BRPI0108923B1 - elemento de ligação específico, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um elemento de ligação específico ou domínio vh ou vl de anticorpo, e, para obter um elemento de ligação específico que liga eotaxina - Google Patents

Abstract

"elemento de ligação específico, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos para produzir um elemento de ligação específico ou domínio vh ou vl de anticorpo, e, para obter um elemento de ligação específico que liga eotaxina". elementos de ligação específicos dirigidos para eotaxina-1, particularmente anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos contra eotaxina -1 humana e especialmente os que neutralizam atividade de eotaxina-1. os domínios vh e/ou vl de anticorpos de fg scfv, aqui chamado cat- 212 e os de anticorpo igg4, aqui chamados cat 213. uma ou mais regiões de determinação complementares (cdrs) de domínios vh e/ou vl de cat212/213, especialmente vh crd3, em outras regiões de armação de anticorpos. composições contendo elementos de ligação específicos e seu uso em métodos para inibir ou neutralizar eotaxina, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

Description

(54) Título: ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO OU DOMÍNIO VH OU VL DE ANTICORPO, E, PARA OBTER UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO QUE LIGA EOTAXINA (51) Int.CI.: C07K 16/24; C12N 15/19; C12N 15/63; C12N 15/66.

(30) Prioridade Unionista: 03/03/2000 US 60/187246.

(73) Titular(es): CAMBRIDGE ANTIBODY TECHNOLOGY LIMITED.

(72) Inventor(es): TRISTAN JOHN VAUGHAN; ALISON JANE WILTON; STEPHEN SMITH; SARAH HELEN MAIN.

(86) Pedido PCT: PCT GB2001000927 de 02/03/2001 (87) Publicação PCT: WO 2001/066754 de 13/09/2001 (85) Data do Início da Fase Nacional: 02/09/2002 (57) Resumo: ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO OU DOMÍNIO VH OU VL DE ANTICORPO, E, PARA OBTER UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO QUE LIGA EOTAXINA. Elementos de ligação específicos dirigidos para eotaxina-1, particularmente anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos contra eotaxina -1 humana e especialmente os que neutralizam atividade de eotaxina-1. Os domínios VH e/ou VL de anticorpos de fg scFv, aqui chamado CAT- 212 e os de anticorpo lgG4, aqui chamados CAT 213. Uma ou mais regiões de determinação complementares (CDRS) de domínios VH e/ou VL de CAT212/213, especialmente VH CRD3, em outras regiões de armação de anticorpos. Composições contendo elementos de ligação específicos e seu uso em métodos para inibir ou neutralizar eotaxina, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, E, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO ESPECÍFICO OU DOMÍNIO VH OU VL DE ANTICORPO

A presente invenção refere-se a elementos de ligação específicos dirigidos a eotaxina-1, particularmente anticorpos humanos contra eotaxina-1 humana e especialmente os que neutralizam atividade de eotaxina1. As formas de realização preferidas da presente invenção empregam o anticorpo VH e/ou domínio VL do fragmento scFv, aqui chamado CAT-212 e do anticorpo IgG4 aqui chamado CAT- 213. Outras formas de realização preferidas empregam uma ou mais regiões de determinação de complementariedade (CDRs) de CAT- 212/-213 domínios VH e/ou VL, especialmente VH CDR3 em outras regiões de armação de anticorpos. Outros aspectos da presente invenção provêem composições contendo elementos de ligação específicos da invenção, e seu uso nos métodos de inibição ou neutralização de eotaxina, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal por terapia.

Eotaxina-1 é uma proteína quimioatraente que liga a um receptor específico, CCR3, que é expressado predominantemente em eosinófilos. Um anticorpo anti-eotaxina-1 pode ser usado para inibir eosinofilia e o recrutamento de eosinófilos para sítios de inflamação. Em uma forma de realização, a presente invenção provê um fragmento de anticorpo humano, chamado CAT- 212, que foi derivado de coleção de exibição de fagos scFv. CAT- 212 neutraliza de modo potente a eotaxina humana, com um IC50 de 650 pM em um bio-ensaio funcionalmente relevante (quimiotaxia). CAT- 212 é de alta afinidade com KD de 15 pM. Em uma outra forma de realização, em que

CAT- 212 scFv é reformatado como um IgG4 humano, o anticorpo foi nomeado CAT- 213. CAT- 213 é de potência similar a CAT- 212 e neutraliza

Petição 870180066277, de 31/07/2018, pág. 14/20 eotaxina humana com um IC₅o de 700 pM no ensaio de quimiotaxia. CAT- 213 também bloqueia quimiotaxia de células mononucleares em camundongos sensibilizados com ovalbumina. Tanto CAT- 212 como CAT- 213 bloqueiam de modo potente a eosinofilia em um modelo in vivo de inflamação alérgica.

.5 Eosinófilos normalmente chegam a 1B3 % dos leucócitos no sangue periférico total. Um acúmulo marcado de eosinófilos, uma condição conhecida como eosinofilia, pode ocorrer em muitos distúrbios como doenças alérgicas, infecções parasíticas e câncer (Rothenburg 1998). A eosinofilia é classificada como tendo mais de 350 eosinófilos por milímetro cúbico de sangue, e em casos severos, níveis podem chegar a acima de 5000 células por milímetro cúbico. Assim como se acumulando no sangue periférico de indivíduos doentes, eosinófilos também podem se acumular seletivamente em qualquer tecido no corpo. Esta eosinofilia pode ser prejudicial devido aos efeitos pró-inflamatórios dos eosinófilos. Em condições eosinófilas, como asma, se tem com freqüência uma correlação entre o número de eosinófilos infiltrantes e a severidade da doença.

Os eosinófilos se acumulam em sítios inflamatórios onde eles podem sobreviver durante períodos prolongados, dependendo da combinação de citoquinas produzidas em seu meio imediato. Os eosinófilos contém muitos mediadores inflamatórios tóxicos que são armazenados em grânulos. Quando da ativação de um ou mais dentre um amplo número de citoquinas, os eosinófilos desgranulam para liberar estas toxinas que incluem proteínas catiônicas, como a proteína básica principal, neurotoxina derivada de eosinófilos e peroxidase eosinofílica. Além disso, eosinófilos ativados também liberam quimioatraentes, mediadores de lipídeos, como leucotrienos e uma ampla faixa de citoquinas inflamatórias. Muitas destas substâncias tem efeitos citotóxicos significantes em tecidos, como o epitélio respiratório em asma (Rothenberg, 1998).

As quimioquinas são um grupo de proteínas de 8B10 kDa ·· ·· ·· ·· ···? Όι ········ · ·····* * · * homólogas (Luster, 1998) que são subdivididas em famílias com base em posições relativas dos resíduos de cisteína conservados. As quimioquinas desempenham um papel importante na mediação da extravazão de leucócitos do sangue nos tecidos como elas provêem sinais direcionais para o movimento de leucócitos durante o desenvolvimento normal e homeostase e, como importante, na inflamação. Apesar de existirem numerosas substâncias quimiotáticas, como leucotrieno B₄, as interleucinas e produtos bacterianos, que são capazes de recrutar eosinófilos para os tecidos, somente a quimioquina, eotaxina-1 foi mostrada para recrutar eosinófilos especificamente.

1 A eotaxina humana é um membro do grupo em rápida expansão de sub-família β ou CC (Cys-Cys) de quimioquinas. Este grupo de moléculas é caracterizado pela presença de 4 cisteínas conservadas, as primeiras 2 sendo adjacentes e compartilham uma identidade de seqüência entre 20 e 75%. Os elementos desta família incluem eotaxina-2 (Frossmann et al, 1997, White et al, 1997), eotaxina-3 (Shinkai et al, 1999), proteína quimioatraente de monócitos (MCP)-l, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MCP-5 (Van Coillie et al, 1999), proteína inflamatória de macrófagos (MIP)-l, MIP_1 β, TARC, LARC, 1309 e RANTES.

Eotaxina -1 é uma proteína de 74 aminoácidos 8,4 kDa, que foi primeiro detectada no fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) de porquinhosda-índia sensibilizados desafiados com alergênios (Griffiths -Johnson et al, 1993, Jose et al, 1994a). A molécula foi primeiro identificada como um quimioatraente potente como induziu um acúmulo substancial de eosinófilos em seu sítio de injeção intradérmico. O gene do porquinho-da-índia foi primeiro clonado (Jose et al, 1994b, Rothenberg et al, 1995a), seguido por camundongos (Rothenberg et al, 1995b). O gene de eotaxina humano foi subseqüentemente identificado (Kitaura et al, 1996; Garcia- Zepeda et al, 1996;

Ponath et al, 1996), e o homólogo de rato foi mais recentemente clonado (Williams et al, 1998). A eotaxina humana tinha 61% de identidade com ·· ····

JO eotaxina de camundongos e porquinhos da índia, e 62% de identidade com eotaxina de ratos. O gene humano está localizado em cromossomo 17 e compreende três exons e dois introns. A região de flanco 5' do gene contém vários elementos regulatórios de consenso, incluindo sítios de ligação para AP1, NFB, elemento de resposta gama interferon e o receptor de glucocorticóide, sugerindo que a expressão do gene é regulada por citoquinas, assim como por glucocorticosteróides.

A eotaxina pode ser produzida por vários tipos de células normais, incluindo células epiteliais, fibroblastos, células endoteliais, Tlinfócitos, monócitos e macrófagos (Cook et al, 1998, Ponath et al, 1996a, Li et al 1997). Apesar de eosinófilos serem as células efetuadoras principais para eotaxina, eosinófilos também sintetizam as próprias eotaxinas, e as armazenam em grânulos intracelulares (Nakajima et al, 1998). A liberação de eotaxina de eosinófilos pode contribuir para o acúmulo local de eosinófilos em condições inflamatórias. A expressão de eotaxina pode ser induzida de diferentes tipos de células por muitos mediadores pró-inflamatórios, como fator alfa de necrose de tumor, interferon e interleucina-1.

Eotaxina-2 foi recentemente clonada (Forssmann et al, 1997, Wbite et al, 1997). Ela não demonstram homologia de seqüência próxima com eotaxina, como compartilha somente 39% de identidade de aminoácidos. Como eotaxina, no entanto, eotaxina-2 é um quimioatraente para eosinófilos e basófilos, apesar de 10B vezes menos potente. Eotaxina-3 também foi recentemente identificada (Shinkai et al, 1999) mas sua potência também aparece como sendo 10B vezes menor que a observada para eotaxina. Conseqüentemente, eotaxina-3 é quimiotáctica para eosinófilos e basófilos somente em concentrações relativamente elevadas (Kitaura et al 1999).

Geralmente, se tem uma redundância substancial na ligação de quimioquinas para receptores de quimioquinas. Tipicamente, várias diferentes quimioquinas CC são capazes de se ligar a um único receptor de quimioquina,

e inversamente, uma única quimioquina CC pode ligar a vários diferentes receptores de quimioquina. O receptor de quimioquina CCR3, tem muitos ligandos incluindo eotaxina, MCP-2, MCP-3, MCP-4, RANTES, eotaxina-2 e

3. Dentre estes, eotaxina parece ser o mais importante. Muitos dos ligandos, como MCP-2, MCP-3 e RANTES, tem uma afinidade relativamente baixa para CCR3 e são, assim, não particularmente efetivos para induzir eventos mediados por CCR3. Em contraste, eotaxina liga ao receptor de quimioquina CC 3 (CCR3) com uma afinidade relativamente elevada, Kd = 0,52 nM (Ponath et al, 1996a). Além disso, eotaxina não é comum dentre quimioquinas CC em que somente liga a CCR3 e não a qualquer outro receptor de quimioquina, isto é, eotaxina é específica para CCR3.

CCR3 humano foi clonado (Combadiere et al, 1995; DAugherty et al 1996) e é uma proteína de domínio de transmembrana 7, de 355 aminoácidos e 41 kDa. Ele contém quatro cisteínas em seu domínio extracelular e oito resíduos serina/ treonina na cauda citoplásmica que são sítios em potencial para fosforilação mediada por proteína G. CCR3 não tem sítios em potencial para glicosilação N-ligada. O receptor humano liga tanto eotaxina de camundongos como humana com afinidade igual (Daughterty et al, 1996). CCR3 de camundongos (Gao et al, 1996) e porquinhos da índia (Sabroe et al, 1998) foram subseqüentemente clonados e compartilham 69 e 67 % de identidade de aminoácidos com CCR-3 humano, respectivamente.

CCR-3 humano é principalmente expresso em eosinófilos (Ponath et al 1996b) e basófilos (Uguccioni et al, 1997, Yamada et al 1997). Verificou-se também que em células T tipo T_H2 (Sallusto et al, 1997), as células microgliais no sistema nervoso central (He et al, 1997) e células dendríticas (Rubbert et al, 1998). Eotaxina é um quimioatraente e ativador de células expressando CCR3. Na ligação de CCR3 em eosinófilos, eotaxina causa mobilização de cálcio intracelular, iniciação de polimerização de actina intracelular, regulagem de expressão de integrina e a indução de produção de

• · ·· · radial oxigênio (Tenscher et al, 1996, Elsner et al, 1996). CCR3 é expresso em níveis particularmente elevados em eosinófílos com 40.000 (DAugherty et al, 1996) para 40.000 receptores por célula. (Ponath et al, 1996b). Muitos ligandos de CCR3, como MCP-2, MCP-3, MCP-4 e RANTES, também ligam

-5 receptores de quimioquinas diferentes de CCR3 e podem, assim, mediar quimioatração de uma ampla variedade de tipos de células. Em contraste devido a sua elevada seletividade para CCR3, eotaxina é capaz de quimioatrair especificamente e ativar as células expressando CCR3 como eosinófílos.

Existem provas crescentes de que o bloqueio dos efeitos de eotaxina pode ser usados terapeuticamente. Existem vários estudos in vivo que tem usado anticorpos de coelhos ou roedores. Um tal estudo procurou os efeitos de um anticorpo anti-eotaxina intravenosamente administrado (iv). Gonzalo et al (1996) injetou 20 pg de um anti-soro policlonal de coelho antieotaxina iv em camundongos desafiados com ovalbumina. A administração de anticorpos antes do desafio reduziu a eosinofilia em 56%, como medido pelo número de eosinófílos acumulando em fluido de lavagem bronco-alveolar (BAL).

Também existem vários relatórios dos efeitos de anticorpos anti-eotaxina localmente administrados. Humbles et al (1997) descreveram a co- injeção de eotaxina de porquinhos da índia (10 ng) com um anti-soro antieotaxina policlonal de coelhos (10 pl) na pele de porquinhos da índia nativos que tinha recebido uma injeção anterior de eosinófílos rotulados ^mIn. O anticorpo policlonal foi capaz de bloquear completamente o acúmulo de eosinófílos local. Similarmente, Teixeira et al, (1997) usaram um modelo de camundongos de eosinofilia, em que eotaxina de murinos (1-30 pmol) foi coinjetada com um anti-soro anti-eotaxina policlonal de coelhos intradermicamente nos sítios reações anafiláticas cutâneas ativas de 4-8 horas.

As diluições de 5% e 20% de recrutamento de eosinófílos bloqueados em antisoro em 45% e 95%, respectivamente. Além disso, Sanz et al (1998) /3

bloquearam o acúmulo de eosinófilos devido a eotaxina endogenamente gerada induzida por injeção IL-4 intradérmica. Um anti-soro policlonal anti-eotaxina deu uma inibição de 54% da última fase (24B28 hr) mas não na fase prematura 0B4 hr) da resposta a 11-4.

. 5 Para ainda entender o papel de eotaxina no estado saudável e doentio mediado por eosinófilos, a ruptura de genes marcada foi usada para gerar camundongos que são deficientes em eotaxina (Rothenberg et al 1997). Quando estes camundongos foram sensibilizados e desafiados com ovalbumina, os números de eosinófilos foram reduzidos por 70% em BAL dos pulmões de camundongos nulos em eotaxina comparado com camundongos de tipo selvagem (18 h após desafio). Isto demonstra que eotaxina melhora a grandeza de recrutamento de eosinófilos após desafio com antígeno em modelos de asma. Nakamura et al (Am. J. Resp. & Crit. Care Med. (1999) 160: 1952- 1956) demonstra a associação de níveis de eotaxina com asma e relação inversa com função do pulmão.

mRNA de eotaxina é produzido de modo constitutivo por vários tecidos, onde foi sugerido desempenhar um papel em abrigo de eosinófilos (Rothenberg et al, 1995). Nos camundongos nulos em eotaxina, não puderam ser detectadas anormalidades histológicas brutas em qualquer órgão, incluindo os conhecidos como expressando eotaxina. Similarmente não puderam ser detectadas mudanças em fenótipo de leucócitos. No entanto, a contagem de eosinófilos total foi reduzida em 3 vezes nos camundongos nulos comparados com o tipo selvagem, sugerindo que eotaxina também desempenha um papel na determinação do número de linha base de eosinófilos na circulação periférica (Rothenberg et al 1997).

Os membros de ligação específicos de acordo com a presente invenção são utilizáveis na ligação e preferivelmente neutralização de eotaxina, com potencial terapêutico em várias doenças e distúrbios em que eotaxina desempenha um papel. As doenças exemplares e distúrbios são discutidos

• ·

ainda abaixo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra potência de neutralização de scFv 3G3 em um ensaio de quimiotaxia mediada por eotaxina, descrita abaixo. Os dados .5 representam a média com barras de erro padrão de duas experiências separadas. A quimiotaxia máxima é o número de células migrando através da câmara inferior em resposta a 50 ng/ml eotaxina humana. O IC₅₀ para scFv 3G3 é 800 nM.

Figura 2 mostra ELISA especificidade CAT- 212 sem sinal acima do fundo (PBS) em qualquer um dos antígenos relacionados e não relacionados testados. Um sinal fraco pode ser observado contra eotaxina de camundongos.

