BRPI0108364B1 - “receptáculo para receber amostras, e, método para isolar ácido nucleico de sangue total - Google Patents

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Abstract

"receptáculo para receber amostras, métodos para coletar sangue, para estabilizar e/ou isolar ácido nucleico de sangue total, usos de um receptáculo, de uma solução contendo sal guanidínio, uma substância tampão, um detergente e/ou um agente redutor, assim como uma fase sólida de ligação a ácido nucleico". a invenção refere-se a um receptáculo para coleta de amostras, contendo uma solução estabilizante de ácido nucleico, e uma fase sólida de ligação a ácido nucleico. o receptáculo é especialmente apropriado para a amostragem de sangue a ser testado para ácido nucleico.

Description

“RECEPTÁCULO PARA RECEBER AMOSTRAS, E, MÉTODO PARA ISOLAR ÁCIDO NUCLEICO DE SANGUE TOTAL” A presente invenção refere-se a um receptáculo para receber amostras, preferivelmente para a coleta de sangue, pelo que o sangue coletado deve ser aplicado especialmente para estabilização, isolamento e testes de ácidos nucleicos.
Durante a coleta da amostra, o sangue é convencionalmente coletado em receptáculos já contendo anticoagulantes, como heparina, citrato ou EDTA. Assim, evita-se que o sangue coagule. As amostras de sangue obtidas deste modo podem ser armazenadas em temperaturas apropriadas durante períodos mais longos de tempo. Referido tipo para obter sangue, no entanto, envolve inconvenientes consideráveis se os ácidos nucleicos, como mRNA ou DNA, devem ser analisados. Para estes fins, os ácidos nucleicos contidos na amostra devem ser melhor estabilizados no momento da coleta, em outras palavras, a degradação dos presentes ácidos nucleicos, mas também a nova síntese de mRNA deve ser evitada.
Este objetivo, com relação à armazenagem estável de ácidos nucleicos contidos no material de amostra desde o momento de coleta, tem sido até agora praticamente impossível de alcançar tendo em vista a armazenagem do sangue pelas seguintes razoes: As células contêm nucleases, isto é, enzimas, que destroem os ácidos nucleicos logo que eles entram em contato com seus substratos (RNA, DNA). O efeito de nucleases celulares e extra-celulares está, normalmente, sob controle fisiológico, desde que as células estejam em seu ambiente normal. A coleta de sangue resulta em mudanças mais ou menos fortes dos ácidos nucleicos contidos nas células. As nucleases estão, então, dentro das células e/oü pela lise de células, liberadas para fora. Além disso, ácidos nucleicos são sintetizados de modo mais ou menos forte. Especificamente, a armazenagem a longo prazo permanente de sangue resulta no envelhecimento e destruição das células.
Outro problema envolvido na armazenagem a longo prazo de amostras de sangue obtidas de acordo com os métodos de coleta convencionais reside na forte transformação de material de amostra. Estas mudanças, como a lise forte de células pode acarretar que os métodos padrões para o isolamento de ácidos nucleicos não trabalham mais com eficiência satisfatória e capacidade de reprodução.
Além dos problemas com relação à armazenagem estável de ácidos nucleicos contidos no material de amostra, o método convencional de coleta de sangue acarreta dificuldades adicionais. Durante o isolamento dos ácidos nucleicos, os anti-coagulantes convencionais não são, com ffeqüência, separados com suficiente eficiência, e tem um efeito perturbador nos testes de ácido nucleico subsequentes, como a amplificação por meio de PCR (reação de cadeia polimerase). Heparina é, por exemplo, um inibidor geralmente conhecido de PCR.
Finalmente, os testes de ácido nucleico quantitativos levantam a dúvida de como o processo completo, partindo desde a coleta da amostra até a medida do ácido nucleico, pode ser controlado sob condições padronizadas. Idealmente, um ácido nucleico padrão, definido em termos de quantidade e qualidade, já deve ter sido adicionado ao material de amostra durante a coleta, de modo a submeter o mesmo ao processo completo de coleta da amostra e determinação da mesma. Isto, também, é impossível com os sistemas de coleta convencionais.
Outro inconveniente em vista de coleta convencional de sangue reside no risco de transmitir material infeccioso, como, até agora, as etapas de processo manuais são requeridas para o isolamento de ácidos nucleicos. Um contato com germes infecciosos potenciais não pode ser excluído.
Um método é descrito no estado da técnica, de acordo com o qual a amostra de sangue é misturada com sal guanidínio diretamente após a coleta da amostra do paciente (EP 0 818 542 Al). Quando usando referido método, o sal guanidínio é pulverulento de modo a explorar a maior estabilidade do sal guanidínio. Referido método engloba, no entanto, várias desvantagens, porque o sal, por exemplo, precisa dissolver primeiro no sangue adicionado. O processo de dissolução depende, particularmente, da temperatura e não pode ser controlado devido ao material de amostra não transparente usado. O uso de um produto correspondente para fins diagnósticos/ médicos é, assim, extremamente problemático.
Nucleases são enzimas extremamente ativas, que podem ser inibidas somente sob condições extremamente desnaturantes. A desnaturação depende da concentração do sal guanidínio dissolvido. De acordo com o processo descrito em EP 0 818 542, uma concentração de inibição de sal guanidínio dissolvido não é provida desde o início. Assim, a degradação de ácidos nucleicos durante o processo de dissolução ocorre em um modo não controlado. Além disso, de acordo com o referido método, não são adicionados agentes redutores, sem o que uma inibição efetiva - especialmente de RNAses -não é geralmente garantida. A amostra obtida de acordo com os métodos convencionais pode, além disso, não ser usada diretamente pelo isolamento adicional de ácidos nucleicos em fases sólidas. O uso de sal guanidínio além disso, não permite a adição de padrões internos de ácido nucleico. Estes padrões são, no entanto, absolutamente necessários para controlar o processo e para a exata quantificação. A presente invenção foi baseada em objeto técnico para prover um receptáculo que não engloba as desvantagens conhecidos do estado da técnica. Particularmente, a amostra coletada com o receptáculo deve ser capaz de ser submetida diretamente aos métodos de testes de ácido nucleico correntes, sem precisar realizar etapas adicionais para o processamento das amostras.
De acordo com a invenção, referido objeto é provido por um receptáculo para receber a amostra, contendo uma solução para estabilização de ácidos nucleicos, e uma fase sólida para ligar os ácidos nucleicos.
