar o operon panBCD do B. subtilis, uma biblioteca de plasmídeo de DNA genômico GP275 da B. subtilis (um derivado de 168) foi transformada em E. coli BM4062 (birAts), e clones resistentes à temperatura foram selecionados a 42° C. Pelos mapas de comparação de restrição para a sequência genômica, um clone particular foi deduzido para conter o gene birA e os genes panBCD adjacentes de B. subtilis. este plasmídeo foi denominado pAN201.

Para superexpressar o operon panBCD e produzir o pantotenato, o promotor nativo do operon panBCD foi substituído por dois promotores constitutivos fortes derivados do bacteriofago SP01 de B. subtilis.

Estes dois promotores são denominados P26 e P]5. Além disso, dois sítios de ligação artificial de ribossomas (RBSs) foram usados para substituir o RBS panB nativo. Estes dois RBSs artificiais (apresentados como SEQ ID NO: 49 e SEQ ID NO: 50) foram prognosticados aumentar a tradução de panBCD; as suas sequências estão mostradas na Tabela IA. Três de tais cassetes de expressão de panBCD engendrados foram construídos nos plasmídeos circulares capazes de replicar na E. coli. Outros características dos plasmídeos incluem um terminador de transcrição independente de rho forte da unidade de transcrição de RNA ribossômico da£. coli, chamado T(T2, um gene de resistência ao cloranfenicol {cat) Gram-positivo, derivado de pC194, e um par de sítios de restrição Notl nas junções entre o réplicon da E. coli e os segmentos intencionados para a integração no B. subtilis. Três plasmídeos desta série, pAN004, pAN005, e pANOOó foram construídos. O pAN004 contém o promotor P26, RBS1, e uma cópia inferior do réplicon da E. coli. O pAN005 contém o promotor P15, que em nossa experiência não é tão forte quanto o P26, RBS1, e a cópia inferior do réplicon. O pANOOó contém o promotor P26, RBS2, e um réplicon de cópia de meio.

Os três cassetes de expressão panBCD contidos nos três plasmídeos mencionados acima foram todos ligados a um fragmento de DNA consistindo das sequências que naturalmente ocorrem imediatamente à montante do gene panB nativo e integrado em cópia única pela recombinação homóloga no local panBCD das cepas RL-1 e PY79 de B. subtilis, substituindo o operon do tipo selvagem. Isto foi realizado em duas etapas.

Primeiro uma supressão-substituição que substituiu cerca de dois terços da região codifícadora panB com um gene de resistência à espectinomicina (spec) Gram-positivo foi integrada no panB para produzir Spec1, auxótrofos de pantotenato. Estas cepas intermediárias foram então transformadas com os cassetes de expressão panBCD de pAN004, pAN005, e pANOOó depois ligando-os a um fragmento de DNA contendo sequências cromossômicas exatamente à montante de panB. A seleção do cassete de entrada foi quanto a prototrofia de pantotenato. As cepas resultantes foram denominadas PA221, PA222 e PA223 (de RL-1), e PA235, PA232 e PA233 (de PY79), respectivamente. Um exemplo de um plasmídeo que contém a sequência unida à montante que está na cepa integrada no PA221 é pAN240 (ver Figura 2). A sequência de nucleotídeo de pAN240 é apresentada como SEQ ID NO: 76. A reação de cadeia de polimerase usando-se iniciadores apropriados foi usada para verificar as estruturas cromossômicas corretas destas cepas engendradas. Quando os extratos da cepa PA221 foram examinados pela SDS-PAGE, duas proteínas foram descobertas serem superexpressas. Uma proteína teve um peso molecular aparente de 29.000 e a outra proteína pareceu ser de 39.000 daltons. As faixas de 29.000 dalton é presumivelmente PanB (peso molecular prognosticado de 29.761). A faixa de proteína maior presumivelmente representa PanC (tamanho prognosticado de 31.960 daltons). A capacidade destas cepas para produzir pantotenato em culturas de tubo de teste foi avaliada como segue. Cada cepa foi cultivada e meio SVY suplementado com 5 g/litro de a-ceto-isovalerato (α-KIV) e 5 g/litro de β-alanina, para garantir que estes precursores não foram limitantes.

Os sobrenadantes da cultura foram submetidos à autoclave e ensaiados usando o bioensaio. Em relação às cepas precursoras, RL-1 e PY79, as cepas engendradas produziram cerca de 8 a 30 vezes mais pantotenato, atingindo 1 g/litro de pantotenato em alguns casos.

Tabela 2. Produção de pantotenato pelas cepas de B. subtilis engendradas em culturas em tubo de teste líquidas cultivadas em meio SVY com 5 g/litro de α-KIV e 5 g/litro de β-alanina. O promotor P26 foi cerca de 3 a 4 vezes mais eficaz do que o promotor P]5, enquanto RBS1 e RBS2 foram grosseiramente equivalentes. Os plasmídeos tais como pAN004, pAN005, pANOOó também podem ser recombinados como círculos no local panBCD do tipo selvagem do B. subtilis pela integração do tipo de Campbell (cruzamento único), selecionando-se quanto a resistência ao cloranfenicol a 5 mg/litro. As cepas obtidas desta maneira produzem aproximadamente a mesma quantidade de pantotenato como as cepas PA221, PA222, e PA223, respectivamente. O pAN004 contendo o promotor P26, RBS1 e uma cópia inferior do réplicon do E. coli, é esquematicamente representado na Figura 3A. A sequência de nucleotídeo do plasmídeo pAN004 é apresentada como a SEQ DD NO: 93. O pANOOó contendo o promotor P26, RBS2 e uma réplicon de copia média de E. coli, é esquematicamente representado na Figura 3B. A sequência de nucleotídeo do plasmídeo pANOOó é apresentada como a SEQ ID NO: 94. A sequência de nucleotídeo de panBCD é apresentada como a SEQ ID NO: 59 e as sequências de aminoácido prognosticadas de PanB, PanC e PanD são apresentadas como as SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28, respectivamente. Os métodos para manipular Bacilos são descritas, por exemplo, em Harwood, C. R. e Cutting, S. M. (editores), Molecular Biological Methods for Bacillus (1990) John Wiley & Sons, Ltd., Chichester, Inglaterra, o conteúdo da qual é aqui incorporada por referência. EXEMPLO II: Produção Realçada de um Panto-Composto Usando Bactérias Que Superexpressam o Produto de Gene panEl - Cetopantoato Reductase.

Este Exemplo descreve a clonagem do gene panEl de B. subtilis e a geração de micro-organismos que superexpressam o produto de gene panEl.

As cepas Pan de B. subtilis (por exemplo, mutantes de B. subtilis bloqueados na síntese de ácido pantotênico) foram anteriormente isoladas, uma das quais foi relatada ser afetada na atividade de cetopantoato reductase (Baigori et al. (1991) J. Bacteriol. 173: 4240 a 4242). Entretanto, as mutações nestas cepas foram incorretamente mapeadas para o intervalo purE-tre do mapa genético da B. subtilis que não contém os genes panE ou panBCD. Além disso, como mostrado abaixo, um mutante panE não tem um fenótipo Pan visto que o produto de gene ilvC pode substituir no lugar do produto de gene panE na B. subtilis como em outras cepas bacterianas tais como a E. coli. Mais recentemente, o gene panE da S. typhimuruim foi localizado e determinado ser alélico ao apbA, um gene requerido para a biossíntese anaeróbica da purina (Frodyma et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 5572 a 5576). A E. coli carrega um gene altamente homólogo na mesma localização no mapa. A identificação do gene panEs na E. coli e na S. typhimurium foi complicada pelo fato de que o produto de gene ilvC, aceto- hidróxi-ácido isômero-reductase, também é capaz de realizar a reação de cetopantoato reductase. Como um resultado, a auxotrofia de pantotenato não é obtida a menos que tanto o panE quanto o ilvC sejam mutados.

Para identificar o gene panEl da B. subtilis, o genoma da B. subtilis foi procurado usando-se a sequência de proteína da E. coli ou S. typhimurium ApbA (PanE), e duas matrizes de leitura aberta foram identificadas tendo homologia ao ApbA, denominadas ylbQ e ykpB. Estes genes foram Renomeados panEl e panEl, devido à sua função proposta na biossíntese de pantotenato. Tanto o panEl quanto o panEl foram clonados como produtos de PCR gerados a partir de DNA genômico de RL-1 como um padrão. Ambos os genes foram rompidos por um gene de resistência à espectinomicina (spec) ou por um gene de resistência ao cloranfenicol (cat).

Os genes interrompidos foram cada um integrados pelo cruzamento duplo no PY79 para dar PA240 (Apa/tEl::spec) e PA241 (ApanEl::cat). Nenhuma destas cepas foram auxótrofas em pantotenato quando testadas em placas isentas de pantotenato (PF), embora a PA240 contendo ApanElr.spoc desenvolveu-se levemente mais lenta em TBAB sem pantotenato adicionado do que com um suplemento de 1 mM de pantotenato. Em comparação, uma cepa ApanBv.spec não produz colônias únicas no TBAB, presumivelmente porque a B. subtilis não tem nenhum sistema de absorção ativo para o pantotenato.

Foi levantada a hipótese de que o gene da B. subtilis, o ilvC, podería funcionar para o panE como foi mostrado para a E. coli.

Consequentemente, os rompimentos panEl e panEl foram introduzidos em uma cepa, CU550, que é relatada ser trpC2 ilvC4 leuC124. Tanto os rompedores panEl único quanto os panEl, panEl duplos foram auxótrofos em pantotenato no meio PF.

Tabela 3. Fenótipos de vários mutantes panEl e panEl em meios rico e definido. *Cada “+” representa cerca de 1 mm de diâmetro de colônia depois durante a noite a 37° C.

Assim, mutar tanto o panEl quanto o ilvC resulta na auxotrofia a pantotenato, enquanto mutar apenas o panEl não, similar ao que foi relatado para a E. coli e S. typhimurium.

Em seguida, o efeito quantitativo de panEl e panEl knockouts em uma cepa que superproduz o pantotenato (PA235 aqui descrito) foi examinada. Os rompimentos panEl e panEl foram introduzidos no PA235, sozinhos ou juntos para produzir PA245 (ApanEl::spec), PA248 {ApanElv.cat) e PA244 {ApanElv.cat, ApanEl::spec). O efeito de cada mutação sobre a produção de pantotenato foi então testado em culturas em tubo de teste líquidas.

Tabela 4. A produção de pantotenato pelos derivados de PA235 contendo rompimentos panEl e panEl.

Assim, a análise de supressão indicou que o gene panEl contribui com mais de 90% da produção de pantotenato, enquanto a supressão de panEl não tem um efeito significante sobre a produção de pantotenato. E portanto concluído que o panEl é responsável pela maior parte, mas não necessariamente por toda, a atividade de cetopantoato reductase na B. subtilis. O resto da atividade de cetopantoato reductase é prognosticada ser fornecida pelo ilvC.

