PL210157B1 - Humanizowane przeciwciało lub jego fragment, kwas polinukleinowy, wektor ekspresyjny do ekspresji przeciwciała lub jego fragmentu, komórka transfekowana wektorem ekspresyjnym, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu do leczenia choroby Alzheimera - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment, kwas polinukleinowy, wektor ekspresyjny do ekspresji przeciwciała lub jego fragmentu, komórka transfekowana wektorem ekspresyjnym, kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu do leczenia choroby Alzheimera.

Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy humanizowanych przeciwciał, które wiążą się z epitopem znajdującym się pomiędzy aminokwasami 13 a 28 w peptydzie Αβ, kwasu polinukleinowego zawierającego sekwencję kodującą łańcuch lekki lub łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała a także zapobiegania i leczenia stanów związanych z betaamyloidem, takich jak choroba Alzheimera, zespół Downa i angiopatia amyloidowa mózgowa. Wynalazek dotyczy zwłaszcza zastosowania humanizowanych przeciwciał monoklonalnych do wiązania amyloidowego beta-peptydu (peptydu Ae) w osoczu, w mózgu i w płynie mózgowo-rdzeniowym w celu zapobiegania kumulowania się bądź odwracania procesu okładania się peptydu Ae w mózgu i w układzie naczyń krwionośnych mózgu i w efekcie do polepszenia pojmowania.

Tło wynalazku

Wiele zespołów charakterystycznych objawów, które w rezultacie dają upośledzenie pojmowania, udary, krwotoki mózgowe i ogólny niedorozwój umysłowy okazuje się być związanych z zawierającymi amyloidowy beta-peptyd Ae płytkami w nerwach i w naczyniach mózgowych w mózgu. Do takich stanów należą zarówno przedkliniczna jak i kliniczna faza choroby Alzheimera, zespół Downa oraz przedkliniczna i kliniczna faza angiopatii amyloidowej mózgowej (CAA). Płytki amyloidowe są uformowane z amyloidowych beta-peptydów. Peptydy te krążą we krwi i w płynie mózgowordzeniowym (CSF), na ogół w postaci skompleksowanej z lipoproteinami. Peptyd Ae w formie krążącej we krwi składa się z 39-43 aminokwasów (najczęściej 40 lub 42 aminokwasów) powstających z rozszczepienia wspólnego białka prekursorowego, amyloidowego białka prekursorowego, często oznaczanego skrótem APP. Niektóre formy rozpuszczalnego peptydu Ae są same w sobie neurotoksyczne i mogą determinować stopień zaawansowania neurodegeneracji i/lub upośledzenia pojmowania [McLean, C. A. i wsp., Ann. Neurol. (1999) 46: 860-866; Lambert M. P. i wsp. (1998) 95: 6448-6453; Naslund J., J. Am. Med. Assoc. (2000) 283: 1571].

Istnieją dowody na to, że peptyd Ae może być transportowany w obydwu kierunkach, pomiędzy mózgiem a krwią [Ghersi-Egea, J-F. i wsp. J. Neurochem. (1996) 67: 880-883; Zlokovic B. V. i wsp., Blochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-1040; Shibata M. i wsp., J. Clin. Invest. (2000) 106: 1489-1499]. Poza tym, peptyd Ae w płytkach i rozpuszczalna forma białka Ae znajdują się między sobą w równowadze w mózgu i we krwi [Kawarabayashi T. i wsp., J. Neurosci. (2000) 21: 372-381].

Jak podano w zgłoszeniach patentowych PCT, USOO/35681 i Stanów Zjednoczonych, U.S. numer seryjny 09/153.130, włączonych do niniejszego opisu jako odnośniki, całkowite poziomy peptydu Ae krążącego w płynie mózgowo-rdzeniowym są podobne u osób normalnych i predysponowanych do pojawienia się u nich objawów choroby Alzheimera. Jednakże średnio, poziomy peptydu Ae42 są niższe u osobników z chorobą Alzheimera [Nitsch R. M. i wsp., Ann. Neurol. (1995), 37: 512-518]. Wiadomo, że peptyd Ae42 ma większą skłonność do agregacji niż peptyd Ae40 i jeśli to zjawisko następuje, w wyniku pojawiają się niepożądane jego skutki, takie jak odkładanie się płytek amyloidowych, przekształcanie się peptydu Ae w toksyczne formy rozpuszczalne, uszkodzenie komórek nerwowych i upośledzenia behawioralne, takie jak otępienie [Golde T. E. i wsp., Biochem. Biophys. Acta (2000) 1502: 172-187].

Sposoby indukowania odpowiedzi immunologicznej w celu zmniejszenia złogów amyloidowych są opisane w publikacji zgłoszenia PCT WO 99/27944 opublikowanej 10 czerwca 1999. W opisie tym postuluje się, że zagregowany peptyd Ae o pełnej długości mógłby być użytecznym immunogenem. Podanie fragmentu Ae (aminokwasy 13-28) skoniugowanego z anty-mysią IgG owcy nie powodowało zmiany w obciążeniu amyloidowym kory mózgowej i tylko u jednego z dziewięciu zwierząt, którym podano iniekcje koniugatu fragmentu 13-28 peptydu Ae wystąpiła limfoproliferacja w odpowiedzi na Ae40. W tym zgłoszeniu wskazuje się również, że przeciwciała, które swoiście wiążą się z peptydem Ae mogą być użyte jako środki lecznicze. Jednak okazuje się to być jedynie domysłem, gdyż przytoczone dane odnoszą się do protokołów, w których prowadzono aktywną immunizację z użyciem np. peptydu Ae42. Peptydy te dostarczano łącznie z adiuwantami i oznaczano miana przeciwciała powstającego w wyniku immunizacji a także poziomy peptydu Ae i peptydu prekursorowego. W publikacji

PL 210 157 B1 mocno podkreśla się tezę, że dla złagodzenia objawów choroby Alzheimera konieczne jest zmniejszenie płytki Αβ i że w efektywnym zmniejszaniu płytki Αβ wymagany jest udział procesów komórkowych.

Publikacja zgłoszenia międzynarodowego, WO 99/60024 z 25 listopada 1999 r, dotyczy sposobów usuwania amyloidu z użyciem przeciwciał anty-amyloidowych. Podano jednakże, że mechanizm tego procesu polega na wykorzystaniu zdolności przeciwciał anty-Ae do wiązania się z już uformowanymi złogami amyloidowymi (czyli płytkami), co w konsekwencji daje miejscowe oczyszczanie mikrogleju ze zlokalizowanych w nim płytek. Mechanizm ten nie został potwierdzony w próbach in vivo. W publikacji tej twierdzi się poza tym, że aby przeciwciała anty-Ae były skuteczne przeciw płytkom Ap, muszą one dotrzeć do miąższu mózgu i przejść przez barierę krew-mózg.

Kilka zgłoszeń patentowych PCT odnoszących się do prób kontroli płytek amyloidowych opublikowano 7 grudnia 2000 r. W publikacji zgłoszeniowej WO 00/72880 opisane jest znaczne zmniejszenie obciążenia płytkami w korze mózgu i w hipokampie myszy transgenicznych, stanowiących model choroby Alzheimera, po traktowaniu N-końcowymi fragmentami peptydów Ap i przeciwciałami, które się z nimi wiążą ale nie po traktowaniu fragmentem Ap 13-28 skoniugowanym z anty-mysią IgG owcy ani przeciwciałem przeciw fragmentowi 13-28, czyli przeciwciałem 266. W badaniach in vitro wykazywano, że przeciwciała skierowane przeciw fragmentom N-końcowym przechodzą przez barierę krew-mózg i indukują fagocytozę płytek amyloidowych.

Publikacja zgłoszeniowa WO 00/72876 zawiera zasadniczo to samo ujawnienie co WO 00/72880 i dotyczy immunizacji samymi składnikami włókienek amyloidowych.

W publikacji zgłoszeniowej WO 00/77178 opisane są przeciwciała zaprojektowane tak, aby katalizowały hydrolizę p-amyloidu, między innymi przeciwciała przeciw mieszaninie związków przejściowych fenyloalaninostatyny, Cys-Ap_10-25, statyno-Phe₁₉-Phe₂₀ i Cys-Ap_10-25-statyno-Phe₂₀-Ala₂₁ i przeciwciała przeciw Ap10-25, posiadające zredukowane wiązanie amidowe pomiędzy Phe19 i Phe20. W tym dokumencie wspomniano o sekwestrowaniu peptydu Ap lecz jest to jedynie przypuszczenie, gdyż nie przytoczono dowodu takiego sekwestrowania. Poza tym, dokument nie dostarcza dowodu in vivo na fakt, że podanie przeciwciał powoduje wypływ peptydu Ap z ośrodkowego układu nerwowego, przeciwdziała tworzeniu się płytek, zmniejsza obciążenie pytkami, tworzy kompleksy pomiędzy tymi przeciwciałami i peptydem Ap w próbkach tkanki ani, że usprawnia pojmowanie.

Wykazano, że jeden szlak w metabolizmie Ap przebiega poprzez transport z ośrodkowego układu nerwowego do osocza [Zlokovic B. V. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) (1996) 93: 4229 -4234; Ghersi-Egea J-F. i wsp., J. Neurochem. (1996) 67: 880-883]. Ponadto wykazano, że peptyd Ap znajdujący się w osoczu może przekraczać barierę krew-mózg i docierać do mózgu [Zlokovic B. V. i wsp., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1993) 67: 1034-1040]. Dowiedziono także, że podanie niektórych poliklonalnych i monoklonalnych przeciwciał anty-Ap zmniejsza odkładanie się płytek amyloidowych u transgenicznych myszy APP^V717F, stanowiących model choroby Alzheimera [Bard F. i wsp., Nature Med. (2000) 6: 916-919]. Podano jednakże, że zachodzi to dzięki niektórym przeciwciałom anty-Ap, przenikającym przez barierę krew-mózg i stymulującym fagocytozę płytek amyloidowych przez komórki mikrogleju. W doświadczeniach Barda, próby ex vivo na skrawkach mózgu ujawniły, że obecność dodanego przeciwciała anty-Ap, łącznie z wprowadzonym egzogennie mikroglejem, indukowała fagocytozę Ap, w wyniku czego ulegały usuwaniu złogi Ap.

Poziomy obydwu rozpuszczalnych peptydów, Ap40 i Ap42 w płynie mózgowo-rdzeniowym i we krwi można łatwo oznaczyć wykonując standaryzowane próby z użyciem przeciwciał przeciw epitopom znajdującym się wzdłuż łańcucha Ap. Takie próby są opisane, przykładowo w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.766.846, US 5.837.672 i US 5.593.846. W opisach tych ujawnione jest wytwarzanie mysich przeciwciał monoklonalnych przeciw centralnej domenie peptydu Ap, która, jak podano, posiada epitopy wokół pozycji 16 i 17 oraz w tych pozycjach. Opisane są również przeciwciała skierowane przeciw regionowi N-terminalnemu. Twierdzono, że niektóre przeciwciała monoklonalne wchodzą w reakcję immunologiczną z pozycjami 13-28 peptydu Ap. Te przeciwciała nie wiążą się z peptydem reprezentującym pozycje 17-28, a więc, według cytowanych opisów patentowych, świadczy to o tym, że jest to ten region (włącznie z pozycjami 16-17 (miejsce α-sekretazy), który jest celem dla tych przeciwciał. Wśród przeciwciał, o których wiadomo, że wiążą się w miejscach pomiędzy aminokwasami 13 a 28 peptydu Ap znajdują się przeciwciała mysie 266, 4G8 i 1C2.

Nieoczekiwanie odkryliśmy, że podanie przeciwciała 266 bardzo szybko i prawie całkowicie przywraca pojmowanie (pamięć przedmiotów) u 24-miesięcznej hemizygotycznej myszy transgenicznej (APP^V717F). Przeciwciało to wcale nie ma właściwości, którymi według stanu techniki powinno się

PL 210 157 B1 charakteryzować przeciwciało, aby było skuteczne w leczeniu choroby Alzheimera, zespołu Downa i innych stanów związanych z peptydem Αβ. Ku naszemu dalszemu zdumieniu zaobserwowaliśmy, że przeciwciała, które wiążą peptyd Ae w pozycjach pomiędzy 13 a 28 (266 i 4G8) mają zdolność sekwestrowania rozpuszczalnych form tego peptydu Ae z ich związanych form krążących we krwi i że obwodowe podanie przeciwciała 266 powoduje szybki wypływ stosunkowo dużych ilości peptydu Ae z ośrodkowego układu nerwowego do osocza. W rezultacie uzyskuje się zmieniony klirens rozpuszczalnego peptydu Ae, zapobieganie powstawaniu płytek i co najbardziej zdumiewające, poprawę pojmowania, nawet bez niezbędnego obniżenia obciążenia płytkami amyloidowymi Ae, przekraczania bariery krew-mózg w jakimś znaczącym stopniu, dekorowania płytek, aktywowania mechanizmów komórkowych czy wiązania z dużym powinowactwem zagregowanego peptydu Ae.

Przedmiotem wynalazku jest humanizowane przeciwciało lub jego fragment, które specyficznie wiąże się z epitopem zawartym w pozycjach 13-28 cząsteczki Ae, i które zawiera:

a. łańcuch lekki posiadający trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR) w łańcuchu lekkim o następujących sekwencjach aminokwasowych:

CDR1 łańcucha lekkiego:

5 10 15 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.1); lub

5 10 15 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.15),

CDR2 łańcucha lekkiego:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID Nr. 2) i CDR3 łańcucha lekkiego:

5

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID Nr. 3) oraz sekwencję regionu zrębowego z łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, i

b. łańcuch ciężki posiadający trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR) w łańcuchu ciężkim o następujących sekwencjach aminokwasowych:

CDR1 łańcucha ciężkiego:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID Nr. 4)

CDR2 łańcucha ciężkiego:

5 10 15 Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 5) albo

5 10 15 Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 16); i

CDR3 łańcucha ciężkiego:

Gly Asp Tyr (SEQ ID Nr. 6) oraz sekwencję regionu zrębowego łańcucha ciężkiego z łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny.

W korzystnym rozwiązaniu humanizowane przeciwciało lub jego fragment charakteryzuje się tym, że CDR1 łańcucha lekkiego ma sekwencję:

5 10 15 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.1) i;

CDR2 łańcucha ciężkiego ma sekwencję:

5 10 15 Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 5).

W jeszcze innym korzystnym rozwiązaniu humanizowane przeciwciało lub jego fragment według posiada region zmienny łańcucha lekkiego zawierający następującą sekwencję:

PL 210 157 B1

5 10 15

Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa 20 25 30

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa 35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110

Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SEQ ID Nr. 7) w której:

Xaa w pozycji 2 oznacza Val albo Ile;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Thr;

Xaa w pozycji 14 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 15 oznacza Leu albo Pro;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ile albo Val;

Xaa w pozycji 50 oznacza Arg, Gln albo Lys;

Xaa w pozycji 88 oznacza Val albo Leu;

Xaa w pozycji 105 oznacza Gln albo Gly;

Xaa w pozycji 108 oznacza Lys albo Arg i

Xaa w pozycji 109 oznacza Val albo Leu a region zmienny w ł a ń cuchu ciężkim posiada nastę pują c ą sekwencję :

5 10 15

Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Xaa Leu Val Ala Gln lle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75

Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Xaa 80 85 90

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp 95 100 105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr. 8) w której:

Xaa w pozycji 1 oznacza Glu albo Gln;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Leu;

Xaa w pozycji 46 oznacza Glu, Val, Asp albo Ser;

Xaa w pozycji 63 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 75 oznacza Ala, Ser, Val albo Thr;

Xaa w pozycji 76 oznacza Lys albo Arg;

Xaa w pozycji 89 oznacza Glu albo Asp;

Xaa w pozycji 107 oznacza Leu albo Thr.

W kolejnym korzystnym rozwiązaniu humanizowane przeciwciało lub jego fragment posiada region zmienny w łańcuchu lekkim odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 9 i region zmienny w łańcuchu ciężkim odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 10, a w jeszcze bardziej korzystnym rozwiązaniu

PL 210 157 B1 humanizowane przeciwciało lub jego fragment posiada łańcuch lekki odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 11 i łańcuch ciężki odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 12.

Humanizowane przeciwciało, według wynalazku korzystnie może być fragmentem tego przeciwciała.

Humanizowane przeciwciało łub jego fragment według wynalazku korzystnie może stanowić izotyp IgG1 immunoglobuliny.

Humanizowane przeciwciało lub jego fragment korzystnie jest wytwarzane w komórce gospodarza wybranej z grupy obejmującej komórki szpiczaka, komórki jajnika chomika chińskiego, komórki jajnika chomika syryjskiego i komórki nerki embrionu ludzkiego.

Przedmiotem wynalazku jest również kwas polmukleinowy zawierający sekwencję kodującą łańcuch łekki lub łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała łub jego fragmentu jak zdefiniowanego powyżej.

