BRPI0709259A2

BRPI0709259A2 - elemento de ligação isolado, molécula de anticorpo isolada, composição, molécula de ácido nucleico isolada, célula hospedeira in vitro, método para produzir um elemento de ligação ou molécula de anticorpo, e, uso de um elemento de ligação ou molécula ou molécula de anticorpo

Info

Publication number: BRPI0709259A2
Application number: BRPI0709259-8A
Authority: BR
Inventors: Ema Suzanne Cohen; Ralph Raymond Minter; Paula Rosamund Harrison; Matthew Alexander Sleeman; Andrew Donald Nash; Louis Jerry Fabri
Original assignee: Medimmune Ltd; Zenyth Operations Pty Ltd
Priority date: 2006-03-27
Filing date: 2007-03-27
Publication date: 2011-06-28
Also published as: SI2423229T1; US8263075B2; EP2423230A1; RU2012157042A; WO2007110631A1; JP5335662B2; US20190040145A1; SI1999152T1; US20140079708A1; US9085628B2; EP2423230B1; BRPI0709259B1; JP5665894B2; PT2423230E; ES2395839T3; MX2008012291A; PL2423229T3; DK2423229T3; DK1999152T3; SI2423230T1

Abstract

ELEMENTO DE LIGAçãO ISOLADO, MOLéCULA DE ANTICORPO ISOLADA, COMPOSIçãO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, CéLULA HOSPEDEIRA IN VITRO, MéTODO PARA PRODUZIR UM ELEMENTO DE LIGAçãO OU MOLéCULA DE ANTICORPO, E, USO DE UM ELEMENTO DE LIGAçãO OU MOLéCULA DE ANTICORPO. Elementos de ligação para cadeia alfa de receptor para fator estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF~ <244>~, especificamente moléculas de anticorpos. Uso dos elementos de ligação no tratamento de doenças inflamatórias e autoimunes, p. ex. artrite reumatóide, asma, resposta alérgica, esclerose múltipla, leucemia mielóide e aterosclerose.

Description

"ELEMENTO DE LIGAÇÃO ISOLADO, MOLÉCULA DE ANTICORPOISOLADA, COMPOSIÇÃO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICOISOLADA, CÉLULA HOSPEDEIRA IN VITRO, MÉTODO PARAPRODUZIR UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO OU MOLÉCULA DEANTICORPO, E, USO DE UM ELEMENTO DE LIGAÇÃO OUMOLÉCULA DE ANTICORPO"

A presente invenção refere-se a elementos de ligação para acadeia alfa do receptor de fator estimulador de colônias de granulócitos emacrófagos (GM-CSFRa), particularmente moléculas de anticorpos anti-GMCSFRa. Ela também se refere ao uso destes elementos de ligação notratamento de doenças inflamatórias, respiratórias e autoimunes mediadascom GMCSFRa, incluindo artrite reumatóide, doença pulmonar obstrutivacrônica e esclerose múltipla.

GM-CSF é um citocina pró-inflamatória de tipo I que acentuaa sobrevida, proliferação e/ou diferenciação de uma ampla faixa de tipos decélulas hematopoiéticas incluindo neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e suascélulas progenitoras. O receptor de GM-CSF é um membro da superfamíliade receptores de hematopoietina. Ele é heterodimérico, consistindo de umasubunidade alfa e uma beta. A subunidade alfa é altamente específica paraGM-CSF, enquanto que a subunidade beta é compartilhada com outrosreceptores de citocina, incluindo IL3 e IL5. Isto é refletido numa distribuiçãomais ampla de tecidos da subunidade de receptor beta. A subunidade alfa,GM-CSFRa, é expressa primariamente em células mielóides e em célulasnão-hematopoiéticas, como neutrófilos, macrófagos, eosinófilos, célulasdendríticas, células endoteliais e células endoteliais respiratórias. GM-CSFRade comprimento pleno é uma glicoproteína de membrana de tipo I com 400aminoácidos que pertence à família de receptores de citocina de tipo I, econsiste de um peptídeo-sinal de 22 aminoácidos (posições de 1 a 22), umdomínio extracelular de 298 aminoácidos (posições de 23 a 320), um domíniode transmembrana das posições de 321 a 345 e um curto domínio intracelularde 55 aminoácidos. O peptídeo-sinal é clivado para proporcionar a formamadura de GM-CSFRa como uma proteína de 378 aminoácidos. Clones decDNA do GM-CSFRa humano e murino encontram-se disponíveis, e, nonível de proteína, as subunidades de receptor apresentam 36% de identidade.GM-CSF é capaz de ligar-se com afinidade relativamente baixa à subunidadeα apenas (Kd de 1 a 5 nM) mas nenhuma com a subunidade β apenas. Noentanto, a presença de ambas as subunidades α e β resulta em um complexoligante-receptor de alta afinidade (Kd « IOOpM). A sinalização de GM-CSFocorre através de sua ligação inicial à cadeia α do GM-CSFR e, então,reticulação com uma subunidade maior da cadeia β comum para gerar ainteração de alta afinidade, que fosforila a via JAK-STAT. A ligação de GM-CSFR ao GMCSF é revista na ref. [1]. Esta interação também é capaz desinalização através da fosforilação de tirosina e ativação da via de MAPquinase.

Patologicamente, GM-CSF mostrou desempenhar um papel naexacerbação de doenças inflamatórias, respiratórias e autoimunes.Neutralização da ligação de GM-CSF a GM-CSFRa é, portanto, umaabordagem terapêutica para o tratamento de doença e condições mediadascom GM-CSFR.

Nicola et al. [2] descreveram um anticorpo murino contra GM-CSFRa humano, denominado 2B7-17-A ou "2B7", que foi reportado comoapresentando uma afinidade relativamente alta por GM-CSFRa humano, ecomo sendo um inibidor potente da ação biológica do GM-CSF humano emdiversos ensaios biológicos diferentes. O anticorpo 2B7 encontra-sedisponível comercialmente junto à Chemicon como MAB1037, e a folha dedados do produto [.Product Data Sheet] para MAB103 7 indica que é uminibidor potente da ação biológica do GM-CSF. 2B7 também foi revelado noW094/09149.Mediante o uso de uma combinação de seleções de bibliotecasde fagos de scFv não tratados, mutagênese randômica e ensaios biológicos ebioquímicos projetados apropriadamente (ver a Parte Experimental abaixo),nós identificamos moléculas de anticorpos altamente potentes que se ligam aGM-CSFRa humano e inibem a ação do GM-CSF humano em seu receptor.

Os resultados aqui apresentados indicam que nossos anticorpos ligam-se auma região ou epitopo diferente de GM-CSFRa em comparação com oconhecido anticorpo anti-GM-CSFRa 2B7, e, surpreendentemente, são aindamais potentes do que 2B7 como demonstrado numa variedade de ensaiosbiológicos.

Assim, esta invenção refere-se a elementos de ligação que seligam a GM-CSFRa humano e inibem a ligação de GM-CSF humano a GM-CSFRa. Elementos de ligação da invenção podem ser antagonistas de GM-CSFR. Os elementos de ligação podem ser inibidores reversíveis competitivosda sinalização de GM-CSF através de GM-CSFR.

Anticorpos e outros elementos de ligação da invenção sãoparticularmente valiosos na ligação e neutralização de GM-CSFRa, e, assim,são úteis nos tratamentos para doenças mediadas com GM-CSFRa, incluindodoenças inflamatórias e autoimunes, como indicado pela experimentação alicontida e corroborando adicionalmente a literatura técnica. Por exemplo, nósdemonstramos em ensaios à base de células que anticorpos da invenção sãocapazes de inibir a liberação de citocinas (p. ex. IL-6 e TNFa) induzida porligação de GM-CSF nativo a seu receptor. Como explicado maisdetalhadamente abaixo, a inibição da atividade de GM-CSF por meio dobloqueio da ligação a GM-CSFRa é uma abordagem terapêutica aotratamento de referidas doenças como artrite reumatóide (RA), asma,inflamação das vias aéreas induzida com fumaça, doença pulmonar obstrutivacrônica (COPD), resposta alérgica, esclerose múltipla (MS), leucemiamielóide e aterosclerose.Elementos de ligação de acordo com a invenção geralmenteligam-se ao domínio extracelular do GM-CSFRa. De preferência, umelemento de ligação da invenção liga-se pelo menos a um radical de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln (YLDFQ), SEQ ID NO: 201, nas posições de 226 a 230 de GM-CSFRa humano maduro (SEQ ID NO: 206). O elemento de ligação podeligar-se a pelo menos um resíduo na seqüência YLDFQ do GM-CSFRahumano, p. ex. ele pode ligar-se a um, dois, três ou quatro radicais daseqüência YLDFQ. Assim, o elemento de ligação pode reconhecer um oumais radicais nesta seqüência, e opcionalmente ele pode ligar-se também aradicais flanqueadores adicionais ou radicais estruturalmente adjacentes nodomínio extracelular de GM-CSFRa.

A ligação pode ser determinada por meio de qualquer métodovantajoso, por exemplo, é possível usar uma varredura de ligação de peptídeo,como um ensaio imunológico ligado a enzima (ELISA) baseado emPEPSCAN, como descrito detalhadamente alhures aqui. Em uma varredura deligação de peptídeo, como do tipo proporcionado por Sistemas PEPSCAN,peptídeos curtos que se sobrepõem derivados do antígeno são selecionadossistematicamente quanto à ligação a um membro de ligação. Os peptídeospodem ser acoplados covalentemente a uma superfície de suporte para formarum conjunto de peptídeos. Em resumo, uma varredura de ligação de peptídeo(p. ex. "PEPSCAN") envolve a identificação (p. ex. usando ELISA) de umconjunto de peptídeos ao que o elemento de ligação se liga, sendo que ospeptídeos apresentam seqüências de aminoácidos correspondentes afragmentos da SEQ ID NO: 206 (p. ex. peptídeos de cerca de 15 radicaiscontíguos da SEQ ID NO: 206), e alinhando-se os peptídeos para determinaruma impressão molecular de radicais ligados pelo elemento de ligação, sendoque a impressão molecular compreende radicais comuns a peptídeos que sesuperpõem. De acordo com a invenção, a impressão molecular identificadapela varredura de ligação de peptídeo ou PEPSCAN pode compreender pelomenos um radical de YLDFQ correspondendo às posições de 226 a 230 daSEQ ID NO: 206. A impressão molecular pode compreender um, dois, três,quatro ou todos os radicais de YLDFQ. Um elemento de ligação de acordocom a invenção pode ligar-se a um fragmento de peptídeo (p. ex. de 15radicais) da SEQ ID NO: 206 compreendendo um ou, mais preferivelmente,todos os radicais YLDFQ correspondentes às posições de 226 a 230 da SEQID NO: 206, p. ex. como determinado por uma varredura de ligação depeptídeo ou método PEPSCAN aqui descrito. Assim, um elemento de ligaçãoda invenção pode ligar-se a um peptídeo apresentando uma seqüência deaminoácidos de 15 radicais contíguos da SEQ ID NO: 206, sendo que aseqüência de 15 radicais compreende pelo menos um radical de, ou, pelomenos, sobrepõe-se parcialmente com, YLDFQ nas posições de 226 a 230 daSEQ ID NO: 206. Detalhes de um método vantajoso de varredura de ligaçãode peptídeo para determinar a liquefação são indicados detalhadamente emoutra parte desta descrição. Outros métodos que são bem conhecidos na arte eque poderiam ser usados para determinar os radicais ligados por um anticorpo,e/ou para confirmar resultados de varredura de ligação de peptídeo (p. ex.PEPSCAN), incluem mutagênese dirigida para sítio, troca de hidrogêniodeutério, espectrometria de massa, RMN, e cristalografia de raios-X.

Assim, um elemento de ligação da invenção neutraliza, depreferência, GM-CSFRa. Neutralização significa redução ou inibição daatividade biológica do GM-CSFRa, p. ex. redução ou inibição da ligação doGM-CSF ao GM-CSFRa, ou da sinalização com GM-CSFRa, p. ex. comomedido por meio de respostas mediadas com GM-CSFRa. A redução ouinibição da atividade biológica pode ser parcial ou total. O grau em que umanticorpo neutraliza o GM-CSFRa é referido como sua potência deneutralização. A potência pode ser determinada ou medida usando-se um oumais ensaios conhecidos pela pessoa versada e/ou como descrito ou referidoaqui. Por exemplo, o elemento de ligação pode apresentar atividadeneutralizadora em um ou mais dos seguintes ensaios:

• Ensaio bioquímico de ligação de ligante

• Ensaio de proliferação de TF-I

• Ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos

· Ensaio de alteração de forma de granulócitos de primatasnão-humanos cynomolgus

• Ensaio de liberação de TNFa de monócitos

• Ensaio de sobrevida de granulócitos

• Ensaio de formação de colônias (inibição de diferenciaçãoin vitro mediada com GM-CSF de progenitores de células sangüíneas)

• Inibição da bioatividade de GM-CSF in vivo, p. ex. emcamundongos quiméricos com medula óssea transgênica expressando GM-CSFR humano

• Ensaio de liberação de citocinas de células mononuclearesdo sangue periférico

A potência é expressa normalmente como um valor IC50, empM exceto se indicado de outra forma. Em ensaios funcionais, a IC50 é aconcentração que reduz uma resposta biológica em 50% de sua máxima. Emestudos de ligação de ligante, a IC50 é a concentração que reduz a ligação dereceptor em 50% do nível máximo de ligação específica. A IC50 pode sercalculada plotando-se o % máximo da resposta biológica (representado, p.ex., pela proliferação de células, que pode ser medida como incorporação de3H timidina em cpm, em um ensaio de proliferação, pela alteração de formaem um ensaio de alteração de forma, por meio de liberação de TNFa em umensaio de liberação de TNFa, por meio de sobrevida em um ensaio desobrevida, pelo número de colônias em um ensaio de formação de colônias,ou pelo aumento do peso do baço ou pela diminuição dos monócitoscirculantes em camundongos quiméricos com medula óssea transgênicaexpressando GM-CSFR humano em um teste de bioatividade) ou % deligação de receptor específico como uma função do Iog da concentração doelemento de ligação, e usando um programa de software, como Prism(GraphPad) para adequar-se uma função sigmoidal aos dados para gerarvalores IC50.

Um valor IC50 pode representar a média de uma pluralidadede medições. Assim, por exemplo, valores de IC50 podem ser obtidos dosresultados de experimentos em triplicata, e, então, é possível calcular umvalor de IC50 médio.

No ensaio de proliferação de TF-1, elementos de ligação dainvenção apresentam normalmente uma IC50 inferior a 1500 pM. Porexemplo, a IC50 pode ser < 300, < 60, < 10, ou < 1,5 pM, p. ex. de cerca de1,0 pM. Normalmente, a IC50 é de pelo menos 0,5 ou 1,0 nM. O anticorpomurino conhecido 2B7 apresentou uma IC50 de cerca de 1600 pM nesteensaio. O ensaio de proliferação de TF-I aqui usado foi com umaconcentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência deneutralização IC50 no ensaio de proliferação de TF-I representa a capacidadede um elemento de ligação em inibir a proliferação de células TF-I induzidapor 7 pM de GM-CSF humano. Para mais detalhes, ver a seção de Métodosde Ensaio e Materiais.

Um elemento de ligação da invenção pode apresentar uma pA2mais negativa do que -6, -7, -8, -9, -10, -10,5 ou -11 no ensaio de proliferaçãode TF-1. Por exemplo, pA2 pode ser de cerca de -10,5 ou -11. O cálculo e asignificância de valores de pA2 são discutidos detalhadamente na ParteExperimental sob Métodos de Ensaio e Materiais.

No ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos,elementos de ligação da invenção normalmente apresentam uma IC50 inferiora 100 pM, p. ex. inferior a 50 pM ou inferior a 30, 25, 20, 15 ou 10 pM.Normalmente a IC50 é de pelo menos 5, 6 ou 7 pM. Em contraste, o anticorpomurino conhecido 2B7 é menos potente com uma IC50 medida de 477 pMneste ensaio. O ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos usadoaqui foi com uma concentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, apotência de neutralização IC50 no ensaio de alteração de forma degranulócitos humanos representa a capacidade de um elemento de ligação eminibir a alteração de forma de granulócitos humanos induzida por 7 pM deGM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio eMateriais.

No ensaio de alteração de forma de granulócitos decynomolgus, elementos de ligação da invenção normalmente apresentam umaIC50 inferior a 20 pM, tipicamente inferior a 10, 5 ou 2,5 pM. A IC50 podeser de, pelo menos, 0,5, 1 ou 1,5 pM. O anticorpo murino conhecido 2B7apresentou uma IC50 de 26 pM quando testado neste ensaio. O ensaio dealteração de forma de granulócitos de cynomolgus usado aqui foi com umaconcentração final de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, a potência deneutralização IC50 no ensaio de alteração de forma de granulócitos decynomolgus representa a capacidade de um elemento de ligação em inibir aalteração de forma de granulócitos de cynomolgus induzida por 7 pM de GM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio eMateriais.

Um elemento de ligação da invenção pode apresentar uma pA2mais negativo do que -6, -7, -8, -9, -10, -10,5 ou -11 no ensaio de alteração deforma de humano e/ou de cynomologus. De preferência, a ρA2 é de cerca de -10 ou-11.

No ensaio de liberação de TNFa de monócitos, elementos deligação da invenção normalmente apresentam uma IC50 inferior a 150 pM,tipicamente inferior a 110 pM, p. ex. inferior a IOOpM. A IC50 pode ser de,pelo menos, 30 ou 40 pM. O ensaio de liberação de TNFa de monócitos usadoaqui foi com uma concentração final de 1 nM de GM-CSF humano. Assim, apotência de neutralização IC 50 no ensaio de liberação de TNFa de monócitosrepresenta a capacidade de um elemento de ligação em inibir a liberação deTNFa de monócitos humanos estimulada com 1 nM de GM-CSF humano.Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

No ensaio de sobrevida de granulócitos, elementos de ligaçãoda invenção normalmente apresentam uma IC50 inferior a IOOOpM,tipicamente inferior a 850 pM. A IC50 pode ser inferior a 500, 250, 150, 100,50, 30, 20 ou 10 pM. A IC50 pode ser de pelo menos 5 pM. O anticorpomurino conhecido 2B7 é inativo neste ensaio até uma concentração de 83 nM.O ensaio de sobrevida de granulócitos usado aqui foi com uma concentraçãofinal de 7 pM de GM-CSF humano. Assim, potência de neutralização IC50 noensaio de sobrevida de granulócitos representa a capacidade de um elementode ligação em inibir a sobrevida de granulócitos humanos induzida com 7 pMde GM-CSF humano. Para maiores detalhes, ver a seção de Métodos deEnsaio e Materiais.

No ensaio de formação de colônias, elementos de ligação dainvenção podem apresentar uma IC50 inferior a 5, inferior a 2,5, inferior a 1 ouinferior a 0,3 μg/ml. De preferência, a IC50 é de 0,25 μg/ml ou menos, p. ex.inferior a 0,1 μg/ml. A IC50 pode ser de pelo menos 0,05 μg/ml. O anticorpomurino conhecido 2B7 apresenta pouca ou nenhuma atividade neste ensaioaté uma concentração de 10 μg/ml (67nM). O ensaio de formação de colôniasusado aqui foi com uma concentração final de 10 ng/ml de GM-CSF humano.Assim, a potência de neutralização IC50 no ensaio de formação de colôniasrepresenta a capacidade de um elemento de ligação em inibir formação decolônias induzida com 10 ng/ml de GM-CSF humano. Para maiores detalhes,ver a seção de Métodos de Ensaio e Materiais.

Um elemento de ligação da invenção pode apresentar umacapacidade dependente da dose para inibir aumento do peso do baço e/ouinibir uma diminuição induzida com GM-CSF em monócitos circulantes emcamundongos quiméricos com medula óssea transgênica expressando GM-CSFR humano, que são tratados com GM-CSF humano. A IC50 para inibiçãodo aumento do peso do baço pode ser inferior a 5, inferior a 2,5, inferior a 2,inferior a 1 ou inferior a 0,75 mg/kg. A IC50 pode ser de, pelo menos, 0,5mg/kg em algumas concretizações.

Adicionalmente, determinou-se a cinética de ligação e deafinidade de elementos de ligação por GM-CSFRa humano, por exemplo, pormeio de ressonância de plasmon de superfície, p. ex. usando BLAcore.Elementos de ligação da invenção normalmente apresenta uma KD inferior a 5nM e, mais preferivelmente, inferior a 4, 3, 2 ou 1 nM. De preferência, KD éinferior a 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,15 nM.

Elementos de ligação da invenção normalmente ligam-se aGM-CSFRa de primata não-humano, p. ex. GM-CSFRa de cynomologusadicionalmente ao GM-CSFRa humano. Como há uma baixa homologia entrereceptor de GM-CSF humano e murino (aproximadamente 36%), elementosde ligação da invenção geralmente não se ligarão ou reagirão de maneiracruzada com o receptor murino.

Normalmente um elemento de ligação da invençãocompreende uma molécula de anticorpo, p. ex. um anticorpo inteiro oufragmento de anticorpo, como discutido mais detalhadamente abaixo. Depreferência, uma molécula de anticorpo da invenção é uma molécula deanticorpo humano.

Um elemento de ligação da invenção compreendenormalmente um domínio VH e/ou VL de anticorpo. Domínios VH edomínios VL de elementos de ligação também são proporcionados como parteda invenção. Dentro de cada um dos domínios VH e VL encontram-se regiõesdeterminadoras de complementaridade ("CDRs"), e regiões de estrutura("FRs"). Um domínio VH compreende um conjunto de HCDRs e um domínioVL compreende um conjunto de LCDRs. Uma molécula de anticorpocompreende tipicamente um domínio VH de anticorpo compreendendo umaVH de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma estrutura. Ela também compreendealternativamente, ou adicionalmente, um domínio VL de anticorpocompreendendo uma VL de CDRl VL, CDR2 e CDR3 e a estrutura. Umaestrutura de domínio VH ou VL compreende quatro regiões de estrutura, FRl,FR2, FR3 e FR4, interdispersadas com CDRs na estrutura a seguir:

FRl - CDRl - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4.

Exemplos de domínios VH e VL de anticorpos, FRs e CDRsde acordo com a presente invenção são como listados na listagem deseqüências anexa que integra a presente descrição. Todas as seqüências VH eVL5 seqüências de CDR, conjuntos de CDRs e conjuntos de HCDRs econjuntos de LCDRs aqui revelados representam aspectos e concretizações dainvenção. Assim, um aspecto da invenção é um domínio VH de um elementode ligação de acordo com a invenção. Um "conjunto de CDRs" compreendeCDRl, CDR2 e CDR3. Assim, um conjunto de HCDRs significa HCDRl,HCDR2 e HCDR3, e um conjunto de LCDRs significa LCDRl, LCDR2 eLCDR3. Exceto se indicado de outra forma, um "conjunto de CDRs" incluiHCDRs e LCDRs. Tipicamente, elementos de ligação da invenção sãoanticorpos monoclonais (mAb).

Como descrito mais detalhadamente na Parte Experimental,nós identificamos um conjunto de moléculas de anticorpos que se ligam aGM-CSFRa. Nós também identificamos determinados radicais nas regiõesdeterminadoras de complementaridade (CDRs) dos domínios VH e VL quesão particularmente importantes para ligação de receptor e potência deneutralização. Como as CDRs são primariamente responsáveis paradeterminar a ligação e a especificidade de um elemento de ligação, sendoque é possível usar uma ou mais CDRs apresentam os radicais apropriados,como definido aqui, como definido aqui, e incorporadas em qualquer estruturavantajosa, por exemplo, uma estrutura de domínio VH e/ou VL de anticorpo,ou uma estrutura de suporte de proteína não-anticorpo, como descrito maisdetalhadamente alhures aqui. Por exemplo, uma ou mais CDRs ou umconjunto de CDRs de um anticorpo podem ser enxertadas em uma estrutura(p. ex. estrutura humana) dando uma molécula de anticorpo ou diferentesmoléculas de anticorpos. Por exemplo, uma molécula de anticorpo podecompreender CDRs como revelado aqui e regiões de estrutura de seqüênciasde segmento de gene de linhagem germinal humana. É possível proporcionarum anticorpo com um conjunto de CDRs em uma estrutura que pode sersujeita a terapia na linhagem germinal, onde um ou mais radicais na estruturasão alterados para equiparar-se aos radicais na posição equivalente naestrutura de linhagem germinal humana mais similar. Assim, regiões deestrutura de anticorpos são, de preferência, de linhagens germinativas e/ouhumanas.

Foi realizada uma investigação em que radicais de umanticorpo candidato foram importantes para o reconhecimento de antígenos,de acordo com o método apresentado na seção experimental, e, então,realizamos análise de seqüências de 160 clones apresentando uma potênciapelo menos 5 vezes maiores do que o clone de anticorpo parental em . umensaio biológico. Os resultados indicaram as posições a seguir comocontribuindo para a ligação de antígenos: radicais Kabat 27A, 27B, 27C, 32,51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL e radicais Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97,99 e 100B no domínio VH. Nas concretizações preferidas da invenção, um oumais destes radicais Kabat é/são os radicais Kabat presentes na posição paraum ou mais dos clones de anticorpos enumerados 1, 2 e de 4 a 20 cujasseqüências são reveladas na listagem de seqüências anexa. Em váriasconcretizações, o radical pode ser igual, ou pode diferir, do radical presentena posição no anticorpo 3.

Nossa análise indicou 4 posições de radicais nas CDRs queapresentam uma influência particularmente forte sobre a ligação do receptor:H97, H100B, L90 e L92 (numeração Kabat). de preferência, H97 de CDR3VH é S. O radical serina nesta posição foi observado em todos os 160 clones erepresentam, portanto, um importante radical para reconhecimento deantígeno.

De preferência, uma CDR3 VH compreende um ou mais dosseguintes radicais:

V, Ν, A ou L no radical Kabat H95, da forma mais preferível, V;

S, F, Η, Ρ, T ou W no radical Kabat H99, da forma maispreferível, S;

A, Τ, P, S, V ou H no radical Kabat Hl OOB, da forma maispreferível, A ou T.

De preferência, radical Kabat H34 na CDRl VH é I. Depreferência, CDR2 VH compreende E no radical Kabat H54 e/ou I no radicalKabat H57.

Onde o elemento de ligação compreende um domínio VH deanticorpo, radical Kabat Hl7 na estrutura de domínio VH é, de preferência, S.

O radical Kabat H94 é, de preferência, I ou uma substituição conservativa domesmo (p. ex. L, V, A ou M). Normalmente H94 é I.

De preferência, uma CDR3 VL compreende um ou mais dosseguintes radicais:

S, T ou M no radical Kabat L90, da forma mais preferível, Sou T;

D, E, Q, S, M ou T no radical Kabat L92, da forma maispreferível, D ou E;

A, P, S, Τ, I, L, M ou V no radical Kabat L96, da forma maispreferível, S, Ρ, I ou V, particularmente S.

Radical Kabat L95A na CDR3 VL é, de preferência, S.

De preferência, uma CDRl VL compreende um ou mais dosseguintes radicais:S no radical Kabat 27A;

N no radical Kabat 27B;

I no radical Kabat 27C;

D no radical Kabat 32,

De preferência, uma CDR2 VL compreende um ou mais dosseguintes radicais:

N no radical Kabat 51;

N no radical Kabat 52;

K no radical Kabat 53.

Em uma concretização preferida, um elemento de ligação dainvenção compreende uma ou mais CDRs selecionadas dentre CDRS VH eVL, i.e. uma CDRl VH, 2 e/ou 3 e/ou uma VL de CDR 1, 2 e/ou 3 dequalquer um dos anticorpos 1, 2 ou de 4 a 20 como mostrado na listagem deseqüências, ou do presente anticorpo 3. Em uma concretização preferida, umelemento de ligação da invenção compreende uma CDR3 VH de qualqueruma das moléculas de anticorpos a seguir: Anticorpo 1 (SEQ ID NO 5);Anticorpo 2 (SEQ ID NO 15); Anticorpo 3 (SEQ ID NO 25); Anticorpo 4(SEQ ID NO 35); Anticorpo 5 (SEQ ID NO 45); Anticorpo 6 (SEQ ID NO55); Anticorpo 7 (SEQ ID NO 65); Anticorpo 8 (SEQ ID NO 75); Anticorpo9 (SEQ ID NO 85); Anticorpo 10 (SEQ ID NO 95); Anticorpo 11 (SEQ IDNO 105); Anticorpo 12 (SEQ ID NO 115); Anticorpo 13 (SEQ ID NO 125);Anticorpo 14 (SEQ ID NO 135); Anticorpo 15 (SEQ ID NO 145); Anticorpo16 (SEQ ID NO 155); Anticorpo 17 (SEQ ID NO 165); Anticorpo 18 (SEQID NO 175); Anticorpo 19 (SEQ ID NO 185); Anticorpo 20 (SEQ ID NO195). De preferência, o elemento de ligação compreende adicionalmente umaCDRl VH da SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 173 e/ou uma CDR2 VH daSEQ ID NO: 4. De preferência, um elemento de ligação compreendendoCDR3 VH da SEQ ID NO: 175 compreende uma CDRl VH da SEQ ID NO:173, mas pode compreender alternativamente uma CDRl VH da SEQ ID NO:3.