Tendo identificado o panEl como um gene importante para a produção de pantotenato, a expressão de panEl aumentada foi testada para determinar se a mesma podería realçar a produção de pantotenato em cepas tais como PA221 ou PA235. A sequência codificadora panEl foi instalada à jusante do promotor P26 e o RBS2 em um vetor, pOTPól, planejado para integrar e amplificar no local bpr (um gene de protease não essencial) ou no local do inserto clonado. O plasmídeo resultante, pAN236 (Figura 4) foi transformado no PA221, selecionando-se quanto a resistência à tetraciclina a 15 mg/litro. A sequência de nucleotídeo de pAN236 é apresentada como a SEQ ID NO: 77. Um transformante, denominado PA236 foi escolhido para outros estudos. Ο PA236 foi mostrado superexpressar uma proteína de cerca de 31.000 daltons, que é próximo ao peso molecular esperado de 33.290 daltons para a proteína panEl. Em resumo, os extratos de célula foram preparados a partir de PY79, RL-1, PA221, PA221/pOTP61 e PA236 (2 amostras). Os extratos de célula foram separados pela eletroforese em gel e os géis foram tingidos com coomassie para visualizar as proteínas. Nas células engendradas para superexpressar ο panE (PA236-1 e PA236-2), uma faixa foi visível tendo um peso molecular aproximado de 31.000 daltons (quando comparado aos marcadores de peso molecular). Além disso, ο PA221 e o PA236 expressaram níveis aumentados de uma faixa de aproximadamente 29.000 daltons, correspondente ao produto de gene panB, e uma faixa de aproximadamente 39.000 daltons, presumivelmente correspondente ao produto de gene panC. Além disso, a E. coli transformada com pANOOó (Figura 3B) expressou faixas que se correlacionam com o panB e o produto de gene panCs ea£. coli transfectada com PAN236 expressou uma faixa de aproximadamente 31.000 daltons correspondente ao produto de gene panE.

Em seguida, ο PA236 foi comparado ao PA221 que carrega o vetor vazio pOTPól quanto a produção de pantotenato em culturas em tubo de teste líquidas suplementadas com 5 g/litro de β-alanina e 5 g/litro de a- KIV.

Tabela 5. Efeito da Superexpressão de panEl e panEl sobre a produção de pantotenato pelas cepas engendradas em culturas em tubo de teste líquidas. A superexpressão de panEl causou um aumento de duas vezes na produção de pantotenato quando comparada à cepa precursora (por exemplo, a levemente acima de 2 g/litro) ao passo que a superexpressão de panEl resultou em uma cepa que produziu cerca de 35% menos pantotenato do que a cepa precursora. A sequência de nucleotídeo panEl e a sequência de aminoácido prognosticada estão apresentadas como as SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30. EXEMPLO III: Produção Realçada de um Panto-Composto Cultivando- se Bactérias Que superexpressem panEl ou panBCD na presença de Valina. A capacidade da valina para funcionar como um suplemento de meio (por exemplo, como um substituto para α-KIV) em cepas engendradas para superexpressar o operon panBCD e panEl foi avaliada. A valina está intimamente relacionada com o α-KIV pela transaminação, é menos cara do que o α-KIV e é comercialmente disponível em quantidades de quilogramas. A valina foi substituída no lugar do α-KIV nas culturas padrão em tubo de teste líquidas em meio SVY. A concentração de valina foi variada de 5 a 50 g/litro. Embora a valina a 5 g/litro foi levemente menos eficaz do que o α-KIV na promoção da produção de pantotenato, a valina a 10 ou 20 g/litro igualou-se ou superou 5 g/litro de α-KIV na promoção da produção de pantotenato. EXEMPLOS IV a X Geração de Micro-organismos Capaz de Produzir Pantotenato em uma Maneira Independente do Precursor As cepas de B. subtilis tais como a PA221 e a PA235 (engendradas para superexpressar a panBCD) e a PA236 (engendrada par superexpressar a panBCD e a panEl) necessitam ser alimentadas com a-ceto- isovalerato (α-KIV) (ou valina) e aspartato (ou β-alanina) para se obter a produção máxima de pantotenato, visto que ambos destes precursores são limitantes para a síntese de pantotenato. Consequentemente, os micro- organismos manipulados foram planejados para eliminar a necessidade para a alimentação de precursores limitantes da biossíntese de pantotenato na produção de pantotenato. Estas cepas também são úteis na produção de vários intermediários no caminho biossintético do pantotenato. EXEMPLO IV: Geração de Micro-organismos Capazes de Produzir Pantotenato em uma Maneira Independente de Aspartato (ou β-Alanina) 0 gene panD foi clonado no vetor de expressão pOTPól para construir o pAN423 (Figura 5). A sequência de nucleotídeo de pAN423 é apresentada como a SEQ ID NO: 78. O fragmento de restrição Notl contendo panD foi isolado a partir de pAN423, auto ligadas e usadas para transformar ο PA221. Os transformantes resistentes ao Tet15, Tet30, e Tet60 foram isolados e guardados para outras análises. Seis dos transformantes pAN423 mais dois transformantes de controle foram cultivados em SVY contendo 5 g/litro de a- KIV com e sem 10 g/litro de aspartato e depois ensaiados quanto a produção de pantotenato (Tabela 6).

Tabela 6. Efeito da superprodução de PanD na produção de pantotenato com e sem aspartato adicionado. *As culturas em tubos de teste foram cultivadas em SVY + α-KIV (5 g/litro) com Asp (10 g/litro) onde indicado. **TetR = resistência aproximada ao Tet de transformante Os transformantes pAN423 produziram pelo menos duas vezes a quantidade de pantotenato em relação aos controles (isto é, a um nível que foi obtido nos experimentos iniciais ou próximo àqueles, pela adição de β-alanina ao meio de cultura). Os dados também mostram que na ausência de aspartato adicionado, os transformantes contendo cópias adicionais do cassete de expressão do gene panD produziram mais pantotenato do que os transformantes de controle. Um dos transformantes, o 423# 1-5, produziu cerca de cinco vezes tanto pantotenato quanto os controles. Estes resultados indicam que os níveis aumentados de proteína PanD “puxam” a conversão de aspartato disponível na direção da β-alanina, e que aumentar a expressão do gene panD pode resultar no realce da produção de pantotenato tanto na presença quanto na ausência de aspartato adicionado. O transformante 423# 1-5 foi re-denominado cepa PA401 e ainda estudado em fermentações de frasco agitado. O meio do frasco agitado foi SVY com maltose no lugar de SVY com glicose. Os resultados dos experimentos de frasco agitado combinam bem com os experimentos de tubo de teste durante as primeiras 24 horas. Nos experimentos de frasco agitado sem a adição de β-alanina, a PA401 produziu aproximadamente 1,5 g/litro de pantotenato em 24 horas. A adição de β-alanina ao meio de cultura não melhorou mais os títulos de pantotenato (Tabela 7), indicando que com esta cepa e estas condições de fermentação, a β-alanina não é limitante da produção de pantotenato. De fato, quando nenhuma β-alanina é alimentada, pode-se observar que a PA401 secreta β-alanina em quantidades significantes no meio.

Tabela 7. Culturas de frasco agitado com a cepa PA401 (panD) com e sem β- alanina.

Cada valor representa a média de frascos abafados de 250 ml em duplicata contendo 50 ml de meio, incubados a 37° C com agitação (200 rpm).

Meio Base: SVY com 10 g/litro a-KIV, 30 g/litro de maltose 2% de Inóculo: SVY com Tet^ cultivados 24 horas. EXEMPLO V: Engendramento do gene panD para Aumentar ainda mais a Síntese de Aspartato Descarboxilase e Realçar a Produção de Pantotenato Este Exemplo descreve a geração de sítios de ligação de ribossoma (RBSs) melhorados no gene panD para aumentar a tradução de mRNA de panD.

Aumentar a tradução do mRNA do gene panD pela geração de RBSs de panD sintético O RBS (SEQ ID NO: 88) usado para expressar panD em pAN423 é um RBS sintético e foi usado para produzir com sucesso outras proteínas na B. subtilis em um nível alto. Entretanto, este contém seis desemparelhamentos quando alinhado com o RBS de B. subtilis “ideal” (SEQ ID NO: 45) (por exemplo, um RBS tendo uma sequência que é complementar à sequência de RNA 16S dentro do ribossoma da B. subtilis). (Ver por exemplo, a Tabela 1B, desemparelhamentos em negrito). Dois novos RBSs foram planejados para imitarem mais intimamente o RBS ideal. Estes RBSs sintéticos, denominados novo projeto A (NDA) e novo projeto B (NDB) (também aludidos aqui como RBS3 e RBS4), são apresentados como a SEQ ID NO: 51 e a SEQ ID NO: 52 e são alinhados com o RBS ideal na Tabela 1B.

Os oligonucleotídeos correspondentes aos filamentos de topo e de fundo de cada novo RBS foram sintetizados, recozidos, depois usados para substituir o RBS no pAN420, gerando os plasmídeos pAN426 e pAN427. Estas construções são ilustradas na Figura 6. A presença dos RBSs NDA e NDB no pAN426 e pAN427 foi confirmada pela análise de sequência de DNA. Em seguida, os genes panD de pAN426 e pAN427 foram transferidos para o vetor de expressão pOTPól da B. subtilis como mostrado na Figura 7, criando pAN428 e pAN429. A sequência de nucleotídeo de pAN429 está apresentada como a SEQ ID NO: 79.

Os fragmentos de restrição Notl que carecem das sequências de vetor da E. coli foram isolados a partir de pAN428 e pAN429, auto ligadas, e usadas para transformar a cepa PA221 para resistência ao Tet .

Quatro isolados resistentes ao Tet60 foram coletados de cada transformação e ensaiados quanto à produção de pantotenato e β-alanina junto com PA221 transformados com o vetor vazio (pOTPól) e PA221 transformados com pAN423 (cepa PA401) (ver a Tabela 8).

Tabela 8. A produção de pantotenato pelas culturas em tubos de teste de PA221 transformado com pAN428 e pAN429 UND: Abaixo dos limites de detecção. * Renomeados PA402. # Renomeados PA403 Quando cultivados no meio suplementado com α-KIV a 5 g/litro (α-KIV5), o transformante pAN428-l e todos os quatros dos transformantes pAN429 produziram mais pantotenato do que o fez ο PA401, sugerindo que estes transformantes continham níveis mais altos de atividade de aspartato descarboxilase. Quando cultivados em meio suplementado com α-KIV0 e Asp10 nenhum dos transformantes pAN428 ou pAN429 produziram mais pantotenato do que ο PA401. Entretanto, o transformante pAN428-l e todos os quatro dos transformantes pAN429 produziram significantemente mais β-alanina do que o fez ο PA401. E possível que a β-alanina em excesso produzida a partir do aspartato adicionado cause a inibição da produção de pantotenato. Altemativamente, a β-alanina pode se acumular porque o pantoato é limitante nestas cepas.

