BRPI0108676B1 - anticorpos humanizados que sequestram peptídeo amilóide beta e seus usos no tratamento de condições caracterizadas por formação de placas amiloides, bem como composição farmacêutica que compreende os referidos anticorpos - Google Patents

Abstract

"anticorpos humanizados que seqüestram peptídeo de a beta". um método para tratar condições caracterizadas pela formação de placas de amilóide tanto profilática quanto terapeuticamente é descrito. o método emprega anticorpos humanizados que seqüestram peptídeo de a<225> solúvel de fluidos biológicos humanos ou que de preferência especificamente ligam um epitopo contido dentro da posição 13-28 do peptídeo de amilóide beta a<225>.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS HUMANIZADOS QUE SEQUESTRAM PEPTÍDEO AMILÓIDE BETA E

SEUS USOS NO TRATAMENTO DE CONDIÇÕES CARACTERIZADAS

POR FORMAÇÃO DE PLACAS AMILOIDES, BEM COMO COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE COMPREENDE OS REFERIDOS ANTICORPOS".

Referência Cruzada a Pedidos de Patentes Relacionados Este pedido de patente reivindica a prioridade dos pedidos de patente provisórios U.S. 60/184.601, depositado em 24 de fevereiro de 2000, 60/254.465, depositado em 8 de dezembro de 2000 e 60/254.498, depositado em 8 de dezem- bro de 2000, os conteúdos de cada um destes são aqui incorporados por referência.

Campo Técnico A invenção refere-se a anticorpos humanizados que ligam a um epitopo entre os aminoácidos 13 e 28 do peptídeo de Αβ para tratamento pre- ventivo e terapêutico de condições associadas com amilóide beta, tal como do- ença de Alzheimer, síndrome de Down e angiopatia cerebral amilóide. Mais especificamente, ela refere-se ao uso de anticorpos monoclonais humanizados para seqüestrar peptídeo de amilóide beta (Αβ) no plasma, cérebro e fluido ce- rebroespinhal para prevenir acúmulo ou para reverter deposição do peptídeo de Αβ dentro do cérebro e na cerebrovasculatura e para melhorar a cognição. Técnica Anterior Várias sintomologias que resultam em déficits cognitivos, aciden- te vascular cerebral, hemorragia cerebral e debilitação mental geral parecem estar associadas com neurite e placas cerebrovasculares no cérebro con- tendo o peptídeo de amilóide beta (Αβ). Entre estas condições estão doença de Alzheimer pré-clínica e clínica, síndrome de Down e angiopatia cerebral amilóide pré-clínica e clínica (CAA). As placas de amilóide são formadas de peptídeos de amilóide beta. Estes peptídeos circulam no sangue e no fluido cerebroespinhal (CSF), tipicamente na forma complexa com lipoproteínas. O peptídeo de Αβ na forma circulante é composto de 39-43 aminoácidos (a maioria 40 ou 42 aminoácidos) resultante da divagem de uma proteína pre- cursora comum, proteína precursora amilóide, freqüentemente designada APP. Algumas formas de Αβ solúvel são por si neurotóxicas e podem de- terminar a severidade da neurodegeneração e/ou declínio cognitivo (McLean, C. A, et al., Ann. Neurol. (1999) 46:860-866; Lambert Μ. P., et al., (1998) 95:6448-6453; Naslund. J., J. Am. Med. Assoe. (2000) 283:1571).

Evidência sugere que Αβ pode ser transportado de volta para adiante entre o cérebro e o sangue (Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883; Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040; Shibata M, et al., J. Clin. Invest. (2000) 106:1489- 1499). Também Αβ em placas está em um equilíbrio com Αβ solúvel no cé- rebro e sangue (Kawarabayashi T, et al., J. Neurosci. (2001) 21:372-381).

Como descrito no pedido de patente PCT US00/35681 e U. S n“ de série 09/153.130 ambos aqui incorporados por referência, os níveis de circulação totais de peptídeo de Αβ no CSF são similares em indivíduos normais e indivíduos pré-dispostos a apresentar os sintomas de Alzheimer.

No entanto, os níveis de Αβ42 são menores em média nos indivíduos com doença de Alzheimer (Nitsch, R. M., et al., Ann. Neurol. (1995) 37:512-518). É conhecido que Αβ42 está mais propenso a agregar-se que Αβ40, e quando isto acontece, conseqüências adversas tais como deposição de Αβ em pla- cas de amilóide, conversão de Αβ às formas solúveis tóxicas, dano cerebral dos nervos e deterioração comportamental tal como demência resultam (Golde, T. E„ et al., Biochem. Biophys. Acta. (2000) 1502:172-187). Métodos para introduzir uma resposta imune para reduzir depó- sitos de amilóide são descritos na publicação do PCT W099/27944 publica- do em 10 de junho de 1999. A descrição postula que o peptídeo de Αβ agre- gado de comprimento total pode ser um imunógeno. A administração de um fragmento de Αβ (aminoácidos 13-28) conjugado com IgG de anticamundon- go de ovelha não causou nenhuma alteração na carga de amilóide do córtex, e apenas um em nove animais que receberam as injeções do conjugado de fragmento 13-28 de Αβ mostraram qualquer linfoproliferação em resposta ao Αβ40. A aplicação também indica que os anticorpos que especificamente li- gam ao peptídeo de Αβ podem ser usados como agentes terapêuticos. No entanto, isto parece ser especulação uma vez que os dados de suporte re- fletem os protocolos que envolvem imunização ativa usando, por exemplo, Αβ42. Os peptídeos são fornecidos usando adjuvantes e títulos de anticorpo formados da imunização, bem como níveis de peptídeo de Αβ e do peptídeo precursor, são determinados. A publicação fortemente sugere que a placa de Αβ deve ser reduzida para abrandar os sintomas de Alzheimer, e que os processos mediados por células são requeridos para redução bem sucedida da placa de Αβ. WO 99/60024, publicada em 25 de novembro de 1999, é direci- onada aos métodos para remoção de amilóides usando anticorpos de anti- amilóides. O mecanismo, no entanto, é exposto para utilizar a capacidade de anticorpos de anti-Αβ para ligar aos depósitos de amilóide pré-formados (isto é, placas) e resultam em liberação microbiológica local subseqüente das placas localizadas. Este mecanismo não foi provado in vivo. Esta publicação também estabelece que para ser eficaz contras as placas de Αβ, os anticor- pos de anti-Αβ devem ganhar acesso ao parênquima cerebral e cruzar a bar- reira hematoencefálica. Várias publicações do PCT que refere-se às tentativas para controlar as placas de amilóide foram publicadas em 7 de dezembro de 2000. WO 00/72880 descreve redução significativa na placa no córtex e no hipocampo em um modelo de camundongo transgênico de doença de Al- zheimer quando tratado usando fragmentos N-terminais de peptídeos de Αβ e anticorpos que ligam a eles, mas não quando tratados com o fragmento 13-28 de Αβ conjugado com IgG de anti-camundongo de ovelha ou com um anticorpo contra o fragmento 13-28, anticorpo 266. Os anticorpos direciona- dos N-terminais foram afirmados cruzar a barreira hematoencefálica e indu- zir fagocitose das placas de amilóide em estudos in vitro. A WO 00/72876 tem virtualmente a mesma divulgação que a WO 00/72880 e é direcionada à imunização com os componentes de fibrilas de amilóide em si. A WO 00/77178 descreve anticorpos que foram designados para catalisar a hidrólise de β-amilóide, incluindo anticorpos construídos contra uma mistura dos compostos de transição de estatina de fenilalanina [Cys- Αβι0-25> estatina Phei9-Phe2o] e estatina Phe2o-Ala2i de Ογε-Αβιο^ e anticor- pos construídos contra Αβιο-25 tendo uma ligação de amida reduzida entre Pheig e Phe2o- Este documento menciona a seqüestração de Αβ, mas isto é especulação por que ele não dá nenhuma evidência de tal seqüestração.

Também, o documento não fornece nenhuma evidência in vivo que a admi- nistração de anticorpos causa efluxo de Αβ do sistema nervoso central, in- terfere com a formação das placas, reduz a carga das placas, forma comple- xos entre os anticorpos e Αβ nas amostras de tecido, ou afeta a cognição.

Foi mostrado que uma rota para o metabolismo de Αβ é através do transporte de SNC para o plasma (Zlokovic, B. V., et al., Proc. Natl. Acad.

Sei (USA) (1996) 93:4229-4234; Ghersi-Egea, J-F., et al., J. Neurochem. (1996) 67:880-883). Adicionalmente, foi mostrado que Αβ no plasma pode cruzar a barreira hematoencefálica e entrar no cérebro (Zlokovic, B. V., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67:1034-1040). Foi também mostra- do que a administração de certos anticorpos de Αβ policlonal e monoclonal diminui a deposição de Αβ em placas de amilóide no modelo de camundon- go transgênico de APPV717F da doença de Alzheimer (Bard, F., et al., Nature Med. (200) 6:916-919); no entanto, isto foi dito ser devido a certos anticorpos de anti-Αβ que cruzam a barreira hematoencefálica que estimula a fagocito- se das placas de amilóide por células microgliais. Nos experimentos de Bard, os ensaios de fatias cerebrais ex vivo mostraram que a presença de anticorpo de Αβ adicionado, junto com micróglia adicionada de forma exóge- na, induziu à fagocitose de Αβ, resultando na remoção de depósitos de Αβ.

Os níveis de tanto Αβ40 e Αβ42 solúveis no CSF e sangue podem facilmente ser detectados usando ensaios padronizados usando anticorpos direcionados contra epitopos ao longo da cadeia de Αβ. Tais ensaios foram reportados, por exemplo, nas Patentes U. S. n.os 5.766.846, 5.837.672 e 5.593.846. Estas patentes descrevem a produção de anticorpos monoclonais murinos para o domínio central do peptídeo de Αβ, e estes foram reportados ter epitopos em volta e incluindo posições 16 e 17. Os anticorpos direciona- dos contra a região N-terminal foram também descritos. Vários anticorpos monoclonais foram afirmados imunorreagir com as posições 13-28 do peptí- deo de Αβ; estes não ligam a um peptídeo que representa as posições 17- 28, assim, de acordo com as patentes citadas, estabelecendo que é esta região, incluindo as posições 16-17 (o sítio de α-secretase) que foi o alvo destes anticorpos. Entre os anticorpos conhecidos para ligar os aminoácidos 13 e 28 de Αβ estão anticorpos de camundongo 266, 4G8 e 1C2.

Agora surpreendentemente observamos que a administração do anticorpo 266 muito rapidamente e quase por completo restaura a cognição (memória dos objetos) em camundongos transgênicos homozigotos de 24 meses de idade (APPV717F). Ainda, o anticorpo não tem as propriedades que a técnica ensina ser requeridas para um anticorpo ser eficaz no tratamento de doença de Alzheimer, síndrome de Down e outras condições relaciona- das com o peptídeo de Αβ. Também para nossa surpresa, observamos que os anticorpos que liga ο Αβ entre as posições 13 e 28 (266 e 4G8) são capa- zes de seqüestrar formas solúveis de Αβ de suas formas circulantes ligadas no sangue, e que a administração periférica do anticorpo 266 resulta em efluxo rápido das quantidades relativamente grandes do peptídeo de Αβ do SNC no plasma. Isto resulta na liberação alterada de Αβ solúvel, prevenção de formação de placas e, mais surpreendentemente, melhora na cognição, mesmo sem necessariamente reduzir carga das placas de amilóide de Αβ, cruzar a barreira hematoencefálica a qualquer extensão significativa, decorar placa, ativar mecanismos celulares ou ligar com grande afinidade ao Αβ agregado.

Divulgação da Invenção A invenção fornece anticorpos humanizados, ou fragmentos destes, que positivamente afetam a cognição nas doenças e condições onde Αβ pode estar envolvido, tal como doença de Alzheimer clínica ou pré- clínica, síndrome de Down e angiopatia cerebral amilóide clínica ou pré- clínica. Os anticorpos ou fragmentos destes não necessitam cruzar a barrei- ra hematoencefálica, decorar a placa de amilóide, ativar as respostas celula- res e ainda necessariamente reduzir a carga da placa de amilóide. Em outro aspecto, esta invenção fornece anticorpos humanizados e fragmentos des- tes que seqüestram peptídeo de Αβ de sua forma circulante ligada no san- gue e alteram a liberação de formas solúveis e ligadas de Αβ no sistema nervoso central e no plasma. Em outro aspecto, esta invenção fornece anti- corpos humanizados e seus fragmentos, em que os anticorpos humanizados especificamente ligam a um epitopo entre os aminoácidos 13 e 28 da molé- cula de Αβ. Em outro aspecto, a invenção fornece anticorpos humanizados e fragmentos destes, em que as CDRs são derivadas de anticorpo 266 mono- clonal de camundongo e em que os anticorpos retêm aproximadamente as propriedades de ligação do anticorpo de camundongo e têm propriedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes ao anticorpo de camundongo (se- qüências SEQ ID NO: 1 até SEQ ID NO: 6). Em outro aspecto, esta invenção fornece anticorpos humanizados e fragmentos destes, em que as regiões variáveis têm seqüências que compreendem a CDR de anticorpo 266 de camundongo e seqüências de estrutura humana específicas (seqüências SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 10), em que os anticorpos retêm aproximada- mente as propriedades de ligação do anticorpo de camundongo e têm pro- priedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes ao anticorpo 266 de camundongo. Em outro aspecto, esta invenção fornece anticorpos humani- zados e fragmentos destes, em que a cadeia leve é SEQ ID NO: 11 e a ca- deia pesada é SEQ ID NO: 12.