De preferência, o elemento de ligação compreende umconjunto de CDRs VH de um dos seguintes anticorpos: Anticorpo 1 (Seq ID3-5); Anticorpo 2 (SEQ ID 13-15); Anticorpo 3 (SEQ ID 23-25); Anticorpo 4(SEQ ID 33-35); Anticorpo 5 (SEQ ID 43-45); Anticorpo 6 (SEQ ID 53-55);Anticorpo 7 (SEQ ID 63-65); Anticorpo 8 (SEQ ID 73-75); Anticorpo 9 (SEQID 83-85); Anticorpo 10 (SEQ ID 93-95); Anticorpo 11 (SEQ ID 103-105);Anticorpo 12 (SEQ ID 113-115); Anticorpo 13 (SEQ ID 123-125); Anticorpo14 (SEQ ID 133-135); Anticorpo 15 (SEQ ID 143-145); Anticorpo 16 (SEQID 153-155); Anticorpo 17 (SEQ ID 163-165); Anticorpo 18 (SEQ ID 173-175); Anticorpo 19 (SEQ ID 183-185); Anticorpo 20 (SEQ ID 193-195).Opcionalmente ele também pode compreender um conjunto de CDRs VL deum destes anticorpos, e as CDRs VL podem ser do mesmo anticorpo ou deum anticorpo diferente relativamente às CDRs VH. De uma maneira geral, umdomínio VH é pareado com um domínio VL para proporcionar um sítio deligação de antígeno de anticorpo, embora, em algumas concretizações, sejapossível usar um domínio VH ou VL sozinho para ligar antígeno. Apromiscuidade de cadeia leve é bem estabelecida na arte, e, assim, o domínioVH e VL não precisa ser do mesmo clone como discutido aqui.

Um elemento de ligação pode compreender um conjunto deCDRs H e/ou L de qualquer um dos anticorpos de 1 a 20 com uma ou maissubstituições, por exemplo, dez ou menos, p. ex. uma, duas, três, quatro oucinco, substituições no conjunto de CDRs H e/ou L revelado. Substituiçõespreferidas não são radicais Kabat diferentes de radicais Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90, 92 e 96 no domínio VL, e radicais Kabat 34, 54, 57, 95, 97,99 e 100B no domínio VH. Onde se realiza substituições nestas posições, asubstituição é, de preferência, para um radical indicado aqui como sendo umradical preferido naquela posição.

Em uma concretização preferida, um elemento de ligação dainvenção é uma molécula de anticorpo humana isolada apresentando umdomínio VH compreendendo um conjunto de HCDRs em uma estrutura delinhagem germinal humana, p. ex. estrutura de linhagem germinal humana dafamília de cadeia pesada VHl ou VH3. Em uma concretização preferida, umamolécula de anticorpo humana isolada tem um domínio VH compreendendoum conjunto de HCDRs em uma estrutura de linhagem germinal humanaVHl DP5 ou VH3 DP47. Assim, as regiões de estrutura de domínio VHpodem compreender regiões de estrutura de segmento de gene de linhagemgerminal humana VHl DP5 ou VH3 DP47. A seqüência de aminoácidos deVH FRl pode ser SEQ ID NO: 251. A seqüência de aminoácidos de VH FR2pode ser SEQ ID NO: 252. A seqüência de aminoácidos de VH FR3 pode serSEQ ID NO: 253. A seqüência de aminoácidos de VH FR4 pode ser SEQ IDNO: 254.

Normalmente o elemento de ligação também apresenta umdomínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs, de preferência, em umaestrutura de linhagem germinal humana, p. ex. uma estrutura de linhagemgerminal humana da família de cadeia leve Vlambda 1 ou Vlambda 6. Emuma concretização preferida, a molécula de anticorpo humana isolada tem umdomínio VL compreendendo um conjunto de LCDRs em uma estrutura delinhagem germinal humana VLambda 1 DPL8 ou VLambda 1 DPL3 ouVLambda 6_6a. Assim, a estrutura de domínio VL pode compreender regiõesde estrutura de segmento de gene de linhagem germinal humana VLambda 1DPL8, VLambda 1 DPL3 ou VLambda 6_6a. O domínio VL FR4 podecompreender uma região de estrutura de segmento de gene de linhagemgerminal humana JL2. A seqüência de aminoácidos de VL FRl pode ser SEQID NO: 255. A seqüência de aminoácidos de VL FR2 pode ser SEQ ID NO:256. A seqüência de aminoácidos de VL FR3 pode ser 257. A seqüência deaminoácidos de VL FR4 pode ser SEQ ID NO: 258.

Um anticorpo não-linhagem germinal tem as mesmas CDRs,porém estruturas diferentes, em comparação com um anticorpo de linhagemgerminal.

Um elemento de ligação da invenção pode competir pelaligação a GM-CSFRa com qualquer elemento de ligação revelado aqui, p. ex.anticorpo 3 ou qualquer um dos anticorpos 1, 2 ou de 4 a 20. Assim, umelemento de ligação pode competir pela ligação a GM-CSFRa com umamolécula de anticorpo compreendendo o domínio VH e domínio VL dequalquer um dos anticorpos 1, 2 ou de 4 a 20. A competição entre elementosde ligação pode ser analisada facilmente in vitro, por exemplo, por meio demarcação de uma molécula repórter a um elemento de ligação que pode serdetectada na presença de um ou mais outros elementos de ligação nãomarcados, para permitir a identificação de elementos de ligação que se ligamao mesmo epitopo ou um epitopo de sobreposição.

A competição pode ser determinada, por exemplo, usandoELISA em que, p. ex., o domínio extracelular de GM-CSFRa, ou umpeptídeo do domínio extracelular, é imobilizado em uma placa, e adiciona-seà placa um primeiro elemento de ligação marcado juntamente com um oumais outros elementos de ligação não marcados. Observa-se a presença de umelemento de ligação não marcado que compete com o elemento de ligaçãomarcado, por meio de uma diminuição do sinal emitido pelo elemento deligação marcado. De maneira análoga, é possível usar um ensaio deressonância de plasmon de superfície para determinar a competição entreelementos de ligação.

Em testes para a determinação de competição pode-seempregar um fragmento de peptídeo do antígeno, particularmente um peptídeoincluindo ou consistindo essencialmente de um epitopo ou região de ligaçãode interesse. É possível usar um peptídeo apresentando o epitopo ouseqüência-alvo mais um ou mais aminoácidos em qualquer ponta. Elementosde ligação de acordo com a presente invenção podem ser tais que sua ligaçãocom antígeno é inibida por um peptídeo com, ou incluindo, a seqüência dada.

Elementos de ligação que se ligam a um peptídeo podem serisolados, por exemplo, de uma biblioteca de apresentação de fago medianteinvestigação com o(s) peptídeo(s).

A presente invenção também proporciona o uso de umelemento de ligação como acima para a medição dos níveis de antígeno emum ensaio de competição, ou seja, um método de medir o nível de antígenoem uma amostra mediante o emprego de um elemento de ligação comoproporcionado pela presente invenção em um ensaio de competição. Isto podeocorrer onde a separação física de antígeno ligado de antígeno ligado não énecessária. A ligação de uma molécula repórter ao elemento de ligação deforma que venha a ocorrer uma alteração física ou óptica quando da ligação,é uma possibilidade. A molécula repórter pode gerar diretamente ouindiretamente sinais detectáveis e, de preferência, mensuráveis. A ligação demoléculas-repórter pode ser direta ou indireta, covalente, por exemplo, viauma ligação de peptídeo ou não-covalente. A ligação via uma ligaçãopeptídica pode ser como um resultado de expressão recombinante de um geneque funde anticorpo codificante e molécula repórter.

A presente invenção também proporciona níveis de mediçãode antígeno diretamente, mediante o emprego de um elemento de ligação deacordo com a invenção, por exemplo, em um sistema de biossensor.

A presente invenção proporciona um método que compreendecausar ou permitir a ligação de um elemento de ligação como proporcionadoaqui a GM-CSFRa. Referida ligação pode ocorrer in vivo, p. ex. apósadministração de um elemento de ligação, ou ácido nucleico que codifica umelemento de ligação, ou pode ocorrer in vitro, por exemplo, em ELISA,Western blot, imunoquímica, imunoprecipitação, cromatografia de afinidade,ou ensaios à base de células, como um ensaio de TF-1.

É possível determinar a quantidade de ligação de elemento deligação a GM-CSFRa. A quantificação pode ser relacionada com aquantidade do antígeno em uma amostra de teste, que pode ser de interessediagnóstico ou prognóstico.

Um kit compreendendo um elemento de ligação ou moléculade anticorpo de acordo com qualquer aspecto ou concretização da presenteinvenção também é proporcionado como um aspecto da presente invenção.Em um kit da invenção, o elemento de ligação ou molécula de anticorpo podeser marcado para permitir sua reatividade em uma amostra a ser determinada,p. ex. como descrito adicionalmente abaixo. Componentes de um kit sãogeralmente estéreis e encontram-se em frascos ou outros recipientes fechadoshermeticamente. Kits podem ser empregados em análise diagnostica ou outrosmétodos para os quais são úteis moléculas de anticorpos. Um kit pode conterinstruções para uso dos componentes em um método, p. ex. um método deacordo com a presente invenção. É possível incluir, em um kit da invenção,materiais ancilares para auxiliar ou permitir a realização de um método do tiporeferido.

As reatividades de anticorpos em uma amostra podem serdeterminadas via qualquer meio apropriado. Ensaio rádio-imunológico (RIA)é uma possibilidade. Antígeno marcado radiativo é misturado com antígenonão-marcado (a amostra de teste) e deixado ligar-se ao anticorpo. Antígenoligado é separado fisicamente de antígeno não ligado, e determina-se aquantidade de antígeno radiativo ligado ao anticorpo. Quanto mais antígenohá na amostra de teste, tanto menos antígeno radioativo se ligará ao anticorpo.

Também é possível usar um ensaio de ligação competitiva com antígeno não-radioativo, usando antígeno ou um análogo ligado a uma molécula repórter. Amolécula repórter pode ser um fluorocromo, corante de fósforo ou a laser comcaracterísticas de absorção ou emissão isoladas espectralmente. Fluorocromosvantajosos incluem fluoresceína, rodamina, ficoeritrina e vermelhos TexasRed. Corantes cromogênicos vantajosos incluem diaminobenzidina. Outrosrepórteres incluem partículas coloidais macromoleculares ou materialparticulado, como pérolas de látex que são coloridas, magnéticas ouparamagnéticas, e agentes biologicamente ou quimicamente ativos que podemcausar diretamente ou indiretamente sinais detectáveis possíveis de seremobservados visualmente, detectados eletronicamente ou registrados de outraforma. Estas moléculas podem ser enzimas, que catalisam reações que sedesenvolvem, ou alteram cores ou causam alterações nas propriedadeselétricas, por exemplo. Elas podem ser excitáveis molecularmente, de talforma que transições eletrônicas entre estados de energia resultem emabsorções ou emissões espectrais características. Elas podem incluir entidadesquímicas usadas em conjunto com biossensores. E possível empregar sistemasde detecção de biotina/avidina ou biotina/estreptavidina e fosfatase alcalina.

Os sinais gerados por conjugados anticorpo-repórterindividuais podem ser usados para derivar dados absolutos ou relativosquantificáveis para ligação de anticorpo relevante em amostras (normal eteste).

Em aspectos adicionais, a invenção proporciona um ácidonucleico isolado que compreende uma seqüência que codifica um elemento deligação, domínio VH e/ou domínio VL de acordo com a presente invenção. Ácido nucleico pode incluir DNA e/ou RNA, e pode ser totalmente ouparcialmente sintético. Referência a uma seqüência de nucleotídeos comoapresentada aqui compreende uma molécula de DNA com a seqüênciaespecificada, e compreende uma molécula de RNA com a seqüênciaespecificada em que U é substituído por T, exceto se o contexto o exigir deoutra forma. Em um aspecto preferido, a presente invenção proporciona umácido nucleico que codifica para uma CDR ou conjunto de CDRs ou sítio deligação de antígeno de anticorpo de domínio VH ou domínio VL, oumolécula de anticorpo, p. ex. scFv ou IgGl ou IgG4, da invenção comodefinido aqui. A presente invenção também proporciona construções em formade plasmídeos, vetores, cassetes de transcrição ou expressão quecompreendem pelo menos um polinucleotídeo como acima.

Um aspecto adicional é uma célula hospedeira transformadacom ou contendo ácido nucleico da invenção. Uma célula hospedeira do tiporeferido pode ser in vitro e pode ser em cultura. Uma célula hospedeira dotipo referido pode ser in vivo. A presença in vivo da célula hospedeira podepermitir a expressão intracelular dos elementos de ligação da presenteinvenção como "intracorpos" ou intracelular anticorpos. Intracorpos podemser usados para terapia gênica.

Um outro aspecto adicional proporciona um método quecompreende introduzir referido ácido nucleico em uma célula hospedeira. Aintrodução pode empregar qualquer técnica vantajosa. No caso de célulaseucarióticas, técnicas vantajosas podem incluir transfecção de fosfato decálcio, transfecção de fosfato de cálcio, DEAE-dextrano, eletroporação,transfecção mediada com lipossomas e transdução usando retrovírus ou outrovírus, p. ex. vaccinia ou, no caso de células de inseto, baculovírus. Aintrodução de ácido nucleico na célula hospedeira, em particular uma célulaeucariótica, pode usar um sistema viral ou baseado em plasmídeo. O sistemade plasmídeo pode ser mantido episomicamente ou pode ser incorporado nacélula hospedeira ou em um cromossomo artificial. A incorporação pode servia integração randômica ou objetivada de uma ou mais cópias em Iocisimples ou múltiplos. No caso de células bacterianas, técnicas vantajosaspodem incluir transformação de cloreto de cálcio, eletroporação e transfecçãousando bacteriófagos.

A introdução pode ser seguida causando ou permitindoexpressão do ácido nucleico, p. ex. cultivando-se células hospedeiras emcondições para expressão do gene.

Em uma concretização, o ácido nucleico da invenção éintegrado no genoma (p. ex. cromossoma) da célula hospedeira. A integraçãopode ser promovida por meio de inclusão de seqüências que promovem arecombinação com o genoma, de acordo com técnicas convencionais.

A presente invenção também proporciona um método quecompreende usar uma construção como indicada acima em um sistema deexpressão para expressar um elemento de ligação ou polipeptídeo comoacima. Assim, métodos de preparar um elemento de ligação, um domínio VHe/ou um domínio VL da invenção, são aspectos adicionais da invenção. Ummétodo pode compreender expressar referido ácido nucleico em condições taisa proporcionar a produção de referido elemento de ligação, domínio VH e/oudomínio VL, e recuperar o mesmo. Um método do tipo referido podecompreender cultivar células hospedeiras em condições para a produção dereferido elemento de ligação ou domínio de anticorpo.

Um método de produção pode compreender uma etapa deisolamento e/ou purificação do produto. Um método de produção podecompreender formular o produto em uma composição incluindo pelo menosum componente adicional, como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Sistemas para a clonagem e expressão de um polipeptídeonuma variedade de células hospedeiras diferentes, são bem conhecidos.

Células hospedeiras vantajosas incluem bactérias, células mamíferas, célulasde plantas, sistemas de leveduras e baculovírus e animais e plantastransgênicas. A expressão de anticorpos e fragmentos de anticorpos emcélulas procarióticas é bem estabelecida na arte [3]. Um hospedeirobacteriano comum, preferido, é E. coli.

A expressão em células eucarióticas em cultura também podeser obtida por aqueles com prática na arte, como uma opção para a produçãode um elemento de ligação [4,5,6]. Linhagens de células mamíferasdisponíveis na arte para expressão de um polipeptídeo heterólogo incluemcélulas de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, células de rim debebê de hamster, células de melanoma de camundongo NSO, células demieloma de rato YB2/0, células de rim embrionário humano, células de retinaembrionária humana, e muitas outras.

Vetores vantajosos podem ser selecionados ou construídos,contendo seqüências reguladoras apropriadas, incluindo seqüênciaspromotoras, seqüências terminadoras, seqüências de poliadenilação,seqüências acentuadoras, genes marcadores e outras seqüências, conformeapropriado. Vetores podem consistir de plasmídeos, p. ex., fagomídeos, oupodem ser virais, p. ex., 'fago, conforme apropriado [7]. Muitas técnicas eprotocolos conhecidos para a manipulação de ácido nucleico, por exemplo, na preparação de construções de ácido nucleico, mutagênese, seqüenciamento,introdução de DNA em células e expressão gênica, e análise de proteínas,encontram-se descritas detalhadamente em Ausubel et ai. [8].

A presente invenção proporciona um método de obter um oumais elementos de ligação capazes de ligar-se ao antígeno, sendo que o método inclui contatar uma biblioteca de elementos de ligação de acordo coma invenção e referido antígeno, e selecionar um ou mais elementos de ligaçãoda biblioteca capazes de se ligarem a referido antígeno.

A biblioteca pode ser aplicada em partículas ou complexosmoleculares, p. ex. pacotes genéticos replicáveis, como levedura, partículasbacterianas ou bacteriófagos (p. ex. T7), ou sistemas covalentes, ribossômicosou outros sistemas de apresentação in vitro, sendo que cada partícula oucomplexo molecular contém ácido nucleico que codifica o domínio variávelVH do anticorpo apresentado sobre o mesmo, e opcionalmente também umdomínio VL apresentado, se presente. A seleção de elementos de ligaçãocapazes de se ligarem ao antígeno e apresentados em bacteriófagos ou outraspartículas de biblioteca ou complexos moleculares, ácido nucleico pode serobtido de um bacteriófago ou de outra partícula ou complexo molecularapresentando um elemento de ligação selecionado. Referido ácido nucleicopode ser usado na produção subseqüente de um elemento de ligação ou umdomínio variável VH ou VL de anticorpo por meio de expressão de ácidonucleico com a seqüência de ácido nucleico obtida de um bacteriófago ououtra partícula ou complexo molecular apresentando um referido elemento deligação selecionado.

Um domínio variável VH de anticorpo com a seqüência deaminoácidos de um domínio variável VH de anticorpo de um referidoelemento de ligação selecionado pode ser proporcionado em forma isolada,como pode um elemento de ligação compreendendo referido domínio VH.

Um domínio variável VL de anticorpo com a seqüência deaminoácidos de um domínio variável VL de anticorpo de um referidoelemento de ligação selecionado pode ser proporcionado em forma isolada,como o pode um elemento de ligação compreendendo um domínio VL do tiporeferido.

A capacidade de ligar-se a GM-CSFRa pode ser testadaadicionalmente, também a capacidade de competir por qualquer um dosanticorpos de 1 a 20 (p. ex. em formato scFv e/ou formato IgG, p. ex. IgGl ouIgG4) para ligação a GM-CSFRa. A capacidade de neutralizar GM-CSFRapode ser testada.

Variantes dos domínios VH e VL e CDRs da presenteinvenção, incluindo aquelas para as quais seqüências de aminoácidos sãoapresentadas aqui podem ser obtidas por meio de métodos de alteração oumutação e seleção de seqüências, e podem ser empregadas em elementos deligação para GM-CSFRa. Seguindo a orientação da química computacionalna aplicação de técnicas de análise de dados multivariados nas relaçõesquantitativas de atividade de propriedade/estrutura [9] de anticorpos podemser derivadas usando-se técnicas matemáticas bem conhecidas, comoregressão estatística, reconhecimento de padrões, e classificação[10,11,12,13,14,15]. As propriedades de anticorpos podem ser derivadas demodelos empíricos e teóricos (por exemplo, análise de radicais de contatoprovável ou propriedade físico-química calculada) de seqüência de anticorpos,estruturas funcionais e tridimensionais, e estas propriedades podem serconsideradas singelamente e em combinação.

Um sítio de ligação de antígeno de anticorpo constituído deum domínio VH e um domínio VL é formado por seis alças de polipeptídeo:três do domínio variável de cadeia leve (VL) e três do domínio variável decadeia pesada (VH). A análise de anticorpos com estrutura atômica conhecidaapresenta relações elucidadas entre a seqüência e estrutura tridimensional desítios de combinação de anticorpo [16,17]. Estas relações implicam que,exceto quanto à terceira região (alça) em domínios VH, alças de sítios deligação apresentam um de uma de um pequeno número de conformações decadeia principal: estruturas canônicas. Mostrou-se que a estrutura canônicaformada em uma alça particular é determinada por seu tamanho e pelapresença de determinados radicais em sítios-chaves tanto nas regiões de alçacomo nas regiões de estrutura [16,17].

Este estudo de relação seqüência-estrutura pode ser usado paraa predição daqueles radicais em um anticorpo de seqüência conhecida, mascom uma estrutura tridimensional desconhecida, que são importantes namanutenção da estrutura tridimensional de suas alças de CDR e,conseqüentemente, conservam a ligação. Estas predições podem sercorroboradas por meio de comparação das predições com os resultados deexperimentos de otimização guia [lead\. Em uma abordagem estrutural, épossível criar um modelo da molécula de anticorpo [18] usando-se qualquerpacote comercial ou livremente acessível, como WAM [19]. E possível usarentão um pacote de programas de análise e visualização de proteínas, comoInsight II (Accelerys, Inc.) ou Deep View [20] para avaliar possíveissubstituições em cada posição na CDR. Esta informação pode ser usada entãopara preparar substituições que provavelmente apresentam um efeito mínimoou benéfico sobre a atividade.As técnicas requeridas para preparar substituições emseqüências de aminoácidos de CDRs, domínios VH ou VL de anticorpo eelementos de ligação são geralmente disponíveis na arte. E possível prepararseqüências variantes com substituições que podem ou não ser preditas comoapresentando um efeito mínimo ou benéfico sobre a atividade, e testadasquanto à capacidade de se ligarem a, e/ou neutralizarem, GM-CSFRa e/ouquanto a qualquer outra propriedade desejada.

Variantes de seqüências de aminoácidos de domínio variávelde qualquer um dos domínios VH e VL cujas seqüências são divulgadas aquiespecificamente podem ser empregadas de acordo com a presente invenção,como discutido. Variantes particulares podem incluir uma ou mais alteraçõesde seqüências de aminoácidos (adição, deleção, substituição e/ou inserção deum radical de aminoácido), podem apresentar menos de cerca de 20alterações, menos de cerca de 15 alterações, menos de cerca de 10 alterações oumenos de cerca de 5 alterações, podem ser 5, 4, 3, 2 ou 1. Alterações podemser preparadas em uma ou mais regiões de estrutura e/ou uma ou mais CDRs.

De preferência, alterações não resultam em perda de função,de modo que um elemento de ligação compreendendo uma seqüência deaminoácido alterada desta forma conserva, de preferência, uma capacidade deligar-se a, e/ou neutralizar, GM-CSFRa. Mais preferivelmente, ele conserva amesma capacidade quantitativa de ligação e/ou de neutralização que oelemento de ligação em que a alteração não é realizada, p. ex. conformemedido em um ensaio aqui descrito. Da forma mais preferível, o elemento deligação compreendendo uma seqüência de aminoácidos assim alteradaapresenta uma capacidade incrementada de ligar-se a, ou neutralizar GM-CSFRa em comparação com um elemento de ligação em que a alteração nãoé realizada, p. ex. conforme medido em um ensaio aqui descrito.

A alteração pode compreender substituir um ou mais radicaisde aminoácidos com um aminoácido não convencional ou não naturalmenteocorrente, modificando um ou mais radicais de aminoácidos em uma formanão convencional ou não naturalmente ocorrente, ou inserindo um ou maisaminoácidos não convencionais ou não naturalmente ocorrentes naseqüência. Números e locais preferidos de alterações em seqüências dainvenção encontram-se descritos alhures aqui. Aminoácidos naturalmenteocorrentes incluem os 20 aminoácidos L "convencionais" identificados comoG, A, V, L, I, Μ, P, F, W, S, T5 N, Q5 Y, C5 K5 R5 H5 D5 E mediante o uso docódigo convencional de uma letra só. Aminoácidos não convencionaisincluem qualquer outro radical que pode ser incorporado em uma espinhadorsal de polipeptídeo ou resultar da modificação de um radical deaminoácido existente. Aminoácidos não convencionais podem sernaturalmente ocorrentes ou não naturalmente ocorrentes. Diversosaminoácidos não convencionais naturalmente ocorrentes são conhecidos naarte, como 4-hidroxiprolina, 5-hidroxilisina, 3-metil-histidina, N-acetilserina,etc. [21]. Aqueles radicais de aminoácidos que são derivados em sua posiçãoN-alfa só se encontrarão na ponta N de uma seqüência de aminoácidos.Normalmente, na presente invenção, um aminoácido é um aminoácido L5 masem algumas concretizações, ele pode ser um aminoácido D. A alteração podecompreender, portanto, a modificação de um aminoácido L em umaminoácido D, ou substituição por um aminoácido D. Formas metiladas,acetiladas e/ou fosforiladas de aminoácidos também são conhecidas, eaminoácidos na presente invenção podem ser sujeitos a modificação do tiporeferido.

Seqüências de aminoácidos em domínios de anticorpo eelementos de ligação da invenção podem compreender aminoácidos nãonaturais ou não convencionais descritos acima. Em algumas concretizações épossível incorporar aminoácidos não-convencionais (p. ex. aminoácidos D)em uma seqüência de aminoácidos durante a síntese, enquanto que, em outrasconcretizações, os aminoácidos não-convencionais podem ser introduzidospor meio de modificação ou reposição dos aminoácidos convencionais"originais" após a síntese da seqüência de aminoácidos.

O uso de aminoácidos não convencionais e/ou nãonaturalmente ocorrentes aumenta a diversidade estrutural e funcional, e,portanto, pode aumentar o potencial para se obter as desejadas propriedadesde ligação e neutralização de GM-CSFRa em um elemento de ligação dainvenção. Adicionalmente, mostrou-se que aminoácidos D e análogosapresentam perfis farmacocinéticos melhores em comparação comaminoácidos L convencionais, em virtude da degradação in vivo depolipeptídeos apresentando aminoácidos L após a administração a um animal.

Como indicado acima, uma seqüência de aminoácidos de CDRsubstancialmente como apresentada aqui é realizada, de preferência, comouma CDR em um domínio variável de anticorpo humano ou uma porçãosubstancial do mesmo. As seqüências de HCDR3 substancialmente comoapresentadas aqui representam concretizações preferidas da presenteinvenção e prefere-se que cada uma destas seja realizada como uma HCDR3em um domínio variável de cadeia pesada humana ou uma porção substancialda mesma.

Domínios variáveis empregados na invenção podem serobtidos ou derivados de qualquer linhagem germinal ou domínio variávelhumano rearranjado, ou podem ser um domínio variável sintético baseado emseqüências consenso ou efetivas de domínios variáveis humanos conhecidos.Uma seqüência de CDR da invenção (p. ex. CDR3) pode ser introduzida emum repertório de domínios variáveis que não apresentam uma CDR (p. ex.CDR3), usando tecnologia de DNA recombinante.

Por exemplo, Marks et ai. (1992) [22] descrevem métodos deproduzir repertórios de domínios variáveis de anticorpos em que iniciadoresconsenso dirigidos, ou adjacentes, à ponta 5' da área de domínio variável sãousados em conjunto com iniciadores consenso para a terceira região deestrutura de genes de VH humanos para proporcionar um repertório dedomínios variáveis VH que não apresentam uma CDR3. Marks et al.descrevem adicionalmente como este repertório pode ser combinado com umaCDR3 de um anticorpo particular. Usando-se técnicas análogas, as seqüênciasderivadas de CDR3 da presente invenção podem ser embaralhadas comrepertórios de domínios VH ou VL que não apresentam uma CDR3, e osdomínios VH ou VL completos embaralhados combinados com um domínioVH ou VL completo embaralhado, combinado com um domínio VH ou VLcognato para proporcionar elementos de ligação da invenção. Em seguida, orepertório pode ser apresentado em um sistema hospedeiro vantajoso, como osistema de apresentação de fago do W092/01047 ou qualquer um de umgrande corpo de literatura subseqüente, incluindo ref. [23], de forma que épossível selecionar elementos de ligação vantajosos. Um repertório podeconsistir de qualquer quantidade, desde IO4 elementos individuais até mais,por exemplo, de IO6 a IO8 ou IO10 elementos. Outros sistemas hospedeirosvantajosos incluem apresentação de levedura, apresentação bacteriana,apresentação de T7, apresentação viral, apresentação de células, apresentaçãode ribossoma e apresentação covalente. Técnicas análogas deembaralhamento ou combinatoriais também são divulgadas por Stemmer(1994)[24], que descreve a técnica com relação a um gene de β-lactamase,mas que observa que a abordagem pode ser usada para a geração deanticorpos.

Uma alternativa adicional consiste em gerar regiões VH ou VLinéditas portando seqüências derivadas de CDR da invenção usandomutagênese randômica de um ou mais genes VH e/ou VL selecionados paragerar mutações em todo o domínio variável. Uma técnica do tipo referido édescrita por Gram et al. (1992) [25], que usou PCR propensa a erro. Emconcretizações preferidas prepara-se uma ou duas substituições deaminoácidos em um conjunto de HCDRs e/ou LCDRs. Outro método quepode ser usado consiste em dirigir mutagênese para regiões de CDR de genesVH ou VL [26,27].

Um aspecto adicional da invenção proporciona um métodopara se obter um sítio de ligação de antígeno de anticorpo para antígeno deGM-CSFRa, sendo que o método compreende proporcionar, como adição,deleção, substituição ou inserção de um ou mais aminoácidos na seqüência deaminoácidos de um domínio VH apresentado aqui, um domínio VH que éuma variante de seqüência de aminoácidos do domínio VH, opcionalmentecombinando-se o domínio VH assim proporcionado com um ou maisdomínios VL, e testando o domínio VH ou combinação ou combinações deVH/VL para identificar um elemento de ligação ou um sítio de ligação deantígeno de anticorpo para antígeno de GM-CSFRa e opcionalmente comuma ou mais propriedades preferidas, de preferência, a capacidade deneutralizar a atividade de GM-CSFRa. Referido domínio VL pode apresentaruma seqüência de aminoácidos que é substancialmente como apresentadoaqui.

É possível empregar um método análogo em que uma ou maisvariantes de seqüências de um domínio VL aqui divulgado são combinadascom um ou mais domínios VH.