W korzystnej realizacji wynalazku kwas polinukleinowy zawiera sekwencję kodują c ą region zmienny łańcucha lekkiego przedstawiony na sekwencji SEQ ID Nr. 7 albo SEQ ID Nr. 9, także korzystnie, sekwencję kodującą region zmienny łańcucha ciężkiego przedstawiony na sekwencji SEQ ID Nr. 8 albo SEQ ID Nr. 10.

Bardziej korzystnie kwas polinukleinowy zawiera sekwencję kodującą łańcuch lekki, przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr. 11, i także korzystnie sekwencję kodującą łańcuch ciężkie, przedstawioną na sekwencji SEQ ID Nr. 12.

Przedmiotem wynalazku jest także kwas polinukleinowy, którego ekspresja w odpowiedniej komórce gospodarza daje przeciwciało lub jego fragment jak zdefiniowano powyżej.

Następnym przedmiotem wynalazku jest wektor ekspresyjny do ekspresji przeciwciała lub jego fragmentu, jak zdefiniowano powyżej, zawierający sekwencje nukleotydowe kodujące to przeciwciało lub jego fragment.

Przedmiotem wynalazku jest także komórka transfekowana tym wektorem ekspresyjnym jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kwas polinukleinowy zawierający sekwencję kodującą łańcuch lekki albo łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała lub jego fragment posiadający łańcuch lekki odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 11 i łańcuch ciężki odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 12.

Przedmiotem wynalazku jest również kwas polinukleinowy, którego ekspresja w odpowiedniej komórce gospodarza daje przeciwciało lub jego fragment, jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również komórka transfekowana dwoma wektorami ekspresyjnymi, jak zdefiniowano powyżej, przy czym pierwszy wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch lekki a drugi wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch ciężki.

Przedmiotem wynalazku jest także wektor ekspresyjny do ekspresji przeciwciała lub jego fragmentu, jak zdefiniowano powyżej, zawierający sekwencje nukleotydowe kodujące to przeciwciało lub jego fragment.

Wynalazek dotyczy również komórki transfekowanej wektorem ekspresyjnym jak zdefiniowano powyżej.

Wynalazek dotyczy również komórki transfekowanej dwoma wektorami ekspresyjnymi, jak zdefiniowano powyżej, przy czym pierwszy wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch lekki a drugi wektor zawiera sekwencję kodującą łańcuch ciężki.

Wynalazek dotyczy również komórki zdolnej do ekspresji humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca humanizowane przeciwciało albo jego fragment jak zdefiniowano powyżej i dopuszczalną farmaceutycznie substancję pomocniczą.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku, włącznie z jego postacią umożliwiającą przedłużoną ekspresję rekombinantowych sekwencji tego przeciwciała lub fragmentu tego przeciwciała w tkankach człowieka, do leczenia klinicznej lub przedklinicznej fazy choroby Alzheimera, zespołu Downa bądź klinicznej lub przedklinicznej fazy angiopatii mózgowej amyloidowej.

Wynalazek dotyczy także zastosowania humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania leku, włącznie z jego postacią umożliwiającą przedłużoną ekspresję rekombinantowych sekwencji tego przeciwciała lub fragmentu tego przeciwciała w tkankach

PL 210 157 B1 człowieka, do leczenia, zapobiegania lub odwracania upośledzenia pojmowania w klinicznej lub przedklinicznej fazie choroby Alzheimera, zespołu Downa bądź klinicznej lub przedklinicznej fazie angiopatii mózgowej amyloidowej.

Wynalazek dotyczy również zastosowania humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu, jak zdefiniowano powyżej, do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.

A zatem, wynalazek dostarcza humanizowanych przeciwciał względnie ich fragmentów, wpływających dodatnio na pojmowanie w chorobach i stanach, w których zaangażowany jest peptyd Αβ, takich jak faza kliniczna lub przedkliniczna choroby Alzheimera, zespół Downa i kliniczna lub przedkliniczna faza angiopatii amyloidowej mózgowej. Te przeciwciała bądź ich fragmenty nie muszą przekraczać bariery krew-mózg, dekorować płytki amyloidowej, aktywować odpowiedzi komórkowych ani nawet koniecznie zmniejszać obciążenia płytkami amyloidowymi. W innym aspekcie, wynalazek dostarcza humanizowanych przeciwciał i ich fragmentów, sekwestrujących peptyd Ae z jego formy związanej krążącej we krwi i zmieniających klirens form rozpuszczalnej i związanej peptydu Ae w ośrodkowym układzie nerwowym i w osoczu. W następnym aspekcie, wynalazek dostarcza takich humanizowanych przeciwciał i ich fragmentów, które swoiście wiążą się z epitopem pomiędzy aminokwasami 13 a 28 w cząsteczce Ae. W kolejnym aspekcie, wynalazek dostarcza takich humanizowanych przeciwciał i ich fragmentów, w których region determinujący dopasowanie (CDR) pochodzi z mysiego monoklonalnego przeciwciała 266 i które to przeciwciała zachowują w zasadzie właściwości wiązania przeciwciała mysiego i wykazują w próbach in vitro i in vivo właściwości odpowiadające funkcyjnie przeciwciału mysiemu (sekwencje SEQ ID Nr. 1 do SEQ ID Nr. 6). W innym aspekcie, wynalazek dostarcza takich humanizowanych przeciwciał i ich fragmentów, w których regiony zmienne zawierają sekwencje posiadające CDRy z mysiego przeciwciała 266 i specyficzne ludzkie sekwencje zrębowe (sekwencje SEQ ID Nr. 7 - SEQ ID Nr. 10), które to przeciwciała zachowują w zasadzie właściwości wiązania przeciwciała mysiego i wykazują w próbach in vitro i in vivo właściwości funkcyjnie odpowiadające przeciwciału mysiemu 266. W innym aspekcie, wynalazek dostarcza takich humanizowanych przeciwciał i ich fragmentów, w których łańcuchem lekkim jest sekwencja SEQ ID Nr. 11 a łańcuchem ciężkim SEQ ID Nr. 12.

Częścią wynalazku są również sekwencje polinukleotydowe kodujące humanizowane przeciwciała bądź ich fragmenty ujawnione powyżej, wektory zawierające sekwencje polinukleotydowe kodujące te humanizowane przeciwciała lub ich fragmenty, komórki gospodarza transformowane wektorami lub z wbudowanymi tymi polinukleotydami, których ekspresja daje powyższe humanizowane przeciwciała lub ich fragmenty, receptury farmaceutyczne takich humanizowanych przeciwciał i ich fragmentów ujawnionych w niniejszym opisie oraz sposoby ich wytwarzania i stosowania.

Takie humanizowane przeciwciała i ich fragmenty są użyteczne do sekwestrowania peptydu Ae u ludzi, do leczenia i zapobiegania u ludzi rozwojowi chorób i stanów charakteryzujących się płytkami Ae bądź toksycznością Ae w mózgu, takich jak choroba Alzheimera, zespół Downa i angiopatia mózgowa amyloidowa, do diagnozowania tych chorób u ludzi i do określania, czy dany osobnik będzie reagował na leczenie z użyciem ludzkich przeciwciał przeciw Ae.

Stosowanie odpowiedniego humanizowanego przeciwciała in vivo do sekwestrowania peptydu Ae krążącego w płynach biologicznych ma na celu zapobieganie i leczenie stanów związanych z tworzeniem się, zawierających peptyd Ae, płytek rozsianych, neuronowych i naczyniowych w mózgu. Takie humanizowane przeciwciało, w tym również jego fragment immunologicznie reaktywny, powoduje usunięcie peptydu Ae z makrocząsteczkowych kompleksów, co na ogół będzie oznaczało transportowanie go w płynach ustrojowych do i z miejsc tworzenia się płytek lub z miejsc, w których mogą być toksyczne. Poza tym, sekwestrowanie osoczowego peptydu Ae przeciwciałem lub jego fragmentem działa jak zatapianie, skutecznie sekwestrując rozpuszczalny peptyd Ae w przedziale osocza i indukując peptyd Ae do przechodzenia do osocza z miejsc w ośrodkowym układzie nerwowym (oun). Przez sekwestrowanie peptydu Ae we krwi, jego wypływ netto z mózgu zwiększa się, zapobiega to, procesowi odkładania się rozpuszczalnego Ae w nierozpuszczalnych płytkach i powstawaniu toksycznych rozpuszczalnych jego postaci w mózgu. Ponadto, nierozpuszczalny peptyd Ae w płytkach, znajdujący się w równowadze z rozpuszczalnym peptydem Ae, może być usuwany z mózgu poprzez efekt sekwestrowania we krwi. Sekwestrowanie peptydu Ae przeciwciałem zwiększa również jego usuwanie z organizmu i hamuje działanie toksyczne rozpuszczalnego peptydu Ae w mózgu a także rozwój i dalsze gromadzenie się nierozpuszczalnego peptydu Ae jako amyloidu w płytkach. Przeciwciała użyteczne w wynalazku nie przechodzą w dużych ilościach przez barierę krew-mózg (poziomy <0,1% w osoczu). Humanizowane przeciwciała stosowane w wynalazku, po podaniu obwodowe, nie muszą

PL 210 157 B1 wywoływać odpowiedzi immunologicznej komórkowej w mózgu jeśli zostaną związane z peptydem Ap bądź gdy krążą we krwi w stanie wolnym, wywierając korzystne działania. Następnie, przy wprowadzeniu obwodowym, do uzyskania ich korzystnego działania nie jest potrzebne, aby w znaczącym stopniu wiązały zagregowany peptyd Ap w mózgu.

Tak więc, w jednym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu leczenia i zapobiegania stanom charakteryzującym się tworzeniem się płytek zawierających białko beta-amyloidu u ludzi, który to sposób polega na podawaniu, korzystnie obwodowo, ludziom potrzebującym takiego leczenia, skutecznej leczniczo lub profilaktycznie ilości humanizowanego przeciwciała monoklonalnego względnie jego fragmentu reaktywnego immunologicznie, które to przeciwciało swoiście wiąże się ze środkowym regionem peptydu Ap. W innym aspekcie, wynalazek dotyczy sposobu hamowania tworzenia się płytek amyloidowych i usuwania płytek amyloidowych u ludzi, który to sposób polega na podawaniu ludziom potrzebującym takiego hamowania skutecznej ilości humanizowanego przeciwciała, które sekwestruje peptyd Ap z jego formy krążącej we krwi i indukuje wypłukiwanie go z mózgu oraz zmienia klirens peptydu Ap w osoczu i w mózgu. W dodatkowych aspektach, przedmiotem wynalazku są te humanizowane przeciwciała, łącznie z ich częściami skutecznymi immunologicznie i sposoby ich wytwarzania.

W oparciu o niniejszy wynalazek można zaproponować metody odwracania upośledzenia pojmowania, poprawy pojmowania, leczenia upośledzenia pojmowania i zapobiegania upośledzenia pojmowania u osobników, u których zdiagnozowano przedkliniczną lub kliniczną fazę choroby Alzheimera, zespół Downa lub kliniczną bądź przedkliniczną fazę angiopatii mózgowej amyloidowej, które to sposoby polegają na podawaniu osobnikowi skutecznej ilości humanizowanego przeciwciała według wynalazku.

Wynalazek dotyczy również zastosowania humanizowanego przeciwciała według wynalazku do wytwarzania leku, włącznie z przedłużoną ekspresją rekombinantowych sekwencji tego przeciwciała lub fragmentu przeciwciała w tkankach człowieka, do leczenia, zapobiegania lub odwracania choroby Alzheimera, zespołu Downa lub angiopatii mózgowej amyloidowej; do leczenia, zapobiegania lub odwracania upośledzenia pojmowania w klinicznej bądź przedklinicznej fazie choroby Alzheimera, w zespole Downa lub w klinicznej bądź przedklinicznej fazie angiopatii mózgowej amyloidowej; bądź do hamowania tworzenia się płytek amyloidowych bądź skutków toksycznego działania rozpuszczalnych form peptydu Ap u ludzi.

Wynalazek jest związany ze zdumiewającą obserwacją, że w przeciągu krótkiego czasu po podaniu przeciwciała według wynalazku, z ośrodkowego układu nerwowego wypływają do krwi względnie duże ilości peptydu Ap. Wynalazkiem objęte są zatem sposoby uzyskiwania odpowiedzi u człowieka na traktowanie przeciwciałem wiążącym Ap lub jego fragment, polegające na: a) podaniu osobnikowi przeciwciała bądź jego fragmentu i b) pomiarze stężenia peptydu Ap we krwi tego osobnika.

Wynalazek pozwala zatem na leczenie człowieka przeciwciałem wiążącym Ap lub jego fragment, polegający na: a) podania osobnikowi pierwszej ilości tego przeciwciała lub jego fragmentu, b) na pomiarze stężenia Ap we krwi tego osobnika w ciągu 3 godzin do dwóch tygodni po podaniu pierwszej dawki, c) o ile to potrzebne, wyliczeniu drugiej ilości przeciwciała lub jego fragmentu w oparciu o rezultaty etapu b), przy czym druga ilość jest taka sama lub różni się od pierwszej ilości i d) podaniu drugiej ilości tego przeciwciała lub jego fragmentu.

Wynalazek pozwala również na sposób oceny u człowieka skuteczności przeciwciała wiążącego się z peptydem Ap lub jego fragmentem w hamowaniu lub w zapobieganiu tworzenia się pytki amyloidowej Ap, zdolności zmniejszania płytki amyloidowej Ap, osłabiania skutków toksycznego działania rozpuszczalnych form Ap bądź do leczenia stanu lub choroby związanej z płytką Ap, który to sposób obejmuje: a) uzyskanie pierwszej próbki osocza lub płynu mózgowo-rdzeniowego osobnika, b) pomiar wyjściowego stężenia Ap w tej pierwszej próbce, c) podanie osobnikowi przeciwciała łub jego fragmentu, d) uzyskanie drugiej próbki osocza lub płynu mózgowo-rdzeniowego tego osobnika w czasie od 3 godzin do dwóch tygodni po podaniu przeciwciała lub jego fragmentu i e) pomiar stężenia Ap w tej drugiej próbce, przy czym skuteczność odnosi się do ilości Ap związanego z przeciwciałem we krwi i stężenia Ap w płynie mózgowo-rdzeniowym.

Krótki opis rysunków

Fig. 1 przedstawia procent peptydu Ap usuniętego przez Mab 266 z płynu mózgowo-rdzeniowego człowieka poprzez błonę dializacyjną w funkcji masy cząsteczkowej odcinanej przez tę błonę dializacyjną.

Fig. 2 przedstawia stężenie całkowitego Ap (Apcałkowite) oznaczone w osoczu myszy transgenicznych APP^V717F po iniekcji 200 μg albo 600 μg Mab 266 w funkcji czasu.

PL 210 157 B1

Fig. 3A przedstawia ilość peptydu Αβ odłożonego w korze mózgowej myszy transgenicznych APP^V717F traktowanych solą fizjologiczną, mysią IgG albo Mab 266. Fig. 3B przedstawia korelację tych wyników z wynikami uzyskanymi na zwierzętach macierzystych.

Fig. 4 przedstawia sekwencje polinukleotydowe do ekspresji łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała 266 z plazmidu pVk-Hu266 i jednoliterowe kody aminokwasów dla wytworzonego łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała 266 (w stanie dojrzałym odpowiadającego sekwencji SEQ ID Nr. 11).

Fig. 5 przedstawia sekwencje polinukleotydowe do ekspresji łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała 266 z plazmidu pVg1-Hu266 i jednoliterowe kody aminokwasów dla wytworzonego łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała 266 (w stanie dojrzałym odpowiadającego sekwencji SEQ ID Nr. 12).

Fig. 6 przedstawia mapę plazmidu pVk-Hu266.

Fig. 7 przedstawia mapę plazmidu pVg1-Hu266.

Sposoby wykonania wynalazku

Peptydy Ae krążące w płynach biologicznych człowieka reprezentują region końca karboksylowego białka prekursorowego kodowanego na chromosomie 21. Na podstawie wyników badań in vitro donoszono, że peptyd Ae jest słabo rozpuszczalny w roztworach fizjologicznych, gdyż zawiera ciąg aminokwasów hydrofobowych stanowiących część regionu, który zakotwicza swój dłuższy prekursor w błonach lipidowych komórek. Nie jest zatem zaskoczeniem, że krążący peptyd Ae jest normalnie kompleksowany innymi resztami, które zapobiegają jego agregacji. Wynikają stąd trudności w wykrywaniu peptydu Ae krążącego w płynach biologicznych.