Figura 3 mostra potência de neutralização de CAT- 212 e CAT213 em um ensaio de quimiotaxia mediada por eotaxina.

Figura 4 ilustra IC50 de CAT- 212 e CAT- 213 em um ensaio de competição.

Figura 5 mostra um gráfico Scatchard de ligação de eotaxina a CAT- 212, usado na determinação de afinidade de CAT- 212 para eotaxina.

Figura 6 ilustra competição de eotaxina de camundongos para ligação a CAT- 212.

Figura 7 mostra neutralização por CAT- 212 do aumento em concentração Ca²⁺ intracelular induzida por eotaxina. Mudança na fluorescência medida com tempo em FLIPR em resposta à adição de 10 nM eotaxina +/- de CAT- 212 (concentração de CAT- 212 mostrada em legenda).

Controle é a adição de tampão apenas. A adição de Ab sozinho não muda a fluorescência de modo significante. A média de reservatórios em triplicata para eotaxina e reservatórios em duplicata para cada concentração de anticorpos é mostrada.

Figura 8 mostra área sob os dados de curva para CAT- 212 em

• · · · um ensaio de fluxo de cálcio, calculado para dados de 12 s a 100 s. O ponto sozinho no eixo-y é eotaxina sozinha. A média e desvio padrão de reservatórios em triplicata para eotaxina e reservatórios duplicados para cada concentração de anticorpo são mostrados.

-5 A figura 9 demonstra especificidade de ligação de CAT- 213 para eotaxina humana.

Figura 10 mostra o efeito de CAT- 212 e CAT- 213 em recrutamento de eosinófilos induzido por eotaxina humana para a bolsa de ar em camundongos sensibilizados com ovalbumina tratados com IL-5. CAT- 212 foi administrado i.po. enquanto CAT- 212 foi administrado tanto i.po. como i.v. em experimentos separados. O efeito de tratamento com anticorpos foi estatisticamente avaliado realizando ANOVA de uma via com teste de Dunnett usando os dados de contagem celular diferencial. * P < 0,05, ** P < 0,01 comparado com animais de controle PBS desafiados com eotaxina humana (=

0% inibição, n = 7 - 8 camundongos ) Cada ponto representa o valor médio e as barras verticais mostram SE. CAT- 213 e CAT- 212 administrados localmente para a bolsa de ar causaram uma inibição relacionada com dose de eosinofilia. CAT- 213 dado sistemicamente também inibiu de modo significante a quimiotaxia de eosinófilos.

A figura 11 ilustra o efeito de CAT- 213 em recrutamento de eosinófilos induzida por ovalbumina para a bolsa de ar em camundongos sensibilizados com ovalbumina. CAT- 213 foi administrado tanto i.po. como i.v. em experimentos separados. O efeito do tratamento com anticorpo foi estatisticamente avaliado ao realizar ANOVA de uma via com teste de Dunnett usando os dados de contagem de células diferencial. * P < 0,05, ** P < 0,01 comparado com animais de controle PBS desafiados com ovalbumina (= 0% inibição, n = 7 - 8 camundongos). Cada ponto representa o valor médio e as barras verticais mostram SE. CAT- 213 administrado localmente na bolsa de ar ou dados sistemicamente causaram uma inibição relacionada com dose potente ···· de eosinofilia. O efeito de administração i.v. de eotaxina anti-camundongos IgG2A (R& D Systems mAb) em recrutamento de eosinófilos é mostrado para comparação.

Figura 12 ilustra o efeito de CAT- 213 em quimiotaxia induzida

-5 por eotaxina de murinos e eotaxina de macaco rhresus de células L1.2-CCR3. Os dados são expressados como + SEM médio de pelo menos 3 experimentos realizados em triplicata ou duplicata, respectivamente.

A figura 13 mostra neutralização por CAT- 213 de quimiotaxia induzida por eotaxina humana de eosinófilos periféricos humanos. Os dados são expressos como + SEM médio de 3 experimentos, realizados com pontos em triplicata.

Figura 14 mostra que CAT- 213 inibiu a mudança de forma mediada por eotaxina de eosinófilos humanos. CAT- 001 (o anticorpo de controle) foi inativo. Os dados são expressos como SEM + médio de 5 experimentos realizados com pontos em duplicata.

Em um aspecto, a presente invenção provê um elemento de ligação específico que liga eotaxina humana e que compreende o domínio VH de CAT- 212 (SEQ ID No. 2) e/ou o domínio VL de CAT- 212 (SEQ ID No. 4).

Geralmente, um domínio VH é colocado aos pares com um domínio VL para prover um sítio de ligação de antígeno anticorpo, apesar de como discutido abaixo um domínio VH sozinho pode ser usados para ligar antígeno. Em uma forma de realização preferida, o domínio VH de CAT- 212 (SEQ ID No. 2) é colocado em ar com o domínio VL de CAT- 212 (SEQ ID

No. 4), de modo que o sítio de ligação de anticorpo - antígeno é formado compreendendo ambos os domínios VH e VL de CAT- 212. Em outras formas de realização, o VH de CAT- 212 é colocado em par com um domínio VL diferente de VL CAT- 212. A promiscuidade de cadeia leve é bem estabelecida na arte.

Um ou mais CDRs podem ser tomados do domínio VH ou VL de CAT- 212 e incorporados em uma armação apropriada. Isto é discutido ainda abaixo. CDRs 1 2 e 3 de VH de CAT- 212 são mostrados nas SEQ ID Nos. 5, 6 e 7, respectivamente. CDRs 1, 2 e 3 de VL de CAT- 212 são

-5 mostrados em SEQ ID Nos. 8, 9 e 10, respectivamente. Variantes dos domínios VH e VL e CDRs destas sequências são especificados aqui e que podem ser empregados em elementos de ligação específicos para eotaxina podem ser obtidos por meio dos métodos de alteração de seqüência ou mutação e triagem. Estes métodos são também providos pela presente invenção.

As variantes de seqüência de aminoácidos de domínio variável de qualquer um dos domínios VH e VL, cujas sequências são especificamente descritas aqui podem ser empregados de acordo com a presente invenção, como discutido. Os variantes particulares podem incluir uma ou mais alterações de seqüência de aminoácido (adição, deleção, substituição e/ou inserção de um resíduo de aminoácido), pode ser menor que cerca de 20 alterações, menor que cerca de 15 alterações, menor que cerca de 10 alterações ou menor que cerca de 5 alterações, 4, 3, 2 ou 1. As alterações podem ser feitas em uma ou mais regiões de armação e/ou um ou mais CDRs.

Um elemento de ligação específico de acordo com a invenção pode ser um que compete para ligação a antígeno com qualquer elemento de ligação específico que tanto liga o antígeno como compreende um elemento de ligação específico, domínio VH e/ou VL descrito aqui, ou VH CDR3 discutido aqui, ou variante de qualquer um destes. A competição entre elementos de ligação pode ser testada facilmente in vitro, por exemplo usando ELISA e/ou marcando uma etiqueta com uma molécula repórter específica para um elemento de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) elemento(s) de ligação não marcados com etiqueta, para permitir a identificação de elementos de ligação específicos que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo sobrejacente.

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Assim, um outro aspecto da presente invenção provê um elemento de ligação específico compreendendo um sítio de ligação de anticorpo - antígeno humano que compete com CAT- 212 ou CAT- 213 para ligação a eotaxina.

-5 Vários métodos são disponíveis na arte para obter anticorpos contra eotaxina e que podem competir com CAT- 212 ou CAT- 213 para ligação a eotaxina.

Em um outro aspecto, a presente invenção provê um método para obter um ou mais elementos de ligação específicos capazes de se ligar ao antígeno, o método incluindo colocar em contato uma coleção de elementos de ligação específicos de acordo com a invenção e referido antígeno, e selecionar um ou mais elementos de ligação específicos da coleção capazes de se ligar ao referido antígeno.

A coleção pode ser mostrada na superfície de partículas de bacteriófagos, cada partícula contendo ácido nucleico codificando o domínio variável VH de anticorpo mostrado em sua superfície, e opcionalmente também um domínio VL mostrado, se presente.

Após seleção de elementos de ligação específicos capazes de ligar o antígeno e mostrados em partículas de bacteriófagos, ácido nucleico pode ser tomado de uma partícula de bacteriófago mostrando o referido elemento de ligação específico selecionado. Este ácido nucleico pode ser usado em produção subseqüente de um elemento de ligação específico ou um domínio variável VH de anticorpo (opcionalmente um domínio variável VL de anticorpo) por expressão de ácido nucleico com a seqüência de ácido nucleico tomada de uma partícula de bacteriófago mostrando um referido elementos de ligação específico selecionado.

Um domínio variável VH de anticorpo com a seqüência de aminoácido de um domínio variável VH de anticorpo de referido elemento de ligação específico selecionado pode ser provido em forma isolada, como pode um elemento de ligação específico compreendendo este domínio VH. A capacidade de ligar eotaxina pode ser ainda testada, também capacidade para competir com CAT- 212 ou CAT- 212 para ligação a eotaxina. A capacidade para neutralizar eotaxina pode ser testada, como discutido ainda.

•5 Um elemento de ligação específico de acordo com a presente invenção pode ligar eotaxina com a afinidade de CAT- 212 ou CAT- 213.

Um elemento de ligação específico de acordo com a presente invenção pode neutralizar eotaxina com a potência de CAT- 212 ou CAT- 213.

A afinidade de ligação e potência de neutralização de diferentes elementos de ligação específicos podem ser comparadas sob condições apropriadas.

Além das sequências de anticorpo, um elemento de ligação específico de acordo com a presente invenção pode compreender outros aminoácidos, por exemplo formando um peptídeo ou polipeptídeo, como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional além da capacidade de ligar antígeno. Os elementos de ligação específicos da invenção podem ter um rótulo detectável, ou podem ser conjugados a uma toxina ou enzima (por exemplo via uma ligação peptidila ou ligante).

Em outros aspectos, a invenção provê um ácido nucleico isolado que compreende uma seqüência codificando um elemento de ligação específico, domínios VH ou VL de acordo com a presente invenção, e métodos para preparar um elemento de ligação específico, um domínio VH e/ou um domínio VL da invenção, que compreende a expressão do referido ácido nucleico sob condições para ocasionar a produção de referido elemento de ligação específico, domínio VH e/ou domínio VL, e recuperação do mesmo.

Os elementos de ligação específicos de acordo com a invenção podem ser usados em um método de tratamento ou diagnóstico de corpo humano ou animal, este método de tratamento (que pode incluir tratamento profilático) de uma doença ou distúrbio em um paciente humano que • · ·· ···· âO

compreende a administração ao referido paciente de uma quantidade efetiva de um elemento de ligação específico da invenção, condições tratáveis de acordo com a presente invenção incluem as discutidas abaixo aqui.

Um outro aspecto da presente invenção provê ácido nucleico, -5 geralmente isolado, codificando um domínio variável VH de anticorpo e/ou domínio variável VL discutidos aqui.

Um outro aspecto da presente invenção provê ácido nucleico, geralmente isolado, codificando uma seqüência CDR VH ou CDR VL aqui descrita, especialmente um CDR VH selecionado dentre SEQ ID No. 5, 6, e 7, ou um CDR VL selecionado dentre SEQ ID Nos. 8, 9 e 10, mais preferivelmente CDR3 VH de CAT- 212 (SEQ ID No. 7).

Um outro aspecto provê uma célula hospedeira transformada com ácido nucleico da invenção.

Ainda outro aspecto provê um método de produção de um 15 domínio variável VH de anticorpo, o método incluindo causar a expressão do ácido nucleico codificando. Este método pode compreender cultivar células hospedeiras sob condições para produção de referido domínio variável VH de anticorpo.

Os métodos análogos para produção de domínios variáveis VL 20 e elementos de ligação específicos compreendendo domínio VH e/ou VL são providos como outros aspectos da presente invenção.

Um método de produção pode compreender uma etapa de isolamento e/ou purificação do produto.

UM método de produção pode compreender a formulação de 25 produto em uma composição incluindo pelo menos um componente adicional, como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Estes e outros aspectos da invenção são descritos em outros detalhes abaixo.

• · • ·

TERMINOLOGIA Elemento de ligação específico

Este descreve um elemento de um par de moléculas que tem especificidade de ligação uma com a outra. Os elementos de um par de ligação

-5 específico podem ser naturalmente derivados ou totalmente ou parcialmente sinteticamente produzidos. Um elemento do par de moléculas tem uma área em sua superfície, ou uma cavidade, que especificamente liga e é assim complementar a uma organização polar e espacial particular do outro elemento do par de moléculas. Assim, os elementos do par tem a propriedade de ligar especificamente um ao outro. Exemplos de tipos de pares de ligação específicos são antígeno-anticorpo, biotina-avidina, receptor hormônio hormônio, receptor-ligando, enzima- substrato. Esta aplicação se refere com reações de tipo antígeno- anticorpo.

Anticorpo

Este descreve uma imunoglobulina natural ou parcialmente ou totalmente sinteticamente produzida. O termo também cobre qualquer polipeptídeo ou proteína tendo um domínio de ligação que é, ou é substancialmente homólogo a, um domínio de ligação de anticorpo. Exemplos de anticorpos são os isotipos de imunoglobulina e suas subclasses isotípicas, fragmentos que compreendem um domínio de ligação de antígeno como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos.

É possível fazer anticorpos monoclonais e outros e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que retém a especificidade do anticorpo original.

Estas técnicas podem envolver a introdução de DNA codificando a região variável de imunoglobulina, ou as regiões de determinação de complementariedade (CDRs) de um anticorpo para as regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de armação, de uma diferente imunoglobulina. Ver, por exemplo, EP-A-184187, GB 2188638A ou EP-A- 239400. Um • · hibridoma ou outra célula produzindo um anticorpo pode ser submetida a mutação genética ou outras mudanças, que podem ou não alterar a especificidade de ligação de anticorpos produzidos.

Como anticorpos podem ser modificados de vários modos, o

-5 termo anticorpo deve ser considerado como cobrindo qualquer elemento de ligação específico ou substância tendo um domínio de ligação com a requerida especificidade. Assim, este termo cobre fragmentos de anticorpo, derivados, equivalentes funcionais e homólogos de anticorpos, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, natural ou totalmente ou parcialmente sintético. As moléculas quimérica compreendendo um domínio de ligação de imunoglobulina, ou equivalente, fundidas em outro polipeptídeo, são assim incluídas. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricos são descritos em EP-A- 0120694 e EP-A- 0125023.

Foi mostrado que fragmentos de um anticorpo completo podem realizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos de ligação são (i) o fragmento Fab consistindo de domínios VL, VH, CL e CHI, (ii) o fragmento Fd compreendendo domínios VH e CHI, (iii) o fragmento Fv consistindo de domínios VL e VH de um anticorpo único, (iv) o fragmento dAb (Ward, E.S. et al, Nature 341, 544- 546 (1989)) que consiste de um domínio VH; (v) regiões CDR isoladas, (vi) fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados (vii) moléculas Fv de cadeia única (scFv) em que um domínio VH e um domínio VL são ligados por um ligante de peptídeo que permite aos dois domínios se associar para formar um sítio de ligação de antígeno (Bird et al, Science, 242, 423- 426, 1988,

Huston et al PNAS USA, 85, 5879- 5883, 1988), (viii) dímeros Fv de cadeia única bi-específica (PCT/ US92/09965) e (ix) diacorpos, fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (WO 94/13804; P. Holliger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90, 6444-6448, 1993). Moléculas Fv, scFv ou diacorpo podem ser estabilizadas pela incorporação de c2S pontes dissulfeto ligando os domínios VH e VL (Y. Reiter et al, Nature Biotech, 14, 1239- 1245, 1996). Os minicorpos compreendendo um scFv ligado a um domínio CH3 podem ser também feitos (S. Hu et al. Câncer REs. 56,3055-3061,1996).

-5 Os diacorpos são multímeros de polipeptídeos, cada polipeptídeo compreendendo um primeiro domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia leve de imunoglobulina e um segundo domínio compreendendo uma região de ligação de uma cadeia pesada de imunoglobulina, os dois domínios sendo ligados (por exemplo um ligante de peptídeo) mas incapaz de associar um com o outro para formar um sítio de ligação de antígeno: sítios de ligação de antígeno são formados pela associação do primeiro domínio de um polipeptídeo dentro do multímero com o segundo domínio de outro polipeptídeo dentro do multímero (WO94/

13804).

Onde os anticorpos bi-específicos devem ser usados, estes podem ser anticorpos bi-específicos convencionais, que podem ser fabricados em vários modos (Holliger, P. e Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446449 (1993)), por exemplo preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser qualquer um dos fragmentos de anticorpos bi20 específicos mencionados acima. Os diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando somente domínios variáveis, potencialmente reduzindo os efeitos de reação anti-idiotípica.

Os diacorpos bi-específicos, como oposto a anticorpos completos bi-específicos, também podem ser particularmente utilizáveis porque eles podem ser prontamente construídos e expressos em E. coli.

Diacorpos (e muitos outros polipeptídeos como fragmentos de anticorpos) de especificidades de ligação apropriadas podem ser prontamente selecionados usando exibição de fagos (WO94/ 13804) de coleçãos. Se um braço do diacorpo for ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade

dirigida contra antígeno X, então uma coleção pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriada selecionado. Os anticorpos completos bi-específicos podem ser feitos por engenharia de nósnos-furos (J.B.B. Ridgeway et al, Protein Eng. 9, 616- 621, 1996).