Um aspecto adicional da invenção proporciona um método depreparar um elemento de ligação para antígeno de GM-CSFRa, sendo quereferido método compreende:

(a) proporcionar um repertório de partida de ácidos nucleicoscodificando um domínio VH que inclui uma CDR3 a ser substituída, oucarecem de uma região codificante de CDR3;

(b) combinar referido repertório com um ácido nucleicodoador que codifica uma seqüência de aminoácidos substancialmente comoindicada aqui para uma CDR3 VH de tal forma que referido ácido nucleicodoador é inserido na região de CDR3 no repertório, de forma a proporcionarum repertório-produto de ácidos nucleicos codificando um domínio VH;

(c) expressar os ácidos nucleicos de referido repertório-produto;

(d) selecionar um elemento de ligação para GM-CSFRa; e

(e) recuperar referido elemento de ligação ou ácido nucleicoque codifica o mesmo.

Novamente, é possível empregar um método análogo em queuma CDR3 VL da invenção é combinada com um repertório de ácidosnucleicos codificando um domínio VL que inclui uma CDR3 a ser substituídaou não apresenta uma região codificante de CDR3.

De forma análoga, uma ou mais, ou todas as três CDRs podemser enxertadas em um repertório de domínios VH ou VL que são, então,selecionados quanto a um elemento de ligação ou elementos de ligação paraGM-CSFRa.

Em uma concretização preferida, é possível usar um ou maisde HCDRl, HCDR2 e HCDR3, p. ex. um conjunto de HCDRs de Anticorpo 1(SEQ ID NOS: 3-5); Anticorpo 2 (SEQ ID NOS: 13-15); Anticorpo 4 (SEQID NOS: 33-35); Anticorpo 5 (SEQ ID NOS: 43-45); Anticorpo 6 (SEQ IDNOS: 53-55); Anticorpo 7 (SEQ ID NOS: 63-65); Anticorpo 8 (SEQ IDNOS: 73-75); Anticorpo 9 (SEQ ID NOS: 83-85); Anticorpo 10 (SEQ IDNOS: 93-95); Anticorpo 11 (SEQ ID NOS: 103-105); Anticorpo 12 (SEQ IDNOS: 113-115); Anticorpo 13 (SEQ ID NOS: 123-125); Anticorpo 14 (SEQID NOS: 133-135); Anticorpo 15 (SEQ ID NOS: 143-145); Anticorpo 16(SEQ ID NOS: 153-155); Anticorpo 17 (SEQ ID NOS: 163-165); Anticorpo18 (SEQ ID NOS: 173-175); Anticorpo 19 (SEQ ID NOS: 183-185) ouAnticorpo 20 (SEQ ID NOS: 193-195); ou opcionalmente Anticorpo 3 (SEQID NOS: 23-25), e/ou é possível usar um ou mais de LCDRl, LCDR2 eLCDR3, p. ex., um conjunto de LCDRs de Anticorpo 1 (SEQ ID NOS: 8-10);Anticorpo 2 (SEQ ID NOS: 18-20); Anticorpo 4 (SEQ ID NOS: 38^0);Anticorpo 5 (SEQ ID NOS: 48-50); Anticorpo 6 (SEQ ID NOS: 58-60);Anticorpo 7 (SEQ ID NOS: 68-70); Anticorpo 8 (SEQ ID NOS: 78-80);Anticorpo 9 (SEQ ID NOS: 88-90); Anticorpo 10 (SEQ ID NOS: 98-100);Anticorpo 11 (SEQ ID NOS: 108-110); Anticorpo 12 (SEQ ID NOS: 118-120); Anticorpo 13 (SEQ ID NOS: 128-130); Anticorpo 14 (SEQ ID NOS:138-140); Anticorpo 15 (SEQ ID NOS: 148-150); Anticorpo 16 (SEQ IDNOS: 158-160); Anticorpo 17 (SEQ ID NOS: 168-170); Anticorpo 18 (SEQID NOS: 178-180); Anticorpo 19 (SEQ ID NOS: 188-190) ou Anticorpo 20(SEQ ID NOS: 198-200); ou opcionalmente Anticorpo 3 (SEQ ID NOS: 28-30).

Uma porção substancial de um domínio variável deimunoglobulina compreenderá pelo menos as três regiões de CDR, emconjunto com suas regiões de estrutura intervenientes. De preferência, aporção também incluirá pelo menos cerca de 50% de um ou ambos dentreprimeira e quarta regiões de estrutura, sendo que 50% são os 50% da ponta Cda primeira região de estrutura e os 50% da ponta N da quarta região deestrutura. Radicais adicionais na ponta N ou C da parte substancial dodomínio variável podem ser aqueles não associados normalmente com regiõesde domínio variável naturalmente ocorrentes. Por exemplo, a construção deelementos de ligação da presente invenção preparados por meio de técnicas deDNA recombinante pode resultar na introdução de radicais N- ou C-terminaiscodificados por ligantes introduzidos para facilitar a clonagem ou outrasetapas de manipulação. Outras etapas de manipulação incluem a introduçãode ligantes para conjugar domínios variáveis da invenção a seqüências deproteínas adicionais incluindo regiões constantes de anticorpos, outrosdomínios variáveis (por exemplo, na produção de diacorpos) ou marcadoresdetectáveis/funcionais como discutido mais detalhadamente alhures aqui.

Embora em um aspecto preferido da invenção elementos deligação compreendendo um par de domínios VH e VL sejam preferidos,domínios de ligação simples baseados em seqüências de domínios VH ou VLformam aspectos adicionais da invenção. É de conhecimento geral quedomínios de imunoglobulina simples, particularmente domínios VH, sãocapazes de ligar antígenos-alvo. Por exemplo, ver a discussão de dAbs alhures aqui.

No caso de qualquer um dos domínios de ligação simples,estes domínios podem ser usados para selecionar domínios decomplementaridade capazes de formar um elemento de ligação de doisdomínios capaz de ligar-se a GM-CSFRa. Isto pode ser obtido por meio demétodos de seleção de apresentação de fago usando-se a assim-chamadaabordagem combinatorial hierárquica dupla como revelado no W092/01047,em que uma colônia individual contendo um clone de cadeia H ou L é usadapara infectar uma biblioteca completa de clones codificando a outra cadeia (Lou H) e o resultante elemento de ligação de duas cadeias é selecionado deacordo com técnicas de apresentação de fago, como aquelas descritas naquelareferência e [22].

Aspectos adicionais da presente invenção proporcionamcomposições contendo elementos de ligação da invenção e pelo menos umcomponente adicional, p. ex. uma composição compreendendo um elementode ligação e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Referidascomposições podem ser usadas em métodos de inibir ou neutralizar GM-CSFRa, incluindo métodos de tratamento do corpo humano ou animal pormeio de terapia.

A invenção proporciona preparações heterogêneascompreendendo moléculas de anticorpos anti-GM-CSFRa. Por exemplo,referidas preparações podem ser misturas de anticorpos com cadeias pesadasde comprimento pleno e cadeias pesadas não apresentando a lisina C-terminal,com vários graus de glicosilação e/ou com aminoácidos derivados, comociclização de um ácido glutâmico N-terminal para formar um radical de ácidopiroglutâmico.

Aspectos da invenção incluem métodos de tratamentocompreendendo a administração de um elemento de ligação comoproporcionado, composições farmacêuticas compreendendo um elemento deligação do tipo referido, e uso de um elemento de ligação do tipo referido nafabricação de uma droga, por exemplo, em um método de preparar uma drogaou composição farmacêutica, compreendendo formular o elemento de ligaçãocom um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Tratamento anti-GM-CSFRa pode ser administrado oralmente(por exemplo, nanocorpos), por meio de injeção (por exemplo,subcutaneamente, intravenosamente, intra-arterialmente, intra-articularmente,intraperitonealmente ou intramuscularmente), por inalação, pela viaintravesicular (instilação na bexiga urinária), ou topicamente (por exemplo,intraocular, intranasal, retal, em feridas, sobre a pele). O tratamento pode seradministrado por meio de infusão pulsada, particularmente com dosesdeclinantes de elemento de ligação. A via de administração pode serdeterminada pelas características físico-químicas do tratamento, medianteconsiderações especiais relativas à doença, ou à exigência de otimizar aeficácia ou minimizar efeitos colaterais. Considera-se que tratamento anti-GM-CSFRa não se restringirá ao uso na clínica. Portanto, prefere-se tambéminjeção subcutânea empregando um dispositivo isento de agulha.

Uma composição pode ser administrada sozinho ou emcombinação com outros tratamentos, dependentes simultaneamente ouseqüencialmente da condição a ser tratada. É possível usar tratamentos decombinação para proporcionar efeitos sinérgicos significativos,particularmente a combinação de um elemento de ligação anti-GM-CSFRacom uma ou mais outras drogas. Um elemento de ligação de acordo com apresente invenção pode ser proporcionado em combinação ou adição a um oumais dos seguintes: NSAIDs (p. ex., inibidores de cox, como Celecoxib eoutros inibidores de cox2 similares), corticosteróides (p. ex. prednisona) edrogas antirreumáticas modificadoras de doença (DMARDs) p. ex. Humira(adalimumab), metotrexato, Arava, Enbrel (Etanercept), Remicade(Infliximab), Kineret (Anakinra), Rituxan (Rituximab), Orencia (abatacept),sais de ouro, antimaláricos, sulfasalazina d-penicilamina, ciclosporina A,diclofenaco, ciclofosfamida e azatioprina.

De acordo com a presente invenção, composiçõesproporcionadas podem ser administradas a indivíduos. A administração é, depreferência, numa "quantidade terapeuticamente efetiva", sendo que isto ésuficiente para apresentar benefício a um paciente. Referido benefício podeser, pelo menos, o melhoramento de pelo menos um sintoma. A quantidadeefetiva administrada, e a taxa e duração da administração, dependerá danatureza e da gravidade do que está sendo tratado. A prescrição dotratamento, p. ex. decisões relativas à dosagem, etc., encontra-se dentro doâmbito da responsabilidade de praticantes gerais e de outros doutoresmédicos, e pode depender da gravidade dos sintomas e/ou da progressão deuma doença que está sendo tratada. Doses apropriadas de anticorpo são bemconhecidas na arte [28,29]. É possível usar dosagens específicas indicadasaqui, ou na obra Physician's DeskReference (2003) como apropriadas para otipo de droga sendo administrada. Uma quantidade terapeuticamente efetivaou dose vantajosa de um elemento de ligação da invenção pode serdeterminada comparando-se sua atividade in vitro e atividade in vivo em ummodelo animal. Métodos para extrapolação de dosagens efetivas emcamundongos e outros animais de teste para humanos já são conhecidos. Adose precisa dependerá de uma quantidade de fatores, incluindo se o anticorpoé para diagnóstico ou para tratamento, do tamanho e da localização da área aser tratada, da natureza precisa do anticorpo (p. ex., anticorpo integral,fragmento ou diacorpo), e da natureza de qualquer marcador detectável ououtra molécula ligada ao anticorpo. Uma dose típica de anticorpo situa-se nafaixa de 100 μ§ a 1 g, no caso de aplicações sistêmicas, e de 1 a 1 mg, nocaso de aplicações tópicas. Tipicamente, o anticorpo será um anticorpointegral, de preferência, IgGl, IgG2 ou, mais preferivelmente, IgG4. Esta éuma dose para um tratamento único de um paciente adulto, que pode serajustada proporcionalmente para crianças e bebês, e também ajustada paraoutros formatos de anticorpos em proporção ao peso molecular. Ostratamentos podem ser repetidos em intervalos diários, bi-semanais, semanaisou mensais, dependendo do julgamento do médico. Em concretizaçõespreferidas da presente invenção, o tratamento é periódico, e o período entre asadministrações é de cerca de duas semanas ou mais, de preferência, de cercade três semanas ou mais, mais preferivelmente de cerca de quatro semanas oumais, ou cerca de uma vez por mês. Em outras concretizações preferidas dainvenção, o tratamento pode ser dado antes, e/ou após a cirurgia, e, maispreferivelmente, pode ser administrado ou aplicado diretamente no sítioanatômico do tratamento cirúrgico.

Elementos de ligação da presente invenção serãoadministrados usualmente em forma de uma composição farmacêutica, quepode compreender pelo menos um componente adicionalmente ao elementode ligação. Assim, composições farmacêuticas de acordo com a presenteinvenção, e para uso de acordo com a presente invenção, podem compreender,adicionalmente ao ingrediente ativo, um excipiente farmaceuticamenteaceitável, veículo, tamponador, estabilizador ou outros materiaisfarmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos por aqueles com prática naarte. Referidos materiais deveriam ser não-tóxicos e não deveriam interferircom a eficácia do ingrediente ativo. A natureza precisa do veículo ou outromaterial dependerá da via de administração, que pode ser oral, ou por injeção,p. ex. intravenosa. Composições farmacêuticas para administração oral podemser forma de tablete, cápsula, pó, líquido ou semi-sólido. Um tablete podecompreender um veículo sólido, como gelatina, ou um adjuvante.Composições farmacêuticas líquidas compreendem geralmente um veículolíquido, como água, petróleo, óleos animais ou vegetais, óleo mineral ou óleosintético. É possível incluir solução salina fisiológica, dextrose ou outrasolução de sacarídeos ou glicóis, como etileno glicol, propileno glicol oupolietileno glicol. No caso de injeção intravenosa, ou injeção no sítio deacometimento, o ingrediente ativo estará em forma de uma solução aquosaparenteralmente aceitável que é isenta de pirogênio e que apresenta pH,isotonicidade e estabilidade vantajosas. Aqueles com prática relevante na arteconhecem como preparar soluções vantajosas empregando, por exemplo,veículos isotônicos, como injeção de cloreto de sódio, injeção de Ringer,injeção de Ringer lactada. É possível incluir conservantes, estabilizadores,tamponantes, antioxidantes e/ou outros aditivos, conforme necessário.Elementos de ligação da presente invenção podem ser formulados em formaslíquidas, semi-sólidas ou sólidas, dependendo das propriedades físico-químicas da molécula, e da via de fornecimento. Formulações podemincluir excipientes, ou combinações de excipientes, por exemplo: açúcares,aminoácidos e tensoativos. Formulações líquidas podem incluir uma amplafaixa de concentrações de anticorpos e pH. Formulações sólidas podem serproduzidas por meio de liofilização, secagem por pulverização, ou secagempor meio de tecnologia de fluido supercríticos, por exemplo. Formulações deanti-GM-CSFRa dependerão da via de fornecimento desejada: por exemplo,formulações para fornecimento pulmonar podem consistir de partículas compropriedades físicas que asseguram a penetração na parte profunda do pulmãomediante inalação; formulações tópicas podem incluir agentes modificadoresde viscosidade, que prolongam o tempo em que a droga permanece no sítio deação. Em determinadas concretizações, o elemento de ligação pode serpreparado com um veículo que protegerá o elemento de ligação contraliberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindoimplantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de fornecimentomicroencapsulados. É possível usar polímeros biodegradáveis, biocompatíveis,como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno,poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação dereferidas formulações são conhecidos por aqueles com prática na arte. Ver, p.ex., Robinson, 1978 [30].

Elementos de ligação de acordo com a invenção podem serusados em um método de tratamento ou diagnóstico do corpo humano ouanimal, como um método de tratamento (que pode incluir tratamentoprofilático) de uma doença ou desordem em um paciente humano, quecompreende administrar a referido paciente uma quantidade efetiva de umelemento de ligação da invenção. Condições tratáveis de acordo com apresente invenção incluem qualquer uma em que GM-CSFRa desempenhaum papel. A literatura técnica publicada indica um papel para GM-CSF emvários doenças e condições, como resumido abaixo. Como GM-CSF se ligaespecificamente a GM-CSFRa, é possível encontrar efeitos patológicos e/ousintomáticos do GM-CSF mediante a inibição do GM-CSF ao GM-CSFRa.Assim, a evidência publicada, adicionalmente aos dados farmacológicos invivo e in vitro apresentados para as moléculas de anticorpos descritas aqui naParte Experimental, indica que é possível usar elementos de ligação dainvenção no tratamento de condições, doenças e desordens autoimunes e/ouinflamatórias, por exemplo, artrite reumatóide, asma, resposta alérgica,esclerose múltipla, leucemia mielóide e aterosclerose. Evidência publicadasobre estas condições encontra-se resumida abaixo:

Asma e respostas alérgicas

Asma bronquial é uma desordem inflamatória persistentecomum do pulmão, caracterizada por hiper-responsividade das vias aéreas,superprodução de muco, fibrose e níveis elevados de IgE. Hiper-responsividade das vias aéreas (AHR) é a constrição exagerada das viasaéreas a estímulos não-específicos. Tanto AHR como também asuperprodução de muco são consideradas responsáveis pela obstruçãovariável das vias aéreas que leva às características de falta de ar dos ataquesde asma (exacerbações) e que é responsável pela mortalidade associada comesta doença (em torno de 2000 mortes/ano no Reino Unido).

Estudos recentes demonstraram que o GM-CSF e seu receptorsão regulados positivamente tanto no nível da proteína como no do mRNA, naasma. Adicionalmente, níveis de expressão correlacionam-se com a gravidadeda doença. A produção incrementada de GM-CSF foi medida em fluido delavagem bronquioalvelolar (BAL), células BAL, saliva, células epiteliaisbronquiolares, e células mononucleares do sangue periférico estimuladas comantígeno de pacientes de asma, quando comparadas com sujeitos não-asmáticos [31,32]. Adicionalmente, mostrou-se que o nível de expressão, nasvias aéreas, do GM-CSF após exposição a alérgeno correlaciona-se com ograu de eosinofilia tissular e com a gravidade da resposta asmática de fasetardia [33]. Estudos posteriores ligaram a expressão regulada positivamentedo GM-CSFR com asma intrínseca ou não-atópica, correlacionando níveis deexpressão com dados da função pulmonar [34]. Em um modelo decamundongo de exposição e sensibilização à albumina, a neutralização daatividade do GM-CSF com um anticorpo policlonal de cabra, por meio deadministração intranasal antes da exposição à ovalbumina, preveniu a hiper-responsividade das vias aéreas e reduziu tanto a infiltração de eosinófilos e asecreção de muco nas vias aéreas [35]. De maneira análoga, em um modelo decamundongo de doença respiratória alérgica iniciada com a administraçãointranasal de partículas de exaustão de diesel, neutralização do GM-CSFnovamente por meio de administração intranasal de um anticorpo policlonalde cabra preveniu a hiper-responsividade das vias aéreas à metacolina,reduziu as contagens de eosinófilos BAL e também diminuiu a expressão decélulas de Goblet produtoras de muco no epitélio das vias aéreas [36].

O papel do GM-CSF em respostas alérgicas foi investigadoadicionalmente em modelos murinos de tolerância induzida. Camundongosexpostos a dose diárias repetidas de ovalbumina nebulizada semsensibilização prévia desenvolvem tolerância à ovalbumina e falham emelicitar inflamação eosinofílica das vias aéreas. A expressão pulmonar do GM-CSF via uma construção adenoviral altera as respostas destes animais efavorece o influxo de eosinófilos em BAL5 a geração de histologiafenotipicamente alérgica e hiperplasia de células de goblet associada. Estageração de uma resposta Th2 típica é evidenciada adicionalmente porconcentrações incrementadas, no soro e BAL, de IL-5 e IL-4 sérica. Trabalhoadicional neste modelo, usando um mouse MHC II KO indica que GM-CSFmodula a interação entre células apresentadoras de antígeno e células T nasvias aéreas, facilitando com isso a interação entre células apresentadoras deantígeno e células T nas vias aéreas, facilitando com isso respostas mediadascom células T nas vias aéreas, facilitando com isso respostas mediadas comcélulas T à ovalbumina [37]. É significativo observar que a atividade do GM-CSF como um ativador potente das respostas de Th2 também pode serdemonstrada em camundongos que não apresentam IL-13 e/ou IL-4,indicando que a neutralização da atividade de GM-CSF apresenta umaterapêutica alternativa para as vias aéreas distintas da atividade destascitocinas.

Realizou-se observações similares em outro modelo murinoem que a exposição intranasal repetida à erva-de-santiago resulta emsensibilização de tipo Th2 e inflamação branda das vias aéreas quando da re-exposição a antígeno [38]. A administração de anticorpos anti-GM-CSF emconjunto com produção diminuída de citocina associada com Th2 na erva-de-santiago, presumivelmente por meio de inibição de GM-CSF endógeno. Emcontraste, o fornecimento de erva-de-santiago a um ambiente de vias aéreasenriquecido com GM-CSF, seja por meio de co-administrações múltiplas deGM-CSF recombinante ou de um fornecimento simples de um vetoradenoviral portando o transgene de GM-CSF, resultou em inflamaçãoeosinofílica consideravelmente incrementada das vias aéreas e respostas dememória de Th2 específicas para erva-de-santiago.

Artrite reumatóide (RA)

A RA é uma doença inflamatória crônica e destrutiva dasjuntas que afeta aproximadamente 1% da população no mundoindustrializado. A RA é caracterizada por hiperplasia e inflamação damembrana sinovial, inflamação no fluido sinovial, e destruição progressiva dacartilagem e do osso circundante que leva comumente a incapacitaçãosignificativa.

Embora a causa da RA ainda permaneça desconhecida, háevidência acumulada do papel do GM-CSF na progressão da RA. Acredita-seque a RA é iniciada e impelida por um processo específico para antígeno,mediado com células T. Em resumo, considera-se que a presença de umantígeno não-identificado em um hospedeiro suscetível inicie uma resposta decélulas T que leva à produção de citocinas de células T com recrutamentoconseqüente de células inflamatórias, incluindo neutrófilos, macrófagos ecélulas B.

Muitas citocinas pró- e anti-inflamatórias são produzidas najunta reumatóide. Além disso, a progressão da doença, reativação esilenciamento são mediados por alterações dinâmicas na produção decitocinas na junta. Em particular, considera-se que TNF-α e IL-I exerçampapéis centrais na patogênese da RA e em muitas das terapias mais novasdesenvolvidas, ou no desenvolvimento, para que a doença pareça inibir aatividade destas duas citocinas pró-inflamatórias.

Estudos recentes em modelos de roedores sugeriram um papelcentral e não-redundante para o GM-CSF no desenvolvimento e progressão daRA. A administração de GM-CSF recombinante exógeno aumenta a patologiaem dois modelos de camundongo diferentes de artrite induzida com colágenode RA (CIA) [39] e em um modelo de artrite monoarticular [40].

Adicionalmente a isto demonstrou-se que camundongos com expressãoinibida de GM-CSF (GM-CSF"7") são resistentes ao desenvolvimento de CIAe que os níveis de IL-I e de fator de necrose de tumor (TNFa) encontrados nofluido de juntas sinovial foi reduzido em comparação com os camundongosde tipo selvagem [41,42]. De maneira análoga, a indução de monoartriteusando injeção intra-articular de albumina de soro bovino metilado e IL-I emcamundongos GM-CSF_/~ resulta em gravidade reduzida de doença, emcomparação com camundongos de tipo selvagem [43].

Adicionalmente, a administração de mAb anti-GM-CSFmurinos melhora significativamente a gravidade da doença em modelos deCIA e de artrite monoarticular. No modelo de CIA, tratamento com mAb foiefetivo no tratamento de progressão de doença estabelecida, histopatologia ediminuição significativa dos níveis de IL-I e TNF-α nas juntas.

Adicionalmente, tratamento com mAb antes do início da artrite diminuiu agravidade da doença de CIA [44,43].

Diversos estudos analisaram os níveis de citocinas e dereceptores presentes no fluido sinovial artrítico e em amostras de biópsia demembranas de tecido humano. Células mononucleares circulantes em 27pacientes de RA, 13 voluntários saudáveis e 14 pacientes com osteoporoseforam avaliadas quanto aos níveis de GM-CSFR por meio do uso de GM-CSFmarcado com PE [45]. Neste estudo demonstrou-se que foi possível detectarduas vezes a quantidade de células positivas para receptor em pacientes deRA (53%), em comparação com controles saudáveis (20%) e pacientes sendosubmetidos a investigação quanto a osteoporose (25%), sugerindo com issoque monócitos podem ser preparados para responderem a GM-CSF produzidolocalmente. A expressão de genes de citocina de pacientes de RA [46] usandohibridização in situ de células SF demonstrou níveis elevados de GM-CSF,IL-1, TNF-a e IL-6. Adicionalmente, sinoviócitos derivados de fibroblastosisolados e cultivados obtidos de voluntários normais demonstraram níveiselevados de proteínas de GM-CSF em resposta a IL-Ια, IL-Iβ, TNF-a e TNF-β [47]. A quantificação dos níveis séricos do GM-CSF em pacientes de RA[48] mostrou que níveis de proteína foram incrementados em pacientes de RAgrave (366 pg/ml, n=26) e moderada (376 pg/ml, n=58) em comparação como grupo de controle (174 pg/ml, n=43), e adicionalmente mostrou-se tambémque GM-CSF foi significativamente elevado no SF de pacientes com RA(1300 pg/ml).

Observou-se previamente que a administração de GM-CSFrecombinante em pacientes sendo tratados de neutropenia poderia causar umaexacerbação da RA [50]. Realizou-se observações similares para um pacientecom síndrome de Felty após tratamento com GM-CSF recombinante [50].

Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)

Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) é definida comoum estado de doença caracterizado por limitação do fluxo de ar que não étotalmente reversível. A limitação crônica de fluxo de ar é usualmente tantoprogressiva como também associada com uma resposta inflamatória anormaldos pulmões a partículas ou gases nocivos. Esta limitação de fluxo de ar écausada por uma mistura de doença das vias aéreas pequenas (bronquioliteobstrutiva) e destruição parenquimal (enfisema), sendo que as suascontribuições relativas variam de pessoa para pessoa. Os sintomascaracterísticos resultantes da doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) sãoa tosse, produção de esputo, e dispnéia ao exercício. A COPD é um problemade saúde pública e é a quarta causa principal de morbidez crônica e demortalidade nos E.U.A. A doença é tratada correntemente com drogasdesenvolvidas originalmente para a asma, como corticosteróides orais ouinalados, com ou sem broncodilatadores incluindo β agonistas. No entanto,nenhuma destas drogas mostrou diminuir a progressão da COPD [51]. Porexemplo, corticosteróides que suprimem marcantemente a inflamaçãoeosinofílica na asma não parecem exercer qualquer efeito sobre a inflamaçãoobservada na COPD que é mediada predominantemente por neutrófilos [52].Conseqüentemente, há uma necessidade de desenvolver novos tratamentospara COPD que objetivam especificamente os processos inflamatóriossubjacentes à patofisiologia desta doença. GM-CSF, através de seu papel nafunção de neutrófilos e macrófagos, pode desempenhar um papel importantena patogênese da COPD.

Em um estudo que usa PCR quantitativa, mostrou-se que, emesputo de COPD comparado com esputo de fumantes não-obstruídos, onúmero de cópias do GMCSF foi significativamente elevado [53].Adicionalmente, em um modelo de roedor de inflamação pulmonar induzidapor fumaça de cigarro, animais tratados intranasalmente com um anticorpopara GM-CSF 2 dias, 4 h e 1 h antes da exposição à fumaça demonstraramuma redução significativa dos níveis de neutrófilos, macrófagos e MMP-9 doBAL, quando comparado com o anticorpo de controle de isótipo 5 dias após aexposição [54]. Estes estudos também são corroborados por nossas própriasobservações em que se pesquisou níveis de GM-CSF em esputo induzido depacientes com uma gama de gravidades de COPD. Nestes estudos, nósmostramos que o GM-CSF foi elevado no esputo de aproximadamente 40%dos pacientes de COPD testados independentemente da gravidade da doença,com níveis de GMCSF aproximando-se de 500 pg/ml em alguns casos. OGMCSF não pareceu ser elevado em pacientes não fumantes e em pacientesde controle fumantes equiparados. Estes dados sugerem que o GM-CSF podeser um dos mediadores-chave na inflamação das vias aéreas induzida porfumaça, e na COPD.

Esclerose múltipla (MS)

O GM-CSF foi implicado na doença autoimune esclerosemúltipla. Mediante a administração de antígeno de glicoproteína deoligodendrócitos de mielina (MOG) a roedores, é possível induzir um modelode esclerose múltipla humana que demonstra muitos dos fenótipos da MS,como inflamação do sistema nervoso central e desmielinação que poderesultar em uma paralisia similar à da MS. Em camundongos sem GM-CSF aMOG foi incapaz de induzir o fenótipo EAE [55]. Adicionalmente, mostrou-se que estes camundongos apresentaram proliferação diminuída de células Trelativamente ao antígeno de MOG e uma produção diminuída das citocinasde Thl, IL-6 e IFN-γ. A administração de anticorpos neutralizadores de GM-CSF ao mesmo tempo como exposição de antígeno preveniu o início dadoença durante 10 dias após o tratamento com evidência de lesões reduzidas.Se administrados após o início da doença, camundongos recuperaram-secompletamente dentro de 20 dias do tratamento [55].Leucemia

O GM-CSF também foi implicado na leucemia mielóide,leucemia mielóide crônica juvenil (JCML). Esta condição é uma desordemmieloproliferativa que afeta primariamente pacientes com menos de 4 anos devida. Progenitores de macrófagos-granulócitos periféricos de JCML in vitro(CFU-GM) demonstram proliferação espontânea a baixas densidades decélulas, uma observação não previamente descrita para outras desordensmieloproliferativas. Adicionalmente, a depleção de monócitos destas culturasaboliu esta proliferação. Subseqüentemente, demonstrou-se que esta proliferaçãoespontânea é mediada via uma hipersensibilidade dos progenitores de JCML aoGM-CSF de citocina derivado de monócitos [56,57,58,59,60,61]. Ao invés deuma superprodução ou de níveis elevados de GM-CSF em pacientes deJCML, a hipersensibilidade dos progenitores de JCML parece ser através deuma via de transdução de sinal de Ras induzida com GM-CSF desregulado[62]. Estudos recentes com um análogo de GM-CSF (E21R), que antagoniza aação de GM-CSF tanto em estudos de ligação como em ensaios funcionais,mostrou que inibindo-se a ação de GM-CSF, é possível reduzirsignificativamente a carga de células de JCML em um modelo de enxertoexógeno de camundongo imunodeficiente/não obeso combinado gravediabético (SCID/NOD) de JCML [63]. A dosagem sistêmica profilática deE21R no momento do enxerto preveniu que progenitores de JCML seestabelecessem na medula óssea, e a dosagem de E21R 4 semanas após oenxerto induziu remissão de JCML, com uma redução da carga celular.Adicionalmente, a administração de E21R a camundongos SCID/NOD co-enxertados com medula óssea humana normal e medula óssea com JCMLcausou uma redução da carga de JCML, no entanto, células de medula ósseanormal permaneceram não-afetadas.

