BRPI0015846B1 - Método para produção de um vírus e/ou proteínas virais diferentes de adenovírus ou de proteínas adenovirais, e, uso de uma célula humana imortalizada - Google Patents

Abstract

"método para a produção de um vírus e/ou proteínas virais diferentes de adenovírus ou proteínas adenovirais, uso de uma célula humana, vírus ou proteína viral para uso em uma vacina obtenível por meio dos citados método e uso, célula humana kit para determinar a atividade de uma protease em uma amostra, uso de uma proteína viral ou um vírus, método para concentrar vírus influenza em condições capazes de, pelo menos em parte, preservar a capacidade de infecção do virus, e, virus influenza infeccioso ou seus derivados". proporciona-se meios e métodos inéditos para a produção de vírus mamíferos, compreendendo infectar uma cultura de células humana imortalizadas com o vírus, incubar a cultura infectada com vírus para propagar o vírus em condições que permitem o desenvolvimento do vírus, e formar um meio contendo virus e remover o meio contendo vírus. os vírus podem ser coletados e usados para a produção de vacinas. vantagens células humanas da presente invenção podem ser cultivadas em condições definidas isentas de soro, e as células apresentam capacidade aperfeiçoada para propagar vírus. em particular, proporciona-se métodos para produzir, em células humanas cultivadas, vírus influenza e vacinas derivadas dos mesmos. este método elimina a necessidade de se usar embriões inteiros de galinhas para a produção de vacinas de influenza. o método proporciona também a remoção contínua ou em bateladas de meios de cultura. assim, a presente invenção permite a produção contínua e em grande escala de vírus com alta concentração.

Description

(54) Título: MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM VÍRUS E/OU PROTEÍNAS VIRAIS DIFERENTES DE ADENOVÍRUS OU DE PROTEÍNAS ADENOVIRAIS, E, USO DE UMA CÉLULA HUMANA IMORTALIZADA (73) Titular: JANSSEN VACCINES & PREVENTION B.V, Pessoa Jurídica. Endereço: ARCHIMEDESWEG 4 NL-2333 CN, Leiden, HOLANDA(NL), Holandesa (72) Inventor: MARIA GRAZIA PAU; ALPHONSUS GERARDUS CORNELIS MARIA UYTDEHAAG; GOVERT JOHAN SCHOUTEN

Código de Controle: EC373995729B9879 FF27B5D947BBB2CD

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 02/10/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados “MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UM VÍRUS E/OU PROTEÍNAS VIRAIS DIFERENTES DE ADENOVÍRUS OU DE PROTEÍNAS ADENOVIRAIS, E, USO DE UMA CÉLULA HUMANA IMORTALIZADA.”

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao desenvolvimento e à manufatura de vacinas. Em particular, a invenção refere-se ao campo da produção de proteínas virais e/ou vírus, mais particularmente ao uso de uma célula mamífera, de preferência uma célula humana, para a produção de vírus que se desenvolvem em células eucarióticas, de preferência mamíferas e, em particular, em células humanas. A invenção é particularmente útil para a produção de vacinas para auxiliar na proteção contra patógenos virais para vertebrados, em particular mamíferos e, especialmente, humanos.

Descreve-se aqui meios e processos para a produção de um vírus e/ou uma proteína viral em uma célula (humana), de preferência utilizando-se um meio sintético definido, e para purificar o vírus e/ou seus componentes da célula e/ou do meio de cultura. Proporciona-se composições farmacêuticas contendo vírus ou seus componentes e processos para a manufatura e recuperação e/ou purificação dos mesmos.

FUNDAMENTOS

A vacinação é a via mais importante para se lidar com infecções virais. Embora uma quantidade de agentes antivirais esteja ·· ·*♦ ·· * · disponível, esses agentes apresentam tipicamente uma eficácia limitada. A administração de anticorpos contra um vírus pode ser uma boa maneira para se lidar com infecções virais uma vez que um indivíduo está infectado (imunização passiva) e, tipicamente, anticorpos humanos ou humanizados

5: efetivamente parecem promissores para se lidar com uma quantidade de infecções virais, porém a maneira mais eficaz e segura de se lidar com infecção viral é, e provavelmente será, a profilaxia através de imunizações ativas. A imunização ativa é referida geralmente como vacinação e as vacinas compreendem pelo menos um determinante antigênico de, tipicamente, um vírus, de preferência uma quantidade de determinantes antigênicos diferentes de pelo menos um vírus ou outro patógeno, p. ex. incorporando-se na vacina pelo menos uma proteína ou polipeptídio (viral) derivado de um vírus (vacinas de subunidade). Tipicamente, os formatos indicados até aqui incluem adjuvantes de modo a acentuar uma resposta imunológica.

Isto também é possível no caso de vacinas baseadas em vírus inteiro (patógeno), p. ex. em um formato inativado. Uma outra possibilidade é o uso de formas vivas, porém atenuadas, do vírus patogênico. Uma outra possibilidade no uso de vírus de tipo selvagem, p. ex., em casos em que indivíduos adultos não se encontram em perigo de infecção, mas sim crianças, e podem ser protegidas por meio de anticorpos matemos e análogos.

A produção de vacinas não é sempre um processo simples. Em alguns casos, a produção de material viral encontra-se em ovos, o que acarreta a dificuldade de se purificar material e medidas extensivas de segurança contra contaminação, etc. Também a produção em bactérias e ou leveduras, que algumas vezes, mas nem sempre, é uma alternativa para ovos requer muitas etapas de purificação e de segurança. A produção sobre células mamíferas poderia ser uma alternativa, embora células mamíferas utilizadas até aqui requerem, por exemplo, a presença de soro e/ou aderência a um suporte sólido para seu desenvolvimento. No primeiro caso, novamente a purificação '♦· • · · ; ;

* « · ·_ » · e a segurança, e, p. ex., a necessidade de protease para suportar a replicação de alguns vírus, tomam-se uma questão. No segundo caso, altos rendimentos e facilidade de produção também tomam-se uma questão. A presente invenção supera pelo menos uma quantidade dos problemas encontrados nos sistemas de produção para a produção de vírus e/ou proteínas virais para fins de vacina em relação aos sistemas do estado da técnica.

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DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção revela uma linha de células humanas imortalizadas, inédita, com a finalidade de propagar e colher vírus, para a produção do referido vírus. Gerou-se células PER.C6 (WO 97/00326) por meio de transfecção de células de retina embriônicas humanas primárias, utilizando-se um plasmídeo que continha o sorotipo Ad 5 (Ad5) e sequências codificando EIA e E1B (nucleotídeos de Ad5 459-3510) sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase (PGK: phosphoglycerate kinase) humano.

As características a seguir tomam PER.C6 ou um derivado particularmente útil como um hospedeiro para a produção de vírus: ele é uma linha de células humanas totalmente caracterizadas, foi desenvolvido em conformidade com GLP, pode ser desenvolvido como culturas em suspensão em meio isento-de-soro definido, isento de quaisquer proteínas de soro humanas ou animais; seu crescimento é compatível com frascos de rolamento, frascos de agitação, frascos de centrifugação e bio-reatores, com tempos de duplicação de cerca de 35 h.

Epidemiologia da influenza

Vírus Influenza, membros da família Orthomyxoviridae, são os agentes causativos de epidemias anuais de doença respiratória aguda. Apenas nos E.U.A. 50 milhões de americanos ficam gripados a cada ano. Avalia-se que as mortes em âmbito mundial (1972-1992) seja de 60.000 (estatística do CDC). Ocorreram 3 casos principais de surtos de pandemias de Influenza, ou seja, em 1918 (gripe espanhola, aprox. 40 milhões de mortes), ’ ..... ·· »«· .. .

em 1957 (gripe asiática, aprox. 1 milhão de mortes), e em 1968 (gripe de Hong-Kong, aprox. 700.000 mortes). Infecções com vírus Influenza são associadas com um amplo espectro de doenças e de complicações que resultam em mortalidade e morbidade em nível substancialmente mundial, especialmente entre os mais idosos e em pacientes com doenças crônicas. A vacinação contra Influenza é mais efetiva na prevenção de complicações freqüentemente fatais associadas com esta infecção (Murphy, E.R e R.G. Webster 1996). Reportou-se a produção de vírus Influenza na linha de células humanas diplóides MRC-5 (Herrero-Euribe L et al 1983). No entanto, as concentrações de vírus Influenza são proibitivamente baixas.

Cepas de vírus Influenza

As vacinas contra gripe atuais contêm Hemoaglutinina purificada e neuraminidase de vírus Influenza A e B. Os 3 vírus que representam cepas epidemiologicamente importantes são a Influenza A (H1N1), Influenza A (H3N2) e Influenza B. A divisão em grupos A e B baseia-se em diferenças antigênicas entre seu antígeno de proteína de nucleoproteína (NP) e de matriz (Μ). O vírus Influenza A é ainda mais subdividido em subtipos baseados na composição antigênica (seqüência) de moléculas de hemoaglutinina (H1 a H15) e neuraminidase (NI a N9). Representantes de cada um destes subtipos foram isolados de pássaros aquáticos, que são provavelmente o reservatório primordial de todos os vírus Influenza para as espécies aviárias e mamíferas. A transmissão foi mostrada entre porcos e humanos e, recentemente, (H5N1) entre pássaros e humanos. Vacinas de Influenza

Três tipos de vacina inativada de Influenza são utilizados correntemente no mundo: vacinas de vírus inteiro, de produto dividido e antígeno de superfície ou de subunidade. Todas estas vacinas contêm as glicoproteínas de superfície, hemoaglutinina (HA) e neuraminidase (NA), das cepas do vírus Influenza que, se espera, passarão a circular na população

JC

5:

* .......... ., humana na estação vindoura. Estas cepas, que são incorporadas na vacina, são desenvolvidas em ovos de galinhas embrionados, e as partículas virais são subseqüentemente purificadas antes de processamento ulterior. A necessidade de ajuste anual de vacinas de Influenza deve-se à variação de antígeno causadas por processos conhecidos como “variação antigênica” e “desvio anti gêmeo”.

“Variação antigênica” ocorre devido ao acúmulo de uma série de mutações pontuais na proteína H ou N de um vírus, resultando em substituições de aminoácidos. Essas substituições previnem a ligação de anticorpos neutralizadores, induzidos por infecção prévia, e a nova variante pode infectar um hospedeiro.

“Desvio antigênico” é a ocorrência de um novo subtipo através de subdivisão genética entre vírus Influenza A animais e humanos. As cepas pandêmicas de 1957 (H2N2) e de 1968 (H3N2) são exemplos de vírus separados através dos quais se introduziu genes H e ou N aviários em vírus humanos circulantes, que subseqüentemente puderam disseminar-se entre a população humana.

Com base em pesquisas epidemiológicas realizadas por mais de uma centena de Centros Nacionais de Influenza, a Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda anualmente a composição da vacina de Influenza, usualmente em fevereiro para o hemisfério norte, e em setembro para o hemisfério sul. Esta prática limita a janela de tempo para a produção e padronização da vacina a um máximo de 9 meses. No caso de uma demanda urgente de muitas doses de vacina, por exemplo quando surge um novo subtipo de vírus Influenza A devido a uma variação antigênica ou devido a um desvio antigênico, a disponibilidade limitada de ovos pode prejudicar a rápida produção de vacina. Outras desvantagens deste sistema de produção são a falta de flexibilidade, o risco da presença de toxinas e os riscos de vírus adventícios, particularmente retrovírus, e os cuidados com a esterilidade. Isto • *♦·· »· ; ; τ * · *·· *··* • · · · * ··· • · · · ··««« * · · ♦· ··· ·· apresenta um problema * sério na prática hodiema da produção de vírus Influenza em ovos de galinha embrionados.

Portanto, o uso de um sistema de cultura de células para a produção de vacina de Influenza podería ser uma alternativa atraente. Vírus 5; Influenza podem ser desenvolvidos sobre diversas células primárias, incluindo as de rim de macaco, rim de bezerro, rim de hamster e rim de frango. No entanto, seu uso para a produção de vacina não é prático, devido à necessidade de se restabelecer culturas destas células primárias para cada preparação de uma vacina. Portanto, o uso de linhas de células imortalizadas contínuas para a produção de vacina de Influenza é uma alternativa atraente.

O uso de sistemas de cultura foi facilitado através da constatação de que a divagem proteolítica de HA em suas duas subunidades (HA1 e HA2) é necessária para a capacidade de infecção de vírus Influenza, e pode ser obtida com a adição de tripsina. A inclusão de tripsina permite a 15 replicaçao e a formação de placa em células de rim canino Madin-Darby (MDCK: Madin-Darby canine kidney) (Tobita et al 1975).