Também parte da invenção são seqüências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos humanizados ou fragmentos destes acima di- vulgados, vetores compreendendo as seqüências de polinucleotídeos que codificam os anticorpos humanizados ou fragmentos destes, células hospe- deiras transformadas com os vetores ou incorporando os polinucleotídeos que expressam os anticorpos humanizados ou fragmentos destes, formula- ções farmacêuticas dos anticorpos humanizados e fragmentos destes aqui divulgados, e métodos de produzir e usar os mesmos.

Tais anticorpos humanizados e fragmentos destes são úteis para seqüestrar Αβ em seres humanos; para tratar e prevenir doenças e condi- ções caracterizadas por placas de Αβ ou toxicidade de Αβ no cérebro, tais como doença de Alzheimer, síndrome de Down e angiopatia cerebral amilói- de em seres humanos; para diagnosticar estas doenças em seres humanos; e para determinar se um indivíduo humano responderá ao tratamento usan- do os anticorpos humanos contra Αβ. A administração de um anticorpo humanizado apropriado in vivo para seqüestrar o peptídeo de Αβ que circula nos fluidos biológicos é útil para tratamento preventivo e terapêutico de condições associadas com a formação de placas difusas, neuríticas e cerebrovasculares contendo Αβ no cérebro. O anticorpo humanizado, incluindo um fragmento imunologicamente reativo deste, resulta na remoção do peptídeo de Αβ dos complexos macro- celulares que podem normalmente ser relevantes em transportá-lo nos flui- dos corporais para e dos sítios onde as placas podem formar ou onde elas podem ser tóxicas. Além disso, a seqüestração do peptídeo de Αβ do plas- ma com o anticorpo ou fragmento deste procede como um "alçapão", efi- cazmente seqüestrando peptídeo de Αβ solúvel no compartimento no plas- ma e induzindo Αβ entrar no plasma das localizações no sistema nervoso central (SNC). Seqüestrando ο Αβ no sangue, o efluxo da rede do cérebro é intensificado e Αβ solúvel é evitado de depositar-se nas placas solúveis e de formar espécies solúveis tóxicas no cérebro. Além disso, ο Αβ insolúvel nas placas que está em equilíbrio com ο Αβ solúvel pode ser removido do cére- bro através de um efeito seqüestrante no sangue. A seqüestração do peptí- deo de Αβ com o anticorpo também intensifica sua remoção do corpo e inibe os efeitos tóxicos do Αβ solúvel no cérebro e o desenvolvimento e também acúmulo de Αβ insolúvel como amilóide nas placas. Os anticorpos úteis na invenção não cruzam a barreira hematoencefálica em grandes quantidades (< 0,1 % dos níveis do plasma). Além disso, os anticorpos humanizados usados na invenção, quando administrados perifericamente, não necessitam eliciar uma resposta imune celular no cérebro quando ligados ao peptídeo de Αβ ou quando livremente circulando para ater seus efeitos benéficos. Tam- bém, quando perifericamente administrados eles não necessitam aprecia- velmente ligar peptídeo de Αβ agregado no cérebro para ter seus efeitos be- néficos.

Desse modo, em um aspecto, a invenção é direcionada a um método para tratar e prevenir condições caracterizadas pela formação de placas contendo proteína amilóide beta em seres humanos, cujo método compreende administrar, preferivelmente perifericamente, a um ser humano em necessidade de tal tratamento uma quantidade terapêutica ou profilati- camente eficaz de anticorpo monoclonal humanizado ou fragmento deste imunologicamente reativo, cujo anticorpo especificamente liga à região in- termediária do peptídeo de Αβ. Em outro aspecto, a invenção é direcionada a um método para inibir a formação de placas de amilóide e para remover placas de amilóide em seres humanos, cujo método compreende administrar a um indivíduo humano em necessidade de tal inibição uma quantidade efi- caz de um anticorpo humanizado que seqüestra peptídeo de Αβ de sua for- ma circulante no sangue e induz efluxo para fora do cérebro bem como libe- ração de Αβ alterado no plasma e no cérebro. Nos aspectos adicionais, a invenção é direcionada a tais anticorpos humanizados, incluindo porções imunologicamente eficazes destes, e aos métodos para sua preparação. A invenção também inclui métodos de reverter declínio cognitivo, melhorar cognição, tratar declínio cognitivo e prevenir declínio cognitivo em um indivíduo diagnosticado com doença de Alzheimer clínica ou pré-clínica, síndrome de Down ou angiopatia cerebral amilóide clínica ou pré-clínica, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anti- corpo humanizado da invenção. A invenção também inclui o uso de um anticorpo humanizado da invenção para a fabricação de um medicamento, incluindo expressão pro- longada de seqüências recombinantes do anticorpo ou fragmento de anti- corpo em tecidos humanos, para tratar, prevenir ou reverter doença de Al- zheimer, síndrome de Down ou angiopatia cerebral amilóide; para tratar, prevenir ou reverter declínio cognitivo em doença de Alzhermer clínica ou pré-clínica, síndrome de Down ou angiopatia cerebral amilóide clínica ou pré-clínica, ou para inibir a formação de placas de amilóide ou os efeitos de espécie de Αβ solúvel tóxica em seres humanos. A invenção está relacionada à observação surpreendente que dentro de um curto período de tempo após a administração de um anticorpo da presente invenção, quantidades relativamente grandes de Αβ efluem do sistema nervoso central para o sangue. Assim, esta invenção inclui métodos para avaliar a resposta de um indivíduo humano ao tratamento com um anti- corpo que liga ο Αβ ou um fragmento deste, compreendendo: a) administrar o anticorpo ou um fragmento deste ao indivíduo; e b) medir a concentração de Αβ no sangue do indivíduo. A invenção também inclui um método de tratar um indivíduo hu- mano com um anticorpo que liga Αβ ou um fragmento deste, compreenden- do: a) administrar uma primeira quantidade do anticorpo ou fragmento deste ao indivíduo; b) dentro de 3 horas a duas semanas após administrar a pri- meira dose, medir a concentração de Αβ no sangue do indivíduo; c) se ne- cessário, calcular uma segunda quantidade de anticorpo ou fragmento deste com base no resultado da etapa b), cuja segunda quantidade é a mesma ou diferente que a primeira quantidade; e d) administrar a segunda quantidade do anticorpo ou fragmento. A invenção também inclui um método de avaliar em um indivíduo humano a eficácia de um anticorpo que liga ao Αβ, ou um fragmento deste, para inibir ou prevenir formação de placa de amilóide de Αβ, para reduzir placa amilóide de Αβ, para reduzir os efeitos da espécie de Αβ solúvel tóxica ou para tratar uma condição ou uma doença associada com a placa de Αβ, compreendendo: a) obter uma primeira amostra do plasma do indivíduo ou CSF; b) medir uma concentração de base de Αβ na primeira amostra; c) ad- ministrar o anticorpo ou fragmento deste ao indivíduo; d) dentro de 3 horas a duas semanas após administração do anticorpo ou fragmento deste, obter uma segunda amostra do plasma do indivíduo ou CSF; e e) medir a concen- tração do Αβ na segunda amostra; em que, a eficácia está relacionada à quantidade de Αβ ligado ao anticorpo no sangue e à concentração de Αβ no CSF.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra a porcentagem do peptídeo de Αβ extraído do fluido cerebroespinhal humano através de uma membrana de diálise por Mab 266 quanto uma função do corte do peso molecular da membrana de diálise. A Figura 2 mostra a concentração do Αβ-rotai encontrado no plasma de um camundongo transgênico APPV717F após injeção ou com 200 «g ou 600 ocg de Mab 266 quanto uma função de tempo. A Figura 3A mostra a quantidade de deposição de peptldeo de Ap no córtex em camundongos transgênicos APPV717F tratados com solução salina, IgG de camundongo ou Mab 266. A Figura 3B mostra a correlação destes resultados com origem parenteral. A Figura 4 corresponde a SEQ ID NO; 17 e mostra as sequências de polinucleotídeos para expressão da cadeia leve 266 humanizada do plasmídio pVk-Hu266 e as codificações dos aminoáddos simples para a cadeia leve de 266 humanizado expressa (correspondendo à SEQ ID NO: 11 quando madura). A sequência completa do gene de cadeia leve de Hu266 está localizada entre os sítios de Mlul e BamHI no pVk-Hu266. O número do nu- cleotídeo indica sua posição no pVgk-Hu266. Os éxons Vk e Ck estão tradu- zidos em código de letra simples; o pontilhado indica o códon de terminação da transladação. A cadeia pesada madura inicia no ácido aspártico subli- nhado duplo (D). As sequências de íntron estão em itálico. A Figura 5 corresponde a SEQ ID NO: 18 e mostra as sequên- cias de polinucleotídeos para expressar a cadeia pesada de 266 humaniza- do do plasmídio pVg1-Hu266 e as codificações dos aminoáddos simples para a cadeia pesada de 266 humanizado expressa {correspondendo à SEQ ID NO: 12 quando madura). A sequência completa do gene de cadeia pesada de Hu266 está localizada entre os sítios de Mlul e BamHI no pVg1-Hu266. O número do nucleotídeo indica sua posição no pVg1-Hu266. Os éxons VH e CH estão tra- duzidos em código de letra simples. O pontilhado indica o códon de termina- ção da transladação. A cadeia pesada madura inicia no ácido glutâmico sub- linhado duplo (D). As sequências de íntron estão em itálico. A Figura 6 é um mapa do plasmídio de pVk-Hu266. A Figura 7 é um mapa do plasmídio de pV1-Hu266.

Modos de Realizar a Invenção Os peptídeos de Ap que circulam nos fluidos biológicos huma- nos representam a região terminal de carbóxi de uma proteína precursora codificada no cromossoma 21. Foi reportado dos resultados de experimentos in vitro que o peptídeo de Ap tem fraca solubilidade em soluções fisiológicas, uma vez que ele contém um alongamento de aminoácidos hidrofóbicos que são uma parte da região que fixa seu precursor mais longo às membranas de lipídeos das células. Desse modo não é surpreendente que o peptídeo de Αβ circulante seja normalmente complexo com outras metades que o previne de agregar-se. Isto tem resultado em dificuldades na detecção de peptídeo de Αβ circulante em fluidos biológicos.

Os documentos das patentes acima mencionadas (Patentes U. S. n.os 5.766.846; 5.837.672 e 5.593.846) descrevem a preparação de anti- corpos, incluindo um anticorpo monoclonal, designado clone 266 que foi desenvolvido contra, e tem mostrado ligar especificamente a um peptídeo compreendendo aminoácidos 13-28 do peptídeo de Αβ. Os presentes apli- cantes observaram que os anticorpos que ligam dentro de sua região, em comparação com os anticorpos que ligam em outro lugar na seqüência de aminoácidos de Αβ, são capazes de seqüestrar o peptídeo de Αβ solúvel muito eficazmente dos complexos macromoleculares. Esta seqüestração afetará o efluxo do peptídeo de Αβ na rede do SNC, alterará sua liberação no SNC e no plasma e reduzirá sua disponibilidade para a formação de pla- cas. Desse modo, os anticorpos desta especificidade, modificados para re- duzir sua imunogenicidade convertendo-os para uma forma humanizada, oferecem a oportunidade para tratar, tanto profilática quanto terapeutica- mente, as condições que estão associadas com a formação de placas de amilóide beta. Estas condições incluem, como acima observado, Alzheimer pré-clínica ou clínica, síndrome de Down e angiopatia cerebral amilóide pré- clínica ou clínica.

Como aqui usado, a palavra "tratar" inclui tratamento terapêuti- co, onde uma condição a ser tratada já é conhecida estar presente e profila- xia - isto é, prevenção ou amenização do possível início futuro de uma con- dição.

Por "anticorpos monoclonais que ligam à região intermediária do peptídeo de Αβ" é significado anticorpos monoclonais (Mab ou Mabs) que ligam uma seqüência de aminoácidos que representa um epitopo contido entre as posições 13-28 do Αβ. A região inteira não necessita ser alvejada.

Desde que o anticorpo ligue pelo menos a um epitopo dentro desta região (especificamente, por exemplo, incluindo o sítio de a-secretase 16-17 ou o sítio no qual o anticorpo 266 liga), tais anticorpos são eficazes no método da invenção.

Por "anticorpo" é significado um anticorpo monoclonal em si, ou um fragmento imunologicamente eficaz deste, tal como um fragmento Fab, Fab’ ou F(ab’)2 deste. Em alguns contextos, aqui, os fragmentos serão mencio- nados especificamente para ênfase; de modo algum, será entendido que independente dos fragmentos serem especificados, o termo "anticorpo" inclui tais fragmentos bem como as formas de cadeia mais simples. Desde que a proteína retenha a capacidade especificamente de ligar seu alvo intenciona- do, e neste caso, seqüestrar o peptídeo de Αβ de suas proteínas portadoras no sangue, está incluso dentro do termo "anticorpo". Também incluso dentro da definição "anticorpo", por exemplo, estão as formas de cadeia simples, em geral designadas regiões de Fv, dos anticorpos com esta especificidade.

Preferivelmente, mas não necessariamente, os anticorpos úteis na invenção são produzidos recombinantemente, visto que a manipulação dos anticorpos tipicamente murinos ou não-humanos com a especificidade apropriada é requerida para convertê-los para a forma humanizada. Os anticorpos podem ou não ser glicosilados, embora os anticorpos glicosilados sejam preferidos.

Os anticorpos são propriamente reticulados através das ligações de dissul- feto, como é bem-conhecido. A unidade estrutural do anticorpo básico é conhecida compreen- der um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A parte amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoáci- dos primariamente responsável para o reconhecimento de antígeno. A parte carbóxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável para a função efetora.