W wyżej wymienionych dokumentach patentowych (US 5.766.846, US 5.837.672 i US 5.593.846) opisane jest wytwarzanie przeciwciał, w tym przeciwciała monokłonalnego oznaczonego jako klon 266, które to przeciwciało powstaje przeciw peptydowi zawierającemu aminokwasy 13-28 z peptydu Ae i wykazano, że wiąże się swoiście z tym peptydem. Zgłaszający niniejszy wynalazek odkryli, że przeciwciała, które wiążą się w obrębie tego regionu, w odróżnieniu od przeciwciał, które wiążą się w innych miejscach sekwencji aminokwasowej Ae, mają zdolność bardzo efektywnego sekwestrowania rozpuszczalnego peptydu Ae z kompleksów makrocząsteczkowych. Sekwestrowanie to powoduje wypływ netto peptydu Ae z ośrodkowego układu nerwowego, zmienia jego klirens w o.u.n. i w osoczu i obniża jego dostępność do celów tworzenia płytki. Tak więc, przeciwciała o takiej swoistości, zmodyfikowane w celu zmniejszenia ich immunogenności przez przekształcenie ich w formę humanizowaną dają sposobność traktowania zarówno profilaktycznego jak i leczniczego stanów związanych z tworzeniem się płytek amyloidowych. Jak wspomniano powyżej, do takich stanów zalicza się przedklmiczną i kliniczną fazę choroby Alzheimera, zespół Downa oraz przedkliniczną i kliniczną fazę angiopatii mózgowej amyloidowej. Stosowany w opisie termin traktowanie obejmuje traktowanie lecznicze, gdy wiadomo, że stan, który ma być leczony już występuje i traktowanie profilaktyczne czyli zapobieganie lub łagodzenie przypuszczalnego przyszłego zaistnienia stanu chorobowego.

Określenie monoklonalne przeciwciała, które wiążą się ze środkowym regionem peptydu Ae oznacza przeciwciała monoklonalne (Mab albo Mabs), które wiążą sekwencję aminokwasową reprezentującą epitop znajdujący się pomiędzy pozycjami 13-28 Ae. Celem nie musi być cały region. Jeśli tylko przeciwciało wiąże przynajmniej epitop w obrębie tego regionu (zwłaszcza np. epitop obejmujący miejsce sekretazy 16-17 albo miejsce, w którym wiąże się przeciwciało 266), to takie przeciwciało jest skuteczne w sposobie według wynalazku.

Termin przeciwciało oznacza przeciwciało monoklonalne jako takie albo jego fragment efektywny imimunologicznie, taki jak Fab, Fab' albo F(ab')2. W niektórych przypadkach, w niniejszym opisie fragmenty będą szczególnie wymienione dla uwypuklenia; tym niemniej, należy rozumieć, że niezależnie od tego, czy fragmenty są wyszczególnione czy nie, termin przeciwciało obejmuje takie fragmenty oraz formy jednołańcuchowe. Jak długo dane białko zachowuje zdolność wiązania żądanego celu, a w tym przypadku, sekwestrowania peptydu Ae z jego białek nośnikowych we krwi, tak długo jest objęte terminem przeciwciało. Terminem przeciwciało objęte są również np. formy jednołańcuchowe, ogólnie nazywane regionami Fv, przeciwciał o tej swoistości. Korzystnie ale nie koniecznie, przeciwciała użyteczne w wynalazku wytwarza się technikami rekombinacji, gdyż w celu przekształcenia ich w formy humanizowane potrzebna jest manipulacja na zazwyczaj mysich lub innych nie-ludzkich przeciwciałach o odpowiedniej swoistości. Przeciwciała mogą ale nie muszą być zglikozylowane, chociaż korzystne są przeciwciała zglikozylowane. Jak wiadomo, przeciwciała są odpowiednio sieciowano poprzez mostki dwusiarczkowe.

PL 210 157 B1

Wiadomo, że podstawowa jednostka strukturalna przeciwciała jest tetramerem. Każdy tetramer składa się z dwu identycznych par łańcuchów polipeptydowych, każda para zawiera jeden łańcuch lekki (około 25 kDa) i jeden łańcuch ciężki (około 50-70 kDa). Część amino-terminalna każdego łańcucha zawiera region zmienny złożony z około 100 do 110 lub większej ilości aminokwasów, w pierwszym rzędzie odpowiedzialnych za rozpoznanie antygenu. Część karboksyterminalna każdego łańcucha definiuje region stały, głównie odpowiedzialny za funkcję efektorową.

Łańcuchy lekkie klasyfikuje się na gamma, mμ, alfa i lambda. Łańcuchy ciężkie dzieli się na gamma, mu, alfa, delta i epsilon. Określają one izotyp przeciwciała, odpowiednio jako IgG, IgM, IgA, IgD i IgE. W łańcucńach lekkich i ciężkich, regiony zmienne i stałe są połączone regionem J, złożonym z około 12 lub większej ilości aminokwasów, a łańcuch ciężki zawiera również region D składający się z około 10 lub większej ilości aminokwasów.

Regiony zmienne każdej pary łańcucńa lekkiego i ciężkiego tworzą miejsce wiążące przeciwciała. Tak więc, nienaruszone przeciwciało ma dwa miejsca wiązania. Wszystkie łańcuchy wykazują tą samą ogólną strukturę stosunkowo konserwatywnych regionów zrębowych (FR), połączonych poprzez trzy regiony hiperzmienne, zwane również regionami determinującymi dopasowanie albo CDR. CDRy z dwóch łańcuchów każdej pary są ze sobą zrównane przez regiony zrębowe, co umożliwia wiązanie ze swoistym epitopem. Od końca aminowego do końca karboksylowego, zarówno łańcuchy lekkie jak i ciężkie zawierają domeny FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Przydział aminokwasów do każdej domeny jest zgodny ze znanymi konwencjami [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (Sekwencje białek o znaczeniu immunologicznym), National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 i 1991; Chothia i wsp., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), Chithia i wsp.. Nature 342: 878883 (1989)].

Jak powszechnie wiadomo, przeciwciała monoklonalne o odpowiedniej swoistości można łatwo generować standardowymi technikami immunizacji ssaków, uzyskując hybrydoma z komórek tych ssaków wytwarzających przeciwciała, bądź unieśmiertelniając te komórki w inny sposób i prowadząc hodowlę hybrydoma lub unieśmiertelnionych komórek dla nadania im odpowiedniej swoistości. W tym przypadku, takie przeciwciała można generować przez immunizację człowieka, królika, szczura lub myszy, np. peptydem reprezentującym epitop obejmujący region 13-28 peptydu Ap albo jego odpowiedni podregion. Materiały do manipulacji rekombinacyjnej można uzyskać drogą przesiewania sekwencji nukleotydowych, kodujących żądane przeciwciało z komórek hybrydoma lub innych je wytwarzających. Takie sekwencje nukleotydowe można następnie przekształcać, dostarczając je w formie humanizowanej.

Termin przeciwciało humanizowane oznacza przeciwciało składające się częściowo lub całkowicie z sekwencji aminokwasowych pochodzących z ludzkiej linii, wytwarzającej przeciwciała dzięki zmianie tej sekwencji przeciwciała, która zawiera nie-ludzkie regiony determinujące dopasowanie (CDR). Taka najprostsza zmiana może polegać na prostej zamianie stałego regionu mysiego na region stały ludzkiego przeciwciała. Uzyskuje się ludzko/mysią chimerę, która może się okazać wystarczająco słabo immunogenna, aby mogła być zaakceptowana do użycia w produkcie farmaceutycznym. Jednakże korzystnie, region zmienny tego przeciwciała a nawet CDR jest również humanizowany sposobami, które już obecnie są znane w stanie techniki. Części zrębowe regionów zmiennych są zastąpione odpowiednimi regionami zrębowymi ludzkimi z pozostawieniem nie-ludzkich CDR zasadniczo niezmienionych a nawet regiony hiperzmienne (CDR) są zastąpione sekwencjami pochodzącymi z genomu ludzkiego. W pełni ludzkie przeciwciała wytwarza się z użyciem genetycznie modyfikowanych myszy, których układy immunologiczne zostały tak zmienionej aby odpowiadały układom immunologicznym ludzkim. Jak wspomniano powyżej, do użycia w sposobach według wynalazku wystarczy wykorzystać fragment przeciwciała swoisty immunologicznie, w tym również fragmenty reprezentujące formy jednołańcuchowe.

W dalszym ciągu, termin humanizowane przeciwciało odnosi się do przeciwciała zawierającego ludzki region zrębowy, co najmniej jeden CDR z przeciwciała nie-ludzkiego, w którym to przeciwciele każdy region stały jest zasadniczo identyczny z regionem stałym ludzkiej immunoglobuliny, a więc, jest identyczny w co najmniej około 85-90%, korzystnie w co najmniej 95%. Tak więc, wszystkie części humanizowanego przeciwciała, za wyjątkiem ewentualnie regionów hiperzmiennych są w zasadzie identyczne z odpowiednimi częściami jednej lub większej ilości natywnych sekwencji immunoglobuliny ludzkiej. Przykładowo, humanizowana immunoglobulina nie będzie na ogół obejmować przeciwciała chimerycznego z mysim regionem zmiennym i ludzkim regionem stałym.

PL 210 157 B1

Humanizowane przeciwciała posiadają co najmniej trzy potencjalne zalety w stosunku do przeciwciał nie-ludzkich i chimerycznych w odniesieniu do ich użycia do leczenia ludzi:

1) dzięki temu, że część efektorowa jest ludzka, może lepiej reagować z innymi częściami ludzkiego układu immunologicznego (np. niszczyć komórki docelowe bardziej wydajnie według mechanizmu cytotoksyczności zależnej od dopełniacza (CDC) lub cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC)).

2) Ludzki układ immunologiczny nie powinien rozpoznawać regionu zrębowego ani regionu C przeciwciała humanizowanego jako obcego, a zatem, odpowiedź przeciwciał na takie wstrzyknięte przeciwciało powinna być słabsza niż na całkowicie nie-ludzkie przeciwciało lub na częściowo obce przeciwciało chimeryczne.

3) W piśmiennictwie są doniesienia, że podane przez iniekcję przeciwciała nie-ludzkie mają znacznie krótszy okres półtrwania w układzie krążenia człowieka niż przeciwciała ludzkie. Wstrzyknięte humanizowane przeciwciała będą miały okres półtrwania, w zasadzie identyczny z okresem półtrwania naturalnie występujących w ustroju przeciwciał ludzkich, co pozwoli na stosowanie mniejszych i mniej czę stych dawek.

Strukturę humanizowanych immunoglobulin można projektować następująco. Zastępuje się aminokwas zrębowy w przeznaczonej do użycia immunoglobulinie ludzkiej (immunoglobulinie akceptorowej) aminokwasem zrębowym z nie-ludzkie] immunoglobuliny dostarczającej CDR (immunoglobuliny donorowej) wówczas, jeśli aminokwas ten mieści się w niżej podanej kategorii:

(a) Jeśli aminokwas w ludzkim regionie zrębowym immunoglobuliny akceptorowej jest nietypowy dla ludzkiej immunoglobuliny w tej pozycji, podczas gdy odpowiedni aminokwas w immunoglobulinie donorowej jest typowy dla immunoglobuliny ludzkiej w tej pozycji;

(b) Jeśli aminokwas ten znajduje się w pozycji bezpośrednio sąsiadującej z jednym z regionów hiperzmiennych (CDR) albo (c) Jeśli dowolny atom łańcucha bocznego aminokwasu zrębowego znajduje się w odległości około 5-6 angstremów (środek do środka) od dowolnego atomu aminokwasu z regionu CDR w trójwymiarowym modelu imimunoglobuliny [Queen i wsp., op. cit. and Co., i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)]. Jeśli każdy z aminokwasów w ludzkim regionie zrębowym immunoglobuliny akceptorowej i odpowiadający mu aminokwas w immunoglobulinie donorowej jest nietypowy dla ludzkiej immunoglobuliny w tej pozycji, to taki aminokwas wymienia się na aminokwas typowy dla immunoglobuliny ludzkiej w tej pozycji.

Korzystnym humanizowanym przeciwciałem jest humanizowana forma mysiego przeciwciała 266. Regiony CDR humanizowanego 266 mają następujące sekwencje aminokwasowe:

CDR1 łańcucha lekkiego:

5 10 15

Arg Ser Ser Gin Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.1)

CDR2 łańcucha lekkiego:

5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID Nr. 2)

CDR3 łańcucha lekkiego:

5

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID Nr. 3)

CDR1 łańcucha ciężkiego:

5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID Nr. 4)

CDR2 łańcucha ciężkiego:

5 10 15

Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 5) i CDR3 łańcucha ciężkiego:

Gly Asp Tyr (SEQ ID Nr. 6).

Korzystny region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała według wynalazku posiada niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, z segmentu Vk, DPK18 i segmentu J, Jk1, z kilkoma substytucjami w aminokwasach konsensusowych w tej samej ludzkiej podgrupie V, celu obniżenia immunogenności:

PL 210 157 B1

5 10 15

Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa 20 25 30

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa 35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110

Gly Thr Xaa Xaa Glu Ile Lys Arg (SEQ ID Nr. 7) w której:

Xaa w pozycji 2 oznacza Val albo Ile;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Thr;

Xaa w pozycji 14 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 15 oznacza Leu albo Pro;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ile albo Val;

Xaa w pozycji 50 oznacza Arg, Gln albo Lys;

Xaa w pozycji 88 oznacza Val albo Leu;

Xaa w pozycji 105 oznacza Gln albo Gly;

Xaa w pozycji 108 oznacza Lys albo Arg i

Xaa w pozycji 109 oznacza Val albo Leu.

Korzystny region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała według wynalazku posiada niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której to sekwencji region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, segmentu VH, DP53 i segmentu J, JH4, z kilkoma substytucjami w aminokwasach konsensusowych w tej samej ludzkiej podgrupie, w celu obniżenia immunogenności:

5 10 15

Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Xaa Leu Val Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75

Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Xaa 80 85 90

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp 95 100 105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr. 8) w której:

Xaa w pozycji 1 oznacza Glu albo Gln;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Leu;

Xaa w pozycji 46 oznacza Glu, Val, Asp albo Ser;

Xaa w pozycji 63 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 75 oznacza Ala, Ser, Val albo Thr;

Xaa w pozycji 76 oznacza Lys albo Arg;

Xaa w pozycji 89 oznacza Glu albo Asp;

Xaa w pozycji 107 oznacza Leu albo Thr.

PL 210 157 B1

Szczególnie korzystny region zmienny łańcucha lekkiego humanizowanego przeciwciała według wynalazku posiada niżej podaną sekwencję aminokwasową, w której to sekwencji region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, z segmentu Vk, DPK18 i segmentu J, Jk1, z kilkoma substytucjami w aminokwasach konsensusowych w tej samej ludzkiej podgrupie V, w celu obniżenia potencjalnej immunogenności:

5 10 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 20 25 30

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln 110

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg (SEQ ID Nr. 9)

Szczególnie korzystny region zmienny łańcucha ciężkiego humanizowanego przeciwciała według wynalazku posiada niżej podaną sekwencję ammokwasową, w której to sekwencji region zrębowy pochodzi z ludzkiej linii komórek zarodkowych, segmentu VH, DP53 i segmentu J, JH4:

5 10 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Leu Val Ala Gln lle Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr 65 70 75

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ala 80 85 90

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 95 100 105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr. 10).

Korzystny łańcuch lekki humanizowanego przeciwciała według wynalazku ma następującą sekwencję ammokwasową:

5 10 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu 20 25 30

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile 35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro 50 55 60

Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 65 70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 80 85 90

Phe Thr Leu Lys lle Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln

PL 210 157 B1

110 115 120

Gly Thr Lys Val Glu lle Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val 125 130 135

Phe lle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

140 145 150

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

155 160 165

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

170 175 180

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

185 190 195

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

200 205 210

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

215

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys (SEQ ID Nr. 11)

Korzystny łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała według wynalazku ma następującą sekwencję aminokwasową:

5 10 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 35 40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

55 60

Glu Leu Val Ala Gln lie Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

70 75

Pro Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr lle Ser Arg Asp Asn Ala

85 90

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

100 105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

110 115 120

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 125 130 135

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

140 145 150

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

155 160 165

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

170 175 180

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

185 190 195

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys

200 205 210

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

215 220 225

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 230 235 240

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

245 250 255

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

260 265 270

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

275 280 285

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

PL 210 157 B1

290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 320 325 330

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 335 340 345

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 350 355 360

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 365 370 375

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 380 385 390

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 395 400 405

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 410 415 420

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 425 430 435

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 440

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys (SEQ ID Nr. 12).

Dla łańcuchów lekkiego i ciężkiego humanizowanych przeciwciał według wynalazku i dla humanizowanego przeciwciała 266 możliwe są również inne sekwencje. Te immunoglobuliny mogą mieć dwie pary kompleksów, łańcuch lekki/łańcuch ciężki, w których przynajmniej jeden łańcuch zawiera jeden lub większą ilość mysich regionów determinujących dopasowanie, funkcyjnie połączonych z ludzkimi segmentami regionu zrębowego.