Aterosclerose

Doença do coração isquêmico é a causa mais comum de morteem todo o mundo. Ao longo dos anos mais recentes, fortaleceu-se o conceitode que a inflamação desempenha um papel significativo na patogênese daaterosclerose, com acúmulo de células inflamatórias ocorrendo par-e-passocom o acúmulo de lipídios nas paredes arteriais.

Uma vez residentes nas paredes arteriais, células inflamatórias,como monócitos e macrófagos, participam e perpetuam a respostainflamatória local. Estes macrófagos também expressam receptoresaglutinadores para uma gama de lipoproteínas e, assim, contribuem para a diferenciação de células em 'células espumosas'. É a morte destas 'célulasespumosas' que contribui para o desenvolvimento do núcleo lipídico, umacaracterística clássica destas lesões. Como a inflamação continua no interioresdestas placas ateroscleróticas, estas células inflamatórias ativadas liberammediadores fibrogênicos e fatores de crescimento que promovem proliferaçãode células musculares lisas (SMC) e fibrose da placa. Além de promoveremfibrose, estas células também liberam enzimas proteolíticas, Metaloproteinasesde matriz (MMPs), que contribuem para um enfraquecimento da placafibrótica tornando-as, desta forma, propensas a rompimento. Uma vezrompidas, estas placas liberam fragmentos celulares e fatores de coagulação,como fator de tecido, no vaso, estimulando a cascata de coagulação e odesenvolvimento de trombos. A trombose arterial resultante pode levar, então,a isquemia miocárdica ou a infarto.

Recentemente o GM-CSF foi implicado em muitos aspectos daprogressão de doença na aterosclerose. Em lesões ateroscleróticas de coelhosalimentados com colesterol, verificou-se que o GM-CSF encontra-se co-localizado com macrófagos e, em menor grau, com células endoteliais ecélulas musculares lisas (SMC) [64]. Adicionalmente, mostrou-se tambémque a expressão de GM-CSF é aumentada em vasos ateroscleróticos humanosnos sítios de acúmulo de macrófagos e em SMCs mediais e células endoteliais[65]. Este aumento dos níveis de GM-CSF é atribuído, em parte, ao contatodireto célula-a-célula de monócitos/macrófagos e células endoteliais durantea formação e patogênese da lesão aterosclerótica [66]. Outro elemento-chavena lesão aterótica é a 'célula espumosa', ou seja, macrófagos que absorveramlipoproteínas de baixa densidade (LDL) oxidadas via receptores deaglutinadores sobre a superfície. In vitro, esta absorção de Ox-LDL podeestimular ainda mais macrófagos a proliferarem via um mecanismodependente de GM-CSF [67].

Como a aterosclerose é um processo inflamatório crônico,investigou-se agentes antiinflamatórios, como glucocorticóides.Dexametasona, um glucocorticóide antiinflamatório, suprime odesenvolvimento da aterosclerose em vários modelos animais experimentais[68,69,70,71]. A eficácia do que foi atribuído à inibição da migração de SMC[72] e proliferação [73], e redução da quimiotaxia de monócitos e leucócitoscirculantes [74]. Estudos recentes mostram que ox-LDL pode induzirliberação de GM-CSF de macrófagos peritoneais de camundongo [75].Adicionalmente, após tratamento com dexametasona esta liberação de GM-CSF foi inibida de uma forma dependente da dose, sugerindo que os efeitosantiinflamatórios da dexametasona são mediados pela inibição da produção deGM-CSF induzida com ox-LDL. Como parece que o GM-CSF possui umpapel central na aterosclerose, uma alternativa aos glucocorticóides poderiaser a inibição da atividade de GM-CSF nesta indicação.

Terminologia

"E/ou" onde usado aqui deve ser considerado como revelaçãoespecífica de cada uma das duas características ou componentes especificadoscom ou sem o outro. Por exemplo, "A e/ou B" deve ser considerado como umarevelação específica de cada um de (i) A, (ii) B e (iii) A e B, como se cada umfosse indicado individualmente aqui.

GM-CSFRa e GM-CSF

GM-CSFRa é a cadeia alfa do receptor para fator estimuladorde colônias de granulócitos macrófagos. A seqüência de comprimento plenodo GM-CSFRa humano é depositado sob o número de acesso S06945(gi: 106355) [76] e indicada aqui como na SEQ ID NO: 202. A forma madurado GM-CSFRa humano, i.e. com o peptídeo-sinal clivado, é indicada aquicomo SEQ ID NO: 206. Exceto se indicado de outra forma no contexto,referências aqui a GM-CSFRa referem-se a GM-CSFRa de primatashumanos ou não-humanos (p. ex., [macacos] cynomolgus), normalmentehumano. GM-CSFRa pode ser GM-CSFRa naturalmente ocorrente ou GM-CSFRa recombinante.

O domínio extracelular de 298 aminoácidos do receptor deGM-CSF humano α possui uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 205.

Exceto se indicado de outra forma no contexto, referênciasaqui a GM-CSF referem-se a GM-CSF de primatas humanos ou não-humanos(p. ex. cynomolgus), normalmente humano.

GM-CSF liga-se normalmente ao domínio extracelular (SEQID NO: 205) da cadeia α do receptor de GM-CSF maduro (SEQ ID NO: 206).Como descrito alhures aqui, esta ligação é inibida por elementos de ligaçãoda invenção.Variantes de recomposição naturalmente ocorrentes do GM-CSFRa foram identificadas - ver, por exemplo, refs. [77 e 78]. O domínioextracelular é altamente conservado nestas variantes de recomposição.Elementos de ligação da invenção podem ou não ligar-se a uma ou maisvariantes de recomposição do GM-CSFRa, e podem ou não inibir a ligaçãode GM-CSF a uma ou mais variantes de recomposição do GM-CSFRa.Elemento de ligação

Isto descreve um elemento de um par de moléculas que seligam uma à outra. Os elementos de um par de ligação podem ser derivadosnaturalmente ou produzidos totalmente ou parcialmente por via sintética. Ummembro do par de moléculas apresenta uma área sobre sua superfície, ou umacavidade, que se liga, e que, portanto, é complementar a uma organizaçãoespacial e polar particular do outro membro do par de moléculas. Exemplosde tipos de pares de ligação são antígeno-anticorpo, biotina-avidina,hormônio-receptor de hormônio, receptor-ligante, enzima-substrato. Apresente invenção refere-se a reações de tipo antígeno-anticorpo.

Um elemento de ligação compreende normalmente umamolécula apresentando um sítio de ligação de antígeno. Por exemplo, umelemento de ligação pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteínanão-anticorpo que compreende um sítio de ligação de antígeno. Um sítio deligação de antígeno pode ser proporcionado por meio de arranjo de CDRssobre suportes de proteína não-anticorpo, como fibronectina ou citocromo Betc. [80,81,82], ou por meio de randomização ou mutação de radicais deaminoácidos de uma alça dentro de uma estrutura de suporte de proteína paraconferir ligação a um alvo desejado. Estruturas de suporte para amanipulação de sítios de ligação inéditos em proteínas foram revistosdetalhadamente [82]. Estruturas de suporte de proteínas para emuladores deanticorpo encontram-se divulgadas no W0/0034784 em que os inventoresdescrevem proteínas (emuladores de anticorpo) que incluem um domínio defibronectina de tipo ΠΙ apresentando pelo menos uma alça randomizada. Umaestrutura de suporte vantajosa sobre a qual enxertar uma ou mais CDRs, p. ex.um conjunto de HCDRs, pode ser proporcionada por qualquer elemento dedomínio da superfamília de genes de imunoglobulina. A estrutura de suportepode ser uma proteína humana ou não-humana.

Uma vantagem de uma estrutura de suporte de proteína não-anticorpo é que ela pode proporcionar um sítio de ligação de antígeno emuma molécula de estrutura de suporte que é menor e/ou mais fácil de fabricardo que pelo menos algumas moléculas de anticorpos. O pequeno tamanho deum elemento de ligação pode conferir propriedades fisiológicas úteis, comouma capacidade de entrar em células, penetrar profundamente em tecidos ouatingir alvos em outras estruturas, ou de ligar-se em cavidades de proteína doantígeno-alvo.

O uso de sítios de ligação de antígeno em estruturas desuporte de proteína não-anticorpo é revista na ref. [79]. São típicas asproteínas apresentando uma espinha dorsal estável e uma ou mais alçasvariáveis, em que a seqüência de aminoácidos da alça ou alças é mutadaespecificamente ou randomicamente para criar um sítio de ligação deantígeno apresentando, para ligação ao antígeno-alvo. Referidas proteínasincluem os domínios de ligação de IgG de proteína A de S. aureus,transferrina, tetranectina, fibronectina (p. ex., domínio de tipo III da 10afibronectina) e lipocalinas. Outras abordagens incluem "microcorpos"sintéticos (Selecore GmbH), que se baseiam em ciclotídeos - pequenasproteínas apresentando ligações dissulfeto intramoleculares.

Adicionalmente a seqüências de anticorpos e/ou um sítio deligação de antígeno, um elemento de ligação de acordo com a presenteinvenção pode compreender outros aminoácidos, p. ex. formando um peptídeoou polipeptídeo, como um domínio dobrado, ou para conferir à moléculaoutra característica funcional adicionalmente à capacidade de ligar-se aantígeno. Elementos de ligação da invenção podem portar um marcadordetectável, ou podem ser conjugados a uma toxina ou a uma enzima ou porçãode objetivação (p. ex. via uma ligação peptidila ou ligante). Por exemplo, umelemento de ligação pode compreender um sítio catalítico (p. ex. em umdomínio de enzima) e também como um sítio de ligação de antígeno, sendoque o sítio de ligação de antígeno liga-se ao antígeno e, assim, objetiva o sítiocatalítico ao antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica doantígeno, p. ex. por meio de clivagem.

No entanto, como indicado, CDRs podem ser portadas porestruturas de suporte, como fibronectina ou citocromo B [80,81,82], aestrutura para portar uma CDR ou um conjunto de CDRs da invenção serágeralmente de uma seqüência de anticorpo de cadeia pesada ou leve ou porçãosubstancial da mesma em que a CDR ou conjunto de CDRs encontra-selocalizado em um local correspondente à CDR ou conjunto de CDRs dedomínios variáveis VH e VL de anticorpos naturalmente ocorrentescodificados por genes de imunoglobulina rearranjados. As estruturas elocalizações de domínios variáveis de imunoglobulina podem serdeterminadas fazendo-se referência a Kabat, et al., 1987 [98], e suasatualizações, agora disponíveis na Internet (http://immuno.bme.nwu.edu ouprocurar "Kabat" usando qualquer mecanismo de busca).

Elementos de ligação da presente invenção podemcompreender regiões constantes de anticorpos ou partes dos mesmo, depreferência, regiões constantes de anticorpos humanos ou partes dos mesmo.

Por exemplo, um domínio VL pode ser ligado a sua ponta C aos domíniosconstantes de cadeia leve de anticorpo incluindo cadeias Ck ou Ολ humanas,de preferência, cadeias Ck. De maneira análoga, um elemento de ligaçãobaseado em um domínio VH pode ser ligado a sua ponta C-terminal a toda ouparte (p. ex. um domínio CHI) de uma cadeia pesada de imunoglobulinaderivada de qualquer isótipo de anticorpo, p. ex., IgG, IgA, IgE e IgM equalquer uma das subclasses de isótipos, particularmente IgGl, IgG2 e IgG4.IgGl, IgG2 ou IgG4 é preferida. IgG4 é preferida porque não se liga acomplemento e não cria funções efetoras. Qualquer variante sintética ouvariante de região constante que possui estas propriedades e estabiliza regiõesvariáveis também é preferida para uso em concretizações da presenteinvenção.

Elementos de ligação da invenção podem ser marcados comum marcador detectável ou funcional. Marcadores detectáveis incluem rádio-marcadores, como 131I ou 99Tc, que podem ser ligados a anticorpos dainvenção usando-se química convencional conhecida na arte da visualizaçãode anticorpos. Marcadores também incluem marcadores de enzimas, comoperoxidase de rabanete, marcadores incluem adicionalmente porçõesquímicas, como biotina, que podem ser detectadas via ligação a uma pormeio de detectável cognata específica, p. ex. avidina marcada. Assim, umelemento de ligação ou molécula de anticorpo da presente invenção pode serem forma de um conjugado compreendendo o elemento de ligação e ummarcador, opcionalmente conjugado via um ligante, como um peptídeo. Oelemento de ligação pode ser conjugado, por exemplo, a enzimas (p. ex.peroxidase, fosfatase alcalina) ou um marcador fluorescente incluindo,embora sem limitação, biotina, fluorocromo, proteína fluorescente verde.

Adicionalmente, o marcador pode compreender uma porção de toxina, comouma porção de toxina selecionada do grupo que consiste de exotoxinade Pseudomonas (PE ou um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo),toxina de Difteria (um fragmento citotóxico ou mutante do mesmo), umatoxina de botulinum de A até F, ricina ou um fragmento citotóxico da mesma,abrina ou um fragmento citotóxico da mesma, saporina ou um fragmentocitotóxico da mesma, toxina antiviral da Phytolacca americana ou umfragmento citotóxico da mesma e briodina 1 ou um fragmento citotóxico damesma. Onde o elemento de ligação compreende uma molécula de anticorpo,o elemento de ligação marcado pode ser referido como um imunoconjugado.Molécula de anticorpo

Descreve-se aqui uma imunoglobulina, quer seja natural, ouproduzida parcialmente ou totalmente por via sintética. O termo tambémcompreende qualquer polipeptídeo ou proteína compreendendo um sítio deligação de antígeno de anticorpo. Fragmentos de anticorpos que compreendemum sítio de ligação de antígeno de anticorpo são moléculas, como Fab,F(ab')2>Fab', Fab'-SH, scFv, Fv, dAb, Fd; e diacorpos.

É possível preparar anticorpos monoclonais e outrosanticorpos, e usar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produziroutros anticorpos ou moléculas quiméricas que conservam a especificidade doanticorpo original. Referidas técnicas podem envolver introduzir DNA quecodifica a região variável de imunoglobulina, ou as CDRs, de um anticorpo nasregiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de umaimunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, a EP-A-184187, GB 2188638Aou EP-A-239400, e um grande corpo de literatura subseqüente. Um hibridomaou outra célula produtora de um anticorpo pode ser sujeita a mutação genéticaou outras alterações, que podem ou não alterar a ligação-a-alvo dosanticorpos produzidos.

Como anticorpos podem ser modificados de diversas maneiras,o termo "molécula de anticorpo" deveria interpretado como abrangendoqualquer elemento de ligação ou substância apresentando um sítio de ligaçãode antígeno de anticorpo. Assim, este termo abrange fragmentos de anticorpose derivados, incluindo qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio deligação de antígeno de anticorpo, quer natural, ou totalmente ou parcialmentesintético. Inclui-se, portanto, moléculas quiméricas compreendendo um sítiode ligação de antígeno de anticorpo, ou equivalente, fundidas a outropolipeptídeo. A clonagem e expressão de anticorpos quiméricas são descritasna EP-A-0120694 e EP-A-0125023, e um grande corpo de literaturasubseqüente.

Técnicas adicionais disponíveis na arte da manipulação deanticorpos tornaram possível isolar anticorpos humanos e humanizados.Anticorpos humanos e humanizados são concretizações preferidas dainvenção, e podem ser produzidos usando-se qualquer método vantajoso. Porexemplo, é possível preparar hibridomas humanos [83]. Apresentação de fago,outra técnica estabelecida para gerar elementos de ligação foi descritadetalhadamente em muitas publicações, como ref. [83] e W092/01047(discutido adicionalmente abaixo). Camundongos transgênicos em que osgenes de anticorpo de camundongo são inativados e substituídosfuncionalmente por genes de anticorpos humanos, enquanto deixa intactosoutros componentes do sistema imunológico de camundongo, podem serusados para isolar anticorpos humanos [84]. Anticorpos humanizados podemser produzidos usando-se técnicas conhecidas na arte, como aquelasdivulgadas, por exemplo, nos W091/09967, US 5,585,089, EP592106, US565,332 e W093/17105. Adicionalmente, W02004/006955 descreve métodospara humanizar anticorpos, com base na seleção de seqüências de estrutura deregião variável de genes de anticorpo humano por meio de comparação de tiposde estruturas de CDR canônicas para seqüências de CDR da região variável deum anticorpo não-humano, com tipos de estrutura de CDR canônicas paraCDRs correspondentes de uma biblioteca de seqüências de anticorposhumanos, p. ex. segmentos de genes de anticorpos de linhagem germinal.Regiões variáveis de anticorpos humanos apresentando tipos de estrutura deCDR canônica similares às CDRs não-humanas formam um subconjunto deseqüências-membro de anticorpos humanos das quais se seleciona seqüênciasde estrutura humana. Os elementos de subconjunto podem ser classificadosadicionalmente por meio de similaridade de aminoácidos entre as seqüênciasde CDR humana e não-humana. No método do W02004/006955, seqüênciashumanas de classificação superior são selecionadas de forma a proporcionaras seqüências de estrutura para construir um anticorpo quimérico quesubstitui funcionalmente seqüências de CDR humanas pelas contra-partes de CDR não-humanas usando-se as estruturas humanas de elementode subconjunto selecionadas, proporcionando com isso um anticorpohumanizado com alta afinidade e baixa imunogenicidade sem a necessidadede comparar seqüências de estrutura entre os anticorpos não-humanos ehumanos. Divulga-se também anticorpos quiméricos preparados de acordocom o método.

Moléculas de anticorpos sintéticas podem ser criadas por meiode expressão de genes gerados por meio de oligonucleotídeos sintetizados emontados dentro de vetores de expressão vantajosos [85, 86].

Mostrou-se que fragmentos de um anticorpo inteiro podemrealizar a função de antígenos de ligação. Exemplos de fragmentos deligação são (i) o fragmento Fab que consiste de domínios VL, VH, CL e CHI;(ii) o fragmento Fd que consiste dos domínios VH e CHI; (iii) o fragmento Fvque consiste dos domínios VL e VH de um anticorpo simples; (iv) o fragmentodAb [87,88,89] que consiste de um domínio VH ou um domínio VL; (v)regiões de CDR isoladas; (vi) fragmentos F(ab')2, um fragmento divalentecompreendendo dois fragmentos Fab ligados[;] (vii) moléculas de Fv decadeia simples (scFv), sendo que um domínio VH e um domínio VL sãoligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios seassociem para formar um sítio de ligação de antígeno [90,91]; (viii) dímerosde Fv de cadeia simples biespecíficos (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos",fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por meio de fusãode gene (W094/13804; [92]). Fv, scFv ou moléculas de diacorpos podem serestabelecidas pela incorporação de pontes dissulfeto que ligam os domíniosVH e VL [93]. Também é possível preparar minicorpos compreendendo umscFv conjugado a um domínio CH3 [94].

Um dAb (anticorpo de domínio) é um fragmento deimunoglobulina de antígeno monomérico pequeno de um anticorpo,nominalmente a região variável de uma cadeia pesada ou célula de anticorpo[89]. dAbs de VH ocorrem naturalmente em camelídeos (p. ex., camelo,lhama) e pode ser produzido imunizando-se um camelídeo com um antígeno-alvo, isolando-se células B específicas para antígeno, e clonando diretamentegenes de dAb das células B individuais. dAbs também podem ser produzidosem cultura de células. Seu pequeno tamanho, boa solubilidade e estabilidade àtemperatura torna-os particularmente úteis fisiologicamente e vantajosos paraseleção e maturação por afinidade. Um elemento de ligação da presenteinvenção pode ser um dAb compreendendo um domínio VH ou domínio VLsubstancialmente como indicado aqui, ou um domínio VH ou domínio VLcompreendendo um conjunto de CDRs substancialmente còmo indicado aqui.Por "substancialmente como indicado" compreende-se que o domínio VH oudomínio VL de CDR da invenção será idêntico ou muito similar às regiõesespecificadas cuja seqüência é indicada aqui. Por "muito similar"compreende-se que, é possível realizar de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, comode 1 a 3 ou 1 ou 2, ou 3 ou 4, substituições de aminoácidos na CDR e/oudomínio VH ou VL.

Onde se pretende usar anticorpos biespecíficos, estes podemser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados dediversas maneiras [95], p. ex., preparados quimicamente ou de hibridomashíbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpos biespecíficosdescritos acima. Exemplos de anticorpos biespecíficos incluem aqueles datecnologia BiTE™ em que os domínios de ligação de dois anticorpos comuma especificidade diferente podem ser usados e ligados diretamente viapeptídeos flexíveis curtos. Isto combina dois anticorpos em uma cadeia depolipeptídeo simples curta. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem umaregião Fc, usando-se apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente osefeitos de reação anti-idiotípica.Diacorpos biespecíficos, em oposição a anticorpos inteirosbiespecíficos, também podem ser particularmente úteis porque podem serfacilmente construídos e expressos em E.coli. Diacorpos (e muitos outrospolipeptídeos, como fragmentos de anticorpos) com especificidades de ligaçãoespecíficas podem ser selecionados facilmente usando-se apresentação defago (W094/13804) de bibliotecas. Se um braço do diacorpo tiver que sermantido constante, por exemplo, dirigido contra GM-CSFRa, então é possívelpreparar uma biblioteca em que o outro braço é variado, e um anticorpo deligação-alvo apropriado selecionado. Anticorpos inteiros biespecíficos podemser preparados por meio de manipulação de tipo botões-em-furos [96].Sítio de ligação de antígeno

Descreve-se aqui a parte de uma molécula que se liga a, e queé complementar a todo ou parte do antígeno-alvo. Em uma molécula deanticorpo, isto é referido como o sítio de ligação de antígeno de anticorpo, ecompreende a parte do anticorpo que se liga a, e que é complementar a todoou a parte do antígeno-alvo. Onde um antígeno é grande, um anticorpo sópode ser ligado a uma parte particular do antígeno, sendo que referida parte édenominada um epitopo. Um sítio de ligação de antígeno de anticorpo podeser proporcionado por um ou mais domínios variáveis de anticorpo. Depreferência, um sítio de ligação de antígeno de anticorpo compreende umaregião variável de cadeia leve (VL) de anticorpo e uma região variável decadeia pesada (VH) de anticorpo.Numeração de Kabat

Radicais de seqüências de anticorpo aqui são referidosgeralmente usando-se numeração Kabat como definido em Kabat et al., 1971[97]. Ver também refs. [98,99].Isolado

Refere-se aqui ao estado em que elementos de ligação dainvenção, ou ácido nucleico que codifica referidos elementos de ligação,geralmente estará de acordo com a presente invenção. Elementos isolados eácido nucleico isolado serão livres ou substancialmente livres de material como qual eles se encontram naturalmente associados, como outros polipeptídeosou ácidos nucleicos com os quais eles são encontrados em seu ambientenatural, ou o ambiente em que eles são preparados (p. ex., cultura de células)quando referida preparação é por meio de tecnologia de DNA recombinantepraticada in vitro ou in vivo. Elementos e ácido nucleico podem serformulados com diluentes ou adjuvantes e, ainda, para fins práticos, podemser isolados - por exemplo, os elementos serão normalmente misturados comgelatina ou outros veículos se usado para revestir placas de microtitulaçãopara uso em ensaios imunológicos, ou serão misturados com diluentes ouveículos farmaceuticamente aceitáveis quando usados no diagnóstico ou naterapia. Elementos de ligação podem ser glicosilados, quer naturalmente oupor meio de sistemas de células eucarióticas heterólogas (p. ex.. células CHOou NSO (ECACC 85110503)), ou eles podem permanecer não-glicosilados(por exemplo, se produzidos por meio de expressão em uma célulaprocariótica).

Breve descrição dos desenhos

Figura 1. Análise de pA2 de dois anticorpos anti-GM-CSFRano ensaio de proliferação de TF-1. A proliferação de células TF-I foiinduzida com concentrações crescentes de GM-CSF na presença deconcentrações crescentes de duas IgG4 otimizadas, Anticorpo 6 (Figura IA) eAnticorpo 1 (Figura 1B), respectivamente. Para dados mostrados no gráficoIA e no gráfico 1B, mediu-se a incorporação de timidina tritiada, e calculou-se a EC50 de GM-CSF em cada concentração de anticorpo. Para dadosmostrados no gráfico ICe gráfico 1D, calculou-se então as relações de dosese analisou-se por meio de regressão de Schild para se obter valores de pA2.

Figura 2. Análise de pA2 de um anticorpo anti-GM-CSFRa,Anticorpo 6, nos ensaios de alteração de forma de granulócitos. Granulócitoshumanos (gráfico 2A e 2C) ou de cynomolgus (2B e 2D) foram tratados comconcentrações crescentes de GM-CSF na presença de concentraçõescrescentes de IgG4. A alteração de forma dos granulócitos foi medida usando-se citometria de fluxo, e calculou-se a EC50 do GM-CSF em cadaconcentração de anticorpo (gráfico 2A e gráfico 2B). Em seguida, as relaçõesde dose foram calculadas e analisadas por meio de regressão de Schild para seobter valores de pA2 (gráfico 2C e gráfico 2D).

Figura 3. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos 1e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a proliferação de células TF-I induzida por 7pM de GM-CSF humano. Mostra-se tambémdados para controle positivo IgG4 2B7 e para um isótipo de controle IgG4.Dados representam a média com barras de desvio padrão de determinaçõesem triplicata no mesmo experimento.

Figura 4. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a alteração deforma de granulócitos humanos induzida por 7pM de GM-CSF humano.Mostra-se também dados para o controle de IgG4 2B7 e para um isótipo decontrole IgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão dedeterminações em triplicata no mesmo experimento.

Figura 5. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a liberação deTNFa de monócitos humanos estimulada com 1 nM de GM-CSF humano.Mostra-se também dados para anticorpo de controle 2B7 e para um controlede isótipo IgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão dedeterminações em triplicata no mesmo experimento.

Figura 6. Potência antagonista de dois anticorpos, Anticorpos1 e 6, respectivamente, como IgG4s em um ensaio que mede a sobrevida degranulócitos humanos induzida por 7pM de GM-CSF humano. Mostra-setambém dados para o anticorpo de controle 2B7 e para um isótipo de controleIgG4. Dados representam a média com barras de desvio padrão dedeterminações em triplicata no mesmo experimento.

Figura 7. mAbs humanos maturados por afinidade Anticorpo 1e Anticorpo 6, mas não o mAb humano parental 28G5 (Anticorpo 3) ou oanticorpo murino conhecido 2B7, inibem diferenciação impelida por GM-CSF de progenitores hemopoiéticos humanos. 5x104 Células mononuclearesdescongeladas de uma amostra de aferese foram cultivadas em agar semi-sólido na presença de 10 ng/ml de GM-CSF e na concentração indicada demAb. Colônias foram contadas no dia 14. Gráfico mostra número de colôniascontra a concentração de mAb em μg/ml.

Figura 8. Análise dose-resposta da eficácia de mAb maturadopor afinidade em camundongos quiméricos Tg huGM-CSFR. Grupos de 5camundongos quiméricos Tg foram tratados com 500 ng de huGM-CSF (ouPBS) s.c. duas vezes ao dia durante 4 dias (D.1-D.4) e controle (CAT001) oumAb de teste (Anticorpo 6) nas concentrações indicadas no D.0. Pesos dosbaços foram avaliados no D.5.

Figura 9. Análise dose-resposta da eficácia do Anticorpo 6 emum ensaio de liberação de citocinas endógenas de células mononucleares desangue periférico humano. IxlO6 Células foram cultivadas durante 72 h. napresença e ausência de anticorpo e realizou-se um ELISA de IL-6 e TNFa nossobrenadantes. Dados representam a inibição média com barras de desviopadrão de determinações em duplicata no mesmo experimento.Parte Experimental

Fundamento

Fragmentos de anticorpos humanos podem ser selecionados invitro a partir de repertórios apresentados sobre a superfície de bacteriófagofilamentoso. Este processo é conhecido como apresentação de fago eproporciona um meio de derivar fragmentos de anticorpos humanos. Oprocesso pode ser usado para isolar especificidades anti-humanas humanas epode ser ajustado para derivar anticorpos com características de afinidadeparticulares.