-5 Domínio de ligação a antígeno

Este descreve a parte de um anticorpo que compreende a área que especificamente liga a e é complementar a parte ou todo o antígeno. Quando um antígeno é grande, um anticorpo pode somente ligar a uma parte particular do antígeno, cuja parte é chamada um epítopo. Um domínio de ligação de antígeno pode ser provido por um ou mais domínios variáveis de anticorpo (por exemplo um assim chamado fragmento de anticorpo Fd consistindo de um domínio VH). Preferivelmente, um domínio de ligação de antígeno compreende uma região variável de cadeia leve de anticorpo (VL) e uma região variável de cadeia pesada de anticorpo (VH).

Específico

Este pode ser usado para se referir à situação em que um membro de um par de ligação específico não irá mostrar qualquer ligação significante a moléculas diferentes do que seu parceiro (s) de ligação específicos. O termo é também aplicável onde, por exemplo, um domínio de ligação a antígeno é específico para um epítopo particular que é transportado por vários antígenos, neste caso o elemento de ligação específico transportando o domínio de ligação de antígeno será capaz de ligar os vários antígenos transportando o epítopo.

Compreender

Este é geralmente usado no sentido de incluir, isto é, permitindo a presença de um ou mais aspectos ou componentes.

Isolado

Este se refere ao estado em que os elementos de ligação específicos da invenção, ou ácido nucleico codificando estes elementos de

ligação, estarão de acordo com a presente invenção. Os elementos e ácido nucleico serão livres ou substancialmente livres de material com o qual eles são naturalmente associados como outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos com os quais eles são encontrados em seu meio natural, ou o meio em que eles são

-5 preparados (por exemplo cultura de células) quando esta preparação é por tecnologia de DNA recombinante praticada in vitro ou in vivo. Os elementos e ácido nucleico podem ser formulados com diluentes ou adjuvantes e ainda por fins práticos serem isolados - por exemplo os elementos serão normalmente misturados com gelatina ou outros veículos se usados para revestir placas de microtitulação para uso em imunoensaios, ou serão misturados com veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes, quando usados em diagnóstico ou terapia. Os elementos de ligação específicos podem ser glicosilados, ou naturalmente ou por sistemas de células eucarióticas heterólogas (por exemplo células CHO ou NSO (ECACC 85110503) ou eles podem ser (por exemplo se produzidos por expressão em uma célula procariótica) não glicosilados.

Por substancialmente como especificado significa-se que o domínio CDR ou VH ou VL relevante da invenção será ou idêntico ou altamente similar às regiões especificadas dos quais a seqüência é aqui especificada. Por altamente similar é contemplado que 1 a 5, preferivelmente

1 a 4 coo 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições podem ser feitas no domínio

CDR e/ou VH ou VL.

A estrutura para realizar um CDR da invenção será geralmente de uma seqüência de cadeia pesada ou leve de anticorpo ou porção substancial do mesmo em que o CDR está localizado em um local correspondendo ao CDR de domínios variáveis de anticorpo VH ou VL de ocorrência natural codificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas e locais de domínios variáveis de imunoglobulina podem ser determinadas por referência a (Kabat E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological

Interest. 4a. ed, US Department of Health and Human Services, 1987, e

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(http://imuno.bme.nwu.edu)).

Preferivelmente, uma sequência de aminoácido CDR substancialmente como aqui especificado é transportada como um CDR em um

-.5 domínio variável humano ou uma porção substancial do mesmo. As sequências CDR3 VH substancialmente como especificado aqui representam formas de realização preferidas da presente invenção e prefere-se que cada uma destas seja transportada como um CDR3 VH em um domínio variável de cadeia pesada humano ou uma porção substancial do mesmo.

Os domínios variáveis empregados na invenção podem ser obtidos a partir de uma linhagem germinal ou um domínio variável humano rearranjado, ou podem ser um domínio variável sintético com base em sequências de consenso de domínios variáveis humanos conhecidos. Uma seqüência CDR da invenção (por exemplo CDR3) pode ser introduzida em um repertório de domínios variáveis faltando um CDR (por exemplo CDR3) usando tecnologia de DNA recombinante.

Por exemplo, Marks et al (Bio/Technology, 1992, 10: 779- 783) descrevem métodos de produção de repertórios de domínios variáveis de anticorpo em que iniciadores de consenso dirigidos em ou adjacentes à extremidade 5' da área de domínio variável são usados em conjunto com iniciadores de consenso para a terceira região de armação de genes VH humanos para prover um repertório de domínios variáveis VH faltando um CDR3. Marks et al ainda descrevem como este repertório pode ser combinado com um CDR3 de um anticorpo particular. Usando técnicas análogas, as sequências derivadas de CDR3 da presente invenção podem ser embaralhadas com repertórios de domínios VH ou VL faltando um CDR3, e os domínios VH ou VL completos embaralhados combinados com um domínio VL ou VH cognato para prover elementos de ligação específicos da invenção. O repertório pode ser então mostrado em um sistema hospedeiro apropriado como o sistema de exibição de fagos de WO 92/01047 de modo que elementos de ligação específicos apropriados podem ser selecionados. Um repertório pode consistir de algo de 10⁴ elementos individuais para cima, por exemplo de 10⁶ a 10⁸ ou 10¹⁰ elementos.

-5 Um embaralhamento análogo ou técnicas combinatoriais são também descritos por Stemmer (Nature, 1994, 370: 389- 391), que descreve a técnica em relação a um gene β- lactamase mas observa que a abordagem pode ser usada para a geração de anticorpos.

Uma outra alternativa é gerar novas regiões VH ou VL transportando uma seqüência derivada de CDR da invenção usando mutagênese aleatória de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados para gerar mutações dentro de todo o domínio variável. Esta técnica é descrita por Gram et al (1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89: 3576- 3580), que usou PCR à prova de erros.

Outro método que pode ser usado é para dirigir mutagênese a regiões CDR de genes VH ou VL. Estas técnicas são descritas por Barbas et al (1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91- 3809- 3813) e Schier et al (1996, J. Mol. Biol. 263- 551-567).

Todas as técnicas acima mencionadas são conhecidas como tal na arte e não forma sozinhas parte da presente invenção. Os versados na arte serão capazes de usar estas técnicas para prover elementos de ligação específicos da invenção usando metodologia de rotina conhecida na arte.

Um outro aspecto da invenção provê um método para obter um domínio de ligação de anticorpo antígeno específico para antígeno de eotaxina, o método compreendendo prover, a título de adição, deleção, substituição ou inserção, um ou mais aminoácidos na seqüência de aminoácido de um domínio VH especificado aqui um domínio VH que é um variante de seqüência de aminoácido de domínio VH, opcionalmente combinando o domínio VH assim provido, com um ou mais domínios VL, e testar o domínio £3

VH ou combinação VH/VL ou combinações para identificar um elemento de ligação específico ou um domínio de ligação anticorpo antígeno específico para um antígeno de eotaxina e opcionalmente com uma ou mais das propriedades preferidas, preferivelmente capacidade para neutralizar a '-5 atividade de eotaxina. Referido domínio VL pode ter uma seqüência de aminoácido que é como substancialmente especificado aqui.

Um método análogo pode ser empregado em que um ou mais variantes de seqüência de um domínio VL discutido aqui são combinados com um ou mais domínios VH.

Um outro aspecto da invenção provê um método para preparar um elemento de ligação específico, específico para antígeno de eotaxina, cujo método compreende:

(a) prover um repertório de partida de ácidos nucleicos codificando um domínio VH que ou inclui um CDR3 a ser substituído ou faltando uma região de codificação CDR3, (b) combinar referido repertório com um ácido nucleico doador codificando uma seqüência de aminoácidos substancialmente como especificado aqui para um VH CDR3 de modo que referido ácido nucleico doador é inserido na região CDR3 no repertório, de modo a prover um repertório de produto de ácidos nucleicos codificando um domínio VH;

(c) expressar os ácidos nucleicos de referido repertório de produto;

(d) selecionar um elemento de ligação específico, específico para um antígeno de eotaxina, e (e) recuperar referido elemento de ligação específico ou ácido nucleico codificando o mesmo.

Novamente, um método análogo pode ser empregado em que um VL CDR3 da invenção é combinado com um repertório de ácidos nucleicos codificando um domínio VL que ou inclui um CDR3 a ser substituído ou faltar uma região codificando CDR3.

Similarmente, um ou mais, ou todos os três CDRs podem ser enxertados em um repertório de domínios VH ou VL que são, então, triados *' para um elemento de ligação específico ou elementos de ligação específicos, *- 5 específicos para antígeno de eotaxina.

Uma porção substancial de um domínio variável de imunoglobulina irá compreender pelo menos as três regiões CDR, juntas com suas regiões de armação intervenientes. Preferivelmente, a porção também irá incluir pelo menos cerca de 50% de uma ou ambas as primeira e quarta regiões de armação, os 50% sendo os 50% C-terminais da primeira região de armação e os 50% N-terminais da quarta região de armação. Os resíduos adicionais na extremidade N-terminal ou C-terminal da parte substancial do domínio variável podem ser os não normalmente associados com as regiões de domínio variável de ocorrência natural. Por exemplo, a construção de elementos de ligação específicos da presente invenção feita por técnicas de DNA recombinantes pode resultar na introdução de resíduos NB ou C-terminais codificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem de outras etapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introdução de ligantes para unir domínios variáveis da invenção para outras sequências de proteína incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, outros domínios variáveis (por exemplo na produção de diacorpos) ou rótulos de proteína, como discutido em maiores detalhes abaixo.

Apesar de um aspecto preferido da invenção, elementos de ligação específicos compreendendo um par de domínios VH e VL são preferidos, os domínios de ligação únicos com base em sequências de domínio

VH ou VL formam outros aspectos da invenção. Sabe-se que os domínios de imunoglobulina únicos, especialmente domínios VH, são capazes de ligar antígenos de marcação de ligação em um modo específico.

No caso de um dos domínios de ligação específicos de cadeia ···* ::: ::: :”:

única, estes domínios podem ser usados para triar domínios complementares capazes de formar um elemento de ligação específico de dois domínios capaz de ligar eotaxina.

Isto pode ser obtido por métodos de triagem de exibição de »-5 fagos usando a assim chamada abordagem combinatorial dual hierárquica como descrito em WO 92/01047, em que uma colônia individual contendo ou um clone de cadeia H ou L é usada para infectar uma coleçãos completa de clones codificando a outra cadeia (L ou H) e o elemento de ligação específico de duas cadeias resultante é selecionado de acordo com técnicas de exibição de fagos, como descrito na referência. Esta técnica é também descrita em Marks et al, ibid.

Os elementos de ligação específicos da presente invenção podem ainda compreender regiões constantes de anticorpos ou partes do mesmo. Por exemplo, um domínio VL pode ser fixado à sua extremidade ΟΙ 5 terminal para domínios constantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias Ck ou Ολ, preferivelmente cadeias λ. Similarmente, um elemento de ligação específico com base em domínio VH pode ser fixado em sua extremidade C-terminal para toda ou parte de uma cadeia pesada de imunoglobulina derivada de qualquer isotipo de anticorpo, por exemplo IgG,

IgA, IgE e IgM e qualquer uma das sub-classes de isotipos, particularmente IgGl e IgG4. IgG4 é preferido.

Os elementos de ligação específicos da invenção podem ser rotulados com um rótulo detectável ou funcional. Os rótulos detectáveis incluem radio-rótulos como ¹³ 4 ou ⁹⁹Tc, que pode ser fixado a anticorpos da invenção usando química convencional conhecida na arte de formação de imagem de anticorpos. Os rótulos também incluem rótulos de enzima como peroxidase de raiz forte. Os rótulos ainda incluem porções químicas como biotina que pode ser detectada via ligação a uma porção detectável cognata específica, por exemplo avidina rotulada.

.31 ···* · · · ··-····

Os elementos de ligação específicos da presente invenção são projetados para serem usados em métodos de diagnóstico ou tratamento em indivíduos humanos ou animais preferivelmente humanos.

Conseqüentemente, outros aspectos da invenção provêem ». 5 métodos de tratamento compreendendo administração de um elemento de ligação específico como provido, composições farmacêuticas compreendendo este elemento de ligação específico e uso deste elemento de ligação específico na fabricação de um medicamento para administração, por exemplo, em um método para fazer um medicamento ou composição farmacêutica compreendendo a formulação do elemento de ligação específico com um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As indicações clínicas em que um anticorpo anti-eotaxina pode ser usado para prover beneficio terapêutico incluem asma, eczema, (dermatite atópica), e outras doenças atópicas como rinite, conjuntividade, alergia a alimentos, colite alérgica que são reconhecidos como doenças mediadas por eosinófilos. A evidência experimental favorece eosinófílos como uma causa da maior parte dos casos de atopia como o tratamento anti- eotaxina é provável como efetivo para todas estas doenças. Existem outras condições alérgicas, como arpergilose broncopulmonar alérgica, e eosinofilia trópica, que tem elevadas contagens de eosinófilos periféricos e que podem ser o assunto de um tratamento anti-eotaxina.

Particularmente, o tratamento anti-eotaxina de acordo com a presente invenção pode ser usado para prover beneficio claro para muitos pacientes com asma (Mattoli et al, 1997; Ying et al, 1997; Brown et al, 1998).

Cerca de 10% da população do Reino Unido tem asma e tratamento corrente não é sempre satisfatório, cerca de 2000 mortes por ano na Inglaterra e Wales são atribuídas a asma e cerca de 6% de pessoas com asma são admitidas em hospitais (com sintomas asmáticos) a cada ano. Existe uma necessidade clara para melhorado tratamento tanto para evitar sintomas de asma como para tratar

3*226 ···* · ; · ; ; · j**; ’· sintomas mais severos, uma vez desenvolvidos. O tratamento anti-eotaxina pode ser dado oralmente, por injeção (por exemplo subcutaneamente ou em emergências intravenosamente), por inalação (para otimizar o perfil dos efeitos benéficos comparados com quaisquer efeitos indesejados) ou por vias

-.5 alternativas de administração. A via de administração pode ser determinada pelas características fisicoquímicas do tratamento, por considerações especiais para a doença, para otimizar eficiência ou para minimizar efeitos laterais.

As condições da pele podem ser melhor tratadas com tratamento tópico com anti-eotaxina. A pele doente com freqüência tem aumentada capacidade absortiva, comparada com pele saudável, de modo que o tratamento tópico pode bem prover a melhor via para terapia, onde é necessária, sem efeitos indesejáveis em outras partes do corpo. Se a condição da pele cobrir a maior parte do corpo, ou se a doença for severa (talvez afetando outros órgãos assim como a pele), então a administração por injeção ou por outro meio eficiente pode ser mais apropriada do que a via tópica. A injeção local pode ser apropriada sob algumas circunstâncias (ver o parágrafo anterior).

Visa-se que o tratamento anti-eotaxina não será limitado ao uso na clínica. Os pacientes podem auto-administrar o tratamento e administração diária pode ser preferida sobre complexos esquemas de dosagem.

Os tratamentos de combinação podem ser usados para prover efeitos sinergísticos significantes, particularmente a combinação de um alelo anti-eotaxina, com uma ou mais drogas anti-interleucina-5 (IL-5). Um elemento de ligação específico, de acordo com a presente invenção, pode ser provido em combinação ou adição de um ou mais corticosteróides, particularmente um ou mais corticosteróides sistêmicos. O tratamento de combinação com um ou mais de outros agentes anti-asma/ anti-alergia, especialmente sobre antagonistas Apreventers@ como cromoglicato, leucotrieno (receptor), xantinas e broncodilatadores de longa ação, podem ser

2Ί empregados para tratamento da asma. As considerações similares de combinações se aplicam ao uso de tratamento anti-eotaxina para pele e outras condições atópicas.

Todas as formas de psoríase, urticária (incluindo urticária

-5 aguda, urticária recorrente crônica, urticária de pressão retardada, urticária fria, urticária dermográfica), prurigo nodularis, erupções eritematosas papulares, penfigóide, porfiria cutânea tarda, reação leve persistente, síndrome de Well, celulite eosinofilia, erupções por drogas, vasculite ( manifestação da pele), púrpura e outras condições da pele podem ser tratados com anti-eotaxina de acordo com a presente invenção. Estas condições podem cobrir uma grande proporção do corpo, podem envolver órgãos diferentes da pele e podem não levar a pele a ter uma aumentada permeabilidade. Mesmo se aplicados de modo efetivo topicamente, no sítio de ação, a via preferida pode ser sistêmica (através do corpo) para as mesmas considerações como sugerido por indicações atópicas. Severa doença de pele com manifestações sistêmicas associadas é um bom exemplo de uma situação em que o tratamento sistêmico pode ser preferido para tratamento tópico ou injeção local.

A doença do intestino inflamatório (colite ulcerativa e doença de Crohn) e colite/ enterite/ gastroenterite/ síndrome de Sulman eosinofílica podem ser tratadas efetivamente com uma terapia anti-eotaxina. Os eosinófilos aparecem como um tipo de célula proeminente nas lesões que caracterizam estas doenças.

Vasculite de várias formas, especialmente idiopática, síndrome de Hugues- Stovin, síndrome de Churg-Strauss, granulomatose broncocêntrica, pneumonite eosinofílica (síndrome de Loffler), eosinofilia pulmonar prolongada, síndrome de Ommen, síndrome de Wiskott- Aldrich, eosinofilia familiar e hiper-eosinofilia idiopática podem ser tratadas com anti-eotaxina.

A eosinofilia de causa desconhecida pode resultar em complicações como pneumonite, vasculite, colite, enterite, gastroenterite, endocardite de Loffler, e fibrose da válvula do coração e muitas síndromes afetando o tecido conectivo. A eosinofilia também pode estar associada com doença maligna (especialmente linfomas, leucemias e cânceres do trato gastrointestinal), tratamentos com drogas (por exemplo infusões citoquinas) e

-5 síndrome da fadiga crônica. O tratamento anti-eotaxina pode ser empregado em qualquer uma destas doenças. Similarmente, síndrome eosinofilia - mialgia, síndrome de óleo tóxico, fasciite difusa com eosinofilia (fasciite eosinofílica) e miosite eosinofílica podem ser tratadas com anti-eotaxina.