As cadeias leves são classificadas como gama, mu, alfa e la- mda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsílon e definem o isótipo do anticorpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, res- pectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoáci- dos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 mais aminoácidos.

As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada formam o sítio de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo intacto tem dois sítios de ligação. As cadeias todas apresentam a mesma estrutura geral das regiões estruturais relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hiperva- riáveis, também denominadas regiões de determinação de complementari- dade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epitopo específico. Do término N ao término C, ambas cadeias leves e pesadas compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A designação dos aminoácidos a cada domínio é de acordo com as convenções bem-conhecidas [Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest" National Institutes of He- alth, Bethesda, Md., 1987 e 1991; Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia, et al., Nature 342:878-883 (1989)].

Como é bem entendido na técnica, os anticorpos monoclonais podem facilmente ser gerados com especificidade apropriada por técnicas padrão de imunização de mamíferos, que formando hibridomas a partir das células produtoras de anticorpos dos ditos mamíferos ou de outra forma imortalizando os mesmos, e cultura dos células de hibridomas ou células imortalizadas para produzí-los com a especificidade apropriada. No presente caso, tais anticorpos poderíam ser gerados por imunização de um ser huma- no, coelho, rato ou camundongo, por exemplo, com um peptídeo que repre- senta um epítope englobando a região 13-28 do peptídeo Αβ ou uma sub- região apropriada do mesmo. Materiais de manipulação recombinante po- dem ser obtidos por reposição das seqüências de nucleotídeos que codifi- cam o anticorpo desejado a partir do hibridoma ou de outra célula que pro- duzem o mesmo. Estas seqüências de nucleotídeos podem ser depois ma- nipuladas para fornecê-los na forma humanizada.

Por "anticorpo humanizado" é significado um anticorpo que é composto parcialmente ou por completo de seqüências de aminoácidos deri- vadas de uma linhagem de germe de anticorpo humano alterando a seqüên- cia de um anticorpo tendo regiões de determinação de complementaridade não-humanas (CDR). Uma tal alteração mais simples pode consistir em substituição da região constante de um anticorpo humano pela região cons- tante murina, assim resultando em uma quimera humana/murina que pode ter suficientemente baixa imunogenicidade a ser aceitável para o uso farma- cêutico. Preferivelmente, no entanto, a região variável do anticorpo e mesmo a CDR é também humanizada por técnicas que são entrementes bem- conhecidas na técnica. As regiões estruturais das regiões variáveis são substituídas pelas regiões estruturais humanas correspondentes que partem da CDR não-humana substancialmente intacta, ou mesmo substituindo a CDR por seqüências derivadas de um genoma humano. Os anticorpos to- talmente humanos são produzidos em camundongos geneticamente modifi- cados cujos sistemas imunológicos foram alterados para corresponder aos sistemas imunológicos humanos. Como acima mencionado, é suficiente para o uso nos métodos da invenção, empregar um fragmento imunologicamente específico do anticorpo, incluindo fragmentos que representam as formas de cadeia simples.

Um anticorpo humanizado novamente refere-se a um anticorpo compreendendo uma estrutura humana, pelo menos uma CDR de um anti- corpo não-humano e em que qualquer região constante presente é substan- cialmente idêntica a uma região constante de imunoglobulina, isto é, pelo menos cerca de 85-90 %, preferivelmente pelo menos 95 % idêntica. Por isso, todas as partes de um anticorpo humanizado, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas às partes correspondentes de uma ou mais seqüências de imunoglobulina humana nativa. Por exemplo, uma imunoglobulina humanizada pode tipicamente não abranger um anticorpo da região variável/região constante de camundongo quimérico.

Os anticorpos humanizados têm pelo menos três vantagens po- tenciais sobre os anticorpos não-humanos e quiméricos para o uso na tera- pia humana: 1) por causa da parte efetora ser humana, ela pode interagir melhor com as outras partes do sistema imunológico humano (por exemplo, destrói as células alvos mais eficazmente por citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC)). 2) O sistema imunológico humano não deve reconhecer a es- trutura ou região C do anticorpo humanizado como estranho, e, portanto a resposta do anticorpo contra um tal anticorpo injetado deve ser menos que contra um anticorpo não-humano totalmente estranho ou um anticorpo qui- mérico parcialmente estranho. 3) Os anticorpos não-humanos injetados foram reportados ter uma meia-vida na circulação humana muito mais curta que a meia-vida dos anticorpos humanos. Os anticorpos humanizados injetados terão uma meia- vida essencialmente idêntica aos anticorpos humanos de ocorrência natural, permitindo doses menores e menos freqüentes a serem dadas. A elaboração das imunoglobulinas humanizadas pode ser reali- zada como segue. Quando um aminoácido encaixar na categoria a seguir, o aminoácido da estrutura de uma imunoglobulina humana a ser usado (imunoglobulina aceptora) é substituído por um aminoácido da estrutura de uma imunoglobulina não-humana que fornece CDR (imunoglobulina doado- ra): (a) o aminoácido na região de estrutura humana da imunoglobu- lina aceptora não é usual para a imunoglobulina humana naquela posição, visto que o aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora é típico para a imunoglobulina humana naquela posição; (b) a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDRs; ou (c) qualquer cadeia lateral de um aminoácido da estrutura dentro de cerca de 5-6 angstroms (centro a centro) de qualquer átomo de um ami- noácido de CDR em um modelo de imunoglobulina tridimensional [Queen, et al., op. Cit., e Co, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88, 2869 (1991)]. Quando cada um dos aminoácidos na região estrutural humana da imunoglobulina aceptora e um aminoácido correspondente na imunoglobulina doadora não é usual para a imunoglobulina humana naquela posição, tal como um aminoá- cido ser substituído por um aminoácido típico para a imunoglobulina humana naquela posição.

Um anticorpo humanizado preferido é uma forma humanizada de anticorpo 266 de camundongo. As CDRs de 266 humanizado têm as se- guintes seqüências de aminoácidos: CDR1 de cadeia leve: 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID NO: 1) CDR2 de cadeia leve: 1 5 Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID NO: 2) CDR3 de cadeia leve: 1 5 Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 3) CDR1 de cadeia pesada: 1 5 Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID NO: 4) CDR2 de cadeia pesada: 1 5 10 15 Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Vai Lys Gly (SEQ ID NO: 5) e CDR3 de cadeia pesada: 1 Gly Asp Tyr (SEQ ID NO: 6).

Uma região variável de cadeia leve preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seguinte seqüência de aminoáci- dos, em que a estrutura originou dos segmentos de Vk DPK18 e do seg- mento de V Jk1 da linhagem de germe humana, com as várias substituições de aminoácidos para os aminoácidos consensuais no mesmo sub grupo de V humano para reduzir a imunogenicidade potencial: 1 5 10 15 Asp Xaa Vai Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Vai Xaa Xaa 20 25 30 Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa 35 40 45 Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Xaa Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Vai 95 100 105 Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110 Gly Thr Xaa Xaa Glu lie Lys Arg (SEQ ID NO: 7) em que: Xaa na posição 2 é Vai ou lie, Xaa na posição 7 é Ser ou Thr;

Xaa na posição 14 é Thr ou Ser;

Xaa na posição 15 é Leu ou Pro;

Xaa na posição 30 é lie ou Vai;

Xaa na posição 50 é Arg, Gin ou Lys;

Xaa na posição 88 é Vai ou Leu;

Xaa na posição 105 é Gin ou Gly;

Xaa na posição 108 é Lys ou Arg; e Xaa na posição 109 é Vai ou Leu.

Uma região variável de cadeia pesada preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seqüência de aminoácidos a se- guir, em que a estrutura originou dos segmentos de VH DP53 e do segmento J JH4 da linhagem de germe humana, com várias substituições de aminoá- cidos para aminoácidos consensuais no mesmo subgrupo humano para re- duzir a imunogenicidade potencial: 15 10 15 Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys GlyLeu 50 55 60 Xaa Leu Vai Ala Gin IleAsn Ser Vai Gly Asn Ser Thr TyrTyr 65 70 75 Pro Asp Xaa Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie SerArg Asp Asn Xaa 80 85 90 Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp 95 100 105 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr XaaVal Thr Vai SerSer(SEQ ID NO: 8) em que: Xaa na posição 1 é Glu ou Gin;

Xaa na posição 7 é Ser ou Leu;

Xaa na posição 46 é Glu, Vai, Asp, ou Ser;

Xaa na posição 63 é Thr ou Ser;

Xaa na posição 75 é Ala, Ser, Vai, ou Thr;

Xaa na posição 76 é Lys ou Arg;

Xaa na posição 89 é Glu ou Asp; e Xaa na posição 107 é Leu ou Thr.

Uma região variável de cadeia leve preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seqüência de aminoácidos a se- guir, em que a estrutura originou dos segmentos de Vk DPK18 e do seg- mento J Jk1 da linhagem de germe humana, com várias substituições de aminoácidos para aminoácidos consensuais no mesmo subgrupo de V hu- mano para reduzir a imunogenicidade potencial: 1 5 10 15 Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu 20 25 30 Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90 Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai 95 100 105 Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin 110 Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg (SEQ ID NO: 9).

Uma região variável de cadeia pesada particularmente preferida de um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seqüência de ami- noácidos a seguir, em que a estrutura originou de segmentos de VH DP53 e de segmento de J JH4 da linhagem de germe humana. 15 10 15 Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Leu Vai Ala Gin fie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 Pro Asp Thr Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 100 105 Thr Ala Vai Tyr TyrCys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser (SEQ ID NO: 10).

Uma cadeia leve preferida para um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seqüência de aminoácidos: 15 10 15 Asp Vai Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Vai Thr Leu 20 25 30 Gly Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro 50 55 60 Gly Gin Ser Pro Arg Leu Leu fie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe 65 70 75 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser GIy Ser Gly Thr Asp 80 85 90 Phe Thr Leu Lys lie Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Vai 95 100 105 Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gin 110 115 120 Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai 125 130 135 Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala 140 145 150 Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 155 160 165 Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 170 175 180 Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 185 190 195 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 200 205 210 Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai 215 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID NO: 11).

Uma cadeia pesada preferida para um anticorpo humanizado da presente invenção tem a seqüência de aminoácido: 15 10 15 Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly 20 25 30 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45 Arg Tyr Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Leu Vai Ala Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75 Pro Asp Thr Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 100 105 Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 110 115 120 Thr Leu Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 125 130 135 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140 145 150 Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Vai Thr 155 160 165 Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe 170 175 180 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai 185 190 195 Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys 200 205 210 Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai 215 220 225 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 230 235 240 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro 245 250 255 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr 260 265 270 Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai Lys Phe 275 280 285 Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys 290 295 300 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 305 310 315 Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 320 325 330 Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr 335 340 345 lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr 350 355 360 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 365 370 375 Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu 380 385 390 Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 395 400 405 Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 410 415 420 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys 425 430 430 Ser Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser 440 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (SEQ ID NO: 12).

Outras seqüências são possíveis para as cadeias leves e pesa- das para os anticorpos humanizados da presente invenção e para 266 hu- manizado. As imunoglobulinas podem ter dois pares de complexos de ca- deia leve/cadeia pesada, pelo menos uma cadeia compreendendo uma ou mais regiões de determinação de complementaridade funcionalmente ligada aos segmentos da região de estrutura humana.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se aos polinucleo- tídeos recombinantes que codificam os anticorpos que, quando expressos, compreendem as CDRs de cadeia pesa e leve de um anticorpo da presente invenção. Quanto à região de estrutura humana, uma seqüências de amino- ácidos da estrutura ou da região variável de uma imunoglobulina não- humana que fornece uma CDR é comparada com as seqüências correspon- dentes em uma coleção de seqüências de região variável de imunoglobulina humana e uma seqüência tendo uma alta porcentagem de aminoácidos idênticos é selecionada. Polinucleotídeos exemplares, que na expressão codificam as cadeias de polipeptídeo compreendendo as CDRs de cadeia pesada e leve de anticorpo monoclonal 266 são dados nas Figuras 4 e 5.

Devido à degeneração do códon e às substituições dos aminoácidos não críticos, outras seqüências de polinucleotídeos podem ser facilmente subs- tituídas por aquelas seqüências. Os polinucleotídeos particularmente preferi- dos da presente invenção codificam os anticorpos, que quando expressos compreendem as CDRs das SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 6, ou qualquer uma das regiões variáveis das SEQ ID NO: 7 - SEQ ID NO: 10, ou as ca- deias leves e pesadas das SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.

Os polinucleotídeos tipicamente também incluirão uma seqüên- cia de polinucleotídeos de controle de expressão operativamente ligada à imunoglobulina humanizada que codifica as seqüências, incluindo as regiões promotoras naturalmente associadas e heterólogas. Preferivelmente, as se- qüências de controle de expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vetores capazes de transformar ou transferir células hospedeira eucarió- ticas, mas seqüências de controle para hospedeiros pró-eucarióticos podem ser também usadas. Uma vez o vetor tenha sido incorporado na linhagem de célula hospedeira apropriada, a célula hospedeira é propagada sob condi- ções adequadas para a expressão de nível alto das seqüências de nucleotí- deos, e, se desejado, a coleção e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesada ou anticorpos intactos, ligando fragmentos ou outras formas de imunoglobulinas podem acompanhar.

As seqüências de nucleotídeos da presente invenção capazes de por fim expressar os anticorpos humanizados desejados podem ser for- madas de uma variedade de diferentes polinucleotídeos (oligonucleotídeos genômicos ou cDNA, RNA, sintéticos, etc.) e componentes (regiões V, J, D e C), bem como uma variedade de diferentes técnicas. Juntar seqüências ge- nômicas e sintéticas apropriadas é um método comum de produção, mas seqüências de cDNA podem também ser utilizadas.

