BRPI0111373B1 - recipiente de reação de amostra de sangue de múltiplas finalidades para uso em um sistema de hematologia baseado em citometria de fluxo, e sistema de citometria de fluxo - Google Patents

Abstract

"sistemas de coleta de luz sem lente e de citometria de fluxo para a classificação e contagem de células biológicas em uma amostra recipiente de reação de amostra de sangue de múltiplas finalidades para uso na citometria de fluxo, e, método para analisar uma amostra de sangue ou uma amostra derivada do sangue". o sistema da presente invenção é um citômetro de fluxo que inclui um sistema ótico sem lente para controlar o caminho da luz emitida a partir de uma fonte de luz de laser (30). a fonte de luz de laser é uma fonte de luz de laser de diodo padrão que emite um feixe fino. a forma do feixe de luz de laser é bem adaptado para a detecção de luz dispersa. além disso, a confiabilidade do sistema é ainda realçada pelo uso de uma série de fotodetectores (48) que não inclui nenhuma parte móvel. a série de fotodetector é tal que a luz dispersa é detectável, e estes dados coletados fornecem uma análise hematológica completa. finalmente, o sistema usa um sistema único de tubos reagentes consumíveis (60) que atuam como câmara de reação, câmaras de mistura e câmaras de refugo para as análises da amostra sangüínea.

Description

“RECIPIENTE DE REAÇÃO DE AMOSTRA DE SANGUE DE MÚLTIPLAS FINALIDADES PARA USO EM UM SISTEMA DE HEMATOLOGIA BASEADO EM CITOMETRIA DE FLUXO, E SISTEMA DE CITOMETRIA DE FLUXO” CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção diz respeito, no geral, à análise de biopartícuJa e mais especificamente a métodos e dispositivos para realizar a análise de célula sanguínea automatizada pela integração das técnicas de dispersão de luz da citometria de fluxo não convencional com um método único para a liberação de reagente e processamento da amostra que minimiza o desperdício de reagente. Mais particularmente, a presente invenção está direcionada a um sistema de análise de amostra sanguínea com base na citometria de fluxo que utiliza um conjunto de características selecionadas que, em combinação, fornecem pelo menos uma contagem sanguínea completa, uma contagem de célula sanguínea branca diferencial de cinco partes e uma contagem de reticulócito em um sistema que seja pequeno, seguro e barato o bastante para ser bem adaptado para o uso em laboratórios clínicos pequenos, consultórios médicos, consultórios veterinários e outros. O sistema também pode ser usado na análise de qualquer amostra biológica outra que não o sangue (por exemplo, urina) que seja receptiva à análise pelas técnicas de citometria de fluxo padrão. A presente invenção também diz respeito a métodos para o uso do sistema de análise de amostra sanguínea com base na citometria de fluxo.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO O sangue periférico de mamífero usualmente contém três classificações principais de tipos de célula sanguínea - as células sanguíneas componentes celulares do sangue ao longo de diversos eixos de coleta de dados no instrumento. A escolha deste tamanho para as partículas permite que a concentração da partícula seja facilmente determinada. Os sistemas de reagente dentro do consumível são sensíveis a uma medição da porcentagem de sólidos (volume de partícula vezes a concentração de partículas); assim, quanto mais baixo o volume escolhido, mais alta a concentração de partículas e mais ampla a faixa de concentrações de partículas que pode ser praticada. A forma de realização preferida é ter a concentração de partículas no consumível em 10.000 por μΐ. Neste nível, o número de eventos de poliestireno contados estarão dentro da mesma faixa como o número de células sangüíneas brancas contado. O segundo reagente de método é designado de “lise”. A lise atua para destruir as células sangüíneas vermelhas enquanto deixa as células sangüíneas brancas intactas. Neste modelo, as células sangüíneas brancas podem ser analisada, sem a interferência dos vastos números de células sangüíneas vermelhas. Este reagente pode ser embalado em um tubo de teste padrão, tampado, preferivelmente em uma forma que o permita ser usado com até cinqüenta testes de consumível separados. A lise preferivelmente contém: • Saponina, que pode ser usada em concentrações entre 6,0 e 20,0 gramas por litro. A concentração preferida é de 18 gramas por litro. • Tampões e preservantes, que consistem de sulfato de sódio (preferivelmente a 12,0 gramas por litro, mas eficaz em uma faixa de 10,0 a 16,0 gramas por litro); EDTA dissódico (preferivelmente a 1,0 grama por litro, mas eficaz de 0,5 a 3,0 gramas por litro); pro-clin 300 (preferivelmente a uma concentração de 0,5 ml por litro); e germaben II (preferivelmente a 1,0 ml por litro). Este pH deste reagente deve estar em uma faixa entre 4,2 e 5,2, com uma osmolaridade entre 235 e 285 miliosmoles e uma condutividade o reticulócito antes que ele se tome uma RBC verdadeiramente madura é o RNA de transferência. A detecção de reticulócitos é importante na avaliação clínica de uma capacidade do paciente para produzir novas células sangüíneas vermelhas. A contagem de reticulócito também pode ser usada para distinguir entre diferentes tipos de anemia. Na anemia, a produção de célula vermelha é diminuída até o ponto onde ela não pode mais manter a remoção de célula vermelha e como um resultado a contagem de célula vermelha global e de hematócritos são baixas. A presença de um número aumentado de reticulócitos nestes pacientes fornece evidência de que a medula óssea está funcionando e tentando compensar o déficit de célula sangüínea vermelha. Se existe um número pequeno ou não detectável de reticulócitos nestes pacientes, a medula óssea não está respondendo adequadamente ao déficit de célula sangüínea vermelha.