A atração de eosinófilos causada por parasitas também pode ter um efeito prejudicial, assim a intervenção com anti-eotaxina nestas condições pode prover benefício. As doenças envolvendo atração por eosinófilos por patógenos incluem infecção por protozoários, e infecções por metazoários, como infestação por helmintos e especialmente infecções por nematódeos (por exemplo filariase, vermes, oncocerciase, toxocariase, ascariase e triquinose, angiostrogiliase, [ meningite eosinofílica]). Uma doença parasítica assintomática pode ser a causa de muitas das formas idiopáticas de doença mediada por eosinófilos.

O tratamento anti-eotaxina pode ter um efeito em células diferente de eosinófilos, por exemplo os expressando CDR-3 como basófilos.

De acordo com a presente invenção, composições providas podem ser administradas a indivíduos. A administração é preferivelmente em uma quantidade terapeuticamente efetiva, esta sendo suficiente para mostrar benefício a um paciente. Este benefício pode ser pelo menos melhora de pelo menos um sintoma. A quantidade real administrada e taxa e curso no tempo de administração, irão depender da natureza e severidade do que está sendo tratado. A prescrição de tratamento, por exemplo decisões em dosagem, etc, está dentro da responsabilidade dos práticos médicos e outros doutores. As doses apropriadas de anticorpo são bem conhecidas dos versados na arte, ver

Ledermann J.A. et al, (1991) Int. J. Câncer 47: 659- 664, Bagshawe K.D. et al (1991) Antibody, Immunoconjugates e Radiopharmaceuticals, 4: 915- 922.

A dose precisa irá depender de vários fatores, incluindo se o anticorpo é para diagnóstico ou para tratamento, o tamanho e o local da área a serem tratados, a natureza precisa do anticorpo (por exemplo anticorpo total,

--5 fragmento ou diacorpo), e a natureza de qualquer rótulo detectável ou outra molécula fixado ao anticorpo. Uma dose de anticorpo típica estará na faixa de 0,5 mg a 100 g para aplicações sistêmicas, e 10 pg a 1 mg para aplicações locais. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpo total, preferivelmente o isotipo IgG4. Esta é uma dose para tratamento único de um paciente adulto, que pode ser ajustada de modo proporcional para crianças e bebês, e também ajustada para outros formatos de anticorpo em proporção ao peso molecular. Os tratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, duas vezes por semana, semanalmente ou mensalmente, conforme recomendações do médico.

Os elementos de ligação específicos da presente invenção irão geralmente ser administrados na forma de uma composição farmacêutica, que pode compreender pelo menos um componente além do elemento de ligação específico.

Assim, composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção e para uso de acordo com a presente invenção podem compreender, além do ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamente aceitável, veículo, tampão, estabilizador ou outros materiais bem conhecidos dos versados na arte. Estes materiais devem ser não tóxicos e devem não interferir com a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outro material irá depender da via de administração, que pode ser oral, ou por injeção, por exemplo intravenosa.

As composições farmacêuticas para administração oral podem estar em forma de comprimido, cápsula, pó ou líquido. Um comprimido pode compreender um veículo sólido como gelatina ou adjuvante. As composições farmacêuticas líquidas geralmente compreendem um veículo líquido com água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleo sintético. A solução salina fisiológica, dextrose ou outra solução de sacarídeos ou glicóis como etileno glicol, propileno glicol ou polietileno glicol podem ser incluídos.

Para injeção intravenosa, ou injeção no sítio do mal aflitivo, o .5 ingrediente ativo estará na forma de uma solução aquosa parenteralmente aceitável, que é isenta de pirogênios e tem um pH apropriado, isotonicidade e estabilidade. Os versados na arte sabem bem preparar soluções apropriadas usando, por exemplo, veículos isotônicos, como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer, injeção de Ringer lactada. Os conservantes, estabilizantes, tampões, anti-oxidantes, e/ou outros aditivos podem ser incluídos, se requerido.

Uma composição pode ser administrada sozinha ou em combinação com outros tratamentos, simultaneamente ou seqüencialmente dependente da condição a ser tratada. Outros tratamentos podem incluir a administração de doses apropriadas de drogas para alívio da dor, como drogas anti-inflamatórias não esteroidais (por exemplo aspirina, paracetamol, ibuprofen ou cetoprofen) ou opiatos como morfina, ou anti-eméticos.

A presente invenção provê um método compreendendo causar ou permitir a ligação de um elemento de ligação específico como provido aqui para eotaxina. Como notado, esta ligação pode ocorrer in vivo, por exemplo após administração de um elemento de ligação específico, ou ácido nucleico codificando um elemento de ligação específico, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo em Elisa, western blotting, imunocitoquímica, imuno-precipitação ou cromatografia por afinidade.

A quantidade de ligação de elemento de ligação específico para eotaxina pode ser determinada. A quantificação pode estar relacionada à quantidade do antígeno em uma amostra de teste, que pode ser de interesse diagnóstico, que pode ser de interesse diagnóstico.

As reatividades dos anticorpos em uma amostra podem ser

3$ determinadas por qualquer meio apropriado. RAdioimunoensaio (RIA) é uma possibilidade. O antígeno rotulado radioativo é misturado com antígeno não rotulado (a amostra de teste) e deixado se ligar ao anticorpo. O antígeno ligado é fisicamente separado do antígeno não ligado e a quantidade de antígeno

- .5 radiotativo ligado ao anticorpo determinada. Quanto mais antígeno se tem na amostra de teste, mesmo o antígeno radioativo irá ligar ao anticorpo. Um teste de ligação competitivo também pode ser usado com antígeno não radioativo, usando antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. A molécula repórter pode ser um fluorocromo, fósforo ou corante laser, com absorção espectralmente isolada ou características de emissão. Os fluorocromos apropriados incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e Texas Red. Os corantes cromogênicos apropriados incluem diaminobenzidina.

Outros repórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou material em partículas como contas de látex que são coloridas, magnéticas ou para-magnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos que podem diretamente ou indiretamente causar sinais detectáveis para serem visualmente observados, eletronicamente detectados ou de outra forma registrados. Estas moléculas podem ser enzimas que catalisam reações que desenvolvem ou mudam de cores ou causam mudanças em propriedades elétricas, por exemplo. Elas podem ser molecularmente excitáveis, como as transições eletrônicas entre estados de energia resultam em absorções espectrais características ou emissões. Elas podem incluir entidades químicas usadas em conjunto com bio-sensores. Sistemas de detecção de biotina/ avidina ou biotina/ estreptavidina e fosfatase alcalina podem ser empregados.

Os sinais gerados por conjugados anticorpo -repórter individuais podem ser usados para derivar dados relativos ou absolutos quantificáveis da ligação de anticorpo relevante em amostras (normal e teste).

A presente invenção também provê o uso de um elemento de .30 i*·* ; j ϊ · · · *··· .·* ligação específico como acima para medir os níveis de antígeno em um teste de competição, isto é um método para medir o nível de antígeno em uma amostra por emprego de um elemento de ligação específico como provido pela presente invenção em um ensaio de competição. Isto pode ser onde a • -5 separação física de antígeno ligado para não ligado não é requerida. A ligação de uma molécula repórter para o elemento de ligação específico de modo que uma mudança física ou óptica ocorre sobre a ligação é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar de modo direto ou indireto sinais detectáveis, e preferivelmente mensuráveis. A ligação de moléculas repórter pode ser direta ou indireta, covalente, por exemplo via uma ligação peptídeo ou não covalente. A ligação via uma ligação peptídeo pode ser como um resultado de expressão recombinante de uma fusão de gene codificando anticorpo e molécula repórter.

A presente invenção também prove medir os níveis de antígeno diretamente, por emprego de um elemento de ligação específico de acordo com a invenção, por exemplo em um sistema biossensor.

O modo de determinação da ligação não é um aspecto da presente invenção e os versados na arte são capazes de escolher um modo apropriado de acordo com sua preferência e conhecimento geral.

A presente invenção ainda se estende a um elemento de ligação específico que compete para ligação com eotaxina com qualquer elemento de ligação específico que tanto liga o antígeno como compreende um domínio V incluindo um CDR com um aminoácido substancialmente como aqui especificado ou um domínio V com uma seqüência de aminoácido como aqui substancialmente especificado. A competição entre os elementos de ligação pode ser testada facilmente in vitro, por exemplo por marcação com etiquetas de uma molécula repórter específica para um elemento de ligação que pode ser detectado na presença de outro(s) elemento(s) de ligação não etiquetados, para permitir a identificação de elementos de ligação específicos que ligam o mesmo epítopo ou um epítopo de sobreposição. A competição pode ser determinada por exemplo usando o ELISA como descrito no exemplo 1.

No teste para competição, um fragmento de peptídeo do antígeno pode ser empregado, especialmente um peptídeo incluindo um

-5 epítopo de interesse. Um peptídeo tendo a seqüência de epítopo mais um ou mais aminoácidos em ambas as extremidades pode ser usado. Este peptídeo pode ser dito como consistindo essencialmente da seqüência especificada. Os elementos de ligação específicos de acordo com a presente invenção podem ser tais que sua ligação para antígeno é inibida por um peptídeo com ou incluindo a seqüência dada. No teste para isto, um peptídeo com ou seqüência mais um ou mais aminoácidos pode ser usado.

Os elementos de ligação específicos que ligam um peptídeo específico podem isolados por exemplo de uma coleção de exibição de fagos por bateia com o(s) peptídeo(s).

A presente invenção ainda provê um ácido nucleico isolado codificando um elemento de ligação específico da presente invenção. O ácido nucleico inclui DNA ou RNA. Em um aspecto preferido, a presente invenção provê um ácido nucleico que codifica para um domínio VH ou VL ou CDR da invenção, como definido acima.

A presente invenção também provê construções na forma de plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão, que compreendem pelo menos um polinucleotídeo, como acima.

A presente invenção também provê uma célula hospedeira recombinante que compreende uma ou mais construções, como acima. Um ácido nucleico codificando qualquer domínio VH, VL ou CDR, ou elemento de ligação específico como provido forma, sozinho, um aspecto da presente invenção, assim como um método de produção do produto codificado, cujo método compreende expressão da codificação de ácido nucleico para o mesmo.

A expressão pode ser obtida, de modo conveniente, por cultura sob condições apropriadas de células hospedeiras recombinantes contendo o ácido nucleico.

Após a produção por expressão de um domínio VH ou VL, ou elemento de ligação específico pode ser isolado e/ou purificado usando qualquer técnica apropriada, então usado como apropriado.

-.5 Os elementos de ligação específicos, domínios VH e/ou VL, e codificando moléculas de ácido nucleico e vetores de acordo com a presente invenção podem ser providos isolados e/ou purificados, por exemplo de seu meio natural, em forma substancialmente pura ou homogênea, ou, no caso de ácido nucleico, livre ou substancialmente livre de ácido nucleico ou genes de origem diferente da seqüência codificando um polipeptídeo com a requerida função. O ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode compreender DNA ou RNA e pode ser totalmente ou parcialmente sintético. Referência a uma seqüência de nucleotídeos como aqui especificado engloba uma molécula de DNA com a seqüência especificada, e engloba uma molécula de RNA com a seqüência especificada em que U é substituído por T, salvo se o contexto requerer de outra forma.

Os sistemas para clonagem e expressão de um polipeptídeo em várias diferentes células hospedeiras são bem conhecidos. As células hospedeiras incluem bactérias, células de mamíferos, leveduras e sistemas de baculovírus. As linhagens de célula de mamíferos disponíveis na arte para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluem células de ovário de hamster chinês, células HeLa, células de rim de hamster bebê, células de melanoma de camundongos NSO e muitas outras. Um hospedeiro bacteriano preferido, comum, é E. coli.

A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos em células procarióticas como E. coli é bem estabelecida na arte. Para um estudo ver por exemplo Pluckthun, A. Bio/Technology, 9: 545-551 (1991). A expressão em células eucarióticas em cultura é também disponível para os versados na arte como uma opção para a produção de um elemento de ligação específico, ver para estudos recentes, por exemplo Ref. M.E. (1993) Curr. Opinion Biotech, 4: 573- 576, Trill J.J. et al, (1995) Curr. Opinion Biotech. 6: 553- 560.

Os vetores apropriados podem ser escolhidos ou construídos,

-.5 contendo sequências regulatórias apropriadas, incluindo sequências de promotor, sequências de terminador, sequências de poliadenilação, sequências de melhorador, genes marcadores, e outras sequências como apropriado. Os vetores podem ser plasmídeos, virais, por exemplo fago, ou fagemídeo, como apropriado. Para outros detalhes, ver, por exemplo, Sambrook et al, Molecular

Cloning, A laboratory Manual, 2a. ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muitas técnicas conhecidas e protocolos para manipulação de ácido nucleico, por exemplo na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, seqüenciamento, introdução de DNA em células e expressão de genes, e análise de proteínas, são descritos em detalhes em Current Protocols in

Molecular Biology, 2a. ed, Ausubel et al, ed. John Wiley & Sons, 1992. As descrições de Sambrook et al, e Ausubel et al são aqui incorporadas por referência.

Assim, um outro aspecto da presente invenção provê uma célula hospedeira contendo ácido nucleico como descrito aqui. Ainda outro aspecto provê um método compreendendo a introdução de tal ácido nucleico em uma célula hospedeira. A introdução pode empregar qualquer técnica disponível. Para células eucarióticas, técnicas apropriadas podem incluir transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação, transfecção mediada por lipossoma, e transdução usando retrovírus ou outros vírus, por exemplo vaccínia ou para células de insetos, baculovírus. Para células bacterianas, técnicas apropriadas podem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecção usando bacteriófagos.

A introdução pode ser seguida ao levar ou permitir a expressão do ácido nucleico, por exemplo por cultivo de células hospedeiras sob condições para expressão do gene.

Em uma forma de realização, o ácido nucleico da invenção é integrado no genoma (por exemplo cromossomo) da célula hospedeira. A integração pode ser promovida por inclusão de sequências que promovem a

..5 recombinação com o genoma, de acordo com técnicas padrões.

A presente invenção também provê um método que compreende usar uma construção como descrito acima em um sistema de expressão a fim de expressar um elemento de ligação específico ou polipeptídeo como acima.

Aspectos e formas de realização da presente invenção serão agora ilustrados a título de exemplo com referência à seguinte experimentação. ABREVIATURAS

TES: 0,2 M Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sacarose;

2TYAG: 2TY suplementado com 100 pg/ml ampicilina e 2% glucose;

2TYAK: 2TY suplementado com 100 pg/ml ampicilina e 50 pg/ml canamicina;

TMB: 3,3',5,5'- tetrametil benzidina;

ACE: 3-amino-9-etil-carbazol;

IC₅o : 50% concentração inibidora;

6MPBS: 6 x PBS contendo 18% solução bloqueio Marvel;

A: Absorbância;

BSA: albumina de soro bovino;

BAL : lavagem broncoalveolar;

CCR : receptor de quimioquina CC;

CC : Cys-Cys;

DMEM: meio de Eagle modificado por Dulbecco;

ELISA : ensaio imunossorvente ligado a enzima;

Fluo-3- AM: Fluo-3-acetóximetil áster;

FCS: soro bezerro fetal;

Grupos: glutamina sintetase;

V_H : variável de cadeia pesada;

HRP : peroxidase de raiz forte

IMAC : cromatografia de afinidade de metal imobilizada; s.5 ICC: imunocitoquímica;

Ig: imunoglobulina;

IPTG: β- D-tiogalactopiranosídeo de isopropila;

V_L : variável de cadeia leve;

MCP : proteína quimio-atraente de monócitos;

MOI: multiplicidade de infecção;

Hepes: ácido [N-[2-hidroxietil] piperazina- Ν'- 2-etanossulfônico)

NM: Nanomolar;

NHS : N-hidróxi succinimida;

NSO: mieloma 0 de camundongo não secretante;

OCT : composto de tecido de corte ótimo;

MPBS; PBS contendo 3% Marvel;

PBS : solução salina tamponada com fosfato;

PBST / 0,05: solução salina tamponada com fosfato + 0,05% (v/v) Tween 20, PBST : solução salina tamponada com fosfato + 0,1% (v/v) Tween 20;

PM : picomolar;

Page : eletroforese de gel poliacrilamida PCR: reação de cadeia polimerase ScFv: variável de fragmento de cadeia única;

SDS : dodecil sulfato de sódio;

SELDI: dessorção/ ionização de laser melhorada na superfície;

TNF - a: fator alfa de necrose de tumor.

LISTA DE EXEMPLOS EXPERIMENTAIS:

EXEMPLO 1 : Isolamento de scFvs de eotaxina anti-humano

EXEMPLO 2 : Potência de neutralização de scFv 3G3 em um ensaio de

quimiotaxia

EXEMPLO 3 : Derivação e seqüência de CAT- 212 EXEMPLO 4 : Especificidade de CAT- 212

EXEMPLO 5 : Potência de neutralização de CAT- 212 em um ensaio de . .5 quimiotaxia

EXEMPLO 6 : Teste de competição de CAT- 212 para ligação de eotaxina a CAT-212

EXEMPLO 7 : determinação de afinidade de CAT- 212 para eotaxina EXEMPLO 8 : Competição de eotaxina de camundongo para ligação a CAT10 212

EXEMPLO 9 : Potência de neutralização de CAT- 212 em um ensaio de fluxo de cálcio

EXEMPLO 10 : Imunorreatividade de CAT- 212 compólipo nasal humano EXEMPLO 11 : Conversão de CAT- 212 para formato IgG4 (CAT- 213)

EXEMPLO 12 : Potência de neutralização de CAT- 213 em um ensaio de quimiotaxia

EXEMPLO 13 : Ensaio de competição para ligação de eotaxina a CAT- 212 EXEMPLO 14 : Efeitos de CAT- 212 e CAT- 213 em um modelo in vivo de inflamação alérgica

EXEMPLO 15 : Potência de neutralização de CAT- 213 em um ensaio de quimiotaxia mediado por eotaxina usando células transfectadas L1.2 CCR-3 : eotaxina de macaco rhesus e camundongos

EXEMPLO 16 : Potência de nucleotídeo de CAT- 213 em um ensaio de quimiotaxia mediado por eotaxina usando eosinófilos humanos

EXEMPLO 17 : Potência de neutralização de CAT- 213 em um ensaio de mudança de forma de eosinófilos mediado por eotaxina

EXEMPLO 1 :

Isolamento de scFvs de eotaxina anti-humano

Repertório de anticorpo scFv «· «·

Uma coleção de anticorpo humano Fv de cadeia única, grande, (Vaughan et al, 1996) derivado de B- linfócitos da amígdala, medula óssea e sangue periférico e clonada em um vetor de fagemídeo foi usada para seleções.