Recentemente mostrou-se que a linha de células MDCK suporta o desenvolvimento de vírus Influenza para a produção de vacina (Brand et al 1996 e 1997, Palache et al 1997). O uso de tripsina requer o 20 desenvolvimento de células MDCK em meio de cultura de tecido isento de soro (MDCK-SF1). No entanto, correntemente, as células de MDCK não são aprovadas como um substrato para a produção de vírus Influenza.

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E importante observar que qualquer sistema não-humano para a produção de vacinas de influenza apresenta uma desvantagem inerente, conhecida como “adaptação”. Os vírus Influenza A e B humanos portam, ambos, mutações no HA, devido à adaptação em ovos de galinhas embrionados. Estas mutações resultam em antigenicidade alterada (Newman et al 1993, Williams e Robertson 1993, Robertson et al 1994, Gubareva et al 1994, Schild et al 1993, Robertson et al 1987, Kodihalli et al 1995). Em

1/ humanos, a imunização com vacinas contendo e HA portando uma mutação de adaptação a ovo induz menos anticorpo neutralizador no vírus que contém um HA adaptado a não-ovo (Newman et al 1993).

Vírus Influenza humana propagados em células caninas, como células de MDCK, também apresentam adaptação, embora em menor grau. Esses vírus parecem-se mais estreitamente com os isolados humanos originais do que com vírus derivados de ovos (Robertson et al 1990).

Além disso, há evidência de que alterações específicas-parahospedeiros em NA e padrões de fosforilação específicos-para-hospedeiro de NA podem afetar a replicação de vírus Influenza (Schulman e Palese 1977; Sugiara e Ueda 1980; Kistner et al 1976).

Portanto, seria claramente vantajoso evitar a adaptação ou outras alterações induzidas-por-hospedeiro no vírus Influenza. Isto pode resultar em uma população mais homogênea de vírus e tomar a vacina finalmente mais efetiva.

Portanto, é um objeto da presente invenção proporcionar células humanas como um substrato para a produção de altas concentrações de vírus Influenza, adequadas para o desenvolvimento de vacinas.

Rotavírus e rotavacinas • ·* ·· ♦ · * • · · · • ·· *·

Rotavírus são a causa mais importante de gastroenterite desidratante grave em crianças pequenas em todo o mundo. Nos países em desenvolvimento as infecções com rotavírus acarretam mais de 800.000 mortes anualmente. Estima-se que nos Estados Unidos os custos com os tratamentos de saúde devidos a infecções com rotavírus ultrapassam 1 bilhão de dólares por ano.

Rotavírus, membros da família de Reoviridae, são vírus de RNA de filamento duplo que consistem de 11 segmentos de RNA, cada um codificando para uma proteína viral (VP: viral particle) estrutural ou nãoestrutural. Este núcleo interior do vírus compreende quatro VP’s: VP1, 2, 3 e

II

6. As VP determinam as três principais propriedades antigênicas do grupo de HRV, subgrupo e sorotipo. Identificou-se sete grupos antigenicamente distintos (A-G), que são codificados pela VP6. A infecção com rotavirus humano (HRV: human rotavirus) é causada predominantemente por rotavirus de grupo A, sendo que os sorotipos 1 a 4 são responsáveis por 95 % das doenças clínicas. A proteção contra doença natural é específica para o sorotipo. O grupo A é ainda mais classificado em subgrupo I e II.

A capa exterior de camada dupla que forma o capsídeo viral consiste de duas proteínas virais, VP4 e VP7, que são antígenos de neutralização envolvidos na imunidade protetora e que determinam o sorotipo, embora a VP4 desempenhe um papel menos importante na determinação do sorotipo. Durante a co-infecção com diferentes sorotipos, os genomas segmentados são facilmente submetidos a subdivisão genética, uma propriedade que foi utilizada para criar uma vacina (Marsha et al 1999).

Dada a prevalência mundial de rotavirus associada com mortalidade e morbidade de crianças, considera-se que a vacinação em grande escala contra rotavirus seja a maneira mais efetiva para se combater este vírus. O objetivo da vacinação podería não ser o de prevenir a doença, mas o de reduzir sua gravidade e complicação, especialmente durante os primeiros anos de vida.

A única vacina efetiva presentemente obtenível é uma vacina viva atenuada administrada oralmente e baseada na subdivisão de segmentos de RNA de rotavirus humanos, codificando as VP7’s dos sorotipos 1, 2 e 4 em um rotavirus Rhesus fornecendo o fundo atenuado juntamente com a VP7 do sorotipo 3. A vacinação com esta vacina tetravalente separada rhesus humana (RRV-TV: human rhesus reassortant tetravalent vaccine), embora altamente efetiva para prevenir gastroenterite grave, é associada com a intussuscepção, uma doença obstrutiva do intestino. Por esta razão, esta vacina não está mais em uso.

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DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO ........ : ·..·

A invenção proporciona um processo para introduzir um vírus e/ou proteínas virais diferentes de adenovírus ou proteínas de adenovírus para uso como uma vacina compreendendo proporcionar uma célula com pelo : menos uma seqüência codificando pelo menos um produto de gene do gene El ou um seu derivado funcional de um adenovírus, proporcionando a referida célula com um ácido nucleico codificando o referido vírus ou as referidas proteínas virais, cultivar a referida célula em um meio adequado e permitir a propagação do referido vírus ou a expressão das referidas proteínas virais e colher o referido vírus e/ou proteínas virais do referido meio e/ou da referida célula.

Até a presente invenção há poucas, ou nenhuma, célula (humana) que se verificou ser adequada para produzir vírus e/ou proteínas virais para uso como vacinas de qualquer maneira reproduzível e de escala ampliável, e/ou rendimentos suficientemente altos, e/ou facilmente purificável. Verificamos agora que células que compreendem seqüências adenovirais El, de preferência em seu genoma, são capazes de manter a propagação de vírus em quantidades significativas.

A célula preferida de acordo com a invenção deriva-se de uma célula primária humana, de preferência uma célula que é imortalizada por um produto de gene do referido gene El. Com o fim de ser capaz de desenvolverse, uma célula primária precisa evidentemente ser imortalizada. Um bom exemplo de uma célula desse tipo deriva-se de um retinoblasto embriônico humano.

Em células de acordo com a invenção é importante que as seqüências de gene El não sejam perdidas durante o ciclo da célula. Portanto, prefere-se que a referida seqüência codificando pelo menos um produto de gene do gene El esteja presente no genoma da referida célula (humana). Por razões de segurança é preciso tomar cuidado para evitar seqüências adenovirais desnecessárias nas células de acordo com a invenção. Portanto, constitui outra concretização da invenção proporcionar células que não produzem proteínas estruturais adenovirais. No entanto, visando obter uma produção de vírus (contínua) em grande escala por meio de cultura de células prefere-se possuir células capazes de desenvolver-se sem a necessidade de ancoragem. As células da presente invenção apresentam essa capacidade. Para se obter um sistema de produção limpo e seguro do qual seja possível facilmente recuperar e, se desejado, purificar o vírus, prefere-se contar com um processo de acordo com a invenção, sendo que a referida célula humana não compreende outras seqüências adenovirais. A célula mais preferida para os processos e usos da invenção é PER.C6, conforme depositado na ECACC n° 96022940 em 26 de fevereiro de 1996, ou um seu derivado.

Assim, a invenção proporciona um método de utilização de uma célula de acordo com a invenção, sendo que a referida célula compreende adicionalmente uma seqüência codificando E2A ou um seu derivado ou análogo ou fragmento funcional, de preferência uma célula em que a referida seqüência codificando E2A ou um seu derivado ou análogo ou fragmento funcional está presente no genoma da referida célula humana e, o mais preferível, uma célula em que a referida seqüência codificando E2A codifica um mutante de E2A sensível à temperatura.

Além disso, conforme indicado, a invenção também proporciona um método de acordo com a invenção em que a referida célula (humana) é capaz de desenvolver-se em suspensão.

A invenção também proporciona um método em que a referida célula humana pode ser cultivada na ausência de soro. As células de acordo com a invenção, em particular PER.C6, apresentam a vantagem adicional de que podem ser cultivadas na ausência de soro ou de componentes de soro. Assim, o isolamento é fácil, a segurança é acentuada e a confiabilidade do sistema é boa (meios sintéticos são os melhores no que tange à /6 * ·· »· • · * · • » » 1

0»» » · · * • · ♦· w» r»» »· » ·»* * t * · reproduzibilidade). As células humanas da invenção e, em particular, aquelas baseadas em células primárias e, particularmente, aquelas baseadas em células HER, são capazes de modificações normais pós- e peri-tradução e de combinação. Isto significa que elas são muito adequadas para se preparar 5 : proteínas virais e vírus para uso em vacinas.

Assim, a invenção proporciona um método de acordo com a invenção, sendo que o referido vírus e/ou as referidas proteínas virais compreendem uma proteína que sofre modificação pós-tradução e/ou peritradução, especialmente quando as referidas modificações compreendem III glicosilação. Um bom exemplo de uma vacina viral que tem sido problemática de se produzir de qualquer maneira confiável é a vacina de Influenza. A invenção proporciona um método de acordo com a invenção em que as referidas proteínas virais compreendem pelo menos um de hemoaglutinina e/ou neuraminidase de vírus Influenza. Outras proteínas 15 virais (subunidades) e vírus (tipos selvagens a serem inativados) ou vírus atenuados que podem ser produzidos nos métodos de acordo com a invenção incluem enterovírus, como rinovírus, aftovírus, ou vírus da poliomielite, herpes-vírus, como vírus do herpes simples, vírus da pseudorraiva ou vírus do herpes bovino, ortomixovírus, como vírus Influenza, um paramixovírus, 20 como vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório, vírus da caxumba ou um vírus do sarampo, retrovírus, como o vírus da imunodeficiência humana ou um parvovírus ou um papovavírus, rotavírus ou um coronavírus, como um vírus da gastroenterite transmissível ou um flavivírus, como o vírus da encefalite transmitida por carrapato ou o vírus da 25 febre amarela, um togavírus, como vírus da rubéola ou vírus encefalomielite eqüina venezuelana, do leste ou do oeste, um vírus causador de hepatite, como vírus da hepatite A ou da hepatite B, um pestivírus, como o vírus da cólera dos porcos ou um rabdovírus, como o vírus da raiva, um vírus Bunyaviridae, como Hantavírus.

II

Em uma /concretização, uma célula da invenção é útil na geração de uma cepa de vírus Influenza que não se desenvolve de maneira muito eficiente em ovos embrionários.

A invenção também proporciona o uso de uma célula humana apresentando uma seqüência que codifica pelo menos uma proteína El de um adenovírus ou seu derivado, homólogo ou fragmento funcional em seu genoma, sendo que essa célula não produz proteínas adenovirais estruturais para a produção de um vírus, ou pelo menos uma proteína viral para uso em uma vacina. Evidentemente, para uma utilização desse tipo também se prefere as células preferidas nos métodos de acordo com a invenção. A invenção também proporciona os produtos resultantes dos métodos e usos de acordo com a invenção, especialmente proteínas virais e vírus obteníveis de acordo com aqueles usos e/ou métodos, especialmente quando colocados numa composição farmacêutica compreendendo excipientes adequados e em alguns formatos (vírus inativados, subunidades) adjuvantes. A dosagem e as vias de administração podem ser selecionadas por meio de testagem clínica não medida em que estas ainda não estejam disponíveis por meio das vacinas já registradas.

Assim, a invenção também proporciona um vírus ou uma proteína viral para uso em uma vacina obtenível através de um método ou de um uso de acordo com a invenção, sendo que o referido vírus ou composto viral é isento de qualquer material proteináceo mamífero não-humano e uma formulação farmacêutica compreendendo um tal vírus e/ou proteína viral.

A invenção também proporciona uma célula humana apresentando uma seqüência codificando pelo menos uma proteína El de um adenovírus ou um seu derivado, homólogo ou fragmento funcional, em seu genoma, sendo que essa célula não produz proteínas adenovirais estruturais e apresentando um ácido nucléico codificando um vírus ou pelo menos uma proteína viral não-adenoviral. Esta célula pode ser usada em um método de ιβ acordo com a invenção.

Em uma concretização preferida, a invenção proporciona vírus Influenza obteníveis por meio de um método de acordo com a invenção ou através do uso de acordo com a invenção.