As células sangüíneas brancas (WBCs) existem no sangue periférico em concentrações muito baixas quando comparadas às células sangüíneas vermelhas. As concentrações normais destas células variam de 5 a 15 x 109 por litro, que aproximadamente são de três ordens de magnitude menores do que as células sangüíneas vermelhas. Estas células são no geral maiores do que as RBCs, tendo diâmetros entre 6 e 13 mícrons, dependendo do tipo de célula branca e da espécie. Diferente das RBCs, existe uma variedade de tipos de célula sangüínea branca que realizam funções diferentes dentro do corpo. Neste pedido, os termos “células sangüíneas brancas”, “célula brancas” e “WBCs” são intercambiavelmente usados para se referir às células sangüíneas nucleadas que não contêm hemoglobina presentes na circulação como descrito acima.

As medições dos números de células sangüíneas brancas são importantes na detecção e monitoramento de um variedade de distúrbios fisiológicos. Números elevados de células sangüíneas brancas anormais são um sinal de leucemia, que é uma proliferação não controlada de uma célula mielógena ou um linfógeno. A neutrofilia, ou números enormemente aumentados de neutrófilos é uma indicação de inflamação ou destruição de tecido no corpo, seja qual for a causa.

As células sangüíneas brancas podem ser amplamente classificadas como granulares ou agranulares. As células granulares ou granulócitos, são ainda subdivididas em neutrófilos, eosinófilos e basófilos. As células brancas agranulares são algumas vezes chamadas de células mononucleares e são subclassificadas em linfócitos e monócitos. As medições destas duas subclassificações de WBC principais (células granulocíticas e mononucleares) constituem o que é chamado de uma contagem diferencial de WBC de parte dupla (ou diferencial de parte dupla). As medições dos componentes destas subclassificações (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfócitos e monócitos), produzem uma contagem diferencial de WBC de parte quíntupla (ou diferencial de cinco partes).

Os neutrófilos são os mais prevalecentes das cinco classes principais de célula brancas, usualmente perfazendo um pouco mais do que a metade do número total de células sangüíneas brancas. Os neutrófilos são assim chamados por que eles contêm grânulos dentro do seu citoplasma, que podem ser tingidos com um corante de pH neutro. Estas células têm um tempo de vida relativamente curto, da ordem de um dia ou menos. Os neutrófilos atacam e destroem bactérias invasoras e outros agentes estranhos nos tecidos ou sangue em circulação como parte dos mecanismos de resposta imune do corpo.

Os eosinófilos são os seguintes mais prevalecentes dos granulócitos, atrás dos neutrófilos, mas no geral são responsáveis por menos do que cinco por cento do número total de células sangüíneas brancas. Os eosinófilos também contêm grânulos dentro do seu citoplasma, que podem ser tingidos com um corante de eosina. Como os neutrófilos, estas células não existem por períodos longos de tempo no sangue periférico. Os eosinófilos desempenham uma parte nos mecanismos de resposta imune do corpo que estão usualmente associados com alergias ou infecções parasíticas.

Os basófilos são os menos comuns dos granulócitos e os menos comuns de todas as cinco classificações de WBCs. Como eles são granulócitos, eles contêm grânulos dentro do seu citoplasma que podem ser tingidos, neste caso usando-se um corante básico (pH alto). Estas células também são conhecidas por desempenhar um papel nos mecanismos de resposta imune do corpo, mas os específicos não são certos.