As cepas que produziram o nível mais alto de β-alanina, os transformantes pAN428-l e pAN429-4, foram renomeados PA402 e PA403, respectivamente. Estas duas cepas foram cultivadas em meio SVY suplementado com vários intermediários e reensaiados quanto à produção de pantotenato e β-alanina. Ο PA221 e ο PA401 foram incluídos como controles. O resultado dos ensaios estão apresentados na Tabela 9.

Tabela 9. A produção de pantotenato de PA402 e PA403 em culturas de tubo de teste.

Quando cultivadas em meio suplementado com α-KIV5 ou Pantoato5, a PA402 e PA403 produziram significantemente mais pantotenato do o fez a PA401. Como antes, ainda que a PA402 e a PA403 produziram significantemente mais β-alanina do que a PA401 quando cultivadas em meio suplementado com α-KIV5 e Asp10, não produziram um aumento proporcional no pantotenato. Entretanto, quando cultivadas em meio suplementado com Pantoato5 mais Asp10, tanto a PA402 quanto a PA403 produziram significantemente mais pantotenato do que a PA401, um aumento de cerca de 30%.

Pode ser concluído a partir destes experimentos que os sítios de ligação de ribossomas panD NDA e NDB melhorados, engendrados no pAN428 e pAN429, respectivamente, levaram a níveis aumentados de atividade de aspartato descarboxilase.

Aumentar a tradução do mRNA do gene panD pela geração de RBSs panD sintético dentro do operonpanBCD O sítio de ligação de ribossoma (RBS) do gene panD de B. subíilis nativo (SEQ ID NO: 43), que é encontrado no cassete P26operon panBCD presente na PA221 (e em outras cepas de produção de pantotenato engendradas aqui descritas), é mostrado na Tabela 1C alinhado com o sítio de ligação de ribossoma ideal (SEQ ID NO: 47). O alinhamento mostra desemparelhamento entre o RBS do gene panD de B. subtilis nativo, que está localizado dentro da sequência codificadora para o PanC, e o ideal RBS. Três novos RBSs (dentro do cassete P26 operon panBCD) foram gerados para aumentar a tradução do mRNA do gene panD e para produzir síntese de aspartato descarboxilase aumentada. Estes RBSs sintéticos (denominados NDI, NDII, e NDIII, também aludidos aqui como RBS5, RBS6 e RBS7, respectivamente) são apresentados como as SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57, respectivamente) e estão incluídos na Tabela 1C. Deve ser observado que embora mudanças no RBS do panD dentro do operon panBCD também muda a sequência de terminal C do aminoácido da proteína PanC codificada por aquele operon, um alinhamento de sequências de aminoácido da proteína PanC conhecidas e suspeitas mostrou que a sequência dos últimos nove aminoácidos da proteína PanC de B. subtilis pode ser alterada sem afetar qualquer dos resíduos de aminoácido conservados indicando que tais mudanças não devem reduzir a atividade ou a expressão da pantotenato sintetase. Os novos RBSs foram sintetizados e incorporados no cassete de expressão panBCD do operon P26 como segue.

Primeiro, os iniciadores de PCR foram planejados para conter os seguintes elementos: (1) uma sequência de ácido nucleico que codifica os primeiros cinco aminoácidos de PanD até e incluindo um único sítio de restrição BsiWÍ que foi previamente introduzido no panD pela PCR; (2) um códon de parada parapanC, (3) pelo menos um RBS sintético; e (4) 30 a 39 pares de base de sequência de ácido nucleico tendo 100% de identidade com panC à montante do RBS de panD. Os iniciadores foram denominados TP102, TP103, e TP104 e continham os sítios de ligação de ribossoma NDI, NDII, e NDIII, respectivamente. Estes três iniciadores foram usados em conjunção com o iniciador 5' TP101, que hibridiza próximo ao códon de início de panC, em três reações de PCR independentes para gerar os produtos de PCR NDI, NDII, e NDIII. Os produtos de PCR foram purificados, digeridos com Xbal, depois clonados no vetor plasmídico pASK-lBA3 que foi digerido com Xbal e Smal. Os plasmídeos resultantes foram denominados pAN431, pAN432, e pAN433. A construção de pAN431 é ilustrada na Figura 8 e é representativa de todas as três construções de plasmídeo. A presença do RBS do gene panD sintético desejado em cada um dos novos plasmídeos foi confirmada pelo sequenciamento de DNA.

Em seguida, os genes panC modificados contendo os novos RBSs de panD foram unidos com o gene panD que utilizando o sítio de restrição BsiWI único. Isto foi realizado pela isolação dos fragmentos de restrição Nsil-BsiWI apropriado de pAN431, pAN432, e pAN433 e ligando- os com um fragmento de restrição Nsil-BsiWI de 2395 pares de base de pAN420, que forneceu o gene panD modificado por BsiWI. Estas construções resultaram nos plasmídeos pAN441, pAN442, e pAN443, respectivamente. Uma construção representativa (pAN441) é ilustrada na Figura 9. A sequência de nucleotídeo de pAN443 é apresentada como a SEQ ID NO: 80.

Os novos RBSs do gene panD foram depois substituídos no cassete de expressão P26operon panBCD como segue. Primeiro, uma mutação de supressão-inserção que remove a região de panC contendo o RBS de panD foi criada. Esta foi construída pela digestão de pAN430 com uma mistura de BspEl e BglII e recuperação do fragmento de 4235 pares de base que é agora ausente na extremidade 3' de panC e na extremidade 5' de panD.

Este fragmento foi ligado com um fragmento de restrição Aval-BamHI a partir do plasmídeo pECC4, que contém o gene da cloranfenicol acetil- transferase (cat). A extensão 5' produzida pela digestão com Aval é compatível com aquela produzida pelo BspEl enquanto às extensões BglII e BamHI também são compatíveis. O plasmídeo resultante foi denominado pAN440, e a sua construção está ilustrada na Figura 10. A mutação de supressão-inserção resultante foi cruzada no panBCD do operon P2g pela recombinação homóloga pela transformação de PA221 com pAN440 linearizado e selecionando quanto a resistência ao cloranfenicol nas placas de Cam3 contendo 1 mM de pantotenato. Diversos transformantes foram testados, e descobriu-se que todos requerem 1 mM de pantotenato para o desenvolvimento, como esperado. Dois destes transformantes foram providos com PA408A e PA408B e foram ensaiados quanto a produção de pantotenato. Nenhuma cepa sintetizou quantidades mensuráveis de pantotenato, mesmo quando cultivadas em meio contendo pantoato e β-alanina a 5 g/litro, indicando que as cepas são deficientes na atividade de pantotenato sintetase. Em seguida, os novos RBSs de panD foram cruzados no panBCD do operon P26 pela transformação de PA408 com DNA plasmídico de pAN441, pAN442, e pAN443 linearizado e selecionando quanto ao desenvolvimento nas placas de TBAB sem suplementação de pantotenato. Uma transformação com pAN430 linearizado (incluindo o RBS de panD nativo) foi incluída como um controle e foi esperada dar origem a transformantes idênticos ao PA221 aqui descrito. Quatro isolados de cada transformação foram ensaiados quanto a produção de pantotenato e β-alanina no meio SVY suplementado com vários intermediários (Tabelas 10 e 11).

Tabela 10. A produção de pantotenato de PA410 - PA413 em culturas de tubo de teste.

Tabela 11. A produção de pantotenato de PA410 - PA413 em culturas de tubo de teste.

Como suposto a partir de experimentos anteriores usando PA221, nenhum dos transformantes que continham o RBS de panD nativo produziu quantidades mensuráveis de pantotenato quando cultivados em meio suplementado com pantoato. Entretanto, nove dos doze transformantes supostos conter os RBSs de panD modificados produziram quantidades significantes de pantotenato (160 a 230 mg/litro) sob estas condições, indicando que possuem níveis elevados de atividade de aspartato descarboxilase. Quando cultivados em meio suplementado tanto com pantoato quanto com aspartato, estes mesmos nove transformantes produziram aproximadamente quatro vezes mais pantotenato do que aqueles com o RBS de panD nativo. Além disso, estes nove transformantes acumularam quantidades mensuráveis de β-alanina (230 a 410 mg/litro).

Todos os transformantes produziram quantidades grosseiramente equivalentes de pantotenato quando cultivados em meio contendo pantoato e β-alanina, demonstrando que cada um contém uma pantotenato sintetase funcional.

Estes dados demonstram que os RBSs de panD sintéticos são cerca de quatro vezes mais eficazes do que o RBS de panD nativo em direcionar a tradução do mRNA do gene panD e evidencia a utilidade de tais RBSs sintéticos em realçar a produção de pantotenato. Os métodos adicionais para aumentar a produção de pantotenato pode incluir, por exemplo, aumentar a meia vida do mRNA do gene panD, aumentar a concentração do promotor para a transcrição de panD e/ou aumentar a estabilidade da proteína PanD. EXEMPLO VI: Construção de Cepas Contendo um Cassete P26 panEl Integrado sem um Gene de Resistência a Antibiótico. O Exemplo II descreve a identificação do gene panEl de B. subtilis que codifica a enzima responsável pela maioria da atividade de cetopantoato reductase no B. subtilis. A PA236 (contendo 0 plasmídeo pAN236) produziu cerca de duas vezes tanto pantotenato (2 g/litro) quanto a sua cepa precursora, PA221 (1 g/litro) em culturas em tubo de teste com SVY 24 horas. Presumiu-se que a PA236 contivesse um plasmídeo pAN236 integrado, amplificado (~3 cópias) com base na seleção quanto a resistência à atraciclina (0 produto de gene tetR sendo codificado no plasmídeo pAN236 além do cassete P26 panEl). Também úteis nas metodologias da presente invenção são as cepas que contêm uma única cópia integrada não amplificável de P26 panEl no local panEl, por exemplo, sem um gene de resistência a antibiótico na cepa. Tal cepa foi gerada como segue.

Um plasmídeo denominado pAN251 foi derivado de pAN236 pela inserção de sequências cromossômicas adicionais exatamente à montante e exatamente a jusante do cassete P26 panEl. Estas sequências adicionais, que fornecem homologia para permitir a integração do cassete P26 panEl em panEl pelo cruzamento duplo, foram obtidas pela PCR de DNA

cromossômico como um padrão. O pAN251 é mostrado na Figura 11. A sequência de nucleotídeo de pAN251 é apresentada como a SEQ ID NO: 81.