W innym aspekcie, wynalazek dotyczy rekombinacyjnych polinukleotydów kodujących przeciwciała, które, wytworzone w wyniku ekspresji tychże polinukleotydów, zawierają CDRy w łańcuchach ciężkim i lekkim z przeciwciała według wynalazku. Odnośnie ludzkiego regionu zrębowego, region zrębowy lub sekwencja aminokwasowa regionu zmiennego nie-ludzkiej immunoglobuliny dostarczającej CDRy jest porównywana z odpowiadającymi sekwencjami w kolekcji sekwencji regionów zmiennych immunoglobuliny ludzkiej i jest wybierana sekwencja wykazująca wysoki procent identycznych aminokwasów. Przykładowe polinukleotydy, których ekspresja daje łańcuchy polipeptydowe, zawierające CDRy łańcucha ciężkiego i lekkiego przeciwciała monoklonalnego 266, są przedstawione na fig. 4 i 5. Ze względu na degenerację kodonu i substytucje aminokwasowe nie mające krytycznego znaczenia, sekwencje te można z łatwością zastąpić innymi sekwencjami polinukleotydowymi. Szczególnie korzystne polinukleotydy według wynalazku kodują przeciwciała, które wytworzone w wyniku ekspresji, zawierają regiony hiperzmienne (CDR) odpowiadające sekwencjom SEQ ID Nr. 1 - SEQ ID Nr. 6 lub regiony zmienne odpowiadające sekwencjom SEQ ID Nr. 7 - SEQ ID Nr. 10 albo łańcuchy lekki i ciężki odpowiadające sekwencjom SEQ ID Nr. 11 i SEQ ID Nr. 12.

Polinukleotydy te będą na ogół ponadto zawierały sekwencję polinukleotydową kontrolującą ekspresję, związaną operacyjnie z sekwencjami kodującymi humanizowaną Immunoglobuline, w tym naturalne lub heterologiczne regiony promotora. Korzystnie, sekwencje kontrolujące ekspresję będą eukariotycznymi układami promotora w wektorach zdolnych do transformowania lub transfekowania eukariotycznych komórek gospodarza ale można również użyć sekwencje kontrolne dla gospodarzy prokariotycznych. Po wprowadzeniu wektora do odpowiedniej linii komórek gospodarza, komórki te namnaża się w warunkach umożliwiających wysoki stopień ekspresji tych sekwencji nukleotydowych, i o ile to pożądane, można prowadzić operacje gromadzenia i oczyszczania łańcuchów lekkich, łańcuchów ciężkich, dimerów łańcucha lekkiego i ciężkiego bądź całych przeciwciał, fragmentów łączących i innych form immunoglobuliny.

Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku zdolne ostatecznie do ekspresji żądanych humanizowanych przeciwciał można tworzyć z wielu różnych polinukleotydów (genomowego lub cDNA, RNA, syntetycznych oligonukleotydów, i podobnych) i komponentów (np. regionów V, J, D i C) wykorzystując wiele różnych technik. Łączenie odpowiednich sekwencji genomowych i syntetycznych jest powszechnie stosowanym sposobem produkcji, jednak można również użyć sekwencje cDNA.

PL 210 157 B1

Sekwencje ludzkiego regionu stałego można izolować stosując znane procedury z wielu różnych komórek ludzkich ale korzystnie z unieśmiertelnionych komórek B. Regiony CDR do produkcji immunoglobulin według wynalazku będą podobnie pochodziły z nie-ludzkich przeciwciał monoklonalnych, zdolnych do wiązania się z epitopem pomiędzy aminokwasem 13 a 28 w peptydzie Ae, które to przeciwciała monoklonalne wytwarza się w dowolnym, dogodnym źródle ssaczym obejmującym myszy, szczury, króliki i inne kręgowce mające właściwości wytwarzania przeciwciał, wykorzystując znane sposoby opisane powyżej. Odpowiednie komórki źródłowe dla sekwencji polinukleotydowych i komórki gospodarza do ekspresji i wydzielania immunoglobuliny można uzyskać z wielu źródeł dobrze znanych w stanie techniki.

Poza humanizowanymi immunoglobulinami szczegółowo tu opisanymi, można łatwo projektować i wytwarzać inne zasadniczo homologiczne modyfikowane immunoglobuliny, stosując różne, znane specjalistom, techniki rekombinacji DNA. Przykładowo, regiony zrębowe mogą się różnić od sekwencji natywnych na poziomie struktury pierwszorzędowej kilkoma substytucjami aminokwasowymi, addycjami i delecjami na końcach i w środku sekwencji i podobnymi zmianami. Ponadto, jako podstawę do humanizowanych immunoglobulin według wynalazku można użyć pojedynczo lub w kombinacjach wiele różnych ludzkich regionów zrębowych. W zasadzie, modyfikacji genów można z łatwością dokonywać wieloma różnymi, dobrze znanymi technikami, takimi jak sterowana miejscem mutageneza.

Alternatywnie, można wytwarzać fragmenty polipeptydowe zawierające tylko część pierwszorzędowej struktury przeciwciała, które to fragmenty posiadają jedną lub więcej aktywności immunoglobuliny (np. aktywność wiązania dopełniacza). Takie fragmenty polipeptydowe można wytwarzać przez rozszczepienie proteolityczne całych przeciwciał metodami znanymi w stanie techniki albo przez insercję kodonów stopu w żądanych miejscach w wektorach użytych do sterowanej miejscem mutagenezy, takich jak po CH1, w celu wytworzenia fragmentów Fab albo po regionie zawiasowym, wytwarzając fragmenty F(ab')2. Przeciwciała jednołańcuchowe można wytwarzać przez połączenie genów VL i VH łącznikiem DNA.

Jak podano powyżej, kodujące sekwencje nukleotydowe będą podlegały ekspresji w gospodarzach po ich operacyjnym związaniu z sekwencją kontrolującą ekspresję (usytuowaną tak, aby zapewnić ich funkcjonowanie). Na ogół, takie wektory ekspresyjne replikują się w organizmach gospodarzy albo jako episomy albo jako integralna część chromosomalnego DNA gospodarza. Zazwyczaj, wektory ekspresyjne będą zawierały markery umożłiwiające selekcję, np. marker tetracyklinowy lub neomycynowy, pozwalające na detekcję komórek transformowanych żądanymi sekwencjami DNA.

E. coli jest gospodarzem prokariotycznym szczególnie użytecznym do klonowania polinukleotydów według wynalazku. Do innych gospodarzy mikrobakteryjnych, przydatnych do użycia, należą bakterie z rodzaju Bacillus, takie jak Bacillus subtilis i inne pałeczki jelitowe (Enterobacteriaceae), takie jak Salmonella, Serratia i różne rodzaje Pseudomonas. W tych gospodarzach prokariotycznych można również wbudowywać wektory ekspresyjne, które na ogół będą posiadały sekwencje kontroli ekspresji zgodne z komórką gospodarza (np. źródło replikacji). Ponadto, może się w nich zawierać jeden z wielu znanych promotorów, takich jak układ promotora laktozowego, układ promotora tryptofanowego (trp), układ promotora beta-laktamazy łub układ promotora z faga lambda. Promotory te będą kontrołowały ekspresję, ewentualnie łącznie z sekwencją operatora i będą posiadały sekwencje miejsca wiązania rybosomu i podobne, do inicjowania i zakańczania transkrypcji i translacji.

Do ekspresji można również użyć inne mikroorganizmy, takie jak drożdże. Korzystnym gospodarzem są Saccharomyces z odpowiednimi wektorami posiadającymi sekwencje kontroli ekspresji, takie jak promotory obejmujące sekwencje dla kinazy 3-fosfoglicerynianowej albo innych enzymów glikolitycznych oraz źródło replikacji, sekwencje terminatora i podobne, stosownie do potrzeb.

Poza mikroorganizmami, do ekspresji i produkcji polipeptydów według wynalazku można również użyć hodowle tkankowe ssacze. Faktycznie preferowane są komórki eukariotyczne, gdyż opracowano dotychczas wiele odpowiednich linii komórkowych gospodarzy zdolnych do sekrecji całych immunoglobulin. Należą do nich linie komórek CHO, różne linie komórek COS, linie komórek jajowych chomika syryjskiego, komórki HeLa, korzystnie linie komórek szpiczaka, transformowane komórki B, ludzkie linie embrionalnych komórek nerki albo hybrydoma. Wektorami ekspresyjnymi dla tych komórek mogą być sekwencje kontroli ekspresji, takie jak źródło replikacji, promotor lub wzmacniacz i niezbędne miejsca przetwarzania informacji, takie jak miejsca wiązania rybosomu, miejsca składania RNA, miejsca poliadenylacji i sekwencje zakańczania transkrypcji. Korzystnymi sekwencjami kontroli

PL 210 157 B1 ekspresji są promotory pochodzące z genów immunoglobulin, SV40, Adenowirusa, bydlęcego wirusa brodawek, cytomegalowirusa i podobnych.

Wektory niosące żądane sekwencje nukleotydowe (np. sekwencje kodujące łańcuch ciężki i łańcuch lekki oraz sekwencje kontrolujące ekspresję) można wprowadzać do komórki gospodarza znanymi sposobami, które są zróżnicowane i zależą od typu komórki gospodarza. Przykładowo, transfekcję z użyciem chlorku wapnia powszechnie stosuje się w odniesieniu do komórek prokariotycznych a traktowanie fosforanem wapnia bądź elektroporację można stosować wobec komórek innych gospodarzy.

Po ekspresji, całe przeciwciała, ich dimery, poszczególne łańcuchy lekkie i ciężkie lub inne formy immunoglobuliny według wynalazku miożna oczyszczać stosując standardowe procedury znane ze stanu techniki, w tym strącanie siarczanem amonowym, chromatografię kolumnową jonowymienną, powinowactwa, z odwróconymi fazami, chromatografię z wykorzystaniem oddziaływania hydrofobowego, elektroforezę w żelu i podobne. Korzystne są zasadniczo czyste immunoglobuliny, o homogenności co najmniej około 90 do 95% a najkorzystniejsze do celów farmaceutycznych są immunoglobuliny o homogenności 98 do 99%. Po oczyszczeniu częściowym lub do żądanej homogenności, polipeptydy te można stosować do celów leczniczych lub profilaktycznych, jak opisano powyżej.

Przeciwciała (w tym fragmenty aktywne immunologicznie) podaje się osobnikowi zagrożonemu lub takiemu, u którego wystąpiły już objawy lub patologie związane z peptydem Ae, takie jak kliniczna lub przedkliniczna faza choroby Alzheimera, zespół Downa lub kliniczna bądź przedkliniczna faza angiopatii amyloidowej, stosując standardowe techniki podawania, korzystnie obwodowe (czyli nie przez podawanie do ośrodkowego układu nerwowego), drogą dożylną, dootrzewnową, podskórną, dopłucną, transdermalną, domięśniową, donosową, dopoliczkową, podjęzykową lub przez podanie czopka. Jakkolwiek przeciwciała można podawać bezpośrednio do układu komorowego, płynu rdzeniowego lub miąższu mózgu a techniki dostarczania do tych miejsc są dobrze znane, nie ma potrzeby stosowania tych znacznie trudniejszych procedur. Przeciwciała według wynalazku są skuteczne po podaniu prostszymi technikami opartymi na dostarczaniu do obwodowego układu krążenia. Korzyści z wynalazku obejmują zdolność przeciwciała do wywierania korzystnego działania nawet wówczas, gdy nie jest ono dostarczone bezpośrednio do samego ośrodkowego układu nerwowego. Rzeczywiście, wykazano w niniejszym opisie, że ilość przeciwciała, która przechodzi przez barierę krew-mózg wynosi <0,1% jego poziomu w osoczu i że przeciwciała według wynalazku mają zdolność sekwestrowania Ae również w krążeniu obwodowym, zmieniając klirens rozpuszczalnego peptydu Ae w o.u.n. i w osoczu.

Kompozycje farmaceutyczne przeznaczone do stosowania projektuje się tak, aby były odpowiednie do wybranego sposobu podawania. Stosuje się w nich, stosownie do potrzeb, dopuszczalne farmaceutycznie substancje pomocnicze, takie jak środki dyspergujące, bufory, środki powierzchniowo-czynne, środki konserwujące, solubilizujące, środki nadające izotoniczność, środki stabilizujące i podobne. Encyklopedia Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton PA, ostatnie wydanie, włączona do niniejszego opisu jako odnośnik, dostarcza całej wiedzy o technikach sporządzania preparatów farmaceutycznych i jest ogólnie znana specjalistom sporządzającym formy leków. Może się okazać szczególnie użyteczna zmiana właściwości rozpuszczalności przeciwciał według wynalazku tak, aby stały się bardziej lipofilowe, np. przez ich enkapsulację w liposomach albo przez zablokowanie grup polarnych.

Korzystne jest dostarczanie układowe obwodowe przez iniekcje dożylne, dootrzewnowe albo podskórne. Nośniki odpowiednie do takich iniekcji są proste. Ponadto, przeciwciała te można dostarczać również przez błony śluzowe, podając aerozole lub czopki. Odpowiednie receptury dla tych sposobów stosowania są dobrze znane i zazwyczaj zawierają środki powierzchniowoczynne; ułatwiające przenikanie przez błonę. Te środki powierzchniowoczynne są często pochodnymi steroidowymi albo lipidami kationowymi, takimi jak chlorek N-[1-(2,3-dioleoilo)propylo-N,N,N-trimetyloamoniowy (DOTMA) albo różnymi związkami, takimi jak hemibursztynian cholesterolu, fosfatydyloglicerole i podobnymi.

Stężenie humanizowanego przeciwciała w preparatach będzie się zawierać w szerokich granicach, od tak niskiego jak około 0,1% do tak wysokiego jak 15 lub 20% wagowych i będzie ono dobrane głównie w oparciu o objętości płynów, lepkości i podobne czynniki, stosownie do wybranej konkretnej drogi podania. Tak więc, typowa kompozycja farmaceutyczna do iniekcji może być tak sporządzona, aby zawierała 1 ml sterylnej, buforowanej fosforanem soli fizjologicznej i 1-100 mg humanizowanego przeciwciała według wynalazku. Tę kompozycję sterylizuje się przez filtrację po jej sporządzeniu

PL 210 157 B1 albo w inny sposób przygotowuje się kompozycję akceptowaną pod względem mikrobiologicznym. Typowa kompozycja do infuzji dożylnej powinna mieć objętość nawet 250 ml cieczy, takiej jak sterylny roztwór Ringera i stężenie przeciwciała wynoszące 1-100 mg/ml lub większe.

Środki terapeutyczne według wynalazku można zamrażać albo liofilizować do przechowywania i rekonstytuowania przed użyciem w odpowiednim sterylnym nośniku. Liofilizacja i rekonstytucja może się wiązać z różnym stopniem spadku aktywności przeciwciała (np. wiadomo, że znane immunoglobuliny, przeciwciała IgM mają większą tendencję do spadku aktywności niż przeciwciała IgG). Dla wyrównania tych strat, powinny być odpowiednio dobrane dawki. Wartość pH tych preparatów powinna być tak dobrana, aby zachować równowagę pomiędzy stabilnością przeciwciała (chemiczną i fizyczną) a komfortem dla pacjenta podczas podawania. Na ogół, tolerowane jest pH w zakresie od 4 do 8.

Jakkolwiek powyższe metody wydają się najbardziej dogodne i najodpowiedniejsze do podawania białek, takich jak humanizowane przeciwciała to również, przy odpowiedniej adaptacji, mogą być stosowane inne techniki podawania, takie jak stosowanie transdermalne i doustne, pod warunkiem, że będzie opracowana właściwa forma preparatu farmaceutycznego.

Może być poza tym pożądane stosowanie preparatów o kontrolowanym uwalnianiu, z użyciem błon i matryc biodegradowalnych albo mini-pomp osmotycznych względnie układów dostarczania opartych na perełkach dekstranowych, alginianach bądź kolagenie.

Podsumowując, są dostępne preparaty do podawania przeciwciał według wynalazku, są one dobrze znane ze stanu techniki i mogą być dobrane spośród wielu możliwości.

Typowe zakresy dawek można optymalizować, wykorzystując standardowe techniki kliniczne. Dawki te będą zależne od sposobu stosowania i stanu pacjenta.

Poniższe przykłady są zamieszczone dla ilustracji wynalazku, nie mają one na celu ograniczenia jego zakresu.

W przykładach tych użyto między innymi mysie przeciwciało monoklonalne oznaczone symbolem 266, które po raz pierwszy wytworzono przez immunizację peptydem złożonym z reszt 13-28 ludzkiego peptydu Ap. Potwierdzono, że przeciwciało to wchodzi w reakcję immunologiczną z tym peptydem, jednak uprzednio doniesiono, że nie reaguje ono z peptydem zawierającym jedynie reszty 17-28 ludzkiego peptydu Ap ani z żadnym innym epitopem w obrębie peptydu Ap. Wytwarzanie tego przeciwciała jest opisane w publikacji patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.766.846, wprowadzonej do niniejszego opisu jako odnośnik. Ponieważ w przykładach opisane są doświadczenia prowadzone w układach mysich, użycie mysich przeciwciał monoklonalnych jest wystarczające. Jednakże w sposobach leczenia według wynalazku, mających zastosowanie u ludzi, korzystne są humanizowane formy przeciwciał o swoistości immunologicznej właściwej dla przeciwciała 266.