Este repertório scFV é calculado para ter cerca de 1,3 χ IO¹⁰ recombinantes . .5 individuais. Os anticorpos deste repertório também incorporam uma porção Cterminal de 6 histidinas para permitir a purificação de scFv por cromatografia de afinidade de metal imobilizada (IMAC) e uma seqüência curta derivada de c-myc para dar um sistema de detecção genérico usando este anticorpo anti-cmyc- monoclonal, 9E10.

Seleção de scFv

Eotaxina humana (Cambridge BioSciences), foi revestido a 10 pg/ml ou diretamente em imunotubos (Nunc; Maxisorp) ou copulado a BSA ativado com suberato de dissuccinimidila revestido sobre placas de 12 microtitulação de Maxisorb (Nunc). Para o primeiro ciclo de seleção, 10 unidades tituladas de fago da coleção foram usados. Três ciclos de seleção da coleção scFv foram realizados de acordo com instruções de protocolos de bateia padrões (Vaughan et al, 1996). Os clones individuais de ciclos 2 e 3 de seleção foram resgatados e triados por fago ELISA.

Resgate de fago para ELISA

Colônias individuais de ciclos 2 e 3 de seleção foram inoculadas em placas de 96 reservatórios contendo 100 μΐ de meio 2TY suplementado com 100 pg/ml de ampicilina e 2% glucose (2TYAG) por reservatório. As placas foram incubadas a 37 °C durante 4 h, agitando. O fago auxiliador M13KO7 foi adicionado a cada reservatório em um MOI de 10 e as placas incubadas durante outra hora a 37 °C. As placas foram centrifugadas em uma centrífuga de topo de banca a 2000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi removido e as pelotas de células foram recolocadas em suspensão em 100 μΐ 2TY suplementado com 100 pg/ml de ampicilina e 50 pg/ml canamicina (2TYAK) e incubados a 30 °C durante a noite com agitação. As placas foram • « • * ···* centrifugadas a 2000 rpm durante 10 min e o sobrenadante contendo fato de

100 μΐ de cada reservatório recuperado em uma placa de 96 reservatórios. Para bloquear o fago, 20 μΐ de 6 x PBS contendo 18% solução de bloqueio Marvel (6MPBS) foi adicionado a cada reservatório e incubado em temperatura . .5 ambiente durante 1 hora. O fago agora está pronto para uso em ELISA.

Fago Elisa

Placas de 96 reservatórios flexíveis (Falcon) foram revestidas durante a noite a 40 °C com 0,5 qg/ml de eotaxina humana em PBS, ou com PBS sozinho como controle. Após revestimento, as soluções foram removidas dos reservatórios, e as placas bloqueadas durante 1 h em temperatura ambiente em PBS contendo 3% Marvel (MPBS). As placas foram lavadas 3 vezes com PBS e então 50 μΐ de fago pré-bloqueado adicionado a cada reservatório. As placas foram incubadas estacionárias a temperatura ambiente durante 1 hora. As placas foram lavadas com 3 mudanças de PBS contendo 0,1% (v/v) Tween

20 (PBST) seguido por 3 mudanças de PBS em temperatura ambiente.

A cada reservatório, 50 μΐ de um conjugado anti -gene VIII HRP (Pharmacia) em um 1 diluição 5000 em MPBS foram adicionados e as placas incubadas em temperatura ambiente durante 1 h. Cada placa foi lavada 3 x com PBST seguido por 3 X com PBS. 50 μΐ de substrato 3,3',5,5'- tetrametil benzidina (TMB; Sigma) foi então adicionado a cada reservatório, e incubado em temperatura ambiente durante 30 min ou até revelação da cor. A reação foi parada pela adição de 25 μΐ de 0,5 M H₂SO₄. O sinal gerado foi medido por leitura da absorbância a 450 nm (A450) usando uma leitora de placa de microtitulação (Bio-Rad 3550).

ScFvs anti-eotaxina

Verificou-se ser muito difícil isolar scFvs específicos para eotaxina com somente 4 diferentes scFv sendo identificados por fago ELISA.

Quando a mesma coleção ScFv foi selecionada contra outros antígenos, muitos outros scFvs foram tipicamente identificados. O clone identificado para outra

caracterização foi chamado 3G3, e este clone deu consistentemente sinais em eotaxina humana de 5-10 vezes sobre o visto em PBS em ELISA.

EXEMPLO 2

Potência de neutralização de scFv 3G3 em um ensaio de quimiotaxia . .5 Antecedentes

A potência de neutralização de anti-Beotaxina scFv 3G3 foi determinada usando ensaio de quimiotaxia in vitro.

O ensaio de quimiotaxia é um ensaio de potência in vitro particularmente relevante como tem a capacidade de eotaxina de quimioatrair células expressando CCR3, que é desejável para inibir in vivo. O ensaio trabalha no princípio que as células expressando o receptor CCR3 irá migrar para um gradiente de eotaxina CDR3 irá migrar para um gradiente de eotaxina por quimiotaxia. O método detalhado aqui é baseado no descrito por Ponath et al, 1996a. Brevemente, eotaxina foi colocada no reservatório de fundo de uma placa Transwell (Costar) junto com o anticorpo de teste em um tampão apropriado. As células transfectadas expressando o receptor CCR3 foram colocadas na câmara de topo do Transwell. As duas câmaras foram separadas por uma membrana de poliéster com um tamanho de poro de 3 pm. As células somente se moveram através dos poros em resposta a um ligando CCR3, como eotaxina. Após um período de incubação definido, o número de células que tinha migrado através da câmara de fundo foi contado, e este número é uma medida de atividade de quimiotaxia da quimioquina que foi colocada na câmara de topo. A inibição desta atividade quimiotática pode assim ser avaliada neste ensaio.

Manutenção de células CCR3

Células L1.2 foram transfectadas com um receptor CCR3 humano para gerar uma linhagem de célula estável expressando CCR3 em sua superfície. As células foram mantidas em RPMI-1640 (Sigma) contendo 10% FCS inativado por calor (Biowhittaker), 1% L-glutamina (Sigma), 10 U penicilina (Sigma), 100 g/ml estreptomicina (Sigma), 250 pg/ml canamicina (Sigma) e 400 pg/ml Geneticin (Gibco). As células foram mantidas entre 1B2 x 10⁶ /ml para uso no ensaio. Não foi requerido estímulo das células para regular a expressão de CCR3 para o ensaio de quimiotaxia. A resposta a 50 ng/ml . 5 eotaxina foi cuidadosamente monitorada como o número de células migrantes pode declinar com o número de passagem de células, provavelmente devido a alterações no nível de expressão de CCR3. Tipicamente, uma amostra de 10% de células migrado através da câmara inferior foram subseqüentemente quantificada por citometria de fluxo. Verificou-se que 50 ng/ml de eotaxina tipicamente induziu a quimiotaxia de 8.000 - 10.000 células (isto é, 10% do valor, isto é, 80.00 BI00.000 células migraram através da câmara inferior no total).

Ensaio de quimiotaxia

O tampão de ensaio de quimiotaxia compreende RPMI- 1640 (Sigma) contendo 1% BSA isento de endotoxina (Bayer Pentex), 100 U/ml penicilina, 100 pg/ml estreptomicina. As soluções de teste de anticorpo (em duplicata) foram diluídas na concentração desejada em tampão de ensaio. Uma faixa de diluição típica de scFV purificado com IMAC (ver próxima seção) 3G3 foi 100 ug/ml a 1 pg/ml. A eotaxina humana (AlbaChem) foi adicionada uma concentração final de 50 ng/ml quando misturada com o scFv de teste apropriado. Todas as amostras foram incubadas durante 30 min em temperatura ambiente. As células L1.2 CCR3 foram centrifugadas a 1.200 rpm em uma centrífuga de topo de banca Heraeus Sepatech 1.0 durante 5 min, o meio removido por aspiração e as células re-suspensas em 25 ml de PBS. As células foram então re-centrifugadas e a pelota de células recolocada em suspensão em tampão de ensaio a 10⁷ células/ml. As soluções de teste (0,6 ml por reservatório) foram colocadas nas câmaras de fundo de placas Transwell. Transwells foram colocados sobre as soluções de teste e 100 μΐ de células (10⁶ células no total) colocados na câmara de topo de cada Transwell. A incubação

foi durante 4 h a 37 °C sob 5% CO₂. As placas foram batidas com cuidado antes da remoção dos Transwells, para desalojar quaisquer células fixadas no lado inferior da membrana. As células migrando através da câmara de fundo foram re-colocadas em suspensão e contadas usando um citômetro de fluxo. As . -5 amostras foram cada contadas durante 60 s usando uma taxa de fluxo de meio.

A inibição de porcentagem de quimiotaxia causada pelo anticorpo de teste foi então determinada.

Purificação de scFv

Para determinar a potência de 3G3 scFv no ensaio de quimiotaxia, scFv foi primeiro preparado por IMAC. 2TYAG (5 ml) foi inoculado com uma colônia única de 3G3 e cultivado durante a noite a 30 °C, com agitação. Esta cultura noturna foi então usada para inocular 500 ml de 2TY contendo 100 pg/ml ampicilina e 0,1% glucose, e cultivada a 30 °C. com agitação, até atingir um A₆oo de 1,0. β-D-tiogalactopiranosídeo de isopropila (IPTG) foi adicionado a 1 mM e a cultura cultivada durante mais 3,5 h a 30 °C.

As células foram coletadas por centrifugação a 5.000 rpm e recolocadas em suspensão em 10 ml de TES (0,2 M Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sacarose, resfriado com gelo), Mais 15 ml de diluição 1:5 (em água) de TES foi adicionado, e a suspensão de células incubada na roda girando a 40 °C durante 30 min. Isto causou choque osmótico e deu um extrato periplásmico contendo o scFv. As células residuais e rejeitos foram pelotizados por centrifugação a 9.000 rpm durante 20 min a 40 °C. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo, e 50 μΐ de 1 M MgCl₂ adicionado. Dois ml de suspensão Ni-NTA (Qiagen), pré-lavados com tampão (50 mM fosfato de sódio, pEl 8, 300 mM NaCI) juntos com um comprimido inibidor de protease (Boehringer Manheim) foram então adicionados ao extrato periplásmico. A preparação foi incubada, girando durante a noite a 40 °C. O Ni-NTA foi pelotizado por centrifugação a 2.000 rpm durante 5 min, e o sobrenadante aspirado. As contas de agarose foram lavadas 3 vezes com 50ml de tampão de :··· :5:

lavagem, centrifugando para coletar agarose entre cada lavagem. Dez ml de tampão de lavagem foram adicionados após a lavagem final, e a suspensão carregada sobre uma coluna de polyprep (BioRad). Tampão de eluição de 2 ml (50 mM NaPi, pH 8, 300 mM NaCi, 250 mM imidazol) foi adicionado à . 5 agarose drenada, e o eluado coletado. scFv purificado com IMAC foi trocado com tampão em PBS por uso de uma coluna Nap 5 (Pharmacia) de acordo com as instruções dos fabricantes. O A₂₈₀ foi lido e a concentração de proteína determinada usando um coeficiente de extinção molar de 1 mg/ml proteína = A₂8o 1-4. scFv purificado foi armazenado em 500 μΐ alíquotas a -70 °C.

Resultados

Dados típicos para scFv 3G3 purificado no ensaio de quimiotaxia são mostrados na figura 1. O IC₅₀ para scFv 3G3 é 800 nM. Este anticorpo é, assim, de potência baixa-moderada.

EXEMPLO 3 :

Derivação e seqüência de CAT- 212

A potência baixa-moderada de scFv 3G3 toma este anticorpo um candidato relativamente inapropriado para qualquer aplicação terapêutica.

Um outro anticorpo scFv, chamado CAT- 212, foi obtido usando várias técnicas e sua seqüência de DNA determinada.

Sequenciamento de DNA

DNA foi amplificado por reação de cadeia polimerase (PCR) de colônias individuais em placas de agar 2TYAg usando os iniciadores específicos para vetor pUC19reverso e fdtetsq (Vaughan et al, 1996). As condições de amplificação compreendem 94 °C durante 1 min, 55 °C durante 1 min, e 72 °C durante 2 min, durante 30 ciclos, antes de uma extensão final de minutos a 72 °C. Os produtos PCR foram purificados usando um kit de limpeza PCR (Promega) a um volume final de 50 μΐ H20. Entre 2 e 5 μΐ de cada inserto, a preparação foi usada como o gabarito para sequenciamento usando o sistema de sequenciamento de ciclo terminador Taq Dye (Applied

• · ··

Biosystems ). Os iniciadores (Osboum et al, 1996) gene31eader, PCRHLink foram usados para seqüenciar V_H e PCRLLink e mycseqlO para seqüenciar o V_L de scFv.

As sequências de nucleotídeos de CAT- 212 V_H e V_L são .-5 mostradas na SEQID No. 1 e 3, respectivamente. As sequências de aminoácido derivadas de CAT- 212 V_H e V_L são mostradas em SEQ ID No. 2 e 4, respectivamente.

Os segmentos V_H e V_L individuais de anticorpos foram alinhados para as sequências de linhagem germinal humana conhecidas em V10 BASE (Tomlinson et al, 1995) e a linhagem mais próxima identificada. A linhagem germinal mais próxima para a cadeia pesada de CAT- 212 foi identificada como DP49, um membro da família Vh3. O V_H de CAT- 212 tinha apenas 6 mudanças da linhagem germinal DP49, duas destas dentro de CDR2. A linhagem germinal mais próxima para a cadeia leve de CAT- 212 foi identificada como DP_K5, um membro da família V_K1. O Vl de CAT- 212 tinha somente 2 mudanças da linhagem germinal DP_K5, ambos dentro de CDRs. A seqüência completa de CAT- 212 ou qualquer derivado da mesma (como CAT213) tinha um total de apenas 8 mudanças da linhagem germinal, das quais 4 são em CDRs. Isto deve ainda minimizar qualquer risco possível de imunogenicidade quando estes anticorpos humanos são usados para tratar pacientes.

EXEMPLO 4 :

Especificidade de CAT- 212

Duas técnicas são usadas para investigar a especificidade de

CAT- 212 : fago ELISA e Western blotting.

Fago ELISA

Para determinar a especificidade de CAT- 212, um fago ELISA foi realizado contra eotaxina humana e de camundongos, e um painel de antígenos humanos relacionados e não relacionados, MIP-1 a, MCP-1, MCP-2,

MCP-3, MCP-4, IL-1 a, IL-1 β, IL-5, IL-18, IL-12, RANTES, fator de crescimento de transformação (TGF)- βΐ, TGF- β2, TNF ct e PBS.

Colônias de E. coli individuais contendo fagemídeo CAT- 212 foram inoculados em 5 ml 2YTAG e incubados a 37 °C durante 4 h, com .5 agitação. Fago auxiliador M13KO7 (Pharmacia) foi adicionado a cada tubo em um MOI de 10 e incubado durante 30 min a 37 °C durante 1 h, os primeiros 30 min estáticos e os finais 30 minutos com agitação suave. As células foram pelotizadas por centrifugação a 3.500 rpm durante 10 min e o sobrenadante descartado. As pelotas de células foram re-colocadas em suspensão em 5 mL 2

TYAK e incubadas a 30 °C durante a noite com agitação. No próximo dia, as células foram pelotizadas por centrifugação a 3.500 rpm durante 10 min. O sobrenadante contendo fagos (5 ml) foi cuidadosamente transferido a um tubo novo, 1 ml de 6MPBS adicionado, e incubado a temperatura ambiente durante 1 h para pré-bloquear o fago antes de ELISA.

As concentrações de revestimento e fornecedores de vários antígenos são mostrados na tabela 1. ELISAS foram realizados essencialmente como descrito no exemplo 1. Os resultados são mostrados na figura 9. CAT212 é específico para eotaxina humana e não reage cruzado com qualquer antígeno humano não relacionado ou relacionado. Um sinal muito leve sobre o fundo foi visto em eotaxina de camundongos. Isto pode indicar que CAT- 212 reconhece eotaxina de camundongos, apesar de relativamente fracamente comparado com humanos. Não se pode obter eotaxina comercialmente disponível para qualquer espécie diferente da humana ou de camundongos. Western Blotting

Eletroforese de gel poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio (SDSPAGE) foi realizada usando um sistema PHAST e 10B15% géis (Pharmacia). As amostras de eotaxina e MCP-1 humano (400 ng) foram cicladas no gel, junto com os marcadores de peso molecular. A eletroforese foi realizada quando proteínas foram transferidas para uma membrana Immobilon

- P (Millipore) por difusão. A membrana foi bloqueada por incubação de MPBS durante 1 h, e então sondada com 10 pg/ml de scFV de CAT- 212 purificado com IMAC em um scFv irrelevante durante 1 h, agitando em temperatura ambiente. Após isto, a membrana foi lavada (3x2 min) em PBST, .0 e então incubada com anticorpo tag anti-myc biotinilado (9E10) a 1 pg/ml durante 1 h. Após outra lavagem, o blot foi incubado com estreptavidina-HRP (Pierce) a 1 pg/ml durante 1 h, antes da lavagem final. O blot foi colocado em substrato ECL (Amersham) e exposto a filme de raios-X (Amersham Hyperfilm ECL), de acordo com as instruções dos fabricantes.