Em seguida, uma cepa foi construída que permitiu a seleção para a entrada do cassete P26 panEl. A cepa incluiu os três componentes seguintes: (1) P26 panBCD; (2) ApanEl; e (3) ilvC, visto que tanto o panEl quanto o ilvC devem ser mutados para se ter um fenótipo Pan. A cepa de partida foi a CU550 (trpC2, ilvC4, leuC124). O cassete P26panBCD do DNA cromossômico de PA221 foi introduzido em duas etapas para criar a cepa PA290. Em seguida, ApanE\::spec foi transformado no PA290, usando o DNA cromossômico da cepa PA240, para dar a cepa PA294 (trpC2, ilvC4, leuC124, P26 panBCD, ΔραηΕΙ::spec), que é um auxótrofo estrito de pantotenato. Finalmente, a PA294 foi transformada com o plasmídeo pAN251, selecionando-se quanto a prototrofia de pantotenato, para dar a cepa PA303. Supõe-se que esta cepa tenha o genótipo trpC2, ilvC4, leuC124, P26 panBCD, P26panEl. A PA303 foi checada quanto a estrutura cromossômica correta no local panEl pela PCR usando iniciadores que flanqueiam a inserção P26 exatamente à montante de panEl. O produto de PCR de PA303 foi do tamanho esperado, com uma perda concomitante do produto de PCR a partir do gene panEl do tipo selvagem, compatível com o fato de se ter obtido o cruzamento de evento duplo desejado. Além disso, a PA303 foi sensível à tetraciclina, que é também compatível com o cruzamento de evento duplo desejado, como oposto a um cruzamento único do tipo de Campbell dos plasmídeos no cromossoma. As auxotrofias de trp, ilv, e leu da cepa precursora foram todas mantidas na PA303.

Em culturas em tubo de teste em SVY líquido de 24 horas, a PA303 produziu quase o mesmo nível de pantotenato como o controle positivo PA236, e cerca de duas vezes tanto quanto a PA221, que não continha o panEl engendrado como indicado na Tabela 12.

Tabela 12. A produção de pantotenato por culturas em tubos de teste de 24 horas de PA303 e controles cultivados em SVY mais 5 g/litro de α-KIV e 5 g/litro de β-alanina. EXEMPLO VII: Geração de Micro-organismos Capazes de Produzir Pantotenato em uma Maneira Independente de α-KIV (ou Valina) O a-ceto-isovalerato (α-KIV) é uma intermediário limitante de taxa para a produção de pantotenato em certas cepas desreguladas quanto a síntese de pantotenato. A adição de α-KTV ou valina a 5 g/litro aumenta a produção de pantotenato em cerca de 5 vezes em culturas de tubo de teste com cepas tais como a PA221. De modo a minorar a necessidade de alimentar o α-KIV ou a valina, cepas foram engendradas que têm uma capacidade aumentada para sintetizar o a-KJV. O α-KIV é produzido no B. subtilis a partir do piruvato pela ação sequencial de três enzimas codificadas pelos quatro genes, ilvB e ilvN, ilvC, e ilvD. Em um B. subtilis do tipo selvagem, três dos genes (ilvB, ilvN, e ilvC) são os primeiro três genes do operon ilv-leu grande. O quarto gene necessário para a síntese de α-KIV, o ilvD, está localizado por si só em algum lugar no cromossoma. Considera-se que o operon ilv-leu do B. subtilis deva ser regulado apenas pelos níveis de leucina. A alimentação de leucina exógena reduz a transcrição do operon ilv-leu em cerca de 13 vezes, provavelmente por um mecanismo de atenuação (Grandoni et al. (1992) J

Bacteriol. 174: 3212 a 3219). A única regulagem de realimentação conhecida no caminho ilv-leu é a inibição do produto de gene leuA pela leucina.

Como uma primeira etapa para desregular a síntese de a-KIV, uma cópia da região ilvBNC do operon ilv-leu de B. subtilis do tipo selvagem foi isolada pela PCR, e instalada adjacente ao promotor P26 e RBS2 em um vetor, pOLL8, que foi planejado para integrar um único cassete de expressão P26 pela recombinação dupla no local amiE. O gene amiE codifica uma a- amilase não essencial, e é um local útil para instalar os cassetes de expressão. O plasmídeo resultante, pAN267, é ilustrado na Figura 12. A sequência de nucleotídeo de pAN267 é apresentada como a SEQ ID NO: 82. O pAN267 deu facilmente transformantes estáveis pelo cruzamento duplo no local amiE de cepas de B. subtilis, como descrito em detalhes abaixo.

Construção de cepas que superproduzem pantotenato que são protótrofos de leucina Inicialmente, uma cepa de B. subtilis contendo ilvC4 e ΔραηΕΧ foi usada para introduzir uma única cópia de P26 panEX no cromossoma sem usar um gene de resistência a antibiótico. O mutante duplo foi requerido para selecionar quanto a uma entrada do cassete P26 panEX porque uma mutação ΔραηΕΧ sozinha não resulta em auxotrofia de pantotenato. Uma cepa denominada CU550 foi obtida contendo ilvC4 para ser usado como uma base para este tipo de construção de cepa. Entretanto, a CU550 também contém uma mutação leuC124 intimamente ligada, de modo que todas as cepas derivadas da CU550 requereram leucina. Tendo mostrado que a combinação de P26 panBCD e P26 panEX foi favorável para a produção de pantotenato, a etapa seguinte foi remontar esta combinação de dois cassetes em um protótrofo de leucina.

Consequentemente, os dois cassetes foram combinados em dois fundos de cepa diferentes, RL-1 e PY79. Para introduzir o P26 panEX cromossômico nos fundos de cepa PY79 e RL-l sem usar um gene de resistência a antibiótico, uma estratégia foi usada que não contou com o ilvC4. (A estratégia levou a vantagem da observação de que a mutação ΔραηΕΙ causa uma braditrofia de pantotenato, manifestada pelas colônias relativamente pequenas nas placas de TBAB (rico)). Primeiro, ApanB::orf e ΔραηΕ::spec foram introduzidos em ambos os fundos de cepa. Em seguida, as cepas resultantes foram transformadas simultaneamente com o DNA das duas cepas, PA221 (P26 panBCD) e PA303 (P26 panEX), selecionando quanto a Part nas placas TBAB. As colônias de dois tamanhos distintos se desenvolveram nas placas seletivas, com o tamanho maior compreendendo cerca de 2% das colônias. Presumiu-se que as colônias maiores foram representadas por co-transformantes que receberam tanto P26 panBCD quanto P26 panEX, e que as colônias menores receberam apenas P26 panBCD.

Compatível com o previsto, as colônias maiores perderam tanto Camr quanto Specr, enquanto as colônias menores perderam apenas o gene cat, e retiveram o gene spec. Além disso, um derivado representativo de PY79 denominado PA327, e um derivado representativo de RL-1, denominado PA328, produziram ambos os níveis elevados de pantotenato em culturas de tubo de teste que foi de cerca de 1,6 a 1,7 g/litro (Tabela 13).

Tabela 13. A produção de pantotenato de PA327, PA328, e controles de culturas em tubo de teste de 24 horas cultivadas em SVY mais 5 g/litro de a- KIV e de (3-alanina.

Assim, concluiu-se que a PA327 e a PA328 continham tanto o P26 panBCD quanto o P26 panEX, e foram usados para outras construções como descrito abaixo. A análise de PCR confirmou a presença dos dois cassetes.

Instalação de um cassete P26 ilvBNC estável nas duas linhagens de cepas que superproduzem pantotenato Tendo-se construído a PA327 e a PA328, derivadas de PY79 e RL-1 contendo ο P26 panBCD e ο P26 panEl, e que são Leu+, a etapa seguinte foi para introduzir cópias estáveis de P26 ilvBNC. Isto foi realizado pela transformação da PA327 e da PA328 com o plasmídeo pAN267, selecionando-se quanto a Specr. A avaliação pela PCR mostrou que cerca de 85% dos transformantes obtidos continham P26 ilvBNC integrado no amiE pelo cruzamento duplo. Um transformante de PA327, denominado PA340, e um transformante de PA328, denominado PA342, foram escolhido para outros estudos.

Em culturas de tubo de teste cultivadas em meio SVY mais 5 g/litro de β-alanina mas sem adicionar α-KIV, tanto a PA340 quanto a PA342 deram o aumento esperado na produção de pantotenato em relação àquela de PA327 e PA328, a cerca de 1,3 a 2 g/litro (Tabela 14).

Tabela 14. Produção de pantotenato e valina pela PA340 e PA342, ambas contendo P26 ilvBNC culturas em tubo de teste de 24 horas cultivadas em SVY com 5 g/litro de β-alanina e com ou sem 5 g/litro de a- KIV

As duas novas cepas também deram um leve aumento na secreção de valina, indicando que os genes ilvBNC foram desregulados.

Entretanto, quando as mesmas cepas foram cultivadas com 5 g/litro de a-KIV adicionados, um outro aumento na produção de pantotenato ocorreu a partir da PA342, sugerindo que o α-KIV foi ainda limitante de taxa neste fundo de cepa. Resultados similares, apenas com mais desenvolvimento e por este motivo níveis superiores de pantotenato, foram observados em culturas de frasco agitado (Tabela 15).

Tabela 15. Produção de pantotenato e valina pela PA340 e PA342, ambas contendo P26 ilvBNC culturas em frasco agitado de 24 horas cultivadas em SVY com 5 g/litro de β-alanina e com ou sem 5 g/litro de a-KIV. EXEMPLO VIII: Aumentar o Número de Cópias de panD em Cepas Engendradas para Superproduzir panEl e os Produtos de gene ilvBNC

Realça a produção de pantotenato Os experimentos onde a β-alanina foi alimentada a culturas de cepas engendradas de B. subtilis comparativamente mostraram que a β- alanina foi um intermediário limitante de taxa na síntese de pantotenato. O efeito de adicionar cópias adicionais de panD na produção de pantotenato em PA340 e PA342 foi examinado. As cepas PA340 e PA342 foram transformadas com DNA cromossômico isolado a partir de PA401 com a seleção na placas contendo 15 pg/ml de tetraciclina (placas Tet15). Os transformantes derivados de cada precursor foram manchados sobre as placas Tet60 para identificar aquelas que foram prováveis de conter cópias múltiplas do cassete de expressão. Doze transformantes de cada transformação que desenvolveu no Tet60 foram riscados para colônias únicas neste meio e depois ensaiados em culturas em tubo de teste em meio SVY para a produção de pantotenato. Um transformante de cada grupo foi descoberto produzir mais do que 300 mg/litro de pantotenato em 24 horas. Estes dois transformantes foram guardados e denominados PA404 (cepa de fundo PA340) e PA405 (cepa de fundo PA342). Ambas as cepas foram resistentes à espectinomicina, indicando que o cassete de expressão P26 ilvBNC estava ainda presente no arniE. A análise de PCR de DNA cromossômico isolado de cada cepa confirmou que o genepanEX desregulado também foi retido.

Em seguida, ο PA404 e ο PA405 foram avaliados nas culturas de frasco agitado que foram cultivados em meio SVY contendo maltose como a fonte de carbono e suplementado com vários intermediários. As culturas foram cultivadas durante 24 e 48 horas e depois ensaiadas quanto à produção de pantotenato, β-alanina, e valina. Os resultados deste experimento são apresentados na Tabela 16. Os dados de cultura análoga em frasco agitado para as cepas precursoras (PA340 e PA342) estão incluídos nas Tabelas para comparação.

Tabela 16. Produção de pantotenato pelas PA404 e PA405 em culturas em frasco agitado depois de 24 horas Os Valores são a média de frascos em duplicata exceto onde indicado por *.