As seqüências de DNA humanas da região constante podem ser isoladas com procedimentos bem-conhecidos de uma variedade de células humanas, mas preferivelmente de células B imortalizadas. As CDRs para produzir as imunoglobulinas da presente invenção serão similarmente deri- vadas de anticorpos monoclonais não-humanos capazes de ligar a um epi- topo entre os aminoácidos 13 e 28 do peptídeo de Αβ, cujos anticorpos mo- noclonais são produzidos em qualquer fonte mamífera conveniente, incluin- do, camundongos, ratos, coelhos ou outros vertebrados capazes de produzir anticorpos por método bem-conhecidos, como acima descrito. As células de fonte adequadas para as seqüências de polinucleotídeos e células hospedei- ras para expressão de imunoglobulina e secreção podem ser obtidas de vá- rias fontes bem-conhecidas na técnica.

Além das imunoglobulinas humanizadas especificamente aqui descritas, outras imunoglobulinas modificadas "substancialmente homólo- gas" podem ser facilmente elaboradas e produzidas utilizando várias técni- cas de DNA recombinante bem-conhecidas a aqueles versados na técnica.

Por exemplo, as regiões estruturais podem variar das seqüências nativas no nível da estrutura primária por várias substituições de aminoácidos, adições e deleções terminais e intermediárias e outras. Além disso, uma variedade de diferentes regiões estruturais humanas pode ser usada isoladamente ou em combinação como uma base para as imunoglobulinas humanizadas da presente invenção. Em geral, as modificações dos genes podem ser facil- mente acompanhadas por uma variedade de técnicas bem-conhecidas, tais como metagênese direcionada ao sítio.

Alternativamente, os fragmentos de polipeptídeos que compre- endem apenas uma parte da estrutura do anticorpo primária podem ser pro- duzidos, cujos fragmentos possuem uma ou mais atividades de imunoglobu- lina (por exemplo, atividade de fixação de complemento). Estes fragmentos de polipeptídeo podem ser produzidos por divagem proteolítica de anticor- pos intactos por métodos bem-conhecidos na técnica, ou por códons de in- terrupção de inserção nas localizações desejadas em vetores usando muta- genes direcionada ao sítio, tal como após CH1 para produzir os fragmentos de Fab ou após a região impedida para produzir os fragmentos de F(ab')2.

Os anticorpos de cadeia simples podem ser produzidos unindo VL e VH com um ligador de DNA.

Como previamente estabelecido, as seqüências de nucleotídeo de codificação serão expressas em hospedeiros após as seqüências terem sido operativamente ligadas (isto é, posicionadas para garantir o funciona- mento) a uma seqüência de controle de expressão. Estes vetores de ex- pressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros ou como episômeros ou como uma parte integral do DNA cromossômico hospedeiro.

Comumente, os vetores de expressão conterão marcadores de seleção, por exemplo, tetraciclina ou neomicina, para permitir a detecção daquelas célu- las transformadas com seqüências de DNA desejadas. E. coli é um hospedeiro procariótico útil particularmente para clonar os polinucleotídeos da presente invenção. Outros hospedeiros micro- bianos adequados para o uso incluem bacilos, tais como Bacillus subtilus e outras enterobacteriáceas, tais como Salmonella, Serratia e várias espécies Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, pode-se também produzir vetores de expressão que tipicamente conterão seqüências de controle de expressão compatíveis com a célula hospedeira (por exemplo, uma origem de replicação). Além disso, qualquer um de vários promotores bem- conhecidos pode estar presente, tais como o sistema de promotor de lacto- se, um sistema de promotor de triptofano (trp), um sistema de promotor de beta-lactamase ou um sistema de promotor de fago lambda. Os promotores tipicamente controlarão a expressão, opcionalmente com uma seqüência operadora, e terão seqüências de sítio de ligação ao ribossoma e outros, para iniciação e completar a transcrição e tradução.

Outros micróbios, tais como levedura, podem ser também usa- dos para expressão. Ascomiceto é um hospedeiro preferido, com vetores adequados tendo seqüências de controle de expressão, tais como promoto- res, incluindo 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas e uma origem de replicação, seqüências de terminação e outros como desejado.

Além dos microorganismos, a cultura celular de tecido mamífero pode também ser usada para expressar e produzir os polipeptídeos da pre- sente invenção. As células eucarióticas são de fato preferidas, por causa de várias linhagens de células hospedeiras adequadas capazes de secretar as imunoglobulinas intactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem as li- nhagens de células de CHO, várias linhagens de células de COS, linhagens de células de Ovário de Hamster Siriano, células de HeLa, preferivelmente linhagens de células de mieloma, células B transformadas, linhagens de cé- lulas reumáticas embriônicas humanas ou hibridomas. Os vetores de ex- pressão para estas células podem incluir seqüências de controle de expres- são, tais como uma origem de replicação, um promotor, um intensificador e sítios de informação de processamento necessários, tais como sítios de liga- ção de ribossoma, sítios de fatias de RNA, sítios de poliadenilação e se- qüências terminadoras transcripcionais. As seqüências de controle de ex- pressão preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulinas, SV40, Adenovírus, Vírus de Papiloma Bovino, citomegalovírus e outros.

Os vetores contendo as seqüências de nucleotídeos de interes- se (por exemplo, as seqüências de codificação de cadeia pesada e leve e seqüências de controle de expressão) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem-conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é co- mumente utilizada para células procarióticas, visto que o tratamento de fos- fato de cálcio ou eletroporação pode ser usado para outros hospedeiros ce- lulares.

Uma vez expressos, os anticorpos totais, seus dímeros, cadeias leve e pesada individuais ou outras formas de imunoglobulina da presente invenção podem ser purificadas de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo a precipitação de sulfato de amônio, permuta iônica, afini- dade, fase reversa, cromatografia de coluna de interação hidrofóbica, ele- troforese em gel e outros. As imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cerca de 90 a 95 % de homogeneidade são preferidas, e 98 a 99 % ou mais homogeneidade mais preferido, para usos farmacêuticos. Uma vez purificados, parcialmente ou à homogeneidade desejada, os polipeptí- deos podem depois ser usados terapêutica ou profilaticamente, como aqui direcionado.

Os anticorpos (incluindo os fragmentos imunologicamente reati- vos) são administrados a um indivíduo em risco ou apresentando sintomas relacionados a Αβ ou patologia tal como doença de Alzheimer clínica ou pré- clínica, síndrome de Down ou angiopatia amilóide clínica ou pré-clínica, usando técnicas de administração padrão, preferivelmente perifericamente (isto é, não por administração no sistema nervoso central) por administração intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramus- cular, intranasal, bucal, sublingual ou de supositório. Embora os anticorpos possam ser administrados diretamente no sistema ventricular, fluido espi- nhal, ou parênquima cerebral, e técnicas para direcionar estas localizações são bem-conhecidas na técnica, na é necessário utilizar estes procedimen- tos mais difíceis. Os anticorpos da invenção são eficazes quando adminis- trados pelas técnicas mais simples que contam com o sistema de circulação periférico. As vantagens da presente invenção incluem a capacidade do an- ticorpo exercer seus efeitos benéficos mesmo que ainda não fornecido dire- tamente ao sistema nervoso central em si. De fato, foi demonstrado aqui que a quantidade de anticorpo que cruza a barreira hematoencefálica é < 0,1 % dos níveis de plasma e que os anticorpos da invenção exercem sua capaci- dade de seqüestrar Αβ na circulação periférica bem como alterar SNC e libe- ração de Αβ solúvel no plasma.

As composições farmacêuticas para administração são elabora- das para ser apropriadas para o modo selecionado de administração, e os excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como agentes dispersantes, tampões, tensoativos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes de iso- tonicidade, agentes estabilizantes e outros são usados como apropriado.

Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, última edição, aqui incorporada por referência, fornece um compêndio de técnicas de formulação como são em geral conhecidas aos praticantes.

Pode ser particularmente útil alterar as características de solubilidade dos anticorpos da invenção, tornando-os mais lipofílicos, por exemplo, encapsu- lando-os em lipossomas ou bloqueando os grupos polares. A liberação sistêmica periférica por injeção intravenosa ou intra- peritoneal ou subcutânea é preferida. Os veículos adequados para tais inje- ções são diretos. Além disso, no entanto, a administração pode ser também realizada através das membranas mucosas por meio de aerossóis nasais ou supositórios. As formulações adequadas para tais modos de administração são bem-conhecidas e tipicamente incluem tensoativos que facilitam a transferência da membrana reticulada. Tais tensoativos são freqüentemente derivados de esteróides ou são lipídios catiônicos, tais como cloreto de N-[1- (2,3-dioleoil)propil-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) ou vários compostos tais como semi-succinato de colesterol, gliceróis de fosfatidila e outros. A concentração do anticorpo humanizado nas formulações de tão baixo quanto cerca de 0,1 % a tanto quanto 15 ou 20 % em peso e será selecionado primariamente com base nos volumes de fluido, viscosidades e assim por diante, de acordo com o modo particular de administração seleci- onado. Assim, uma composição farmacêutica típica para injeção pode ser composta para conter 1 ml_ de água tamponada estéril de solução salina tamponada de fosfato e 1-100 mg do anticorpo humanizada da presente in- venção. A formulação pode ser filtrada estéril após produzir a formulação, ou do contrário tornada microbiologicamente aceitável. Uma composição típica para infusão intravenosa pode ter um volume tanto quanto 250 mL de fluido, tal como solução de Ringer estéril, e 1-100 mg por mL, ou mais na concen- tração do anticorpo. Os agentes terapêuticos da invenção podem ser con- gelados ou liofilizados para armazenagem e reconstituído em um veículo estéril adequado antes do uso. A liofilização e reconstituição podem levar a graus variados de perda de atividade do anticorpo (por exemplo, com globu- linas imunes convencionais, anticorpos de IgG tendem a ter maior perda de atividade que os anticorpos de IgG). Dosagens podem ter que ser ajustadas para compensar. O pH da formulação será selecionado para equilibrar a es- tabilidade do anticorpo (químico ou físico) e confortar o paciente quando administrado. Em geral, o pH entre 4 e 8 é tolerado.

Embora os métodos anteriores parecer o mais convenientes e mais apropriados para administração de proteínas tais como anticorpos hu- manizados mediante adaptação adequada, outras técnicas para administra- ção, tais como administração transdérmica e administração oral podem ser empregadas desde que formulação própria seja elaborada.

Além disso, pode ser desejável empregar formulações de libera- ção controlada usando películas e matrizes biodegradáveis, ou minibombas osmóticas ou sistemas de liberação com base nas contas de dextrano, algi- nato ou colágeno.

Em resumo, as formulações que estão disponíveis para admi- nistração dos anticorpos da invenção são bem-conhecidas na técnica e po- dem ser selecionadas de uma variedade de opções.

Os níveis de dosagem típicos podem ser otimizados usando téc- nicas clínicas padrão e serão dependentes do modo de administração e da condição do paciente.

Os exemplos a seguir são intencionados a ilustrar mas não a li- mitar a invenção.

Os exemplos aqui abaixo empregam, entre outros, um anticorpo monoclonal murino designado "266" que foi originalmente preparado pela imunização com um peptídeo composto de resíduos 13-28 de peptídeo de Αβ humano. Ο anticorpo foi confirmado imunorreagir com este peptídeo, mas tinha sido anteriormente reportado não reagir com o peptídeo contendo ape- nas os resíduos 17-28 de peptídeo de Αβ humano, ou em quaisquer outros epitopos dentro do peptídeo de Αβ. A preparação deste anticorpo é descrita na Patente U. S. n.9 5.766.846, aqui incorporada por referência. Visto que os exemplos aqui descrevem experimentos conduzidos em sistemas murinos, o uso de anticorpos monoclonais murinos é satisfatório. No entanto, nos méto- dos de tratamento da invenção intencionada para o uso humano, as formas humanizadas dos anticorpos com a imunoespecificidade correspondente àquela do anticorpo 266 são preferidas. EXEMPLO 1 SEQÜESTRAÇÃO DE PEPTÍDEO DE Αβ ADICIONADO EM FLUIDOS HU- MANOS

As amostras de fluido cerebroespinhal humano (CSF) (50 μΙ) e plasma humano (50 μΙ) foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente como segue: 1. sozinho; 2. junto com 5 ng de peptídeo de Αβ 40; ou 3. 5 ng de peptídeo de Αβ 40 mais 1 mg de anticorpo monoclonal 266 (descrito, por exemplo, na Patente U. S. n.9 5.766.846, aqui incorporada por referência).

As amostras foram depois submetidas à eletroforese em um gel de gradiente não-desnaturante a 4-25 %, isto é, eletroforese de gradiente não desnaturante (NDGGE) e transferidas para nitrocelulose. As manchas foram depois marcadas com Ponceau S ou, para western blot, sondadas com anticorpo monoclonal marcado com biotina (3D6) que é direcionado contra os cinco aminoácidos de peptídeo de Αβ, desenvolvidos com estrep- tavidina-peroxidase de rábano silvestre e detectados mediante quimilumi- nescência reforçada (ECL). Os diâmetros hidratados dos materiais contidos nas faixas nas manchas foram estimados usando marcadores de peso mo- lecular de Pharmacia. Assim, se o peptídeo de Αβ estiver ligado às outras moléculas, ele pode operar no tamanho do complexo resultante.