Os linfócitos são os tipos de célula mais prevalecentes dos tipos de células mononucleares e no geral perfazem entre 20 e 30 por cento do número total de células sangüíneas brancas. Os linfócitos não têm grânulos no seu citoplasma e seus núcleos ocupam uma grande maioria do volume de célula. A área fina do citoplasma dos linfócitos pode ser tingida, visto que ela contém RNA. Os linfócitos circulam no sangue periférico, deixam a circulação como parte do mecanismo de resposta imune do corpo e eventualmente retoma para o sangue periférico. Muitos linfócitos são células de vida relativamente longa.

Os monócitos são formas imaturas de macrófagos que, sozinhos, têm pouca capacidade para combater agentes infecciosos na sangue em circulação. Entretanto, quando existe uma infecção nos tecidos que circundam um vaso sangüíneo, estas células deixam o sangue em circulação e entram nos tecidos circundantes. Quando isto acontece, os monócitos passam por uma transformação dramática para formar macrófagos, aumentando seus diâmetros tanto quanto cinco vezes e desenvolvendo grandes números de mitocôndrias e lisossomas no seu citoplasma. Os macrófagos atacam depois os objetos estranhos invasores pela fagocitose e ativação de outras células do sistema imune, tais como as células T. O número aumentado de macrófagos são um sinal de que inflamação está ocorrendo no corpo.

As plaquetas são encontradas em todas as espécies de mamífero e estão envolvidas na homeostase. Os animais normais terão no geral entre 1 a 5 x 1011 plaquetas por litro. Estas partículas celulares são usualmente muito menores do que as RBCs, tendo um diâmetro entre 1 e 3 pm. As plaquetas são formadas como botões a partir das superfícies de megacariócitos, células muito grandes encontradas na medula óssea que sozinhas não deixam a medula para entrar na circulação sangüínea. Ao invés, os botões se comprimem e entram na circulação como plaquetas. Como as RBCs, as plaquetas carecem de núcleos e assim não podem reproduzir. Funcionalmente, as plaquetas atuam agregar assim como para obstruir ou reparar pequenos furos nos vasos sangüíneos. No caso de furos maiores, a agregação de plaqueta atua como uma etapa precoce na formação do coágulo. Como um resultado, a contagem e a função da de plaqueta são clinicamente muito importantes. As contagens de plaqueta baixas anormais podem ser a causa de um distúrbio de coagulação.

Coletivamente, a contagem e determinação do tamanho de RBCs, a contagem de WBCs e a contagem de plaquetas é chamada de uma contagem sangüínea completa (CBC). A classificação das células sangüíneas brancas nas cinco classificações principais, expressada como uma base percentual é chamada de um diferencial de cinco partes. A classificação das células sangüíneas vermelhas em duas classificações, células sangüíneas vermelhas maduras e células sangüíneas vermelhas reticuladas, em uma base percentual é chamada de uma contagem de reticulócito. A determinação de um CBC, com um diferencial de 5 partes e uma contagem de reticulócito, é um procedimento de diagnóstico comum realizado para diagnosticar, rastrear e tratar uma abundância de enfermidades. Estes testes perfazem a grande maioria de análise da hematologia que são realizadas em laboratórios clínicos humanos e de animal por todo o mundo. Estes três testes podem ser todos realizados usando-se um microscópio, centrífuga, câmara de contagem, lâmina e reagentes apropriados. Entretanto, as habilidades necessárias para realizar estes testes manualmente são raras e levam anos de treinamento. Além disso, o tempo requerido para realizar cada um destes testes manualmente é muito alto. Como um resultado, a automação significante por intermédio da instrumentação foi perseguida neste campo desde os idos de 1950, quando os primeiros contadores de célula por impedância de Coulter apareceram.

Um contador de impedância consiste de duas câmaras cheias com uma solução salina e conectadas por intermédio de um pequeno orifício. Na presença de uma voltagem constante através do orifício, as células passadas individualmente através do orifício deslocam um volume de solução salina e desse modo aumentam a impedância do orifício. O tamanho da célula pode estar relacionado com o pulso de voltagem gerado pela passagem da célula através do orifício. Como um resultado, quando uma célula passa através do orifício, a sua presença e tamanho podem ser determinados a partir do pulso de voltagem resultante.