Na ausência de qualquer suplementação de meio, a PA404 e a PA405 fabricaram de quatro a cinco vezes mais pantotenato em 24 horas comparado à sua cepa isogênica precursora (Tabela 16). O fornecimento de β-alanina foi claramente limitante na cepa precursora de PA340 e PA342. A adição de P26 panD amplificado aumentou enormemente o fornecimento de β-alanina. EXEMPLO IX: Desregulagem do Gene ilvD da B. subtilis Realça a Produção de Pantotenato Para desregular a expressão do gene ilvD, os procedimentos padrão (descritos acima) foram usados para integrar o promotor P26 constitutivo e um sítio de ligação de ribossoma artificial, RBS2, exatamente à montante da região codificadora ilvD. O gene ilvD mapeia por si só, diferente do operon ilvBNC. Primeiro, uma região de 2,4 kb do cromossoma RL-1 que contém a região codifícadora ilvD e 730 pares de base à montante da sequência foi clonado pela PCR em uma cópia inferior do vetor chamado pOK12 (cerca de 15 por célula E. coli), para dar o plasmídeo pAN257, mostrado na Figura 13.

Levando a vantagem de um sítio EcoRI natural exatamente à montante do gene promotor ilvD nativo, e um sítio Ncol natural no códon ilvD de início, uma sequência artificial contendo P26 e RBS2 foi inserida no pAN257 para dar pAN263 (Figura 14). A sequência de nucleotídeo de pAN263 é apresentada como a SEQ ID NO: 83. Em paralelo com esta construção, o gene cat também foi inserido no pAN257, entre o mesmo sítio EcoRI à montante e um sítio BglII no meio da região codifícadora ilvD, para dar pAN261, que é suprimido por uma parte grande do gene ilvD (Figura 15).

Usando-se a pAN261 e pAN263, o cassete P26 ilvD poderia ser então instalado no cromossoma de B. subtilis em duas etapas. Na primeira etapa, o pAN261 é introduzido pela transformação, selecionando quanto a resistência ao cloranfenicol, e depois confirmando um fenótipo Ilv. Na segunda etapa, o pAN263 é introduzido, selecionando-se para Ilv+, checando quanto a sensibilidade ao cloranfenicol, e confirmando a estrutura local correta pela PCR. O pAN261 foi primeiro transformado na cepa RL-1 (altamente competente) para dar a cepa PA343 (AilvD::caí), e depois o DNA cromossômico de PA343 foi usado para transformar PA340 e PA342 para auxotrofia de Ilv, produzindo as cepas denominadas PA348 e PA349, respectivamente. O DNA cromossômico é inerentemente mais eficiente do que o plasmídeo monomérico na transformação do B. subtilis. Similarmente, o DNA do pAN263 foi transformado na PA343 (moderadamente competente) para dar a cepa PA345 (P26 üvD), e depois o DNA cromossômico de PA345 foi usado para transformar a PA348 e a PA349 para prototrofía de 7/v+, produzindo as cepas PA374 e PA354, respectivamente.

Como prognosticado, a PA374 e a PA354 deram mais aumentos na produção de pantotenato, a cerca de 2,5 a 2,9 g/litro, em culturas de tubo de teste cultivadas em SVY mais 5 g/litro de β-alanina (Tabela 17).

Tabela 17. Produção de pantotenato e valina pela PA374 e PA354, contendo P26 HvD, e controles, em culturas em tubo de teste de 24 horas cultivadas em SVY com 5 s/litro de β-alanina e com ou sem 5 g/litro de a-KTV.

Na ausência de β-alanina adicionada, as cepas PA374 e PA354 produziram apenas cerca de 0,2 g/litro de pantotenato em culturas de tubo de teste, indicando que a atividade PanD é significantemente limitante de taxa.

Para aliviar esta limitação, o cassete amplificável P26 panD da cepa PA401 foi instalado. O DNA cromossômico de PA401 foi transformado no PA374 e PA354, selecionando para atr a 15 mg/litro, para produzir as cepas PA377 e PA365, respectivamente. Depois os transformantes foram obtidos, as cepas foram riscadas em placas contendo 30 e 60 mg/litro de tetraciclina para reamplificar o número de cópia do cassete P26 panD integrado no local bpr. Em culturas de tubo de teste cultivadas em SVY sem α-KIV ou β-alanina, uma melhora substancial nos títulos de pantotenato em relação daqueles de PA374 e PA354 foram obtidos (Tabelas 18 e 19).

Tabela 18. Produção de pantotenato pela PA365, contendo P26 panD, amplificado e controles, em culturas de tubo de teste de 24 e 36 horas cultivadas em SVY-glicose sem β-alanina ou a-KIV. n.d. = não determinado; b.d. = abaixo da detecção Tabela 19. Produção de pantotenato pela PA377, contendo P26 panD amplificado, e controles, em culturas de tubo de teste de 27 horas cultivadas em SVY-glicose ou SVY-maltose, sem α-KIV, e com ou sem β-alanina.

Em SVY com glicose, um aumento na produção de pantotenato pode ser ainda obtido pela alimentação de 5 g/litro de β-alanina sugerindo que o aumento na expressão de panD podería aumentar ainda mais a produção de pantotenato. No SVY com maltose, nenhum aumento adicional no pantotenato foi obtido pela alimentação de β-alanina sugerindo que a síntese de β-alanina e/ou de aspartato é suprimida pela glicose. As cepas PA377 e PA365 foram avaliadas em fermentadores de 10 litros, onde tipicamente produzem acima de 20 g/litro de pantotenato em 48 horas sem β- alanina e a-KIV ou valina suplementares, descritos em detalhes abaixo. EXEMPLO X: Fermentações de 10 litros de Micróbios que produzem Pantotenato O engendramento dos cassetes P26 ilvBNC e P26 ilvD para dar as cepas PA342 e PA354 permitiram a produção de 22 e 26 g/litro de pantotenato, respectivamente, sem a adição de valina ou α-KIV ao meio de fermentação (Tabela 20). Em 48 horas, ambas as cepas secretaram cerca de 0,5 g/litro de valina no meio.

Tabela 20. Fermentações de 10 litros de cinco cepas que superproduzem pantotenato. Síntese de Pantotenato em Fermentadores Com a adição do cassete P26 panD às cepas PA354 e PA374 para criar as cepas PA365 e PA377, nem a β-alanina nem o a-KIV necessitaram ser adicionados aos fermentadores. A cepa PA365 produziu 21 g/litro de pantotenato em 48 horas e 27 g/litro em 72 horas sem nenhum dos precursores adicionados ao meio (Tabela 20). A PA377 foi um pouco melhor, produzindo 18 g/litro de pantotenato em 36 horas, 22 g/litro em 48 horas, e 31 g/litro em 72 horas). A Valina foi medida em 0,85 e 1,5 g/litro para as cepas PA365 e PA377, respectivamente, em 48 horas em meio SVYG. A cepa PA377 manteve a valina entre 1 a 1,5 g/litro durante a maior parte da fermentação e a β-alanina entre 0,2 e 0,5 g/litro. A cepa PA377 foi ainda avaliada em fermentadores de 10 litros no extrato de levedura com base no meio PFMG. Os rendimentos de pantotenato no meio PFMG e SVYG foram similares. No PFMG, a PA377 produziu 19 g/litro de pantotenato em 36 horas, 25 g/litro em 48 horas, e 29 g/litro em 72 horas. No SVYG, a PA377 produziu 18 g/litro de pantotenato em 36 horas, 22 g/litro em 48 horas e 31 g/litro em 72 horas (Tabela 20). EXEMPLO XI: Conversão da Cepa PA377 a um Protótrofo de Triptofano A PA377 (Trp) foi transformada a Trp+ usando DNA cromossômico a partir da PY79 para dar a cepa PA824. Depois da re- amplifícação do cassete P26panD, a PA824 foi comparada com PA377 quanto a produção de pantotenato em culturas de tubo de teste cultivadas in SVY glicose com ou sem 5 g/litro de β-alanina (Tabela 21).

Tabela 21: derivados Trp+ de PA377: Produção de pantotenato em culturas de tubo de teste em 48 horas cultivadas em SVY glicose, ± β-alanina As cepas Trp+ desenvolveram-se em densidades ligeiramente mais altas do que a PA377. Na ausência de β-alanina exógena, todas as cepas produziram níveis de pantotenato similares, enquanto que com a adição de β- alanina, os derivados de Trp+ produziram um pouco mais de pantotenato.

Estudos de Fermentador com PA824 A PA824 foi avaliada em vasos CF3000 Chemap de 14 litros com volumes de trabalho de 10 litros. As formulações para dois dos meios usados nos fermentadores são dadas nas Tabelas 22 e 23.

Todas as fermentações foram processos em batelada alimentados limitados em glicose. Imediatamente depois da inoculação, a agitação foi ajustada a 200 rpm. A glicose a 2% inicialmente adicionada ao lote foi consumida durante o desenvolvimento exponencial. Depois disso, as concentrações de glicose foram mantidas entre 0,2 e 1,0 g/litro pela alimentação contínua de uma solução a 60% de glicose. A bomba de alimentação de taxa variável foi controlada por computador e ligada á concentração de dissolvido oxigênio [p02] no tanque por um algoritmo.

Quando a [p02] caiu a 30%, o controle computadorizado iniciou automaticamente o ajuste da taxa de agitação para manter uma concentração de oxigênio dissolvido entre 25 e 30% [p02]. O controle computadorizado e o registro de dados foram pelo software Braun MFCS.

Em um estudo, a PA284 foi cultivada em fermentadores em duas temperaturas (40°C e 43 °C) no meio descrito na Tabela 22. Os resultados de dois experimentos demonstraram que os títulos de pantotenato mais altos em pontos no tempo iniciais foram produzidos a 43°C. A massa de célula aproximou-se de 150 unidades de densidade ótica a uma OD60o e 56 horas a 43 °C, e os títulos de pantotenato foram 21 g/litro, 28 g/litro e 36 g/litro a 36, 48 e 72 horas, respectivamente. Na fermentação paralela a 40°C, a massa de célula aproximou-se a 120 unidades de densidade ótica a uma OD6oo e 56 horas, e os títulos de pantotenato foram 18 g/litro, 26 g/litro e 37 g/litro em 36,48 e 72 horas, respectivamente.

Em um outro estudo, a PA824 foi cultivada em um fermentador a 43 °C no meio descrito na Tabela 23. A massa de célula excedeu 160 unidades de densidade ótica a uma OD60o e 36 horas, e os títulos de pantotenato foram 23 g/litro, 34 g/litro, 37 g/litro e 40 g/litro em 24, 36, 48 e 60 horas, respectivamente. Em outras fermentações, aumentando-se a quantidade de elementos traço na alimentação de glicose (por exemplo, aumentando-se a concentração de SM de IX para 2X) resultou em títulos ainda mais altos de pantotenato.