Western blots de CSF com ou sem 5 ng de peptídeo de Αβ não mostram nenhuma evidência do peptídeo de Αβ em resposta à detecção mediada por anticorpo 3D6. Resultados similares são obtidos para plasma humano. Isto foi verdadeiro apesar do fato que o peptídeo de Αβ pode ser detectado por SDS-PAGE seguido por western blot usando a mesma técnica e na mesma amostra de CSF. Presumidamente, a detecção de peptídeo de Αβ foi evitada por interações entre este peptídeo e outros fatores nos fluidos testados. Porém, quando o Mab 266 é adicionado à incubação, as bandas características que representam o peptídeo de Αβ seqüestrado complexados com o anticorpo estão presentes tanto no plasma quanto no CSF. A banda principal é aproximadamente 11 nm de diâmetro hidratado, correspondendo ao monômero do anticorpo com uma banda adicional menor em 13 nm cor- respondendo ao dímero do anticorpo. EXEMPLO 2 ESPECIFICIDADE DO ANTICORPO SEQÜESTRANTE

As amostras contendo 50 μΙ de CSF humano ou 10 μΙ de CSF de APpV7i?F foram usadas. APV717F são camundongos transgênicos que repre- sentam um modelo de camundongo de doença de Alzheimer em que o transgene de proteína precursora amilóide humana com uma mutação da doença de Alzheimer é expresso e resulta na produção de peptídeo de Αβ humano no sistema nervoso central.

As amostras foram incubadas com ou sem vários Mabs (1 μΙ) du- rante 1 hora em temperatura ambiente e depois submetidas à eletroforese em uma NDGGE a 4-25 % e marcadas em nitrocelulose com descrito no Exemplo 1. Os anticorpos foram como segue: Mab 266 (liga às posições 13-28);

Mab 4G8 (ligas às posições 17-24); QCBpan (policlonal de coelho para as posições 1-40);

IgG de camundongo (não-específico);

Mab 3D6 (liga às posições 1-5);

Mab 21F12 (liga às posições 33-42);

Mab 6E10 (liga às posições 1-17); e QCB4o,42 (policlonais de coelho para Αβ4ο e Αβ42). A detecção do complexo de anticorpo de peptídeo de Αβ foi des- crita no Exemplo 1 - marcado com biotina 3D6 (para o término N do peptídeo de Αβ) seguido por estreptavidina-HRP e ECL. Detecção similar em CSF humano com Mab 266, em algumas circunstâncias substituiu QCB40,42 que liga ao término carboxila do peptídeo de Αβ, por 3D6.

Os resultados mostraram que os anticorpos testados, apenas Mab 4G8 e Mab 266 permitiram a detecção de peptídeo de Αβ.

Os resultados mostraram que para CSF humano, apenas Mab 266 e Mab 4G8 foram capazes de seqüestrar quantidades detectáveis de um complexo de Αβ do anticorpo (novamente, sem qualquer anticorpo, nenhum Αβ é detectado) Mab 266 foi também capaz de produzir resultados similares àqueles obtidos com CSF humano com CSF de camundongos transgênicos de APPV717F. O peptídeo de Αβ pôde ser seqüestrado em CSF humano usando Mab 266 independente se o anticorpo de 3D6 ou QCB40,42 foi usado para desenvolver o western blot. EXEMPLO 3 DEMONSTRAÇÃO DE COMPLEXO DE PEPTÍDEO DE Αβ-266 POR ELE- TROFORESE BIDIMENSIONAL

Uma amostra contendo 50 ng de peptídeo de Αβ40 foi incubada com 2 μg de Mab 266 a 37° C durante 3 horas. Uma incubação correspon- dente de Mab 266 sozinha foi usadas como um controle.

As amostras foram depois submetidas à eletroforese em gel bi- dimensional.

Na primeira dimensão, as amostras incubadas foram submetida à NDGGE como descrito no Exemplo 1. O gel de poliacrilamida foi depois cortado em trajetórias estreitas perpendiculares à direção do primeiro fluxo dimensional e separação em gel sob condições de desnaturação/redução por SDS-PAGE (gel de uréia de Tricina) foi executada na segunda dimen- são. A presença das bandas foi detectada ou por coloração em Ponceau-S (qualquer proteína) ou por desenvolvimento específico usando Mab 6E10 (Senetek, Inc.) e Αβ de anti-camundongo biotinilado no sistema de detecção com base em HRP. A coloração de Ponceau-S das manchas de nitrocelulose após transferência permitiu visualização das cadeias pesada e leve de Mab 266 sozinho, Foi confirmado que o peptídeo de Αβ estava em um complexo com Mab 266 como uma banda a 4 kD foi observada que alinha com o tamanho do Mab 266 de extensão total visto após a NDGGE de primeira dimensão. EXEMPLO 4 DEMONSTRAÇÃO DE NÃO-EQUIVALÊNCIA DE LIGAÇÃO E SEQÜES- TRAÇÃO O peptídeo de Αβ enquanto circula no pasma e CSF é acredita- do estar contido em um complexo com proteínas, incluindo apolipoproteína E. O presente exemplo demonstra que os anticorpos de apoE, embora ca- pazes de ligar ao complexo, não seqüestram apoE do restante do complexo.

Os complexos de apoE (500 ng) foram incubados com Mab ou anticorpos policlonais a apoE (2 pg) a 37° C durante uma hora. As amostras incubadas foram depois submetidas à NDGGE usando as técnicas descritas no Exemplo 1. Seguindo NDGGE, western blotting foi executada com anti- corpos de anti-apoE de cabra purificados de afinidade com detecção por ECL. Quando nenhum anticorpo estiver presente, apoE pode ser detectado a 8-13 nm consistente com sua presença em partículas de lipoproteína. A presença de anticorpos monoclonal ou policlonal para apoE resulta em uma alteração de população de apoE para uma espécie molecular maior, uma "super alteração". Isto demonstra que os anticorpos para apoE não seqües- tram, isto é, removem apoE de uma partícula de lipoproteína, do que ligar ao apoE nas lipoproteínas criando uma espécie molecular maior. EXEMPLO 5 SEQÜESTRAÇÃO DE Αβ NÃO É PERTURBADA POR ANTICORPOS DE

ANTI-apoE

Uma amostra de 100 μΙ de CSF humano foi incubada ou com Mab 266 sozinho, ou com anti-apoE policlonal, com ou ambos anticorpos durante 60 minutos a 37° C. As amostras foram depois analisadas por NDGGE como descrito no Exemplo 1 e a detecção de bandas executadas como descrito no Exemplo 1.

Os resultados mostram que desde que Mab 266 fosse adiciona- do à amostra, a banda em aproximadamente 11 nm de característica de di- âmetro do complexo de 266-peptídeo de Αβ foi visível. Este é o caso quer ou não anti-apoE esteja presente. Esta banda, demonstrando Αβ seqüestrado, também aparece se 50 ng de peptídeo de Αβ for adicionado à mistura de incubação na presença de Mab 266. Assim, a alteração do peso molecular de apoE pela presença de anticorpo de anti-apoE não interfere com a se- qüestração de peptídeo de Αβ por Mab 266. EXEMPLO 6 SEQÜESTRAÇÃO DE PEPTÍDEO DE Αβ IN VIVO A. Camundongos de APPV717F transgênicos, também denomina- dos camundongos de PDAPP, sobre expressam uma forma mutante de proteína de APPV717F humana. Estes camundongos produzem Αβ humano no SNC e têm níveis elevados de peptídeo de Αβ humano que circulam no CSF e no plasma. Camundongos de oito meses de idade foram injetados intravenosamente com solução salina ou 100 pg de Mab 266. Eles foram sangrados 10 minutos após injeção inicial e novamente em 20 horas após injeção inicial.

As amostras contendo 20 μΙ de plasma de cada animal foram analisadas por NDGGE e western blot com o anticorpo 3D6 como descrito no Exemplo 1. Os animais injetados com solução salina não apresentaram a presença da banda de peptídeo de Αβ seqüestrado com característica de 11 nm mesmo após 10 minutos ou 20 horas. Porém, os dois animais que foram injetados com Mab 266 não apresentaram a aparência desta banda após 20 horas. B. Camundongos de APPV717F de dois meses de idade foram usados neste estudo. No dia zero, os camundongos receberam ou nenhum Mab 266, 1 mg de Mab 266 ou 100 μg deste anticorpo. As amostras foram tiradas dois dias antes da administração dos anticorpos e nos dias 1, 3, 5 e 7. As amostra do plasma foram submetidas à NDGGE seguido por western blotting e detecção com 3D6 como descrito no Exemplo 1. Em todos os pontos de tempo seguindo administração de Mab 266, o complexo de 266/Αβ foi detectado a menos que a amostra de plasma tivesse sido tratada com proteína G, que liga à imunoglobulina, assim eficazmente removendo o Mab 266. Níveis consistentes do complexo durante o período de tempo tes- tado foram encontrados exceto para uma queda suave no dia onze em ani- mais injetados com 100 μg de Mab 266; em geral, os níveis nos animais administrados com 100 pg foram consistentemente menores que aqueles encontrados nos camundongos administrados com 1 mg deste anticorpo. C. Dois camundongos de APPV717F de dois meses de idade fo- ram administrados com 1 mg de Mab 266 intravenosamente e uma amostra de plasma de 25 μΙ foi tirada de cada uma. A amostra de plasma foi subme- tida à NDGGE seguido por western blot como acima descrito exceto que a ligação com 3D6 biotinilado foi seguida pela detecção com estreptavidina125! (Amersham) e pela exposição a uma tela de fosforimageamento. O nível do complexo foi estimado em comparação com uma curva padrão usando quantidades conhecidas de Αβ40 complexado com níveis de saturação de Mab 266 e detectado similarmente. A quantidade de peptídeo de Αβ ligado a Mab 266 foi estimada em aproximadamente 100 ng/ml, representando um aumento de aproximadamente 1.000 vezes sobre peptídeo de Αβ endógeno nestes camundongos que tinha sido determinados ser cerca de 100 pg/ml.

Isto também foi similar para o nível de peptídeo de Αβ em cérebro de AppV7i7F antes çjg deposição de Αβ (50-100 ng/g); APPV717F humano e Αβ humano em camundongos de Tg de APPV717F são produzidos quase unica- mente no cérebro. Assim, parece que a presença de Mab 266 no plasma age como um tanque de peptídeo de Αβ que facilita o efluxo na rede de peptídeo de Αβ do SNC no plasma. Este efluxo na rede elevado provavel- mente resulta de tanto aumentar o efluxo de Αβ do SNC para o plasma e também de evitar Αβ no plasma de reentrar no cérebro. O tamanho correto para o peptídeo de Αβ seqüestrado foi con- firmado trabalhando com 20 μΙ_ de amostras de plasma obtidas de camun- dongos de APPV717F 24 horas após ser injetado com 1 mg de Mab 266 em géis de SDS-PAGE de TRIS-tricina seguido por western blotting usando o anticorpo de anti-Αβ 6E10 antes, ou após, a exposição de proteína G usando contas ligadas à proteína G. Uma banda que foi submetida à depleção por proteína G foi detectada a 4-8 kD, consistente com a presença de monôme- ros e possivelmente dímeros de peptídeo de Αβ. D. Camundongos de APPV717F de dois meses de idade foram tratados ou com PBS (n=7) ou 500 pg de Mab 266 biotinilado - isto é, m266B (n=9) intraperitonealmente. Tanto antes quanto 24 horas após a injeção, os plasma foi analisado por peptídeo de Αβ total usando uma modificação do método de ELISA de Johnson-Wood, K. Et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 94:1550-1555; e Bales, K. R, et al., Nature Genet (1997) 17:263-264. Ο Αβ total ligado ao m266 B foi medido usando Optiplates (Packard, Inc.) de 96 cavidades revestidas com m3D6. As amostras de plasma diluído e os padrão (concentrações variadas de Αβ40 e m266B) foram incubados durante à noite nas placas revestida e a quantidade de complexo de Αβ/ιτι266Β total foi determinada com o uso de 125l-Estreptavidina. Além disso, no ponto de tempo de 24 horas, as amostras de plasma foram primeiro revestidas com proteína G para quantificar peptídeo de Αβ não ligado ao Mab 266, e Αβ-rotai e Αβ42 foram determinado por ELISA no CSF. Em animais injetados com PBS, os níveis de peptídeo de Αβ no plasma foram 140 pg/ml tanto antes quanto após a injeção. Os níveis de plasma foram similares nos camundon- gos injetados com Mab 266 antes da injeção, mas os níveis de peptídeo de Αβ não ligados ao Mab 266 foram indetectavéis em 24 horas pós injeção.

Os níveis no CSF foram também medidos, CSF representa um compartimento extracelular dentro do SNC e a concentração de moléculas no CSF reflete em grande parte a concentração de substâncias no espaço extracelular do cérebro. CSF foi isolado do compartimento da cisterna mag- na. Os camundongos foram anestesiados com pentobarbital e a musculatura da base do crânio para a primeira vértebra foi removida. CSF foi colhido cui- dadosamente puncionando a membrana aracnóide que cobre a cisterna com uma micro agulha sob um microscópio de dissecação e extraindo o CSF em uma micropipeta de polipropileno. Em 24 horas pós-injeção, um aumento no peptídeo de Αβ total no CSF dos camundongos injetados com Mab 266 foi observado, e um aumento aproximadamente de duas vezes no Αβ42 quando comparados com os camundongos injetados com PBS foi obtido no CSF.

Isto foi confirmado usando eletroforese em gel de desnaturação seguido por western blotting com anticorpo específico de Αβ42 21F12.