Fragmentos de anticorpos consistindo apenas dos domíniosvariáveis de cadeia pesada (VH) e variáveis de cadeia leve (VL) conjugadospor um ligante de peptídeo curto contêm toda a informação que é necessáriapara se determinar a ligação de antígeno. Referidos fragmentos sãoconhecidos como Fv de cadeia simples (scFv). Mostrou-se que quandoapresentados na superfície do fago, scFv dobram-se corretamente e ligam-seao antígeno. Repertórios grandes de scFv foram construídos desta maneira, eproporcionaram uma fonte da qual é possível isolar clones individuais para odesenvolvimento de candidatos a droga. ScFv candidatos são entãoformatados como moléculas de IgG integral (tipicamente IgG humana) paraaplicações terapêuticas.Sumário

Realizou-se seleções em uma biblioteca de apresentação defago de scFv derivada de linfócitos de baço humanos para enriquecerpopulações de fagos que se ligam a GM-CSFRa humano. Nós isolamosanticorpos scFv apresentando características selecionadas e convertemos estesscFv em IgG4. Usando-se uma variedade de ensaios, um painel de anticorposfoi isolado, otimizado e foi submetido a terapia de linhagem germinal paraproduzir IgG4 com especificação apropriada para um anticorpo terapêutico.

Clones de anticorpo, cujas seqüências são mostradas comoanticorpos 1, 2 e de 4 a 20 na listagem de seqüências, foram derivados de umanticorpo parental. O parental é mostrado como anticorpo 3 na listagem deseqüências, e também é referido aqui como 28G5. Os 19 clones foramselecionados de acordo com o fato de mostrarem propriedades particularmenteboas numa faixa de ensaios biológicos, como descrito na Parte Experimental,e foram designados com números de anticorpos 1, 2 e de 4 a 20.

Os bioensaios foram designados de forma a refletirem anatureza inflamatória de doenças, como artrite reumatóide. Por exemplo, aalteração de forma de neutrófilos necessária para o seu recrutamento ao sítiode ação, a liberação de fatores pró-inflamatórios por monócitos e a sobrevidaincrementada de tipos de células inflamatórias em resposta a sinaisparticulares. Os anticorpos apresentam potente atividade de neutralizaçãonestes ensaios.

Protocolos detalhados dos métodos de ensaio usados sãoapresentados abaixo na seção intitulada "Materiais e métodos de ensaio".Isolamento de anticorpos Iead

Usou-se uma grande biblioteca de anticorpos humanos de FVde cadeia simples (scFv) para seleções. Isto foi derivado dos linfócitos debaço de 20 doadores saudáveis, e clonado em um vetor de fagomídeo. ScFvsque reconheceram GM-CSFRa foram isolados da biblioteca de apresentaçãode fago numa série de ciclos de seleção repetidos em GMCSF-Ra purificadoderivado da superexpressão de um domínio extracelular, solúvel, marcadocom purificação do receptor em células HEK293T. Isto foi obtidosubstancialmente como descrito por Vaughan et al [102]. De maneiraresumida, após exposição do receptor biotinilado à biblioteca de fagos, aproteína com fago ligado foi capturada em pérolas magnéticas revestidas comestreptavidina. Fagos não ligados foram removidos por lavagem. Fagosligados foram então resgatados como descrito por Vaughan et al e repetiu-seo processo de seleção. Realizou-se três ciclos de seleção em concentraçõescada vez menores de antígenos. Uma proporção representativa de scFvs dooutput de ciclos de seleção foi submetida a seqüenciamento de DNA.

Após estas seleções iniciais da biblioteca de apresentação defago, identificou-se um painel de scFv único em um ensaio de ligação deligante, que foi projetado para se identificar anticorpos scFv expressando fagoque foram capazes de inibir a ligação de GM-CSF a domínio extracelular deGM-CSFRa purificado. A potência de neutralização destes scFv no ensaio deligação de ligante compreende de 0,65 a 3,3 nM.

Anticorpos que foram ativos no ensaio bioquímico de ligaçãode ligante foram avaliados quanto à atividade biológica em um ensaio deproliferação de TF-1, que mediu a potência de neutralização por meio daavaliação da capacidade dos anticorpos de inibirem a proliferação de célulasTF-I estimuladas com GM-CSF. TF-I é uma linhagem de células pré-mielóides humana estabelecida de um paciente com eritroleucemia. Estalinhagem de células é dependente-de-fator para a sobrevida e a proliferação, eé mantida rotineiramente no GM-CSF humano. A inibição da proliferaçãodependente de GM-CSF foi determinada medindo-se a redução daincorporação de timidina tritiada no DNA recentemente sintetizado de célulasque se dividem. Todos os scFv apresentaram potência mensurável nesteensaio, com valores de IC50 abrangendo de cerca de 180 a 1200 nM.

Os clones de scFv mais potentes foram reformatados comomoléculas de anticorpos IgG4 humanas com um domínio constante de cadeiapesada gama 4 humana e um domínio constante de cadeia leve lambdahumana. Construiu-se vetores para os clones de scFv mais potentes parapermitir a expressão dos anticorpos como anticorpo IgG4 integral comodescrito por Persic et al. [100] com algumas poucas modificações. Incluiu-seum fragmento oriP nos vetores para facilitar o uso com as células HEK-EBNA293 e para permitir replicação epissômica. O domínio variável VH foiclonado no poli-ligante entre a seqüência líder de secreção e o domínioconstante gama 4 humano do vetor de expressão pEU8.1(+). O domíniovariável VL foi clonado no poli-ligante entre a seqüência líder de secreção e odomínio constante lambda humano do vetor de expressão pEU4.1(-). CélulasHEK-EBNA 293 foram co-transfectadas com as construções expressandocadeia pesada e cadeia leve, e anticorpo integral foi purificado do meiocondicionado usando-se cromatografia de afinidade de proteína A. Aspreparações de anticorpo purificadas foram filtradas de forma estéril earmazenadas a 4°C em solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes daavaliação. A concentração de proteína foi determinada medindo-se aabsorbância a 280 nm usando-se o método BCA (Pierce).

A IgG re-formatada foi comparada com o anticorpo murinoconhecido 2B7 no ensaio de proliferação de TF-1. As IgG4s conservaram ouincrementaram atividade neste ensaio, com valores de IC50 compreendendode 6 a cerca de 1600 nM.

Na doença inflamatória, a alteração de forma de neutrófilos énecessária para seu recrutamento no sítio de ação. Projetou-se um ensaio dealteração de forma de granulócitos humanos para emular esta respostabiológica usando-se separação de células ativada com fluorescência (FACS)para medir a alteração da forma dos granulócitos isolados do sangue após suaexposição a GM-CSF. Avaliou-se a capacidade de anticorpos IgG4 anti-GM-CSFRa em inibir a resposta de alteração de forma de neutrófilos15 relativamente ao GM-CSF, e valores de IC50 de clones selecionadoscompreenderam de cerca de 15 a 350 nM. Um anticorpo 28G5 representativoneutralizou GMCSF-R de cynomolgus no ensaio de alteração de forma degranulócitos de cynomologus com um IC50 de cerca de 5 nM. O anticorpomurino conhecido 2B7 também foi capaz de neutralizar a resposta biológica20 resultante de ligação de GM-CSF com o receptor de cynomolgus.

Em seguida, mediu-se a afinidade de ligação a receptor dosanticorpos usando BIAcore, com valores de Kd calculados compreendendo de32 a 377 nM.Otimização

25 Em um esforço para aperfeiçoar a potência de 28G5 iniciou-se

um programa de otimização. Produziu-se bibliotecas de anticorpos em que serealizou a mutagênese randômica das CDR3s de Vh ou Vl. Cada CDR3 foirandomizada em dois blocos de 6 aminoácidos para recuperar toda a CDR5produzindo bibliotecas Hl (bloco N-terminal de VH de CDR3 de 6 aa), H2(bloco C-terminal de VH de CDR3 de 6 aa), Ll (bloco N-terminal de VL deCDR3 de 6 aa) e L2 (bloco C-terminal de VL de CDR3 de 6 aa). Asbibliotecas resultantes foram submetidas a ciclos de seleção repetida paraligação ao GM-CSFRa humano. Clones isolados deste processo de seleçãoforam usados então para construir uma biblioteca de fago combinada quecontinha scFv tanto com CDR3s de cadeia pesada mutadas e CDR3s decadeia leve mutadas. Estas bibliotecas também foram submetidas ao mesmoprocedimento de seleção.

Em cada estágio do processo de otimização, scFv que foramcapazes de inibir a ligação de IgG4 de 28G5 ao receptor de GM-CSF foramidentificados usando-se um ensaio de competição por epitopo com 28G5 e oreceptores, e foram então analisados no ensaio de proliferação de TF-1, comodescrito abaixo.

Após mutagênese randômica de seqüências CDR3 de cadeiaesada de 28G5, identificou-se um conjunto de scFv com potência deneutralização mensurável no ensaio de TF-1. A maior parte dosmelhoramentos de potência foi obtida quando a ponta 3' da VH de CDR3 foirandomizada.

Após mutagênese randômica de seqüências de CDR3 decadeia leve de 28G5 identificou-se um conjunto de scFv com potência deneutralização mensurável no ensaio de TF-1. Todos os melhoramentos depotência foram obtidos quando a ponta 3' da VL de CDR3 foi randomizada.

Após combinação das bibliotecas de mutagênese randômicade CDR3 de cadeia pesada e cadeia leve, identificou-se um conjunto de scFvscom potência incrementada no ensaio de proliferação de TF-I relativamenteao scFv de 28G5 parental. ScFv com melhoramentos de potência de >60000vezes relativamente ao 28G5 parental foram isolados. Todas as combinaçõesdas bibliotecas resultaram em scFv melhorado, i.e. Hl/Ll, H1/L2, H2/L1,H2/L2. Isto é particularmente interessante porque não se isolou scFvsmelhorados da biblioteca de LI.

Um conjunto de 19 scFv identificados durante a otimização de28G5 foram reformatados e expressos como IgG4s, usando-se os métodosdescritos acima. O conjunto constitui-se dos clones de anticorpos 1, 2 e de 4 a20. Alguns dos clones mais potentes neste conjunto foram obtidos dasbibliotecas mutagenizadas de CDR3 HeL combinadas. Os anticorpos IgG4neste conjunto foram avaliados quanto a sua atividade no ensaio deproliferação de TF-I e foram comparados com o anticorpo murino conhecido2B7. Todas as IgG4s otimizadas foram mais potentes do que 2B7 nesteensaio. Nesta ocasião, 2B7 apresentou um IC50 calculado de cerca de 1,6 nM,enquanto que os clones apresentaram valores de IC50 calculadoscompreendendo de cerca de 1 pm a cerca de 1100 pM. Dados sãoapresentados na Tabela 1 abaixo e resumidos como a seguir:

IC50 <1500 pM Anticorpos 1, 2 e de 4 a 20

IC50 <300 pM Anticorpos 1, 2, de 4 a 12 e de 14 a 20

IC50 <60 pM Anticorpos 1, 2, de 4 a 6, de 8 a 11, 14 e de16 a 20

IC50 <10 pM Anticorpos 1, 5, 6, 11 e 20A Figura 3 ilustra a potência antagonista de dois anticorposrepresentativos da invenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação como conhecido anticorpo 2B7 no ensaio de proliferação de TF-1.

O sistema BIAcore 2000 (Pharmacia Biosensor) foi usado paraavaliar os parâmetros cinéticos da interação de algumas das IgG4s otimizadaspara Iead com domínio extracelular de receptor de GM-CSF marcado compurificação recombinante. A afinidade dos anticorpos foi muito melhorada,com valores Kd calculados de 0,127 nM a cerca de 5 nM. Dados sãomostrados na Tabela 2. Obteve-se melhoramentos tanto nas taxas ativas etaxas inativas. A correlação entre a afinidade das IgG4s pelo domínioextracelular solúvel de GM-CSFR a, e seu desempenho no ensaio de TF-I foimuito bom, com um coeficiente de Pearson de 0,85 (p<0,0001). A título decomparação, a KD de 2B7 calculada separadamente e mostrada como sendode cerca de 7 nM.

Anticorpos IgG4 identificados durante a otimização de 28G5foram avaliados no ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos eforam comparados com o anticorpo murino conhecido 2B7. Todos osanticorpos que foram avaliados neste ensaio (anticorpos 1, 2, 5, 6, de 9 a 11,16 e 20) se mostraram muito potentes com IC50s compreendendo de 7,8 a 90pM. Dentre estes, anticorpos 1, 2, 5, 6, 9, 16 e 20 apresentaram IC50sinferiores a 50 pM, e anticorpos 1, 2, 6, 16 e 20 apresentaram IC50s inferioresa 25 pM. Nossos anticorpos foram mais potentes do que 2B7, queapresentaram uma IC50 de 477 pM. Dados são mostrados na Tabela 3. AFigura 4 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos dainvenção, Anticorpo 1 e Anticorpo 6, em comparação com o conhecidoanticorpo 2B7 no ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos.

Anticorpos IgG4 identificados durante a otimização de 28G5foram avaliados no ensaio de alteração de forma de granulócitos decynomolgus. Todos os anticorpos foram capazes de neutralizar a atividade deGM-CSF no receptor de cynomolgus e também no receptor de humanos, etodos os anticorpos foram mais potentes do que 2B7. 2B7 apresentou umaIC50 de 26 pM, enquanto que anticorpos representativos (Anticorpo 6,Anticorpo 1 e Anticorpo 2) do conjunto apresentaram valores de IC50 de1,73, 2,03 e 3,2 pM, respectivamente.

Um conjunto das IgG4s identificadas durante a otimização de28G5 foi avaliado quanto a sua potência de neutralização no ensaio deliberação de TNFa de monócitos. Este ensaio testa a capacidade de se inibir aliberação do fator pró-inflamatório TNFa de monócitos humanos quando elessão tratados com GM-CSF. Anticorpos 1, 2, 5, 6, 9 e 10 foram testados, etodos se mostraram ativos neste ensaio e foram capazes de neutralizartotalmente a ação do GM-CSF em seu receptor (IC50 compreendendo decerca de 43 a 139) enquanto que, na concentração de 333 nM, 2B7 só pôdeproporcionar 50% de inibição da liberação de TNFa induzida com GM-CSF,indicando que este anticorpo é apenas um inibidor parcial neste ensaio. AFigura 5 ilustra a potência antagonista de dois anticorpos representativos dainvenção em comparação com o conhecido anticorpo 2B7 no ensaio deliberação de TNFa de monócitos. Dados são mostrados na Tabela 4 eencontram-se resumidos como a seguir:

<150 pM de Anticorpo nums. 1, 2, 5, 6, 9 e 10<110 pM de Anticorpo nums. 1, 2, 5, 6 e 9

<100 pM de Anticorpo nums. 1, 5, 6 e 61Uma característica da doença inflamatória é a sobrevidaincrementada de tipos de células inflamatórias em resposta a sinaisparticulares. Granulócitos são capazes de sobreviver durante um tempo maislongo na presença de GM-CSF e, assim, avaliou-se a capacidade dosanticorpos IgG4 isolados durante a otimização de 28G5 para inibir estaresposta, em um ensaio de sobrevida de granulócitos. Todos os IgG4s anti-GM-CSFRa da otimização para Iead foram ativos neste ensaio, e potências deneutralização representativas (IC50) compreenderam de 7,0 a 843,7 pM. Istocontrasta com o anticorpo murino conhecido 2B7 que foi completamenteinativo até uma concentração de 83 nM. A Figura 6 ilustra a potênciaantagonista de dois anticorpos representativos da invenção, Anticorpo 1 eAnticorpo 6, em comparação com o conhecido anticorpo 2B7 no ensaio desobrevida de granulócitos.

Estes dados, como ilustrado nas Figuras de 3 a 6, indicam quenossos anticorpos apresentam propriedades significativamente diferentes emcomparação com o anticorpo murino conhecido 2B7. Por exemplo, anticorposrepresentativos da invenção inibiram a sobrevida de granulócitos e aproliferação de TF-I estimulada com 7 pM de GM-CSF na sobrevida degranulócitos e nos ensaios de proliferação de TF-1, respectivamente, enquantoque 2B7 não inibiu a sobrevida de granulócitos, mas inibiu a proliferação deTF-I (embora, em menor grau do que nossos anticorpos). Os dados indicamque elementos de ligação da invenção apresentam maior afinidade e melhorcapacidade de inibir uma variedade de efeitos biológicos mediados por meiode GM-CSF-R em comparação com conhecidos anticorpos anti-GM-CSFRa.

As seqüências de aminoácidos derivadas de 28G5 e seusderivados foram alinhadas com as seqüências de linhagem germinal humanasconhecidas no banco de dados VBASE, e a linhagem germinal mais próximaidentificada por meio de similaridade de seqüência. A linhagem germinal maispróxima do domínio VH de 28G5 e seus derivados foi identificada comoVHl DP5. A VH de 28G5 apresenta 14 alterações relativamente à linhagemgerminal VH 1-24 (DP5) em regiões de estrutura. A linhagem germinal maispróxima do domínio VL é Vlambdal VL 1-e (DPL8), que apresenta apenas 5alterações com relação à linhagem germinal nas regiões de estrutura. Regiõesde estrutura de 28G5 e seus derivados foram retornadas à linhagem germinalpor meio de mutagênese dirigida para sítio para equiparar identicamenteanticorpos humanos nativos. Todos, exceto um aminoácido, puderam serconvertidos à linhagem germinal com alterações meramente modestas napotência do anticorpo. A isoleucina de aminoácido na posição 94 da cadeiapesada (usando numeração Kabat, Kabat et ai. 1971) não pôde ser alterada àtreonina de linhagem germinal sem uma completa perda de atividade. Portanto,esta alteração simples relativa à linhagem germinal foi mantida na região deestrutura do anticorpo.

Uma plena análise de dois dos anticorpos anti-GM-CSFRa,Anticorpo 6 e Anticorpo 1, foi realizada no ensaio de proliferação de TF-1. Osdados confirmam que estes anticorpos constituem antagonistas altamentepotentes neste sistema com valores de pA2 calculados de -11,3±0,2 e -11,0±0,2, respectivamente (Figura 1).Uma análise pA2 plena de um dos anticorpos anti-GM-CSFRa,Anticorpo 6, foi realizada nos ensaios de alteração de forma de granulócitosde humanos e de cynomolgus. Os dados confirmam que este anticorpo é umantagonista altamente potente nestes antagonista altamente potente nestessistemas com valores pA2 calculados de -10,58 e -10,78 nos ensaios dehumanos e de cynomolgus, respectivamente (Figura 2).

GM-CSF impele a diferenciação de células progenitorashemopoiéticas em colônias de granulócitos e macrófagos em ensaios de agarsemi-sólido. Portanto, anticorpo 6 e Anticorpo 1 maturados por afinidade, oanticorpo mAb parental 3 (28G5) e um controle negativo (CAT001) foramavaliados quanto a sua capacidade de antagonizar esta atividade específica deGM-CSF usando-se células progenitoras derivadas de sangue periférico, emum ensaio de formação de colônias. Dados apresentados na Figura 7demonstram que ambos os mAbs representativos maturados por afinidadeforam inibidores potentes da formação de colônias hemopoiéticas in vitromediada por GM-CSF humano.

Valores de IC50 aproximados foram de 0,08 μg/ml (Anticorpo6) e 0,25 μg/ml (Anticorpo 1) para o mAb maturado por afinidade. Éinteressante observar que o anticorpo murino conhecido 2B7 pareceuapresentar pouca ou nenhuma atividade inibidora neste ensaio até umaconcentração de 66 nM.

Em experimentos de controle, o mAb maturado por afinidadenão exerceu efeito sobre a formação de colônia mediada pela combinação deSCF + IL-3 + G-CSF como esperado e, na ausência de citocinas, a formaçãode colônias foi desprezível (<4 colônias/cultura).

Para a análise in vivo da atividade antagonista de mAbespecífico para huGM-CSFRa, é possível usar transplante de medula óssea decamundongos transgênicos (Tg) expressando ambas as cadeias, α e β, do GM-CSFR humano em camundongos de tipo selvagem, para gerar animaisquiméricos de forma a limitar a expressão de huGM-CSFR transgênico acélulas hemopoiéticas derivadas de medula óssea células hemopoiéticas e,assim, assemelha-se mais estreitamente ao perfil de expressão do receptorendógeno. Nestes camundongos Tg quiméricos a administração de huGM-CSF leva a um aumento do peso do baço e à marginalização de monócitoscirculantes do sangue. Anticorpo 6 maturado por afinidade e um mAb decontrole negativo, CATOO1, foram avaliados quanto a sua capacidade deantagonizar estas respostas in vivo mediadas com GM-CSF. Para a análisedose-resposta, 6 grupos de 5 camundongos Tg quiméricos foram tratados com500 ng de huGM-CSF s.c duas vezes ao dia durante 4 dias (dia 1-4) e umsétimo grupo de controle de cinco animais recebeu apenas PBS. Quatro dos 6grupos de animais tratados com huGM-CSF receberam mAb de teste(Anticorpo 6) a 16 mg/kg, 5,3 mg/kg, 1,78 mg/kg ou 0,59 mg/kg no dia 0[D.0], enquanto que um quinto grupo dos animais tratados com huGM-CSFrecebeu CAT001 de controle a 16 mg/kg no dia D.0. Resultados apresentadosna Figura 8 demonstram que, em comparação com o controle de PBS, otratamento com huGM-CSF induziu um aumento significativo do peso dobaço e uma diminuição dos monócitos circulantes do sangue. Como esperado,tratamento com 16 mg/kg de controle CAT001 não exerceu qualquer efeitosobre o aumento do peso do baço ou sobre a diminuição dos monócitos dosangue. Em contraste, houve um claro efeito dose-resposta após o tratamentocom o mAb de teste, Anticorpo 6, porque a 16 mg/kg este anticorpo anulou oaumento do peso do baço e, embora ainda aparente, o efeito foi muitoreduzido a 0,59 mg/kg de mAb. A IC50 poderia parecer situar-se em algumponto entre 0,59 mg/kg e 1,78 mg/kg. Observou-se um resultado similar paraa diminuição induzida com GM-CSF em monócitos circulantes - tratamentocom mAb de teste, Anticorpo 6, a 16 mg/kg anulou o aumento, enquanto quemAb a 0,59 mg/kg apresentou um impacto meramente menor sobre estaresposta. Estes dados mostram que o anticorpo anti-GM-CSFRa é umantagonista de GM-CSFRa humano in vivo.

Para investigar adicionalmente as propriedadesantiinflamatórias destes anticorpos anti-GM-CSFRa, Anticorpo 6 foi avaliadaem um ensaio de liberação de citocinas de células mononucleares do sangueperiférico. Neste ensaio, TNFa e IL-6 podem ser liberados endogenamente,dependendo do doador. Neste ensaio, o GM-CSF também é produzidoendogenamente pelas células, ao invés de adicionado exogenamente, e,portanto, resultados observados neste ensaio representam a inibição dosefeitos biológicos da ligação de GM-CSF endógeno nativo a seu receptor.

Após a administração do anticorpo 6, ambas estas citocinasforam inibidas de forma dependente da dose, como ilustrado na figura 9. Estesdados indicam que estes anticorpos podem inibir a atividade de GM-CSFnativo e que, mediante a inibição da sinalização de GM-CSF, é possível inibircitocinas pró-inflamatórias-chave, como IL-6 e TNFa5 sendo que ambos estãoimplicados numa variedade de indicações inflamatórias, como artritereumatóide.

Adicionalmente, com base neste resultado com Anticorpo 6pode-se esperar que cada um dos anticorpos de 1 a 20 também poderiademonstrar a inibição neste ensaio, porque se acredita que todos os anticorposde 1 a 20 ligam-se à mesma região de GM-CSFRa.

Mapeamento de radicais importantes para o reconhecimento de antígeno, eanálise de seqüência

Foi determinado que a variabilidade de radicais em posições naseqüência do scFv de Anticorpo 6 submetido a terapia na linhagem germinalpara identificar quais posições são normalmente conservadas para ligação deligante e sendo que referidas posições são variáveis no anticorpo que aindaconserva atividade de ligação de ligante.

Posições que contribuem para a ligação de antígeno foramverificadas como sendo os radicais Kabat 27A, 27B, 27C, 32, 51, 52, 53, 90,92 e 96 no domínio VL, e radicais Kabat 17, 34, 54, 57, 95, 97, 99 e IOOB nodomínio VH.

Identificou-se sete posições que pareceram ser importantespara a ligação de antígeno: H95, H97, H99, HlOOB, L90, L92 e L96. Nósanalisamos então os radicais nestas posições em seqüências de 160 variantesisoladas durante o processo de otimização do anticorpo 28G5, sendo que todasapresentaram um melhoramento mínimo de 5 vezes na potência no ensaio deproliferação de TF-1.

Dados na Tabela 5 abaixo resumem os diferentes aminoácidos(de, possivelmente, 20) que foram observados em cada uma destas posições, eem L95A. Onde as posições são fortemente conservadas com relação aosaminoácidos presentes no 28G5 e/ou Anticorpo 6, isto é boa evidência de quereferidos aminoácidos são "chave" para a ligação do antígeno. Por exemplo,os radicais nas posições a seguir são fortemente conservados: H97, H100B,L90, L92.Método

A seqüência de DNA que codifica o scFv Anticorpo 6maturado por afinidade e submetida a terapia na linhagem germinal foiconvertida ao formato de apresentação de ribossoma, substancialmente comodescrito na ref. [101]. Realizou-se PCR propensa a erro na seqüência doAnticorpo 6, usando-se as condições de elevada mutação (7,2 mutações por1.000 bp [pares de bases]) de acordo com o protocolo do fabricante (BDBioscience), para criar uma biblioteca de seqüências 574D04 variantescontendo mutações pontuais randômicas. Esta biblioteca foi expressa emribossomas e incubada com GM-CSFRa marcado com purificação parapermitir a ocorrência de ligação. Variantes capazes de se ligarem a GM-CSFRa marcado foram capturadas e removidas usando-se pérolasparamagnéticas revestidas com proteína G (Dynal). As variantes não-ligadasremanescentes na população foram adicionadas a um combinado de quatroanticorpos anti-idiotípicos biotinilados, que haviam sido derivadospreviamente da grande biblioteca de apresentação de fago de anticorposhumanos descrita na ref. [102] e que se sabia que se ligam ao scFv Anticorpo6. Variantes ligadas pelos anticorpos anti-idiotípicos biotinilados foramcapturadas com pérolas de estreptavidina, enquanto que variantes não-ligadasforam removidas por lavagem. Este processo foi repetido durante mais doisciclos de seleção de apresentação de ribossoma, de acordo com a metodologiageral da ref. [101].

Uma proporção representativa de variantes das emissões deseleção foi clonada em um vetor de fagomídeo e as variantes de scFv foramexpressas em fago para teste com ELISA, usando-se o mesmo método comodescrito em Edwards BM et al (2003) Journal of Molecular Biology, vol.334:103. Aquelas variantes que não apresentaram ligação a GM-CSFRamarcado com purificação foram testadas quanto à ligação com o combinadode quatro anticorpos anti-idiotípicos que foram usados na seleção. Variantes,que no ensaio de ligação de anti-idiotipo demonstraram ligação que foi igualou maior do que o Anticorpo 6 scFv, foram seqüenciadas e as seqüênciasforam analisadas para encontrar posições em que havia uma elevadafreqüência de mutação.

Verificou-se que a taxa média de mutação da população devariantes é de 3,05 aminoácidos por cadeia Vh ou Vl, usando-se 486seqüências para as cadeias Vh e 451 seqüências para as cadeias VL. Elasforam analisadas quanto a "pontos quentes" mutacionais, freqüência deplotação de mutação em relação a sua posição ao longo do scFv. A análisefocalizou aqueles clones com pelo menos uma mutação de CDR por Vh e VLe menos de 4 mutações por Vh e VL. A partir deste conjunto de 123seqüências Vh e 148 seqüências VL, "pontos quentes" foram definidos comoaqueles que apresentaram uma freqüência mutacional de 5% ou mais.

Sete posições entre VHCDR3 e VLCDR3 do Anticorpo 6 foramsalientadas como posições putativas importantes para a ligação de antígenousando-se o método de seleção negativo de apresentação de ribossoma.Realizou-se então uma análise em 160 variantes de seqüência isoladas duranteo processo de otimização do anticorpo 28G5, em que as seqüências inteiras deVhCDR3 e VlCDR3 foram randomizadas e selecionadas para maiorafinidade. Todas as seqüências (incluindo Anticorpo 6) são variantes do 28G5que mostraram um melhoramento mínimo de 5 vezes na potência no ensaio deproliferação de TF-1.

Determinação de epitopo linear

Foram selecionados o Anticorpo 6 e o conhecido anticorpo2B7 contra 2442 peptídeos, cada um representando regiões curtas daseqüência de aminoácidos da porção extracelular do GM-CSFR-α, usando-seum método PEPSCAN. Calculou-se a média de sinais de ligação para cadaanticorpo contra todos os peptídeos para gerar um sinal de fundo médio, ecalculou-se para cada peptídeo uma relação sinal/fundo. Para ambos,Anticorpo 6 e 2B7, uma relação sinal/fundo de quatro ou mais foi contadacomo um sinal positivo específico. As seqüências de peptídeos que fornecemsinal positivo específico foram analisadas quanto a unidades repetitivas deligação conservadas e verificou-se que o Anticorpo 6 ligou-se, de preferência,a uma unidade repetitiva YLDFQ, correspondendo aos radicais de 226 a 230de GM-CSFRa humano maduro, e o 2B7 anticorpo ligou-se, de preferência, auma unidade repetitiva DVRI, correspondendo aos radicais de 278 a 281 doGM-CSFRa humano maduro. A numeração da seqüência de aminoácidospara o receptor maduro é como apresentada na SEQ ID NO: 206.