5* Em outro aspecto a invenção proporciona um kit para se determinar a atividade de uma protease em uma amostra compreendendo pelo menos uma proteína viral ou vírus obtenível por meio de um método ou de um uso de acordo com a invenção, sendo que o referido vírus ou a referida proteína viral é isento/a de qualquer material proteináceo mamífero não- 11 humano. Este aspecto da invenção é útil, particularmente para se determinar a atividade de protease em meio de cultura. O meio de cultura distingue-se por representar um contexto difícil para se determinar a atividade de uma protease. No entanto, utilizando-se uma proteína viral ou um vírus da invenção como um alvo para a protease, é possível determinar precisamente a atividade da referida protease também no meio de cultura. Em uma concretização preferida, portanto, a referida atividade de protease em uma amostra compreendendo meio de cultura. Em uma concretização preferida a referida protease compreende tripsina. Em uma concretização preferida a referida proteína viral compreende HAO.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para concentrar vírus Influenza em condições capazes de, pelo menos em parte, conservar a capacidade de infecção do vírus, compreendendo obter um sobrenadante isento de células compreendendo o referido vírus de uma cultura de células, e ultrafiltrando-se o referido sobrenadante em condições de baixo cisalhamento. Preparações de vírus Influenza colhidas de ovos embrionários necessitam tipicamente ser purificados para a preparação de uma vacina. A purificação acarreta tipicamente pelo menos uma etapa de concentração do vírus. As tecnologias atuais para a concentração de vírus Influenza a partir dessas preparações relativamente brutas de vírus Influenza

são incômodas. Utilizando-se um método de concentração da invenção é possível concentrar preparações de vírus Influenza em condições que contêm, pelo menos em parte, a capacidade de infecção do vírus. De preferência, concentra-se vírus que é ou que pode ser tomado infeccioso. Com ‘pode ser tomado infeccioso’ compreende-se a geração de vírus infeccioso por meio de divagem de HAO. Em uma concretização preferida, a referida concentração é realizada utilizando-se uma fibra oca. Uma fibra oca é particularmente adequada para se concentrar em condições de baixo cisalhamento. Em uma concretização preferida, a referida cultura de células compreende células cultivadas in vitro. O sobrenadante de células cultivadas in vitro é considerado particularmente adequado para concentração utilizando-se um método da invenção. Particularmente quando o referido sobrenadante compreende meio de cultura isento de soro. Em uma concretização preferida realiza-se a referida ultrafiltração com filtro que permite que proteínas individuais passem enquanto os vírus são retidos. De preferência, o referido filtro compreende um limiar de corte de 500 KD. Mais preferivelmente, o referido filtro compreende um limiar de corte de 750 KD. Em uma concretização particularmente preferida, a referida concentração compreende adicionalmente pelo menos uma remoção parcial de proteínas compreendendo um peso molecular menor que 500 KD e, mais preferivelmente, menor que 750 KD. De preferência, a referida purificação é obtida utilizando-se um filtro mencionado.

Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona vírus Influenza infeccioso ou seus derivados concentrados com um método da invenção. Um derivado de um vírus Influenza infeccioso da Influenza é tipicamente um vírus, partícula de vírus, ou proteína viral ou parte da mesma que pode ser usada para fins de imunização. Tipicamente, isto acarreta uma etapa de inativação de capacidade de infecção de vírus.

EXEMPLOS

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Para ilustrar a invenção, proporciona-se os exemplos a seguir que não se destinam a limitar a abrangência da invenção.

Exemplo 1

MATERIAIS E MÉTODOS

5' Cultura de células PER.C6 e MDCK

Células de rim canino Madin Darby (MDCK) foram cultivadas em meio Eagle modificado Dulbecco (DMEM, Life Technologies Breda,

Países Baixos) contendo 10 % de soro bovino fetal inativado e lx LGlutamina (Gibco-BRL), a 37°C e 10 % de CO₂. Culturas de suspensão de

PER.C6 foram cultivadas em ExCell 525 (JRH Biosciences) suplementadas com lx L-Glutamina, a 37°C e 10 % de CO₂, em culturas estacionárias em discos de 6 poços (Greiner) ou em 490 cm² de fiascos de rolamento de cultura de tecido (Corning Costar Corporation) durante rotação contínua a 1 rpm.

Teste de imunofluorescência

Realizou-se ensaios de imunofluorescência direta para a detecção de infecção por vírus Influenza com o uso do kit IMAGEN® de vírus Influenza A e B (Dako) de acordo com o protocolo padrão do fornecedor. As amostras foram observadas microscopicamente utilizando-se iluminação de epifluorescência. As células infectadas foram caracterizadas por uma fluorescência verde-maçã brilhante.

Manchamento com iodeto de propídio

Pelotas de células foram suspensos em 300 μΐ de [uma preparação fria] de PBS/0,5 % BSA + 5 μΐ de iodeto de propídio (concentração de 50 pg/ml) em solução de PBS/FCS/azida conhecida pelas pessoas versadas na arte. Em seguida, as células viáveis e as mortas foram detectadas por meio de análise citofluorométrica de fluxo.

Ensaio de hemoaglutinação

De uma maneira geral, realizou-se as ensaios de :··. *;· .··, .· .........

........... ·..· ·..· : ·..

hemoaglutinação visando as concentrações de vírus Influenza de acordo com métodos conhecidos por pessoas versadas na arte. Aqui, 50 μΐ de uma solução de vírus diluída duas vezes em PBS foram adicionados a 25 μΐ de PBS e 25 μΐ de uma suspensão a 1 % de eritrócitos de peru (Biotrading

- Benelux B.V.) em PBS e incubados em placas de microtitulação de 96 poços a 4°C durante 1 h. O padrão de hemoaglutinação foi examinado e avaliado, e expresso como unidades hemoaglutinadoras (HAU's: hemagglutinating units). O número de HAU's correspondeu ao valor recíproco da maior diluição de vírus que apresentou hemoaglutinação completa.

Análise de Western blot da proteína de Influenza HA

De uma maneira geral, os vírus Influenza obtidos foram rompidos em um tamponador Laemmli de acordo com métodos conhecidos de pessoas versadas na arte e volumes diferentes de misturas de proteína obtidos foram separados utilizando-se géis de PAGE/SDS a 10 %. Em resumo, os manchamentos foram bloqueados durante 30 min à temperatura ambiente com solução bloqueadora (5 % de leite em pó desnatado (Biorad) em TB ST suplementado com soro de coelho a 1 % (Rockland)), seguido de 3 lavagens com TBST. Em seguida, os manchamentos foram incubados com o anti-soro anti A/Sydney/5/97 HA (98/768 NISBC) diluído a 1/500 em 1 % de

BSA/TBST com soro de coelho a 5 % (Rockland) O/N à temperatura ambiente. Novamente, os manchamentos foram lavados 8 vezes com TBST. Finalmente, os manchamentos foram incubados com o anti-soro de ovelha anti-coelho (marcado com HRP, Rockland) diluído a 1/6000 em solução bloqueadora durante 1 h à temperatura ambiente. Após 8 lavagens com TBST o complexo proteína-conjugado foi visualizado com ECL (Amersham Pharmacia Biotech), e expôs-se películas (Hyperfilm, Amersham Life Science). Os anti-soros foram obtidos junto à NIBSC (UK) e aplicados em diluições recomendadas pela NIBSC.

Ensaio de imunodifusão radical simples (SRID: Single Radial » * » • ·

Immunodiffusion)

A concentração de hemoaglutinina nos sobrenadantes, derivados de células PER-C6 infectadas com vírus Influenza, foi determinado pelo teste de imunodifusão radial simples (SRID) conforme previamente

5- descrito (Wood et al 1977). O ensaio foi realizado utilizando-se antígenos NISSC (UK) convencionais e reagentes de anti-soros.

Ensaio de placa

Um total de 1 ml de sobrenadantes virais diluídos serialmente 10 vezes foi inoculado sobre células MDCK que foram desenvolvidas até 95 % de confluência em placas de 6 poços. Após 1 h a 35°C as células foram lavadas duas vezes com PBS e sobrecarregadas com 3 ml de mix de agarose (1,2 ml de agarose a 2,5 %, 1,5 ml de 2x MEM, 30 μΐ de 200 mM LGlutamina, 24 μΐ de tripsina-EDTA, 250 μΐ de PBS). As células foram incubadas em uma atmosfera úmida de 10 % de CO₂ a 35°C durante aproximadamente 3 dias e avaliou-se as placas virais.

Ensaio de capacidade de infecção de vírus (TCID^o)

Realizou-se a titulação de vírus infecciosos em células MDCK. Em resumo, semeou-se células em placas de 96 poços a uma densidade de 4 x 10⁴ células/poço em DMEM suplementado com 2 mM de L20 Glutamina. Vinte e quatro horas mais tarde as células foram infectadas com 100 μΐ de sobrenadantes de cultura diluídos serialmente dez vezes, em quadruplicado, em meio contendo Tripsina-EDTA a uma concentração de 4 pg/ml. Duas horas após a infecção, as monocamadas de células foram lavadas duas vezes em PBS e incubadas em meio contendo tripsina durante 7 dias, a

35°C. Os sobrenadantes destas culturas foram então testados com uma ensaio de HA. As concentrações de TCID₅₀ foram calculadas de acordo com o método de Karber (1931).

Inativação do vírus Influenza com β-propiolactona

Para a inativação dos vírus visando a obtenção de vírus

5'

II inteiros inativados para a geração de vacinas derivadas de PER.C60, realizouse um protocolo de mutação conhecidos por pessoas versadas na arte empregando β-propiolactona. A β-propiolactona é uma agente muito efetivo que é amplamente utilizado para a inativação de vírus e é bem conhecido na arte devido a seus efeitos mutantes. Ele modifica bases de ácido nucléico do genoma viral e o genoma da célula hospedeira e bloqueia a replicação subseqüente. Seguindo-se um protocolo estabelecido utilizado para se preparar a vacina de Influenza inteiro inativado preparada sobre ovos embrionados, a quantidade de vírus correspondendo a aproximadamente 400 pg de HA por cepa foi inativada e usada para a formulação final de vacina. Em resumo, adicionou-se um volume de tamponador de fosfato de sódio 0,3 M a 9 volumes de preparação de vírus Influenza. A inativação dos vírus foi realizada adicionando-se um volume de 10 % de β-propiolactona (Newall Design, UK) a 100 volumes de preparação de vírus tamponada com fosfato e incubando-se a 20°C durante 24 b. A inativação dos vírus foi verificada por meio de ensaio de placas e não se detectou quaisquer placas para qualquer das bateladas inativadas (dados não mostrados).

Exemplo 2A

Armazenamento e pré-cultura de células PER.C6

Utilizou-se a linha de células PER.C6 (depositada sob o n°

96022040 na European Collection of Animal Cell Cultures no Centre for Applied Microbiology and Research), ou seus derivados (descrito no WO 97/00326). As linhas de células foram armazenadas com um sistema Two Tier Cell Bank System. A linha de células selecionadas foi armazenada um depósito de células-mestres para pesquisa (rMCB: research master cell bank) que foi armazenada em locais diferentes. A partir destes rMCB preparou-se depósitos de células de trabalho para pesquisa (rWCB: research working cell banks) como a seguir: uma ampola do rMCB foi descongelada, e as células foram propagadas até que estivessem presentes suficientes células para se

J24 • *♦ • « · • * congelar as células com o uso de gelo seco. Até 500 ampolas contendo 1 ml (1 a 2 x 10⁶ células/ml) de rWCB foram armazenadas na fase vapor de um congelador de N₂ líquido. Uma ampola contendo 5 x 10⁶ células PER.C6 do WCB foi descongelada em um banho de água a 37°C. As células foram

5' transferidas rapidamente para um tubo de 50 ml e ressuspensas adicionandose 9 ml do meio de suspensão Excell 525 (JRH Biosciences) suplementado com 1 x L-Glutamina. Após 3 min de centrifugação a 1000 rpm numa centrífuga de mesa, as células foram ressuspensas numa concentração final de 3 x 10⁵ células/ml e cultivadas em um frasco de cultura de tecidos T80, a

37°C, 10 % de CO₂. Dois a três dias mais tarde, as células foram semeadas em frascos de rolamento de cultura de tecidos de 490 cm² (Corning Costar Corporation), com uma densidade de 3 x 10⁵ por ml e cultivadas em rotação contínua a 1 rpm.

Exemplo 2B

Células PER.C6 como linha de células permissivas para vírus Influenza A

PER.C6 como uma célula humana não foi reconhecida por sua capacidade de manter a infecção por vírus Influenza e replicação. Portanto, verificou-se se as células PER.C6 eram permissivas para infecção por vírus Influenza em comparação com a linha de células de cão Madin Darby Canine

Kidney (MDCK) que serviu como um controle positivo.