ScFv CAT 212 foi reagido especificamente com eotaxina humana, como uma banda distinta de peso molecular previsto foi observada, apesar de não ter detectado banda em trilha MCP-1. Um scFv de controle, irrelevante, na mesma concentração, não reagiu com outra eotaxina ou MCP-1. EXEMPLO 5 : Potência de neutralização de CAT- 212 em um ensaio de quimiotaxia mediado por eotaxina

A potência de CAT- 212 (e CAT- 213, ver exemplo 12) foi testada no ensaio de quimiotaxia, como descrito no exemplo 2. Antes do teste, scFv monomérico foi preparado por cromatografia de filtragem de gel FPLC. Preparação de scFv monomérico

ScFv monomérico foi preparado por filtragem de gel de material purificado por IMAC, em uma coluna Sephadex 75 em um sistema FPLC de Pharmacia. A coluna foi ciclada em PBS a 0,5 ml/min, e amostra de 500 μΐ foi carregada. As frações contendo scFv monomérico purificado foram coletadas. A concentração de scFv foi determinada por leitura de A₂80nm das frações de pico reunidas.

Uma faixa de diluição típica (em tampão de teste) para scFv purificado com CAT- 212 EPLC- foi de 1 pg/ml até 0,001 pg/ml.

Resultados

Os resultados são mostrados na figura 3 (média de três /5¼

··· estimativas). CAT- 212 inibiu a quimiotaxia mediada por eotaxina de células L1.2 transfectadas com CCR3 com um IC₅₀ de 650 + 83 pM. As modificações feitas para 3G3 tinham assim levado a uma melhora acima de 1000 vezes na potência de anticorpo scFv. CAT- 212 é um anticorpo de neutralização anti. -5 eotaxina altamente potente.

EXEMPLO 6 : Teste de competição de CAT- 212 para ligação de eotaxina a CAT-212

Introdução

CAT- 212, quando passivamente imobilizado a uma placa de microtitulação de poliestireno apropriada foi mostrado para ligar a eotaxina em um modo dependente da concentração como definido por sua constante de dissolução (K_D). β - emissão de eotaxina rotulada com iodo gera um sinal de luz detectável (cintilação) quando interage com uma placa de microtitulação impregnada com fósforo (Flash Plate ™). A faixa curta desta emissão assegura que o sinal resultante é devido a antígeno ligado com pequena contribuição de material não ligado. Esta técnica foi usada para determinar o K_D da interação de eotaxina - CAT- 212 e a afinidade relativa de preparações CAT- 212 e CAT- 213 (ver exemplo 13) por inibição competitiva.

Protocolo de ensaio

Os reservatórios de uma FlashPlate ™ (NEN SMP 200, 96 reservatórios) foram revestidos com 100 μΐ de CAT- 212 purificado com IMAC 40 nM (para método de preparação, ver seção 2) diluído em 0,05 M tampão carbonato- bicarbonato (Sigma). A placa foi selada e incubada a 4 °C durante 4 h, então foi esvaziada por inversão e bloqueada com 150 μΐ 1%

Marvel em PBS (Sigma) durante a noite a 4 °C. Imediatamente após uso, a placa foi esvaziada por inversão e lavada 3 vezes com PBS, então secada de modo blot.

O tampão de teste foi composto de meio RPMI (Sigma) contendo 0,5% de albumina de soro bovino (Sigma). Amostras de teste foram

5½ ·· ·· » diluídas 3 vezes em tampão para dar 11 concentrações em duplicata. 50 μΐ de amostra de teste diluída foram adicionados aos reservatórios, seguido por 50 μΐ 125 de 30 pM r^JI] eotaxina (Amersham). A placa foi selada e incubada em temperatura ambiente durante 1-2 h. A placa foi contata em contador de . 5 cintilação Packard Topcount (reservatórios contados durante 2 min cada).

Os dados foram analisados usando uma equação logística de 4 parâmetros usando GraphPad Prism (GraphPad Inc) para dar valores IC₅₀ aparentes. Y = Fundo + (topo-fundo)/ (1+10 ^Λ ((LogIC50-X) * HillSlope))

X = logaritmo de concentração, Y é o CPM.

Resultados

A figura 4 mostra os resultados de um ensaio em que CAT- 212 não rotulado, foi usado para competir para [ I] eotaxina ligando a CAT- 212 revestido em uma placa flash. CAT- 212 demonstra um IC₅₀ de 42,5 pM neste ensaio (média de 4 estimativas).

EXEMPLO 7 :

Determinação de afinidade de CAT- 212 para eotaxina

Protocolo de ensaio

Um Flash plate ™ foi revestida com CAT- 212 e reagentes preparados como descrito no exemplo 6. Uma diluição de duas vezes em série de [ I] eotaxina +/- um excesso de cem vezes de eotaxina não rotulada em tampão de ensaio foi preparado e amostras de 100 μΐ em duplicata adicionadas para a placa revestida. As amostras foram seladas e incubadas durante 2 horas em temperatura ambiente e contadas. Os dados foram analisados por ajuste de curva não linear usando o KELL para software Windows (Biosoft) de acordo com a fórmula :

Y = (B_Max+ [L] / (K_D + [L] ) onde [L] é a concentração de ligando livre, K_D é a afinidade e B_MAX a concentração de sítio de ligação máxima.

O dado é então visualizado pelo uso de Gráfico Scatchard

7>(ê>

(figura 5) de relação ligado/ livre versus ligado dando uma linha reta com uma curva = 1/K_D e um intercepto x de Β,^χ quando o ligando está ligando a uma população homogênea de sítios de ligação.

Resultados

..5 A partir do gráfico ScatChard (figura 5), a afinidade para ligação de eotaxina para CAT- 212 foi estimada a 146 pM.

EXEMPLO 8 :

Competição de eotaxina de camundongo para ligação a CAT- 212

Introdução

Para se dirigir à atividade in vivo de CAT- 212/ CAT- 213, duas estratégias foram empregadas (ver exemplo 14).

(1) efetuar eosinofilia em um modelo de camundongo por injeção de eotaxina humana, (2) efetuar eosinofilia em um modelo de camundongo por indução da produção de eotaxina endógena.

Para a segunda abordagem, foi primeiro necessário determinar se CAT- 212/ CAT- 213 reconhece a eotaxina de camundongo.

Protocolo de ensaio

Flash Plate ™ foi preparada como no exemplo 6. Onze em uma série de três diluições de eotaxina de camundongo e humana não rotulada (R&D) em tampão de ensaio e misturada com I - eotaxina preparada em uma concentração estimada de 30 pM e 100 μΐ adicionados aos reservatórios em duplicata. A placa foi selada e incubada em temperatura ambiente durante 2 horas, contada e os dados processados como no exemplo 6.

Resultados

A estimativa IC₅₀ para ligação CAT- 212 a eotaxina de camundongos é 296 nM (média de duas estimativas). Os dados são mostrados na figura 6. CAT- 212 assim reconhece eotaxina de camundongo.

···· ·*· ····· ··· ·

EXEMPLO 9

Potência de neutralização de CAT- 212 em um ensaio de fluxo de cálcio

Introdução

Este ensaio funcional é projetado para medir o aumento em

„.5 Ca intracelular produzido quando um receptor é ligado e ativado por este ligando. Neste caso, as células transfectadas com CCR3 são carregadas com um corante fluorescente sensível a Ca (fluo3AM) e a fluorescência monitorada durante o tempo usando FLIPR. Em FLIPR, medida de fluorescência em cada reservatório é realizada em intervalos programados (a cada 1 ou 5 segundos) e reagente é adicionada simultaneamente a cada

A I reservatório. O aumento em concentração de Ca intracelular induzido por eotaxina ligando o receptor CCR3 é medido e sua proporção para aumentar em fluorescência. A inibição desta resposta causada por CAT- 212 ligando a e neutralizando eotaxina pode ser quantificada.

Protocolo de ensaio

As células CCR3 foram ativadas por suplementação de meio de cultura comum com 0,5 pg/ml de butirato de sódio (Sigma) durante 24 horas antes da experiência para aumentar a expressão de CCR3 e, assim, a grandeza da resposta a eotaxina. As células CCR3 ativadas foram lavadas duas vezes em

RPMI1640 e então recolocadas em suspensão a 4 x 10⁶ células /ml em RPMI1640 contendo fluo-3AM 2 μΜ recentemente preparado (Molecular Probes), 0,03% de ácido plurônico (Molecular Probes) e 0,1% FCS. As células foram então incubadas durante 45 min a 37 °C. Após isto, elas foram lavadas uma vez em RPMI1640 e duas vezes em tampão FLIPR (125 mM cloreto de sódio, 5 mM cloreto de potássio, 1 mM cloreto de magnésio, 1,5 mM cloreto de cálcio, 25 mM Hepes, 5 mM glucose, e 0,1% FCS, pH 7,4). Eles foram finalmente recolocados em suspensão em tampão FLIPR a 1 x 10⁶/ml e 100 μΐ colocados em placas sobre uma placa de paredes pretas de 96 reservatórios com uma base transparente (Corning) para dar 1 x 10⁵ células por reservatório.

···· ··· ····· ··· ·

A placa foi então centrifugada a 1000 rpm durante 5 min para dar uma monocamada uniforme, relativamente densa, de células.

Uma série de diluição de CAT- 212 foi preparada em 6 x concentração final (final 200 nM- 1,6 nM) e pré-incubada com um volume

..5 igual de 60 nM eotaxina (Cambridge Bioscience) durante 10 min em temperatura ambiente. Todos os tratamentos foram preparados em pelo menos duplicata usando tampão FLIPR em um volume final de 100 μΐ em uma placa de poliestireno de 96 reservatórios (Corning). A concentração final de eotaxina sobre as células foi de 10 nM.

A placa contendo as células carregadas com fluo-3 foram colocadas em FLIPR e leituras de fluorescência foram feitas a cada 1 segundo pelos primeiros 60 segundos então em intervalos de 5 segundos até o final. O experimento foi realizado em temperatura ambiente. Para o experimento, 50 μΐ de cada tratamento foram adicionados a cada reservatório após um intervalo de

10 segundos.

Resultados

Os resultados desta experiência são ilustradas na figura 7. PodeO | se notar que CAT- 212 dá uma inibição dependente de dose de fluxo de CA produzida por eotaxina ligando seu receptor em células CCR3. A figura 8 mostra a área sob a curva para estes dados dando um valor IC₅₀ aproximado de 5 nM.

EXEMPLO 10

Imunorreatividade de CAT- 212 compólipo nasal humano

Introdução

Pólipo nasal humano é um tecido inflamatório caracterizado por uma infiltração de eosinófilos. A expressão de eotaxina foi documentada como sendo regulada em pólipo nasal e a proteína eotaxina pode ser detectada por imunocitoquímica usando anticorpos anti-eotaxina (Ponath et al, 1996a). CAT212 foi assim tríada para imuno-reatividade com seções de pólipo nasal humano.

Preparação de tecidos para ICC

Tecido de pólipo nasal humano foi obtido de amostras cirúrgicas. Tecidos foram cortados em pedaços de 5 mm³ e montados sobre .5 pedaços de cortiça usando uma gota de composto de tecido de corte ótimo (OCT; Sakura). Para congelar os tecidos, 20 ml de isopentano foram resfriados em um banho de nitrogênio líquido e os tecidos montados imersos durante 30 s. Os tecidos congelados foram então colocados em um crio-tubo e imersos em nitrogênio líquido por mais 30 segundos. Os blocos de tecido foram armazenados congelados a B 70 °C. Para as seções cortadas, o composto OCT foi aplicado como um pedaço crioestato se o tecido congelado incrustado. O pedaço e o tecido foram então congelados durante 30 segundos em nitrogênio líquido. O tecido foi então montado em um crioestato e crio-seções de 5 mícrons de cada tecido humano cortadas em lâminas de microscópio.

Preparação de anticorpos de fagos para ICC

Os clones de anticorpos de fagos foram resgatados como descrito no exemplo 1. O sobrenadante contendo fagos foi pré-bloqueado com 1% BSA antes do uso em ICC.

Protocolo

As seções de tecido humano foram fixadas por imersão em acetona em temperatura ambiente durante 15 min, secadas em ar e então lavadas três vezes em PBSt durante 10 min (total). Os scFvs de teste foram diluídos em PBST e aplicados às seções durante 2 h em temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas 3 vezes em PBST e incubadas com anticorpo 9E10 de camundongo diluído 1/100 em PBST. As seções foram lavadas 3 vezes em PBST e incubadas em polímero de peroxidase anti-camundongo EnVision como suprido (DAKO K4006) durante 30 min. As seções foram novamente lavadas 3 vezes em PBST e coloridas com substrato de 3-amino-9-etilcarbazol peroxidase (AEC; Sigma). O substrato AEC foi preparado por diluição de uma solução de carga (2,4 mg/ml de AEC dissolvido em dimetilformamida ) 1:10 em tampão de acetato de sódio 20 mM, pH 5,2 e adicionando 0,15% (v/v) de peróxido de hidrogênio. Cem μΐ de substrato AEC solução foram adicionados a cada seção e incubados durante 5-10 min seguido . 5 por lavagem em água da bica contendo 0,1% Tween para parar a revelação da cor. As lâminas foram então contra-coloridas com hematoxilina (DAKO S2020) durante < 5 segundos e então lavadas 3 vezes em água. As seções lavadas foram então revestidas em montagem aquosa e uma tampa de cobertura de vidro aplicada.

Resultados

CAT- 212 em seções coloridas de 30 pg/ml de pólipo nasal humano em um modo equivalente ao visto com um anticorpo anti-eotaxina de controle positivo (Cambridge Bioscience) a 50 pg/ml. Não se tem coloração detectável no substrato somente controle ou com um scFv irrelevante na mesma concentração. CAT- 212 demonstrou coloração citoplásmica específica no epitélio de cobertura, e em células mononucleares alongadas e endotélio situado no estroma do pólipo nasal. Isto está consistente com o perfil ICC publicado obtido com um anticorpo anti-eotaxina em pólipo nasal (Ponath et al, 1996a). Para confirmar que a coloração era específica para eotaxina, um

ICC de competição foi realizado em que 40 pg/ml de CAT- 212 foram préligados a 133 pg/ml, 660 qg/ml, e 1,33 mg/ml de eotaxina antes de adição às seções do pólipo nasal. CAT- 212 sozinho deu boa coloração como descrito acima. Quando CAT- 212 foi pré- ligado a eotaxina, se tem uma inibição dependente da dose de ligação a pólipo nasal com 1,33 mg/ml eotaxina virtualmente abolindo toda a coloração específica.

EXEMPLO 11

Conversão de CAT- 212 para formato IgG4 (CAT- 213)

Introdução

Os vetores usados na conversão de formato scFv (CAT- 212) e\ em anticorpo completo (IgG4, CAT- 213) foram: pGamma 4 (vetor de expressão V_H), e pMR15.1 (vetor de expressão V_L). Ambos vetores foram obtidos de Lonza Biologics.

Protocolo <,5 Todos os iniciadores usados foram referenciados SEQ ID Nos.

Na Tabela 3. O V_H DNA e V_k DNA foram inicialmente amplificados usando oligonucleotídeos pll3/pl32 e pl09a/pll0b, respectivamente. Todas as reações PCR usaram polimerase Pwol (Roche) para suas capacidades de leitura de prova e condições de PCR foram 25 ciclos de 94 °C, 30 segundos, 50 °C, 30 segundos, 72 °C, 60 segundos. As sequências de sinal para ambos V_H e V_K foram adicionadas por amplificação com pl0/pl32 e pll/pllOb, respectivamente. Os fragmentos V_H e V_K de DNA foram digeridos em paralelo com seus vetores receptores, com HindIII, Apal e BstBI, BsiWI, respectivamente. Os fragmentos foram então ligados juntos, assim construindo os plasmídeos separados. Ambos os plasmídeos foram digeridos com BamHI e Not I e ligados para formar a construção final. Todos os digestos de restrição e ligações foram realizados usando enzimas de New England Biolabs, usando os tampões recomendados pelo fornecedor.

Para transformação dos vetores, células E. coli eletrocompetentes (DH5 a) foram usadas. A eletroporação foi realizada em cubetas de 0,2 cm de eletroporação gap, em que 5 μΐ de DNA ligado foram adicionados a 100 pL de células de E. coli. As células receberam um pulso único de 2,5 kV a 200 Ω seguido por um período de recuperação de 20 minutos em 2TY a 37 °C em um incubador com agitação. As alíquotas foram colocadas em placas de agar 2TYAG e incubadas a 37 °C durante a noite. O dia seguinte, as colônias foram tomadas e tríadas por PCR usando polimerase Taq e os iniciadores apropriados.

Um clone com o inserto de tamanho correto foi cultivado em

100 ml 2TY (contendo 100 pg/ml ampicilina) durante a noite a 37 °C em um incubador de agitação. As células foram coletadas por centrifugação a 3.000 g durante 15 min, e um kit maxi-prep QIAGEN foi usado para extrair o DNA plasmídeo. A concentração de DNA foi determinada de modo espectrofotométrico considerando que um A₂₆₀ nm de 1 = 50 pg/ml. A

..5 construção final foi seqüenciada com iniciadores p24, p34 e p36 e p37 para confirmar a seqüência correta.