Método PEPSCAN (varredura de ligação de peptídeo)

A superposição de, na maior parte, peptídeos sintéticos 15-merapresentando seqüências derivadas de GMCSF foram sintetizadas eselecionadas usando-se cartões mini-PEPSCAN com formato de cartão decrédito (placa de 455 poços com poços de 3 ul) como descrito previamente[103]. A ligação de anticorpos a cada peptídeo foi testada em um ensaioimunológico ligado a enzima (ELISA) à base de PEPSCAN. Cartões depolipeptídeo com formato de cartão de crédito de 455 poços contendo ospeptídeos ligados covalentemente foram incubados com amostra (porexemplo, 10 ug/ml de anticorpo ou soro diluído a 1/1000 em uma solução dePBS que contém 5% de soro de cavalo (v/v) e 5% de ovalbumina(peso/volume)) e 1% de Tween80 ou em case de bloqueio brando em umasolução de PBS com 4% de soro de cavalo (v/v) e 1% de Tween80 (4°C, deum dia para o outro). Após a lavagem, os peptídeos foram incubados comuma peroxidase anti-anticorpo (diluição a 1/1000, por exemplo, peroxidaseanti-camundongo de coelho, Dako) (1 h, 25°C), e subseqüentemente, após alavagem, adicionou-se o substrato de peroxidase sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) e 2 ul/ml de H2O2 a 3%. Após 1 hora mediu-se odesenvolvimento de cor. O desenvolvimento de cor do ELISA foi quantificadocom uma câmara de CCD e um sistema de processamento de imagem. Amontagem consiste de uma câmara CCD e uma lente de 55 mm (Sony CCDVideo Camara XC-77RR, Nikon micro-nikkor, lente de 55 mm f/2,8), umadaptador de câmara (Sony Camara adaptor DC-77RR) e o pacote de softwarede processamento de imagem Optimas, versão 6,5 (Media Cybernetics, SilverSpring, MD 20910, E.U.A.). Optimas roda em um sistema de computadorPentium.

Materiais e métodos de ensaioEnsaio bioquímico de ligação de ligante

Realizou-se preparações de scFv purificado como descrito noExemplo 3 do W001/66754 [104]. Concentrações de proteína de preparaçõesde scFv purificado foram determinadas usando-se o método BCA [105].Placas de microtitulação Fluoronunc™ de 96 poços foram revestidas de umdia para o outro a 4°C com 50 μΐ/poço de IgG4 anti-humano diluído a 2,5μg/ml em PBS. Placas foram lavadas 3 vezes com 300 μΐ/poço de PBS/0,1%de Tween-20 antes de bloquear durante 1 hora à temperatura ambiente com300 μΐ/poço de 3% de BSA em PBS. Placas foram lavadas novamente 3 vezescom 300 μΐ/poço de PBS/0,1% de Tween-20 e, depois, adicionou-se 50 μΐ deGM-CSFRa humano diluído a 62,5 ng/ml em 1% de BSA/PBS em cada poço,e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Apóslavagem por 3 vezes como descrito acima, adicionou-se 25 μΐ de material deamostra em cada poço, seguido de 25 μΐ de GM-CSF biotinilado diluído a 2nM em 1% de BSA/PBS. Para definir a ligação total, usou-se tamponadorapenas como o material de amostra. Para definir ligação não-específica, usou-se GM-CSF biotinilado a 100 nM em 1% de BSA como o material deamostra. Placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente antesde lavagem por 3 vezes como descrito acima. Adicionou-se 50 μΐ deestreptavidina marcada com európio (PerkinElmer) diluído a 100 ng/ml emtamponador de ensaio DELFIA™ a cada poço da placa e isto foi incubadodurante de 30 a 60 minutos à temperatura ambiente antes de lavar 7 vezescom tamponador de lavagem DELFIA™. Adicionou-se 50 μΐ/poço desolução de incremento de DELFIA™ às placas e as amostras foram lidas a615 nm em uma leitora de placas.Ensaio de proliferação de TF-I

Células TF-1, obtidas da R&D Systems e conservadasrotineiramente em RPMI 1640, 10% de FBS, 1 mM de piruvato de sódio e 4ng/ml de GM-CSF, foram privadas de nutriente por meio de lavagem por 3vezes em meio de ensaio (RPMI 1640, 5% de FBS, 1 mM de piruvato desódio), ressuspendendo-se em meio de ensaio e incubando-se durante de 7 a24 horas a 37°C em 5% de CO2. Células foram então ressuspensas a lxl05/mlem meio de ensaio e adicionou-se 100 μΐ em cada poço de uma placa decultura de tecidos de fundo plano e 96 poços. Amostras de teste forampreparadas por meio de filtração estéril da amostra de estoque antes dadiluição em meio de ensaio. Adicionou-se então 50 μΐ do material de teste emcada poço de células e estas foram incubadas durante de 45 a 60 min a 37°Cem 5% de CO2- Adicionou-se então, em cada poço, 50 μΐ de GM-CSF diluídoao valor de EC8O em meio de ensaio (ou 0,4 ng/ml no caso de algumasbateladas de GM-CSF), e as placas foram incubadas durante 16 horas a 3 7 0Cem 5% de CO2 em uma câmara umedecida. Isto representa uma concentraçãofinal de 7 pM de GM-CSF. Para medir a proliferação das células, adicionou-se 20 μΐ de 3H-timidina diluída a 5,0 μΟ/ιηΙ em meio de ensaio em cada poçoda placa e as placas foram incubadas durante 4 horas ±30 min a 37°C em 5%de CO2. Em seguida, células foram colhidas em placas 96 poços GF/CUnifilter™ usando-se um colheitador de placas e lavadas. Após adição de 50μΐ de MicroScint 20™ em cada poço da placa de filtração, as placas foramfechadas hermeticamente e contadas em uma leitora de placas TopCount.Ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos

Revestimentos tampão humanos (bolsa de sangue humano doServiço de Transfusão de Sangue) foram misturados em um volume igual de3% de Dextrano T-500 em 0,9% de NaCl. Em seguida, a mistura foi incubadanuma posição ereta até formar-se uma interface. A camada superior foicolhida e aplicada em forma de camada sobre um gradiente de densidade1,077 histopaque que, então, foi centrifugado a 400 g durante 40 minutos edeixado parar sem frenagem. As camadas superiores deste gradiente foramremovidas deixando o pellet de granulócitos. Quaisquer células sangüíneasvermelhas remanescentes no pellet foram lisadas por meio de ressuspensãodas células em 20 ml de água gelada durante 30 s, seguido de adição imediatade cloreto de sódio gelado a 1,8%. Células foram então re-pelotizadas a 1200rpm e ressuspensas em meio de ensaio (RPMI 1640, 10% de FBS, 100 u/mlde penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina, 25 mM de HEPES) a lxl06/ml.Adicionou-se então 100 μΐ de células em cada poço de uma placa de culturade tecidos de fundo plano e 96 poços. Preparou-se amostras de teste por meiode filtração estéril das amostras de consumo e diluindo, conforme apropriado,em meio de ensaio.

Para isolamento de anticorpos lead, adicionou-se então 50 μΐde amostra de teste às células, e as placas foram incubadas durante de 45 a 60min a 3 7 0C em 5% de CO2. Isto representa uma concentração final de 7 pMde GM-CSF. Isto foi seguido da adição de 50 μΐ de GM-CSF, diluído a 0,4ng/ml em meio de ensaio, em cada poço, e de uma incubação de 4 horas a3 7 0C em 5% de CO2 numa câmara umedecida.

Para otimização para lead, IgG4s filtrados diluídos em meio deensaio foram misturados com um volume igual de GM-CSF a 0,4 ng/ml emmeio de ensaio. Isto representa uma concentração final de 7 pM de GM-CSF.Adicionou-se então 100 μΐ de anticorpo/GM-CSF em cada poço. Isto foiseguido de uma incubação de 3 horas a 3 7 0C em 5% de CO2 numa câmaraumedecida.

Adicionou-se formaldeído frio a uma concentração final de1,25% e as células foram fixadas de um dia para o outro a 4°C. Analisou-se2000-5000 eventos por poço com a técnica de citometria de fluxo. A médiageométrica do espalhamento direto (FSC) para cada amostra foi entãoderivada usando CellQuest. Células foram direcionadas de forma a excluirpopulações irrelevantes (p. ex., fragmentos/células mortas) quando se calculaa média geométrica.

Ensaio de alteração de forma de granulócitos de Cynomolgus

Anticorpos foram avaliados em um ensaio que mede aalteração de forma de granulócitos de cynomolgus após estimulação comGM-CSF. Granulócitos foram purificados de sangue integral de cynomolguse o ensaio foi realizado substancialmente como descrito para o ensaio dealteração de forma de granulócitos humanos.Dados de afinidade de ligação usando análise de biossensor

O sistema BIAcore 2000 System (Pharmacia Biosensor) foiusado para avaliar os parâmetros cinéticos da interação entre scFvs e IgG4scom os receptores recombinantes. O Biosensor usa os efeitos ópticos daressonância de plasmon de superfície sobre alterações do estudo naconcentração de superfície resultante da interação de uma molécula de umcomposto a ser analisado com uma molécula de ligante que é ligadacovalentemente a uma matriz de dextrano. Tipicamente, a espécie decomposto a ser analisado em solução livre é passada sobre o ligante acoplado,e qualquer ligação é detectada como um aumento do sinal de SPR local. Istoé seguido de um período de lavagem, durante o qual a dissociação da espéciede composto a ser analisado é observada como uma diminuição do sinal deSPR, após o que qualquer composto a ser analisado remanescente é extraídodo ligante, e o procedimento é repetido com várias concentrações diferentesde composto a ser analisado. Empregou-se usualmente uma série de controlesdurante um experimento para assegurar que, nem a capacidade de ligaçãoabsoluta, nem o perfil cinético do ligante acoplado se alteramsignificativamente. Usa-se tipicamente uma solução salina proprietária detamponador de herpes (HBS-EP) como o diluente principal de amostras decomposto a ser analisado e solvente de fase de dissociação. Os dadosexperimentais são registrados em unidades de ressonância (correspondendodiretamente ao sinal de SPR) com relação ao tempo. As unidades deressonância são diretamente proporcionais ao tamanho e à quantidade decomposto a ser analisado ligado. É possível usar então o pacote de programasBIAevaluation para atribuir a constante de taxa à fase de dissociação(unidades de taxa de dissociação s"1) e fase de associação (unidades de taxa deassociação M"1 s"1). Estes valores permitem, então, o cálculo das Constantesde Afinidade de Associação e Dissociação.

Avaliou-se a afinidade de IgG4 usando um ensaio simples emque a IgG4 foi capturada de maneira não-covalente por meio de superfície deproteína A de amina. Uma série de diluições de domínio extracelular dereceptor de GM-CSF marcado com purificação recombinante, de 100 a 6,25nM, foi passada então seqüencialmente sobre o IgG4. Calculou-se amolaridade do receptor usando-se a concentração (Bradford) e a massa preditade polipeptídeo maduro não-modificado após a tradução (39,7 kDa). Cada umdos dois conjuntos de dados separados foi analisado em formatos idênticos.

Dados corrigidos com relação a células de referência foram submetidos aajustamento usando-se o modelo de Langmuir a 1:1 ajustado para cálculoglobal simultâneo das taxas de associação e dissociação, com o valor Rmaxajustado para global. O nível de IgG4 capturado durante cada ciclo foiavaliado para assegurar que a quantidade capturada permaneceu estáveldurante todo o experimento. Adicionalmente, a taxa de dissociação do IgG4foi avaliada para determinar se seria necessária uma correção do desvio dalinhagem de base. No entanto, ambas as interações de proteína A provaramser suficientemente reproduzíveis e estáveis. A validade dos dados foirestringida pelo valor T e chi2 calculado (parâmetro valor/desvio), quedeveria ser <2 e > 100 respectivamente.

Produção de domínio extracelular de GM-CSFRa marcado com purificação:

Usou-se um vetor de expressão pEFBOS [106] incorporandouma seqüência codificando domínio extracelular α de receptor de GM-CSFhumano (SEQ ID NO: 205, representando os aminoácidos de 1 a 298 do GM-CSF R maduro) com uma seqüência-sinal de IL-3 de murino e incorporandoum marcador de purificação N-terminal, para produzir polipeptídeo dedomínio extracelular (ECD) de receptor de GM-CSF marcado N-terminalrecombinante. O polipeptídeo de ECD marcado foi expresso em células CHOusando-se o vetor pEFBOS com o uso de procedimentos convencionais. Estepolipeptídeo também pode ser referido como domínio extracelular de GM-CSFRa purificado, ou como o domínio extracelular solúvel de GM-CSFRa.

É possível usar qualquer marcador de purificação vantajoso, p.ex., peptídeo Flag (DYKDDDE - SEQ ID NO: 204), Fc, biotina ou marcadorhis. A purificação pode ser conduzida empregando-se qualquer técnicaapropriada, ρ. ex. um polipeptídeo de ECD marcado com Flag (SEQ ID NO:203) pode ser purificado em uma coluna de cromatografia de afinidade M2 eeluído com peptídeo FLAG.Ensaio de liberação de TNFa de monócitosPurificação de Monócitos (Kit de Isolamento de Monócitos - Miltenyi Biotec- 130-053-301):

Revestimentos tampão humanos (bolsa de sangue humano doServiço de Transfusão de Sangue) foram aplicados em forma de camada sobreum gradiente de densidade 1,077 histopaque (Sigma, número de catálogo1077-1) e células foram centrifugados a 400xg durante 40 minutos. Não seaplicou frenagem ao parar a centrífuga. Em seguida, colheu-se células PBMCda interface. Células foram lavadas em PBS e pelotizadas a 3OOxg durante 10min antes que as células sangüíneas vermelhas remanescentes sejam lisadaspor meio de ressuspensão em 20 ml de água gelada durante 15 s, seguido deadição imediata de NaCl gelado a 1,8%. Células foram então pelotizadas a1200 rpm durante 5 min e ressuspensas em 600 μΐ de tamponador MACS(PBS, 2 mM de EDTA). Adicionou-se às células 200 μΐ de reagente debloqueio Fc fornecido com o kit e isto foi misturado antes de se adicionar 200μΐ de coquetel de hapteno-anticorpo (também fornecido com o kit) emisturação. Em seguida, células foram incubadas a 4°C durante 15 min antesde serem lavadas duas vezes em 50 ml de tamponador MACS. O pellet decélulas foi ressuspenso em 600 μΐ de tamponador MACS antes de seadicionar 200 μΐ de reagente de bloqueio Fc e misturação, seguido de 200 μΐde micro-pérolas anti-hapteno MACS e misturação. As células foramincubadas durante 45 min a 4°C antes de lavagem em 50 ml de tamponadorMACS e ressuspensão em 500 μΐ de tamponador MACS. Preparou-se umacoluna simples (Miltenyi Biotec 130-042-401) por meio de lavagem deperfusão com 3 ml de tamponador MACS antes que a suspensão de célulasfosse aplicada na coluna. O efluente foi recolhido como a fração de monócitosenriquecida. A coluna foi lavada com 2x3ml de tamponador MACS erecolheu-se o efluente. A pureza dos monócitos foi verificada por meio demanchamento com anti-CD14-PE usando-se métodos convencionais decitometria de fluxo. Células foram ressuspensas finalmente a 4 χ 10 /ml emmeio de ensaio (RPMI 1640, 10% de FCS, lOOU/ml de penicilina, 100 μ^πύde estreptomicina).Estimulação de Monócitos:

50 μΐ de células foram adicionados em cada poço de uma placade cultura de tecidos de fundo plano Costar com 96 poços. Adicionou-se emtodos os poços 25 μΐ de 150 μ^πιΐ de rhlFNy (R&D Systems). IgG4sfiltrados diluídos em meio de ensaio foram misturados com um volume igualde GM-CSF a 56 ng/ml (4 nM) em meio de ensaio. Isto representa umaconcentração final de 1 nM de GM-CSF. Adicionou-se então, em cada poço,75 μΐ de mistura de anticorpo/GM-CSF. Controles consistiram de poçoscarregados apenas com GM-CSF ou sem GM-CSF e sem anticorpo. Placasforam então incubadas durante 18 horas a 3 7 0C com 5% de CO2 numacâmara umedecida. O sobrenadante foi então colhido para testar níveis deTNF-α por meio de ELISA.

ELISA de TNFa (R&D Systems ELISA Developins System DY210):

Placas de ELISA imunossorvente Fluoronunc foram revestidasde um dia para o outro à temperatura ambiente com 100 μΐ de anticorpo decaptura a 4 μg/ml em PBS. Placas foram então lavadas três vezes comPBS/0,1% de Tween e bloqueadas com 300μl/poço de Marvel a 3% em PBSdurante 1 hora à temperatura ambiente. Placas foram lavadas 3 vezes comPBS/0,1% de Tween. 100 μΐ do sobrenadante das placas de ensaio foramtransferidos para a placa de ELISA e adicionou-se, nos poços de controle,uma titulação de TNF-α diluído em meio de ensaio. Placas foram incubadas àtemperatura ambiente durante 2 horas antes de lavagem de 4 a 5 vezes comPBS/0,1% de Tween. Adicionou-se, em cada poço da placa, 100 μΐ deanticorpo de detecção diluído a 300 ng/ml em 1% de Marvel/PBS, e as placasforam incubadas durante mais 2 horas à temperatura ambiente antes delavagem de 4 a 5 vezes com PBS/0,1% de Tween. Estreptavidina-európio(PerkinElmer 1244-360) foi diluído a 1:1000 em tamponador de ensaioDELFIA (PerkinElmer 4002-0010) e adicionado a ΙΟΟμΙ/poço antes de seincubar durante 45 min à temperatura ambiente. Placas foram lavadas então 7vezes em tamponador de lavagem DELFIA antes da adição de 100 μΐ/poço desolução de incremento (PerkinElmer 4001-0010) e leitura a 615 nm em umaleitora de placas.

Ensaio de sobrevida de granulócitos

Células foram purificadas de revestimentos tampão humanoscomo descrito com referência ao ensaio de ativação de neutrófilos (ensaio dealteração de forma), lavadas em meio de ensaio (RPMI-1640 Glutamax, 10%de FBS, 100 U/ml de penicilina, 100 μg/ml de estreptomicina) e ressuspensasa 1 χ 106/ml em meio de ensaio. Adicionou-se 100 μΐ de células em cada poçode uma placa de cultura de tecidos de fundo plano Costar de 96 poços.Estoques filtrados de anticorpo foram diluídos em meio de ensaio emisturados com um volume igual de GM-CSF a 0,4 ng/ml. Isto representauma concentração final de 7 pM de GM-CSF. Poços de controle continhamapenas meio ou GM-CSF apenas. Adicionou-se então 100 μΐ da mistura deamostra de teste/GM-CSF em cada poço na placa, e as células foramincubadas durante 68 horas a 37°C/5% de CO2 numa câmara umedecida.Adicionou-se 20 μΐ de AlamarBlue em cada poço e as placas foram incubadasdurante mais 24 horas a 37°C/5% de CO2 numa câmara umedecida. Placasforam então lidas a 560 nm e 590 nm em uma leitora de placas.

Análise pA2 de anticorpos anti-GM-CSFRa no ensaio de proliferação deTF-I e nos ensaios de alteração de forma de granulócitos de humanos ecynomolgus

A principal ferramenta farmacológica para quantificar aafinidade de um antagonista competitivo é a análise de Schild. Usando estaabordagem é possível determinar meios independentes do sistema paraestimar a afinidade antagonista em um ensaio funcional. O método baseia-seno conceito de que a concentração de antagonista e sua afinidade determina oantagonismo da resposta antagonista. Como o antagonista pode serquantificado e a concentração do antagonista é conhecida, é possíveldeterminar a afinidade do antagonista. Este antagonista é quantificadomedindo-se a relação de concentrações equi-ativas de agonistas, sendo istomedido na presença e na ausência do antagonista, e referido como relações dedose(DR).

Relações de dose podem ser calculadas tomando-se a relaçãoda EC50 do agonista (tipicamente GM-CSF) na ausência do elemento deligação para a EC50 do agonista na presença de uma concentração simples deelemento de ligação. As relações de dose, expressas como Iog(DR-I) podemser usadas então numa regressão linear no Iog [elemento de ligação] paraproduzir uma regressão de Schild. Assim, para cada concentração de elementode ligação haverá um valor de DR correspondente; estes são plotados como aregressão de Iog(DR-I) relativamente a Iog [elemento de ligação]. Se oantagonismo for competitivo, haverá relação linear entre Iog (DR-I) e Iog[elemento de ligação] de acordo com a equação de Schild, sendo que aequação é como a seguir:

Log(DR-I) = Iog [A]-Iog KaNestas circunstâncias, um valor de zero para a ordenada daráuma interceptação do eixo χ em que Iog [a] = Iog KA. Portanto, aconcentração de elemento de ligação que produz um Iog (DR-I) = O será igualao Iog KA, a constante de dissociação de equilíbrio do complexo elemento deligação - receptor. Esta é uma quantificação independente-do-sistema daafinidade do elemento de ligação que deveria ser precisa para cada sistemacelular contendo o receptor.Como os valores de Ka são obtidos de um gráfico logarítmico,eles são distribuídos Iog normalmente. O logaritmo negativo destaconcentração particular é referido empiricamente como pA2, a concentraçãode antagonista que produz um desvio de duas vezes a curva de resposta dadose de agonista. A potência antagonista pode ser quantificada calculando-sea pA2 de uma concentração simples de antagonista que produz um valorsimples para a relação de dose da equação, sendo que

pA2 = Iog (DR-l)-log[a][a] = concentração molar de antagonista que torna necessáriodobrar a concentração de agonista para elicitar a resposta submáxima original.

DR = a relação de dose é quantificada medindo-se a relação deconcentrações equi-ativas de agonista medida na presença e na ausência doantagonista.

pA2 pode ser calculado a partir dos dados de ensaio dose-resposta.

Inibição da diferenciação mediada com GM-CSF in vitro, de progenitoresde células sangüíneas em um ensaio de formação de colônias

Células mononucleares do sangue periférico enriquecidascom células progenitoras hemopoiéticas foram obtidas de doadores quesofreram mobilização de células progenitoras e aferese como parte de seutratamento clínico padrão. Amostras foram re-identificadas e células nãoforam crio-conservadas antes do uso. 5x104 Células mononucleares foramcultivadas em agar semi-sólido [107] na presença de GM-CSF humano a umaconcentração final de 10 ng/ml. maBs humanos maturados por afinidade, deteste, e o anticorpo murino conhecido 2B7, foram adicionados às culturas emagar a uma concentração final de 10, 5, 1, 0,5, 0,1 ou 0,05 μg/ml. O mAbhumano parental 28G5 e um mAb humano de controle negativo equiparadocom isótipo, CATOO1, foram avaliados a uma concentração simples de 10μg/ml. Para fins de controle, mAbs também foram avaliados quanto a suacapacidade de bloquear a formação de colônias estimuladas por umacombinação de SCF, LL-3 e G-CSF (Croker et al., 2004) e quanto a seuimpacto sobre a formação de colônias na ausência de citocinas. A formaçãode colônias (agregados > 40 células) foi incrementada após 14 dias deincubação a 37°C com 10% de CO2 em ar. Colônias foram fixadas comgluteraldeído e contadas usando-se um microscópio de dissecção com umaumento de 35X78

Inibição da atividade biológica do GM-CSF in vivo em camundongostransgênicos GM-CSFRafi humanos

Gerou-se camundongos transgênicos (Tg) expressando ambasas cadeias, α e β, do GM-CSFR humano sob o controle de um promotor deMHC de classe I, e descreveu-se respostas de células sangüíneas e de baço invivo à administração de huGM-CSF [108]. Para análise in vivo da atividadeantagonista de mAb especifica para huGM-CSFRa, é possível usartransplante de medula óssea dos camundongos Tg em camundongos de tiposelvagem para gerar animais quiméricos de tal forma que a expressão dehuGM-CSFRaP transgênico se limite a células hemopoiéticas derivadas demedula óssea e, assim, assemelha-se mais estreitamente ao perfil de expressãodo receptor endógeno. Nestes camundongos Tg huGM-CSFRaP quiméricos,a administração de huGM-CSF leva a um aumento do peso do baço e àmarginalização de monócitos circulantes do sangue.Geração de camundongos Tg quiméricos:

Fêmures e tíbias de camundongos Tg doadores foramremovidos, e a medula óssea foi enxaguada com PBS estéril mais 3% de sorode bezerro fetal (FCS). Em seguida, os tampões de medula óssea foramsugados através de uma agulha 23 G para se obter uma suspensão de célulassimples, depois células foram lavadas uma vez com PBS frio + 3% de FCS epassados através de uma tela de aço inoxidável. Removeu-se então célulasvermelhas por meio de Iise em 0,168 M de tamponador de cloreto de amônio,após o que células foram lavadas mais duas vezes com solução salinatamponada com fosfato (PBS) + 3% de FCS antes de serem passadasnovamente através de uma tela de aço inoxidável. Para remover ainda maiscélulas mortas e fragmentos de células, a suspensão foi centrifugada atravésde um leito de FCS. Células viáveis são recuperadas no pellet, lavadas umavez com PBS e ressuspensas em PBS a 2,5 χ 107/ml. Camundongos C57/BL6recipientes com de 5 a 8 semanas de vida foram irradiados letalmente com 2doses de 550 Rad, com intervalo de 3 horas. Camundongos recipientes foraminjetados intravenosamente (i.v) com 0,2 ml de suspensão de células (i.e. 5 χ106 células/camundongo) e alojados subseqüentemente em caixas cobertas com0,02 M de neomicina em sua água potável durante 3 semanas. Areconstituição foi avaliada após 6 semanas por meio de análise de FACS desangue periférico usando-se mAbs específicos para as cadeias huGMCSFRa eβ79

Tratamento com GM-CSF e análise subseqüente de camundongos Tgquiméricos:

Camundongos Tg quiméricos foram tratados duas vezes ao diapela via subcutânea (s.c.) com 500 ng de huGM-CSF durante 4 dias. Paraanálise da atividade antagonista do anticorpo, grupos de 5 camundongosreceberam administração de doses selecionadas de mAb (ver abaixo) pela viaintraperitoneal (i.p.) 1 dia antes do início do tratamento com GM-CSF. No dia5, retirou-se amostras de 0,2 ml de sangue para análise de populações deleucócitos circulantes, em particular monócitos do sangue, usando um sistemade hematologia ADVIA™ (Bayer Diagnostics). Animais foram entãosacrificados, e os baços removidos para medição dos pesos.Inibição de IL-6 e TNFa expresso endogenamente de células mononuclearesde sangue periférico humano.

Revestimentos tampão humanos (bolsa de sangue humano doServiço de Transfusão de Sangue) foram aplicados em forma de camada sobreum gradiente de densidade de densidade 1,077 de histopaque (Sigma, númerode catálogo 1077-1) e células foram centrifugadas a 400xg durante 40minutos. Não se aplicou frenagem quando da parada da centrífuga. CélulasPBMC foram então colhidas da interface. Células foram lavadas em PBS epelotizadas a 300xg durante 10 min antes que as células sangüíneasvermelhas remanescentes fossem lisadas por meio de ressuspensão em 20 mlde água gelada durante 15 s, seguido da adição imediata de NaCl gelado a1,6%. Células foram então pelotizadas a 1200 rpm durante 5 min eressuspensas em 10 ml de 10% de FBS/RPMI e 1% de penicilinaestreptomicina. Células foram então diluídas a 5 χ 106/ml. 110 μΐ de célulasforam aplicados em cada poço (5,5 χ 105/poço) e células foram deixadasassentarem durante 1 h a 37°C, 5% de CO2. Adicionou-se os seguintesreagentes como controles de concentração final simples; PHA (5 μg/ml),LPS (25 μg/ml), GM-CSF (10 ng/ml) e isótipo de controle (50 μg/ml).Anticorpo 6 foi adicionado a uma concentração de partida final de 50 μg/mlcom uma série de diluição de cinco vezes. Placas foram incubadas entãodurante 72 h a 37°C, 5% de CO2. Sobrenadantes foram recolhidos após72 h, e os níveis de TNFa e IL-6 foram calculados usando-se os seguinteskits de ELISA R&D (hTNF-a R&D Duoset ELISA developmentsystem DY210 e hIL-6 R&D Duoset ELISA development system DY206).ELISA foram realizados de acordo com as recomendações dos fornecedores.Tabela 1: Inibição da proliferação induzida com GM-CSF de células TF-Ipor meio de anticorpos IgG4 não-submetidos a terapia na linhagemgerminal isolados a partir da otimização de 28G5. A proliferação decélulas TF-I foi induzida com uma concentração simples de GM-CSF napresença de concentrações crescentes de anticorpos IgG4. Mediu-se aincorporação de timidina tritiada, e calculou-se os valores de IC50 para osanticorpos. Dados são representativos de n>3, SEM [erro padrão da média,EPM] é mostrado.<table>table see original document page 91</column></row><table>

Tabela 2: Análise cinética de anticorpos IgG4 não-submetidos a terapia nalinhagem germinal anti-GM-CSFRa isolados durante a otimização de 28G5.Anticorpos IgG4 foram imobilizados na superfície de um chip revestido comproteína A e uma série de diluições de GM-CSF Ra ECD marcado compurificação foram passados sobre a IgG4. Dados foram submetidos ao ajusteusando-se a Langmuir 1:1 simultânea ka Icd com permissão de transporte de massa.

<table>table see original document page 91</column></row><table>Dados para anticorpos 9 e 11 foram bifásicos

Tabela 3: Inibição da alteração de forma induzida com GM-CSF degranulócitos humanos por meio de anticorpos IgG4 não-submetidos a terapiana linhagem germinal isolados durante a otimização de 28G5. Granulócitoshumanos foram tratados com uma concentração simples de GM-CSF napresença de concentrações crescentes de anticorpo IgG4. A alteração de formados granulócitos foi medida usando-se citometria de fluxo e calculou-se osvalores de IC50 para os anticorpos.

<table>table see original document page 92</column></row><table>

Tabela 4: Inibição da liberação induzida com GM-CSF de TNFa demonócitos. Monócitos humanos foram tratados com uma concentraçãosimples de GM-CSF na presença de concentrações crescentes de anticorpoIgG4 não-submetidos a terapia na linhagem germinal. A liberação de TNFafoi medida com ELISA e calculou-se os valores de IC50 para os anticorpos.