No dia anterior à infecção, semeou-se 2 x 10⁵ células MDCK por poço em placas de 6 poços. Vinte e quatro horas mais tarde, 4 x 10⁵ PER.C6 semeadas e as células MDCK por poço foram infectadas com a cepa H1N1 A/Puerto Rico/8/34 (titulação de 3,6 x 10⁷ pfu/ml) [N.T.: pfu são unidades formadoras de placa], (obtidas de Dr. E. Claas, Leiden University Medicai Center, Países Baixos). A infecção foi realizada com diversas multiplicidades de infecção (moi’s: multipliticies ofinfectiori) variando de 0,1 a 10 pfu/célula. Após cerca de 2 horas de incubação a 37°C removeu-se o inóculo que foi substituído por meio de cultura fresco. Realizou-se uma

5’ ensaio de imunofluorescência direta para a detecção de infecção por vírus Influenza 24 e 48 h após a infecção. O experimento mostrou permissividade de PER.C6 para infecção por Influenza, com percentuais de células positivas dependentes de MOI e comparáveis com MDCK (Fig-1).

Exemplo 3

PER.C6 usado para a propagação de vírus Influenza A

Verificou-se se a replicação e a propagação do vírus Influenza poderia ser suportada por PER.C6. No dia da infecção, células PER.C6 foram semeadas em frascos de rolamento de cultura de tecidos de 490 cm², com a densidade de 2 χ 10⁵ células/ml em um volume final de 40 ml, na presença de 5 pg/ml de tripsina-EDTA (Gibco-BRL). As células foram, ou falsamente inoculadas, ou infectadas com a cepa H3N2 A/Shenzhen/227/95 (titulação de 1,5 χ 10⁶ pfu/ml) (obtida de Dr. E. Claas, Leiden University Medicai Centre, Países Baixos). Realizou-se infecções a uma MOI IO'⁴ e 10'³ pfu/células. Após 1 h de incubação a 37°C removeu-se o inóculo por meio de centrifugação das células a 1500 rpm e ressuspensão das células em meio de cultura fresco + 5 pg/ml de tripsina-EDTA. A cada dia realizou-se a colheita de 1,3 ml de suspensão de células a cada dia, desde o dia 1 até o dia 6 após a infecção. Os sobrenadantes foram armazenados a -80°C e usados para ensaios de hemoaglutinação. Os pelotas de células foram usados para testes de imunofluorescência direta e para o manchamento com iodeto de propídio. Exemplo 4

Permissividade de PER.C6 para diferentes cepas de Influenza

Para investigar a permissividade de PER.6G a diversas cepas de Influenza, realizou-se uma infecção utilizando-se cepas de vacina H1N1 A/Beijing/262/95 e seu produto subdividido X-127, obtidas junto ao National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC, UK). No dia da infecção as células PER.C6 foram semeadas em frascos de rolamento de cultura de tecidos de 490 cm², com a densidade de aproximadamente 1 χ 10⁶ células/ml em um volume final de 50 ml. As células foram inoculadas com 5 μΐ (diluição de 10^-4) e 50 μΐ (diluição de 10³) de vírus na presença de 5 pg/ml de tripsina-EDTA.

Visando determinar se a tripsina era realmente necessária realizou-se mais uma infecção inoculando-se 5 μΐ da cepa A/Beijing/262/95 na ausência da protease. Após aproximadamente 1 h de incubação a 37°C o inóculo foi removido por meio de centrifugação das células a 1500 rpm e ressuspensão das mesmas em meio de cultura fresco ± 5 μg/ml de tripsinaEDTA. No dia 2 e no dia 4 após a infecção adicionou-se mais tripsina às amostras. A colheita de 1,3 ml de suspensão de células foi realizada desde o dia 1 até o dia 6 após a infecção. Os sobrenadantes foram armazenados a 80°C e usados para ensaios de hemoaglutinação e infecções ulteriores; os pelotas de células foram usados em testes de imunofluorescência direta. Os resultados obtidos com as ensaios indicadas acima de imunofluorescência e hemoaglutinação são mostrados na Fig. 4 e na Fig. 5, respectivamente, ilustrando a eficiente replicação e liberação dos vírus.

Exemplo 5

Capacidade de infecção de vírus propagado sobre PER.C6

Verificou-se se os vírus desenvolvidos em PER.C6 eram infecciosos e se a adaptação à linha de células poderia incrementar os rendimentos de vírus. Utilizou-se sobrenadantes de vírus derivados de PER.C6 infectadas com as cepas A/Beijing/262/95 e seu produto subdividido X-127 (dil. 10-3) e colhidas no dia 6 após a infecção. No dia da infecção, PER.C6 foram semeados em frascos de rolamento de cultura de tecidos de 490 cm , com a densidade de aproximadamente 1x10 células/ml em um volume final de 50 ml. As células foram inoculadas com 100 μΐ e 1 ml de sobrenadante de vírus na presença de 5 pg/ml de tripsina-EDTA. Visando determinar se a tripsina ainda era necessária realizou-se mais uma infecção por meio de inoculação de 100 μΐ da cepa A/Beijing/262/95 na ausência da

ST * · ♦

..... ·· ·· ; ·..· protease. Após aproximadamente 1 hora de incubação a 37°C removeu-se o inóculo por meio de centrifugação das células a 1500 rpm e ressuspendendose as mesmas em meio de cultura fresco ± 5 pg/ml de tripsina-EDTA. No dia 2 e no dia 4 após a infecção adicionou-se mais tripsina às amostras. A

5- colheita de 1,3 ml de suspensão de células foi realizada desde o dia 1 até o dia 6 após a infecção. Os sobrenadantes foram armazenados a -80°C e usados para ensaios e infecções ulteriores; utilizou-se pelotas de células para testes de imunofluorescência direta. Os resultados obtidos com os ensaios indicadas acima de imunofluorescência e hemoaglutinação são mostrados na Fig. 6 e

J U Fig. 7. Os dados obtidos com o presente experimento mostraram capacidade de infecção dos vírus desenvolvidos em PER.C6 e também um aumento dos rendimentos de vírus.

Exemplo 6

A presença de receptores de superfície celular para vírus Influenza sobre

PER.C6.

A propagação de Influenza A e B humano em ovos de galinhas embrionados sempre leva a uma seleção de variantes ligadoras de receptor que abrigam substituições de aminoácidos na porção distai da cabeça globular HA nas regiões expostas e funcionalmente importantes da molécula.

Devido a estas mutações, as cepas adaptadas a ovos podem diferir dos vírus humanos originais em suas atividades antigênicas e imunogênicas, e também no que se refere à sua virulência. Vírus Influenza humana isolados de células MDCK apresentam usualmente uma proteína HA que é idêntica à proteína HA presente no vírus da amostra clínica original. Um estudo recente (Govorkava 1999) esclareceu a base molecular para a seleção de variantes em ovos de galinha e a ausência deste fenômeno de seleção de variante em células MDCK. Verificou-se que todas as cepas de Influenza A e B humanas isoladas de células MDCK ligam-se com alta afinidade e especificidade a ligações de galactose-ácido alfa2,3 siálico presentes em oligossacarídeos ·· ··

........... .. ·..· ;

presentes em receptores de superfície celular, (Sia2-3Gal). Utilizando-se lectinas específicas foi possível demonstrar que só estavam presentes receptores contendo Sia2-3Gal sobre a superfície de células embriônicas de galinha, sendo que células de MDCK expressaram tanto Sia2-6Gal como

5‘ Sia2-3Gal. A expressão das porções Sia2-3Gal e Sia2-6Gal sobre a superfície das células PER.C6 foram estudadas por meio de análise FACS, empregandose duas diferentes lectinas marcadas com digoxiganina (DIG): Aglutinina de Sambuca nigra (SNA: Sambuca nigra agglutinin) que reconhece especifícamente ligações Sia2-6Gal e a aglutinina de Maackia amurensis

II (MAA: Maackia amurensis agglutinin), que reconhece especifícamente ligações Sia2-3Gal. A Fig. 8A mostra o reconhecimento das lectinas SNA e MAA e sua ligação aos sítios de glicosilação. Além disso, a Fig. 8A mostra a interação esquemática entre o anticorpo anti-DIG marcado com FITC e a lectina marcada com DIG que reconhece a ligação específica de sialila na espinha dorsal de glicosilação do receptor presente na superfície celular.

Ambas as lecitinas foram tiradas do kit de diferenciação de glicano (Boehringer-La Roche).

O experimento foi realizado sobre células PER.C6 em suspensão e células MDCK e CHO aderentes. Células de MDCK e CHO foram liberadas do suporte sólido utilizando-se tripsina-EDTA (Gibco-BRL).

As suspensões de células foram então lavadas mais uma vez com Mem-5 %

FBS e incubadas neste meio durante 1 hora a 37°C. Após lavagem com PBS (Gibco-BRL) as células foram ressuspensas a uma concentração de aproximadamente 10⁶ células/ml em meio de ligação (solução salina tamponada com Tris, pH 7,5, 0,5 % de BSA, e 1 mM de cada um dentre MgCl_2j MnCl₂, e CaCl₂). Frações de células foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente com as lectinas SNA e MAA marcadas com DIG. Após 1 h, as células tratadas com lectina foram lavadas com PBS e incubadas durante mais uma hora à temperatura ambiente com anticorpo anti-DIG * ’ » · « marcado com FITC (Boehringer-Mannheim). Finalmente, as células foram lavadas com PBS e analisadas por meio de seleção de células ativadas com fluorescência empregando-se um aparelho FAC-sort (Becton Dickinson). Os resultados mostrados na Fig. 8B demonstram que células PER.C6 foram manchadas tanto com lectina apresentando a presença do Sia2-6Gal como com os receptores de Sia2-3Gal.

No mesmo experimento utilizou-se células de MDCK como controle positivo para ambos os receptores sialilados, sendo que células de CHO, em virtude da ausência da enzima de glicosilação 2-6 sialiltransferase nestas células de hamster, representaram um controle negativo para a porção Sia2-6Gal. Os quadros superiores mostram resultados com a lectina SNA e os quadros inferiores mostram resultados com a lectina MAA. A partir destes resultados pode-se concluir que PER.C6 expressa proteínas de superfície celular que servem para ambas as ligações de Sia2-3Gal e Sia2-6Gal em suas cadeias de oligossacarídeos.

Exemplo 7

Efeito de diferentes concentrações de tripsina-EDTA sobre a viabilidade de células PER.C6, sobre a produção de vírus Influenza em células PER.C6 e sobre a proteína HA daí derivada.

Devido à exigência absoluta de tripsina para a propagação de vírus Influenza em culturas celulares investigou-se os efeitos de diferentes concentrações de tripsina-EDTA sobre a viabilidade de PER.C6 e a replicação de vírus em células PER.C6 após infecção utilizando-se diversas cepas de Influenza.

Infecção com a cepa de vírus Influenza A/Sydney/5/97 na presença de baixas concentrações de tripsina

No dia da infecção, células PER.C6 foram semeadas em frascos de rolamento de cultura de tecidos com 490 cm², a uma densidade de r

1x10 células/ml, na presença de tripsina-EDTA a concentrações finais de

0,5, 1, 2, 3 e 5 pg/ml.

Estas concentrações de tripsina não interferem com as características de crescimento das células e com sua viabilidade (dados não mostrados). As células são, ou falsamente infectadas, ou infectadas com vírus Influenza desenvolvidos sobre PER.C6 [da cepa] A/Sydney/5/97 a uma MOI de 10⁴ pfu/célula. a produção viral foi monitorada por meio de imunofluorescência direta (dados não mostrados), ensaios de _; hemoaglutinação, imunodifusão radial simples (SRID) indicada acima e ensaios de placa, todas como descrito acima. Os resultados deste experimento são representados na Fig. 9 e mostram que o teor de HA, conforme medido por SRID, e também a atividade biológica do vírus, expressa em HAU, foram os mais altos quando se utilizou a concentração de tripsina, de 1 pg/ml. A Fig. 9 também mostra que através do uso de ensaio de placa foi possível observar o número mais alto de unidades formadoras de placa (pfu: plaque forming units) por ml na amostra correspondendo a células desenvolvidas em meio contendo 2 pg/ml de tripsina.

Infecção com cepa de vírus Influenza B/Harbin/7/94.

No dia da infecção semeou-se células PER.C6 em frascos de rolamento de cultura de tecidos com 490 cm a uma densidade de 1 x 10 células/ml, na presença de diferentes concentrações de tripsina-EDTA, variando de 1 a 5 pg/ml. As células foram infectadas com vírus B/Harbin/7/94 desenvolvido sobre PER.C6 a uma MOI de 10'³ pfu/célula. A produção do vírus foi monitorada por meio ensaios de imunofluorescência direta, hemoaglutinação e ensaio de placa conforme mostrado na Fig. 10. A infectabilidade de PER.C6 no dia 2 elevou-se com a concentração de tripsina. Contudo, no dia 3 não se observou qualquer diferença significativa no percentual de células infectadas quando 1, 2,5 ou 5 pg/ml de tripsina estavam presentes. Na ausência de tripsina (0 pg/ml) não se detectou infecção por vírus Influenza. No dia da última colheita (dia 4 após a infecção) a atividade

...........