Uma transfecção de 36 placas foi realizada em células NSO por eletroporação (250V) usando o sistema gs (Lonza) usando o gene glutamina sintetase como o marcador selecionável. As células NSO de tipo selvagem em

DMEM (Sigma) contendo FCS dialisado a 10% com 2 mM glutamina. Células NSO 6 x 10⁷ foram transfectadas com 300 pg de DNA, linearizadas por Pvu I. Após eletroporação, as células foram recolocadas em suspensão em DMEM com glutamina e colocadas em placas de 36 x 96 reservatórios (50 μΐ/ reservatório) e incubadas a 37 °C em 5% CO₂. No dia seguinte, 150 μΐ/ reservatório de meio seletivo (DMEM sem glutamina) foi adicionado. Após aproximadamente 3 semanas, as colônias foram tríadas por ELISA (ver abaixo) usando um anticorpo irrelevante como um controle negativo. Todas as colônias produzindo > 20 pg/ml foram expandidas em placas de 24 reservatórios e então duplicadas em frascos T25. Um frasco foi cultivado para saturação e o outro congelado. A primeira linhagem de célula (não clonal) chamada 4B7 foi adaptada para meio isento de soro e expandida em um volume de 2 L para purificação usando proteína A.

Triagem de ensaio ELISA para detectar expressão de IgG

Cada reservatório de uma placa ELISA (Immulon 4, Dynex

Technologies) foi revestido com 100 μΐ de 1 pg/ml de igG anti-humano de cabra (Harlan) em tampão 50 mM bicarbonato de sódio/ carbonato, pH 9,6, a 4 °C durante a noite. As placas foram lavadas 3 vezes em PBS contendo 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST/ 0,05). CAT- 213 foi diluído em PBST/ 0,05 e uma série de diluições de 2 vezes foi gerada através da placa. A placa foi incubada durante 1 h em temperatura ambiente, e então lavada 3 vezes em PBST/ 0,05.

Cem 1 de 1:5000 anticorpo IgG anti-humano de cabra, conjugado a HRP (Harlan), diluído em PBST/ 0,05, foi adicionada a cada reservatório e incubado durante 30 min em temperatura ambiente. A placa foi lavada 3 vezes em PBST/

..5 0,05. Após, 100 μΐ de tampão substrato HRP recentemente preparado (0,4 mg/ml o-fenileno diamina em 24 mM ácido cítrico, 52 mM hidrogênio fosfato de sódio, pH 5,2, contendo 5 1 H2O2 / 50 ml tampão logo antes do uso) foram adicionados a cada reservatório. Após 5-10 min, as reações foram paradas com a adição de 50 pl de 12,5 % de ácido sulfurico. Ο A490 foi medido.

A linhagem de célula inicialmente expressando a maior quantidade de IgG, como indicado por um sinal elevado na triagem ELISA, foi escolhido para expansão. Isto acarretou expandir de uma placa de 96 reservatórios para um frasco T75. Esta linhagem de célula foi então adaptada para um meio isento de soro (Lonza NM2) envolvendo diluições em série, diminuindo o soro pela metade a cada vez (porcentagem de partida de soro é 10%). Uma vez adaptada a meio isento de soro, a linhagem de célula foi então cultivada até saturação em frascos de 150 ml, e coletada pelo menos em 10% de viabilidade de célula. O sobrenadante foi clarificado por centrifugação, então filtrado através de um filtro de 0,22 pm. O anticorpo foi purificado do sobrenadante usando uma coluna de afinidade de proteína A.

Ensaio de ligação para detectar IgG específico anti-eotaxina

Cada reservatório de uma placa ELISA (Immulon 4, Dynex Technologies) foi revestida com 100 pl de 0,5 pg/ml eotaxina (Albachem) em tampão 50 mM bicarbonato de sódio/ carbonato, pH 9,6, a 4 °C durante a noite.

O resto do protocolo é igual que o ensaio de triagem (ver seção acima).

Resultados, incluindo um anticorpo de protocolo irrelevante, são mostrados na figura 9.

EXEMPLO 12 : Potência de neutralização de CAT- 213 em um ensaio de quimiotaxia mediado por eotaxina

Ensaio de quimiotaxia

Protocolo do ensaio

A potência de CAT- 213 foi testada no ensaio de quimiotaxia, essencialmente como no exemplo 2. Antes do teste, CAT- 213 foi purificado

..5 do sobrenadante usando uma coluna de afinidade de proteína A (como no exemplo 11). Uma faixa de diluição típica para CAT- 213 purificado com proteína A foi de 100 nM até 0,03 nM em tampão de ensaio.

Resultados

Os resultados deste ensaio são mostrados na figura 3.

CAT- 213 inibiu a quimiotaxia mediada por eotaxina de células

L1.2 transfectadas com CCR3 com um IC50 de 700 + 350 pM. A potência é similar à vista para CAT- 212 neste ensaio.

EXEMPLO 13 : Ensaio de competição para ligação de eotaxina a CAT- 212

Protocolo de ensaio

O teste de Flash Plate foi realizada essencialmente como no exemplo 6. A Flash Plate foi revestida com 40 nM CAT- 212. CAT- 212, CAT- 213 e eotaxina foram diluído no tampão de ensaio e 50 1 adicionados aos reservatórios seguido por 50 1 de 60 pM [ ¹²⁵I] eotaxina.

Resultados

O IC₅₀ de CAT- 213 neste ensaio é 59,3 pM (média de 4 estimativas, figura 4). Isto é similar ao valor obtido de scFv, CAT- 212. EXEMPLO 14 : Efeitos de CAT- 212 e CAT- 213 em um modelo in vivo de inflamação alérgica

O modelo de bolsa de ar de inflamação alérgica foi escolhido como um modelo conveniente para estudar eosinofilia. Dexamathasone (uma droga anti-inflamatória esteroidal) foi mostrada para bloquear o recrutamento de eosinófilos na bolsa de ar neste modelo (ver Das et al, 1997). Outros anticorpos anti-eotaxina tinham sido previamente mostrados para bloquear o recrutamento de eosinófilos em uma faixa de modelos in vivo (discutido acima) ·< «·· ·· · ♦· »· ·· ·· ···· > e e · *· ·♦-····- * ··’ >·· · · · * v ··♦ · _Λ · • *· ··· ·· ·» ·· ··*» *· em que a eosinofilia foi estimulada com ou administração local de eotaxina ou induzida por desafio com ovalbumina (antígeno) em animais sensibilizados com ovalbumina.

Os efeitos de CAT- 212 ou CAT- 213 foram investigados no

..5 modelo de bolsa de ar em camundongos sensibilizados com ovalbumina em que a eosinofilia foi induzida ou por eotaxina humana recombinante ou bolsa intra-ar administrada com ovalbumina (i.po.).

Métodos

Camundongos fêmeas Balb/c (17B21 g, suprido por Harlan

U.K. ou Charles Ri ver) foram alojados em uma unidade de barreira para animais pequenos em Babraham Institute (Cambridgeshire). Os camundongos foram alojados em 3 em uma gaiola com um ciclo de 12 h dia/noite (luzes em 7 a.m.). Os animais foram deixados se aclimatar no alojamento durante pelo menos 2 semanas antes da experimentação e permitido o acesso ad libitum a alimentos e água.

A sensibilização foi realizada como descrito por Das et al, 1997. Brevemente, os camundongos foram sensibilizados para ovalbumina por injeção sub-cutânea (s.c.) de 100 g ovalbumina em gel hidróxido de alumínio (0,4 mL de solução salina contendo 3,3 mg de hidróxido de alumínio;

Rehydragel) em dias 1 e 8. Uma bolsa de ar foi formada no dorso dos camundongos do modo previamente registrado por Das et al, 1997. No dia 9, os camundongos foram anestesiados com isoflurano e 2,5 ml de ar estéril (0,25 m filtrados) injetados s.c. no dorso de cada camundongo. No dia 12, os camundongos foram injetados com mais 2,5 ml de ar estéril para re-inflar a bolsa de ar. No dia 15, os camundongos foram desafiados com ou eotaxina ou ovalbumina.

Procedimento de desafio de eotaxina humana

Em um experimento piloto, foi estabelecido que eotaxina recombinante humana (Albachem) administrada i.po. pode evocar eosinofilia <£>G em camundongos sensibilizados com ovalbumina. 30 min antes da administração de eotaxina humana, IL-5 de murinos recombinantes (IL-5, 100 pmol kg'¹) foram injetados intravenosamente (i.v.) para aumentar a poça circulante de eosinófilos (ver Collins et al, 1995). Após 6 h, eotaxina humana

..5 (1 pg, 0,5 ml, i.po.) causaram um aumento significante em recrutamento de eosinófilos na bolsa de ar comparado com solução salina (0,5 ml, i.po., eotaxina 5.3, 1.1, solução salina 1.2, 0,3 eosinófilos x 10⁵; n = 6, P < 0,01 Teste Mann-Whitney ). Em outras experiências 100 pmols kg'¹ IL-5 (i.v.) assim como 1 pg de eotaxina humana (i.po.) foram usados e medidas foram feitas 6 h após administração de eotaxina. Um grupo de controle tratado com solução salina apenas foi também incluído em todas as experiências para dar o influxo de célula de linha base (grupo de desafio de imitação).

Procedimento de desafio com ovalbumina

A dose de desafio de ovalbumina foi determinada de uma série de experimentos pilotos em camundongos sensibilizados com ovalbumina. Em uma experiência inicial, ovalbumina 1 e 10 mas não 100 pg (0,5 ml, i.po.) foi mostrada como causando um recrutamento de eosinófilos significante comparado com os animais tratados com veículo (0,5 ml, solução salina, i.po.) após 24 h. Como 10 pg ovalbumina produziu a maior parte da resposta reprodutível (ovalbumina 6,4 + 1,1, solução salina 1,46 + 0,23 eosinófilos x 10⁵; n = 6, P < 0,01, ANOVA com teste de Dunnett), esta dose foi subseqüentemente usada em uma experiência com passar de tempo. Nesta experiência, os camundongos receberam solução salina ou 10 pg de ovalbumina (i.po.) e o influxo de células foi avaliado entre 2-72 h após desafio.

O ponto de tempo de 6 horas foi selecionado como influxo de eosinófilos (assim como células totais) para a bolsa de ar sendo máximo neste momento (ovalbumina 5,4 + 1,4, solução salina 1,1, + 0,2 eosinófilos x 10⁵, n = 5-6). Em todas as experiências subseqüentes, 10 pg de ovalbumina (i.po.) foram administrados e as medidas tomadas a 6 h. Um grupo de controle desafiado com solução salina apenas foi também incluído em todas as experiências para dar o influxo de célula de linha base (grupo de desafio de imitação). Além do mais, níveis de eotaxina de camundongo demonstraram ser elevados seguindo desafio de ovalbumina (10 μ i. po.) em animais sensibilizados para

..5 ovalbumina (controle de solução salina 93 ± 12, desafio de ovalbumina 3539 ± 372 pg ml'¹; n = 8-9, P < 0,001, teste de Mann-Whitney).

Administração da droga

Tratamentos de anticorpo IgG sistêmico (CAT-213, CAT-001 [controle de IgG nulo], ou eotaxina anti-camundongo [R&D Systems]) foram

i. v. durante 30 minutos antes da administração de eotaxina humana ou ovalbumina. Tratamentos de bolsa intra-ar locais com CAT-212, CAT-171 [controle scFv nulo] ou CAT-213 foram concomitantes com administração de eotaxina humana ou ovalbumina. Grupos de controle de veículo foram incluídos em todos os experimentos de anticorpos e estes camundongos receberam PBS. Todas as injeções i.v. forma feitas por meio de veia da cauda em um volume de 100 μΐ e todas as injeções i.po. forma feitas em um volume total de 0,5 μΐ.

Quantificação de resultados

Camundongos foram mortos antes da lavagem tanto por asfixia por CO₂ quanto, quando amostras de plasma foram necessárias, uma overdose de pentobarbitona de sódio foi seguida de punção cardíaca. As bolsas de ar forma lavadas com o PBS resfriado com gelo (1 ml; sem cálcio ou magnésio; Sigma) contendo 5 U ml'¹ de heparina e armazenados em gelo. Uma alíquota (10 μΐ) de fluido de lavagem foi removida para avaliação das células totais (contador de células descartável de leitura rápida, Immune

Systems Ltd.) e uma amostra posterior contendo 100.000 células foi retirada para preparação de citospina. O fluido de lavagem remanescente foi centrifugado 1000 g durante 5 min., o sobrenadante foi então aliquotado e armazenado a B70°C. A pelota de célula foi recolocada em suspensão e · · ··· ··· ·· · · · ···* ··· ····· ··· · • ··· ····· · · · citospinas preparadas, secadas por ar e coloridas com corante Wrights para contagem de célula diferencial. Em alguns casos, o sobrenadante de lavagem foi testado para eotaxina por ELISA (R&D Systems).

Todos os resultados mostrados significam ± SE. Os dados de , .5 influxo de célula são expressos como o número de célula por bolsa de ar ou, para tratamento por droga, como % de inibição de influxo de eosinófilo. % de inibição de influxo de eosinófilo foi calculada a partir dos dados de número de célula para cada grupo de tratamento com a seguinte equação:

(Grupodesafiadode influxode célulamédio[controlePBS]-camundongode testedeinfluxode célula) xlOO (Grupo B desafiadode influxode célulamédio[controlePBS] B Grupode desafiode imitaçãode influxode célulamédio)

O ± SE médio foi então calculado para cada grupo de tratamento.

A maior parte dos dados em bruto foram estatisticamente analisados tanto com ANOVA quanto com Dunnetfs. Testes de teste t não em pares de estudantes ou Mann-Whitney também forma usados. Toda análise estatística foi realizada usando-se o programa de computador Instat e diferenças entre valores médios forma tomadas como significantes quando P < 0,05.

Resultados

Efeito de CAT-212 ou CAT-213 em camundongos tratados com eotaxina

i. po.

CAT-212 (0,0005, 0,005 e 0,05 mg kg’¹ i.po.) significativamente atenuaram a eosinofilia (32, 79 e 85% de inibição, respectivamente ; n = 8) causada por eotaxina humana (lg; i.po) em camundongos sensibilizados para ovalbumina e tratados com IL-5 (figura 10). Controle de CAT-171 nulo scFv (0,05 g kg'¹ i.po.) não teve efeito sobre recrutamento de eosinófilo (-5, 15% de inibição; n = 8).

CAT-213 (0,001, 0,01, 0,1 e 1 mg kg'¹, n= 7-8) administrado

i.po. concorrentemente com eotaxina humana (1 μ, i.po) causou uma inibição relacionada a dose potente de eosinofilia (Figura 10).

Todas as doses de CAT-213 foram eficazes e a inibição máxima de 94% foi observada com CAT-213 a 1 pg kg'¹. CAT_001 1 μ kg'¹ teve pouco efeito sobre o influxo de célula (7. 1% de inibição, n = 8.

CAT 213 (0,01, 0,1, 1 & 10 mg kg'¹) administrado i.v. durante min. antes da injeção i.po. de eotaxina humana (1 pg) causou uma inibição dependente de droga significativa (46, 73, 79 & 91%, respectivamente, n= 8) . .5 de recrutamento de eosinófilo em camundongos sensibilizados com ovalbumina e tratados com IL-5 (Figura 10). Controle CAT-001IgG4 (10 mg kg'¹) não afetou significativamente o recrutamento de eosinófilo (8 ± 1% de inibição, n = 8).

Assim, administração de bolsa intra-ar de CAT-213 é equipotente a CAT-212 em sua capacidade de evitar a eosinofilia in vivo (ED₉₀ tanto para CAT-213 quanto para CAT-212 é de aproximadamente 1 x 10'⁹ mols kg'¹). CAT-213 e CAT-212 bloqueiam a eosinofilia in vivo pela neutralização de eotaxina humana; estes anticorpos demonstraram anteriormente ter uma potência neutralizadora contra eotaxina humana quando comparados com o teste de quimiotaxia in vitro (ver Exemplo 12). CAT-213 também evita o recrutamento de eosinófilo seguinte à administração i.v. (CAT-212 não foi testado i.v.). No entanto, CAT-213 é um inibidor mais potente de eosinofilia induzida por eotaxina humana quando fornecido localmente (CAT-213 i.po. é aproximadamente 10 vezes mais potente comparado com administração i.v.; Figura 10).

Efeito de CAT-213 em animais tratados i.po com ovalbumina

Recrutamento de eosinófilo inibido dependentemente de dose CAT-213 (0,01, 0,1, 1 e 10 mg kg'¹, η = 7B8) i.po. induzido por ovalbumina. CAT-213 e ovalbumina foram administrados concorrentemente. CAT-213 0,1 mg kg'¹ w 10 mg kg'¹ causaram 60% e 97% de inibição, respectivamente.

CAT-213 i.po. também inibiu influxo de célula mononuclear para a bolsa de ar, no entanto, o recrutamento de neutrófilo não foi significativamente afetado (Tabela 2). CAT-001 10 mg kg'¹ i.po. teve pouco efeito sobre o influxo de célula (inibição de influxo de eosinófilo foi B20 ± 18%, n = 8).

Ο • ·· ·· ·· ·· ···· ·········· ·

CAT-213 administrado i.v. inibiu significativamente o recrutamento de eosinófilo induzido por ovalbumina (i.po.). CAT-213 (0,01, 0,1, 1 e 10 mg kg'¹ i.v., n = 8) fornecidos 30 min. antes da ovalbumina bloquear a eosinofilia a 6 hr. 1 e 10 mg kg'¹ causou um a inibição

..5 significativa de recrutamento de eosinófilo a 56 e 85%, respectivamente. CAT-213 0,01 e 0,1 mg kg'¹ assim como CAT-001 (controle de anticorpo nulo) 10 mg kg'¹ foram inativos (Figura 19; CAT-001 inibição 14. 14%, n = 8). CAT-213 i.v. (mas não CAT-001) causou uma inibição relacionada a dose de neutrófilo induzido por ovalbumina e recrutamento de célula mononuclear para a bolsa de ar (Tabela 2).