P r z y k ł a d 1.

Sekwestrowanie dodanego peptydu Ap w płynach ludzkich

Próbki ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) (po 50 ul) i osocza ludzkiego (po 50 ul) inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej następująco:

1. sama próbka

2. łącznie z 5 ng peptydu Ap 40 albo

3. łącznie z 5 ng peptydu Ap 40 plus 1 mg przeciwciała monoklonalnego 266 (opisanego np. w publikacji patentu Stanów Zjednoczonych Ameryki, US 5.766.846 wprowadzonego do niniejszego opisu jako odnośnik).

Próbki poddano elektroforezie w nie-denaturującym gradiencie 4-25% żelu, czyli nie-denaturującej elektroforezie gradientowej (NDGGE) i przeniesiono na filtry nitrocelulozowe. Następnie wizualizowano materiał na filtrze przez barwienie odczynnikiem Ponceau S a w przypadku Western-blottingu, jako sondę użyto znakowane biotyną przeciwciało monoklonalne (3D6), które reaguje z pierwszymi pięcioma aminokwasami peptydu Ap, sondę wywoływano kompleksem: streptawidyna-peroksydaza chrzanowa i wykrywano metodą wzmocnionej chemiluminescencji (ECL). Średnice w stanie uwodnienia mas cząsteczkowych materiałów zawartych w prążkach na filtrach oznaczano wobec markerów mas cząsteczkowych firmy Pharmacia. Tak więc, jeśli peptyd Ap jest związany z innymi cząsteczkami, to powinien wędrować do miejsca charakterystycznego dla wielkości cząsteczki wytworzonego kompleksu.

Western blottingi płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) bez dodatku lub z dodatkiem 5 ng peptydu Ap nie wykazywały dowodu na obecność peptydu Ap przy detekcji z udziałem przeciwciała 3D6. Podobne wyniki otrzymano dla osocza ludzkiego. Było to prawidłowe, pomimo faktu, że peptyd Ap

PL 210 157 B1 powinien być wykryty metodą SDS-PAGE z następnym Western-blottingiem, tą samą techniką i na tych samych próbkach CSF. Prawdopodobnie, detekcji peptydu Αβ przeszkadzały interakcje między tym peptydem a innymi czynnikami w testowanych płynach. Jednakże, jeśli do mieszaniny inkubacyjnej dodano Mab 266, to występowały charakterystyczne prążki reprezentujące sekwestrowany peptyd Ae skompleksowany z przeciwciałem, zarówno w osoczu jak i w CSF. Cząsteczki w głównym prążku miały średnicę w stanie uwodnionym około 11 nm, co odpowiada monomerowi przeciwciała. Dodatkowy mniejszy prążek zawierał cząsteczki o średnicy 13 nm, co odpowiada dimerowi przeciwciała.

P r z y k ł a d 2.

Swoistość sekwestrującego przeciwciała

W doświadczeniu użyto próbki zawierające po 50 Ae ludzkiego CSF albo po 10 μl CSF od myszy APP^V717F. Myszy APP^V717F są myszami transgenicznymi reprezentującymi mysi model choroby Alzheimera. Zachodzi w nich ekspresja transgenu dla białka prekursorowego ludzkiego amyloidu z mutacją rodzinnej choroby Alzheimera, co powoduje, że w ośrodkowym układzie nerwowym wytwarzany jest ludzki peptyd Ae.

Próbki inkubowano z dodatkiem lub bez dodatku różnych przeciwciał monoklonalnych (Mab) w ilości po 1 μg, przez godzinę w temperaturze pokojowej i następnie poddano je elektroforezie w 4-25% NDGGE. Prążki przenoszono na nitrocelulozę i sondowano, jak w przykładzie 1. Użyto następujące przeciwciała:

Mab 266 (wiąże się w pozycjach 13-28);

Mab 4G8 (wiąże się w pozycjach 17-24);

QCBpan (przeciwciało poliklonalne królika dla pozycji 1-40);

Mysią IgG (nie-swoista);

Mab 3D6 (wiąże się w pozycjach 1-5);

Mab 21F12 (wiąże się w pozycjach 33-42);

Mab 6E10 (wiąże się w pozycjach 1-17) i

QCB40,42 (przeciwciała poliklonalne królika dla Ae40 i Ae42).

Detekcję kompleksu peptydu Ae z przeciwciałem prowadzono w sposób opisany w przykładzie 1, z użyciem wyznakowanego biotyną 3D6 (dla N-końca peptydu Ae) i następnie kompleksu: streptawidyny-peroksydaza chrzanowa z detekcją ECL. Podobną detekcję prowadzono w próbkach ludzkiego CSF inkubowanych z Mab 266, wywoływanych przeciwciałem 3D6, w niektórych przypadkach zastąpionym przez QCB40,42, które wiąże się z końcem karboksylowym peptydu Ae, dla 3D6.

Doświadczenia wykazały, że spośród testowanych przeciwciał, tylko Mab 4G8 i Mab 266 pozwalały na detekcję peptydu Ae.

Wyniki pokazały, że w ludzkim CSF, tylko Mab 266 i Mab 4G8 miały zdolność sekwestrowania, w wykrywalnych ilościach, kompleksu przeciwciało-Ae (również w tym przypadku, bez dodania przeciwciała nie wykrywano Ae). Mab 266 dawało również wyniki podobne do tych, jakie uzyskano dla ludzkiego CSF w doświadczeniach z CSF pochodzącym od transgenicznych myszy APP^V717F. Peptyd Ae mógł być sekwestrowany w ludzkim CSF w próbach z użyciem Mab 266 niezależnie od tego, czy do wywoływania biotów w Western-blottingu było użyte przeciwciało 3D6 czy QCB40,42.

P r z y k ł a d 3.

Demonstrowanie kompleksu peptyd Ae - Mab 266 w dwukierunkowej elektroforezie

Próbkę zawierającą 50 ng peptydu Ae₄₀ mkubowano z ilością 2 μg Mab 266 w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Jako kontrolę prowadzono równoległą inkubację z samym Mab 266. Następnie próbki poddano dwukierunkowej elektroforezie. W pierwszym kierunku, inkubowane próbki rozwijano techniką NDGGE, jak opisano w przykładzie 1. Żel poliakryloamidowy cięto na poszczególne pasma, prostopadle do kierunku rozwijania w pierwszym kierunku a w drugim kierunku przeprowadzono rozdział w żelu w warunkach denaturujących/redukujących metodą SDS-PAGE (w żelu Tricine-mocznik). Obecność prążka wykrywano albo metodą barwienia odczynnikiem Ponceau-S (każde białko) albo metodą specyficznego wywoływania z użyciem przeciwciała 6E10 Mab (Senetek Inc.) i biotynylowanego anty-mysiego Ae w układzie detekcji opartym na peroksydazie chrzanu (HRP).

Barwienie odczynnikiem Ponceau-S blotów na nitrocelulozie po przeniesieniu umożliwiło wizualizację łańcuchów ciężkiego i lekkiego samego Mab 266. Potwierdzono, że peptyd Ae znajdował się w kompleksie z Mab 266, gdyż wystąpił prążek przy 4 kD, odpowiadający wielkości Mab 266 o pełnej długości widocznemu po elektroforezie NDGGE w pierwszym kierunku.

PL 210 157 B1

P r z y k ł a d 4.

Wykazanie nierównoważności wiązania i sekwestrowania

Jako, że peptyd Ap krąży w osoczu i w CSF, sądzi się, że znajduje się on w kompleksie z białkami, w tym z apolipoproteiną E. W niniejszym przykładzie wykazano, że przeciwciała przeciw apoE, chociaż mają zdolność wiązania się z kompleksem, nie sekwestrują apoE z pozostałej reszty kompleksu.

Kompleksy apoE (500 ng) inkubowano z Mab lub z przeciwciałami poliklonalnymi przeciw apoE (2 ug) w temperaturze 37°C, przez godzinę. Po inkubacji, próbki poddano elektroforezie NDGGE z użyciem technik opisanych w przykładzie 1. Po NDGGE przeprowadzono Western-blotting z użyciem oczyszczonych metodą powinowactwa kozich przeciwciał anty-apoE, z detekcją ECL. Jeśli przeciwciało jest nieobecne, wówczas apoE można wykryć w paśmie 8-13 nm odpowiadającym jej obecności w cząsteczkach lipoproteiny. Obecność monoklonalnych lub poliklonalnych przeciwciał przeciw apoE powoduje przesunięcie populacji apoE w kierunku związków o większych masach cząsteczkowych, tak zwane super przesunięcie (super shift). Jest to dowodem na fakt, że przeciwciała przeciw apoE nie sekwestrują, czyli nie usuwają apoE z cząsteczki lipoproteinowej, natomiast wiążą się z apoE na lipoproteinach wytwarzając cząsteczki o większych masach cząsteczkowych.

P r z y k ł a d 5.

Przeciwciała anty-apoE nie zaburzają sekwestrowania Ap

Próbkę 100 ul ludzkiego CSF inkubowano albo z samym Mab 266 albo z poliklonalnym anty-apoE albo z obydwoma przeciwciałami, w czasie 60 minut w temperaturze 37°C. Próbki analizowano metodą NDGGE, jak opisano w przykładzie 1 i następnie prowadzono detekcję prążków w sposób opisany w przykładzie 1.

Wyniki doświadczenia wskazują, że jeśli do próbki był dodany Mab 266, wówczas był widoczny prążek odpowiadający średnicy około 11 nm, charakterystycznej dla zsekwestrowanego kompleksu: Mab 266-peptyd Ap. Jest to przypadek, w którym anty-apoE jest obecne lub nieobecne. Ten prążek, reprezentujący zsekwestrowany Ap, pojawiał się również jeśli do mieszaniny inkubacyjnej zawierającej Mab 266 dodano 50 ng peptydu Ap. Tak więc, zmiana masy cząsteczkowej apoE w obecności przeciwciał anty-apoE nie zakłóca sekwestrowania peptydu Ap przez Mab 266.

P r z y k ł a d 6.

Sekwestrowanie peptydu Ap in vivo

A. W transgenicznych myszach APP^V717F, znanych również pod nazwą myszy PDAPP, zachodzi nadekspresja zmutowanej formy ludzkiego białka APP. Myszy te wytwarzają ludzki Ap w ośrodkowym układzie nerwowym i mają podwyższony poziom ludzkiego peptydu Ap krążącego w CSF i w osoczu. Myszom ośmiomiesięcznym wstrzykiwano dożylnie sól fizjologiczną lub 100 ug Mab 266. Od myszy pobierano krew po 10 minutach od początkowej iniekcji i po 20 godzinach od początkowej iniekcji.

Próbki zawierające po 20 ul osocza od każdego zwierzęcia analizowano metodą NDGGE z Western-blottingiem, z sondą przeciwciała 3D6, jak to opisano w przykładzie 1. U zwierząt traktowanych solą fizjologiczną nie wykazano obecności prążka odpowiadającego średnicy 11 nm, charakterystycznego dla sekwestrowanego peptydu Ap przy średnicy 11 nm ani po 10 minutach ani po 20 godzinach. Jednakże u dwu zwierząt, którym wstrzyknięto Mab 266 był widoczny ten prążek w osoczu pobranym po 20 godzinach.

B. W tym badaniu użyto dwie miesięczne myszy APP^V717F. W dniu 0, myszom nie podano wcale Mab 266, podano 1 mg Mab 266 albo 100 ug tego przeciwciała. Pobierano próbki osocza na dwa dni przed podaniem przeciwciał i w dniach 1, 3, 5 17. Próbki osocza analizowano metodą NDGGE z następnym Western-blottingiem i detekcją przeciwciałem 3D6, jak opisano w przykładzie 1. We wszystkich punktach czasowych po podaniu Mab 266, wykrywano kompleks 266/Ap, o ile próbka osocza nie była traktowana białkiem G, które wiąże się z immunoglobuliną, usuwając przez to skutecznie Mab 266. Oznaczano zgodne poziomy kompleksu w badanym czasie za wyjątkiem lekkiego spadku w siódmym dniu u zwierząt, którym wstrzyknięto 100 ug Mab 266. Generalnie, poziomy kompleksu u zwierząt, którym podano 100 ug były zgodnie niższe od poziomów oznaczonych u myszy, którym podano 1 mg tego przeciwciała.

C. Dwóm dwumiesięcznym myszom APP^V717F podano dożylnie po 1 mg Mab 266 i od każdej myszy pobrano próbkę osocza po 25 ul. Próbkę osocza analizowano metodą NDGGE, następnie prowadzono Western-blotting, jak opisano powyżej, z tym wyjątkiem, że po związaniu z biotynylowanym przeciwciałem 3D6 prowadzono detekcję streptawidyną ¹²⁵J (Amersham) i ekspozycję na kliszę właściwą dla substancji znakowanych izotopem fosforu. Poziom kompleksu oceniano przez porównanie

PL 210 157 B1 z krzywą standardową sporządzona na znanych ilościach Ae40 skompleksowanego z wysycającymi ilościami Mab 266 i prowadząc podobną detekcję. Ilość peptydu Ae związanego z Mab 266 szacowano na około 100 ng/ml, co oznacza mniej więcej 1000-krotny wzrost ponad poziom endogennego peptydu Ae u tych myszy, oznaczony na około 100 pg/ml. Jest to poziom podobny również do poziomu peptydu Ae w mózgu myszy APP^V717F przed odłożeniem się złogów Ae (50-100 ng/g). Ludzki APP i ludzki Ae u myszy APP^V717F Tg jest wytwarzany prawie wyłącznie w mózgu. Okazuje się zatem, że obecność Mab 266 w osoczu działa jak zatapiacz peptydu Ae, ułatwiając jego wypływ netto z ośrodkowego układu nerwowego i osocza. Ten zwiększony wypływ netto prawdopodobnie wynika zarówno ze zwiększonego wypływu Ae z o.u.n. do osocza jak i z zapobiegania temu, aby Ae obecny w osoczu powtórnie wnikał do mózgu.

Prawidłową wielkość sekwestrowanego peptydu Ae potwierdzono przez elektroforezę próbek po 20 μl osocza, uzyskanego od myszy APP^V717F po 24 godzinach od iniekcji 1 mg Mab 266 metodą SDS-PAGE w żelu TRIS-tricine i następny blotting typu Western z użyciem przeciwciała 6E10 anty-Ae przed lub po ekspozycji na białko G, w postaci perełek ze związanym białkiem G. Prążek, który nie zawierał białka G był wykrywany w paśmie 4-8 kD, co jest zgodne z obecnością monomerów i prawdopodobnie dimerów peptydu Ae.

A. Dwóm dwumiesięcznym myszom APP^V717F podano dootrzewnowe albo PBS (n=7) albo 500 μg biotynylowanego Mab 266, czyli m266B (n=9). Przed iniekcją, i po 24 godzinach od podania iniekcji, analizowano osocze na całkowity peptyd Ae metodą ELISA, zmodyfikowaną według Johnsona-Wooda K. i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550-1555] i Balesa K. R., i wsp. [Nature Genet (1997) 17: 263-264]. Całkowitą ilość Ae związanego z m266B oznaczano w 96-dołkowych płytkach Optiplates (Packard, Inc.) powleczonych przeciwciałem m3D6. Rozcieńczone próbki osocza i standardy (różne stężenia Ae40 i m266B) inkubowano przez noc w powleczonych płytkach i oznaczano ilość całkowitego kompleksu Ae/m266B metodą z użyciem ¹²⁵J-streptawidyny. Ponadto, w punkcie czasowym 24-tej godziny, próbki osocza na początku traktowano białkiem G, w celu ilościowego oznaczenia peptydu Ae nie związanego z Mab 266, a następnie oznaczano w płynie mózgowo-rdzeniowym całkowity Ae (AeTotal) i Ae42 metodą ELISA. U zwierząt traktowanych PBS, poziomy peptydu Ae w osoczu wynosiły 140 pg/ml zarówno przed jak i po iniekcji. Poziomy w osoczu były podobne jak przed iniekcją u myszy, którym wstrzyknięto Mab 266, ale poziomy peptydu Ae nie związanego z Mab 266 były niewykrywalne po 24 godzinach od iniekcji.

Oznaczano również poziomy w CSF. CSF reprezentuje przedział pozakomórkowy w ośrodkowym układzie nerwowym i stężenie cząsteczek w CSF jest w pewnym stopniu odzwierciedleniem stężenia substancji w przestrzeni pozakomórkowej mózgu. CSF pobierano ze zbiornika móżdżkowo-rdzeniowego. Myszy usypiano pentobarbitalem i usuwano umięśnienie od podstawy czaszki do pierwszego kręgu. CSF zbierano przez ostrożne nakłucie mikroigłą pod mikroskopem preparacyjnym błony pajęczynówkowej okrywającej zbiornik i wyciągnięcie CSF do mikropipepty polipropylenowej. Po 24 godzinach od iniekcji, stwierdzono wzrost poziomu całkowitego peptydu Ae w CSF u myszy, którym wstrzyknięto Mab 266 i około dwukrotny wzrost w poziomie Ae42, w porównaniu z poziomem u myszy, którym podano PBS. Potwierdzono to wykonując elektroforezę w żelu denaturującym i następny Western-blotting z Ae42-swoistym przeciwciałem 21F12.