Ί Η : :

......... ·..* biológica do vírus, um ensaio medido por meio de hemoaglutinação, não diferiu significativamente. É interessante observar que o ensaio de capacidade de infecção realizado nas amostras coibidas nos dias 3 e 4 após a infecção apresentou uma diferença na produção do vírus. Obteve-se as concentrações mais altas nos dias 3 e 4 quando se utilizou uma concentração de tripsina de 2,5 a 5 (dia 3) e 1 pg/ml (dia 4).

Infecção por produto subdividido X-127 de vírus Influenza

No dia da infecção, células PER.C6 foram semeadas em frascos de cultura de tecidos T25, a uma densidade de 1 χ 10⁶ células/ml, na presença de diferentes concentrações de tripsina-EDTA variando de 0 a 7,5 pg/ml. As células foram infectadas com vírus X-127 desenvolvido sobre PER.C6 (produto subdividido de ovo para a cepa A/Beijing/262/95) a uma MOI de 10‘⁴ e 10‘³ pfu/célula. O desenvolvimento viral foi monitorado por meio de ensaios de imunofluorescência direta, hemoaglutinação e ensaio de placa. Como mostrado nas Fig. 11 e Fig. 12, as concentrações de HAU apresentaram-se idênticas entre as amostras, independentemente da concentração de tripsina e utilizou-se a MOI inicial. Além disso, não se observou quaisquer diferenças significativas nas concentrações de capacidade de infecção, conforme medido por meio de ensaio de placa.

Infecção de PER.C6 com a cepa de vírus Influenza A/Sydney/5/97 na presença de altas concentrações de tripsina

Para se testar o efeito de concentrações crescentes de tripsina sobre a viabilidade das células e a replicação de vírus, semeou-se células PER.C6 em frascos de rolamento a uma densidade de 1 χ 10⁶ células/ml na presença de diversas concentrações de tripsina-EDTA variando de 0 a 12,5 pg/ml. As células foram, ou falsamente infectadas, ou infectadas com vírus A/Sydney/5/97 desenvolvido sobre PER.C6 a uma MOI de 4 χ 10’⁵ pfu/célula. Determinou-se as HAU’s presentes nas bateladas obtidas conforme descrito. É importante observar que os dados ilustrados na Fig. 13 ·· ♦

............ ..

mostram claramente que concentrações de tripsina de até 10 pg/ml não interferem com a viabilidade da célula. Além disso, a atividade biológica do vírus obtido no dia 4 após infecção, conforme medida com HAU, foi mais alta quando se utilizou uma concentração de tripsina de 2,5 a 5 pg/ml. Além disso, mediu-se a TCID₅₀ (Fig. 14A) e realizou-se ensaios de placa (dados não mostrados). Não se verificou diferenças relevantes nestas ensaios de placa, nas concentrações de capacidade de infecção (TCID⁵⁰), na divagem e quantidade de HA (aproximadamente 10 pg/ml) conforme determinado por análise de Western blot mostrada na Fig. 14B.

Exemplo 8

Produção de vírus Influenza em células PER.C6 em um sistema de bio-reator de perfusão de fibras ocas.

A escalabilidade da produção do vírus Influenza em células PER.C6 desenvolvidas em suspensão foi estudada mediante a utilização de bio-reatores de 3 litros (volume total) contendo um volume de suspensão de células de 2 litros de células em meio isento de soro, que também é isento de proteínas animais ou derivadas de humanos (ExCell 525, JRH Biosciences).

A infecção com Influenza foi realizada a uma densidade de células de aproximadamente 3 χ 10⁶ células/ml. As células foram incubadas com vírus A/Sydney/5/97 desenvolvido sobre PER.C6 a uma MOI de 10'⁴ pfu/célula. A cada dia recolheu-se amostras de 5 a 10 ml de suspensões de células para realizar contagens gerais de células, para medições de concentração de glucose, para ensaios de imunofluorescência, para ensaios de hemoaglutinação e para ensaios de capacidade de infecção. Os resultados destes experimentos são mostrados na Fig. 15.

Para se investigar a presença e o status dos Western blots de proteína HA utilizando dois diferentes anticorpos anti-HA obtidos junto ao NIBSC foram utilizados. Também foram realizados ensaios de SRID conforme descrito acima. Os resultados ilustrados nos dois Western blots na

515 ··* t» .::: • · ♦ ♦ · • · • « • · • · ·· ·♦·· • · · *

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Fig. 16 mostram que a batelada de vírus Influenza produzida neste bio-reator renderam um teor de HA de uma concentração estimada de 15 pg/ml que foi confirmada por meio de ensaio de SRID. A HA produzida é comparável com a HA de referência do NIBSC em termos de composição de subunidade e reatividade imunológica com os anti-soros específicos de subtipo de referência.

Exemplo 9

Infecção de PER.C6 com A/Sydney/5/97 em um bio-reator de 15 litros, seguida de um processo de fluxo descendente (DSP: Down Stream Process}.

Células PER.C6 desenvolvendo-se em suspensão foram incubadas a 37°C em um sistema de perfusão de fibras ocas com um reator de 15 litros, com um volume de suspensão de células de 10 litros em meio ExCell 525 isento de soro (JRH Biosciences). A infecção por Influenza foi realizada a 35°C a uma densidade celular de aproximadamente 3,3 χ 10⁶ células/ml em meio contendo 5 pg/ml de tripsina-EDTA (Life Technologies). As células foram inoculadas com vírus A/Sydney/5/97 desenvolvido sobre PER.C6 (número de passagem 3) a uma MOI de IO'⁴ pfu/célula. Continuouse a perfusão com meio ExCell 525 isento de soro contendo tripsina-EDTA durante as primeiras 24 h após a infecção. Dois dias após a infecção as células foram alimentadas com uma solução alimentados por batelada contendo glucose, aminoácidos essenciais e glutamina extra: 82 ml por litro de suspensão contendo 50 m/v % de glucose (NPBI-Países Baixos), 50x aminoácidos essenciais sem Gin (Gibco-BRL-Life Technologies) e 200 mM de glutamina (Gibco-BRL-Life Technologies). A cada segundo dia colheu-se amostras de suspensão de células de 10 ml com o fim de se realizar contagens convencionais de células (resultados mostrados na Fig. 17, gráfico à esquerda), medições de concentração de glucose (resultados mostrados na Fig. 17, gráfico à direita), imunofluorescência direta (Fig. 18), hemoaglutinação (Fig. 19) e ensaios de capacidade de infecção (dados não

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mostrados). Além disso, a proteína HA foi investigada por meio de análise de Western blot e comparada com um controle de HA padrão do NIBSC (Fig. 20). No dia da colheita final de toda a suspensão de células (92 h após a infecção) realizou-se uma clarificação dos fragmentos de células em um fluxo contínuo a 20.000 g com o uso de um sistema de separação Powerfuge® (Carr, JM Separations) de acordo com o protocolo proporcionado pelo fabricante. O sobrenadante clarificado foi então concentrado vinte vezes utilizando-se um cartucho de membrana de fibras ocas com um limiar de corte de 500 kD (A/G Technology, JM Separations). Os resultados ilustrados na Fig. 21 mostram que a recuperação quantitativa de vírus Influenza vivo após concentração por meio de fibras ocas conforme medido com ensaios de hemoaglutinação e capacidade de infecção é muito significativa.

Exemplo 10

A imunogenicidade de vírus Influenza desenvolvidos sobre PER.C6 e vacinas derivadas dos mesmos

Para se determinar a imunogenicidade de vírus Influenza desenvolvidos sobre PER.C6 projetou-se um estudo in vivo e um modelo de exposição em furões. Utilizou-se duas bateladas de vacinas trivalentes de Influenza inteiro inativado (composto de A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 e

B/Harbin/7/94), contendo 15 pg de HA de cada uma das três cepas. A primeira batelada foi obtida de ovos de galinha férteis e a segunda foi obtida de células PER.C6. A produção, purificação, inativação e formulação das vacinas trivalentes de Influenza inteiro inativado derivadas de PER.C6 foram realizadas como descrito abaixo.

Desenvolvimento de cepas de Influenza A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 e

B/Harbin/7/94 sobre PER.C6.

A produção de todas as três bateladas virais de Influenza foi realizada em três sistemas separados de bio-reatores alimentados por batelada de fibras ocas de 3 litros com volumes de suspensão de células de 2 litros.

530 ··♦ ·· * · ··

Realizou-se alimentação por batelada com a adição da seguinte solução: um volume total de 96 ml contendo 50 m/v % de glucose (NPBI), 50x aminoácidos essenciais sem Gin (Gibco-BRL-Life Technologies), 200 mM de glutamina (Gibco-BRL-Life Technologies) e 7,5 m/v % de NaHCO₃ (Merck) foi adicionado de uma só vez. Realizou-se infecções por Influenza a densidades de células variando de 1,8 x 10⁶ a 2,6 x 10⁶ células viáveis/ml, em meio ExCell 525 isento de soro contendo 5 qg/ml de tripsina-EDTA. Células PER.C6 foram inoculadas com as bateladas de vírus A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 e B/Harbin/7/94 desenvolvidos sobre PER.C6 a diferentes • * ·♦ • » •

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MOIs de: IO⁴ (A/Sydney/5/97) ou 10'³ (A/Beijing/262/95 e B/Harbin/7/94) pfu/célula. Durante o período de produção de vírus colheu-se amostras de 10 ml a cada segundo dia para realizar contagens convencionais de células e de viabilidade, medições de concentração de glucose, ensaios de imunofluorescência direta e ensaios de hemoaglutinação. A Fig. 22 (resultados de células PER.C6 infectadas com A/Sydney/5/97) mostra as contagens total e de viabilidade de células após infecção com o vírus (quadro superior à esquerda), o consumo de glucose (quadro superior à direita), o percentual de células positivas na detecção de imunofluorescência direta (quadro inferior à esquerda) e as HAUs (quadro inferior à direita). Fig. 23 (resultados das células PER.C6 infectadas com A/Beijing/262/95) mostra as contagens total e de viabilidade de células após a infecção com o vírus (quadro superior à esquerda), o consumo de glucose (quadro superior à direita), o percentual de células positivas na detecção de imunofluorescência direta (quadro inferior à esquerda) e as HAUs (quadro inferior à direita). A Fig. 24 (resultados de células PER.C6 infectadas com B/Harbin/7/94) mostra as contagens total e de viabilidade das células após infecção com o vírus (quadro superior à esquerda), o consumo de glucose (quadro superior à direita), o percentual de células positivas na detecção de imunofluorescência direta (quadro inferior à esquerda) e as HAUs (quadro inferior à direita).

Vírus contendo concentrados foram armazenados a -80°C até o DSP.

Em todos os três casos o consumo de glucose e a viabilidade e a contagem total de células das células PER.C6 foram comparáveis. Também os níveis de produção dos três vírus, conforme medido por meio de imunofluorescência direta, foram semelhantes. Embora as concentrações de HAU e de capacidade de infecção houvessem diferido entre cepas diferentes, PER.C6 conservou a replicação de todos os vírus Influenza que foram testados aqui.

No dia da colheita de toda a batelada (seja no dia 3 ou no dia 4 após a infecção) sobrenadantes virais foram clarificados por meio de centrifugação a 2000 rpm em uma centrífuga de mesa e concentrados dez vezes por meio de ultrafiltração utilizando-se um cartucho de membrana de fibras ocas com um limiar de corte de 750 kD (A/G Technology, JM Separations) seguindo-se os protocolos proporcionados pelo fabricante. Vírus Influenza foram purificados dos sobrenadantes concentrados via duas etapas subseqüentes de centrifugação de densidade: gradiente de sucrose de bloco de 25-70 % (1,5 h a 27 K) seguido de um gradiente de sucrose contínuo de 25-70 % (4 h a 23 K). Bandas virais foram diluídas em aproximadamente 50 ml de um tamponador de fosfato e, fmalmente, pelotizados a 24.000 rpm em uma ultracentrífuga. Pelotas virais foram dissolvidos em 1,5 a 2,3 ml de um tamponador de fosfato, fracionados e congelados a -80°C.

A formulação de vacinas de Influenza inativado baseia-se na quantidade (em microgramas) da proteína HA “imunologicamente ativa”, conforme medido com o ensaio de SRID (Wood et al 1977). O teste foi realizado para se caracterizar o teor de HA das bateladas. Ao mesmo tempo mediu-se a quantidade total de proteínas empregando-se o kit de ensaio de proteína DC baseado em Lowry (Biorad) seguindo-se os procedimentos sugeridos pelo fabricante. Verificou-se que HA constitui cerca de 20 a 30 % do teor total de proteína da preparação de vírus.

