BRPI0014481B1 - construto e uso do mesmo para regular a expressão de um gene exógeno em uma planta transgênica - Google Patents

Abstract

"promotor para regulagem de expressão de genes estranhos". a presente invenção refere-se a um promotor para regulagem da expressão de genes estranhos em organismos transgênicos, que compreende um promotor tendo as características de identificação de um promotor tendo a sequência selecionada do grupo consistindo em sequências mencionadas nas seq id nos: 1 a 3 e fragmentos funcionais ou derivados destes, em que o referido promotor é adaptado para ser operacionalmente localizado com respeito ao referido gene estranho para expressão do referido gene.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CONSTRUTO E USO DO MESMO PARA REGULAR A EXPRESSÃO DE UM GENE E-XÓGENO EM UMA PLANTA TRANSGÊNICA".

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO (a) Campo da Invenção A invenção refere-se a um construto para regular a expressão de genes exógenos em um organismo transgênico, particularmente em uma espécie específica de folhas em plantas transgênicas. (b) Descrição da Técnica Anterior A transformação genética de micróbios foi empregada durante mais do que 15 anos para produzir moléculas recombinantes úteis, e aplicações nas indústrias farmacêuticas, cosméticas e dermatológicas estão sendo atualmente exploradas. Esta tecnologia foi expandida de micróbios para plantas e animais nos últimos dez anos com o desenvolvimento de técnicas requeridas para adaptar este conceito geral aos organismos eucarióticos complexos. Basicamente um gene codificando para uma proteína de interesse ou um gene codificando para uma enzima responsável por uma modificação de uma trilha metabólica que induz a uma molécula de interesse, é ligado em um estilo apropriado as seqüências reguladoras cis e trans-atuantes, e transferidas para uma célula alvo onde é incorporada na maquinária molecular (em um estilo transitório ou estável). A célula transgênica, ou um tecido ou organismo regenerado da célula transgênica realizará então a transcrição e translação do transgene e portanto será capaz de acumular a proteína de interesse ou realizará a nova reação metabólica por meio da atividade da enzima de interesse. O aparecimento de indústria de cultivo molecular é uma das mais promissoras indústrias do século vindouro. Sua promessa é fornecer fabricas de moléculas seguras e renováveis para a indústria. Entre as aplicações que são atualmente desenvolvidas são a produção de anticorpos monoclonais de baixo custo para os usos terapêuticos e diagnósticos, a produção de quantidades ilimitadas de hormônio, citocinas e outras moléculas bioativas para o tratamento de doenças crônicas ou letais, a produção de substitutos biosseguros para vários componentes do sangue, a produção de quantidades ilimitadas de enzimas de processamento para a indústria de alimentos e polpa, a produção de enzimas de baixo custo para tratamentos de lixo, e a produção de moléculas bioativas seguras para a indústria cosmética.

Limitações para a aplicação desta tecnologia têm freqüentemen-te vindo da incapacidade de organismos transgênicos para acumular quantidades adequadas do produto recombinante, como um resultado de baixas taxas de transcrição, união imprópria do mensageiro, instabilidade do mRNA exógeno, fracas taxas de translação, hipersuscetibilidade da proteína recombinante para a ação de proteases endógenas de hipersuscetibilidade do organismo recombinante para a proteína estranha que resulta em crescimento impróprio e limitado ou nos casos piores, em fortes efeitos deletérios ao organismo hospedeiro. A impropriedade de nível de produção tem um impacto direto no desenvolvimento de aplicações quando as margens de benefício são estreitas, ou quando o tratamento e/ou disposição de matérias residuais causa biossegurança ou problemas ambientais. O melhoramento do nível de acúmulo do produto recombinante desejado desse modo parece ser um fator crítico que garante a comercialização de muitas aplicações de agricultura molecular. A fotossíntese é uma reação metabólica de importância superior no mundo vivente. Ela é realizada pela maioria das algas e plantas terrestres, e por algumas bactérias. Esta reação total envolve uma reunião complexa de proteínas de transferência de elétron espacialmente disposta dentro do sistema de membrana tilacóide localizada no cloroplasto de células de folha. Esta cadeia de transporte de elétron é acoplada em uma extremidade com a antena fotossintética, que compreende uma variedade de macromolé-culas, incluindo uma molécula comum a todo o organismo fotossintético, clorofila, e na outra extremidade, para as enzimas envolvidas em síntese de NADPH e ATP, e ao ciclo Calvin, envolvido no acoplamento da liberação de energia de NADPH e ATP com a fixação de dióxido de carbono gasoso em moléculas orgânicas. Entre as proteínas envolvidas na reação fotossintética total, uma carboxilase de bifosfato de Ribulose (Rubisco), é a proteína mais abundante na terra. A fotossíntese é, portanto, o que as células de folha são dedicadas a realizar, e existe um interesse óbvio no uso de promotores de genes envolvidos em tal atividade metabólica específica de tecido proeminente, através da construção de potentes cassetes de expressão específicos de folha para aplicações em biotecnologia de planta.