W dodatkowym doświadczeniu, trzy-miesięcznym myszom APP^V717F Tg wstrzyknięto albo PBS albo Mab 266 dożylnie i oznaczano poziomy Ae40 i Ae42 w sposób następujący:

W celu oznaczenia Ae40, użyto przeciwciało monoklonalne m2G3, swoiste względem Ae40. Próbę ELISA opisaną przez Johnsona-Wooda K. i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550 -1555) zmodyfikowano przekształcając ją w próbę radioimmunologiczną (RIA), przez zastąpienie odczynnika streptawidyna-HRP wyznakowaną ¹²⁵J-streptawidyną. Dla próbek osocza i CSF prowadzono procedurę w warunkach niedenaturujących, nie stosując guanidyny w buforach. W celu oznaczenia w homogenacie mózgu Ae rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego w węglanie, próbki homogenizowano w temperaturze 4°C, w roztworze o składzie: 100 mM węglanu, 40 mM NaCl (pH 11,5), wirowano z szybkością 10.000 x g przez 15 minut i oznaczano Ae we frakcjach supernatantu (rozpuszczalny) i peletki (nierozpuszczalny), według opisu podanego w publikacji: Johnson-Wood K. i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94: 1550-1555) przytoczonej powyżej. Oznaczenie kompleksu Ae/Mab 266 w osoczu prowadzono modyfikowaną próbą radioimmunologiczną. Myszom wstrzyknięto biotynylowane Mab 266 (Mab 266B) i izolowano osocze z próbek krwi pobieranych w wielu punktach czasowych. Całkowity Ae związany z Mab 266 oznaczano w płytkach 96-dołkowych Optiplates (Packard, Inc.) powleczonych przciwciałem m3D6. Rozcieńczone próbki osocza i standardy (różne stężenia Ae40

PL 210 157 B1 i Mab 266B) inkubowano przez noc w powleczonych płytkach i oznaczano ilość całkowitego kompleksu Αβ/Mab 266B metodą z użyciem ¹²⁵J-streptawidyny.

Po trzech godzinach od dożylnego podania Mab 266, obserwowano dwukrotny wzrost poziomu Αβ₄₀ w CSF i nieznaczny wzrost poziomu Αβ₄₂. Jednakże, zarówno po 24 jak i po 72 godzinach wzrastały dwu- do trzykrotnie poziomy zarówno Ae₄₀ jak i Ae₄₂ w CSF. Podobne wyniki uzyskano prowadząc analizę w żelu denaturującym z następnym Western-blottingiem na obecność Ae w połączonych płynach CSF. Wypływ Ae przez płyn tkankowy mózgu, będący w pewnym stopniu odzwierciedleniem poziomu w CSF, jest prawdopodobnym wytłumaczeniem obserwowanego wzrostu Ae w CSF.

Jest ważne, że zmiana w poziomach peptydu Ae w CSF nie może być spowodowana wniknięciem Mab 266 do CSF, gdyż jego poziomy mierzone po 24 godzinach od iniekcji, wynoszące poniżej 0,1% poziomu Mab 266 w osoczu, są niewystarczające aby wytłumaczyć tę zmianę. Powyższe wyniki sugerują, że peptyd Ae jest usuwany z miąższu mózgu do CSF dzięki obecności przeciwciała w układzie krążenia krwi.

Formy peptydu Ae rozpuszczalne w PBS lub w buforze węglanowym oznaczano w homogenatach kory mózgowej u tych samych myszy, którym wstrzyknięto Mab 266 i u których analizowano CSF w sposób opisany powyżej. Obserwowano podobne wzrosty w poziomach tych rozpuszczalnych form w homogenatach kory mózgowej.

P r z y k ł a d 7.

Mab 266 działa jak zatapiacz peptydu Ae in vitro

Skonstruowano komorę dializacyjną, działającą jako system in vitro do badania zdolności Mab 266, do działania jako zatapiacz peptydu Ae. W górnej komorze rurki polipropylenowej oddzielonej od dolnej komory membraną dializacyjną specyficznie odcinającą cząsteczki o masach cząsteczkowych w zakresie 10-100 kD umieszczono jeden ml ludzkiego CSF. Dolna komora zawierała 75 μl PBS z dodatkiem lub bez dodatku 1 μg Mab 266.

Stan równowagi ustalał się po 3 godzinach, co oznaczono przez zbadanie materiału w dolnej komorze metodą elektroforezy w różnych punktach czasowych w kwaśnych żelach mocznikowych i następnie metodą blottingu typu Western na obecność peptydu Ae, stosując jako sondę przeciwciało 6E10. Próbki denaturowano w kwasie mrówkowym do końcowego stężenia 80% (objętościowo) i redukowano 1%-owym e-merkaptoetanolem. Próbki poddano elektroforezie (od anody do katody) w buforze do rozwijania, 0,9 M kwasie octowym, w gradiencie od 4% do 35% żelu poliakryloamidowego, zawierającego 6 M mocznika, 5% (objętościowo) lodowatego kwasu octowego i 2,5% odczynnika TEMED. Przed przeniesieniem na filtr nitrocelulozowy zobojętniano kwaśny odczyn żelu. Następnie, do identyfikacji Ae zastosowano standardowe techniki Western-blottingu. Wykryte prążki odpowiadały masie cząsteczkowej 4 kD.

Następnie oznaczono ilość Ae usuniętego z górnej komory przez analizę techniką ELISA zawartości obydwu komór, górnej i dolnej (n=4) po 3 godzinach. Wyniki dla różnych odcięć mas cząsteczkowych w obecności i w nieobecności Mab 266 są przedstawione na fig. 1. Jak to jest widoczne na figurze, jedynie minimalne ilości peptydu Ae przechodziły przez membranę, jeśll w dolnej komorze znajdował się PBS, natomiast 50% peptydu Ae ulegało sekwestrowaniu w dolnej komorze jeśli znajdował się w niej Mab 266 a masa cząsteczkowa odciętej frakcji wynosiła 25 kD; wzrastające ilości przenikały przez membranę wraz ze wzrostem odcinanych mas cząsteczkowych do 100 kD, gdzie prawie 100% peptydu Ae przeszło przez tę membranę.

Zaobserwowano również, że przeciwciała 3D6 i 10D5, przeciw N-końcowi Ae, mają zdolność przeciągania peptydu Ae przez membranę w tym układzie, jakkolwiek nie mają właściwości sekwestrowania peptydu Ae w analizach opisanych w przykładzie 1. Wyniki doświadczenia wskazują, że przeciwciała przeciw peptydowi Ae mają powinowactwo w warunkach doświadczenia wystarczające do sekwestrowania tego peptydu z innych białek wiążących w roztworach fizjologicznych, ale przeciwciała monoklonalne takie jak Mab 266, które wchodzą w reakcję immunologiczną z epitopem w pozycjach 13-28, są znacząco bardziej efektywne i wiążą się z większym powinowactwem.

W podobnych próbach, wydzielana przez astrocyty apoE, którą oczyszczano w sposób opisany przez DeMattos'a R. B. i wsp. [J. Biol. Chem. (1998) 273: 4206-4212], Sun'a Y. i wsp. [J. Neurosci. (1998) 18: 3261-3272] wywierała mały, ale statystycznie znaczący wpływ, na wzrost masy peptydu Ae w dolnej komorze. Nie zaobserwowano żadnego widocznego wpływu w przypadku, gdy zamiast Mab 266 użyto poliklonalną IgG albo BSA.

PL 210 157 B1

P r z y k ł a d 8.

Przepływ peptydu Ae z ośrodkowego układu nerwowego do osocza

A. Jeden ug peptydu Ae₄₀ rozpuszczono w 5 ul CSF szczura aby utrzymywać go w stanie rozpuszczonym i wstrzyknięto go do przestrzeni podpajęczynówkowej zbiornika móżdżkowo-rdzeniowego myszy rasy Swiss-Webster typu dzikiego. Myszom tym uprzednio podano dożylne iniekcje albo PBS (n=3) albo 200 ug biotynylowanego Mab 266 (n=3). W różnych punktach czasowych od traktowania oznaczano poziom całkowitego Ae (Ap_Total) w osoczu myszy metodą Ae ELISA, z użyciem 3D6 jako przeciwciała powlekającego i standardów Ae zmieszanych z nadmiarem biotynylowanego Mab 266. Każdą próbkę osocza po pobraniu od każdego zwierzęcia, wysycano nadmiarem biotynylowanego Mab 266 w celu detekcji Ae techniką ELISA. U myszy, którym wstrzyknięto PBS występowały minimalne wykrywalne ilości tego peptydu, dając poziomy 0,15 ng/ml jako wartości szczytowe po 30-60 minutach i po tym czasie poziomy spadały w zasadzie do zera. U myszy, którym podano Mab 266 poziom peptydu Ae w osoczu osiągnął po 60 minutach wartości 330-krotnie wyższe od wykrytych u myszy, którym wstrzyknięto PBS (około 50 ng/ml) a po 180 minutach poziom ten wzrósł do wartości średnio 90 ng/ml.

B. Powtórzono powyższą procedurę, wstrzykując dożylnie dawki 200 ug (n=3) albo 600 ug (n=3) dwumiesięcznym myszom APP^V717F. Mab 266 wstrzyknięto dożylnie 3-miesięcznym myszom APP^V717F+/+ w powyższych dawkach. Przed iniekcją i w różnych punktach czasu po iniekcji dożylnej, oznaczano stężenie w osoczu Ae związanego z Mab 266 metodą radioimmunologiczną. Szczegółowe wyniki dla jednej przykładowej myszy są przedstawione na fig. 2.

Okazało się, że stężenie Ae związanego z przeciwciałem monoklonałnym Mab 266 wzrosło w ciągu 4 dni z poziomów wyjściowych 150 pg/ml do poziomów ponad 100 ng/ml. Z analizy wczesnych punktów czasowych na krzywej wyliczono, że szybkość wnikania netto AeTotal do osocza myszy APP^V717F Tg wynosiła 42 pg/ml/minutę wobec wysycających poziomów tego przeciwciała.

Badanie wpływu Mab 266 na poziomy Ae w osoczu, zarówno u myszy typu dzikiego jak i myszy APP^V717F Tg, jak również wpływu tego przeciwciała na stężenie Ae w CSF wykazało, że obecność Mab 266 krążącego we krwi powoduje zmianę w równowadze przepływu Ae lub w jego transporcie pomiędzy ośrodkowym układem nerwowym a osoczem.

P r z y k ł a d 9.

Wpływ Mab 266 na Ae w mózgu

Czteromiesięcznym myszom APP^V717F+/+ podawano co 2 tygodnie przez 5 miesięcy dootrzewnowe iniekcje soli fizjologicznej, Mab 266 (500 ug) albo kontrolną IgG mysią (100 ug, Pharmigen). Myszy uśmiercano w wieku 9 miesięcy i oznaczano odkładanie się Ae w korze mózgowej.

Ilościowo oznaczano procent powierzchni objętej reaktywnością immunologiczną Ae zidentyfikowaną przeciwciałem pan-Ae królika (QCB, Inc.) w korze mózgowej bezpośrednio pokrywającej grzbietową część hipokampa, w sposób opisany przez Holtzmana D. M. i wsp. [Ann. Neurol. (2000) 97: 2892-2897]. Wyniki są przedstawione na fig. 3A. Na tym etapie, u około połowy zwierząt z każdej grupy nie zaczęło się odkładanie Ae. Jednakże, procent myszy z poniżej 50% obciążeniem Ae w korze mózgowej był znacząco niższy (p=0,02, test Chi-kwadrat) w grupie zwierząt traktowanych Mab 266. Jakkolwiek u myszy APP^V717F w ciągu 9 miesięcy mogą się odłożyć bardzo duże ilości złogów Ae, to zaznacza się duża zmienność. U około 50% myszy nie obserwuje się złogów a u około 50% występują znaczne złogi. U myszy traktowanych PBS i IgG, odpowiednio 6/14 i 5/13 myszy miało powyżej 50% kory mózgowej objętej barwieniem na Ae, podczas gdy u jedynie jednej z 14 myszy traktowanych Mab 266 wystąpił taki poziom zabarwienia. U prawie 50% zwierząt we wszystkich grupach wcale nie rozwinęły się złogi Ae do wieku 9 miesięcy życia. Ten ostatni fakt wydaje się wynikać z pochodzenia rodzicielskiego poszczególnych myszy w naszej kohorcie, gdyż chociaż u wszystkich badanych myszy potwierdzono, że mają typ APP^V717F+/+, to wysokie poziomy złogów Ae obserwowano jedynie u myszy pochodzących od 4/8 par hodowlanych (mioty o wysokiej patologii). Myszy pochodzące od innych 4 par hodowlanych były rzeczywiście wolne od złogów Ae (mioty o niskiej patologii). Przyjmując pochodzenie rodzicielskie jako dodatkową zmienną losową, uzyskano silny, znaczący wpływ m266 na zmniejszenie złogów Ae (p=0,0082, fig. 3B).

P r z y k ł a d 10.

Wstrzyknięte obwodowe Mab 266 nie wiąże się z płytkami u myszy APP^V717F Tg

Do badania, czy Mab 266 wstrzykiwany dootrzewnowe w ciągu 5 miesięcy związał się z Ae w mózgu, użyto skrawki mózgów od 9-miesięcznych myszy APP^V717F+/+ Tg ze złogami Ae, uprzednio traktowanych albo Mab 266 albo solą fizjologiczną albo kontrolną IgG. Obróbkę tkanki i barwienie

PL 210 157 B1 immunologiczne prowadzono w sposób opisany w piśmiennictwie [Bales K. R. i wsp., Nature Genet. (1997) 17: 263-264]. Tkankę pobraną od wszystkich grup zwierząt inkubowano z wyznakowaną fluoresceiną IgG anty-mysią (Vector, Inc.) i następnie badano pod mikroskopem fluorescencyjnym. W żadnej z grup nie było widocznych specyficznych barwnych plam złogów Ae. Odwrotnie, jeśli zastosowano Mab 266 na skrawki przed ich inkubacją z anty-mysią IgG, wówczas złogi Ae były łatwo wykrywalne.

P r z y k ł a d 11.

Wpływ podawania przeciwciała 266 na pojmowanie 24-miesięcznych transgenicznych, hemizygotycznych myszy PDAPP

Użyto 16 hemizygotycznych, transgenicznych myszy APP^V717F. Na początku badania średni wiek myszy wynosił 24 miesiące. Wszystkie iniekcje podawano dootrzewnowe (i.p.). Połowa myszy dostawała cotygodniowe iniekcje buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) i służyła jako kontrola a drugiej połowie podawano 500 mikrogramów mysiego przeciwciała 266 rozpuszczonego w PBS. Iniekcje stosowano w czasie 7 tygodni (42 dni), podając ogółem po 6 iniekcji. Po trzech dniach od ostatniej iniekcji oceniano zachowanie się zwierząt w próbie zadania rozpoznania przedmiotu (Object recognition task), prowadzonej zasadniczo w sposób opisany w publikacji J.-C. Dodart'a i wsp. [Behavioral Neuroscience 113 (5) 982-990 (1999)]. Wyliczano współczynnik rozpoznawania (TB x 100)/(TB-TA). Wyniki są podane w poniższej tabeli 1.

T a b e l a 1.

Statystyka opisowa dla współczynnika rozpoznawania

	Współczynnik rozpoznawania (minuty)
	N	Średnia	Odchylenie standardowe	Błąd standardowy
Kontrola (PBS)	8	71 2**	8,80	3,11
Przeciwciał o 266	8	54,35	7,43	2,62

p=0,0010

Podawanie 500 mikrogramów przeciwciała 266 cotygodniowo, 24-miesięcznym, hemizygotycznym, transgenicznym myszom wiązało się ze znaczącą zmianą zachowania. Myszy transgeniczne traktowane przeciwciałem miały współczynniki rozpoznawania podobne, jak u kontrolnych myszy typu dzikiego [J.-C. Dodart i wsp.]. Różnica we współczynniku rozpoznawania była statystycznie znamienna przy poziomie prawdopodobieństwa 0,001. Większy współczynnik rozpoznawania wskazuje na to, że traktowanie przeciwciałem, które wiąże się z peptydem beta-amyloidowym w regionie 13-28 aminokwasów będzie odwracać upośledzenie behawioralne, które jest udokumentowane w tym mysim modelu choroby Alzheimera. Tak więc, stosowanie przeciwciał, które wiążą peptyd beta-amyloidowy w regionie 13-28 aminokwasów, będzie leczyć takie choroby jak choroba Alzheimera i zespół Downa i będzie powstrzymywać spadek zdolności pojmowania, typowo związany z postępem choroby.