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Exemplo 11

Imunogenicidade in vivo de vacinas inativadas produzidas em ovos e em

PER.C6.

Furões e camundongos representam dois modelos animais 5 bem estabelecidos para se estudar infecção por Influenza e foram usados para se determinar a eficácia e a imunogenicidade de vacinas de Influenza. Utilizando-se o sistema de teste em modelo de camundongo, as imunogenicidades produzidas pelas vacinas trivalentes derivadas de PER.C6 e de ovos contendo A/Sydney/5/97, A/Beijing/262/95 e B/Harbin/7/94 são comparadas por análise dos animais vacinados através de ensaio de inibição de hemoaglutinação. Utilizando-se o modelo de infecção de furão, a imunização é seguida de uma exposição com A/Sydney/5/97. Ensaio de recuperação de vírus em células MDCK e a ensaio de inibição de hemoaglutinação realizadas nos soros são utilizadas para se comparar a imunogenicidade e a eficácia das duas vacinas.

Estudo in vivo em camundongos

Noventa camundongos fêmeas Balb/C são divididos em nove grupos de dez camundongos. No dia 0 coletou-se até 100 μΐ de sangue. O soro é separado e armazenado a -20°C. Cada camundongo é então vacinado com a vacina apropriada de acordo com o esquema na Tabela 1. No dia 28 colheu-se mais 100 μΐ de sangue. O soro é armazenado a -20°C. Cada camundongo é novamente vacinado de acordo com o esquema na Tabela I. No dia 42 colheu-se uma amostra de sangue de 100 μΐ e todos os camundongos foram sacrificados. O soro é separado e congelado a -20°C.

Conduz-se ensaios de inibição de hemoaglutinação (HI: Haemagglutination inhibition) em amostras de soro desde o dia 0, 28 e 42. Todas estes ensaios são conduzidas em paralelo a cada dia para os vírus desenvolvidos sobre ovos e sobre células.

Tabela I

Teste de imunogenicidade em camundongos

Número do grupo	Tipo de antígeno	Volume de imunização (ml)	Via de vacinação	Total de pg de Ha por dose
1	vírion inteiro trivalente de ovo	0,5	s.c.	9,0
2	vírion inteiro trivalente de ovo	0,5	s.c.	3,0
3	vírion inteiro trivalente de ovo	0,5	s.c.	1,5
4	vírion inteiro trivalente de ovo	0,5	s.c.	0,15
5	vírion inteiro trivalente de PER. C6	0,5	s.c.	9,0
6	vírion inteiro trivalente de PER. C6	0,5	s.c.	3,0
7	vírion inteiro trivalente de PER. C6	0,5	s.c.	1,5
8	vírion inteiro trivalente de PER. C6	0,5	s.c.	0,15
9	PBS	0,5	s.c.	0

Estudo in vivo em furões.

Dezoito furões fêmeas adultos (albinos ou doninhas) foram divididos em três grupos de seis divididos como a seguir: O grupo 1 recebeu a vacina de teste derivada de ovo por via intramuscular (i.m.), os animais foram expostos a A/Sydney/5/97. O grupo 2 recebeu a vacina de teste derivada de PER.C6 por via i.m., os animais foram expostos a A/Sydney/5/97. O grupo 3 recebeu apenas o diluente de vacina de teste e foi exposto a A/Sydney/5/97. Nos dias 0 e 28 administrou-se as vacinas de teste, li No dia 56, todos os furões foram infectados por via intranasal com 0,5 ml do vírus de exposição A/Sydney/5/97 a TCID₅₀ 10³. Realizou-se lavagens nasais e as contagens de células inflamatórias, a temperatura e os pesos dos furões foram monitorados uma vez ao dia desde o dia 57 até o dia 63. Todos os animais foram sacrificados no dia 63. O soro foi separado e armazenado a 15 20°C. As amostras de lavagem nasal foram armazenadas em gelo e realizouse uma contagem de recuperação de células da lavagem nasal utilizando-se ensaio de exclusão de Trypan blue.

Determinou-se a concentração dos vírus obtidos das amostras de lavagem nasal através da medição da recuperação de vírus em células

MDCK. Utilizou-se o cálculo de Spearman e Karber (1931) para calcular os

5R • « ·* ·« valores de TCID₅₀. Conduziu-se ensaios de inibição de hemoaglutinação em amostras de soro colhidas nos dias 0, 28, 56 e 63. Com base neste experimento conclui-se que a vacina de teste derivada de PER.C6 foi efetiva.

Exemplo 12

Caracterização de proteína HA derivada de vírus Influenza produzido sobre

- PER.C6

Visando estudar a glicosilação de HA em células PER.C6 gerou-se uma batelada de HA não-clivada (HAO). Células PER.C6 foram infectadas com vírus A/Sydney/5/97 (número de passagem 5 sobre PER.C6) a

UI MOIs de 1, 0,1 e 0,01 pfu/célula em meio ExCell 525 contendo tripsinaEDTA à concentração final de 5 pg/ml. Após 1 h de incubação a 35°C, as células foram lavadas duas vezes com PBS para remover a tripsina e incubadas O/N a 35°C e com 10 % de CO₂, na ausência de tripsina. No dia seguinte, as suspensões de células foram colhidas e centrifugadas (500 g) e os pelotas de células foram lavados duas vezes com meio. Sobrenadantes virais foram congelados a -80°C e utilizou-se amostras dos mesmos em ensaios de Western blot conforme descrito para investigar a presença ou a ausência de proteína HA não-clivada.

Proteína HA não-clivada (HAO) consiste de duas subunidades:

HA1 e HA2, que são conectadas via uma ligação dissulfeto. Como esta ligação dissulfeto pode ser rompida via redução com DTT, HA1 e HA2 podem ser separadas e visualizadas sobre um gel redutor seguido de Western blots utilizando-se anti-soros que reconhecem as subunidades. Caso a proteína HA consista apenas de HAO, será possível visualizar uma banda que migra mais lentamente através de um gel de SDS/PAGE em comparação com a subunidade de HA1 e com a subunidade HA2 que migra mais longe. Os resultados mostrados na Fig. 25 sugerem a presença de HAO predominantemente não-clivada de infecções com PER.C6 quando comparados com o controle positivo derivado de ovo que foi obtido junto ao <

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NIBSC (UK). Para confirmar que a banda detectada era efetivamente hemoaglutinina não-clivada digerida, uma amostra de HAO foi digerida com diferentes concentrações de tripsina variando de 2,5 a 10 pg/ml em meio O/N a 37°C. As proteínas digeridas foram então carregadas em condições de redução sobre um gel de SDS/PAGE seguido de análise de Western blot utilizando-se os mesmos anti-soros conforme descrito para Fig. 14. Como mostrado na Fig. 26A foi possível obter a divagem do HAO, confirmando a geração de proteína HA não-clivada em PER.C6. Com base nestes resultados desenvolveu-se um ensaio para determinar a atividade de tripsina em meio de cultura, utilizando-se HAO de Influenza como substrato.

Ensaio de atividade de tripsina

Para se determinar se a tripsina, presente no meio de cultura de uma operação de produção de Influenza, ainda está ativa desenvolveu-se um ensaio de atividade de tripsina. Este ensaio baseia-se na medição da atividade enzimática da tripsina para clivar o substrato mais relevante para a produção de vacina de Influenza: a HAO.

Determinou-se se, em uma cultura de PER.C6 inoculadas com Influenza B/Harbin/7/94 (MOI de 10’³/10-4 pfu/célula), a tripsina permanecia ativa durante toda a operação de produção. Para tal finalidade, 10 μΐ de sobrenadante colhido nos dias 1, 2 e 3 após a infecção foram usados para clivar 68 ng do substrato que consistia de HAO de vírus Influenza A Sydney/5/97, O/N a 37°C. Após a digestão adicionou-se inibidores de protease até uma concentração final de lx (coquetel inibidor de protease completo, Boehringer Mannheim) em 3x tamponador Laemli com 150 mM de

DTT (Fluka). As amostras foram carregadas sobre um gel de 10 % de TrisHCL SDS/PAGE gel (Biorad) e processadas. Realizou-se o Western blot conforme descrito. Os resultados são mostrados na Fig. 26B e demonstram que nas culturas de PER.C6 inoculadas com vírus Influenza B/Harbin a tripsina permanecia ativa durante toda a operação de produção, como os ri »« » «

sobrenadantes de cultura também foram capazes de clivar HAO completamente.

Exemplo 13

Digestão de HAO com N-Glicosidase F

A proteína HA de vírus Influenza é uma glicoproteína que contém de 3 a 9 sítios de oligossacarídeos de glicosilação ligados a N. O número de sítios depende da cepa do vírus. A localização destes sítios é determinada pela seqüência de nucleotídeos do gene de HA, e, como o genoma viral do Influenza é replicado por uma RNA polimerase propensa a erro, ocorrem freqüentemente mutações que geram a adição ou a remoção de sítios de glicosilação. Determina-se então a composição e a estrutura das cadeias de oligossacarídeos presentes na HA por meio de um conjunto de enzimas de glicosilação biossintéticas e de aparação proporcionadas pela célula hospedeira. Como a glicosilação de HA desempenha um papel importante na virulência e na eficácia da vacina, investigou-se as propriedades de HA produzida em PER.C6 infectadas com Influenza. A digestão de proteína HAO não clivada de A/Sydney/5/97 com a enzima F de N-glicosidase foi realizada utilizando-se protocolos fornecidos pelo fabricante para remover os sete oligossacarídeos que se espera estarem presentes no polipeptídio de HA de A/Sydney/5/97. O A/Sydney/5/97 de Influenza foi lisado com 1 % d Triton X-100 (Merck). O inibidor de protease foi adicionado a uma fração deste vírus lisado correspondendo a 68 ng de HA, até uma concentração final de lx (coquetel completo de inibidor de protease Boehringer Mannheim). Esta amostra foi incubada na presença de

100 mM de NaPO₄ pH 7, 10 mM de EDTA (J.T. Baker), 1 % de SDS (J.T.

Baker) e 1 % de B-mercaptoetanol (Merck). Isto foi incubado durante 10 min à temperatura ambiente. A amostra foi diluída 5 vezes em mM de NaPO₄ pH 7, 10 mM de EDTA (J.T. Baker), 0,625 % de NP-40 e 1 % de Bmercaptoetanol (Merck). Disto, utilizou-se 40 μΐ para a digestão de glico-P.

* :« ··· * » · • ♦

Para isto adicíonou-se 2 μΐ de 10/μΙ de glico-F (N-Glicosidase F, Boehringer) e incubou-se durante um período mínimo de 16 h a 37°C. Em seguida, adicionou-se 3x tamponador Laemli com 150 mM de DTT (Fluka) até uma concentração final de lx. As amostras foram processadas sobre um gel de

SDS/PAGE a 7,5 %. O SDS-Page e Western blot foram realizados como a seguir. De maneira resumida, o manchamento foi bloqueado durante 30 min à temperatura ambiente com solução de bloco (5 % de leite em pó desnatado,

Biorad em TBST suplementado com 1 % de soro de coelho (Rockland), seguido de 3 lavagens com TBST. Em seguida, o manchamento foi incubado com o anti-soro de HA aíiti A/Sydney/5/97 HA (98/768 NIBSC) diluído a 1/500 em 1 % de BSA/TBST com 5 % de soro de coelho (Rockland) de um dia para o outro à temperatura ambiente. Novamente, o manchamento foi lavado 8 vezes com TBST. Finalmente, o manchamento foi incubado com o anti-soro anti-ovelha de coelho marcado com HRP (Rockland) diluído a

1/6000 em solução de bloqueio durante 1 h à temperatura ambiente. Após 8 lavagens com TBST o complexo proteína-conjugado foi visualizado com ECL (Amersham Pharmacia Biotech), e expôs-se películas (Hyperfilm,

Amersham Life Science). Como mostrado na Fig. 27, o tratamento com a enzima F de glicosidase reduziu claramente o tamanho da proteína com aproximadamente 28-30 kD, sendo [isto] aproximadamente a perda predita de cerca de 4 kD por oligossacarídeo. A banda de proteína representada com um asterisco (*) é a HAO desglicosilada, que migra de uma maneira semelhante para o produto de subunidade de HA1 obtido após divagem de HAO em subunidades HA1 e MA2 (faixas à direita).

Exemplo 14

Clivagem de HAO com Accutase.