Muitos dos constituintes peptídicos dos mecanismos fotossintéti-cos são codificados por genes presentes no genoma cloroplástico; como um exemplo, a subunidade pesada de Rubisco, que suporta os sítios catalíticos para fixação de C02, é codificada por um gene cloroplástico. Entretanto, a pequena subunidade desta enzima é codificada por um gene nuclear, e desse modo a holo-proteína Rubisco é feita de subunidades codificadas por dois diferentes genomas. Por razões óbvias, tem existido um grande interesse em tentar usar os promotores Rubisco para controlar a transcrição de trans-genes em folhas de plantas transgênicas. O promotor tem sido extensivamente caracterizado e seu uso em vetores de expressão é protegido pela patente U.S. n° 4.962.028.

Seria altamente desejável ser provido com um promotor para regular a expressão de genes exógenos em um organismo transgênico, mais especificamente em plantas transgênicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é suprir com um promotor para a regulação de expressão de genes exógenos em um organismo transgênico, mais especificamente em plantas transgênicas.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, é fornecido um promotor para regular a expressão de genes exógenos em organismos transgênicos, que compreendem um promotor tendo as características de identificação de um promotor tendo uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seqüências mencionadas nas SEQ ID NOS: 1 a 3 e fragmentos funcionais ou derivados destes, onde o referido promotor é adaptado para ser operacionalmente localizado com respeito ao referido gene exógeno para expressão do referido gene. O promotor preferido da presente invenção tem uma seqüência selecionada do grupo consistindo em seqüências mencionadas nas SEQ ID NOS: 1 a 3.

Preferivelmente, o organismo é uma planta.

Preferivelmente, o promotor da presente invenção pode ser modulado pela presença ou ausência de luz. A planta preferida é uma dicot, uma monocot ou uma gimnos- perma.

De acordo com outra modalidade da presente invenção, é fornecido um método de regular a expressão de genes exógenos em organismos transgênicos, compreendendo as etapas de : a) preparar um organismo transgênico empregando-se um construto de expressão consistindo em pelo menos um promotor da presente invenção, e uma ORF de um gene, onde o referido promotor é operacionalmente localizado com respeito ao referido gene para a expressão do referido gene.

Para o propósito da presente invenção os seguintes termos são definidos abaixo : A expressão "fragmentos funcionais ou derivados destes" é destinada a significar qualquer derivado ou fragmento de seqüências SEQ ID NOS: 1-3 que levam em consideração um nível equivalente de expressão de um gene exógeno como o promotor da presente invenção mencionado nas SEQ ID NOS: 1 - 3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O seguinte é uma descrição detalhada do método empregado para gerar cepas de alfafa transgênica que pode ser reguladas em sua expressão de um gene repórter.

Nesta modalidade, um promotor tendo a seqüência mencionada nas SEQ ID NOS: 1 - 3 foi então ligado a um gene repórter e um terminador, e este construto foi inserido em vetores de expressão de planta adequados para bombardeio de DNA sobre folhas de alfafa e para transferência de DNA mediada por Agrobactéria como descrito por Desgagnés e outros (1995, Plant Cell Tissue Organ Cult. 42 : 129 -140). Estes dois métodos de transferência de DNA foram empregados para demonstrar que a expressão do gene repórter pode ser modulada pela luz.