Visto que a tecnologia da impedância evoluiu, os contadores de célula automatizados foram desenvolvidos de modo que pudessem ser capazes de contar RBCs, WBCs e plaquetas simultaneamente no mesmo instrumento, com base nos tamanhos diferentes destas classes de células. Esta automação provou ser uma enorme economia de trabalho para os laboratórios hospitalares. Entretanto, estes sistemas foram incapazes de distinguir entre todos os tipos diferentes de células sangüíneas brancas e assim foram incapazes de fornecer uma contagem diferencial de cinco partes. Além disso, estes instrumentos também foram incapazes de distinguir entre reticulócitos e células sangüíneas vermelhas normais e assim também não puderam fornecem uma contagem de reticulócito. A citometria de fluxo é um método poderoso de análise para determinar o conteúdo celular de vários tipos de amostras e em particular amostras que contenham células vivas. Em aplicações clínicas, citômetros de fluxo são úteis para a contagem e classificação de linfócitos, para a caracterização imunológica de leucemias e linfomas e para a reação cruzada de tecidos para transplantes. Na maior parte das técnicas de citometria de fluxo, as células em uma solução fluídica são motivadas a fluir individualmente através de um feixe de luz, usualmente produzido por uma fonte de luz de laser. Conforme a luz atinge cada célula, a luz é dispersa e a luz dispersa resultante é analisada para determinar o tipo de célula. A célula também pode ser opcionalmente rotulada com um marcador ligado a uma molécula fluorescente, que fluoresce quando a luz a atinge e desse modo revela a presença do marcador na célula. Neste modelo, informação a cerca dos componentes de superfície da célula pode ser obtida. Os exemplos de tais moléculas fluorescentes incluem FITC (isotiocianato de fluoresceína), TRITC (isotiocianato de tetrametil rodamina), Vermelho do Texas (sulforodamina 101) e PE (ficoeritrina). além disso, os componentes intracelulares da célula, tais como os ácidos nucléicos, podem ser tingidos e subsequentemente detectados pela fluorescência. Os exemplos de tais compostos incluem brometo de etídio, iodeto de propídio, YOYO-1, YOYO-3, TOTO-1, TOTO-3, BO-PRO-1, YO-PRO-1 e TO-PRO-1.

As medições de célula sangüínea feitas usando-se a citometria de fluxo frequentemente utiliza duas medições separadas - uma para medir as RBCs e as plaquetas e a outra para medir as WBCs muito menos comuns. A razão para separar as medições é que as RBCs são muito mais comuns do que os outros tipos de célula sangüínea e assim a detecção de outros tipos de célula na presença das RBCs requer que as RBCs sejam removidas ou que grandes volumes de amostra sejam medidos. Altemativamente, estas células podem ser distinguidas com base no fingimento imunoquímico de antígenos de superfície celular particulares e/ou fingimento de tipo de célula diferencial. Assim, na Patente US 5.047.321 (Loken et ai), um método de etapa única para as análises de célula sangüínea utiliza pelo menos dois pigmentos fluorescentes e um marcador de célula rotulada para diferenciar entre as células. Entretanto, a menos que duas diluições separadas da mesma amostra sejam realizadas, o método ainda requer volumes maiores de amostra para fornecer dados estatísticos suficientes com respeito aos componentes do sangue menos comuns.

As medições da dispersão de luz são amplamente usadas na citometria de fluxo para medir tamanhos de célula e para distinguir entre diversos tipos diferentes de células. É conhecido que a luz incidente é dispersa pelas células em ângulos pequenos (aproximadamente de 0,5 a 20°) a partir da linha percorrida pela luz incidente que examina as células e que a intensidade da luz dispersa é proporcional ao volume da célula. A luz dispersa em ângulos pequenos é chamada de luz dispersa avançada. A luz dispersa avançada (também chamada de dispersão de luz avançada ou dispersão de ângulo pequeno para ângulos de dispersão entre 0,5 - 2,0°) é útil na determinação do tamanho da célula. A capacidade para medir tamanhos de célula é influenciada pelo comprimento de onda utilizado e pela faixa precisa de ângulos em que a luz é coletada. Por exemplo, o material dentro das células tendo uma absorção forte no comprimento de onda da iluminação pode interferir com a determinação do tamanho por que as células que contêm este material produzem sinais de dispersão para a frente menores que de outro modo seria esperado, levando a subestimativas do tamanho da célula. Além disso, as diferenças no índice refrativo entre as células e o meio circundante também podem influenciar as medições de dispersão em ângulo pequeno.

Tipos de célula diferentes podem ser distinguidos com base na quantidade de dispersão de luz ortogonal (ou dispersão lateral em ângulo reto) que elas produzam. As células tendo um alto grau de granularidade, tais como granulócitos sangüíneos, dispersam a luz incidente em ângulos muitos mais altos do que as células com baixa granularidade, tais como os linfócitos.