As formas de realização preferidas adicionais são descritas nas reivindicações subsidiárias. O receptáculo, de acordo com a invenção, tem as seguintes vantagens: 1. A amostra, preferivelmente sangue, é lisada já no momento da coleta, ou seja, porque o receptáculo de coleta já contém uma solução de lise correspondente, que é, ao mesmo tempo, uma solução estabilizante de ácido nucleico. 2. A solução estabilizante de ácido nucleico tem o efeito que o material de amostra, especialmente os ácidos nucleicos contidos na mesma, são estabilizados diretamente após contato da solução. 3. A solução estabilizante de ácido nucleico é, além disso, selecionada de modo que o material de amostra pode ser usado diretamente em métodos de isolamento subsequentes. 4. A solução estabilizante de ácido nucleico pode ser separada durante o isolamento subsequente de modo eficaz o suficiente para evitar uma inibição, por exemplo, de PCR. 5. Um padrão interno pode ser adicionado à solução estabilizante de ácido nucleico, que permite o controle do processo completo, desde a coleta da amostra até a detecção do ácido nucleico. 6. A fase sólida contida no receptáculo é particularmente apropriada para o isolamento de ácidos nucleicos ligados aos mesmos em um tempo posterior. Além disso, a ligação preferida dos ácidos nucleicos à fase sólida facilita o isolamento subsequente, devido a uma primeira separação de ácido nucleico e componentes adicionais da amostra já ocorre no receptáculo. A solução estabilizante de ácido nucleico pode ser selecionada de modo que o ácido nucleico é ligado à superfície correspondente imediatamente após a lise da célula, ou somente após a adição de reagentes adicionais. O caso anterior é, por exemplo, dado se uma superfície de vidro na presença de um sal guanidínio for provido anteriormente. O segundo caso por exemplo, por exemplo, ser obtido ao prover uma superfície ligada por biotina antes e por subsequente adição de estreptavidina com propriedades de ligação de ácido nucleico. O receptáculo pode, basicamente, ser usado para receber quaisquer líquidos do corpo. Ele é apropriado, particularmente, para receber líquidos do corpo contendo componentes celulares como medula óssea. Preferivelmente, no entanto, um receptáculo para a coleta direta de sangue total de um doador está envolvido. O receptáculo é preferivelmente formado de um receptáculo para coleta de sangue convencional (por exemplo um tubo pequeno) em que um volume definido de uma solução estabilizante de ácido nucleico e uma fase sólida de ligação a ácido nucleico estão contidas. O tubo pequeno é, a seguir, preferivelmente provido com uma pressão baixa definida, que permite que somente um certo volume de sangue seja coletado. O tubo pequeno pode ser manipulado de acordo com métodos convencionais para a coleta de sangue. A solução contida no tubo pequeno contém, de acordo com sua forma de realização preferida, os seguintes reagentes: um sal guanidínio, por exemplo tiocianato de guanidínio, um detergente por exemplo Triton-X 100, um agente redutor, por exemplo ditiotreitol, e um sistema tampão apropriado, como citrato, tris, MES ou HEPES. Na composição descrita, a solução é compatível com o tubo de vácuo pequeno. A solução pode ser armazenada no tubo de vácuo pequeno sem problemas, sem afetar adversamente a função de estabilização desejada. Particularmente para o doador de sangue, o sistema completo não é problemático e é seguro para a coleta de sangue. A solução contendo o sal guanidínio, que serve como lise e substância de estabilização, a fase sólida de ligação a ácido nucleico, a substância tampão, o agente redutor e o detergente, é estável em armazenagem e transforma o sangue adicionado, recentemente coletado, em um material, que é do mesmo modo estável à armazenagem e pode ser usado diretamente para teste adicional e, respectivamente, isolamento de ácido nucleico. O tiocianato de guanidínio e/ou cloreto de guanidínio são preferivelmente usados como sal guanidínio. O sal guanidínio está preferivelmente presente em uma concentração de 1 a 8,0 M.
Tris ou citrato são preferivelmente usados como substância tampão, pelo que o pH exato é preferivelmente ajustado com HCI. Outros tampões possíveis são, no entanto, HEPES, MOPS, MES, citrato e fosfato, como por exemplo PBS.
Como fase sólida, todos os materiais de ligação a ácido nucleico podem ser usados. São especialmente apropriados as partículas de vidro, polímeros de ligação a ácido nucleico, partículas revestidas com os mesmos, revestimentos de ligação a ácido nucleico do sistema de coleta ou partículas revestidas com sílica. Altemativamente, a superfície da fase sólida de ligação a ácido nucleico pode ser revestida com moléculas de ligação específicas (por exemplo estreptavidina, oligonucleotídeos, peptídeo ácidos nucleicos (PNAs), etc, que interagem com moléculas marcadores sobre o ácido nucleico ou diretamente com o ácido nucleico. A formação dos materiais somente depende da forma do sistema de coleta e o subsequente método de isolamento. São especialmente apropriadas as formações que podem ser diretamente usadas depois quando o ácido nucleico é adicionalmente processado. São especialmente apropriadas as superfícies sendo compatíveis com métodos de isolamento convencionais, como partículas magnéticas ou lãs.
As fases sólidas apropriadas são comercialmente disponíveis, por exemplo partículas magnéticas revestidas com sílica, como estão contidas no Kit de isolamento de mRNA para sangue/ medula óssea (Roche). A concentração de tampão preferivelmente está na faixa entre 10 e 300 mM, ainda mais preferivelmente entre 10 e 100 mM.
Triton-X-100 é preferido como detergente. Outros detergentes possíveis são NP-40, Tween 20, Polydocanol ou outros detergentes. A concentração de detergentes preferivelmente está na faixa entre 5 e 30% (p/v) ainda mais preferivelmente entre 10 e 20% (p/v).
Como agente redutor, DTT é preferido, pelo que, no entanto, também β-mercaptoetanol, TCEP (tris (2-carbóxietil) fosfina) ou outros agentes redutores podem ser usados. A concentração preferida do agente redutor está na faixa entre 0,1 e 10% (p/v) ainda mais preferido 0,5 a 2 % (p/v). O pH da solução está preferivelmente na faixa entre 3,0 e 9,0, ainda mais preferivelmente entre 4,0 e 7,5. O pH da solução é particularmente selecionado de modo que, quando da adição de material de amostra, um valor de pH na faixa de 5,0 a 7,5, é ajustado. Como é fixado por predefinição da pressão baixa, pelo que o volume de amostra é coletado, ele pode ser garantido por emprego de uma concentração de tampão desejada ou, respectivamente, um volume de solução correspondente antes, de modo que o pH desejado é realmente obtido quando da recepção do volume de amostra completo. É especialmente preferido um pH na faixa entre 6,3 e 6,9 após a recepção da amostra.