Materiais e Métodos Sequenciamento de DNA O seqüenciamento de DNA foi realizado como descrito por San-ger e outros (1977, P.N.A.S. USA, 74 : 5643 - 5647).

Os promotores resultantes da presente invenção têm a seqüên-cia como mencionado nas SEQ ID NOS: 1 a 3.

Construção de vetores e cassetes de expressão Os cassetes para análise de expressão empregando o gene repórter GUS foram agrupados como segue. Um cassete GUS sem promotor foi digerido de pBI101 com Hindlll e EcoRI, e foi inserido nos sítios Hindlll e EcoRI do sítio de policlonagem pUC19. O plasmídeo resultante foi denominado pBI201 e foi empregado para outros construtos. Vários fragmentos de deleção de pGPIas3-2 foram transcricionalmente e transicionalmente fundidos no terminal 5’ do gene repórter GUS em pBI201 e estes foram empregados para estudos de expressão transitória empregando-se o bombardeio de DNA. Na identificação do fragmento de deleção adequado, ele foi subclona-do em um vetor de expressão de planta binária tal como pBH 01 (Clonetech). Estes plasmídeos recombinantes foram empregados para integração estável através de infecção por A. tumefaciens como abaixo descrito.

Transferência de DNA mediada por Agrobactéria e regeneração de cepas transgênicas.

Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em cepas de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 por eletroporação como descrito em Khoudi e outros ( 1999, Biotechnol. Bioeng., 64: 135 - 143). Cepas de Agrobactéria selecionadas foram então co-cultivadas com discos de folhas de genótipo C5-1 durante 4 dias na ausência de pressão de seleção (canamici-na). Seguindo este período de incubação, discos de folha foram lavados e mimados, e então permitidos formar caios sobre o veículo B5H. Os calos foram então transferidos durante 21 dias em veículo SH para indução de embrião e durante 28 dias em BOÍ2Y para o desenvolvimento de embrião. Os embriões em formato de torpedo foram removidos de Boi2Y e colocados em veículo MS para regeneração. A canamicina estava presente em todo o veículo de cultivo exceto para o co-cultivo e regeneração em MS. Este método é descrito por fim em Desgagnés e outros (1995, Plant Cell Tissue Or-gan Cult. 42: 129 -140). As plantinhas enraizadas foram desenvolvidas até a maturidade na estufa.

Ao mesmo tempo em que a invenção foi descrita em conexão com as modalidades específicas desta, será entendido que é capaz de outras modificações e este pedido é destinado a abranger quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais divergências da presente descrição como incluem-se na prática conhecida e habitual dentro da técnica à qual a invenção pertence e como pode ser aplicada aos aspectos essenciais anteriormente mencionados, e como segue no escopo das reivindicações anexas.

Claims (8)

1. Construto para regular a expressão de um gene exógeno em uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende um promotor tendo uma sequência nucleotídica selecionada do grupo consistindo em sequências identificadas por SEQ ID NOs: 1 a 3; e um gene exógeno, em que referido promotor é adaptado para ser operacionalmente localizado com relação ao referido gene exógeno para expressão do referido gene e-xógeno em uma planta transgênica.

2. Construto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é modulado para expressão transcricional do referido gene na presença ou ausência de luz.

3. Construto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido gene exógeno compreende um fragmento funcional de uma sequência definida por ácidos nucléicos 0 a 700 de SEQ ID NO: 2.

4. Construto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma dicot, uma monocot ou uma gimnosper-ma.

5. Uso de um construto, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser para regular a expressão do referido gene exógeno em uma planta transgênica.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a referida planta é uma dicot, uma monocot ou uma gimnosperma.

7. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido promotor é modulado para a expressão transcricional do referido gene na presença ou ausência de luz.

8. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido gene exógeno compreende um fragmento funcional de uma sequência definida por ácidos nucléicos 0 a 700 de SEQ ID NO: 2.