Obciążenie amyloidem (procent powierzchni objętej materiałem reaktywnym immunologicznie po barwieniu przeciwciałami anty-Ae, 3D6 albo 21F12) oznaczano ilościowo w korze mózgowej bezpośrednio przylegającej do hipokampa, w tym powierzchni obręczy i ciemieniowej kory mózgowej z mózgów 24-miesięcznych zwierząt traktowanych mysim przeciwciałem przez 7 tygodni, jak opisano powyżej. Wyniki podano w poniższej tabeli. Różnice pomiędzy traktowanymi grupami nie są statystycznie znamienne.

T a b e l a 2.

Obciążenie płytkami amyloidowymi u myszy APP^V717F+/- po traktowaniu mysim przeciwciałem 266 anty-Ae.

	Obciążenie płytkami (%)
Stosując 3D6	Stosując 21F12
	N	Średnia	Błąd standardowy	Średnia	Błąd standardowy
Kontrola (PBS)	7	44,3	5,93	0,77	0,14
Przeciwciał o 266	8	38,0	2,96	0,93	0,11

PL 210 157 B1

U tych bardzo starych zwierząt, traktowanie mysim przeciwciałem 266 nie doprowadziło do znacząco różnego obciążenia amyloidowego w porównaniu z grupą kontrolną, traktowaną PBS, według oznaczeń z użyciem albo 3D6 albo 21F12. Poza tym, obciążenie Ae było znacząco większe i znacząco podwyższone w porównaniu do obciążenia amyloidowego u zwierząt młodszych (patrz poniżej), które nie mogły odróżnić nowego przedmiotu od przedmiotu znanego w teście rozpoznania przedmiotu. Co najbardziej zdumiewające, wyniki te pokazują, że przeciwciała anty-Ae mogą odwracać upośledzenie pojmowania bez potrzeby zmniejszania obciążenia amyloidowego jako takiego.

Po 7 tygodniach traktowania, współczynnik rozpoznawania grupy traktowanej m266 nie różnił się statystycznie od tego, jakiego można byłoby się spodziewać dla kohorty 24-miesięcznych myszy typu dzikiego. Wskazuje to na całkowite odwrócenie spadku zdolności pojmowania u tych transgenicznych zwierząt.

P r z y k ł a d 12.

Wpływ podawania przeciwciała 266 na pojmowanie u młodych, transgenicznych, hemizygotycznych myszy PDAPP

Użyto pięćdziesiąt cztery (54) homozygotyczne, transgeniczne myszy APP^V717F. Na początku badania, dwadzieścia trzy myszy (23) były w wieku 2 miesięcy. Pozostałe myszy, na początku badania były w wieku 4 miesięcy. Doświadczenie trwało 5 miesięcy. Tak więc, w końcowym stadium badania myszy miały albo około siedem (7) miesięcy albo około dziewięciu (9) miesięcy.

Wszystkie iniekcje podawano dootrzewnowe (i.p.). Każda mysz w grupie kontrolnej PBS otrzymywała cotygodniowo iniekcję buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS; 200 μβ. Każda mysz w kontrolnej grupie IgG otrzymywała co tydzień iniekcję izotypu IgG1 κ1 jako kontrolę (100 μg/mysz/tydzień). Każda mysz w grupach Wysokiej Dawki otrzymywała co tydzień iniekcję 500 mikrogramów przeciwciała 266 rozpuszczonego w PBS (HD). Każda mysz w grupie Niskiej Dawki otrzymywała co tydzień iniekcję 100 mikrogramów przeciwciała 266 rozpuszczonego w PBS (LD). Po trzech dniach od ostatniej iniekcji oceniano zachowanie zwierząt w próbie zadania rozpoznania przedmiotu, jak to opisano w powyższym przykładzie 10, i wyliczano współczynnik odróżniania jako różnicę pomiędzy czasem spędzonym przy nowym przedmiocie a czasem spędzonym przy znajomym przedmiocie. Wyniki są przedstawione w tabeli 3. Dane są zgrupowane według wieku myszy na końcu badania.

T a b e l a 3.

Statystyka opisowa dla współczynnika odróżniania

	Współczynnik odróżniania (minuty)
	N	Średnia	Odchylenie standardowe	Błąd standardowy
Wiek 7 miesięcy
PBS	7	2,12	4,22	1,59
IgG	8	0,81	3,64	1,29
HD	8	10,04*	6,52	2,30
Wiek 9 miesięcy
PBS	7	1,87	3,54	1,34
IgG	8	0,96	3,51	1,24
LD	8	10,75*	6,44	2,28
HD	8	12,06***	7,82	2,76

* p<0,05 *** P<0,0001

Powyższe dane rozpatrywane łącznie, potwierdzają konkluzję, że podawanie przeciwciała 266, przeciwciała skierowanego przeciw centralnej domenie Ae, zmniejsza odkładanie się płytek u 7-9-miesięcznych transgenicznych myszy APP^V717F a także odwraca uprzednio występujące upośledzenia behawioralne. Leczenie pacjentów przeciwciałem skierowanym przeciw centralnej domenie peptydu Ae będzie hamowało, bądź zapobiegało upośledzeniu pojmowania, typowo związanemu z postępem choroby i będzie go odwracało.

PL 210 157 B1

Współczynnik odróżniania dla traktowanych zwierząt nie różnił się znacząco od tego, jakiego można byłoby oczekiwać dla myszy typu dzikiego w tym samym wieku. Tak więc, tak, jak w przypadku starszych zwierząt (przykład 11), traktowanie przeciwciałem m266 całkowicie odwracało upośledzenie pojmowania u tych młodszych zwierząt transgenicznych.

P r z y k ł a d 13.

Synteza humanizowanego przeciwciała 266

Komórki i przeciwciała. Mysią linię komórek szpiczaka Sp2/0 uzyskano z muzeum szczepów ATCC (Manassas, VA). Utrzymywano ją w pożywce DME zawierającej 10% FBS (nr. katalogowy:

# SH32661.03, HyClone, Logan, UT) w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C. Mysie komórki hybrydoma 266 początkowo hodowano w pożywce RPMI-1640 zawierającej 10% FBS (HyClone), 10 mM HEPES, 2 mM glutaminy, 0,1 mM aminokwasów egzogennych, 1 mM pirogronianu sodu i 25 μg/ml gentamycyny i następnie powiększono skalę do objętości 2,5 litra w pożywce bez surowicy (Hybridoma SFM, nr. katalogowy: # 12045-076, Life Technologies, Rockville, MD) zawierającej 2% FBS o niskiej zawartości Ig (Iow Ig FBS, nr katalogowy: # 30151.03, HyClone) w butelkach cylindrycznych. Mysie przeciwciało monoklonalne 266 (Mu266) oczyszczano z supernatantu hodowli metodą chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny wypełnionej Sepharozą z białkiemi G. Biotynylowane Mu266 przygotowano z użyciem biotyny EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin (nr. katalogowy:

# 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Klonowanie cDNA dla regionu zmiennego. Całkowity RNA ekstrahowano z około 10⁷ komórek hybrydoma stosując odczynnik TRIzol (Life Technologies). Izolowano poli(A)⁺RNA w układzie PolyTract mRNA Isolation System (Promega, Madison, WI), postępując według instrukcji dostawcy. Dwuniciowy cDNA syntetyzowano w zestawie do amplifikacji SMART™RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA), postępując stosownie do instrukcji dostawcy. CDNA dla regionu zmiennego łańcuchów lekkiego i ciężkiego amplifikowano w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) z użyciem 3'-primerów, które przyłączają się odpowiednio do mysich regionów stałych kappa i gamma i uniwersalny primer 5' dostarczony w zestawie SMART™RACE cDNA Amplification Kit. Primer 3' do reakcji PCR amplifikującej cDNA części zmiennej łańcucha lekkiego (VL) miał następującą sekwencję:

5'-TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC-3'

[SEQ ID Nr. 13] z resztami 17-46 hybrydyzującymi z mysim regionem Ck. Primery 3' do reakcji PCR amplifikującej cDNA dla części zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) miały zdegenerowane sekwencje:

G T

5'-TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGACCGATGGGGCTGTCGTTTTGGC-3'

T

[SEQ ID Nr. 14] z resztami 17-50 hybrydyzującymi z mysim łańcuchem gamma CH1. cDNA dla VL i VH subklonowano do wektora pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) w celu oznaczenia sekwencji.

Sekwencjonowanie DNA prowadzono w cyklach sekwencjonowania PCR z użyciem fluorescencyjnych terminatorów dideoksy-łańcucha (Applied Biosystems, Foster City, CA), postępując według instrukcji producenta. Reakcje sekwencjonowania analizowano w modelu 377 aparatu do sekwencjonowania DNA (Applied Biosystems).

Konstruowanie regionów zmiennych humanizowanego 266 (Hu266)

Humanizację mysich regionów zmiennych przeciwciała prowadzono w sposób opisany przez Queen'a i wsp. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 10029-10033 (1988)]. W oparciu o homologię sekwencji wybrano ludzki region zrębowy części zmiennej jako akceptor dla regionów hiperzmiennych (CDR) Mu266. Do sporządzenia modelu molekularnego regionów zmiennych użyto programy komputerowe ABMOD i ENCAD [Levitt M., J. Mol. Biol. 168: 595-620 (1983)]. Aminokwasy w humanizowanych regionach V przewidywanych jako te, które mają kontakt z regionami CDR zastąpiono odpowiednimi resztami Mu266. Substytucji tej dokonano na resztach 46, 47, 49 i 98 w łańcuchu ciężkim i na reszcie 51 w łańcuchu lekkim. W celu wyeliminowania potencjalnej immunogenności, zamieniono aminokwasy w humanizowanym regionie V, które okazały się rzadkie w tej samej podgrupie regionu V na aminokwasy konsensusowe. Zmian tych dokonano na resztach 42 i 44 w łańcuchu lekkim.

Skonstruowano geny dla regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego i dokonano ich amplifikacji, stosując osiem zachodzących na siebie syntetycznych oligonukleotydów o długości w zakresie od około 65 do 80 zasad [He X., Y. i wsp., J. Immunol. 160: 1029-1035 (1998)]. Oligonukleotydy te zgrzewano parami i wydłużano fragmentem Klonowa polimerazy DNA I, uzyskując cztery fragmenty

PL 210 157 B1 dwuniciowe. Otrzymane fragmenty denaturowano, zgrzewano parami i wydłużano za pomocą fragmentu Klenowa, uzyskując dwa fragmenty. Te fragmenty denaturowano, zgrzewano parami i wydłużano raz jeszcze, uzyskując gen o pełnej długości. Otrzymany produkt amplifikowano w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) w układzie Expand High Fidelity PGR System (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Fragmenty amplifikowane w reakcji PCR oczyszczano w żelu i klonowano do wektora pCR4Blunt-TOPO. Po potwierdzeniu sekwencji, geny dla VL i VH trawiono enzymami MIuI i Xbal, oczyszczano w żelu i subklonowano odpowiednio do wektorów przygotowanych do ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego, konstruując w ten sposób wektory pVk-Hu266 i pVg1-Hu266 (patrz odpowiednio figury 6 i 7) [Co M. S. i wsp., J. Immunol. 148: 1149-1154 (1992)]. Dojrzałe humanizowane przeciwciało 266 powstałe w wyniku ekspresji tych plazmidów ma łańcuch lekki zgodny z sekwencją SEQ ID Nr. 11 i łańcuch ciężki zgodny z SEQ ID Nr. 12.

Trwała transfekcja. Trwałą transfekcję do linii mysich komórek szpiczaka Sp2/0 przeprowadzono przez elektroporację w aparacie Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) przy napięciu 360 V i natężeniu 25 uF w sposób opisany w literaturze (Co i wsp., 1992). Przed transfekcją linearyzowano DNA plazmidów i pVk-Hu266 i pVg1-Hu266 za pomocą enzymu Fspl. Ilość około 10⁷ komórek Sp2/0 transfekowano ilościami 20 ug pVk-Hu266 i 40 ug pVg1-Hu266. Transfekowane komórki zawieszano w pożywce DME zawierającej 10% FBS i posłowano do kilku 96-dołkowych płytek. Po 48 godzinach użyto pożywki selekcyjne (pożywkę DME zawierającą 10% FBS, suplement do pożywek HT, 0,3 mg/ml ksantyny i 1 ug /ml kwasu mykofenolowego). Po około 10 dni od rozpoczęcia selekcji, analizowano supernatanty hodowli na produkcję przeciwciała metodą ELISA, jak opisano poniżej. Klony dające wysoką wydajność namnażano w pożywce DME zawierającej 10% FBS i dalej analizowano na ekspresję przeciwciała. Wyselekcjonowane klony zaadaptowano do wzrostu w pożywce Hybridoma SFM.

Oznaczanie ekspresji przeciwciała metodą ELISA. Wgłębienia w 96-dołkowej płytce ELISA (Nunc-Immuno plate, nr. katalogowy: # 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) powleczono ilością 100 ul poliklonalnego przeciwciała, koziej IgG anty-ludzkiej, specyficznej względem fragmentu Fcy (nr. katalogowy: # 109-005-098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) o stężeniu 1 ug/ml, w buforze 0,2 M węglanu/dwuwęglanu sodu (pH 9,4) przez dobę, w temperaturze 4°C. Po wypłukaniu buforem do przemywania (PBS z dodatkiem 0,1% Tween'u 20), studzienki blokowano ilością 400 ul buforu Superblock Blocking Buffer (nr katalogowy # 37535, Pierce) w czasie 30 minut i następnie przemywano buforem do przemywania. Próbki zawierające Hu266 rozcieńczano odpowiednio buforem ELISA (PBS z dodatkiem 1% BSA i 0,1% Tween'u 20) i wprowadzono do płytek ELISA (100 ul/wgłębienie). Jako standard użyto humanizowane przeciwciało monoklonalne HuM195, IgGl anty-CD33 (Co i wsp., 1992, jak wyżej). Płytkę ELISA inkubowano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, po czym wgłębienia przemyto buforem do przemywania. Następnie, do każdego wgłębienia podano 100 ul rozcieńczonych w stosunku 1/1000 skoniugowanych z HPR anty-ludzkich, kozich przeciwciał poliklonalnych kappa (nr. katalogowy: # 1050-05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) w buforze ELISA. Po godzinnej inkubacji w temperaturze pokojowej i przemyciu buforem do przemywania, do każdego wgłębienia dodano po 100 ul substratu ABTS (nr. katalogowe: # 507602 i 506502, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Wywoływanie barwy zatrzymywano przez dodanie do każdego dołka 100 ul 2% kwasu szczawiowego. Odczyt absorbancji prowadzono przy 415 nm w czytniku do mikropłytek OPTImax (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Oczyszczanie Hu266. Jeden ze stabilnych transfektantów Sp 2/0 o wysokiej ekspresji Hu256 (klon 1D9), zaadaptowano do wzrostu w pożywce Hybridoma SFM i powiększono hodowlę do 2 litrów w cylindrycznych kolbach. Zebrano wyczerpany supernatant hodowli w czasie, gdy żywotność komórek osiągnęła 10% lub była niższa i wprowadzono go na kolumnę z sepharozą-białko A. Kolumnę przemyto PBS i następnie eluowano przeciwciało roztworem 0,1 M chlorowodorku glicyny (pH 2,5) i 0,1 M NaCl. Eluowane białko dializowano wobec 3 zmian po 2 litry PBS, przefiltrowano przez filtr 0,2 um i przechowywano w temperaturze 4°C. Stężenie przeciwciała oznaczano przez pomiar absorbancji przy 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A280). Przeprowadzono elektroforezę SDS-PAGE w buforze Tris-glicyna, postępując według standardowych procedur, w gradiencie żelu 4-20% (nr. katalogowy: # EC6025, Novex, San Diego, CA).

Oczyszczone humanizowane przeciwciało 266 redukowano i poddano elektroforezie w żelu SDS-PAGE. Całe przeciwciało daje dwa pasma o masach cząsteczkowych około 25 kDa i 50 kDa. Te wyniki są zgodne z masami cząsteczkowymi łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego albo fragmentu łańcucha ciężkiego, wyliczonego na podstawie ich składu aminokwasowego.

PL 210 157 B1

P r z y k ł a d 14.

Własności wiążące in vitro humanizowanego przeciwciała 266.