Em um experimento adicional, camundongos de Tg de APPV717F de três meses de idade foram injetados ou com PBS ou Mab 266 intraveno- samente e tanto os níveis de Αβ40 e Αβ42 foram medidos no CSF como se- gue: Para a medição de Αβ40, o anticorpo monoclonal m2G3, especí- fico para Αβ40 foi utilizado. A ELISA descrita (Johnson-Wood, K., et al., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA (1997) 94:1550-1555) foi modificado em um RIA subs- tituindo a Estreptavidina-reagente de HRP por 125l-Estreptavidina. Para as amostras de plasma e CSF, o procedimento foi executado sob condições de não-desnaturação que necessitaram de guanidina nos tampões. Para medi- ção de carbonato solúvel e Αβ insolúvel no homogenato de cérebro, amostra foi homogeneizada com carbonato a 100 nM, NaCI a 40 mM, pH 11,5 (4o C), girada a 10.000 x g durante 15 min e Αβ foi avaliado no sobrenadante (solú- vel) e as frações do pélete (insolúvel) como descrito (Johnson-Wood, K., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1997) 94:1550-1555) e listado acima. A me- dição do complexo de Αβ/Mab 266 no plasma foi executada por um RIA mo- dificado. Os camundongos foram injetados com Mab 266 biotinilados (Mab 266B) e o plasma foi isolado em múltiplos pontos de tempo. Ο Αβ total ligado ao Mab 266 foi medido usando Optiplate de 96 poços (Packard, Inc.) reves- tidas com m3D6. As amostras do plasma diluídas e os padrão (concentra- ções variadas de Αβ40 e Mab 266B) foram incubados durante a noite nas placas revestidas e a quantidade do complexo de Αβ total/Mab 266B foi de- terminada com o uso de 125l-Estreptavidina.

Três horas seguindo a injeção intravenosa de Mab 266, houve um aumento de duas vezes nos níveis de Αβ40 de CSF e um aumento não- significativo no Αβ42. Porém, em tanto 24 quanto 72 horas houve um au- mento de duas a três vezes em Αβ40 e Αβ42 no CSF. Resultados similares foram obtidos usando análise em gel desnaturante seguido por western blo- tting de Αβ de CSF de banco. O efluxo de Αβ no fluido intersticial do cérebro, que é refletido a certo grau pelos níveis de CSF, provavelmente seja respon- sável pelo aumento observado no Αβ do CSF. É significativo que a alteração nos níveis de peptídeo de Αβ do CSF não pode ser devido à entrada de Mab 266 no CSF uma vez que os níveis medidos 24 horas após injeção, que são menos que 0,1 % dos níveis do plasma de Mab 266, são insuficientes para responder pelas alterações.

Estes resultados sugerem que o peptídeo de Αβ seja extraído da parênqui- ma do cérebro no CSF pela presença do anticorpo no fluxo sanguíneo.

As formas de peptídeo de Αβ que são solúveis em PBS ou tam- pão de carbonato foram medidas nos homogenatos corticais cerebrais nos mesmos camundongos que tinham sido injetados com Mab 266 e em que o CSF foi analisado como acima descrito. Aumentos similares nestas formas solúveis nos homogenatos corticais foram observados. EXEMPLO 7 Mab 266 AGE COMO UM ALÇAPÃO DE PEPTÍDEO DE Αβ IN VITRO

Uma câmara de diálise foi construída como um sistema in vitro para testar a capacidade de Mab 266 agir como um alçapão para o peptídeo de Αβ. Um mL de CSF humano foi colocado na câmara superior de um tubo de polipropileno separado por uma membrana de diálise com um corte es- pecificado na faixa de 10-100 kD de uma câmara inferior contendo 75 μί de PBS com ou sem 1 pg de Mab 266.

Pareceu que o equilíbrio foi alcançado após 3 horas, como de- terminado mediante a submissão do material na câmara inferior aos géis de uréia ácida seguido por western blotting para peptídeo de Αβ com 6E10 em vários pontos de tempo. As amostras foram desnaturadas em ácido fórmico para uma concentração final de 80 % (vol/vol) e reduzidas com β- mercaptoetanol (1 %). As amostras foram submetidas à eletroforese (anodo para catodo) em um tampão trabalhando com ácido acético a 0,9 M em um gel de gradiente de poliacrilamida de 4 % a 35 % contendo uréia a 6 M, 5 % (vol/vol) de ácido acético glacial e 2,5 % de TEMED. O pH acídico do gel foi neutralizado antes da transferência para nitrocelulose. Subseqüentemente, as técnicas de western blotting foram usadas para identificar Αβ. As bandas detectadas correspondem a 4 kD. A quantidade de Αβ removido da câmara superior foi assim de- terminada por análise de ELISA de ambas câmaras superior e inferior (n=4) após 3 horas. Os resultados para os vários cortes de peso molecular na pre- sença e ausência de Mab 266 estão mostrados na Figura 1. Como mostra- do, embora apenas quantidades mínimas de peptídeo de Αβ cruzaram a membrana quando PBS foi colocado na câmara inferior, 50 % do peptídeo de Αβ foram seqüestrados na câmara inferior quando o Mab 266 estava presente e o corte de peso molecular foi 25 kD; quantidades crescentes cruzaram a etapa que o corte de peso molecular aumentava para 100 kD, quando quase 100 % do peptídeo de Αβ foi extraído ao longo da mem- brana.

Foi também observado que os anticorpos de Αβ anti-N-terminal 3D6 3 10D5 foram capazes de extrair o peptídeo de Αβ alo longo da mem- brana neste sistema, apesar de não-capaz de seqüestrar o peptídeo de Αβ nos ensaio descritos no Exemplo 1. Estes resultados mostram que os anti- corpos ao peptídeo de Αβ têm suficiente afinidade sob estas condições para seqüestrar o peptídeo nas soluções fisiológicas distantes de outras proteínas de ligação, mas que os Mabs tais como 266 que são imunorreativos com um epitopo nas posições 13-28 são substancialmente mais eficazes e ligam com maior afinidade.

Em ensaios similares, apoE4 secretado por astrócito que foi pu- rificado como descrito por DeMattos, R. B., et al., J. Biol. Chem. (1998) 273:4206-4212; Sun, Y„ et al., J. Neurosci. (1998) 18:3261-3272, teve um efeito pequeno mas estatisticamente significativo em diminuir a massa de peptídeo de Αβ na câmara inferior. Nenhum efeito aparente foi observado quando o IgG policlonal ou BSA foi substituído por Mab 266. EXEMPLO 8 FLUXO DE PEPTÍDEO Αβ NO PLASMA DO SNC A. Um μg de Αβ4ο foi dissolvido em 5 μί de CSF de rato para mantê-lo solúvel e foi depois injetados no espaço subaracnóideo da cisterna magna de camundongos do tipo selvagem de Swiss-Webster que tinham sido previamente recebidos injeções IV ou de PBS (n=3) ou 200 μg de Mab 266 biotinilado (n=3). Em diferentes pontos de tempo seguindo o tratamento, Αβ-rotai no plasma dos camundongos foi determinado por ELISA de Αβ, usan- do 3D6 como o anticorpo de revestimento e padrão de Αβ misturado com um excesso de 266 biotinilado. Cada amostra de plasma foi aguçada com um excesso de 266 biotinilado após a remoção de cada animal para a detecção de Αβ na ELISA. Nos camundongos injetados com PBS, quantidades mini- mamente detectáveis do peptídeo em níveis de 0,15 ng/ml foram detectadas como valores de pico após 30-60 minutos, após os quais os níveis foram essencialmente zero. Entretanto, no camundongo submetido à administra- ção de Mab 266, o peptídio de Αβ de plasma alcançou níveis de 330-dobras maiores que aqueles detectados em camundongos infectados com PBS após 60 minutos, (aproximadamente 50 ng/ml) e alcançou valores de apro- ximadamente 90 ng/ml após 180 minutos. B. Este procedimento foi repetido usando ou 200 μg (n=3) ou 600 μg (n=3) injetado IV nos camundongos de APPV717F de dois meses de idade. O Mab 266 foi injetado i.v. em camundongos APPV717F +/+ de 3 me- ses de idade com as doses acima. Ante e em diferentes pontos de tempo seguindo injeção i.v., a concentração do plasma de Αβ ligado ao Mab 266 foi determinado por RIA. Os resultados detalhados de um camundongo ilustrati- vo estão mostrados na Figura 2.

Foi observado que a concentração de Αβ ligado ao Mab 266 do anticorpo monoclonal aumentou de níveis básicos de 150 pg/ml para níveis de acima de 100 ng/ml em quatro horas. Analisando os pontos de tempo mais iniciais na curva, foi determinado que a taxa de rede de entrada do Αβ-rotai no plasma do camundongo de Tg de APPV717F foi 42 pg/ml/minuto na presença de níveis de saturação do anticorpo.

Os efeitos de Mab 266 nos níveis de Αβ do plasma em tanto camundongos do tipo selvagem quanto de Tg de APPV717F bem como os efeitos do anticorpo na concentração de Αβ em CSF mostram que a presen- ça de Mab 266 circulante resulta em uma alteração no equilíbrio do fluxo de Αβ ou transporte entre o SNC e o plasma. EXEMPLO 9 EFEITO DE Mab 266 EM Αβ NO CÉREBRO

Camundongos de APPV717F +/+ de quatro meses de idade foram tratados a cada 2 semanas durante 5 meses com injeções IP de solução salina, Mab 266 (500 μ9) ou IgG de camundongo de controle (100 pg, Phar- migen). Os camundongos foram sacrificados em nove meses de idade, e a deposição de Αβ no córtex foi determinada. A % da área coberta por imunor- reatividade de Αβ, como identificado com um anticorpo de pan-Αβ de coelho (QCB, Inc.), foi quantificado no córtex imediatamente sobrepondo o hipo- campo dorsal como descrito por Holtzman, D. M., et al., Ann. Neurol. (2000) 97:2892-2897. Os resultados estão mostrados na Figura 3A. Nesta idade, cerca da metade de cada grupo ainda não iniciou a desenvolver a deposição de Αβ. No entanto, a % de camundongos com > 50% de carga de Αβ no córtex foi significativamente menos (P=0,02, teste de Chi-quadrado) no gru- po tratado com 266. Embora os camundongos de APPV717F possam desen- volver grandes quantidades de depósitos de Αβ por nove meses, há uma grande variabilidade com cerca de 50 % apresentando nenhum deposito e cerca de 50 % apresentando depósitos substanciais. Nos animais tratados com PBS e IgG, 6/14 e 5/13 camundongos tinha mais que 50 % do córtex coberto por manchação de Αβ, enquanto apenas 14 camundongos tratados com Mab 266 tinham este nível de manchação. Quase 50 % dos animais em todos os grupos ainda não tinham desenvolvido deposição de Αβ em 9 me- ses de idade. O último parece ser devido à origem parental de camundongos individuais em nossa coorte uma vez que embora todos camundongos estu- dados foram confirmados ser APPV717F+/+, níveis altos de deposição de Αβ foram observados apenas em camundongos derivados de pares de linha- gem 4/8 (ninhadas de alta patologia). Camundongos derivados dos outros 4 pares de raças foram virtualmente livres de depósitos de Αβ (detritos de bai- xa patologia). Usando origem parental como um co-variado, houve um efeito forte, significativo de m266 na redução de deposição de Αβ (p=0,0082, Fig. 3B). EXEMPLO 10 Mab 266 PERIFERICAMENTE INJETADO NÃO LIGA ÀS PLACAS EM CA- MUNDONGOS DE Tg DE APPV717F

Para determinar se o Mab 266 injetado i.p. durante 5 meses foi ligado ao Αβ no cérebro, seções do cérebro de camundongos de Tg de APPV717F de g meses de idade que continham depósitos de Αβ e tinha sido tratado ou com Mab 266 ou solução salina ou IgG de controle foram utilizados. O processamento do tecido e imunomanchação foram execu- tados como descrito (Bales, K. R., et al., Nature Genet. (1997) 17:263- 264). O Tecido de todos os grupos de animais foi incubado com IgG de anti-camundongo marcado com fluoresceína (Vetor, Inc.) e depois exami- nados sob um microscópio fluorescente. Nenhuma manchação específica de depósitos de Αβ foi vista em qualquer um dos grupos. Em contraste, quando aplicar Mab 266 nas seções antes da incubação das seções com IgG de anti-camundongo, os depósitos de Αβ foram claramente detecta- dos. EXEMPLO 11 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE ANTICORPO 266 NA COGNIÇÃO EM CAMUNDONGOS DE PDAPP HEMIZIGOTOS TRANSGÊNICOS DE 24 MESES DE IDADE

Sessenta camundongos transgênicos hemizigotos (APPW17F) fo- ram usados. Os camundongos estavam aproximadamente 24 meses de ida- de do início do estudo. Todas as injeções foram intraperitoneal (i.p.) Metade dos camundongos receberam semanalmente injeções de solução tampona- da de fosfato (PBS, "Controle") e a outra metade recebeu 500 microgramas de anticorpo 266 de camundongo dissolvido em PBS. As injeções foram fei- tas durante um período de sete semanas (42 dias) para um total de seis in- jeções. Três dias seguindo a última injeção, o comportamento dos animais foi avaliado usando uma tarefa de reconhecimento de objetos, essencial- mente descrito em J. C. Dodart, et al., BehavioralNeuroscience, 113 (5) 982- 990 (1999). Um índice de reconhecimento (Tb x 100)/(Tb-Ta) foi calculado.

Os resultados estão mostrados abaixo na Tabela 1.

Tabela 1. estatísticas descritivas para o índice de reconhecimento A administração de 500 microgramas de anticorpo 266 sema- nalmente a camundongos transgênicos hemizigotos de 24 meses de idade foi associado com uma alteração significativa no comportamento. Os ca- mundongos transgênicos tratados com anticorpo tinham índices de reconhe- cimento que foram similares aos animais de controle do tipo selvagem [J. C.