Como um resultado, as medições da dispersão para a frente e lateral em ângulo reto são comumente usadas para distinguir entre tipos diferentes de células sangüíneas, tais como as células sangüíneas vermelhas, linfócitos, monócitos e granulócitos. Adicionalmente, os eosinófilos podem ser distinguidos dos neutrófilos e de outros linfócitos e outros granulócitos com base na medição da polarização da dispersão lateral em ângulo reto. Normalmente, a luz polarizada incidente é ortogonalmente dispersa e permanece polarizada. Entretanto, os eosinófilos fazem com que a luz polarizada incidente ortogonalmente dispersa tome-se despolarizada em um grau maior do que as outras células. Este grau mais alto de despolarização permite a identificação específica de populações de eosinófilo nas amostras de sangue. O Pedido de Patente Copendente US 09/507.515, depositado em 18 de fevereiro de 2000, divulga um citômetro de fluxo de abertura numérica alta melhorado que utiliza um detector de luz dispersa lateral de ângulo alto para detectar eosinófilos em uma amostra de sangue. O uso de um detector de luz dispersa lateral de ângulo alto (em ângulos de cerca de 130°) permite discriminação maior dos eosinófilos nas populações de célula sangüínea. Entretanto, em contraste aos sistemas convencionais, o sistema descrito no Pedido de Patente copendente US N° 09/507.515 não requer que a luz incidente seja despolarizada. Os conteúdos inteiros do Pedido de Patente US 09/507.515 são por meio deste incorporados por referência. A Patente US 5.492.833 (Rodriguez et al.) divulga um método para distinguir eritrócitos de reticulócitos pelo tratamento das células com um reagente fantasma, seguido pela medição da dispersão da luz. A Patente US 5.559.037 (Kim et al.) divulga um método para a contagem de células sangüíneas vermelhas nucleadas (NRBCs) lixiviando primeiro as células sangüíneas vermelhas, expondo depois as NRBCs a um corante nuclear e medindo a fluorescência e a dispersão da luz. A Patente US 5.733.784 (Studhohne et al.) divulga um método para a medição da concentração de reticulócito em uma amostra de sangue que utiliza um reagente corante de reticulócito que é incubado por um período entre 15 minutos e 4 horas antes que as medições de dispersão da luz sejam tomadas. A Patente US 5.879.900 (Kim et al.) divulga um método para a análise simultânea e quantitativa de subpopulações de WBCs, NRBCs e WBC danificadas que utiliza as medições da dispersão da luz e da fluorescência multi-dimensionais. A Patente US 5.891.734 (Grill et al.) divulga um sistema para diferenciar células sangüíneas em uma amostra de sangue que aspira uma parte de sangue e a mistura com um reagente fluorescente, depois automaticamente conduz a amostra tingida através de um citômetro de fluxo e mede a dispersão da luz e a fluorescência ângulo múltiplo.