Investigou-se a possibilidade de substituir tripsina-EDTA derivado de mamíferos por proteínas não-mamíferas ou recombinantes. Recentemente, uma mistura de enzimas proteolíticas e colagenolíticas (Accutase®, PAA) de espécies invertebradas tomou-se disponível para cultura de células de rotina. Devido a esta fonte a Accutase não-mamífera é livre de príons, parvovírus e outros componentes que podem contaminar potencialmente soluções de tripsina-EDTA. Até agora não foi possível obter qualquer informação no que se refere ao tipo de proteases presentes na Accutase. A divagem de HAO foi estudada utilizando-se análise de Western blot. Uma quantidade constante de proteína HAO, obtida por meio de PER.C6 infectada com A/Sydney/5/97 a uma MOI de 1 pfu por célula sem tripsina, foi digerida com diluições seriais de Accutase, O/N a 37°C. Como um controle positivo utilizou-se a mesma quantidade de HAO foi digerida com 100 ng de tripsina-EDTA. As proteínas digeridas foram então carregadas sobre um gel de SDS-PAGE a 10 %, sob condições de redução, para análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 28 a digestão com tratamento de 2 μΐ de Accutase resultou em divagem completa de HAO; observou-se divagem parcial utilizando-se 0,2 μΐ.

Estes resultados sugerem que o tratamento com Accutase durante a replicação e produção de Influenza pode substituir tripsina-EDTA durante infecções com Influenza sobre PER.C6.

Exemplo 15

Análise de microscopia de elétrons de vírus Influenza sobre células PER.C6

Realizou-se estudos de transmissão de microscopia de elétrons sobre a cepa de Influenza A/Sydney/5/97, e também sobre sobrenadantes contendo viral e material purificado de sucrose para determinar o fenótipo deste vírus Influenza produzido sobre PER.C6. Todos os métodos que foram utilizados são bem conhecidos por pessoas versadas na arte. A Fig. 29 mostra que os últimos estágios do ciclo de vida do vírus são representados pelo brotamento e a liberação de vírions envelopados da membrana citoplásmica. Detectou-se picos correspondendo às proteínas virais HA e NA, ornamentando a periferia das partículas de vírions. A figura também mostra o ο» ·#*-* ·» pleiomorfismo característico de vírus Influenza.

Exemplo 16

Infecção de PER.C6 com uma grande variedade de cepas de vírus Influenza

AeB

5- O uso de PER.C6 como uma tecnologia de plataforma para a produção de vacina de Influenza requer que PER.C6 suporte o desenvolvimento de uma ampla faixa de cepas de diferentes subtipos de Influenza.

Culturas em suspensão estática de células PER.C6 que foram desenvolvidas em frascos T25 e/ou em placas de 6 poços em meio ExCell 525 foram infectadas a uma densidade de células de 10⁶ células/ml com 16 cepas diferentes de vírus Influenza mostradas na Fig. 30A. Estas cepas compreenderam diversas cepas avícolas e de tipo H3N2, H1N1, B. As infecções foram realizadas na presença de 5 pg/ml de tripsina. Os vírus foram obtidos junto ao NIBSC (UK) como tipo selvagem passado sobre ovo ou cepas subdivididas e são indicados. A infecção foi realizada com uma diluição de vírus recomendada pelo NIBSC nas folhas de produto que foram fornecidas com as diferentes cepas. Todos os vírus testados foram capazes de propagação sobre PER.C6 conforme visualizado por imunofluorescência (dados não mostrados) e titulação de fluídos de sobrenadante em ensaio de pfu (Fig. 30B).

Estes resultados mostram que até mesmo cepas de Influenza (ilustradas por um asterisco), como A/Johannesburg/33/94, B/Beijing/184/93 e A/Duck/Singapore-Q/F 119-3/97, que normalmente são difíceis de produzir sobre ovos embrionados, podem replicar e ser produzidos sobre as células PER.C6 humanas.

Exemplo 17

Geração de vírus de Herpes Simples de tipo 1 (HSV-1T vírus de Herpes

Simples de tipo 2 (HSV-2) e vírus do sarampo sobre PER.C6.

Testou-se se outros vírus além do vírus Influenza e o aderiovírus, como vírus do Herpes simples de tipo 1 e 2 e vírus do sarampo, também poderíam replicar sobre PER.C6. Vacinas que se derivam destes vírus desenvolvidos sobre PER.C6 e que induzem efeitos neutralizadores em

S humanos para a proteção contra infecções de tipo selvagem são geradas a partir de bateladas de vírus desenvolvidos sobre PER.C6. As cepas que foram obtidas junto à ATCC e usadas para infecção de células PER.C6 são ilustradas na Tabela II.

Tabela II

Cepas vírus do Herpes simples e do sarampo que foram obtidas junto à

ATCC e que foram usadas para a infecção de células PER.C6.

Vírus	Cepa	ATCC	Lote n°	História da passagem	Titulação
Herpes Simples tipo 1	Macintyre	VR-539	1327850	y.s./12, PR RabK/5, Mb/1, PrRabK/5, Vero/4, Vero (ATCC CC1-81)/1	106'75 TCID50/200 μΐ
Herpes Simples tipo 2	MS	VR-540	216463	Plexo coróide de ovelha/?, HeLa/?, PrRabK/7, V ero (ATCC CCl-81)/3	ίο7·5 TCID50/200 μΐ
Sarampo	Edmonston	VR-24	215236	HK/24, HuAm/40, MRC5/1, MRC-5 (ATCC CCL171)/1	104 TCID50/ml

Para testar se os vírus HSV-1 e HSV-2 e do sarampo obtidos junto à ATCC poderíam replicar e ser produzidos sobre PER.C6, semeou-se células de passagem número 46 em câmaras labtek revestidas com Poli-L15 Lisina utilizando-se métodos conhecidos por pessoas versadas na arte, a 10⁵ células/poço. Células Vero derivadas de macaco (obtidas junto à ATCC) foram cultivadas na passagem número 137 e foram usadas como controles positivos e semeadas a uma densidade de 2,5 x 10⁴ células/poço. No dia 0, quando poços com células PER.C6 apresentaram 60 % de confluência e células Vero apresentaram 80 % de confluência, as células foram infectadas com diferentes MOIs (10³, 10², 10^_1 e 1 TCID⁵⁰ por célula). Em intervalos diários após infecção as células foram fixadas e analisadas mediante imunofluorescência utilizando-se anticorpos monoclonais específicos-para41 tipo conjugados com FITC utilizando-se um kit (Imagen Herpes Simplex Virus (HSV) de tipo 1 e 2, (Dako) e anticorpos conjugados com FITC contra a proteína HA e de matriz de vírus do sarampo (measles IFA kit, Light diagnostics) de acordo com os procedimentos sugeridos pelo fabricante. Os anti-soros são direcionados contra antígenos de vírus HSV-1 e -2 e do sarampo.

• ·· • ♦ • · • ♦

Os resultados resumidos na Fig. 31 mostram que PER.C6 é permissivo para infecções por HSV-1 (Fig. 31D), HSV-2 (Fig-31E) e vírus do sarampo (Fig. 31 A). Além disso, as cinéticas sugerem que estes vírus replicam sobre PER.C6 de uma maneira dependente de MOI.

Em seguida investigou-se se HSV-1, -2 e o vírus do sarampo poderíam ser propagados sobre PER.C6. A isto infectou-se células finais com uma MOI de 0,01, 0,1 e 1 TCID₅₀/célula para HSV-1 (Fig. 32C) e HSV-2 (Fig. 32A) e uma MOI de 0,001 TCID₅o/célula para vírus do sarampo (Fig. 32B) (número de passagem 3). Na ocorrência de cpe quase completa, as células e sobrenadantes foram colhidos, rapidamente congelados em N₂ líquido, e orvalhados. Após isto, os sobrenadantes clarificados foram passados de maneira cega utilizando aproximadamente 100 μΐ sobre PER.C6 (este é número de passagem 2). Após se atingir novamente uma cpe quase completa realizou-se uma terceira passagem (número de passagem 3) de uma maneira semelhante. As MOIs dos números de passagem 2 e 3 foram determinadas em retrospecto por meio de ensaios TCID₅₀.

Os resultados destes experimentos mostram que os vírus do Herpes Simples de tipo 1 e 2 e o vírus do sarampo podem ser replicados sobre PER.C6 e que a replicação e a propagação pode ocorrer até mesmo quando se utiliza MOIs tão baixas quanto 10'⁷.

Exemplo 18

Seleção de rotavírus para replicação sobre PER.C6.

Para se testar se PER.C6 também poderia suportar a replicação de um rotavirus, células 'PER.C6 foram infectadas com um rotavirus Rhesus (MMU 18006; ATCC#VR-954; cepa S:USA:79:2; lot#2181153). Células PER.C6 (número de passagem 41) foram cultivadas a uma densidade de 1 x 10⁵ por ml e células Vero derivadas de macaco (obtidas junto à ATCC, número de passagem 139) foram cultivadas a uma densidade de 2,5 x 10⁴ por ml, e subseqüentemente semeadas em câmaras Labtek, que haviam sido prérevestidas com poli-L-lisina utilizando-se processos conhecidos por pessoas versadas na arte. As células foram infectadas com uma MOI de 1 TCID₅₀/célula de rotavirus Rhesus na presença e na ausência de 2 pg/ml de tripsina-EDTA. Após 90 min de infecções, as células foram lavadas com meio ExCell 525 e ainda mais incubadas a 37°C em 10 % de CO₂ sob uma atmosfera umidificada. Durante 5 dias consecutivos após a infecção colheuse amostras dos sobrenadantes [que foram] clarificados de células e de fragmentos celulares e analisados com uma ELISA específica para rotavirus (IDEIA Rotavirus, Dako). Os resultados ilustrados na Fig. 33 mostram claramente que o rotavirus Rhesus replica sobre PER.C6.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Fig. 1. Percentual de células infectadas (células positivas) observado microscopicamente após ensaio de imunofluorescência versus o percentual de células mortas medido via FACS após manchamento com iodeto de propídio, a MOIs de 10-3 e 10-4.

A baixa viabilidade das células das amostras derivadas de infecção a MOI de 10-3 não deu origem a dados confiáveis.

Fig. 2. Percentual de células infectadas observadas microscopicamente após ensaio de imunofluorescência. As amostras derivadas de infecção a MOI de 10 e 1, 48 h após a infecção, não são mostradas, devido a CPE completa.

Fig. 3. Cinéticas da propagação de vírus medidas em unidades hemoaglutinadoras (HAU) desde o dia 1 até o dia 6 após infecção.

····

........... ·

Fig. 4. Percentual de células infectadas (células positivas) observadas microscopicamente após ensaio de imunofluorescência.

Fig. 5. Cinéticas de propagação de vírus medidas em unidades hemoaglutinadoras (HAU) desde o dia 1 até 6 após infecção.

Fig. 6. Percentual de células infectadas (células positivas) observadas microscopicamente após ensaio de imunofluorescência.

Fig. 7. Cinéticas de propagação de vírus medidas em unidades hemoaglutinadoras (HAU) desde o dia 2 até o dia 6 após infecção.

Fig. 8. Expressão de ligações Sia2-3Gal e Sia2-6Gal sobre receptores de superfície celular presentes em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO: Chinêse Hamster Ovary), células PER.C6 e células de MDCK. (A) Representação esquemática da interação da lactina de aglutinina de Sambuca nigra (SNA) que reconhece especificamente ligaçõesSia2-6Gal e da lactina de aglutinina de Maackia amurensis (MAA) que reconhece especificamente ligações Sia2-3Gal. A interação esquemática com o anticorpo anti-DIG marcado com FITC reconhecendo a lectina marcada com DIG ligada à cadeia de oligossacarídeo sobre a proteína de superfície celular também é ilustrada. (B) Análise FACS de células incubadas com lectinas marcadas com DIG. Detectou-se lectinas ligadas às células com anticorpo anti-DIG marcado com FITC utilizando-se processos conhecidos por pessoas versadas na arte. As contagens dos números de células são plotadas contra a intensidade de fluorescência de células manchadas com lectina (cinza) em comparação com células que foram incubadas apenas com o anticorpo antiDIG [marcado com] FITC (aberto). Os quadros superiores mostram o desvio na análise FACS obtido com o uso de lectina SNA, e os quadros inferiores mostram o desvio na análise FACS obtido com o uso de lectina MAA.

Fig. 9. Infecção com A/Sydney/5/97 sobre PER.C6. (A) Efeito de tripsina-EDTA sobre titulações de HAU. (B) Concentração de HA em pg/ml e (C) titulações de capacidade de infecção de vírus em pfu/ml

.........* ·. ; _φ, conforme medido em sobrenadantes virais brutos, 96 horas após infecção.

Fig. 10. Infecção com B/Harbin/7/94 sobre PER.C6. (A)

Efeito de diferentes concentrações de tripsina-EDTA presentes durante e após infecção com o vírus sobre a cinética do crescimento. (B) Titulações de EEAU

S por 50 μΐ e (C) titulações de capacidade de infecção de vírus em pfu/ml.