EXEMPLO XII: Identificação e Caracterização do produto de gene oaA de B. subíilis A versão anotada da sequência genômica de B. subtílis disponível no site da web “Subtilist” não contém nenhum gene rotulado como coaA. Entretanto uma procura de homologia usando a sequência de proteína da pantotenato cinase de E. coli como uma sequência duvidosa deu um bom emparelhamento com o gene iqjS da B. subtilis, que é anotada como “desconhecida; similar à pantotenato cinase.” Este gene parece ser o penúltimo gene em um operon contendo cinco matrizes de leitura aberta (Figura 18). Duas das matrizes de leitura aberta codificam proteínas que são similares à D-serina desidratase e à “cetoacil reductase”; as outras duas não têm nenhuma homologia conhecida. Para a matriz de leitura aberta correspondente ao coaA, existem três códons de início possíveis; cada uma tendo um sítio de ligação de ribossoma possível (RBS) associado com ela. As três ORFs coaA potencial foram denominadas coaAl, coaA2, e coa A3, da mais longa para a mais curta.

Todas as três matrizes de leitura aberta coaA potenciais foram clonadas junto com os respectivos RBSs pela PCR seguida pela ligação no plasmídeo de expressão pAN229. O pAN229 é um vetor de cópia inferior na E. coli que fornece a expressão do promotor Pi5 do fago SP01 e pode integrar por cruzamento único no bpr com seleção de tetraciclina. Um plasmídeo representativo resultante, pAN281, é mostrado na Figura 19.

Para determinar se as ORFs de coaA clonado putativo de fato codificam uma atividade da pantotenato cinase, diversos isolados de todos os três plasmídeos foram transformados na E. coli cepa YH1, que contêm o alelo coaA15(Ts). Os transformantes foram riscados em placas incubadas a 30° e 43°C para testar quanto a complementação do alelo sensível à temperatura.

Todos os isolados de todas as três variantes coaA, exceto para um isolado de pAN282, bem complementado a 43°C, indicando que todos as três construções de plasmídeo codificam uma pantotenato cinase ativa.

Consequentemente, pode ser concluído que a matriz de leitura aberta iqjS de B. subtilis codifica uma pantotenato cinase ativa. EXEMPLO XIII: Supressão do gene coaA do genoma de B. subtilis O gene coaA de B. subtilis (iqjS) foi suprimido do cromossoma de uma cepa de B. subtilis por meios convencionais. A maior parte da sequência codificadora coaA foi suprimida de um clone plasmídico e substituída por um gene de resistência ao cloranfenicol (cat), enquanto se deixou aproximadamente 1 kb de sequência à montante e à jusante para permitir a recombinação homóloga dentro do cromossoma, para dar o plasmídeo pAN296 (ver a Figura 17). O pAN296 foi depois usado para transformar uma cepa do B. subtilis (PY79), selecionando quanto a resistência ao cloranfenicol. A maior parte dos transformantes resultaram de um cruzamento de evento duplo que substitui eficazmente o gene cat no lugar de um gene coaA. A cepa transformada contendo a supressão de coaA - inserção de cat desenvolveu-se normalmente devido à presença de uma segunda pantotenato cinase de B. subtilis que codifica o gene aqui descrito. EXEMPLO XIV: Identificação e Caracterização de um Segundo Gene de B. subtilis que Codifica a Atividade da Pantotenato Cinase Como descrito em detalhes no presente relatório descritivo, de modo a maximizar a produção de pantotenato, é necessário restringir o fluxo de pantotenato na direção da coenzima A (CoA), por exemplo, pela redução da atividade de pantotenato cinase, a primeira enzima no caminho do pantotenato para CoA. Depois descobrindo que a supressão do gene coaA do cromossoma de B. subtilis não é um evento letal (ver o Exemplo XIII), foi concluído que a B. subtilis deve conter um segundo gene que codifica uma pantotenato cinase ativa, visto que a pantotenato cinase é uma atividade de enzima essencial.

Um segundo gene que codifica a pantotenato cinase foi identificado pela complementação da cepa YH1 da E. coli (coaA15(Ts)) com um banco de gene da B. subtilis e selecionando quanto a transformantes que foram capazes de desenvolver a 43° C. Descoberto entre os transformantes estavam duas famílias dos plasmídeos que tiveram mapas de restrição em sobreposição dentro de cada uma das famílias, mas não entre as famílias.

Como suposto, o mapa de restrição de uma família foi idêntica àquele prognosticado a partir da sequência genômica de B. subtilis para o homólogo do gene coaA da E. coli (que nós denominamos também coaA, ver acima) e as sequências circundantes. As outras famílias tiveram um mapa de restrição que não estava completamente em sobreposição com o primeiro. O sequenciamento de DNA das extremidades dos insertos clonados da segunda família mostrou que os clones vieram de uma região do cromossoma da B. subtilis que inclui a extremidade 3’ do gene ftsH, a extremidade 5’ do gene sul, e todos dentre os genes yacB, yacC, yacD, cisK, pabB, pabA e pabC. Numa das matrizes de leitura aberta destes insertos clonados apresentaram homologia a qualquer uma das sequências da pantotenato cinase conhecidas, fossem procarióticas ou eucarióticas.

Diversa supressões foram criadas através das sequências genômicas da B. subtilis nos insertos clonados. Cada supressão foi testada quanto a complementação pantotenato cinase sensível à temperatura da E. coli. Em particular, uma supressão que removeu todo o DNA entre um sítio Stu I no vetor de clonagem e um sítio Swa I no gene yacC, deixa yacB como a única matriz de leitura aberta intacta no inserto clonado (ver a Figura 21).

Este plasmídeo suprimido ainda complementou a pantotenato cinase mutante da E. coli. Entretanto, uma outra supressão que removeu o DNA do sítio Swa I no yacC através de um sítio Bstl 1071 no gene ftsH (já truncado), pode não complementar a pantotenato cinase mutante de E. coli. A partir destes resultados, foi concluído que a matriz de leitura aberta yacB foi responsável pela atividade de complementação. Para confirmar que o yacB é um gene da pantotenato cinase, a ORF de yacB mais 112 pares de base a jusante da sequência flanqueadora foi amplificado pela PCR em duas reações independentes e clonado à jusante de um promotor constitutivo para dar os plasmídeos pAN341 e pAN342 (Figura 22). Tanto o pAN341 quanto o o pAN342 complementou o defeito no YH1 a 44 C, enquanto um plasmídeo de controle, que tem a mesma espinha dorsal, mas expressa panBCD ao invés de yacB não o fez. Isto confirmou que a matriz de leitura aberta de yacB foi responsável para a complementação de YH1.

Como tal, um novo gene que codifica a atividade da pantotenato cinase na B. subtilis foi descoberto o qual não está relatado pela homologia a qualquer gene da pantotenato cinase anteriormente conhecida.

Este gene foi renomeado coaX, como um segundo, gene alternativo que codifica uma enzima que catalisa a primeiro etapa no caminho do pantotenato para CoaA. A supressão de coaX pelos métodos descritos acima para suprimir a coa A, em conjunção com a redução na atividade da enzima CoaA, fornece um meio para reduzir a atividade da pantotenato cinase ao nível desejado.

Diversos homólogos do gene coaX da B. subtilis foram identificados pela procura de homologia de vários bancos de dados publicamente disponíveis usando a sequência da matriz de leitura aberta de yacB (coaX) publicada e a sequência de aminoácido prognosticada (como apresentado na SEQ ID NOs: 84 e 85 respectivamente). Nos dois casos (Mycobacterium tuberculosis e Streptomyces coelicolor) os genes homólogos coaX são adjacentes ou quase adjacentes aos genes biossintéticos de pantotenato, compatíveis com estes homólogos tendo um papel no metabolismo de pantotenato. As proteínas CoaX não apresentam nenhuma homologia á família de CoaA de pantotenato cinases, nem à família eucariótica de pantotenato cinases exemplificadas pelo PanK de Saccharomyces cerevisiae. O alinhamento das sequências de aminoácido de diversos homólogos de CoaX bacterianos com a sequência de aminoácido prognosticada a partir da translação da ORF de yacB da B. subtilis descrita na sequência genômica de B. subtilis publicada revelou que as proteínas de CoaX das outras bactérias contiveram resíduos de aminoácido adicionais nas suas extremidades de terminal de carbóxi. Além disso, estas extensões para além da extremidade do aminoácido prognosticado para o produto de gene da B. subtilis contiveram dois segmentos de sequência relativamente bem conservados. A tradução das sequências de nucleotídeo exatamente à jusante do códon de parada da ORF de yacB da B. subtilis em uma matriz de leitura diferente revelou a existência das sequências de aminoácido muito similares às extensões de terminal carbóxi de outras proteínas CoaX

bacterianas. Acredita-se assim que exista um erro na sequência de DNA publicada da sequência de ORF de yacB da B. subtilis que causa uma mudança ma matriz que leva a uma sequência de aminoácido à jusante artificial e à terminação prematura.

As sequências geradas por PCR de CoaX da B. subtilis em pAN341 e pAN342 (descritas acima) contêm bastante sequência flanqueadora à jusante para codificar a extensão de terminal carbóxi putativa descrita acima, que é compatível com o resultado de que os clones foram funcionais no ensaio de complementação. Entretanto quando o iniciador de PCR 3’ foi posicionado para incluir apenas a ORF de yacB mais curta prognosticada a partir da sequência publicada, mas não para incluir a extensão de terminal carbóxi putativa, então os plasmídeos resultantes, pAN329 e pAN330 (similares em estrutura aos pAN341 e pAN342; ver a Figura 22), não complementam o defeito no YH1. Este resultado sustenta a noção de que a sequência codificadora yacB publicada contém um erro de mudança de matriz, e que a extremidade do terminal carbóxi de CoaX é necessária para a atividade da pantotenato cinase, A sequência de nucleotídeo prognosticada correta para o coaX da B. subíilis é apresentada como a SEQ

ID NO: 19 e a sequência de aminoácido traduzida é apresentada como a SEQ ID NO: 9. Um alinhamento da sequência múltipla das sequências de aminoácido de CoaX da B. subtilis e 11 homólogos deste estão apresentados na Figura 23. EXEMPLO XV: Geração de Gene coaA Mutantes que Codificam a Pantotenato Cinase Tendo Atividades Reduzidas ou Sensíveis à Temperatura Este exemplo descreve estratégias para modificar o gene coaA (isto é, pela introdução de mutações de ponto) para reduzir a atividade de pantotenato cinase depois que o coaX é suprimido do genoma.

Clonagem e sequenciamento do alelo do gene coaA da E. coli sensível à temperatura.