Uma solução especialmente preferida contém 4,5 M tiocianato de guanidínio, 50 mM Tris/HCl, 15% (p/v), Triton-X-100, 100 mM DTT, uma fase sólida de partículas de vidro ou partículas magnéticas revestidas com sílica, pelo que o pH é ajustado de modo que um pH de 6 a 7,5 é obtido após a adição de sangue.
De acordo com uma forma de realização preferida adicional, o volume para receber a amostra de sangue tem uma baixa pressão, que pode ser ajustada de modo que um volume de sangue previamente definido é sugado no receptáculo, após o que um vaso de sangue foi perfurado. Correspondentemente, os receptáculos evacuados se encontram disponíveis no mercado. O receptáculo contendo o sangue coletado pode ser então imediatamente submetido aos testes adicionais, ou pode ser conservado durante um período de tempo mais longo (até vários dias ou semanas) sem quaisquer desvantagens para a qualidade da amostra.
De acordo com o método subjacente à presente invenção, o sangue recentemente coletado é contatado diretamente com a solução acima descrita no receptáculo de coleta de sangue, de modo que todos os processos que mudam o padrão de ácido nucleico da amostra são parados. Os ácidos nucleicos podem estar preferivelmente presentes no receptáculo já ligados à fase sólida, ou eles podem ser ligados à fase sólida em uma etapa de reação adicional.
Os dados com relação aos ácidos nucleicos provados, que são determinados depois dentro do escopo de teste de ácido nucleico, assim constituem, exatamente, a condição real no tempo da coleta do sangue, ou seja, em vista das quantidades e em vista dos tipos de ácidos nucleicos. A quantidade coletada de sangue preferivelmente corresponde a 0,1 a 4 vezes a quantidade da solução presente no receptáculo. A última chega, preferivelmente, a 0,5 a 5,0 ml. Assim, a concentração final de sal guanidínio após a adição do sangue preferivelmente está na faixa entre 1,0 e 5 M, preferivelmente entre 1,0 e 3,0 M. O receptáculo, de acordo com a invenção, é preferivelmente usado para a coleta de sangue, se a amostra de sangue se destinar a ser usada para testes de ácidos nucleicos. O uso de solução acima mencionada como parte do sistema de coleta descrito sozinho garante a lise imediata das células e a estabilização simultânea da amostra pela inativação direta das nucleases. A amostra de sangue assim obtida pode ser armazenada, de modo surpreendente, durante vários dias, mesmo em temperatura ambiente. O sistema de coleta além disso, garante uma manipulação não infecciosa, segura contra contaminação, ou seja partida da coleta do sangue, via o isolamento do ácido nucleico até os procedimentos de teste. De acordo com os métodos convencionais para o isolamento de ácidos nucleicos, até agora etapas de manipulação adicionais (como a transformação da amostra de sangue coletada nos reagentes para o isolamento de ácido nucleico, etc) tem sido sempre necessárias, que ocasiona um risco adicional de infecção ou contaminação da amostra. O ácido nucleico ligado à fase sólida pode ser isolado de modo surpreendente do material de amostra em um modo fácil, mesmo em uma armazenagem mais longa. A presença da fase sólida durante a lise da amostra acarreta uma ligação imediata dos ácidos nucleicos à superfície. Assim, perdas no rendimento, causadas, por exemplo, pela formação de um precipitado, que pode ocorrer após uma armazenagem mais longa, são evitadas, como a superfície com o ácido nucleico praticamente ligado na mesma em um modo quantitativo pode ser facilmente removida do sistema. A amostra obtida com o sistema de coleta de sangue pode ser submetida a métodos comuns para o isolamento de ácidos nucleicos. Quando usando partículas magnéticas revestidas com sílica, é possível usar métodos padrões correntes para o isolamento de ácidos nucleicos (separação magnética, lavagem, eluição do ácido nucleico). A presente invenção, assim, consiste de um sistema receptor de amostra, que é configurado de modo que as seguintes condições são atendidas: 1. Coleta controlada da amostra e simultânea estabilização dos ácidos nucleicos (DNA, RN A) contidos no material de amostra. 2. Coleta da amostra, que pode ser feito completamente sem usar anticoagulantes. 3. Ligação dos ácidos nucleicos (diretamente ou após uma etapa de processo adicional) a uma fase sólida contida no sistema. 4. A amostra obtida com o sistema descrito pode ser facilmente integrada em sistemas de isolamento existentes para ácidos nucleicos. 5. O sistema incluindo a amostra contida no mesmo é estável na armazenagem.
Além disso, verificou-se, de modo surpreendente, que a amostra obtida com o sistema de coleta descrito é estável em armazenagem no receptáculo durante um período de tempo mais longo, sem degradação dos ácidos nucleicos.
Os seguintes exemplos irão explicar a invenção.
Figura 1: Receptáculo de coleta com uma substância estabilizante de ácido nucleico (N-sS), vácuo definido, contendo uma fase sólida e selada com septo.
Figura 2: Ilustração gráfica de uma análise de gel (1% agarose) de 28S e 18 S rRNA armazenado no receptáculo de coleta durante diferentes períodos de tempo. Coluna 1: isolamento e separação do RNA imediatamente após a coleta (sem armazenagem), coluna 2: armazenagem durante um mês a -20 °C, coluna 3: armazenagem durante 6 dias a 4 °C. A quantidade de RNA aplicado correspondia a um volume de sangue de 120 μΐ.
Figura 3: Ilustração gráfica de uma análise de gel (1% agarose) de DNA armazenado no receptáculo de coleta durante diferentes períodos de tempo. Coluna 1: isolamento imediatamente após a coleta (sem armazenagem), coluna 2: armazenagem durante um mês a -20 °C, coluna 3: armazenagem durante 6 dias a 4 °C. A quantidade de RNA aplicado correspondia a um volume de sangue de 10 μΐ Figura 4: Ilustração gráfica de uma análise de gel de MS2-RNA isolado após incubação em soro/ solução estabilizante com/ sem DTT após 180 min, a 40 °C. Coluna 1: controle positivo: MS-2 RNA; coluna 2: marcador de DNA; colunas 3 a 5: MS-2 RNA após incubação com solução estabilizante contendo DTT (determinação de 3 vezes); colunas 6 a 8: MS-2 RNA após incubação com solução estabilizante sem DTT (determinação de 3 vezes).