Dodart, et al.]. A diferença no índice de reconhecimento foi estatisticamente significativa no nível de probabilidade de 0,001. o índice de reconhecimento aumentado é uma indicação que o tratamento com um anticorpo que liga ao peptídeo de amilóide beta na região de aminoácidos 13-28 reverterá a dete- rioração comportamental que tinha sido documentada neste modelo de ca- mundongo da Doença de Alzheimer. Portanto, a administração dos anticor- pos que ligam peptídeo de amilóide beta na região dos aminoácidos 13-28 tratará doenças tais como doença de Alzheimer e síndrome de Down e deterá o declínio cognitivo tipicamente associado com a progressão da doença. A carga de amilóide (% da área coberta por material imunorrea- tivo após manchação com anticorpos de anti-Αβ 3D6 ou 21F12) foi quantifi- cado no córtex imediatamente sobrepondo o hipocampo incluindo as áreas do córtex cingulado e parietal dos cérebros dos animais de 24 meses de idade tratados com 266 de anticorpo de camundongo durante sete semanas, como acima descrito. Os resultados são apresentados na tabela abaixo. As diferenças entre os grupos de tratamento não são estatisticamente significa- tivas.

Tabela 2. Carga de placa de amilóide em camundongos de appv717<+/~ se- guindo o tratamento com anticorpo de anti-aft de 266 de camundongo Para estes animais muito envelhecidos, o tratamento com anti- corpo 266 de camundongo não resultou em uma carga de amilóide significa- tivamente diferente comparada com o grupo tratado com PBS, medido usando ou 3D6 ou usando 21F12. Além disso, a carga de Αβ foi substanci- almente maior e significativamente aumentada comparada com a carga de amilóide em animais mais jovens (ver abaixo) que não foram capazes de discriminar um novo objeto de um familiar na tarefa de reconhecimento de objetos. Mais surpreendente, estes resultados demonstram que os anticor- pos de anti-Αβ podem reverter déficits cognitivos sem a necessidade de re- duzir a carga de amilóide per se.

Após 7 semanas de tratamento, o índice de reconhecimento do grupo tratado com m266 não foi significativamente diferente do que podería ser esperado para uma coorte do tipo selvagem de camundongos de 24 me- ses de idade! Isto indica uma reversão completa do declínio cognitivo nestes animais transgênicos. EXEMPLO 12 EFEITO DA ADMINISTRAÇÃO DE ANTICORPO 266 NA COGNIÇÃO EM

CAMUNDONGOS DE PDAPP HEMIZIGOTOS TRANSGÊNICOS JOVENS

Cinqüenta e quatro (54) camundongos transgênicos homozigo- tos (APPV717F) foram usados. Vinte e três (23) eram aproximadamente dois meses mais velhos no início do estudo. A duração do tratamento foi de cinco meses. Assim, no término do estudo, os camundongos ou foram aproxima- damente sete (7) meses envelhecidos ou aproximadamente nove (9) meses envelhecidos.

Todas as injeções foram intraperitoneais (i.p.). Cada camundon- go nos grupos de controle de "PBS" recebeu semanalmente uma injeção de solução salina tamponada de fosfato (PBS; 200 μΙ_). Cada camundongo nos grupos de controle de "IgG" recebeu semanalmente injeções de controle de isótipo de IgGlKl (100 μg/camundongo/semana). Cada camundongo nos grupos de "Alta Dose" recebeu semanalmente uma injeção de 500 micro- gramas de anticorpo 266 dissolvidos em PBS ("HD"). Cada camundongo no grupo de "Baixa Dose" recebeu semanalmente uma injeção de 100 micro- gramas de anticorpo 266 dissolvidos em PBS ("LD"). Três dias seguindo a última injeção, o comportamento dos animais foi avaliado usando uma tarefa de reconhecimento de objetos, como descrito no Exemplo 10 acima, e um índice de descriminação foi calculado como a diferença entre o tempo gasto em um novo objeto e o tempo gasto em um objeto familiar. Os resultados estão mostrados abaixo na Tabela 3. Os dados são agrupados pela idade dos camundongos no final do estudo.

Tabela 3. Estatísticas descritivas para o índice de descriminação *p<0,05 ***p<0,0001 Considerados juntos estes dados suportam a conclusão que a administração do anticorpo 266, um anti-direcionado contra o domínio cen- tral de Αβ, atenua a deposição de placas em camundongos transgênicos de APpV7i?F d© 7.9 meses de idade, bem como reverte as deteriorações com- portamentais anteriormente caracterizadas. O tratamento dos pacientes com um anticorpo direcionado contra o domínio central do peptídeo de Αβ inibirá ou prevenirá declínio cognitivo tipicamente associado com a progressão da doença, e irá revertê-lo. O índice de discriminação para os animais tratados não foi signi- ficativamente diferente do que poderia ser esperado para os camundongos do tipo selvagem da mesma idade. Assim, apenas em animais mais velhos (Exemplo 11), o tratamento com m266 completamente reverteu o declínio cognitivo nestes animais transgênicos mais jovens. EXEMPLO 13 SÍNTESE DE ANTICORPO 266 HUMANIZADO CÉLULAS E ANTICORPOS. A linhagem celular de mieloma de camundongo Sp2/0 foi obtida de ATCC (Manassas, VA) e mantida em meio de DMF contendo 10 % de FBS (Cat # SH32661.03, HyClone, Logan, UT) em uma incubadora de CO2 a 37° C. As células do hibridoma de 266 de ca- mundongo foram primeiro desenvolvidas em meio de RPMI-1640 contendo 10 % de FBS (HyClone), HEPES a 10 mM, glutamina a 2 mM, aminoácidos não essenciais a 0,1 mM, piruvato de sódio a 1 mM, gentamicina a 25 pg/ml e depois expandidos em meio livre de soro (Hybridoma SFM, Cat # 12045- 076, Life Technologies, Rockville, MD) contendo 2 % de FBS de Ig baixo (Cat # 30151.03, HyClone) a um volume de 2,5 litros em frascos roliços. O anticorpo 266 monoclonal de camundongo (Mu266) foi purificado do sobre- nadante da cultura por cromatografia de afinidade usando uma coluna de Sefarose de Proteína G, Mu266 Biotinilado foi preparado usando EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Cat # 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL). CLONAGEM DOS cDNAs DA REGIÃO VARIÁVEL. O RNA total foi extraído de aproximadamente 107 células do hibridoma usando reagente de TRIzol (Life Technologies) e poli(A)+ RNA foi isolado com o Sistema de Isolamento de mRNA de PoluATract (Promega, Madison, Wl) de acordo com os protocolos do fornecedor. O cDNA filamentado duplo foi sintetizado usan- do 0 kit de Amplificação de cDNA SMART®RACE (Clontech, Paio Alto, CA) seguindo 0 protocolo do fornecedor. Os cDNAs da região variável para as cadeias leve e pesada foram amplificados por reação de cadeia de polime- rase (PCR) usando iniciador 3' que se associaram respectivamente às regi- ões constantes de cadeia capa e gama de camundongo e um iniciador uni- versal 5' fornecido no kit de Amplificação de cDNA de SMART™RACE. Para VLPCR, o iniciador 3' tem a seqüência: 5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC- 3' [SEQ ID NO: 13] com resíduos 17-46 que hibridizam com a região de Ck de camundongo.

Para PCR de VH, os iniciadores 3' têm as seqüências degeneradas: A G T S^TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-S’ T [SEQ ID NO: 14] com resíduos 17-50 que hibridizam com a cadeia gama de camundongo CH1. Os cDNAs de VL e VH foram subclonados para o vetor pCR4Blunt- TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) para a determinação da seqüência. A se- qüenciação do DNA foi realizada por reações de seqüenciação de ciclo de PCR com os terminadores de cadeia de dideóxi fluorescente (Applied Bi- osystems, Foster City, CA) de acordo com a instrução do fabricante. As rea- ções de seqüenciação foram analisadas em um Seqüenciador de DNA Mo- delo 377 (Applied Biosystems). CONSTRUÇÃO DE REGIÕES VARIÁVEIS DE 266 HUMANI- ZADO (Hu266). A humanização das regiões V de anticorpo de camundongo foi realizada por Queen et al. [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029-10033 (1988)]. A estrutura da região V humana usada como um aceptor para CDRs de Mu266 foi selecionada com base na homologia da seqüência. Os pro- gramas de computador ABMOD e ENCAD [Levitt, M., J. Mol. Biol. 168:595- 620 (1983)] foram usados para construir um modelo molecular das regiões variáveis. Os aminoácidos nas regiões V humanizadas que foram prognosti- cados ter contato com as CDRs foram substituídos pelos resíduos corres- pondentes de Mu266. Isto foi feito em resíduos 46, 47, 49 e 98 na cadeia pesada e no resíduo 51 na cadeia leve. Os aminoácidos na região V huma- nizada que foram ligados para ser raros no mesmo subgrupo da região V foram alterados para os aminoácidos consensuais para eliminar a imunoge- nicidade potencial. Isto foi feito nos resíduos 42 e 44 na cadeia leve.

Os genes da região variável de cadeias leve e pesada foram construídos e amplificados usando oito oligonucleotídeos sintéticos de so- breposição variando na extensão de aproximadamente 65 a 80 bases [He, X. Y., et al., J. Immunol. 160:0291035 (1998)]. Os oligonucleotídeos foram tratados a calor em pares e extendidos com o fragmento de Klenow de DNA polimerase I, rendendo quatro fragmentos filamentado duplo. Os fragmentos resultantes foram desnaturados, tratados a calor em pares, e entendidos com Klenow, rendendo dois fragmentos. Estes fragmentos foram desnatura- dos, tratados a calor em pares e estendidos mais uma vez, rendendo um gene de extensão completa. O produto resultante foi amplificado por PCR usando o Sistema de PCR de Alta Fidelidade Expandido (Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN). Os fragmentos amplificados por PCR foram purificados em gel e clonados no vetor de pCR4Blunt-TOPO. Após a confir- mação da seqüência, os genes VL e VH foram digeridos com MUil e Xbal, purificados em gel e subclonados respectivamente nos vetores para expres- são de cadeias leve e pesada para produzir pVK-Hu266 e pVg1-Hu266 (ver Figuras 6 e 7, respectivamente, aqui) [Co, M. S., et al., J. Immunol. 148:1149-1154 (1992)]. O anticorpo 266 humanizado maduro expresso destes plasmídios tem a cadeia leve da SEQ ID NO: 11 e a cadeia pesada da SEQ ID NO: 12. TRANSFECÇÃO ESTÁVEL. A transfecção estável na linhagem de células de mieloma de camundongo Sp2/0 foi acompanhada por eletropo- ração usando um aparelho Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) em 360 V e 25 pF como descrito (Co et al., 1992). Antes da transfecção, os DNAs dos plasmídios pVk-Hu266 e pVg1-Hu266 foram linearizados usando Fspl. Apro- ximadamente 107 células de Sp2/0 foram transferidas com 20 pg de pVk- Hu266 e 40 pg de pVg1-Hu266. As células transfectadas foram suspensas em meio de DME contendo 10 % de FBS e colocadas em várias placas de 96 cavidades. Após 48 h, o meio de seleção (meio de DME contendo 10 % de FBS, suplemento de meios de HT, 0,3 mg/ml de xantina e 1 pg/ml de áci- do micofenólico) foi fornecido. Aproximadamente 10 dias após a incubação da seleção, os sobrenadantes da cultura foram testados para a produção de anticorpo por ELISA como mostrado abaixo. Clones de alto rendimento fo- ram expandidos em meios de DME contendo 10 % de FBS e também anali- sados por expressão de anticorpo. Os clones selecionados foram depois adaptados ao desenvolvimento em SFM de Hibridoma. MEDIÇÃO DE EXPRESSÃO DE ANTICORPO POR ELISA. Ca- vidades de uma placa de ELISA de 96 cavidades (placa de Nunc-lmmuno, Cat # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) foram revestidas com 100 μΙ de 1 μg/ml de anticorpos policlonais de IgG anti-humano de cabra, específicos para fragmento de Fcy(Cat # 109-005-098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) em tampão de carbonato-bicarbonato de sódio a 0,2 M (pH 9,4) durante a noite 4o C. Após lavagem com Tampão de Lavagem (PBS conten- do 0,1 % de Tween 20), as cavidades foram bloqueadas com 400 μΙ de Tampão de Bloqueio de Superblock (Cat # 37535, Pierce) durante 30 min e depois lavados com Tampão de Lavagem. As amostras contendo Hu266 foram apropriadamente diluídas em Tampão de ELISA (PBS contendo 1 % de BSA e 0,1 % de Tween 20) e aplicados às placas de ELISA (100 μΙ por cavidade). Como um padrão, o anticorpo monoclonal de IgG 1 de anti-CD33 humanizado HuM195 (Co, et al., 1992, acima) foi usado. A placa de ELISA foi incubada durante 2 h em temperatura ambiente e as cavidades foram lavadas com Tampão de Lavagem. Depois, 100 μΙ de anticorpos policlonais de capa anti-humanos de cabra conjugados com HRP 1/1.000 diluídos (Cat # 1050-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) em Tampão de ELISA foram aplicados a cada cavidade. Após incubar durante 1 h em temperatura ambiente e lavar com Tampão de Lavagem, 100 μΙ de substrato de ABTS (Cat #s 507602 e 506502, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) foram adicionados a cada cavidade. O desenvolvimento de cor foi inter- rompido adicionando 100 μΙ de ácido oxálico a 2 % em cavidade. A absor- bância foi lida a 415 nm usando uma leitora de microplaca OPTImax (Mole- cular Devices, Menlo Park, CA). PURIFICAÇÃO DE Hu266. Um dos transferidos estáveis de Sp2/0 de alta expressão de Hu266 (clone 1D9) foi adaptada ao desenvolvi- mento em SFM de Hibridoma e expandido para 2 litros em frascos roliços.