Para se obter a informação significativa a cerca das quantidades e tipos de células na amostra ou da concentração de marcadores nas superfícies da célula, as amostras devem ser padronizadas com respeito à quantidade de dispersão da luz, fluorescência ou impedância associadas com as populações padronizadas de células. Além disso, o próprio instrumento de citometria de fluxo deve ser calibrado para garantir o desempenho apropriado. A calibração do instrumento é tipicamente realizada pela passagem de partículas padrão através do instrumento e a medição da dispersão, fluorescência ou impedância resultantes. Os citômetros de fluxo podem ser calibrados com materiais padrão sintéticos (por exemplo, pérolas de poliestireno) ou com células ou outro material biológico (por exemplo, pólen ou núcleos tingidos). Estes materiais de padronização são fabricadas para serem extremamente uniformes no tamanho e para conter as quantidades precisas de moléculas fluorescentes para servirem na calibração dos tubos fotomultiplicadores usados na detecção de sondas fluorescentes. Entretanto, os procedimentos de calibração são longos e complicados e requerem treinamento extensivo para realizar apropriadamente. Além disso, estes procedimentos de calibração são tipicamente realizados uma vez no início da análise. As mudanças no instrumento, isto é, tendência, ou na amostra podem alterar o desempenho do instrumento. Conseqüentemente, existe uma necessidade para um meio de realizar a calibração automática do mecanismo dos citômetros de fluxo que remova a exigência quanto a calibração manual habilitada e que possa ajustar a calibração como necessário para considerar as mudanças no instrumento com o tempo e com as diferenças nas amostras, de modo que o desempenho ótimo do instrumento possa ser obtida para cada amostra medida. A Patente US 5.627.037 (Ward et al.) divulga um método de etapa única para a determinação de números absolutos de uma ou mais populações de reticulócitos e/ou leucócitos em uma amostra de sangue integral usando-se a citometria de fluxo. O método compreende misturar uma amostra de sangue com um diluente, em que o diluente continha um fixativo, um ou mais marcadores de célula fluorescentes e um número conhecido de micropartículas fluorescentes por volume unitário e depois disso analisar a amostra pela citometria de fluxo. A fluorescência devido às micropartículas deve ser distinguível daquela devido aos marcadores de célula. O citômetro de fluxo é conduzido com um conjunto deflagrador de fluorescência tal que todas as células e as micropartículas excedam o nível deflagrado. Os eventos são depois reanalisados sob condições onde as micropartículas são distinguíveis dos marcadores de célula. O número de micropartículas e o número de células (como determinado pelo número de marcadores de célula) são então contados. O número de células e o número de micropartículas fornecem uma relação que pode ser usada, conhecendo-se o número de micropartículas por volume unitário e o volume total da amostra, para calcular o número absoluto de células na amostra de sangue integral. Entretanto, os métodos descritos na Patente US 5.627.037 contam com duas etapas analíticas para fornecerem o número absoluto de células por amostra e não divulgam ou sugerem que o citômetro de fluxo pode ser simultaneamente padronizado usando-se as micropartículas incluídas na amostra. A Patente US 5.380.663 (Schwartz et ai.) divulga um método para calibrar um citômetro de fluxo, que utiliza populações combinadas de micro pérolas fluorescentes e um programa de software igualado a cada população combinada de micropérolas. Cada lote de micropérola contém pelo menos duas populações diferentes de micropérolas fluorescentes e cada população tem uma intensidade de fluorescência diferente. O programa de software contém informação sobre a intensidade de fluorescência de cada população de micropérolas dentro do lote. O programa de software monitora as micropérolas fluorescentes quanto a degradação da fluorescência e alerta o operador quando a intensidade de fluorescência cai abaixo dos níveis aceitáveis. O método não fornece um meio para padronizar automaticamente amostras de modo que as variabilidades nas medições devido às diferenças entre os citômetros de fluxo sejam reduzidas ou eliminadas. A Patente US 5.451.525 (Shenkin et al.) divulga um método para determinar o número total de células em uma amostra, que não requer um volume de amostra conhecido. O método utiliza um número conhecido de partículas diferentes que são adicionadas a um espécime de sangue antes que o espécime seja ensaiado em um citômetro de fluxo. Pela contagem das partículas adicionadas e das células e relacionando o número de partículas contadas ao número de partículas adicionadas, o número de células na amostra de sangue integral pode ser depois determinada sem a necessidade de medir o volume da amostra medida. Porque o volume da amostra medida é desconhecido, o método divulgado é incapaz de determinar se diluições da amostra apropriadas foram feitas. O método além disso não divulga um meio automático para calibrar o instrumento para garantir que a variabilidade nas medições devido às diferenças entre os citômetros de fluxo seja reduzida ou eliminada.

As técnicas da citometria de fluxo que usam as características da dispersão de luz das células foram aplicadas pela Technicon começando nos idos de 1970 para realizar a análise diferencial de célula branca, em combinação com a determinação de CBC. A análise de reticulócito automatizada foi desenvolvida nos anos de 1980 na Becton-Dickinson e nos sistemas de citometria de fluxo fluorescentes da Coulter. Entretanto, estes sistemas antigos não realizam um CBC ou diferencial de célula sangüínea branca. Eventualmente, os fabricantes como a Technicon (Bayer), Coulter (Beckman-Coulter) e Abbott incorporaram a contagem de reticulócito com seus sistemas diferenciais de CBC / célula branca diferencial automatizados, em tais sistemas de hematologia de final alto como o Technicon (Bayer) H*3, Bayer Advia 120, Coulter STKS, Coulter Genesis e Abbotts CellDyn 3500 e CellDyn 4000. Estes sistemas instrumentais foram capazes de medir todos os parâmetros para uma análise de hematologia completa que são clinicamente importantes para a avaliação do paciente, a saber, CBC, WBC diferencial de cinco partes e contagem reticulócito. Entretanto, estes instrumentos tipicamente utilizam sistemas óticos complexos e caros. Além disso, os sistemas de hematologia de final alto são planejados para serem máquinas de alto rendimento, de modo que freqüentemente amostras de espécimes diferentes múltiplas estão sendo simultaneamente processadas, requerendo diferentes combinações de tratamentos e análises. As análises de células sangüíneas vermelhas e células sangüíneas brancas requerem sistemas de reagente diferentes e são freqüentemente otimizadas de uma maneira que requer caminhos hidráulicos completamente diferentes. Como um resultado, para realizar simultaneamente tanto a análise de célula sangüínea vermelha quanto de célula sangüínea branca, caminhos hidráulicos completamente separados e distintos são criados para cada tipo de amostra. Esta combinação de caminhos hidráulicos de amostra simultânea múltipla cria complexidade indesejavelmente alta, devido ao uso de grandes números de válvulas, linhas de vácuo, câmaras de reação, seringas e outros.