Figura 5: Ilustração gráfica de uma análise de gel de MS2-RNA, que foi isolado após incubação em soro/ solução estabilizante durante 3 dias a 40 °C. O teor de tiocianato de guanidínio (teor GTC) da solução estabilizante após a adição de soro, em que o RNA em questão foi incubado, é indicado na coluna correspondente.
Coluna 1: 2,70 M GTC, coluna 2: 2,5 M GTC, coluna 3: 2,36 M GTC, coluna 4: 2,2 M GTC, coluna 5: 2,08 M GTC, coluna 6: 1,94 M GTC, coluna 7: 1,80 M GTC, coluna 8: 1,66 M GTC.
Figura 6: Ilustração gráfica de uma análise de gel de produtos de amplificação de PCR de MS2-RNA, que foi isolado em soro/ solução estabilizante após incubação durante 1 a 8 dias a 40 °C.
Coluna 1 produto de amplificação de RNA isolado após 1 dia, coluna 2: produto de aplicação de RNA isolado após 8 dias, coluna 3: marcador de DNA, coluna 4: MS2-RNA positivo, controle: 0,8 \\% em 10 μΐ RT 1:50 diluído, 1 μΐ amplificado.
Figura 7: Ilustração gráfica de uma análise de gel de MS2-RNA isolado após incubação durante 6 (colunas 2-12) e respectivamente 13 (colunas 14-19) dias em temperatura ambiente em soro/ solução estabilizante. O valor de pH obtido após misturação do soro e a solução estabilizante é indicado através das colunas em questão.
Coluna 1, 13, 20: marcador de DNA, coluna 2: pH 8,0, coluna 3: pH 7,7, coluna 4: pH 7,5, coluna 5: pH 7,35, coluna 6: pH 7,18, colunas 7, 14: pH 7,07, colunas 8, 15; pH 6,94, colunas 9, 16: pH 6,8, colunas 10, 17: pH 6,72, coluna 11, 18; pH 6,68, colunas 12, 19: pH 6,7. A solução estabilizante do RNA em colunas 12, 19 tinha o mesmo valor de pH que as do RNA na coluna 11, no entanto, continha 5 M GTC em vez de 4 M.
Figura 8: Ilustração gráfica da prova de RNA e DNA no gel agarose padrão (1% agarose). Coluna 1: marcador de peso molecular, colunas 2 a 4: ácidos nucleicos isolados; coluna 2: ácido nucleico de lisado de sangue total contendo MS2 RNA (7 dias), coluna 3: ácido nucleico de lisado de sangue total contendo MS2 RNA (0 dias, controle), coluna 4: ácido nucleico de lisado de sangue total (7 dias), coluna 5, ácido nucleico de lisado de sangue total (0 dias, controle). As bandas superiores mostram DNA cromossômico (claramente reconhecível em todas as 4 amostras), as bandas inferiores nas colunas 2 e 3 mostram o MS2 RNA adicionado e isolado.
Exemplo 1 Sistema de coleta de sangue De acordo com uma forma de realização preferida, o sistema de coleta de sangue pode ser composto como a seguir (ver ill 1): um tubo pequeno é cheio com um volume definido da solução estabilizante de ácido nucleico, é provido com uma fase sólida de ligação a ácido nucleico e com um vácuo definido, e é então selado com um septo. O septo é construído para ser compatível com o kit de coleta de sangue corrente (cânula, etc). No presente exemplo, 2,2 ml de reagente foram providos antes, e o vácuo foi ajustado para deixar o influxo de 2,2 ml de sangue exatamente durante a coleta da amostra. Os ácidos nucleicos contidos na corrente de sangue entrando foram imediatamente transferidos em forma estável.
Anotações preliminares gerais para os exemplos seguintes: SE não mencionado de outra forma, a substância estabilizante de ácido nucleico (N-sS) foi composta como a seguir em todos os exemplos descritos abaixo: 45 mM tris, 5 M tiocianato de guanidínio, 0,8 % (p/v) ditiotreitol, 18% (p/v) Triton-X-100, pH 6,0.
Em todos os exemplos como descritos, a substância estabilizante de ácido nucleico foi misturada com a amostra em uma relação 1:1 (1 volume N-sS mais 1 volume material de amostra).
Em todos os exemplos, sangue foi estabilizado por enchimento do mesmo, diretamente, durante a coleta, em um tubo pequeno contendo N-sS. Exemplo 2 Estabilidade de ácido nucleico anos misturacão do material de amostra e N-sS Isolamento de RNA e DNA no lisado de amostra com superfícies derivadas de sílica Material e método: O material de amostra para isolamento de DNA e RNA foi usado diretamente após a coleta, após armazenagem durante 6 dias a 4 °C e após armazenagem durante 1 mês a -20 °C. O kit de isolamento de RNA HighPure (Boehringer Manheim, cat. No. 1828 665) foi usado para o isolamento de RNA (figura 2). As instruções dos fabricantes no folheto foram modificadas. Um volume de lisado de amostra de 2,4 ml foi aplicado em 4 alíquotas com 600 μΐ cada sobre a coluna, de modo que um lisado de amostra total de 2,4 ml lisado foi aplicado. Todas as outras etapas foram realizadas em correspondência com as instruções. O RNA foi eventualmente eluído com 100 μΐ de tampão de eluição. O kit de sangue QiaAmp (Qiagen-Cat. No. 29104) foi usado para o isolamento de DNA (figura 3). O procedimento padrão descrito nas instruções dos fabricantes foi modificado em vários pontos: 400 μΐ volume de amostra foram diretamente aplicados sobre a coluna, pelo que o reagente de ligação contido no kit não foi usado: 25 μΐ de solução de carga proteinase K foram adicionados, e a amostra incubada durante 10 min, em temperatura ambiente. A seguir, a coluna foi colocada em um tanque de coleta e centrifugada de acordo com as instruções dos fabricantes. Todas as etapas adicionais foram realizadas de acordo com a descrição providas nas instruções dos fabricantes, exceto pelo uso de etanol. O volume de eluição foi de 200 μΐ. Exemplo 3 Significado de redução de reagentes (por exemplo DTP na solução estabilizante para a estabilização a longo prazo de RNA Material e método: Solução estabilizante usada: 4,0 M GTC; 13,5 % Triton-X 100, 45 mM Tris/HCl, com ou, respectivamente, sem 120 mM DTT. 700 μΐ soro foram misturados com 700 μΐ de solução estabilizante. Após uma incubação durante 2 min, 20 μΐ MS2-RNA (0,8 pg/μΐ de Roche Diagnostics) foram adicionados. As amostras foram incubadas durante 180 min a 40 °C e, a seguir, aplicadas em alíquotas a 400 μΐ com o kit de RNA total High Pure de Roche, de acordo com o experimento 1. As amostras foram eluídas em 50 μΐ e congeladas a -20 °C. Os testes foram efetuados com gel agarose (ver figura 4).