Novamente, os dados acima provêem indicação de que CAT213 é um inibidor mais potente de eosinofilia quando fornecido localmente à bolsa de ar (aproximadamente 10 vezes mais potente do que administração i.v.; Figura 19). No entanto, administração sistêmica (i.v.), mas não local (i.

po.) de CAT-213 tem a capacidade de bloquear o influxo de neutrófilo. Tanto administração sistêmica quanto local de CAT-213 podem inibir a quimiotaxia de célula mononuclear.

Em um experimento separado, os efeitos da administração sistêmica (i.v.) de eotaxina anti-camundongo IgG2A (R&D Systems) foram investigados em camundongos desafiados com ovalbumina (i.po.) para prover dados comparativos. Eotaxina anti-camundongo (0,05, 0,5 e 5 mg kg'¹, n = 78) causou uma inibição relacionada a dose de recrutamento de eosinófilo (14, 37 e 67%, respectivamente). Assim, CAT-213 e a eotaxina anti-camundongo IgG2A produziram uma inibição similar de quimiotaxia de eosinófilo tanto na magnitude de resposta quanto na potência (Figura 19).

SUMÁRIO

Em resumo, os anticorpos anti-eotaxina humanos, CAT-212 (scFv) e CAT-213 (IgG4) bloqueiam potentemente a eosinofilia em um modelo in vivo de uma inflamação alérgica. CAT-213 é eficaz quando fornecido tanto localmente quanto sistemicamente. A administração sistêmica de CAT-213 tem a ação adicional de bloquear neutrófilo assim como a quimiotaxia de célula mononuclear. Estes dados são consistentes com uma ação de CAT-213 e CAT-212 em bloquear a resposta biológica a eotaxina in

..5 vivo.

EXEMPLO 15

Potência de neutralização de CAT-213 em um ensaio de quimiotaxia mediada por eotaxina usando células transfectadas com L1.2 CCR-3: e de macaco rhesus e camundongo

A capacidade de CAT-213 de neutralizar a eotaxina de macaco rhesus e de camundongo foi avaliada no ensaio de quimiotaxia, essencialmente como descrito no Exemplo 2.

Protocolo de ensaio

O protocolo de ensaio seguido foi, essencialmente, o mesmo que aquele descrito para o Exemplo 2. A quimiotaxia foi induzida ou com eotaxina de macaco rhesus ou eotaxina de murinos. Eotaxina de macaco rhesus (125ng/ml) ou de murinos foi incubada na câmara inferior de um sistema de cultura Transwell antes da adição de lxlO⁶ ou 2x10⁶ de células L1.2-CCR3, respectivamente para a câmara superior do Transwell. Células migradas foram quantificadas por análise FACS e foram contadas a uma taxa de fluxo alto durante 1 minuto.

Resultados

CAT-213 inibiu quimiotaxia mediada por eotaxina de macaco rhesus e camundongo de células L1.2-CCR3 com uma média geométrica IC50 e valores de intervalo de confiança de 95% de 3,03xl0'⁷M (Ι,ΟΙχΙΟ'⁷, 0,01x10'⁷M) e 2,63xlO’^ôM (1,30x10'⁶, 5,34x10—6-M), respectivamente (Figura 12). Os dados representam ao menos 3 experimentos realizados em triplicata e duplicata, respectivamente.

EXEMPLO 16

Potência de neutralização de CAT-213 em um ensaio de quimiotaxia mediado por eotaxina usando eosinófilos humanos

O ensaio de quimiotaxia é um sistema de ensaio in vitro .5 relevante, já que avalia a capacidade de a eotaxina quimioatrair células expressando CCR3. Estes experimentos são de relevância fisiológica aumentada já que, neste caso, as células expressando CCR3 são eosinófilos humanos obtidos diretamente a partir de sangue.

Preparação de eosinófilos

Eosinófilos foram isolados de sangue periférico heparinizado de doadores atópicos, não-asmáticos sem nenhum sinal de doença alérgica. O sangue foi misturado com 1/5 de volume de solução de dextrano (6% p/v em solução salina) e eritrócitos foram deixados sedimentar durante 45 minutos à temperatura ambiente. O plasma depletado de eritrócitos foi colocado em camadas em Lymphoprep® e centrifugado a 800g durante 25 minutos a 20°C para separara células mononucleares de granulócitos.

Pelotas de granulócitos foram depletadas de eritrócitos residuais por meio de duas rodadas de lise hipotônica, após o que os neutrófilos foram rotulados com microcontas superparamagnéticas revestidas com anti-CD16 (MACS, Miltenyi Biotec; 2 μΐ de contas por 3x10⁶ de granulócitos) por uma incubação de 30 minutos a 0°C. As células forma então carregadas em uma coluna de lã de aço de 10 ml em um campo magnético forte e as células não rotuladas eluídas com quatro volumes de coluna de tampão de rotulação resfriado com gelo (PBS, 2xlO'³M EDTA, 0,5% p/v se albumina de soro bovino). As células eluídas foram rotineiramente > 95% de eosinófilos.

Protocolo de ensaio

Eosinófilos foram ressuspendidos em HBSS suplementado

com 1x10'²M HEPES e 0,3% p/v BSA, e incubados por, ao menos, 45 min. A 37°C/5% CO₂ antes do uso em ensaios de quimiotaxia. Amostras (meio ou o

eotaxina humana 1x10, mais ou menos CAT-213 ou CAT-001 (anticorpo de controle)) foram adicionadas às fontes inferiores de câmaras de .5 microquimiotaxia de 48 fontes. Filtros de membrana de policarbonato isento de polivinilpirrolidona (PVP) (tamanho de poro de 8-pm) foram colocados entre as fontes inferior e superior e as câmaras foram incubadas durante 30 minutos a 37°C/5% CO₂. As células forma então adicionadas às fontes superiores e as câmaras incubadas por 60 minutos adicionais a 37°C/5%CO₂.

Ao final deste período, células não migrantes foram secadas, fixadas em metanol e coloridas usando May-Grünwald/Giemsa. Células migradas foram contadas em campos de alta força (x400) para cada amostra.

Resultados

Os resultados de três experimentos separados realizados com pontos triplicados estão mostrados na Figura 13 (média ± SEM). CAT-213 inibiu quimiotaxia mediada por eotaxina de eosinófilos humanos com uma média geométrica IC50 e intervalos de confiança de 95% de 1,53x10’⁹M (3,09x1o¹¹, 7.54x10⁸M). CAT-001 (o anticorpo de controle) não afetou a quimiotaxia. Portanto, CAT-213 neutraliza a quimiotaxia induzida por eotaxina de eosinófilos humanos.

EXEMPLO 17

Potência de neutralização de CAT-213 em um ensaio de mudança de forma de eosinófilo mediada por eotaxina

A mudança de forma é um processo requerido em quimiotaxia e pode ser tomada como evidência de uma resposta migratória, a vir. Para eosinófilos se moverem da circulação para os tecidos em resposta a um gradiente de eotaxina (quimiotaxia), a reorganização de elementos citoesqueletais deve ocorrer. Esta reorganização está associada com mudanças específicas na morfologia da célula que pode ser visualizada em

um citômetro de luxo como mudanças em fusão dianteira (FSC). O ensaio usado neste exemplo usa um método descrito por Sabroe et al (1999).

Protocolo de ensaio

Experimentos foram realizados usando preparações de .5 granulócitos que foram obtidas como se segue. Sangue periférico foi tomado em seringas contendo EDTA (150 μΐ 0,5MK EDTA por 10 ml de sangue) e os eritrócitos sedimentados pela adição de lml de 6% dextrano-T500 em 0,9% de solução salina por 10 ml de sangue. A sedimentação foi deixada ocorrer durante 40 minutos à temperatura ambiente. O plasma depletado de eritrócitos foi então posto em camadas em gradiente de percoll 70%-80% descontínuo e centrifugado a 1137g durante 20 minutos à temperatura ambiente para separar células mononucleares de granulócitos. A camada de granulócito resultante foi lavada em PBS e então pelotizada a 306g durante 5 minutos à temperatura ambiente. A pelota de célula foi então ressuspendida em tampão de mudança de forma (PBS, 1x10'³M CaCl2, 1x10'³M MgCl2, 1x10'²M HEPES, 1x10‘²M glicose, 0,1% BSA, pH 7,3). As células foram então incubadas a 37°C durante 30 min.

3x10’⁹M eotaxina ou tampão, mais ou menos CAT-213 ou CAT-001 (controle) foram adicionados a tubos de citômetro de fluxo de polipropileno em um volume de 300 μΐ. 5x10⁵ células (em 100 μΐ) foram adicionadas a cada tubo. Os tubos foram então imediatamente incubados a 37°C durante 7 minutos antes de serem transferidos para um banho de água resfriada com gelo. Finalmente, 25 μΐ de tampão Cellfix (lOx) foram adicionados e tubos individuais foram lidos em um citômetro de fluxo.

Eosinófilos foram identificados por sua autofluorescência no canal FL2. FSC foi então avaliado.

Resultados

Os resultados deste ensaio estão mostrados na Figura 14. CAT-213 inibiu mudança de forma evocada em eosinófilos humanos por eotaxina humana, com uma média geométrica IC₅₀ e intervalo de confiança de 95% de 7,14χ10’^1θΜ (2,07χ10'^1θ, 2,44xlO'⁹M). CAT-001 não afetou a mudança induzida por eotaxina. Os dados expressaram como média ± SEM a partir de 5 experimentos realizados com pontos duplicados, com células de doadores separados.

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·♦ »· • · * 0 i.

« · « · f * < ·*»

Tabela 1

Antígeno de teste	Concentração de revestimento	Fornecedor
Eotaxina humana	10	Cambridge Bioscience
Eotaxina de camundongo	10	Cambridge Bioscience
MtP-la	10	Cambridge Bioscience
MCP-1	10	Cambridge Bioscience
MCP-2	10	Cambridge Bioscience
MCP-3	10	Cambridge Bioscience
MCP-4	10	Cambridge Bioscience
IL-la	1	Cambridge Bioscience
IL-Ιβ	1	Cambridge Bioscience
IL-5	1	R&D Systems
IL-12	1	Gift: doação de Genetics Institute
IL-18	1	R&D Systems
TGF-1	0,5	ImmunoKontact
TGF-p2	0,5	ImmunoKontact
TNFa	10	Gift:: BASF Bio-Research Corporation
RANTES	10	Peptrotech

Tabela 2-0 efeito de CAT- 213 i.v. em neutrófilos induzidos por ovalbumina e recrutamento de células mononucleares em camundongos sensibilizados com ovalbumina

Tratamento	Dose (mg kg'1 i.v.)	Neutrófilos (% Inibição)	Células mononucleares (% Inibição)	n
CAT-213	0,01	9± 13	-7± 18	8
	0,1	37 ±9	49 ±23	8
	1	41 ± 12*	101 ±30*	8
	10	61 ±6**	156±12**	8
CAT-001	10	1 ± 10	-3 ±57	8

Valores de inibição médios + SE % para o efeito de CAT- 213 ou CAT-001 em quimiotaxia de célula mononuclear ou neutrófilo. O efeito do tratamento de anticorpos foi estatisticamente avaliado realizando ANOVA de uma via com teste de Dunnett usando dados de contagem de células diferenciais. * P < 0,05, ** P < 0,01 comparado com animais de controle de PBS desafiados com ovalbumina. CAT- 213 inibiu de modo significante i.v. neutrófilos e quimiotaxia de células mononucleares.

Tabela 3

Lista de iniciadores usados para conversão de CAT- 212 para formato de IgG ····

SEQ ID NO.	Iniciador
11	PIO
12	Pll
13	P24
14	P34
15	P36
16	P37
17	P109a
18	PI 10b
19	P113
20	P132

Claims (10)

REIVINDICAÇÕES

1 -10 -9

Concentração de anticorpos (Log« M)

120-, ώ ώ

Ο 00 ι-‘-1-1-,-1-1-1-r

Ο Ο Ο Ο (D CM opuejBiuj soiyouisoe ep % \03

14/14 eiiuoj ep eõuepniu e]oj)uoo ep %

1¾¾¾¾¾¾¾¾ eueuinq euixejo^

Al —ΓΙΟ —ΓΙΟ

FIGURA 2 uiu QSfr b eioueqjosqy

FIGURA 3

Concentração de anticorpos (nM) ^3

1/l^í ··»* *·· ····· ··· · ·

1000 10000 co —ΓΙΟ <N| —I—

C\l

1. Elemento de ligação específico que se liga a eotaxina humana, caracterizado pelo fato de que compreende:

um domínio VH de anticorpo compreendendo um CDR1 de

2/14 ··· ··· ·· • · · · ··· ··

SSd soBuopunuieo ·· ·· ···· ··

2) e pelo domínio VL de CAT- 212 (SEQ ID NO: 4), a afinidade do elemento de ligação específico e a afinidade do sítio de ligação a antígeno sendo como determinadas sob as mesmas condições.

Petição 870180066277, de 31/07/2018, pág. 15/20

2. Elemento de ligação específico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compete para ligação a eotaxina com um domínio de ligação de eotaxina de um anticorpo

15 compreendendo o domínio VH de CAT- 212 (SEQ ID NO: 2) e o domínio VL de CAT- 212 (SEQ ID NO: 4).

3. Elemento de ligação específico de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VH de CAT- 212 (SEQ ID NO: 2).

20 4. Elemento de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de compreender o domínio VL de CAT- 212 (SEQ ID NO: 4).

4/14 re c

re

E re

I

UJ cn cn τ—( 1

CN CN

Η H < < O O

FIGURA 4 ► ··· ··· ·· · ·· ·· ·· ·· ♦··· * Λ ····· .········· ·

5/14 : : : : : : .··. ·’ . ·

Gráfico scatchard de ligação de eotaxina a CAT- 21

Ligado (molar) ··· ··· ·· · ·· ·· ·· ** ····

- Λ*·········** *

5. Elemento de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que liga a eotaxina

25 com afinidade igual a ou melhor que a afinidade de um sítio de ligação a antígeno de eotaxina formado pelo domínio VH de CAT- 212 (SEQ ID NO:

5 VH tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, um CDR2 de VH tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6, e um CDR3 de VH tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7; e e um domínio VL de anticorpo compreendendo um CDR1 de VL tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8, um CDR2 de VL

10 tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 e um CDR3 de VL tendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.

6/14 ..· :: ::: .-. ' .j . ’ .

FIGURA 6

Ιθε/M

6. Elemento de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que neutraliza eotaxina.

7/14

FIGURA 7

Tempo (segundos)

O o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o: 10 CO 01 r-

I

FIGURA 8

-30000 J CAT-212 nM

7. Elemento de ligação específico de acordo com a 5 reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que neutraliza eotaxina com uma potência igual a ou melhor que a potência de um sítio de ligação a antígeno de eotaxina formado pelo domínio VH de CAT- 212 (SEQ ID NO: 2) e o domínio VL de CAT- 212 (SEQ ID NO: 4), a potência do elemento de ligação específico e a potência do sítio de ligação a antígeno como

10 determinadas sob as mesmas condições.

8. Elemento de ligação específico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de compreende uma molécula de anticorpo scFv.

9/14 ·· ·* « · ···· ·<*

FIGURA 9 ο

ο ο

ο

IgG, ng/ reservatório

UJU06Í7 V

10/14 ·' ·« V . ο ο >0.0.

·*· *·· ·· ο ' ο

Β

Ο

FIGURA 10

120 η

I ο

C0

Ο ο

ο •

ο

I Γ

Ο ο

Ο Μ·

I ο

CM ~ι

Ο eiiyouisoe θρ oeóiqiui %

Dose anticorpo (mg kg'¹) • · · ·· ·· • · · · · ·

11/14 ·· · · ··· · ···· ··

FIGURA 11 . o .

> Q. >

a a

CO CO 0 r- n)

CM CM — i-τΟ o

CM O v vo o o

CO CD xj ejigouisoe ep oeõiqiui %

O

CM

Dose anticorpo (mg kg'¹)

12/14

1O\ oeóbjBilu ap a|ojjuoo ap %

Concentração de anticorpos (Log₁₀M)

FIGURA 12 /0^

13/14 l·-CO

I

9. Elemento de ligação específico de acordo com qualquer 15 uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de anticorpo.

10. Elemento de ligação específico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo completo.

20 11. Elemento de ligação específico de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreender uma região constante de IgG4.

z

12. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de nucleotídeos codificando um domínio VH ou

25 VL de anticorpo do elemento de ligação específico, em que a sequência de nucleotídeo compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3.

13. Método para produzir um elemento de ligação específico ou domínio VH ou VL de anticorpo, caracterizado pelo fato de compreender cultivar células hospedeiras transformadas com o ácido nucleico isolado como

Petição 870180066277, de 31/07/2018, pág. 16/20 definido na reivindicação 12, sob condições para a produção do referido elemento de ligação específico ou domínio VH ou VL de anticorpo.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de ainda compreender isolar e/ou purificar referido elemento de ligação específico ou domínio variável VH ou VL de anticorpo.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender a formulação do elemento de ligação específico ou domínio variável VH ou VL de anticorpo em uma composição incluindo, pelo menos, um componente adicional.

16. Método, caracterizado pelo fato de compreende ligar o elemento de ligação específico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 a eotaxina ou um fragmento de eotaxina; e determinar a quantidade de ligação do elemento de ligação específico a eotaxina ou um fragmento de eotaxina.

Petição 870180066277, de 31/07/2018, pág. 17/20 e·· ··« ·· · ·· ·· ·· ·· ····

-10 -9

Concentração de anticorpos (LogioM

120