Sobrenadante da cultura gasto foi colhido quando a viabilidade celular al- cançou 10 % ou menos e carregado em coluna de Sefarose de proteína A. A coluna foi lavada com PBS antes do anticorpo ser eluído com glicina-HCI a 0,1 M (pH 2,5), NaCI a 0,1 Μ. A proteína eluída foi submetida à diálise junto com 3 alterações de PBS de 2 litros e filtrada através de um filtro de 0,2 pm antes da armazenagem a 4o C. A concentração do anticorpo foi determinada medindo a absorbância a 280 nm (1 mg/ml = 1.4 A280). SDS-PAGE em tam- pão de Tris-glicina foi executado de acordo com os procedimentos padrão em um gel de gradiente de 4-20 % (Cat # EC6025, Novex, San Diego, CA). O anticorpo 266 humanizado purificado é reduzido e trabalhado em um gel de SDS-PAGE. O anticorpo total mostra duas bandas de pesos moleculares aproximados de 25 kDa e 50 kDa. Estes resultados são consistentes com os pesos moleculares do fragmento de cadeia leve e de cadeia pesada ou de cadeia leve calculado de suas composições de aminoácidos. EXEMPLO 14 PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO IN VITRO ANTICORPO 266 HUMANIZADO A eficácia da ligação do anticorpo 266 humanizado, sintetizado e purificado como acima descrito, foi comparada com o anticorpo 266 de ca- mundongo usando anticorpo 266 de camundongo biotinilado em uma ELISA comparativa. As cavidades de uma placa de ELISA de 96 cavidades (placa Nunc-lmmuno, Cat # 439454, NalgeNunc) foram revestidas com 100 μΙ de peptídeo de β-amilóide (1-42) conjugado com BSA em tampão de carbonato- bicarbonato de sódio a 0,2 M (pH 9,4) (10 pg/mL) durante a noite a 4o C. O conjugado de Αβ1.42-Β8Α foi preparado dissolvendo 7,5 mg de Αβι-^-Cys^ (Αβι.42 de cisteína C-terminal, AnaSpec) em 500 μΙ de dimetilsulfóxido, e de- pois imediatamente adicionar 1.500 pL de água destilada. Dois (2) miligra- mas de albumina de soro bovino ativado por maleimida (Pierce) foram dis- solvidos em 200 pL de água destilada. As duas soluções foram combinadas, misturadas por completo e deixadas repousar em temperatura ambiente du- rante duas (2) horas. Uma coluna de cromatografia em gel foi usada para separar o peptídeo não reagido do conjugado de ΑβΊ-42-Cys-BSA.

Após lavar as cavidades com solução tamponada de fosfato (PBS) contendo 0,1 % de Tween 20 (Tampão de Lavagem) usando uma la- vadora de placa de ELISA, as cavidades foram bloqueados adicionando 300 pL de reagente de SuperBIock (Pierce) por cavidade. Após 30 minutos de bloqueio, as cavidades foram lavadas com Tampão de Lavagem e o líquido em excesso foi removido.

Uma mistura de Mu266 biotinilado (0,3 pg/ml de concentração fi- nal) e anticorpo competidor (Mu266 ou Hu266; partindo da concentração a 750 pg/ml e diluições seriais de 3 vezes) em Tampão de ELISA foram adici- onados em triplicata em um volume final de 100 μΙ por cavidade. Como um controle não-competidor, 100 μΙ de 0,3 μg/ml de Mu266 biotinilado foram adicionados. Como um controle de base, 100 μΙ de Tampão de ELISA foram adicionados. A placa de ELISA foi incubada em temperatura ambiente du- rante 90 minutos. Após lavar as cavidades com Tampão de Lavagem, 100 μΙ de estreptavidina conjugada com HRP de 1 μg/ml (Cat # 21124, Pierce) fo- ram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada em temperatura am- biente durante 30 min e lavada com Tampão de Lavagem. Para o desenvol- vimento de cor, 100 μΙ/ cavidade de Substrato de ABTS Peroxidase (Kirke- gaard & Perry Laboratories) foram adicionados. O desenvolvimento da cor foi interrompido adicionando 100 μΙ/ cavidade de 2 % de ácido oxálico. A ab- sorbância foi lida a 415 nm. As absorbâncias foram representadas em gráfi- co contra o log da concentração do competidor, curvas foram ajustadas aos pontos dos dados (usando Prism) e o IC50 foi determinado para cada anti- corpo usando os métodos bem-conhecidos na técnica. O IC50 médio para o camundongo 266 foi 4,7 μg/mL (três expe- rimentos separados, desvio padrão = 1,3 pg/mL) e para 266 humanizado foi 7,5 μg/mL (três experimentos separados, desvio padrão = 1,1 pg/mL). Um segundo ajuste dos três experimentos foi realizado para ser 3,87 pg/mL (SD

= 0,12 pg/mL) e para 266 humano, o IC50 foi determinado ser 4,0 pg/mL (SD = 0,5 pg/mL). Na base destes resultados, foi concluído que o 266 humaniza- do tem propriedades de ligação que são muito similares àquelas do anticor- po 266 de camundongo. Portanto, nós esperamos que o 266 humanizado tenha atividades muito similares in vitro e in vivo comparadas com o 266 de camundongo e apresentará em seres humanos os mesmos efeitos demons- trados com o 266 de camundongo em camundongos. EXEMPLO 15 PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO IN VITRO DE ANTICORPOS 266 E 4G8 DE

CAMUNDONGO A afinidade do anticorpo (KD - Kd / Ka) foi determinada usando um biossensor BIAcore 2000 e os dados analisados com BIAevaluation (v 3.1). Um anticorpo de captura (anti-camundongo de coelho) foi acoplado através dos grupos amino livres aos grupos carboxila na célula de fluxo 2 de um chip do biossensor (CM5) usando carbodiimida de N-etil-N-dimetilami- nopropila.e N-hidroxissucinimida (EDC/NHS). Um IgG de coelho não- específico foi acoplado à célula de fluxo 1 como um controle de base. Os anticorpos monoclonais foram capturados para render 300 unidades de res- sonância (RU). Amilóide beta 1-40 ou 1-42 (Biosource International, Inc.) foi depois fluído no chip em concentrações decrescentes (1000 a 0,1 vezes KD). Para regenerar o chip, o anticorpo de anti-Αβ ligado foi eluído do chip usando uma lavagem com glicina-HCI (pH 2). Uma injeção de controle não contendo nenhum amilóide beta serviu como um controle para subtração de base. Os sensorgramas demonstrando fases de associação e dissociação foram analisados para determinar Kd e Ka. Usando este método, a afinidade do anticorpo 266 de camundongo para tanto Αβι-40 e para Αβι_42 foi observa- do ser 4 pM. A afinidade de 4G8 para Αβι.40 foi 23 nM e para Αβι-42 foi 24 nM. Apesar de uma diferença de 6000 vezes em afinidades para Αβ, tanto 266 quanto 4G8, que ligam aos epitopos entre os aminoácidos 13 e 28 de Αβ, eficazmente seqüestram Αβ de CSF humano. Portanto, a localização do epitopo é suprema, do que afinidade de ligação, na determinação da capaci- dade de um anticorpo seqüestrar Αβ e fornecer as vantagens benéficas e surpreendentes da presente invenção. EXEMPLO 16 MAPEAMENTO DO EPITOPO DE ANTICORPO 266 DE CAMUNDONGO

USANDO METODOLOGIA DE BIACORE E PEPTÍDEOS SOLÚVEIS O BIAcore é um sistema de biossensor automatizado para me- dir interações moleculares [Karlsson R., et al., J. Immunol. Methods 145:229- 240 (1991)]. A vantagem do BIAcore sobre os outros ensaios de ligação é que a ligação do antígeno pode ser medida sem ter que marcar ou imobilizar o antígeno (isto é, o antígeno mantém uma conformação mais nativa). A metodologia de BIAcore foi usada para avaliar a ligação dos vários frag- mentos de peptídeo de amilóide beta ao anticorpo 266 de camundongo, es- sencialmente como acima descrito no Exemplo 12, exceto que todas as di- luições foram feitas com solução tamponada de HEPES contendo Tween 20, uma variedade de fragmentos de Αβ (BioSource International) foi injetada, e uma concentração simples de cada fragmento foi injetada (440 nM).

Os fragmentos de amilóide beta 1-28, 12-28, 17-28 e 16-25 li- gam ao anticorpo 266 de camundongo, enquanto os fragmentos de Αβ 1 -20, 10-20 e 22-35 não ligam. Os fragmentos 1-20, 10-20 e 22-35 ligam aos ou- tros MABs com especificidade de epitopo conhecido para aquelas regiões de Αβ. Usando esta metodologia, o epitopo de ligação para o anticorpo 266 de camundongo parece ser entre os aminoácidos 17 e 25 de Αβ. Uma vez a ligação usualmente ocorre com pelo menos 3 resíduos do epitopo presente, pode-se também inferir que o epitopo está contido dentro dos resíduos 19- 23. EXEMPLO 17 PROPRIEDADES DE LIGAÇÃO IN VITRO DE ANTICORPO 266 HUMANI- ZADO A afinidade (KD = Kd / Ka) de anticorpo 266 humanizado, sinteti- zado e purificado como acima descrito, foi determinada essencial mente como acima descrito no Exemplo 15. Usando este método, a afinidade de 266 humanizado para Αβι.42 foi observada ser 4 pM.

Claims (15)

1. Anticorpo humanizado que se liga especificamente a um epi- topo contido dentro das posições 13 a 28 de peptídeo beta amiloide, caracte- rizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve hu- manizada compreendendo a seguinte sequencia: Asp Xaa Vai Met Thr Gin Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Vai Xaa Xaa Gly 15 10 15 Gin Pro Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Xaa Tyr Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Xaa Leu Leu lie Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Vai Tyr Tyr Cys Ser Gin Ser 85 90 95 Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Xaa Xaa Glu lie Lys 100 105 110 Arg (SEQ ID NO:7) em que: Xaa na posição 2 é Vai ou lie, Xaa na posição 7 é Ser ou Thr; Xaa na posição 14 é Thr ou Ser; Xaa na posição 15 é Leu ou Pro; Xaa na posição 30 é lie ou Vai; Xaa na posição 50 é Arg, Gin ou Lys; Xaa na posição 88 é Vai ou Leu; Xaa na posição 105 é Gin ou Gly; Xaa na posição 108 é Lys ou Arg; e Xaa na posição 109 é Vai ou Leu; e uma região variável de cadeia pesada compreendendo a se- guinte sequencia: Xaa Vai Gin Leu Vai Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Xaa Leu Vai 35 40 45 Ala Gin lie Asn Ser Vai Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Xaa Vai 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Xaa Xaa Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Xaa Vai Thr Vai Ser Ser 100 105 110 (SEQ ID NO:8); em que: Xaa na posição 1 é Glu ou Gin; Xaa na posição 7 é Ser ou Leu; Xaa na posição 46 é Glu, Vai, Asp, ou Ser; Xaa na posição 63 é Thr ou Ser; Xaa na posição 75 é Ala, Ser, Vai, ou Thr; Xaa na posição 76 é Lys ou Arg; Xaa na posição 89 é Glu ou Asp; e Xaa na posição 107 é Leu ou Thr.

2. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que tem uma região variável de cadeia leve da se- quência dada pela SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia pesada dada pela SEQ ID NO: 10.

3. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizado pelo fato de que tem uma cadeia leve da sequencia dada pela SEQ ID NO: 11 e uma cadeia pesada da sequencia dada pela SEQ ID NO: 12.

4. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que é um isotipo de imunoglobulina IgG-i.

5. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1, ca- racterizado pelo fato de que sequestra peptídeo beta amiloide a partir da sua forma circulante ligada, e altera a liberação de formas solúveis e ligadas de peptídeo beta amiloide no sistema nervoso central e plasma.

6. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizado pelo fato de que especificamente liga um epítopo contido dentro das posições 13-20 do peptídeo beta amiloide.

7. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizado pelo fato de que especificamente liga um epítopo contido dentro das posições 17-25 do peptídeo beta amiloide.

8. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 5, ca- racterizado pelo fato de que especificamente liga um epítopo contido dentro das posições 19-23 do peptídeo beta amiloide.

9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo humanizado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

10. Uso do anticorpo humanizado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para a fabrica- ção de um medicamento para tratar doença de Alzheimer clínica ou pré- clínica, síndrome de Down ou angiopatia cerebral amiloide clínica ou pré- clínica.

11. Uso do anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento pa- ra tratar doença de Alzheimer.

12. Uso do anticorpo humanizado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato ser para a fabricação de um medicamento para inibir a formação de placas de amiloide ou os efei- tos de espécies tóxicas solúveis de peptídeo beta amiloide; reduzir as placas de amiloide ou os efeitos de espécies tóxicas solúveis de peptídeo beta ami- loide; prever, tratar ou reverter declínio cognitivo; ou melhorar cognição em um ser humano.

13. Uso do anticorpo humanizado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser para a fabrica- ção de um medicamento para prevenção de doença clínica ou pré-clínica de Alzheimer, síndrome de Down, ou angiopatia de amiloide cerebral, clínica ou pré-clínica, em um ser humano.

14. Uso de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo, quando administrado perifericamente em um ser humano, não necessita cruzar a barreia hematoencefálica para exe- cutar os seus efeitos benéficos.

15. Uso de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo, quando administrado perifericamente a um ser humano, não requer respostas celulares para executar os seus efeitos benéficos.