Resultado: Não se pode obter estabilização a longo prazo de RNA sem a adição de reagentes redutores para a solução estabilizante.
Exemplo 4 Estabilidade de MS2-RNA em soro/ solução estabilizante : Dependência de concentração de GTC
Material e método Soluções estabilizantes usadas: 3 - 5 M GTC, 13,5% Triton-X, 50 mM DTT, 42 mM tris/HCl; pH das soluções: aproximadamente 4,0; pH das soluções após a adição de soro: aproximadamente 6,7. 2 ml de soro foram misturados com 2,5 ml de soluções estabilizantes respectivas. Após um tempo de incubação de 2- 5 min, 90 μΐ MS2-RNA (0,8 pg/μΐ de Roche) foram adicionados e incubados a 40 °C. 400 μΐ de amostra foram coletados em intervalos regulares e aplicados com o kit de RNA total High Pure de Roche, de acordo com o experimento 1. As amostras foram eluídas em 50 μΐ e congeladas a -20 °C. Para análise da integridade de RNA, 20 μΐ de eluado foram aplicados sobre gel agarose a 1,5% (figura 5). O teste RT- PCR foi efetuado por meio de AMV- RT e PCR. 10 μΐ do eluados foram submetidos a transcrição reversa por meio de AMV-RT (Roche) e a seguir analisados por meio de PCR quantitativo no ciclador de luz. mistura para RT: 4,0μ1 AMV-RT tampão (42 °C durante 1 h) 2,0μ1 dNTP’s concentração final 0,5 μΐ inibidor RNAse, (Roche, 20 unidades) Ι,ΟμΙ Iniciador 2827 (concentração final 1 μΜ) 1,9μ1 DMPC-água Ο,όμΐ AMV-RT (Roche, 15 unidades) 10 ul Gabarito- RNA 20μ1 O PCR foi realizado no ciclador de luz em uma temperatura de recozimento de 61 °C por uso de SYBR-Verde como sistema de detecção. Todas as amostras com um ciclo de limiar maior que 20 são consideradas como sendo negativas, como o sinal detectado é exclusivamente possível para a formação de dímeros de iniciador. Isto pode ser claramente provado pela análise de curvas de fusão no ciclador de luz (Roche). O produto RT foi diluído com 1:50 água biodestilada e 1 μΐ da mesma foi usado para um PCR de 10 μΐ de acordo com o seguinte esquema: mistura para PCR: 1,6μ1 MgCl2(solução de carga 25mM) 5,9μ1 DMPC-água 0,25 μΐ Iniciador 2827 (solução de carga 20mM) 0,25μΐ Iniciador 2335 (solução de carga 20mM) 1,0μ1 SYBR-Gren-Mastermix (Roche) hOu.1 RT mistura 10μ1 O produto de amplificação de PCR foi completamente aplicado sobre um gel agarose a 2%. (ver figura 6).
Resultado: A figura 5 mostra o MS2-RNA eluído detectado no gel agarose após uma incubação durante 3 dias a 40 °C. Apesar de todas as amostras de RNA ainda poderem ser amplificadas e claramente identificadas após 8 dias a 40 °C, diferenças claras da integridade de RNA em resposta ao teor de GTC podem ser reconhecidas após 3 dias. Conseqüentemente, um teor de sal menor que 2 M no soro/ solução estabilizante é vantajoso para a integridade do RNA. Não é mostrado o fato de que MS2-RNA é completamente degradado pela RNases já 2 min após a adição ao soro, de modo que RNA não pode mais ser identificado. Isto pode ser provado por meio de referido exemplo que a degradação do RNA pela adição de solução estabilizante ao soro pode ser claramente retardada. MS2-RNA pode ser detectado por PCR sem quaisquer problemas após 8 dias a 40 °C em soro/ solução estabilizante (figura 6).
Exemplo 5 Estabilidade de MS2-RNA em soro/ solução estabilizante. Dependência do valor de pH da amostra contendo solução estabilizante Material e método Solução usada: 4M (5M) GTC 14,4% Triton-X-100 50 mM DTT 45mM tris HC1 pH após a adição de soro entre 6,7 e 8,0. 2,5ml de solução estabilizante foram misturados com 2,0 ml de soro. Após a adição de 90 μΐ MS2 RNA (0,8 μg/ml Roche), as amostras foram incubadas em temperatura ambiente. O RNA de amostra de 500 μΐ foi aplicado com o kit de RNA viral da Roche de acordo com o exemplo 4 em intervalos regulares e isolado em 50 pl de tampão de eluição. 20 μΐ do eluado foram analisados por meio de gel agarose (ver figura 7).
Resultado O pH do soro / solução estabilizante e, assim, também o pH e região de tampão da solução estabilizante é decisivo para a estabilização a longo prazo de RNA. Enquanto, dado um valor de pH de 8,0, RNA intacto não pode mais ser identificado após 2 dias, RNA intacto pode ainda ser identificado após uma incubação durante 13 dias em temperatura ambiente dada uma faixa de pH entre 6,6 e 7,0. Além do valor de pH, no entanto, também uma concentração de GTC otimamente ajustada é significante para a estabilização a longo prazo de RNA (ver exemplo 4). O exemplo ilustrado toma claro que uma concentração final de GTC de 2,2 M GTC na amostra estabilizada é melhor para uma estabilização a longo prazo que 2,8 M.
Exemplo 6 Estabilidade de uma superfície de ligação a ácido nucleico na presença de uma solução estabilizante mostrada pelo uso de partículas magnéticas revestidas com sílica Material e método: solução usada: 4,5M GTC 15% Triton-X-100 100 mM DTT
50 mM MES
As partículas magnéticas revestidas com sílica foram tomadas de um kit de isolamento de mRNA para sangue/ medula óssea (Roche Molecular Biochemicals). A quantidade de partículas usadas por ml foi aproximadamente 35 mg. O sistema de coleta de sangue consistindo de tubo de coleta pequeno, a solução estabilizante e as partículas magnéticas foi armazenado durante 14 dias em temperatura ambiente. Depois, sangue total foi coletado com referido sistema. Um sistema de coleta recentemente produzido (tubo pequeno, solução estabilizante, partículas magnéticas) foi usado para fins de controle. O isolamento de ácidos nucleicos contidos no material de amostra foi efetuado para ambas as misturas. As partículas magnéticas foram separadas com um imã, o excesso descartado. As partículas foram re-colocadas em suspensão em 50% etanol, 10 mM tris, pH 7,0, e lavadas com a mesma solução várias vezes. As partículas foram finalmente aquecidas em 10 mM Tris/ HCI pH 7,0 a 70 °C, pelo que o ácido nucleico é mantido isento das partículas magnéticas. As partículas foram separadas magneticamente, e o excesso contendo ácido nucleico foi analisado no gel agarose padrão.