Duas cepas da E. coli, cada uma exibindo um fenótipo do mutante CoaA diferente, foram obtidas a partir do E. coli Genetic Stock Center. A cepa DV62 contém o alelo coaA15(Ts), e a DV79 contém a mutação coaA16(Fr). A DV62 é sensível à temperatura a 43°C e produz uma pantotenato cinase que é sensível à temperatura. A DV79 foi obtida pela reversão de DV62 para a resistência à temperatura, e produz uma atividade da pantotenato cinase resistente à realimentação, estável à temperatura. Visto que as sequências de DNA destes alelos não estão disponíveis na literatura, os genes coaA das duas cepas mutantes foram clonados pela PCR e sequenciados, além de um gene coaA de uma cepa que é do tipo selvagem no local coaA, MM294. O iniciador de PCR na extremidade 5’ foi planejado para incluir o códon de início mais quatro bases à montante, e adicionados em um sítio de ligação de ribossoma (RBS) arbitrariamente escolhido. Os três fragmentos de PCR gerados foram cada um ligados entre os sítios Xbal e BamHI de pAN229 para dar pAN284 (a partir de coaA15(Ts)), pAN285 (a partir do coaA do tipo selvagem), e pAN286 (a partir de coaA16(Fr)). O pAN229 é uma cópia inferior do vetor da E. coli que fornece a expressão do promotor Pi5 e que pode integrar o cruzamento único no bpr na B. subtilis com seleção de tetraciclina.

Todos os três plasmídeos foram transformados na cepa YH1 da E. coli para os testes de complementação. Todos os três plasmídeos complementaram a mutação coaA sensível à temperatura na E. coli YH1. E pressuposto que o gene coaA15(Ts) no pAN284 é provavelmente superexpresso de modo significante em relação ao gene de cromossoma normal, tal que a superprodução compense quanto ao defeito de sensíveis à temperatura. A complementação de um defeito pela superprodução é um fenômeno bem documentado na E. coli.

As regiões codificadoras de coaA de pAN284, 285, e 286 foram subclonadas no pGEM7 para dar pAN306, 307, e 308, respectivamente, para o sequenciamento de DNA. Como suposto, a sequência de DNA do inserto no pAN307 (a partir do coaA do tipo selvagem) emparelhou com a sequência coaA do banco de dados de genoma da E. coli (GenBank®). A sequência de pAN306 contém uma única mudança de base que causa uma substituição S176L (isto é, uma substituição de Ser Leu na sequência de aminoácido apresentada como a SEQ ID NO: 2).

Interessantemente, a sequência de DNA do inserto pAN308, derivado da cepa resistente à realimentação, foi idêntica àquela derivada da sua precursora sensível à temperatura (representada no pAN306). Isto está de acordo com os dados genéticos que indicam que a reversão da mutação sensível à temperatura ocorreu em um segundo sítio diferente do gene coaA. A mutação S176L, prognosticada causar o defeito sensível à temperatura na pantotenato cinase da E. coli, mudou um resíduo de serina que é conservado em todas as pantotenato cinases conhecidas ou suspeitadas codificadas pelo coaA bacteriano, incluindo aquelas de B. subtilis (ver a SEQ ID NO: 3 e referências ao alinhamento). Com base nisto, uma mudança de serina para leucina nos resíduos homólogos na pantotenato cinase de B. subtilis é prognosticada resultar in uma enzima sensível à temperatura ou em uma que seja menos ativa. Consequentemente, para produzir um gene de coaA da B. subtilis mutante, esta mudança específica foi introduzida no gene coaA da B. subtilis. A versão mutante é instalada no cromossoma de uma cepa da B. subtilis suprimida quanto ao coaX, por exemplo, e o micro- organismo recombinante é checado quanto á sensibilidade à temperatura (por exemplo, desenvolvimento reduzido a 43° C). A mutação é depois instalada em uma cepa que superproduza o pantotenato, preferivelmente uma cepa suprimida para o gene coaX acima mencionado por métodos padrão para dar cepas favoráveis quanto a produção de pantotenato na B. subtilis, isto é, uma cepa que tenha atividade reduzida da pantotenato cinase sob condições típicas de fermentação.

Mutações de Ponto de coaA Adicionais Resultando na Atividade Reduzida da Pantotenato Cinase Claro que é esperado que muitas outras mutações de ponto ou combinações de mais do que uma mutação de ponto no coaA da B. subtilis também levará à atividade reduzida. Mutações apropriadas podem ser geradas pela reação de cadeia de polimerase mutagênica e de recombinação in vitro, e identificadas pela avaliação quanto aos alelos que complementam deficientemente o mutante coaA15(Ts) da E. coli. Um exemplo de tal mutação deste tipo é uma substituição de tirosina para histidina no aminoácido 181 do coaA da B. subtilis, gerada pela reação de cadeia de polimerase mutagênica (ver a SEQ ID NO: 3 e a primeira linha do alinhamento da Figura 24). Ο ρΑΝ282Α isolado foi derivado a partir da matriz de leitura aberta do coaA da B. subtilis de tamanho médio descrita no Exemplo XII. O pAN282A complementou o mutante coaA15(Ts) da E. coli de modo muito deficiente, mas não obstante a um nível que foi detectável acima do fundo.

Como foi feito para os clones coaA da E. coli, a matriz de leitura aberta de pAN282A foi subclonada no pGEM7 para dar pAN303. A sequência de DNA do inserto no pAN303 apresentou uma única mudança de base que levou a uma mudança de aminoácido de tirosina para histidina na tirosina correspondente a Y181 da SEQ ID NO: 3. Este resíduo de tirosina é conservado em todos os genes coai/homólogos bacterianos presentes no GenBank (Figura 24). Este resíduo de tirosina e a serina que é alterada na pantotenato cinase sensível à temperatura da E. coli descrita acima são separados por apenas três resíduos de aminoácido em uma região que é altamente conservada nas pantotenato cinases bacterianas ao passo que a sequência de DNA de um segundo isolado da matriz de leitura aberta de tamanho médio, de pAN282B, foi idêntica à sequência do tipo selvagem do projeto de sequenciamento do genoma da B. subtilis. A única mudança de base encontrada no pAN303 provavelmente ocorreu durante a amplificação por PCR do gene coaA. Se esta variante de coaA2 tem atividade biológica residual suficiente na B. subtilis, pode ser útil no futuro para fornecer atividade reduzida da pantotenato cinase.

Um plasmídeo preferido que pode servir como uma base para mutagenizar a matriz de leitura aberta do coaA é o pAN294 (ver por exemplo, a Figura 25 e o Exemplo XII). Em resumo, a PCR mutagênica é realizada usando-se o pAN294 como um padrão e variantes de coaA tendo atividade reduzida da pantotenato cinase são avaliadas como descrito acima.

Altemativamente, as mutações tais como um isolado no pAN282A podem ser instaladas no pAN294. A mutação desejada é depois introduzida no cromossoma de uma cepa do B. subtilis pela transformação com o derivado de pAN294 apropriado e selecionada quanto a resistência ao cloranfenicol a 5 mg/litro. Entre os transformantes resultantes serão isolados os que contêm a mutação desejada.

De uma maneira similar, as mutações que reduzem a atividade da enzima CoaX podem ser geradas e identificadas, e tais mutações usadas para otimizar a produção de pantotenato pela redução da produção de CoA como descrito acima. EXEMPLO XVT: Supressão do segundo gene da pantotenato cinase, o gene coaX da B. subíilis Com o conhecimento adquirido acima no que diz respeito à existência e á natureza de coaX, pode-se criar uma supressão da matriz de leitura aberta do coaX a partir do cromossoma da B. subíilis que removerá a atividade codificada, e que não afetará adversamente a expressão dos genes à jusante de coaX. Em tal cepa suprimida, o gene coaÁ será o único gene que codifica a pantotenato cinase.

Para suprimir o gene coaX da B. subíilis, o plasmídeo pAN336 (SEQ ID NO: 92), que contém à montante e à jusante homologia para o cruzamento duplo, foi construído com um gene de resistência à canamicina substituindo a maior parte da ORF de coaX (Figura 26). A cepa PY79 foi transformada para resistência à canamicina pelo pAN336, e um isolado confirmado ter resultado de um cruzamento duplo pela PCR foi denominado PA876. Como prognosticado, a supressão de coaX por si só não é letal para a B. subíilis. Além disso, o DNA cromossômico de PA876 não pode transformar ο PA861 competente (PY79 àcoaA v.caí) para resistência à canamicina. Estes resultados indicam que é a combinação de ΔcoaAv.caí e XcoaX :: kan que é letal para a B. subíilis, confirmando que a B. subíilis contém dois genes não ligados que codificam a pantotenato cinase, coaA e coaX, e que cada um dos genes sozinho é capaz de fornecer pantotenato cinase suficiente para uma taxa de desenvolvimento normal. EXEMPLO XVII: Construção de um plasmídeo planejado para permitir a mutagênese direta do gene coaA da B. subtilis De modo a introduzir facilmente os genes coaA mutados no cromossoma da B. subtilis, foi necessário instalar um gene de resistência a antibiótico adjacente ao gene coaA. Isto foi realizado unindo-se juntos no vetor pGEM5 três fragmentos de DNA: (1) uma sequência de DNA de 3,4 kb contendo 2,5 kb de sequência genômica à montante de coaA e da(s) matriz(es) de leitura aberta de coaA; (2) uma sequência de DNA de 1,1 kb contendo um gene de resistência ao cloranfenicol (cat); e (3) uma sequência de DNA de 1.4 kb compreendendo uma região à jusante do operon que contém o coaA. O plasmídeo resultante, denominado pAN294, eficazmente substitui a matriz de leitura aberta iqjT (a matriz de leitura aberta exatamente à jusante de coaA) com o gene cat, com homologia suficiente flanqueando ambos os lados do gene cat para permitir a recombinação dupla no cromossoma da B. subtilis (Figura 25). O pAN294 foi transformado na cepa PY79 da B. subtilis, selecionando-se quanto a resistência ao cloranfenicol a 5 mg/litro para dar as cepas PA836 e PA837, que são presumivelmente idênticas. A PA836 e a 837 foram checadas pela PCR de diagnóstico para mostrar que o gene cat foi integrado pelo cruzamento duplo, como oposto ao cruzamento único. A PA836 e a PA837 desenvolveram-se normalmente, o que leva à conclusão de que a matriz de leitura aberta iqjT não é essencial (isto é, a matriz de leitura aberta iqjT pode ser suprimida das cepas PA836 e PA837 sem nenhum efeito signifícante no desenvolvimento ou na produção de pantotenato). Assim, alelos variantes (isto é, mutações) do gene coaA podem ser introduzidos no pAN294 e os plasmídeos resultantes podem ser usados para introduzir os alelos variantes no cromossoma de, por exemplo, uma cepa da B. subtilis. EXEMPLO XVIII: Geração de genes mutantes de coaX que codificam a pantotenato cinase tendo atividades reduzidas ou sensíveis à temperatura Os genes mutantes de coaX são gerados pela introdução de mutações de ponto no gene e testando-se os mutantes resultantes quanto a capacidade para complementar a cepa YH1 da E. coli como descrito no Exemplo XII. As mutações preferidas nas sequências do gene coaX são aquelas que codificam uma substituição de um resíduo conservado entre as sequências CoaX de uma variedade de fontes bacterianas (por exemplo, um resíduo conservado apresentado na Figura 23). Altemativamente, mutações aleatórias na sequência do gene coaX são geradas pela PCR mutagênica e pela recombinação in vitro e identificadas pela avaliação quanto a alelos que deficientemente complementam o mutante coaA15(Ts) da E. coli.