Além disso, uma quantidade significante de treinamento é requerida para aprender a como usar estes instrumentos apropriadamente e estes sistemas de instrumento requerem manutenção diversas vezes ao ano, no mínimo. Como um resultado, os altos custos associados com a aquisição, uso e manutenção destes instrumentos de finalidade superior os tomam financeiramente inacessíveis às pequenas clinicas e consultórios médicos. Os médicos podem ter acesso a este instrumento pela utilização de laboratórios comerciais que coletaram as amostras de sangue da clínica ou consultório médico e transportarão as amostras de volta para o laboratório para a análise nestes sistemas de hematologia de finalidade superior. Os resultados são então enviados ao médico. Este processo é muito consumidor de tempo e mais freqüentemente que o médico não terá os resultados até o dia seguinte, pelo menos.

Assim, se um médico deseja uma avaliação hematológica completa (CBC, WBC diferencial de cinco partes e contagem de reticulócito) rapidamente, o laboratório no consultório deve usar alguma combinação de métodos manuais. A instrumentação, tal como os contadores de impedância que realizam CBC com WBC diferencial limitada, está disponível para estes laboratórios na clínica, mas os sistemas que podem produzir diferenciais de cinco partes e contagens de reticulócito não está. Assim, para se obter valores para estes parâmetros, os métodos manuais são utilizados. Estes métodos manuais, entretanto, são lentos, de trabalho intensivo e propensos a erro do operador.

Os contadores de impedância de finalidade inferior disponíveis para as clínicas e consultórios médicos incluem sistemas tais como o Abbott 1200, ABX Micros e o Sysmex K-21. Embora os sistemas de hematologia de finalidade superior tenham melhorado pela incorporação das técnicas citométricas de fluxo e outros avanços, a tecnologia usada nos sistemas de finalidade inferior mudou muito pouco. Estas unidades de finalidade inferior têm se tomado muito mais compactas e eficientes através da incorporação de microeletrônicos semicondutores onde aplicável; entretanto, no final estes sistemas não são funcionalmente diferentes do instrumentos Coulter usados pelos laboratórios clínicos nos idos de 1970 e recentemente nos de 1980. Em particular, estes instrumentos ainda não podem realizar uma diferencial WBC de cinco partes, nem podem produzir uma contagem de reticulócito.

Os instrumentos de impedância de finalidade inferior usados em clínicas pequenas e consultórios médicos no geral usam pacotes de reagente volumosos que são intencionados para laboratórios maiores. Visto que o número de amostras conduzidas nestes instrumentos é baixa comparado às suas contrapartes de laboratório, significantes volumes de reagentes são desperdiçados na realização dos ciclos de partida e paralisação, bem como nas limpezas do sistema entre as amostras. Assim é impossível prever quantas amostras de paciente um usuário obterá de uma embalagem de reagente. Como um resultado, o usuário deve manter uma quantidade em excesso de reagentes à mão, levando inevitavelmente a um grau substancial de desperdício de reagente. Além disso, as hidráulicas destes instrumentos, conquanto no geral menos complexas do que nos sistemas de laboratório de finalidade superior, são ainda propensas aos mesmos resultados de confiabilidade associados com tubos, válvulas numerosas, bombas de vácuo e as dimensões pequenas das aberturas usadas para contar as células. Assim para aplicações dentro da clínica ou dentro do consultório, os instrumentos de impedância de finalidade inferior são gravemente deficientes em produzir os resultados necessários para a análise completa da hematologia, são usuários muito ineficientes de reagentes e têm os mesmos problemas de confiabilidade herdados que estão associados com sistemas de análise de fluido biológico de finalidade superior.

Algumas tentativas foram feitas para tratar as necessidades de análise de amostra de sangue clínica de laboratórios pequenos e consultórios médicos, mas estes esforços têm encontrado apenas sucesso limitado. Por exemplo, a tecnologia QBC®, desenvolvida pela Becton-Dickinson, não requer a citometria de fluxo ou outra tecnologia cara. A única parte móvel requerida é uma centrífuga para forçar os componentes celulares do sangue a formarem camada em um tubo capilar furado com precisão, super dimensionado. Dentro do tubo capilar, um ‘flutuador’ plástico que é precisamente fabricado quanto as características de tamanho e densidade estabelece equilíbrio de densidade dentro das camadas de célula sangüínea branca e de plaqueta, expandindo desse modo as camadas dez vezes. Isto permite estimativas razoavelmente precisas da contagem de plaqueta, a contagem de WBC e um diferencial WBC de duas partes (granular e agranular), bem como uma medição muito precisa de hematócritos. O sistema QBC® não utiliza qualquer reagente líquido e é portanto muito seguro. Este método também é um método de dose unitária, em que um único tubo capilar e flutuador são usados para cada análise. Como um resultado, não existe reagente desperdiçado.