Resultado Tabela 1: Após armazenagem de 14 dias a propriedade de ligação de ácido nucleico da fase sólida não foi mudada. A amostra, assim como o controle, mostram as mesmas propriedades de ligação de ácido nucleico. Exemplo 7 Estabilidade, isolamento e prova de DNA e RNA após armazenagem durante 7 dias com ligação simultânea a partículas magnéticas revestidas com sílica Material e método suspensão usada: 4,5M GTC 15% Triton-X-100 100 mM DTT
50 mM MES 35 mg/ml partícula Quatro sistemas de coleta de sangue (tubos pequenos) contendo 1 ml de suspensão acima mencionada foram misturados com 1 ml de sangue total. 25 pg MS2 RNA foram adicionalmente adicionados em dois dos tubos pequenos (lisados de sangue total). Um tubo pequeno de cada uma das duas misturas (lisado de sangue total +/- MS2 RNA) foi aplicado imediatamente depois para o isolamento de ácidos nucleicos (desempenho ver exemplo 6). Os dois outros tubos pequenos foram armazenados durante 7 dias em temperatura ambiente. O isolamento de ácidos nucleicos foi realizado após referido período de tempo. O volume de eluição chegou a 200 μΐ por 200 μΐ de volume de sangue total. Os ácidos nucleicos foram analisados no gel agarose padrão. Resultado A estabilidade do DNA cromossômico e MS2-RNA pode ser identificada após armazenagem durante 7 dias no sistema de coleta de amostra (solução, fase sólida) (figura 8).
REIVINDICAÇÕES

Claims (21)

1. Receptáculo para receber amostras, preferencialmente para receber sangue, contendo uma solução compreendendo um sal guanidínio, uma substância tampão, e um detergente, que estabiliza ácidos nucleicos, e uma fase sólida capaz de ligar ácidos nucleicos, caracterizado pelo fato de ter uma baixa pressão no espaço para receber a amostra.
2. Receptáculo de acordo com a reivindicação I, caracterizado pelo fato de que o sal guanidínio é selecionado dentre tiocianato de guanidínio e cloreto de guanidínio.
3. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o sal guanidínio está presente em uma concentração de l a 8 M.
4. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que, após a adição do material de amostra, a solução tem um valor de pH de 4 a 7,5, e que a substância tampão é selecionada dentre tampão Tris(hidroximetil) aminometano (Tris), ácido 2-(4-(2-hídroxíetil)-1 -piperazinil)-etanosulfônico (HEPES), ácido 3-(N-morfo1ino)-propanosulfônico (MOBS), ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfônico (MES), citrato e fosfato.
5. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a fase sólida é provida separadamente como lã, filtro, partícula, gel, esferas, cilindro e/ou bastões e/ou está díretamente conectada com o receptáculo.
6. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a substância tampão está presente em uma concentração dc 10 a 300 mM.
7. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o detergente é selecionado dentre Triton X-100, NP-40, Polydocanol e Tween 20.
8. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o detergente está presente em uma concentração de 5 a 30 %, em peso.
9. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a solução compreende adicionalmente um agente redutor selecionado dentre ditiotreitol, β-mercaptoetanol e Tris (2-cloroetil) fosfato (TCEP).
10. Receptáculo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o agente redutor está presente em uma concentração de 0,1 a 10,0 %, em peso.
11. Método para isolar ácido nucleico de sangue total, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: prover um receptáculo tendo um interior para receber uma amostra, o interior compreendendo uma fase sólida de ligação a ácido nucleico e em que a solução compreende sal guanidínio a 1 a 8 M, um tampão, e um detergente; coletar o sangue total no receptáculo, em que a solução causa lise das células e estabilização dos ácidos nucleicos; estocar a amostra de fluido no receptáculo por mais do que um dia, em temperatura compreendendo temperatura ambiente; e isolar ácido nucleico a partir do sangue estocado.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de engatar o vaso com um acessório de amostragem de sangue.
13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a solução compreende ainda um agente redutor.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a solução compreende um único tampão, um único agente redutor e um único detergente.
15. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a evacuação facilita a coleta de um volume definido da amostra.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o receptáculo compreende um tubo tendo uma extremidade aberta selada por um septo.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o tampão é efetivo, ao misturar com uma quantidade de sangue total igual ao volume definido, a prover uma mistura resultante com um pH entre 4,0 e 7,5.
18. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o volume definido é de cerca de 0,1 a cerca de 4 vezes o volume da solução.
19. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada pelo menos 3 dias após a etapa de coleta.
20. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada pelo menos 7 dias após a etapa de coleta.
21. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a etapa de isolamento é realizada pelo menos 14 dias após a etapa de coleta.
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Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2326725A1 (en) * 1998-04-23 1999-10-28 Takara Shuzo Co., Ltd. Method for synthesizing dna
DE19836559A1 (de) * 1998-08-12 2000-03-23 Antigen Gmbh Gefäß zur Entnahme von Blut
EP1300465A1 (de) * 2001-10-08 2003-04-09 Agrobiogen GmbH Biotechnologie Verfahren und Vorrichtung zur Isolierung von RNS-Proben
US7482116B2 (en) 2002-06-07 2009-01-27 Dna Genotek Inc. Compositions and methods for obtaining nucleic acids from sputum
DE10231659B4 (de) * 2002-07-12 2006-01-19 Preanalytix Gmbh Zusammensetzung zum Binden von Nukleinsäure an eine Festphase
EP1413874A1 (en) 2002-10-16 2004-04-28 Streck Laboratories, Inc. Method and device for collecting and preserving cells for analysis
EP1435241A1 (en) * 2002-12-30 2004-07-07 Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co. Ltd Method for stabilizing blood, serum, or plasma specimen and container containing ph buffer agent
US7601491B2 (en) 2003-02-06 2009-10-13 Becton, Dickinson And Company Pretreatment method for extraction of nucleic acid from biological samples and kits therefor
JP2006528482A (ja) * 2003-07-24 2006-12-21 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 核酸の逆転写及び／または増幅方法
WO2005031304A2 (en) * 2003-09-22 2005-04-07 Becton, Dickinson And Company Quantification of analytes using internal standards
CA2482097C (en) * 2003-10-13 2012-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods for isolating nucleic acids
WO2005064010A1 (de) * 2003-12-19 2005-07-14 Preanalytix Gmbh Zusammensetzung zum binden von nukleinsäure an eine festphase
MXPA05001815A (es) * 2004-02-20 2005-08-24 Hoffmann La Roche Adsorcion de acidos nucleicos a una fase solida.