Wydajność wiążącą humanizowanego przeciwciała 266, zsyntetyzowanego i oczyszczonego w sposób opisany powyżej, porównano z mysim przeciwciałem 266, stosując biotynylowane mysie przeciwciało 266 w porównawczej próbie ELISA. Wgłębienia w 96-dołkowej płytce ELISA (Nunc-Immuno plate, nr katalogowy: # 439454, NalgeNunc) powlekano przez dobę, w temperaturze 4°C, ilością 100 μl peptydu β-amyloidowego (1-42) skoniugowanego z BSA w buforze 0,2 M węglanu/dwuwęglanu sodu (pH 9,4) (10 μg /ml). Koniugat Ae_1-42-BSA sporządzono przez rozpuszczenie 7,5 mg Ae_1-42-Cys₄₃ (C-terminalna cysteina Άβ_1-42, AnaSpec) w 500 μl dimetylosulfotlenku i następne natychmiastowe dodanie 1500 μl destylowanej wody. Dwa (2) miligramy aktywowanej maleimidem albuminy surowicy cielęcej (Pierce) rozpuszczono w 200 μl wody destylowanej. Te dwa roztwory połączono, dokładnie zmieszano i pozostawiono w temperaturze pokojowej na dwie godziny. Nieprzereagowany peptyd oddzielono od koniugatu Ae_1-42-Cys-BSA metodą chromatografii żelowej na kolumnie.

Po przemyciu wgłębień, buforowaną fosforanem, solą fizjologiczną (PBS) z dodatkiem 0,1% Tween'u 20 (bufor do przemywania) w urządzeniu do przemywania płytek ELISA, wgłębienia blokowano przez dodanie do każdego wgłębienia po 300 μl odczynnika SuperBlock (Pierce). Po 30 minutach blokowania, wgłębienia przemyto buforem do przemywania i usunięto nadmier płynu.

Do każdego wgłębienia dodano mieszaninę biotynylowanego Mu266 (w końcowym stężeniu 0,3 μg/ml) i przeciwciała konkurencyjnego (Mu266 lub Hu266, zaczynając od końcowego stężenia 750 μg/ml, poprzez następne seryjne 3-krotne rozcieńczenia) w buforze ELISA, w końcowej objętości 100 μl/wgłębienie, nastawiając po trzy jednakowe próbki. Do próbki kontrolnej bez przeciwciała konkurencyjnego dodano 100 μl biotynylowanego Mu266 o stężeniu 0,3 μg/ml. W próbce kontrolnej, służącej jako tlo, użyto tylko 100 μl buforu ELISA. Płytkę ELISA inkubowano w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Po przemyciu wgłębień buforem do przemywania, do każdego wgłębienia dodano po 100 μl skoniugowanej z HPR streptawidyny w stężeniu 1 μg /ml (nr. katalogowy 21124, Pierce). Płytkę inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut po czym przemyto ją buforem do przemywania. W celu wywołania barwy dodano 100 μl/wgłębienie substratu dla peroksydazy ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories). Wywoływanie barwy kończono dodając 100 μl/wgłębienie 2% kwasu szczawiowego. Pomiar absorbancji wykonywano przy 415 nm. Wartości absorbancji wykreślono względem logarytmu stężenia przeciwciała konkurencyjnego, krzywe dopasowano do punktów z naniesionymi danymi (za pomocą pryzmatu) i oznaczono IC50 dla każdego przeciwciała ogólnie znanymi metodami.

Średnie IC₅₀ dla mysiego 266 wyniosło 4,7 μg/ml (trzy oddzielne doświadczenia, odchylenie standardowe = 1,3 μg/ml) a dla humanizowanego 266 wyniosło 7,5 μg/ml (trzy oddzielne doświadczenia, odchylenie standardowe = 1,1 μg/ml). Przeprowadzono drugą serię trzech doświadczeń, w zasadzie w sposób opisany powyżej. Oznaczone IC₅₀ dla mysiego 266 wyniosło 3,87 μg/ml (SD = 0,12 μg /ml) a dla ludzkiego 266 IC₅₀ wyniosło 4,0 μg/ml (SD = 0,5 μg/ml). Na podstawie tych wyników wyciągnęliśmy wniosek, że humanizowane 266 ma właściwości wiążące bardzo podobne do mysiego przeciwciała 266. Tak więc, zakładamy, że humanizowane 266 ma bardzo podobną aktywność in vitro i in vivo do aktywności mysiego 266 i u ludzi będzie wywierać takie samo działanie jak mysie 266 u myszy.

P r z y k ł a d 15.

Właściwości wiążące in vitro mysich przeciwciał 266 i 4G8.

Oznaczono powinowactwo przeciwciała (KD = Kd/Ka) w czujniku biologicznym BIAcore biosensor 2000 i zanalizowano dane programem komputerowym BIAevaluation (v.3.1). Przeciwciało wychwytujące (przeciwciało królika anty-mysie) sprzęgano poprzez wolne grupy aminowe z grupami karboksylowymi w celce przepływowej 2 koszyka czujnika (CM5) z użyciem N-etylo-N-dimetyloaminopropylo-karbodiimidu i N-hydroksysukcynimidu (EDC/NHS). Nieswoistą IgG królika sprzęgnięto z celką przepływową 1 jako kontrolę tła. Przeciwciała monoklonalne wychwytywano tak, aby uzyskać 300 jednostek rezonansowych (RU). Następnie przez koszyk przepływał amyloid-beta 1-40 albo 1-42 (Biosource International, Inc.) w zmniejszających się stężeniach (1000 do 0,1 x KD). W celu regeneracji koszyka, związane przeciwciało anty-Ae eluowano z koszyka przez przemywanie chlorowodorkiem glicyny (pH 2). Iniekcja kontrolna nie zawierająca amyloidu-beta służyła jako kontrola do odjęcia linii odniesienia. Zanalizowano sensogramy uwidaczniające fazy asocjacji i dysocjacji w celu oznaczenia Kd i Ka. Stosując tę metodę, oznaczono, że powinowactwo mysiego przeciwciała 266 zarówno do Ae_1-40 jak i Ae_1-42 wynosi 4 pM. Powinowactwo 4G8 do Ae_1-40 wynosiło 23 nM a do Ae_1-42 wynosiło 24 nM. Pomimo 6000-krotnej różnicy w powinowactwach do Ae, zarówno 266 jak i 4G8, wiążące się

PL 210 157 B1 z epitopami pomiędzy aminokwasami 13 a 28 peptydu Ae, skutecznie sekwestrują Ae z ludzkiego płynu mózgowo-rdzeniowego. Tak więc, w oznaczaniu zdolności przeciwciała do sekwestrowania peptydu Ae i uzyskania korzystnych i nieoczekiwanych korzyści z wynalazku, główne znaczenie ma lokalizacja epitopu a nie powinowactwo wiązania.

P r z y k ł a d 16.

Mapowanie epitopu mysiego przeciwciała 266 z użyciem metodologii Biacore i rozpuszczalnych peptydów.

BIAcore jest zautomatyzowanym układem czujnika biologicznego do pomiaru interakcji molekularnych [Karlsson R. i wsp., J. Immunol. Methods 145: 229-240 (1991)]. Zaleta układu BIAcore w stosunku do innych prób wiązania polega na tym, że można oznaczać wiązanie antygenu bez potrzeby jego znakowania lub immobilizacji (antygen utrzymuje się w bardziej naturalnej konformacji). Metodologię BIAcore zastosowano do oceny wiązania różnych fragmentów peptydu amyloidowego-beta z mysim przeciwciałem 266, zasadniczo w sposób opisany powyżej w przykładzie 12, z tym, że do wszystkich rozcieńczeń stosowano buforowaną HEPES sól fizjologiczną zawierającą Tween 20, wstrzykiwano różne fragmenty Ae (BioSource International) i wstrzykiwano pojedyncze stężenie każdego fragmentu (440 nM).

Beta-amyloidowe fragmenty 1-28, 12-28, 17-28 i 16-25 wiązały się z mysim przeciwciałem 266, natomiast fragmenty 1-20, 10-20 1 22-35 nie wiązały się. Fragmenty 1-20, 10-20 i 22-35 wiązały się z innymi przeciwciałami monoklonalnymi o znanej swoistości wiązania dla tych regionów Ae. Stosując tę metodologię wykazano, że epitop wiążący się z mysim przeciwciałem 266 znajduje się pomiędzy aminokwasami 17 a 25 peptydu Ae. Ponieważ wiązanie występuje zazwyczaj z co najmniej trzema resztami w epitopie, można wywnioskować, że ten epitop jest zawarty na resztach 19-23.

P r z y k ł a d 17.

Właściwości wiążące in vitro humanizowanego przeciwciała 266

Powinowactwo (KD = Kd/Ka) humanizowanego przeciwciała 266, zsyntetyzowanego i oczyszczonego w sposób opisany powyżej, oznaczano w sposób zasadniczo taki sam, jaki jest opisany w przykładzie 15. Oznaczone tą metodą powinowactwo humanizowanego przeciwciała 266 wobec Ae1-42 wynosi 4 pM.

Claims (27)

1. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment, które specyficznie wiąże się z epitopem zawartym w pozycjach 13-28 cząsteczki Ae., i które zawiera:

a. łańcuch lekki posiadający trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR) w łańcuchu lekkim o następujących sekwencjach aminokwasowych:

CDR1 łańcucha lekkiego:

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.1); lub

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.15),

CDR2 łańcucha lekkiego:

1 5

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser (SEQ ID Nr. 2) i CDR3 łańcucha lekkiego:

1 5

Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr (SEQ ID Nr. 3) oraz sekwencję regionu zrębowego z łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny, i

b. łańcuch ciężki posiadający trzy regiony determinujące dopasowanie (CDR) w łańcuchu ciężkim o następujących sekwencjach aminokwasowych:

CDR1 łańcucha ciężkiego:

1 5

Arg Tyr Ser Met Ser (SEQ ID Nr. 4)

CDR2 łańcucha ciężkiego:

1 5 10 15

Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 5) albo

PL 210 157 B1

1 5 10 15

Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 16); i CDR3 łańcucha ciężkiego:

Gly Asp Tyr (SEQ ID Nr. 6) oraz sekwencję regionu zrębowego łańcucha ciężkiego z łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny.

2. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, w którym CDR1 łańcucha lekkiego ma sekwencję:

1 5 10 15

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ile Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His (SEQ ID Nr.1) i;

CDR2 łańcucha ciężkiego ma sekwencję:

1 5 10 15

Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Lys Gly (SEQ ID Nr. 5).

3. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment według za-strz. 1, posiadające region zmienny łańcucha lekkiego zawierający następującą sekwencję:

1 5 10 15

Asp Xaa Val Met Thr Gln Xaa Pro Leu Ser Leu Pro Val Xaa Xaa

20 25 30

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Xaa

35 40 45

Tyr Ser Asp Gly Asn Ala Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Xaa Leu Leu lle Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe

65 70 75

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

80 85 90

Phe Thr Leu Lys lle Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Xaa Gly Val 95 100 105

Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Xaa 110

Gly Thr Xaa Xaa Glu lle Lys Arg (SEQ ID Nr. 7) w której:

Xaa w pozycji 2 oznacza Val albo Ile;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Thr;

Xaa w pozycji 14 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 15 oznacza Leu albo Pro;

Xaa w pozycji 30 oznacza Ile albo Val;

Xaa w pozycji 50 oznacza Arg, Gln albo Lys;

Xaa w pozycji 88 oznacza Val albo Leu;

Xaa w pozycji 105 oznacza Gln albo Gly;

Xaa w pozycji 108 oznacza Lys albo Arg i Xaa w pozycji 109 oznacza Val albo Leu a region zmienny w łańcuchu ciężkim posiada następującą sekwencję:

1 5 10 15

Xaa Val Gln Leu Val Glu Xaa Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

20 25 30

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Arg Tyr Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Xaa Leu Val Ala Gln Ile Asn Ser Val Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr

65 70 75

Pro Asp Xaa Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa 80 85 90

Xaa Asn Thr Leu Tyr Leu Glin Met Asn Ser Leu Arg Ala Xaa Asp

PL 210 157 B1

95 100 105

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

110

Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser (SEQ ID Nr. 8) w której :

Xaa w pozycji 1 oznacza Glu albo Gln;

Xaa w pozycji 7 oznacza Ser albo Leu;

Xaa w pozycji 46 oznacza Glu, Val, Asp albo Ser;

Xaa w pozycji 63 oznacza Thr albo Ser;

Xaa w pozycji 75 oznacza Ala, Ser, Val albo Thr;

Xaa w pozycji 76 oznacza Lys albo Arg;

Xaa w pozycji 89 oznacza Glu albo Asp;

Xaa w pozycji 107 oznacza Leu albo Thr.

4. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, posiadające region zmienny w łańcuchu lekkim odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 9 i region zmienny w łańcuchu ciężkim odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 10.

5. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 4, posiadające łańcuch lekki odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 11 i łańcuch ciężki odpowiadający sekwencji SEQ ID Nr. 12.

6. Humanizowane przeciwciało, według zastrz. 1 lub zastrz. 5, znamienne tym, że stanowi je fragment tego przeciwciała.

7. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi go izotyp IgG1 immunoglobuliny.

8. Humanizowane przeciwciało lub jego fragment według zastrz. 1, które to przeciwciało lub jego fragment jest wytwarzane w komórce gospodarza wybranej z grupy obejmującej komórki szpiczaka, komórki jajnika chomika chińskiego, komórki jajnika chomika syryjskiego i komórki nerki embrionu ludzkiego.

9. Kwas polinukleinowy zawierający sekwencję kodującą łańcucń lekki lub łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowanego w zastrz. 1.

10. Kwas polinukleinowy według zastrz. 9, zawierający sekwencję kodującą region zmienny łańcucha lekkiego przedstawiony na sekwencji SEQ ID Nr. 7 albo SEQ ID Nr. 9.

11. Kwas polinukleinowy według zastrz, 9, zawierający sekwencję kodującą region zmienny łańcucha ciężkiego przedstawiony na sekwencji SEQ ID Nr. 8 albo SEQ ID Nr. 10.

12. Kwas polinukleinowy według zastrz. 9, zawierający sekwencję kodującą łańcuch lekki przedstawiony na sekwencji SEQ ID Nr. 11.

13. Kwas polinukleinowy według zastrz. 9, zawierający sekwencję kodującą łańcuch ciężki przedstawiony na sekwencji SEQ ID Nr. 12.

14. Kwas polinukleinowy zawierający sekwencję kodującą łańcuch lekki albo łańcuch ciężki humanizowanego przeciwciała lub jego fragment jak zdefiniowano w zastrz. 5.

15. Kwas polinukleinowy, którego ekspresja w odpowiedniej komórce gospodarza daje przeciwciało lub jego fragment jak zdefiniowano w zastrz. 1.

16. Kwas polinukleinowy, którego ekspresja w odpowiedniej komórce gospodarza daje przeciwciało lub jego fragment jak zdefiniowano w zastrz. 5.

17. Wektor ekspresyjny do ekspresji przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano w zastrz. 1, zawierający sekwencje nukleotydowe kodujące to przeciwciało lub jego fragment.

18. Komórka transfekowana wektorem ekspresyjnym jak zdefiniowano w zastrz. 17.

19. Komórka transfekowana dwoma wektorami ekspresyjnymi jak zdefiniowano w zastrz. 17, przy czym pierwszy wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch lekki a drugi wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch ciężki.

20. Wektor ekspresyjny do ekspresji przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano w zastrz. 5, zawierający sekwencje nukleotydowe kodujące to przeciwciało lub jego fragment.

21. Komórka transfekowana wektorem ekspresyjnym jak zdefiniowano w zastrz. 20.

22. Komórka transfekowana dwoma wektorami ekspresyjnymi jak zdefiniowano w zastrz. 20, przy czym pierwszy wektor zawiera sekwencję nukleotydową kodującą łańcuch lekki a drugi wektor zawiera sekwencję kodującą łańcuch ciężki.

23. Komórka zdolna do ekspresji humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo zastrz. 5.

PL 210 157 B1

24. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca humanizowane przeciwciało albo jego fragment jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo zastrz. 5 i dopuszczalną farmaceutycznie substancję pomocniczą.

25. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała łub jego fragmentu jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo zastrz. 5 do wytwarzania leku, włącznie z jego postacią umożliwiającą przedłużoną ekspresję rekombinantowych sekwencji tego przeciwciała lub fragmentu tego przeciwciała w tkankach człowieka, do leczenia klinicznej lub przedklinicznej fazy choroby Alzheimera, zespołu Downa bądź klinicznej lub przedklinicznej fazy angiopatii mózgowej amyloidowej.

26. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo zastrz. 5 do wytwarzania leku, włącznie z jego postacią umożliwiającą przedłużoną ekspresję rekombinantowych sekwencji tego przeciwciała lub fragmentu tego przeciwciała w tkankach człowieka, do leczenia, zapobiegania lub odwracania upośledzenia pojmowania w klinicznej lub przedklinicznej fazie choroby Alzheimera, zespołu Downa bądź klinicznej lub przedklinicznej fazie angiopatii mózgowej amyloidowej.

27. Zastosowanie humanizowanego przeciwciała lub jego fragmentu jak zdefiniowano w zastrz. 1 albo zastrz. 5 do wytwarzania leku do leczenia choroby Alzheimera.

Rysunki

PL 210 157 B1

Poziom peptydu Αβ w osoczu (pg/ml)

Poziomy peptydu Αβ w osoczu po dożylnym podaniu iniekcji 266