Fig. 11. Infecção com X-127 utilizando-se uma MOI de 10'³ sobre PER.C6. (A) Efeito de tripsina-EDTA sobre HAU dado em HAU/50 μΐ e (B) titulações de capacidade de infecção de vírus em pfu/ml durante 5 dias após infecção.

Fig. 12. Infecção com X-127 utilizando-se uma MOI de 10‘⁴ sobre PER.C6. (A) Efeito de tripsina-EDT sobre HAU dado em HAU/50 μΐ e (B) titulações de capacidade de infecção de vírus em pfu/ml durante 5 dias após infecção.

Fig. 13. Efeito de tripsina-EDTA sobre (A) viabilidade de 15 células PER.C6 e (B) atividade biológica do vírus. A viabilidade das células foi medida após manchamento com trypan-blue. As titulações de HAU foram medidas conforme descrito e dadas por 50 μΐ.

Fig. 14. Efeito de tripsina-EDTA sobre as titulações de capacidade de infecção de vírus e teor de proteína HA após infecção com

Influenza de células PER.C6 com A/Sydney/5/97. (A) O ensaio de capacidade de infecção foi realizado por meio de inoculação, em quadruplicata, de células MDCK com um total de 100 μΐ de sobrenadantes contendo vírus diluídos serialmente 10 vezes em meio isento de soro com tripsina-EDTA (4 pg/ml). Após sete dias, o sobrenadante destas culturas foi testado quanto à atividade de HA. As titulações de vírus infecciosos foram calculadas de acordo com o método de Spearman-Karber (1931). (B) análise de Western blot da proteína HA de A/Sydney/5/97. A colheita das proteínas virais foi realizada por meio de disrupção e desnaturação de proteínas utilizando-se um tamponador de lise contendo SDS. A operação • · • •Μ eletroforésica foi realizada sobre um gel de 10 % de SDS/PAGE em condições redutoras. Proteínas separadas foram sondadas com os anti-soros anti-A/Sydney-HA específicos. Carregou-se quantidades crescentes do controle positivo antígeno A/Sydney HA (4 faixas à esquerda) e 10 μΐ de sobrenadantes de células PER.C6 das amostras incubadas com a tripsina indicada (5 faixas à direita).

Fig. 15. Viabilidade de células PER.C6, concentração de glucose e cinéticas de desenvolvimento de A/Sydney/5/97 em um sistema de perfusão de fibras ocas.

Fig. 16. Caracterização e quantificação do vírus Influenza A/Sydney/5/97 propagado sobre PER.C6 em um sistema de perfusão de fibras ocas. Realizou-se SDS-PAGE e Western blots como descrito na legenda da Fig. 14 para o anticorpo anti-A/Sydney-HA de ovelha. O anticorpo monoclonal anti HA-tag (sonda HA (F7), monoclonal de camundongo (Santa Cruz) foi utilizado numa diluição de 1:1000. Como um segundo anticorpo utilizou-se um anticorpo conjugado HRP-anti[jcamundongo de cabra (Biorad) numa diluição de 1:7500.

Fig. 17 Viabilidade de células PER.C6 (quadro à esquerda) e concentração de glucose (quadro à direita) em um bio-reator de 12 litros até 92 b após infecção viral utilizando vírus A/Sydney/5/97.

Fig. 18. Infecção de PER.C6 com A/Sydney/5/97 em uma suspensão de células de 10 litros em um bio-reator de 12 litros. Cinéticas de replicação de vírus conforme medidas por meio de ensaio de imunofluorescência são dadas em percentuais de células manchadas positivamente.

Fig. 19. Infecção de células PER.C6 com A/Sydney/5/97 em uma suspensão de células de 10 litros em um bio-reator de 12 litros. As cinéticas da replicação de vírus conforme medidas por meio de ensaio de hemoaglutinação são dadas em HAUs durante vários dias após infecção viral.

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A barra ilustrada com um asterisco é o número de HAUs obtidas após clarificação com Powerfuge® conforme descrito no texto.

Fig.20. Western blot após uma infecção de PER.C6 com vírus A/Sydney/5/97 em uma suspensão de células de 10 litros em um bio-reator de 12 litros. Mostra-se a caracterização e a quantificação do polipeptídio HA do vírus Influenza A/Sydney/5/97. Realizou-se SDS/PAGE e Western blot conforme descrito na legenda da figura 14. As diferentes subunidades (HA1 e HA2) e as proteínas HAO não-clivadas são ilustradas com setas. A HA obtida junto ao NIBSC serviu como um controle positivo.

Fig. 21. Determinação de HAUs e pfu/ml após infecção de PER.C6 com A/Sydney/5/97 em uma suspensão de células de 10 litros em um bio-reator de 12 litros. A infecção foi seguida de Processamento de Fluxo Descendente (DSP: Down Stream Processing). Mostra-se também a recuperação de rendimentos virais após ultrafiltração através de fibras ocas (concentração de 20 vezes).

Fig. 22. Infecção de PER.C6 com A/Sydney/5/97 em uma suspensão de células de 2 litros em um bio-reator de 3 litros. Dá-se a viabilidade de células PER.C6 (alto à esquerda), concentração de glucose (alto à direita) e cinéticas de desenvolvimento do vírus no percentual de células que mancharam positivamente (abaixo à esquerda) e HAUs (abaixo à direita).

Fig. 23. Infecção de PER.C6 com A/Beijing/262/95 em suspensão de células de 2 litros em um bio-reator de 3 litros. Dá-se a viabilidade de células PER.C6 (alto à esquerda), concentração de glucose (alto à direita) e cinéticas de desenvolvimento do vírus no percentual de células que mancharam positivamente (abaixo à esquerda) e HAUs (abaixo à direita).

Fig. 24. Infecção de PER.C6 com B/Harbin/7/94 em uma suspensão de células de 2 litros em um bio-reator de 3 litros. Dá-se a ⁿ · * 4 - · * • ·» · «· viabilidade de células PER.C6 (alto à esquerda), concentração de glucose (alto à direita) e cinéticas de desenvolvimento do vírus no percentual de células que mancharam positivamente (abaixo à esquerda) e HAUs (abaixo à direita).

Fig. 25. análise de Western blot de proteína HAO de A/Sydney/5/97 não-clivada. Detecta-se proteínas que mancham positivamente após incubação com os anti-soros anti-A/Sydney específicos obtidos junto ao NIBSC e descritos como na legenda da Fig. 14 e no texto.

Fig. 26. (A) análise de Western blot de proteína HAO derivada de A/Sydney/5/97 digerida com tripsina. Proteínas são detectadas após incubação com os anti-soros anti-A/Sydney específicos. À esquerda, um HA de A/Sydney padrão clivado, à direita, HAO tratado com quantidade crescente de tripsina. (B) Determinação da atividade de tripsina no sobrenadante de cultura de uma operação de produção de Influenza B/Harbin, utilizando-se HAO de Influenza A/Sydney/5/97 como substrato, análise de Western blot de produtos de divagem de HAO, HA1 e HA2, conforme visualizado por meio de anti-soros específicos para HA de anti-Influenza A/Sydney/5/97 indicados na legenda da Fig. 14.

Fig. 27. análise de Western blot de HAO de A/Sydney digerido com N-glicosidase F. Proteínas são detectadas com os anti-soros antiA/Sydney específicos. A banda de proteína ilustrada com um asterisco é o produto desglicosilado.

Fig. 28. Análise de Western blot de HA de A/Sydney/5/97 após digestão com Accutase. Proteínas são detectadas após incubação com os anti-soros policlonais anti-A/Sydney-HA específicos. À esquerda, HAO antes e após tratamento com tripsina, à direita HAO digerido com quantidade descrescente de Accutase.

Fig. 29. Micrografias de elétrons de Influenza A/Sydney/5/97.

(A) Células PER.C6 72 h após infecção. (B e C) Manchamento negativo em

• ···· « _Ι vírus derivado de PER.C6 infectadas. (D e E) Manchamento negativo de material purificado com sucrose.

Fig. 30. (A) Todas as diferentes cepas de Influenza, A e B, testadas em células PER.C6. (B) Titulações de capacidade de infecção dos três vírus de tipo A e B ilustrados derivados de células PER.C6.

Fig. 31. Imunofluorescência de PER.C6 e células Vero infectadas com vírus que não de Influenza. (A) Células que mancham positivamente após infecção com vírus do sarampo. (B) Células que mancham positivamente após infecção de células Vero com vírus HSV-í. (C) Células que mancham positivamente após infecção de células Vero com vírus HSV-2. (D) Células que mancham positivamente após infecção de células PER.C6 com vírus HSV-1. (E) Células que mancham positivamente após infecção com células PER.C6 com vírus HSV-2.

Fig. 32. Titulações de capacidade de infecção determinadas após propagação do vírus do sarampo (quadro do meio), HSV-1 (quadro inferior) e HSV-2 (quadro superior) sobre células PER.C6.

Fig. 33. Replicação de rotavírus após infecção de células PER.C6 (quadro superior) e Vero (quadro inferior) com diferentes MOIs conforme medido com ELISA em sobrenadantes brutos.

5..

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Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para a produção de um vírus e/ou proteínas virais diferentes de adenovírus ou de proteínas adenovirais para uso como uma vacina, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar uma célula com um ácido nucléico codificando o referido vírus, cultivar a referida célula em um meio, e permitir a expressão do referido vírus e coletar o referido vírus e/ou proteínas virais a partir do referido meio e/ou da referida célula, em que referida célula é uma PER.C6 depositada no ECACC sob número de acesso 96022940.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula não produz proteínas estruturais adenovirais.
3. 3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a referida célula compreende adicionalmente uma sequência codificando E2A.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a referida sequência que codifica E2A está presente no genoma da referida célula humana.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a referida sequência que codifica E2A codifica um mutante E2A sensível à temperatura.
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida célula humana não compreende quaisquer outras sequências adenovirais.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida célula humana é capaz de se desenvolver em suspensão.
8. 8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida célula humana é cultivada na ausência de soro.

   Petição 870170003552, de 18/01/2017, pág. 4/11

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9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido vírus compreende uma proteína que sofre modificações pós-traducionais e/ou peritraducionais.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as referidas modificações compreendem glicosilação.
11. 11. Método de acordo com as reivindicações 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a referida proteína viral compreende pelo menos uma dentre uma neuraminidase e/ou uma hemoaglutinina de vírus Influenza.
12. 12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um enterovírus, como um rinovírus, aftovírus, ou vírus da poliomielite.
13. 13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um herpes-vírus, como vírus do herpes simples, vírus da pseudo-raiva ou vírus do herpes bovino.
14. 14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um ortomixovírus, como um vírus Influenza, um paramixovírus, como um vírus da doença de Newcastle, vírus sincicial respiratório, vírus da caxumba ou um vírus do sarampo.
15. 15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um retrovírus, como um vírus da imunodeficiência humana, ou de que o referido vírus é um parvovírus ou um papovavírus.
16. 16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um rotavírus ou um coronavírus, como um vírus da gastroenterite transmissível

    Petição 870170003552, de 18/01/2017, pág. 5/11

    3/4 ou um flavivírus, como um vírus da encefalite transmitido por carrapato ou vírus da febre amarela.
17. 17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um togavírus, como um vírus da rubéola ou vírus da encefalomielite equina venezuelana, do leste, ou do oeste.
18. 18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um vírus causador da hepatite, como vírus da hepatite A ou vírus da hepatite B.
19. 19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um pestivírus, como um vírus da cólera dos porcos ou um rabdovírus, como um vírus da raiva.
20. 20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o referido vírus é um vírus Bunyaviridae, como Hantavírus.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a adição de um excipiente aos vírus coletados e/ou proteínas virais, para obter uma composição farmacêutica de vacina.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender adição de um adjuvante.
23. 23. Método de acordo com as reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende vírus inativado ou uma ou mais subunidades de um vírus.
24. 24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizado pelo fato de que a vacina compreende pelo menos hemaglutunina de um vírus Influenza.
25. 25. Uso de uma célula humana imortalizada, caracteriPetição 870170003552, de 18/01/2017, pág. 6/11

    4/4 zado pelo fato de que dita célula humana apresenta uma sequência codificando pelo menos uma proteína E1 de um adenovírus em seu genoma, sendo que esta célula não produz proteínas adenovirais, para a produção de um vírus não adenoviral para o uso em uma vacina, e em que a referida célula humana é uma célula PER.C6 depositada no ECACC sob número de acesso 96022940.
26. 26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a referida célula humana compreende adicionalmente uma sequência codificando E2A em seu genoma.
27. 27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o referido E2A é sensível à temperatura.

    Petição 870170003552, de 18/01/2017, pág. 7/11

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    Ϋ/Ζ7/Ά mói 0.1 MOI 1 MOI10