EP1584923A3 (en) * 2004-04-07 2006-01-04 Roche Diagnostics GmbH Stabilization of biomolecules in samples
CA2560513A1 (en) 2004-04-08 2005-12-01 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
US20080176209A1 (en) * 2004-04-08 2008-07-24 Biomatrica, Inc. Integration of sample storage and sample management for life science
CN101175853A (zh) 2005-03-16 2008-05-07 Dna吉诺特克股份有限公司 用于保存来自体液的核酸的组合物和方法
MX2008007253A (es) 2005-12-09 2008-09-30 Dna Genotek Inc Sistema de contenedor para almacenar de forma liberable una sustancia.
CA113861S (en) 2005-12-09 2007-08-22 Dna Genotek Inc Vial
US8097419B2 (en) 2006-09-12 2012-01-17 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009
US8080645B2 (en) 2007-10-01 2011-12-20 Longhorn Vaccines & Diagnostics Llc Biological specimen collection/transport compositions and methods
US9481912B2 (en) 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
EP1932913B1 (en) 2006-12-11 2013-01-16 Roche Diagnostics GmbH Nucleic acid isolation using polidocanol and derivatives
CN102776173B (zh) 2006-12-11 2014-10-29 霍夫曼-拉罗奇有限公司 使用聚多卡醇和衍生物的核酸分离
EP1938756A1 (en) * 2006-12-29 2008-07-02 Qiagen GmbH Method and materials for triggered release of a biological sample
US9683256B2 (en) 2007-10-01 2017-06-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system
US11041215B2 (en) 2007-08-24 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc PCR ready compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences
US20090053704A1 (en) * 2007-08-24 2009-02-26 Natalia Novoradovskaya Stabilization of nucleic acids on solid supports
US10004799B2 (en) 2007-08-27 2018-06-26 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
AU2008293504B2 (en) 2007-08-27 2012-04-12 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Immunogenic compositions and methods
CA2861667C (en) 2007-10-01 2017-06-13 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Biological specimen collection and transport system and methods of use
US11041216B2 (en) 2007-10-01 2021-06-22 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and quantifying nucleic acid sequences in blood samples
US20090155838A1 (en) * 2007-11-28 2009-06-18 Smart Tube, Inc. Devices, systems and methods for the collection, stimulation, stabilization, and analysis of a biological sample
DE102008026058A1 (de) * 2008-05-30 2009-12-03 Qiagen Gmbh Lyse, Binde- und/oder Waschreagenz verwendbar zur Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren
US11634747B2 (en) * 2009-01-21 2023-04-25 Streck Llc Preservation of fetal nucleic acids in maternal plasma
DE202010018569U1 (de) 2009-02-18 2017-09-26 Streck Inc. Konservierung zellfreier Nukleinsäuren
CA2780536C (en) 2009-11-09 2018-01-02 Streck, Inc. Stabilization of rna in and extracting from intact cells within a blood sample
CA2806670A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing dna, rna and proteins in blood and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
US9845489B2 (en) 2010-07-26 2017-12-19 Biomatrica, Inc. Compositions for stabilizing DNA, RNA and proteins in saliva and other biological samples during shipping and storage at ambient temperatures
CN101963595A (zh) * 2010-09-02 2011-02-02 毅新兴业（北京）科技有限公司 一种血清多肽内标校正检测方法
US9956281B2 (en) 2011-05-04 2018-05-01 Streck, Inc. Inactivated virus compositions and methods of preparing such compositions
CA2779850C (en) 2011-06-17 2016-08-09 Norgen Biotek Corporation Methods, reagents and kits for preservation of nucleic acids in biological samples
CN106442039B (zh) 2011-06-19 2020-08-07 阿博根公司 用于样品采集的装置、溶液和方法
JP6329072B2 (ja) * 2011-09-26 2018-05-23 キアゲン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 細胞外核酸の安定化および単離
US11021733B2 (en) 2011-09-26 2021-06-01 Qiagen Gmbh Stabilization and isolation of extracellular nucleic acids
CN103827303B (zh) * 2011-09-26 2021-10-22 普瑞阿那利提克斯有限公司 细胞外核酸的稳定化和分离
WO2013112916A1 (en) 2012-01-26 2013-08-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Composite antigenic sequences and vaccines
AU2013240200B2 (en) * 2012-03-28 2016-10-20 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for the collection and isolation of nucleic acids from biological specimens
US9480966B2 (en) 2012-04-30 2016-11-01 General Electric Company Substrates and methods for collection, stabilization and elution of biomolecules
US9044738B2 (en) 2012-04-30 2015-06-02 General Electric Company Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids
US9040679B2 (en) 2012-04-30 2015-05-26 General Electric Company Methods and compositions for extraction and storage of nucleic acids
US9040675B2 (en) 2012-04-30 2015-05-26 General Electric Company Formulations for nucleic acid stabilization on solid substrates
CN104755628B (zh) 2012-09-25 2019-03-01 凯杰有限公司 生物样品的稳定化
US9725703B2 (en) 2012-12-20 2017-08-08 Biomatrica, Inc. Formulations and methods for stabilizing PCR reagents
JP6407248B2 (ja) 2013-03-18 2018-10-17 キアゲン ゲーエムベーハー 細胞外核酸の安定化および単離
US11525155B2 (en) 2013-03-18 2022-12-13 Qiagen Gmbh Stabilisation of biological samples
RU2654666C2 (ru) * 2013-05-24 2018-05-21 Оккам Байолэбс, Инк. Система и способ сбора образца нуклеиновой кислоты
ES2938048T3 (es) 2013-07-24 2023-04-04 Streck Llc Composiciones y procedimientos para estabilizar las células tumorales circulantes
CN106572650B (zh) 2014-06-10 2021-08-31 生物马特里卡公司 在环境温度下稳定凝血细胞