<table>table see original document page 92</column></row><table><table>table see original document page 93</column></row><table>Chave para a listagem de seqüências

Na listagem de seqüências anexa encontram-se listadasseqüências de ácido nucleico e aminoácidos ("PRT") para 20 clones deanticorpo, compreendendo o clone parental e os 19 clones do conjuntootimizado. Anticorpos são numerados de Abl a Ab20. O clone parental éanticorpo 3, representado pelas SEQ ID NOS: de 21 a 30 e SEQ ID NOS: de211 a 212.

A lista a seguir identifica, por número, as SEQ ID NOS emque se mostra seqüências das moléculas indicadas:

<table>table see original document page 94</column></row><table><table>table see original document page 95</column></row><table><table>table see original document page 96</column></row><table>

As seqüências de nucleotídeos de domínio VL de anticorpos50 de 1 a 20 não incluem o códon gcg mostrado na ponta 3' nas SEQ ID NOS: 6,16, 26, 36, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106, 116, 126, 136, 146, 156, 166, 176, 186e 196. Correspondentemente, as seqüências de aminoácidos de domínio VLnão incluem o radical Ala C-terminal (resíduo 113) nas SEQ ID NOS: 7, 17,27, 37, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107, 117, 127, 137, 147, 157, 167, 177, 187 e197, respectivamente. O radical Alal 13 e códon gcg correspondente nãoforam expressos nos Anticorpos de 1 a 20. uma comparação das seqüênciasescritas com segmentos de genes de linhagem germinal, particularmente JL2,indica que o radical Ala e códon gcg correspondente não formam parte dodomínio VL90

O radical Gly na posição 112 esteve presente nas seqüênciasscFv e IgG expressas. No entanto, este radical não está presente nasseqüências de segmento j de linhagem germinal humana que formam a regiãode estrutura 4 do domínio VL, p. ex. JL2. O radical Gly não é consideradocomo uma parte do domínio VL.

Para expressar a cadeia leve da IgG, proporcionou-se umaseqüência de nucleotídeos codificando a cadeia leve do anticorpo,compreendendo um primeiro éxon codificando o domínio VL, um segundoéxon codificando o domínio CL, e um íntron separando o primeiro éxon e osegundo éxon. Em circunstâncias normais, o íntron é recortado por meio deequipamento de processamento de mRNA celular, conjugando-se a ponta 3'do primeiro éxon com a ponta 5' do segundo éxon. Assim, quando DNAapresentando a referida seqüência de nucleotídeos foi expresso como RNA, oprimeiro e segundo éxons foram recompostos. Tradução do RNA recompostoproduz um polipeptídeo compreendendo o domínio VL e o domínio CL. Apósrecomposição, o Gly na posição 112 é codificado pela última base (g) daseqüência de estrutura 4 de domínio VL e as primeiras duas bases (gt) dodomínio CL.

As seqüências de domínio VL dos Anticorpos de 1 a 20 são asSEQ ID NOS: de 186 a 246 como indicado acima. As seqüências denucleotídeos de domínio VL terminam com cta como o códon final, e Leu é oradical de aminoácido final nas seqüências de aminoácidos de domínio VLcorrespondentes.

Seqüências de domínio VL e domínio VH não-submetidas aterapia na linhagem germinal de Anticorpo 6 são mostradas nas SEQ IDNOS: de 247 a 250, adicionalmente às seqüências de domínio VL e dedomínio VH submetidas a terapia na linhagem germinal mostradas nas SEQID NOS: 51, 52, 56, 57, 216 e 217.Referências

Todos os documentos mencionados aqui, nesta descrição, sãoincorporados aqui por referência.

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<170> Cambridge Antibody Technology patent software version 1.0<210> 1<211> 360<212> DNA<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl<4 00> 1

caggtgcagc tggtgcaatctcatgtaaag tttccggatacccggaaaag gacttgagtggcacagaggt tccagggcagatggaactga gcagcctgagtctttcagtg gcatcgccta<210> 2<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl<4 00> 2

Gln Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 AlaSer Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Val Ser 25 Gly Tyr Thr Leu Thr 30 Glu LeuSer Ile His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp MetGly Gly 50 Phe Asp Pro Glu Glu 55 Asn Glu Ile Val Tyr 60 Ala Gln Arg PheGln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Ile Val Gly 100 Ser Phe Ser Gly Ile 105 Ala Tyr Arg Pro Trp 110 Gly GlnGly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl

<400> 3

Glu Leu Ser Ile His

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

caccctcact gaactgtcca tccactgggt gcgacaggct 120

gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180

agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacggcctac 240

atccgaggac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300

tcgcccctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcctca 360<223> Abl<4 00> 4

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><400>

Ala Gln Arg Phe Gln15

5

11

PRT

Homo sapiens

Abl5

Val Gly Ser Phe Ser Gly Ile Ala Tyr Arg Pro

10

<210><211><212><213><220><223><400>

6

339DNA

Homo sapiens

Abl6

cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct

caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

attttcggcg gagggaccaa gctcaccgtc ctaggtgcg

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl<4 00> 7

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagctc

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgatcagcacg

60

120

180

240

300

339

Gln Ser Val Leu Thr 5 Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerSer Ile Ser Thr 100 Ile Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Leu Thr Val 110 Leu Gly

14PRT

Homo sapiensAbl

Ala<210><211><212><213><220><223><4 00> 8

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 9<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<220><223> Abl<4 00> 9

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl<400> 10

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Ser Ile Ser Thr Ile5 10

<210> 11

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab2<4 00> 11

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc aatagtgggg 300tctttcagtg gccccgccct gcgcccctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360<210> 12<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab2<4 00> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15

Ser Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ile Ser 25 Gly His Ser Leu Ser 30 Glu LeuSer Ile His 35 Trp Val Arg Gln Thr 40 Pro Thr Lys Gly Phe 45 Glu Trp MetGly Gly 50 Phe Asp Pro Glu Glu 55 Asn Glu Ile Val Tyr 60 Ala Gln Arg PheGln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Thr Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysSer Ile Val Gly 100 Ser Phe Ser Gly Pro 105 Ala Leu Arg Pro Trp 110 Gly Lys

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 13<211> 5<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab2<4 00> 13Glu Leu Ser Ile His5

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab2<4 00> 14

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

1511PRT

Homo sapiens

Ab215

Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Ala Leu Arg Pro5 10

16339DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><400>

Ab216

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcc

<210> 17

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab2<4 00> 17

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Ala<210><211><212><213><220><223><400>

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300339

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu Gly110

1814PRT

Homo sapiens

Ab218

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab2<4 00> 19

His Asn Asn Lys Arg Pro SerHomo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab220

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

21360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab321

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc

tctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac

<210> 22

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab3<4 00> 22

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

85 90

Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

235

PRT

Homo sapiens

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60

120

180

240

300

360

Pro Gly Ala 15 Ser Glu Leu30 Glu Trp MetGln Arg PheThr Ala Tyr 80Tyr Tyr Cys 95 Trp Gly Lys110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab323

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab3<4 00> 24

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

2511PRT

Homo sapiens

Ab325

Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr5 10

<210> 26

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab3<4 00> 26

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 27

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab3<400> 27

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300339

50

55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu

65

70

75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Ala<210><211><212><213><220><223><400>

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu Gly110

2814PRT

Homo sapiens

Ab328

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 29<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<220><223> Ab3 <4 00> 29 His Asn Asn Lys Arg C1 Pro Ser<210> 30 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab3 <4 00> 30 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val

5 10

<210> 31

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab4<4 00> 31

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagctcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtccacccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctggcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggacactgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttttctttcagtc ccccgaccta cgggtactgg ggcaaaggga32120PRT

Homo sapiens

ctggggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgtgccaatggtcac

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60

120

180

240

300

360

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab432

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

Ser Leu

10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys

35 40

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val

50 55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser

65

70

75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr

85 90

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100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

335

PRT

Homo sapiens

Gly Phe

45Tyr Ala60

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<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab433

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 34

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab4<4 00> 34

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

3511PRT

Homo sapiens

Ab435

Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Thr Tyr Gly Tyr5 10

36339DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab436

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg<210> 37113PRT

Homo sapiens

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300339

<211><212><213><220><223><4 00>

Ab437

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50

55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Ala<210><211><212><213><220><223><4 00>

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala45

Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu Gly110

3814PRT

Homo sapiens

Ab438

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab4<4 00> 39

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

4011PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab440

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

41360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><400>

Ab541

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt

tctttcagtg gctaccctta ccgcccgtgg ggccaaggga

<210> 42

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab5<4 00> 42

ctggggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgtgccaatggtcac

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

Gln Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 AlaSér Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ile Ser 25 Gly His Ser Leu Ser 30 Glu LeuSer Ile His 35 Trp Val Arg Gln Thr 40 Pro Thr Lys Gly Phe 45 Glu Trp MetGly Gly 50 Phe Asp Pro Glu Glu 55 Asn Glu Ile Val Tyr 60 Ala Gln Arg PheGln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Thr Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Ile Val Gly 100 Ser Phe Ser Gly Tyr 105 Pro Tyr Arg Pro Trp 110 Gly GlnGly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210><211><212><213><220><223><4 00>

435

PRTHomo

sapiens

Ab543

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab5<4 00> 44

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><400>

Ala Gln Arg Phe Gln15

4511PRT

Homo sapiens

Ab545

Val Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Pro Tyr Arg Pro

10

46

339

DNA

Homo sapiens

Ab546

<210><211><212><213><220><223><4 00>

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 47

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab5<4 00> 47

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Ala

<210> 48<211><212><213><220><223><4 00>

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300339

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu Gly110

14PRT

Homo sapiens

Ab548

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 49<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<220><223> Ab5<4 00> 49

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<210> 50

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab5<4 00> 50

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

<210> 51

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6<4 00> 51

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cccggaaaag gacttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacggcctac 240

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<210> 52

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6<4 00> 52

Gln Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 AlaSer Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Val Ser 25 Gly Tyr Thr Leu Thr 30 Glu LeuSer Ile His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp MetGly Gly 50 Phe Asp Pro Glu Glu 55 Asn Glu Ile Val Tyr 60 Ala Gln Arg PheGln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Ile Val Gly 100 Ser Phe Ser Pro Leu 105 Thr Leu Gly Leu Trp 110 Gly GlnGly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6

<4 00> 53Glu Leu Ser Ile His5

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab6<4 00> 54

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln5 10 15

Gly

<210> 55

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6<4 00> 55

Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu5 10

<210> 56<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab6<4 00> 56

cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgaccgttg aggccggcct gagtggttcg 300

gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtgcg 339

<210> 57

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6<4 00> 57

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15

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Ala

<210> 58

<211> 14

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6

<4 00> 58

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<212> PRT

<213> Homo sapiens<220><223> Ab6<4 00> 59

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6011PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><400>

Ab660

Ala Thr Val Glu Ala Gly Leu Ser Gly Ser Val5 10

61360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab761

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca' tccactgggt

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc

tctttcagtg gccccgtgta cggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac

<210> 62

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab 7<4 00> 62

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu

20 25

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35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

85 90

Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Val Tyr Gly Leu

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

635

PRT

Homo sapiens

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab763

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab 7<4 00> 64

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Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

6511PRT

Homo sapiens

Ab765

Val Gly Ser Phe Ser Gly Pro Val Tyr Gly Leu

10

66

339

DNA

Homo sapiens

Ab766

<210><211><212><213><220><223><4 00>

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 67

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab 7<4 00> 67

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300339

Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu Gly

Ala<210><211><212><213><220><223><4 00>

6814PRTHomo

Ab768

sapiens

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 69

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab7<4 00> 69

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

7011PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab770

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

71360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab871

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctctcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggtcccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatgagcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctatagactgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgctctttcagtc ccccggccta ccgcccctgg ggcaaaggga caatggtcac<210> 72<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab8<4 00> 72

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

85 90

Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Ala Tyr Arg Pro

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

735

PRT

Homo sapiens

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

Pro Gly Ala15

Ser Glu Leu30

Glu Trp Met

Gln Arg Phe

Thr Ala Tyr80

Tyr Tyr Cys95

Trp Gly Lys110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab873

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab8<400> 74

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

7511PRT

Homo sapiens

Ab875

Val Gly Ser Phe Ser Pro Pro Ala Tyr Arg Pro5 10

<210> 76

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab8<400> 76

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 77

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab8<400> 77

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Ala<210><211><212><213><220><223><4 00>

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

339

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu Gly110

7814PRT

Homo sapiens

Ab878

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab8<4 00> 79

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<210> 80

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab8<4 00> 80

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

<210> 81

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab9<4 00> 81

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300tctttcagtc cggtcacgta cggcctctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360<210> 82<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab9<4 00> 82

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu Ser Glu Leu

20 25 30

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Val Thr Tyr Gly Leu Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 83<211> 5<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab9<4 00> 83Glu Leu Ser Ile His5

<210> 84

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab9<400> 84

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln5 10 15

Gly

<210> 85

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab9<4 00> 85

Val Gly Ser Phe Ser Pro Val Thr Tyr Gly Leu5 10

<210> 86

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab9<400> 86

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg 339

<210> 87

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab9<4 00> 87

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro

20 25 30

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly100 105 110

Ala<210> 88<211> 14<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab9<4 00> 88

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 89

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab9<400> 89

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

9011PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab990

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

91360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

AblO91

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc

tctttcagtg gcctcgcgta caggccctgg ggcaaaggga caatggtcac

<210> 92

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> AblO<4 00> 92

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

85 90

Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro

100 105

Gly Thr Met Val Thr Ile Ser Ser115 120

935

PRT

Homo sapiens

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcatctcgagt

60120180240300360

<210><211><212><213><220><223><4 00>

AblO93

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 94<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<220><223> AblO<4 00> 94

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

9511PRT

Homo sapiens

AblO95

Val Gly Ser Phe Ser Gly Leu Ala Tyr Arg Pro

10

96

339

DNA

Homo sapiens

AblO96

<210><211><212><213><220><223><4 00>

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 97

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> AblO<4 00> 97

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Ala<210><211><212><213><220><223><4 00>

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

339

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

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Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu Gly110

9814PRT

Homo sapiens

AblO98

Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro Tyr Asp Val Ser5 10

<210> 99<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<220><223> AblO<400> 99

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<210> 100<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> AblO<4 00> 100

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

<210> 101

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abll<4 00> 101

caggtgcagc tggtgcaatc tggcgctgag gtgaagaagctcatgtaaaa ttccgggaca cagcctcagt gaactgtccacccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctggcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggacactgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttttctttcagtc cgatcacgta cggcctctgg ggcaaaggga<210> 102<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abll<4 00> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Pro Gly His

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys

35 40

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val

ctgaggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgtgccaatggtcac

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60

120

180

240

300

360

50

55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr

85 90

Ala Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Ile Thr Tyr

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

1035

PRT

Homo sapiens

Lys Lys

Ser Leu

Gly Phe

45Tyr Ala60

Ile AspAla ValGly Leu

Pro Glu Ala 15 Ser Glu Leu30 Glu Trp MetGln Arg PheThr Ala Tyr 80Tyr Tyr Cys 95 Trp Gly Lys110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abll

103

Glu Leu Ser Ile His5

10417PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223> Abll<4 00> 104

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly<210><211>< 212 ><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

105

11

PRT

Homo sapiens

Abll105

Val Gly Ser Phe Ser Pro Ile Thr Tyr Gly Leu

106339DNA

Homo sapiens

5 10

<210><211><212><213><220>

<223> Abll<4 00> 106

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggtcctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

339

<210><211><212><213><220><223><4 00>

107113PRT

Homo sapiens

Abll107

Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Val Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu Gly

Ala <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Abll <4 00> 108 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5<210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

Asp Val Ser

10<223> Abll<4 00> 109

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

11011PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abll110

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val5 10

<210> 111

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl2<4 00> 111

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttc

tctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga caatggtcac

<210> 112

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl2<400> 112

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His Ser Leu

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys Gly Phe

35 40 45

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

85 90

Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

1135

PRT

Homo sapiens

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl2

113

Glu Leu Ser Ile His5

11417PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223> Abl2<400> 114

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln5 10 15

Gly

<210> 115

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl2<4 00> 115

Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr5 10

<210> 116<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl2<4 00> 116

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagcc gaccgagatc 300

cgcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc ctaggtgcg 339

<210> 117

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl2<4 00> 117

Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro 20 25 30 Tyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 GluPro Thr Glu Ile 100 Arg Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Leu Thr Val 110 Leu Gly

Ala <210> 118 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Abl2 <4 00> 118 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5<210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

10<223> Abl2<4 00> 119

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

<210> 120

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl2<4 00> 120

Gln Ser Tyr Asp Ser Glu Pro Thr Glu Ile Arg5 10

121360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl3121

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagctcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtccacccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctggcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggacactgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttttctttcagtg gctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga<210> 122<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl3<4 00> 122

ctggggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgttccaatggtcac

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

Gln Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 AlaSer Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ile Ser 25 Gly His Ser Leu Ser 30 Glu LeuSer Ile His 35 Trp Val Arg Gln Thr 40 Pro Thr Lys Gly Phe 45 Glu Trp MetGly Gly 50 Phe Asp Pro Glu Glu 55 Asn Glu Ile Val Tyr 60 Ala Gln Arg PheGln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Thr Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysSer Ile Val Gly 100 Ser Phe Ser Gly Trp 105 Ala Phe Asp Tyr Trp 110 Gly LysGly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210><211><212><213><220><223><4 00>

1235

PRT

Homo sapiens

Abl3123

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 124

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>26

<223> Abl3<4 00> 124

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly

12511PRT

Homo sapiens

Ala Gln Arg Phe Gln15

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl3

125

Val Gly Ser Phe Ser Gly Trp Ala Phe Asp Tyr5 10

126339DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl3126

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gtcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 127

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl3<400> 127

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

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ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgggcatcatc

60

120

180

240

300

339

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Arg95

Val Leu Gly110

Ala <210> 128 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Abl3 <400> 128 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5<210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

Asp Val Ser

10<223> Abl3<4 00> 129

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

<210> 130

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl3<4 00> 130

Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Thr Gly Ile Ile Val5 10

<210> 131

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl4<4 00> 131

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagctcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtccacccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctggcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggacactgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgtttagcgtgaccg cctgggcctt tgactactgg ggcaaaggga<210> 132120PRT

Homo sapiens

ctggggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgttccaatggtcac

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60120180240300360

<211><212><213><220><223><4 00>

Abl4

132

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val5 10Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys

35 40

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val

50 55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr

85 90

Ser Ile Leu Gly Ser Val Thr Ala Trp Ala Phe

100 105

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1335

PRT

Homo sapiens

Lys Lys Pro Gly 15 AlaSer Leu Ser 30 Glu LeuGly Phe 45 Glu Trp MetTyr Ala Gln Arg Phe60 Ile Asp Thr Ala Tyr 80Ala Val Tyr Tyr 95 CysAsp Tyr Trp 110 Gly Lys

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl4133

Glu Leu Ser Ile His5

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Gly

<210> 135<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl4<4 00> 135

Leu Gly Ser Val Thr Ala Trp Ala Phe Asp Tyr5 10

<210> 136

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl4<4 00> 136

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gagttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 137

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl4<4 00> 137

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

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20 25

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35 40

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50 55

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Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

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Asp Arg Phe

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138

14

PRT

Homo sapiens

Abl4138

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<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Abl4<4 00> 139

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<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

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<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 141

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<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 142

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5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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85 90 95

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln5 10 15

Gly

<210> 145

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 145

Ala Gly Ser Ile Pro Gly Trp Ala Phe Asp Tyr5 10

<210> 146

<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 146

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

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cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtt gattagcgcc 300

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<210> 147

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 147

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Ala <210> 148 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Abl5 <4 00> 148 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5<210> 149 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

10<223> Abl5<4 00> 149

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<220>

<223> Abl6<4 00> 151

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctctcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggtcccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatgagcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctatagactgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgttctctttcagtc cgttgaccat gggcctctgg ggcaaaggga caatggtcac<210> 152<211> 120<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl6<4 00> 152

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

5 10

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20 25

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35 40 45

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50 55 60

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85 90

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100 105

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1535

PRT

Homo sapiens

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60

120

180

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360

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<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl 6153

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Abl6<4 00> 154

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln5 10 15

Gly

<210> 155<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl6<4 00> 155

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<223> Abl6<4 00> 156caggctgtgc tgactcagcctcctgtactg ggagcggctccttccaggaa cagcccccaacctgaccgat tctctgcctccaggctgagg atgaggctgagttttcgggg gagggaccaa<210> 157<211> 113<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl6<400> 157Gln Ala Val Leu Thr5

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Ser Ala Ser Lys Ser65

Gln Ala Glu Asp Glu85

Leu Ser Gly Ser Val100

Ala

<210> 158<211> 14<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl6<4 00> 158

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<210> 159<211> 7<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

10

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16011PRT

Homo sapiens

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Abl6160

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10

<210><211><212><213><220><223><4 00>

161360DNA

Homo sapiens

Abl7161

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120

180

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360

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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

1635

PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl7163

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<213> Homo sapiens

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165

11

PRT

Homo sapiens

Abl7165

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<211> 339

<212> DNA

<213> Homo sapiens

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<223> Abl7<4 00> 166

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120

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339

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Ala <210> 168 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Abl7 <4 00> 168 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5<210> 169 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

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<212> PRT

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<220>

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171360DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><400>

Abl8171

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Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

1735

PRT

Homo sapiens

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl8173

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<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Gly<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ala Gln Arg Phe Gln15

175

11

PRT

Homo sapiens

Abl8175

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10

<210><211><212><213><220><223><4 00>

176339DNA

Homo sapiens

Abl8176

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tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

ctcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaggtgcg

<210> 177

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl8<4 00> 177

Gln Ala Val Leu Thr Gln ProSer Ser Val Ser

5 10

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20 25

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50 55

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85 90

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Gly

30

Pro

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Asp

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<210> 180

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl8<400> 180

Gln Ser Tyr Asp Ser Gln Trp Asn Gln Pro Leu5 10

<210> 181

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl9<400> 181

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca tccactgggt gcgacagact 120

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg aagagaatga aatagtctac 180

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catctataga cacggcctac 240

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt attattgtgc aatagtgggg 300

tctgtcagtc gcatcacgta cggcttctgg ggcaaaggga caatggtcac cgtctcgagt 360

<210> 182

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl 9 <400> 182 Gln Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 AlaSer Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ile Ser 25 Gly His Ser Leu Ser 30 Glu LeuSer Ile His 35 Trp Val Arg Gln Thr 40 Pro Thr Lys Gly Phe 45 Glu Trp MetGly Gly 50 Phe Asp Pro Glu Glu 55 Asn Glu Ile Val Tyr 60 Ala Gln Arg PheGln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Ile Asp Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Thr Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Asp Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 CysAla Ile Val Gly 100 Ser Val Ser Arg Ile 105 Thr Tyr Gly Phe Trp 110 Gly LysGly Thr Met 115 Val Thr Val Ser Ser 120 <210> 183 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Abl9

<4 00> 183Glu Leu Ser Ile His5

<210> 184

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Abl9<4 00> 184

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr5 10

Gly

<210> 185

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl9<4 00> 185

Val Gly Ser Val Ser Arg Ile Thr Tyr Gly Phe5 10

186339DNA

Homo sapiens

Ala Gln Arg Phe Gln15

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl9186

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

atcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc ctaagtgcg

<210> 187

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl9<4 00> 187

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Asn Pro His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagccggaa

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctccccccacgtc

60

120

180

240

300

339

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrLeu Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Arg95

Val Leu Ser110

Ala <210> 188 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Abl9 <4 00> 188 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly 5<210> 189 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

Asp Val Ser

10<223> Abl9<4 00> 189

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

<210> 190<211> 11<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl9<400> 190

Gln Ser Tyr Asp Ser Arg Asn Pro His Val Ile5 10

<210> 191

<211> 360

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab20<4 00> 191

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt

tctttcagtc ccctgacgct gggcctctgg ggcaaaggga

<210> 192

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab20<4 00> 192

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys

35 40

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val

50 55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr

85 90

Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

1935

PRT

Homo sapiens

ctggggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgttccaatggtcac

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

Lys Lys

Ser Leu

Gly Phe

45Tyr Ala60

Ile AspAla ValGly Leu

Pro Gly Ala15

Ser Glu Leu30

Glu Trp Met

Gln Arg Phe

Thr Ala Tyr80

Tyr Tyr Cys95

Trp Gly Lys110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab20193

Glu Leu Ser Ile His5

<210> 194

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220><223> Ab20<400> 194

Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val Tyr Ala Gln Arg Phe Gln5 10 15

Gly

<210> 195

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab20<4 00> 195

Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu Gly Leu5 10

<210> 196<211> 339<212> DNA<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab20<4 00> 196

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgaccgtgg acgaggccct gagtggttcg 300

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc ctaagtgcg 339

<210> 197

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab20<4 00> 197

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15

Arg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Ala Thr Val Asp Glu 95 AlaLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu Ser

Ala <210> 198 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens<220> <223> Ab20 <4 00> 198 Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile 5<210> 199 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens<220>

10<223> Ab20<4 00> 199

His Asn Asn Lys Arg Pro Ser5

<210> 200

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab20<4 00> 200

Ala Thr Val Asp Glu Ala Leu Ser Gly Ser Val5 10

<210> 201<211> 5<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 201Tyr Leu Asp Phe Gln5

<210> 202

<211> 385

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 202

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro15 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr Val Ala Pro

20 25 30

Ala Ser Ser Leu Asn Val Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser

35 40 45

Trp Asp Cys Gln Glu Asn Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp

50 55 60

Lys Lys Asn Arg Val Val Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser65 70 75 80

Cys Thr Phe Arg Glu Ile Cys Leu His Glu Gly Val Thr Phe Glu Val

85 90 95

His Val Asn Thr Ser Gln Arg Gly Phe Gln Gln Lys Leu Leu Tyr Pro

100 105 110

Asn Ser Gly Arg Glu Gly Thr Ala Ala Gln Asn Phe Ser Cys Phe Ile

115 120 125

Tyr Asn Ala Asp Leu Met Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala

130 135 140

Pro Arg Asp Val Gln Tyr Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Cys Pro Tyr Tyr Ile Gln Asp Ser Gly Thr His Val

165 170 175

Gly Cys His Leu Asp Asn Leu Ser Gly Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Phe

180 185 190

Leu Val Asn Gly Thr Ser Arg Glu Ile Gly Ile Gln Phe Phe Asp Ser

195 200 205

Leu Leu Asp Thr Lys Lys Ile Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn Val

210 215 220

Thr Val Arg Cys Asn Thr Thr His Cys Leu Val Arg Trp Lys Gln Pro225 230 235 240

Arg Thr Tyr Gln Lys Leu Ser Tyr Leu Asp Phe Gln Tyr Gln Leu Asp

245 250 255

Val His Arg Lys Asn Thr Gln Pro Gly Thr Glu Asn Leu Leu Ile Asn

260 265 270

Val Ser Gly Asp Leu Glu Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro

275 280 285

Arg Ala Lys His Ser Val Lys Ile Arg Ala Ala Asp Val Arg Ile Leu290 295 300Asn Trp Ser Ser Trp Ser Glu Ala Ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly305 310 315 320

Asn Leu Gly Ser Val Tyr Ile Tyr Val Leu Leu Ile Val Gly Thr Leu

325 330 335

Val Cys Gly Ile Val Leu Gly Phe Leu Phe Lys Arg Phe Leu Arg Ile

340 345 350

Gln Arg Leu Phe Pro Pro Val Pro Gln Ile Lys Asp Lys Leu Asn Asp

355 360 365

Asn His Glu Val Glu Asp Glu Ile Ile Trp Glu Glu Phe Thr Pro Glu370 375 380

Glu385

<210> 203

<211> 316

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<223> Seqüência humana com etiqueta FLAG<400> 203

Ala Ser Ile Ser Ala Arg Gln Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Thr1 5 10 15

Arg Gln Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr Val Ala Pro Ala Ser Ser Leu

20 25 30

Asn Val Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser Trp Asp Cys Gln

35 40 45

Glu Asn Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp Lys Lys Asn Arg

50 55 60

Val Val Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser Cys Thr Phe Arg65 70 75 80

Glu Ile Cys Leu His Glu Gly Val Thr Phe Glu Val His Val Asn Thr

85 90 95

Ser Gln Arg Gly Phe Gln Gln Lys Leu Leu Tyr Pro Asn Ser Gly Arg

100 105 110

Glu Gly Thr Ala Ala Gln Asn Phe Ser Cys Phe Ile Tyr Asn Ala Asp

115 120 125

Leu Met Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala Pro Arg Asp Val

130 135 140

Gln Tyr Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg Arg Glu Ile Arg145 150 155 160

Cys Pro Tyr Tyr Ile Gln Asp Ser Gly Thr His Val Gly Cys His Leu

165 170 175

Asp Asn Leu Ser Gly Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Val Asn Gly

180 185 190

Thr Ser Arg Glu Ile Gly Ile Gln Phe Phe Asp Ser Leu Leu Asp Thr

195 200 205

Lys Lys Ile Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn Val Thr Val Arg Cys

210 215 220

Asn Thr Thr His Cys Leu Val Arg Trp Lys Gln Pro Arg Thr Tyr Gln225 230 235 240

Lys Leu Ser Tyr Leu Asp Phe Gln Tyr Gln Leu Asp Val His Arg Lys

245 250 255

Asn Thr Gln Pro Gly Thr Glu Asn Leu Leu Ile Asn Val Ser Gly Asp

260 265 270

Leu Glu Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro Arg Ala Lys His

275 280 285

Ser Val Lys Ile Arg Ala Ala Asp Val Arg Ile Leu Asn Trp Ser Ser

290 295 300

Trp Ser Glu Ala Ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly305 310 315