Os mutantes assim gerados (isto é, os mutantes tendo atividade coaX reduzida) podem ser ainda engendrados tal que o gene coaA endógeno seja suprimido (como descrito no Exemplo XIII). Os mutantes de CoaX de atividade reduzida também podem ser ainda engendrados para conter produtos de gene de CoaA de atividade reduzida como descrito no Exemplo XV. EXEMPLO XIX: Produção Realçada de Panto-Compostos Usando Bactérias Tendo Supressões em Uma ou Mais das Enzimas Biossintéticas do Pantotenato Se o panto-composto desejado não é pantotenato, então uma supressão apropriada de um ou mais dos genes biossintéticos do pantotenato a partir de uma cepa que superproduza o pantotenato fornecerá uma cepa que produz o dito panto-composto desejado. Neste exemplo, o panto-composto desejado é o pantoato. Partindo-se com, por exemplo, a cepa PA236, PA313 ou PA824 um ou ambos dos genes panC e panD são suprimidos. Em um outro exemplo, o cetopantoato é o panto-composto desejado. Iniciando-se com, por exemplo a cepa PA244, PA245 ou PA824 um, dois ou todos dos genes ilvC, panE\,panC epanD são suprimidos da cepa de partida. Se a β- alanina é o panto-composto desejado, então panB e panC podem ser suprimidos, preferivelmente de uma maneira que deixe uma fusão na matriz de uma parte pequena da extremidade 5’ de panB com uma parte pequena da extremidade 3’ de panC, a partir da cepa PA221, PA235, PA245 ou PA313.

Em todos dos exemplos acima mencionados, a cepa que produz o panto- composto será uma auxótrofa em pantotenato. Consequentemente, o meio de desenvolvimento requer pantotenato suficiente para o desenvolvimento adequado. Os vetores planejados para superexpressar panD como descrito acima são depois transformados nas cepas acima para realçar ainda mais a produção de β-alanina.

As supressões acima mencionadas são realizadas por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, pela inserção de um gene de resistência a antibiótico e remoção de sequência suficiente do(s) gene(s) alvo(s) para inativar o(s) dito(s) gene(s) alvo(s).

Altemativamente, a remoção de sequências alvejadas é realizada sem a introdução simultânea de um gene de resistência a antibiótico no dito gene alvo e depois introduzido pela congregação (co-transformação com qualquer outra sequência de DNA selecionável apropriada) seguido pela avaliação quanto a perda de função do dito gene alvo pela plaqueação de réplica. EQUIVALENTES Aqueles habilitados na técnica reconheceram ou serão capazes de averiguar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as formas de realização específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes são intencionados a estarem abrangidos pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Método de produzir um panto-composto, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo que superexpressa aspartato-a-descarboxilase, tendo atividade de panD e/ou pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato de Bacillus sob condições tais que o panto-composto seja produzido, sendo que o método é independente da necessidade de alimentação de beta-alanina, e o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato do Bacillus subtilis.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a enzima biossintética de pantotenato é selecionada do grupo que consiste em cetopantoato hidróxi-metil-transferase, pantotenato sintetase e cetopantoato reductase.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa pelo menos duas enzimas biossintéticas do pantotenato.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa pelo menos três enzimas biossintéticas do pantotenato.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o panto-composto é selecionado do grupo que consiste em pantotenato, pantoato, cetopantoato e β-alanina.

7. Método de produzir um panto-composto, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo que superexpressa a aspartato-a-descarboxilase, tendo atividade de panD e/ou cetopantoato reductase (KPAR-O) sob condições tais que o panto-composto seja produzido, sendo que o método é independente da necessidade de alimentação de beta-alanina, e o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o panto-composto é pantotenato ou pantoato.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a cetopantoato reductase é derivada de bactéria.

10. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a cetopantoato reductase é derivada de Bacillus.

11. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a cetopantoato reductase é derivada de Bacillus subtilis.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 all, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo KPAR-0 ainda superexpressa pelo menos uma enzima biossintética de pantotenato além de superexpressar a cetopantoato reductase e/ou aspartato-a-descarboxilase.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo KPAR-0 ainda superexpressa pelo menos uma enzima dentre cetopantoato hidróxi-metil-transferase e pantotenato sintetase.

14. Método de produzir pantotenato, em que o pantotenato é produzido em um nível selecionado do grupo que consiste em a pelo menos 2 g/litro e a pelo menos 30 g/litro, de uma maneira independente da alimentação de aspartato ou β-alanina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo que superexpressa a aspartato-a-descarboxilase (AaD- 0), sob condições tais que o pantotenato seja produzido, sendo que o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

15. Método de produzir pantotenato, em que o pantotenato é produzido em um nível selecionado do grupo que consiste em a pelo menos 2 g/litro e a pelo menos 30 g/litro, de uma maneira independente de alimentação de valina ou α-ceto-isovalerato, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo tendo um caminho biossintético de isoleucina- valina (ilv) desregulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido, sendo que o método é independente da necessidade de alimentação de beta- alanina, e o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

16. Método de produzir pantotenato com produção com alto rendimento independente de β-alanina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo manipulado sob condições tais que o pantotenato seja produzido em um rendimento em um nível maior do que 10 g/litro, 20 g/litro, 30 g/litro ou 40 g/litro, sendo que o método é independente da necessidade de alimentação de beta-alanina, e o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa aceto-hidróxi-ácido sintetase derivada de Bacillus ou é transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico ilvBN ou uma sequência alsS derivada de Bacillus, em que a enzima superexpressa tem atividade ilvBN.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa a aceto-hidróxi-ácido isômero-reductase derivada de Bacillus ou é transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico ilvC derivada de Bacillus, em que a enzima superexpressa tem atividade ilvC.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa a di- hidróxi-ácido desidratase derivada de Bacillus ou é transformado com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico de ilvD derivada de Bacillus, em que a enzima superexpressa tem atividade ilvD.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa a aspartato-a-descarboxilase derivada de Bacillus ou é transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panD derivada de Bacillus, em que a enzima superexpressa tem atividade panD.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 20, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo ainda tem um caminho biossintético do pantotenato desregulado.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo superexpressa qualquer enzima dentre cetopantoato hidróxi-metil-transferase, cetopantoato reductase, pantotenato sintetase e aspartato-a-descarboxilase derivadas de Bacillus.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é transformado com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panBCD ou um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico de panEl derivada de Bacillus.

24. Método de produzir β-alanina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo que superexpresse a aspartato- α-descarboxilase (AaD-O) sob condições tais que β-alanina seja produzida, sendo que o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo AaD-0 tem uma mutação em uma sequência de ácido nucleico que codifica uma enzima biossintética de pantotenato selecionada do gmpo que consiste em cetopantoato hidróxi-metil- transferase, cetopantoato reductase e pantotenato sintetase.

26. Método de aumentar a produção de um panto-composto, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo que tenha um caminho biossintético do pantotenato desregulado e que também tenha uma mutação que resulte na atividade reduzida da pantotenato cinase sob condições tais que a produção do panto-composto seja realçada, sendo que o método é independente da necessidade de alimentação de beta-alanina, e o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um micro- organismo pertencente a um gênero selecionado do grupo que consiste em Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci, Streptomyces e Bacillus, preferencialmente Bacillus subtílis.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a recuperação do panto-composto.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 23, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a recuperação do pantotenato.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou 26, ou 27 a 28, caracterizado pelo fato de que o panto-composto é produzido em um nível maior do que 2 g/litro.

31. Micro-organismo recombinante empregado no método como definido nas reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que superexpressa a aspartato-a-descarboxilase e tem um caminho biossintético de isoleucina-valina (ilv) desregulado, sendo que o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

32. Micro-organismo recombinante empregado no método como definido nas reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que tem um gene coaX mutante, o dito gene coaX mutante codificando a atividade da pantotenato cinase reduzida no dito micro-organismo, e que tem ainda um gene coaA mutante, o dito gene coaA mutante codificando a atividade da pantotenato cinase reduzida no dito micro-organismo, sendo que o dito micro- organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

33. Micro-organismo recombinante empregado no método como definido nas reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende um vetor compreendendo um gene coaX isolado, sendo que o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

34. Micro-organismo recombinante empregado no método como definido nas reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que superproduz um panto-composto, o micro-organismo tendo um caminho biossintético do pantotenato desregulado e tendo pelo menos uma mutação que resulta em uma diminuição na capacidade do micro-organismo para sintetizar a coenzima A (CoA), e que tem pelo menos uma mutação que resulta em um nível de atividade da pantotenato cinase reduzido, sendo que o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Serratia, Proteus e Saccharomyces.

35. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que tem uma mutação em um gene coaA ou homólogo deste, e tendo uma mutação em um gene coaX ou homólogo deste, as mutações resultando em níveis de atividade da enzima CoaA reduzidos e de atividade da enzima CoaX reduzidos.

36. Micro-organismo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que ainda tem um caminho biossintético do pantotenato desregulado.

37. Micro-organismo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizado pelo fato de que tem ainda um caminho biossintético de isoleucina-valina (ilv) desregulado.

38. Micro-organismo recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 a 37, caracterizado pelo fato de que é Gram positivo.

39. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que é pertencente a um gênero selecionado do grupo que consiste em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Lactococci e Streptomyces.

40. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que é pertencente ao gênero Bacillus.

41. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que é a Bacillus subtilis.

42. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 59.

43. Vetor empregado no método como definido nas reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo fato de que compreende um gene coaXisolado, preferencialmente um gene coaX isolado de Bacillus subtilis.

44. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que ainda compreende sequências reguladoras.

45. Vetor de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que as sequências reguladoras compreendem um promotor constitutivamente ativo.

46. Vetor de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o promotor constitutivamente ativo compreende as sequências Pveg (SEQ ID NO: 41), P15 (SEQ ID NO: 39) ou P26 (SEQ ID NO: 40).

47. Vetor de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que as sequências reguladoras compreendem pelo menos um sítio de ligação de ribossoma (RBS) artificial.

48. Vetor de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o RBS artificial compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 57.

49. Vetor, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em pAN004 (SEQ ID NO: 93), pAN005, pANOOó (SEQ ID NO: 94), pAN236 (SEQ ID NO: 77), pAN423 (SEQ ID NO: 78), pAN428, pAN429 (SEQ ID NO: 79), pAN441, pAN442, pAN443 (SEQ ID NO: 80), pAN251 (SEQ ID NO: 81), pAN267 (SEQ ID NO: 82), pAN256, pAN257, pAN263 (SEQ ID NO: 83), pAN240 (SEQ ID NO: 76), pAN294 (SEQ ID NO: 72), pAN296 (SEQ ID NO: 73), pAN336 (SEQ ID NO: 92), pAN341 e pAN342.

50. Micro-organismo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de acordo com a reivindicação 42 ou 44, sendo que o dito micro-organismo é um micro-organismo recombinante selecionado do grupo consistindo em Bacillus, Corynebacterium, Lactobacillus, Streptomyces, Salmonella, Escherichia, Klebsiela, Serratia, Proteus e Saccharomyces.