US10287570B2 (en) 2014-11-21 2019-05-14 Occam Biolabs, Inc. System and method for collecting a sample of nucleic acid
CA2971830A1 (en) * 2014-12-29 2016-07-07 Bonac Corporation Composition containing nucleic acid molecule stably
JP2016136911A (ja) * 2015-01-29 2016-08-04 株式会社テクノスルガ・ラボ 生物群集構造の維持、常温保存、輸送が可能な保存・輸送技術及びこの技術を用いた検体の採取・輸送・保管容器
US11168351B2 (en) 2015-03-05 2021-11-09 Streck, Inc. Stabilization of nucleic acids in urine
WO2016183292A1 (en) 2015-05-14 2016-11-17 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Rapid methods for the extraction of nucleic acids from biological samples
CN108473932B (zh) 2015-09-09 2022-07-15 集联健康有限公司 用于样品收集、稳定化和保存的系统、方法和装置
US20170145475A1 (en) 2015-11-20 2017-05-25 Streck, Inc. Single spin process for blood plasma separation and plasma composition including preservative
EP3377645B1 (en) 2015-11-20 2023-10-04 Qiagen GmbH Method of preparing sterilized compositions for stabilization of extracellular nucleic acids
SG11201804776SA (en) 2015-12-08 2018-07-30 Biomatrica Inc Reduction of erythrocyte sedimentation rate
CA3025569A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Norgen Biotek Corp. Preservation of cell-free nucleic acids in biological samples
EP4656715A3 (en) 2016-07-29 2026-02-25 Streck LLC Suspension composition for hematology analysis control
CN106701741A (zh) * 2016-12-26 2017-05-24 广州和实生物技术有限公司 一种羊水、绒毛样本中核酸快速提取试剂盒
TWI882519B (zh) 2017-01-10 2025-05-01 美商集聯健康有限公司 用於收集和儲存來自受試者之血液的裝置
FI3568475T3 (fi) 2017-01-16 2023-05-15 Spectrum Solutions L L C Nukleiinihapon säilytysliuos ja käyttömenetelmiä
JP7110360B2 (ja) 2017-10-09 2022-08-01 テルモ ビーシーティー バイオテクノロジーズ，エルエルシー 凍結乾燥方法
CN115119829B (zh) 2017-10-19 2024-07-12 斯特雷克股份有限公司 用于胞外囊泡的溶血和凝血调节以及稳定化的组合物
CN108261332A (zh) * 2018-01-22 2018-07-10 无锡百泰克生物技术有限公司 一种血液rna保存管
US11712692B2 (en) 2018-11-20 2023-08-01 Spectrum Solutions L.L.C. Sample collection system including sealing cap and valve
CN113614477B (zh) 2019-03-14 2023-04-28 泰尔茂比司特生物技术有限公司 冷冻干燥装载托盘组件及系统
US11701094B2 (en) 2019-06-20 2023-07-18 Spectrum Solutions L.L.C. Sample collection system including valve and plug assemblies
MX2022004372A (es) * 2019-10-10 2022-07-27 Liquid Biopsy Res Llc Composiciones, métodos y kits para la estabilización de muestras biológicas y de arn.
CN112051866B (zh) * 2020-08-24 2023-10-24 南京市金陵中学 一种基于齿轮传动的四维光伏发电自动跟踪系统
EP4206323A4 (en) * 2020-08-28 2024-08-28 Kao Corporation Rna storage method
CN113965154A (zh) * 2021-09-23 2022-01-21 晟高发新能源发展(江苏)有限公司 一种太阳能光伏板调节装置
CN113890477B (zh) * 2021-10-29 2024-04-26 西安热工研究院有限公司 一种风电塔筒上的光伏发电组件跟踪阳光的角度调节系统及方法
CN116054712B (zh) * 2023-03-31 2023-07-18 新乡职业技术学院 一种基于光感的光伏板支座

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
US5346994A (en) * 1992-01-28 1994-09-13 Piotr Chomczynski Shelf-stable product and process for isolating RNA, DNA and proteins
US5494590A (en) * 1992-06-11 1996-02-27 Becton Dickinson Method of using anticoagulant solution in blood separation
AU4775193A (en) 1992-07-17 1994-02-14 Aprogenex, Inc. In situ detection of nucleic acids using 3sr amplification
DE19520398B4 (de) 1995-06-08 2009-04-16 Roche Diagnostics Gmbh Magnetisches Pigment
US5945515A (en) * 1995-07-31 1999-08-31 Chomczynski; Piotr Product and process for isolating DNA, RNA and proteins
DE19548680A1 (de) * 1995-12-23 1997-06-26 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zum quantitativen Nachweis von spezifischen Nukleinsäuresequenzen
DE19622885A1 (de) * 1996-06-07 1997-12-11 Boehringer Mannheim Gmbh Reagenzzubereitung enthaltend magnetische Partikel in Form einer Tablette
AT1082U2 (de) * 1996-07-09 1996-10-25 Labordiagnostika Ges Mbh Verfahren zur stabilisierung von nukleinsäuren vor deren isolierung aus blutproben
US6231815B1 (en) * 1996-12-03 2001-05-15 Roche Diagnostics Gmbh Storage and transport system for sample material
DE19702907A1 (de) * 1997-01-28 1998-07-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren und Vorrichtung zur Reinigung von Nukleinsäuren
CA2293820A1 (en) * 1997-06-25 1998-12-30 Promega Corporation Method of isolating rna
DE19746874A1 (de) 1997-10-23 1999-04-29 Qiagen Gmbh Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren an hydrophoben Oberflächen - insbesondere unter Verwendung hydrophober Membranen
JP4025399B2 (ja) * 1997-10-28 2007-12-19 株式会社日立製作所 核酸の回収方法及び装置
WO1999029904A2 (en) 1997-12-10 1999-06-17 Sierra Diagnostics, Inc. Methods and reagents for preservation of dna in bodily fluids
DE19836559A1 (de) 1998-08-12 2000-03-23 Antigen Gmbh Gefäß zur Entnahme von Blut
DE19856415C2 (de) 1998-12-08 2001-06-07 Thomas Fenner Verfahren zur Reinigung bzw. Isolierung viraler Nukleinsäuren
US6936414B2 (en) 1999-12-22 2005-08-30 Abbott Laboratories Nucleic acid isolation method and kit
US6602718B1 (en) * 2000-11-08 2003-08-05 Becton, Dickinson And Company Method and device for collecting and stabilizing a biological sample
ATE384954T1 (de) * 2000-11-08 2008-02-15 Becton Dickinson Co Verfahren und vorrichtung zum sammeln und zum stabilisieren einer biologischen probe

Also Published As

Publication number Publication date
EP2189220A1 (de) 2010-05-26
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US20030143566A1 (en) 2003-07-31
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JP3702225B2 (ja) 2005-10-05

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