<210> 204<211> 8<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> Peptideo FLAG sintético<4 00> 204

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210> 205

<211> 298

<212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 205

Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr Val Ala Pro Ala Ser Ser Leu Asn Val1 5 10 15

Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser Trp Asp Cys Gln Glu Asn

20 25 30

Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp Lys Lys Asn Arg Val Val

35 40 45

Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser Cys Thr Phe Arg Glu Ile

50 55 60

Cys Leu His Glu Gly Val Thr Phe Glu Val His Val Asn Thr Ser Gln65 70 75 80

Arg Gly Phe Gln Gln Lys Leu Leu Tyr Pro Asn Ser Gly Arg Glu Gly

85 90 95

Thr Ala Ala Gln Asn Phe Ser Cys Phe Ile Tyr Asn Ala Asp Leu Met

100 105 110

Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala Pro Arg Asp Val Gln Tyr

115 120 125

Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg Arg Glu Ile Arg Cys Pro

130 135 140

Tyr Tyr Ile Gln Asp Ser Gly Thr His Val Gly Cys His Leu Asp Asn145 150 155 160

Leu Ser Gly Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Val Asn Gly Thr Ser

165 170 175

Arg Glu Ile Gly Ile Gln Phe Phe Asp Ser Leu Leu Asp Thr Lys Lys

180 185 190

Ile Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn Val Thr Val Arg Cys Asn Thr

195 200 205

Thr His Cys Leu Val Arg Trp Lys Gln Pro Arg Thr Tyr Gln Lys Leu

210 215 220

Ser Tyr Leu Asp Phe Gln Tyr Gln Leu Asp Val His Arg Lys Asn Thr225 230 235 240

Gln Pro Gly Thr Glu Asn Leu Leu Ile Asn Val Ser Gly Asp Leu Glu

245 250 255

Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro Arg Ala Lys His Ser Val

260 265 270

Lys Ile Arg Ala Ala Asp Val Arg Ile Leu Asn Trp Ser Ser Trp Ser

275 280 285

Glu Ala Ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly

290 295

<210> 206<211> 378<212> PRT<213> Homo sapiens<4 00> 206

Glu Lys Ser Asp Leu Arg Thr Val Ala Pro Ala Ser Ser Leu Asn Val15 10 15

Arg Phe Asp Ser Arg Thr Met Asn Leu Ser Trp Asp Cys Gln Glu Asn

20 25 30

Thr Thr Phe Ser Lys Cys Phe Leu Thr Asp Lys Lys Asn Arg Val Val

35 40 45

Glu Pro Arg Leu Ser Asn Asn Glu Cys Ser Cys Thr Phe Arg Glu Ile

50 55 60

Cys Leu His Glu Gly Val Thr Phe Glu Val His Val Asn Thr Ser Gln65 70 75 80Arg Gly Phe Gln Gln Lys Leu Leu Tyr Pro Asn Ser Gly Arg Glu Gly

85 90 95

Thr Ala Ala Gln Asn Phe Ser Cys Phe Ile Tyr Asn Ala Asp Leu Met

100 105 110

Asn Cys Thr Trp Ala Arg Gly Pro Thr Ala Pro Arg Asp Val Gln Tyr

115 120 125

Phe Leu Tyr Ile Arg Asn Ser Lys Arg Arg Arg Glu Ile Arg Cys Pro

130 135 140

Tyr Tyr Ile Gln Asp Ser Gly Thr His Val Gly Cys His Leu Asp Asn145 150 155 160

Leu Ser Gly Leu Thr Ser Arg Asn Tyr Phe Leu Val Asn Gly Thr Ser

165 170 175

Arg Glu Ile Gly Ile Gln Phe Phe Asp Ser Leu Leu Asp Thr Lys Lys

180 185 190

Ile Glu Arg Phe Asn Pro Pro Ser Asn Val Thr Val Arg Cys Asn Thr

195 200 205

Thr His Cys Leu Val Arg Trp Lys Gln Pro Arg Thr Tyr Gln Lys Leu

210 215 220

Ser Tyr Leu Asp Phe Gln Tyr Gln Leu Asp Val His Arg Lys Asn Thr225 230 235 240

Gln Pro Gly Thr Glu Asn Leu Leu Ile Asn Val Ser Gly Asp Leu Glu

245 250 255

Asn Arg Tyr Asn Phe Pro Ser Ser Glu Pro Arg Ala Lys His Ser Val

260 265 270

Lys Ile Arg Ala Ala Asp Val Arg Ile Leu Asn Trp Ser Ser Trp Ser

275 280 285

Glu Ala Ile Glu Phe Gly Ser Asp Asp Gly Asn Leu Gly Ser Val Tyr

290 295 300

Ile Tyr Val Leu Leu Ile Val Gly Thr Leu Val Cys Gly Ile Val Leu305 310 315 320

Gly Phe Leu Phe Lys Arg Phe Leu Arg Ile Gln Arg Leu Phe Pro Pro

325 330 335

Val Pro Gln Ile Lys Asp Lys Leu Asn Asp Asn His Glu Val Glu Asp

340 345 350

Glu Ile Ile Trp Glu Glu Phe Thr Pro Glu Glu Gly Lys Gly Tyr Arg

355 360 365

Glu Glu Val Leu Thr Val Lys Glu Ile Thr

370 375

<210> 207<211> 333<212> DNA<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl<4 00> 207

cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagctc gatcagcacg 300

attttcggcg gagggaccaa gctcaccgtc cta 333

<210> 208

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl<4 00> 208

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro

20 25 30

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu100 105

<210> 209<211> 333<212> DNA<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab2<400> 209

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta<210> 210<211> 111<212> PRT

Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Leu 75 Ala Ile Thr Gly Leu 80Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser90 95 Thr Lys Leu Thr Val 110 Leu

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300333

<213> Homo sapiens <220> <223> Ab2 <4 00> 210 Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu

<210><211><212><213><220><223><4 00>

211333DNA

Homo sapiens

Ab3211

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

<210> 212

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab3<4 00> 212

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

333Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu

213333DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220>

<223> Ab4<4 00> 213

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

<210> 214

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab4<4 00> 214

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

333

Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu

215333DNA

Homo sapiens

<210><211><212><213><220>

<223> Ab5<4 00> 215

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta<210> 216<211> 111

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

333<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab5<400> 216

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro20 25 30

Tyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 SerLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu

<210> 217

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab6<4 00> 217

cagtctgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240caggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgaccgttg aggccggcct gagtggttcg 300gttttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333

<210> 218<211> 111<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab6<4 00> 218

Gln Ser Val Leu Thr 5 Gln Pro Pro Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Ala Thr Val Glu Ala 95 GlyLeu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 219

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab7<4 00> 219

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

<210> 220

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab7<400> 220

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

ccctggccat cactgggctcacagcagcct gagtggttcg

240300333

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

100

105

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu110

<210><211><212><213><220><223><400>

221333DNAHomo

Ab8221

sapiens

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta<210> 222111PRT

Homo sapiens

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

333

<211><212><213><220><223><4 00>

Ab8222

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

<210> 223

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu110<223> Ab9<400> 223

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

<210> 224

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab9<4 00> 224

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

225333DNA

Homo sapiens

cagggcagag ggtcaccatc 60atgtaagctg gtaccagcag 120acaagcggcc ctcaggggtc 180ccctggccat cactgggctc 240acagcagcct gagtggttcg 300 333

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

AblO225

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta<210> 226111PRT

Homo sapiens

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcagcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

<211><212><213><220><223><4 00>

AblO226

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser5 10Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu110

60

120

180

240

300

333<210><211><212><213><220><223><400>

227333DNA

Homo sapiens

Abll227

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggtcctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatggttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta<210> 228<211> 111<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abll<4 00> 228

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

Gly Val

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

100

229333DNA

Homo sapiens

Abl2229

105

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Ser95

Val Leu110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

cgcttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc cta

<210> 230

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl2<4 00> 230

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagcgagcc

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgaccgagatc

60

120

180

240

300

333

Gly Ala Pro Gly Gln15

Asn Ile Gly Ala Pro30

Thr Ala Pro Lys Leu45

Val Pro Asp Arg Phe60

Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Glu

85 90 95

Pro Thr Glu Ile Arg Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110

<210> 231

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl3<4 00> 231

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcaggac gggcatcatc 300gtcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333

<210> 232<211> 111<212> PRT

<213> Homo sapiens <220> <223> Abl3 <4 00> 232 Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Asp Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Gln Ser Tyr Asp Ser 95 ArgThr Gly Ile Ile 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu

<210> 233

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl4<4 00> 233

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcgagga caggatgacg 300

gagttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta 333

<210> 234

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl4<4 00> 234

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Pro20 25 30Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Asp Arg Met Thr Glu Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

<210> 235

<211> 333

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 235

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg

gccttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

<210> 236

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Abl5<4 00> 236

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

Thr Ala Pro Lys Leu45

Val Pro Asp Arg Phe60

Ala Ile Thr Gly Leu80

Ser Tyr Asp Ser Glu95

Val Thr Val Leu110

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacagccagtt

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgattagcgcc

60120180240300333

20

25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35

40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50

55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu

65

70

75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Leu Ile Ser Ala Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala45

Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

100

237333DNA

Homo sapiens

Abl 6237

105

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Gln95

Val Leu110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatgcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataacacctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcctcaggctgagg atgaggctga ttattactgc gcgacctccggttttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccatacgagatcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60

120

180

240

300

333

<210><211><212><213><220><223>

238111PRT

Homo sapiensAbl6<400> 238 Gln Ala Val Leu Thr 5 Gln Pro Ser Ser Val 10 Ser Gly Ala Pro Gly 15 GlnArg Val Thr Ile 20 Ser Cys Thr Gly Ser 25 Gly Ser Asn Ile Gly 30 Ala ProTyr Asp Val 35 Ser Trp Tyr Gln Gln 40 Leu Pro Gly Thr Ala 45 Pro Lys LeuLeu Ile 50 Tyr His Asn Asn Lys 55 Arg Pro Ser Gly Val 60 Pro Asp Arg PheSer Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu 85 Ala Asp Tyr Tyr Cys 90 Ala Thr Ser Asp Glu 95 IleLeu Ser Gly Ser 100 Val Phe Gly Gly Gly 105 Thr Lys Val Thr Val 110 Leu

<210><211><212><213><220><223><4 00>

239333DNA

Homo sapiens

Abl7239

gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240ttattactgc gcgaccgtcg aggacggcct gagtggttcg 300ggtcaccgtc cta 333

<210><211><212><213>

240111PRT

Homo sapiens

<220> <223> Abl7 <4 00> 240 Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser SerArg Val Thr Ile O Ser Cys Thr Gly Ser 20 25Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu 35 40 Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro50 55 Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala

10

65

70

75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

241333DNA

Homo sapiens

Gly Ala Pro

Asn Ile Gly30

Thr Ala Pro45

Val Pro Asp60

Ala Ile Thr

Thr Val Glu

Val Thr' Val110

Gly Gln15

Ala Pro

Lys Leu

Arg Phe

Gly Leu80Asp Gly95Leu

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Abl8241

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcagcttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtccctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctccaggctgacg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagccagtg gaaccagcccctcttcgggg gagggaccaa ggtcaccgtc cta<210> 242

60120180240300333<211> 111<212> PRT<213> Homo sapiens<220>

<223> Abl8<400> 242

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20

25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35

40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50

55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu

65

70

75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Trp Asn Gln Pro Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrVal Thr

<210><211><212><213><220><223><4 00>

100

243333DNA

Homo sapiens

Abl9243

105

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Ser Gln95

Val Leu110

gtcctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60caacatcggg gcaccttatg atgtaagctg gtaccagcag 120actcctcatc tatcataaca acaagcggcc ctcaggggtc 180caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240ttattactgc cagtcctatg acagccggaa cccccacgtc 300gctcaccgtc cta 333

<210><211><212><213><220><223><4 00>

244111PRT

Homo sapiens

Abl9244

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50

55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln

85 90

Asn Pro His Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

245333DNA

Homo sapiens

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleSer TyrLeu Thr

Pro

Gly

30

Pro

Asp

Thr

Asp

Val110

Gly Gln15

Ala Pro

Lys Leu

Arg Phe

Gly Leu80Ser Arg95Leu

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab20245

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccctcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cagggcagag ggtcaccatcatgtaagctg gtaccagcag

60120cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgaccgtgg

gttttcggcg gagggaccaa ggtcaccgtc cta

<210> 246

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab20<4 00> 246

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

247360DNA

Homo sapiens

acaagcggcc ctcaggggtcccctggccat cactgggctcacgaggccct gagtggttcg

180240300333

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleThr ValVal Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Asp Glu Ala95

Val Leu110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Linhagem não germinal de Ab 6247

caggtgcagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc

tcatgtaaaa tttccggaca cagcctcagt gaactgtcca

cccacaaaag gatttgagtg gatgggagga tttgatcctg

gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca

ctgaccctga gcagcctgag atccgacgac acggccgttt

tctttcagtc cgctaacgtt gggcctctgg ggcaaaggga

<210> 248

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Linhagem não germinal de Ab 6<4 00> 248

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ile Ser Gly His

20 25

Ser Ile His Trp Val Arg Gln Thr Pro Thr Lys

35 40

Gly Gly Phe Asp Pro Glu Glu Asn Glu Ile Val

50 55

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser65 70 75

Leu Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr

85 90

Ser Ile Val Gly Ser Phe Ser Pro Leu Thr Leu

100 105

Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 249<211> 333

ctggggcctctccactgggtaagagaatgacatctatagaattattgttccaatggtcac

agtgaaggtcgcgacagactaatagtctaccacggcctacaatagtggggcgtctcgagt

60120180240300360

Lys Lys

Ser Leu

Gly Phe

45Tyr Ala60

Ile AspAla ValGly Leu

Pro Gly Ala 15 Ser Glu Leu30 Glu Trp MetGln Arg PheThr Ala Tyr 80Tyr Tyr Cys 95 Trp Gly Lys110<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Linhagem não germinal de Ab 6<400> 249

caggctgtgc tgactcagcc gtcctcagtg tctggggccc

tcctgtactg ggagcggctc caacatcggg gcaccttatg

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcataaca

cctgaccgat tctctgcctc caagtctggc acctcagcct

caggctgacg atgaggctga ttattactgc gcgacggtcg

gttttcgggg gagggaccaa gctcaccgtc cta

<210> 250

<211> 111

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Linhagem não germinal de Ab 6<400> 250

Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser

5 10

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser

20 25

Tyr Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly

35 40

Leu Ile Tyr His Asn Asn Lys Arg Pro Ser Gly

50 55

Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu65 70 75

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala

85 90

Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys100 105

25130PRT

Homo sapiens

cagggcagagatgtaagctgacaagcggccccctggccataggccggcct

ggtcaccatcgtaccagcagctcaggggtccactgggctcgagtggttcg

60120180240300333

Gly Ala

Asn Ile

Thr Ala

45Val Pro60

Ala IleThr ValLeu Thr

Pro Gly Gln15

Gly Ala Pro30

Pro Lys Leu

Asp Arg Phe

Thr Gly Leu80

Glu Ala Gly95

Val Leu110

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab 6

251

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val

5 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr20 25

25214PRT

Homo sapiens

Lys Lys Pro Gly Ala15

Thr Leu Thr30

<210><211><212><213><220><223><4 00>

Ab 6252

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly5 10

<210> 253

<211> 32

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Ab 6<4 00> 253

Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp

5 10

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val20 25

Thr Ala Tyr Met Glu15

Tyr Tyr Cys Ala Ile30<210> 254

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens<220>

<223> Ab 6

<400> 254

Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser5 10

<210> 255

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220> <223> Ab 6 <400> 255 Gln Ser Val Leu Thr Gln 5 Arg Val Thr Ile Ser Cys 20 <210> 256 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 <400> 256 Trp Tyr Gln Gln Leu Pro 5 <210> 257 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 <4 00> 257 Gly Val Pro Asp Arg Phe 5 Leu Ala Ile Thr Gly Leu 20 <210> 258 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Ab 6 <400> 258 Phe Gly Gly Gly Thr ς Lys

10 15

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tya25 30

10

Claims

1. Elemento de ligação isolado para GM-CSFRa humano,caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação inibe a ligação de GM-CSF a GM-CSFRa, e sendo que o elemento de ligação liga pelo menos umradical de Tyr-Leu-Asp-Phe-Gln nas posições de 226 a 230 de GM-CSFRahumano como mostrado na SEQ ID NO: 206.

2. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que se liga a domínio extracelular de GM-CSFRacom uma afinidade (KD) de 5 nM ou menos em um ensaio de ressonância deplasmon de superfície.

3. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 1 oureivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula deanticorpo.

4. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VH de anticorpocompreendendo um conjunto de regiões determinadoras decomplementaridade CDRl5 CDR2 e CDR3 e uma estrutura, sendo que oconjunto de regiões determinadoras de complementaridade compreende umaCDRl com seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 173,uma CDR2 com seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, e uma CDR3 comseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:-5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO:-95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 175;SEQ ID NO: 185; e SEQ ID NO: 195;ou compreende aquele conjunto de seqüências de CDR comuma ou duas substituições de aminoácidos.

5. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 3 oureivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VHde anticorpo compreendendo regiões determinadoras de complementaridadeCDRl, CDR2 e CDR3 e uma estrutura, e sendo que o radical Kabat H97 emCDR3 VH é S.

6. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que CDR3 VH compreende adicionalmente um oumais dos seguintes radicais:V, Ν, A ou L no radical Kabat H95;S, F, Η, Ρ, T ou W no radical Kabat H99;A, Τ, P, S, V ou H no radical Kabat HlOOB.

7. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o radical Kabat H95 é V.

8. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 6 oureivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o radical Kabat H99 é S.

9. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o radical Kabat HlOOBé A ou T.

10. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dereivindicação 6, caracterizado pelo fato de que CDR3 VH apresenta umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO:-5, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 55, SEQID NO: 65, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:-105, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO:-145, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 185e SEQ ID NO: 195.

11. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 5 a 10, caracterizado pelo fato de que o radical Kabat H34na CDRl VH é I.

12. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 5 a 11, caracterizado pelo fato de que CDRl VH apresentauma seqüência de aminoácidos SEQ ED NO: 3.

13. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 5 a 12, caracterizado pelo fato de que CDR2 VHcompreende E no radical Kabat H54 e/ou I no radical Kabat H57.

14. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 5 a 13, caracterizado pelo fato de que CDR2 VH apresentauma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 4.

15. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 5 a 14, caracterizado pelo fato de que o radical Kabat Hl7na estrutura do domínio VH é S.

16. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 5 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende umdomínio VL de anticorpo compreendendo regiões determinadoras decomplementaridade CDRl, CDR2 e CDR3 e a estrutura.

17. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que CDR3 VL compreende um ou mais dosseguintes radicais:S, T ou M no radical Kabat L90;D, E, Q, S, M ou T no radical Kabat L92;S, Ρ, I ou V no radical Kabat L96.

18. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que o radical Kabat L90 é S.

19. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 17 ou25 reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o radical Kabat L92 é D ou E.

20. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o radical KabatL95A é S.

21. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 17 a 20, caracterizado pelo fato de que o radical Kabat L96é S.

22. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que a CDR3 VLapresenta uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistede SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQID NO: 60, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:- 100, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO:- 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO:- 180, SEQ ID NO: 190 e SEQ ID NO: 200.

23. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 a 22, caracterizado pelo fato de que CDRl VLcompreende um ou mais dos seguintes radicais:S no radical Kabat 27A;N no radical Kabat 27B;I no radical Kabat 27C;D no radical Kabat 32.

24. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 a 23, caracterizado pelo fato de que CDRl VL apresentauma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 8.

25. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 a 24, caracterizado pelo fato de que CDR2 VLcompreende um ou mais dos seguintes radicais:N no radical Kabat 51;N no radical Kabat 52;K no radical Kabat 53.

26. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 16 a 25, caracterizado pelo fato de que CDR2 VL apresentauma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 9.

27. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende umdomínio VH de anticorpo em que o radical Kabat H94 é I.

28. Elemento de ligação isolado para GM-CSFRa humano,caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação inibe a ligação de GM-CSF a GM-CSFRa, e sendo que o elemento de ligação liga-se ao domínioextracelular de GM-CSFRa humano com uma afinidade (KD) de 5 nM oumenos em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície.

29. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 28,caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo.

30. Elemento de ligação isolado para GM-CSFRa humano,caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação inibe a ligação de GM-CSF a GM-CSFRa, e sendo que o elemento de ligação compreende umamolécula de anticorpo humana ou humanizada que compete pela ligação dodomínio extracelular de GM-CSFRa humano com uma molécula de anticorpoapresentando um domínio VH e um domínio VL com seqüências deaminoácidos selecionadas dentre as seguintes:domínio VH da SEQ ID NO: 2 e domínio VL da SEQ ID NO: 7;domínio VH da SEQ ID NO: 12 e domínio VL da SEQ IDNO: 17;domínio VH da SEQ ID NO: 22 e domínio VL da SEQ IDNO: 27;domínio VH da SEQ ID NO: 32 e domínio VL da SEQ IDNO: 37;domínio VH da SEQ ID NO: 42 e domínio VL da SEQ IDNO: 47;domínio VH da SEQ ID NO: 52 e domínio VL da SEQ IDNO: 57;NO: 67:NO: 77;NO: 87;NO: 97;NO: 107;NO: 117;NO: 137;NO: 147;NO: 157;NO: 167;domínio VH da SEQ ID NO: 62 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 72 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 82 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 92 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 102 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 112 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 122 e domínio VL da SEQ IDNO: 127;domínio VH da SEQ ID NO: 132 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 142 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 152 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 162 e domínio VL da SEQ IDdomínio VH da SEQ ID NO: 172 e domínio VL da SEQ IDNO: 177;domínio VH da SEQ ID NO: 182 e domínio VL da SEQ IDNO: 187; ouNO: 197.domínio VH da SEQ ID NO: 192 e domínio VL da SEQ ID

31. Elemento de ligação isolado para GM-CSFRa humano,caracterizado pelo fato de que o elemento de ligação inibe a ligação de GM-CSF a GM-CSFRa e sendo que o elemento de ligação compreende umamolécula de anticorpo compreendendo um domínio VH de anticorpocompreendendo um conjunto de regiões determinadoras decomplementaridade HCDRl, HCDR2 e HCDR3 e uma estrutura, sendo que oconjunto de regiões determinadoras de complementaridade compreende umaHCDRl com seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 173,uma HCDR2 com seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 4, e uma HCDR3com seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de SEQ IDNO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45;SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO: 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ IDNO: 95; SEQ ID NO: 105; SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO:- 135; SEQ ID NO: 145; SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO:- 175; SEQ ID NO: 185; e SEQ ED NO: 195.

32. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 27 ou qualquer uma das reivindicações de 29 a 31,caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo é uma molécula deanticorpo humano ou humanizado.

33. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 32,caracterizado pelo fato de que a estrutura de domínio VH é uma estrutura deDP47 VH3 ou DP5 VHl de linhagem germinativa humana.

34. Elemento de ligação de acordo com a reivindicação 32 oureivindicação 33, caracterizado pelo fato de que compreende um domínio VLsendo que a estrutura de domínio VL é uma estrutura VLambda 6_6a,VLAmbda 1 DPL3 ou VLambda 1 DPL8 de linhagem germinativa humana.

35. Molécula de anticorpo isolada para GM-CSFRa humano,caracterizada pelo fato de que inibe a ligação de GM-CSF a GM-CSFRa, eque compreendeum domínio VH com a seqüência de aminoácidos do domínioVH mostrada na SEQ ID NO: 52 ou uma variante da mesma com uma ouduas alterações de aminoácidos, eum domínio VL com a seqüência de aminoácidos do domínioVL mostrada na SEQ ID NO: 57 ou um variante da mesma com uma ou duasalterações de aminoácidos;sendo que as alterações de aminoácidos são selecionadas dogrupo que consiste de substituições, inserções e deleções.

36. Elemento de ligação de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 3 a 27 ou de 29 a 34, ou uma molécula de anticorpo deacordo com a reivindicação 35, caracterizado(a) pelo fato de que a moléculade anticorpo é IgG4.

37. Elemento de ligação ou uma molécula de anticorpo deacordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 36, caracterizado(a) pelofato de que se liga ao domínio extracelular de GM-CSFRa humano com umaafinidade (KD) de 1 nM ou menos em um ensaio de ressonância de plasmonde superfície.

38. Elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordocom a reivindicação 37, caracterizado(a) pelo fato de que se liga ao domínioextracelular de GM-CSFRa humano com uma afinidade (KD) de 0,5 nM oumenos em um ensaio de ressonância de plasmon de superfície.

39. Elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordocom qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado(a) pelo fatode que apresenta uma potência de neutralização IC50 de 60 pM ou menos emum ensaio de proliferação de células TF-I com 7 pM de GM-CSF humano.

40. Elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordocom a reivindicação 38, caracterizado(a) pelo fato de que apresenta umapotência de neutralização IC50 de 10 pM ou menos em um ensaio deproliferação de células TF com 7 pM de GM-CSF humano.

41. Elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordocom qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadofa) pelo fatode que apresenta uma potência de neutralização IC50 de 50 pM ou menos emum ensaio de alteração de forma de granulócitos humanos com 7 pM de GM-CSF humano.

42. Elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordocom a reivindicação 41, caracterizado(a) pelo fato de que apresenta umapotência de neutralização IC50 de 25 pM ou menos em um ensaio dealteração de forma de granulócitos humanos com 7 pM de GM-CSF humano.

43. Elemento de ligação ou molécula de anticorpo de acordocom qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizadoía) pelo fatode que apresenta uma potência de neutralização IC50 de 100 pM ou menosem um ensaio de liberação de TNFa de monócitos com 1 nM de GM-CSFhumano.

44. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendeum elemento de ligação ou molécula de anticorpo como defmido(a) emqualquer uma das reivindicações precedentes e um excipientefarmaceuticamente aceitável.

45. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fatode que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica umelemento de ligação ou molécula de anticorpo como definido(a) em qualqueruma das reivindicações de 1 a 43.

46. Célula hospedeira in vitro, caracterizada pelo fato de quecontém uma molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 43.

47. Método para produzir um elemento de ligação ou moléculade anticorpo como definido(a) em qualquer uma das reivindicações de 1 a 43,caracterizado pelo fato de que compreende cultivar células hospedeiras comodefinidas na reivindicação 46.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que compreende adicionalmente purificar o elemento de ligação.

49. Método para produzir uma molécula de anticorpo paraGM-CSFRa humano, caracterizado pelo fato de que compreende:proporcionar, como inserção, deleção ou substituição de um oumais aminoácidos na seqüência de aminoácidos de um domínio VH parentalcompreendendo HCDRl, HCDR2 e HCDR3, um domínio VH que é umavariante de seqüência de aminoácidos do domínio VH parental; sendo quea CDRl VH parental apresenta uma seqüência de aminoácidosSEQ ID NO: 3;a CDR2 VH parental apresenta uma seqüência de aminoácidosSEQ ID NO: 4; ea CDR3 VH parental apresenta uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 15; SEQID NO: 25; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 55; SEQ ID NO:- 65; SEQ ID NO: 75; SEQ ID NO: 85; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 105;SEQ ID NO: 115; SEQ ID NO: 125; SEQ ID NO: 135; SEQ ID NO: 145;SEQ ID NO: 155; SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 185; e SEQ ID NO: 195;ou sendo quea CDRl VH parental apresenta uma seqüência de aminoácidosSEQ ID NO: 173, a CDR2 VH parental apresenta uma seqüência deaminoácidos SEQ ID NO: 174, e a CDR3 VH parental apresenta umaseqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 175; eopcionalmente combinar o domínio VH assim proporcionadocom um ou mais domínios VL para proporcionar uma ou mais combinaçõesVH/VL; etestar o domínio VH ou a combinação ou combinações VH/VLpara identificar uma molécula de anticorpo para GM-CSFRa humano.

50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que referido um ou mais domínios VL são proporcionados comoinserção, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos na seqüência deaminoácidos de um domínio VL parental compreendendo LCDRl, LCDR2 eLCDR3; sendo quea CDRl VL parental apresenta uma seqüência de aminoácidosSEQID NO: 8;a CDR2 VL parental apresenta uma seqüência de aminoácidosSEQID NO: 9; ea CDR3 VL parental apresenta uma seqüência de aminoácidosselecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 20, SEQ IDNO: 30, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 70,SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 110, SEQ IDNO: 120, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO:-160, SEQID NO: 170, SEQID NO: 180, SEQID NO: 190 e SEQID NO: 200.

51. Método de acordo com a reivindicação 49 ou reivindicação-50, caracterizado pelo fato de que compreende testar a molécula de anticorpoquanto à capacidade de inibir ligação de GM-CSF humano a GM-CSFRahumano.

52. Método para produzir uma composição de molécula deanticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende obter uma molécula deanticorpo usando um método como definido em qualquer uma dasreivindicações de 49 a 51, e formular a molécula de anticorpo em umacomposição compreendendo pelo menos um componente adicional.

53. Uso de um elemento de ligação ou molécula de anticorpocomo definido(a) em qualquer uma das reivindicações de 1 a 43,caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para trataruma doença ou condição inflamatória, respiratória ou autoimune.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelofato de que a condição ou doença é artrite reumatóide, asma, doença pulmonarobstrutiva crônica, resposta alérgica, esclerose múltipla, leucemia mielóide ouaterosclerose.