Embora a tecnologia QBC® trate de do que diz respeito à confiabilidade e desperdício de reagente para usuário dentro da clínica, ela não alcança bem o objetivo de liberar os parâmetros requeridos para um CBC, produz um diferencial incompleto e não quantifica reticulócitos. Adicionalmente, a precisão e a exatidão dos parâmetros produzidos pelo sistema QBC®, exceto para os hematócritos, são piores do que aqueles dos sistemas de impedância de finalidade inferior. Conseqüentemente, permanece uma necessidade enorme para um sistema de análise de fluido biológico barato que seja capaz de produzir parâmetros que sejam confiáveis aos clínicos e médicos em tomar decisões que afetem o tratamento de uma grande porcentagem de seus pacientes.

Para tratar a necessidade quanto a parâmetros hematológicos que estejam além da capacidade dos instrumentos de impedância de finalidade inferior em um cenário dentro da clínica, diversos fatores principais devem ser tratados. O tamanho, custo e complexidade associados com os sistemas hematológicos de finalidade superior devem ser reduzidos, enquanto se retém a capacidade para realizar números altos de análises de sangue completas. Os sub-sistemas principais que contribuem para o custo e complexidade dos sistemas hematológicos de finalidade superior são o projetos óticos e o planejamento do manuseio fluídico, bem como os sistemas de reagente.

Para reduzir o tamanho do sistema ótico a laser, a incorporação de um diodo de laser em um laser a gás reduz significantemente o tamanho do pacote total. Além disso, um diodo de laser também pode reduzir o custo do sistema a laser. Entretanto, os diodos de laser não têm as características óticas dos laseres a gás. Eles são astigmáticos e têm regiões de ruído dependentes da temperatura, que são chamadas de “ajuste de modo”. Este ruído de ajuste de modo toma a detecção de partículas pequenas tais como plaquetas muito difíceis. O controle da temperatura do diodo de laser para uma área térmica silenciosa pode reduzir este problema de ajuste de modo. Isto pode ser realizado por uma variedade de sistemas de retroalimentação de temperatura, tal como um refrigerador termo elétrico, que mantém a temperatura do diodo laser em uma faixa de temperatura muito estreita. Entretanto, qualquer tipo de controle térmico é custoso, especialmente visto que o próprio diodo de laser é uma fonte de calor. Assim mesmo o ato de ligar o diodo laser causa efeitos de ajuste de modo até que o equilíbrio térmico seja atingido, o que podería levar de cinco a dez minutos.

Existem custos significantes e complexidades outras que não da fonte de luz de laser, associados com as óticas de formação de feixe e coleta de luz para os instrumentos do tipo de citometria de fluxo.

As óticas de formação de feixe são no geral intencionadas a adotar um feixe de laser gaussiano circular e criar uma elipse onde a energia de distribuição é tanto mais intensa quanto mais uniformemente distribuída na área de interesse. Muitos instrumentos de hematologia usam um método colimado com as caudas da curva gaussiana sendo bloqueadas por uma abertura. Isto cria um efeito de cartola, que dá uniformidade na região de interesse e reduz a necessidade para o controle fluídico e a estabilidade da ação de apontar o laser, mas sacrifica a densidade de energia na célula.

Além disso, para criar um feixe muito fino que seja sub-celular no tamanho (< 4 mícrons), que seja útil para medições em tempo de vôo, o método tradicional foi primeiro expandir o feixe de laser inicial, de modo que ele pudesse ser então focalizado para um tamanho de ponto pequeno. Tanto a etapa de expansão quanto a etapa de focalização são realizadas usando-se vários elementos óticos, tais como lentes, divisores de feixe e espelhos. Nestes casos custos significantes são incorridos tendo-se muitos componentes óticos. Além do alto custo de fabricar cada um destes componentes, cada componente ótico incorre ainda em custos em que cada um necessita ser mantido seguro no espaço e cuidadosamente alinhado. A ótica de coleta de luz nos sistemas de citômetro de fluxo são ainda mais complexos do que a ótica que forma o feixe. Isto é porque em quase todas as aplicações, mais do que uma medição de luz é feita. Para realizar isto, duas ou mais fontes de detecção são necessárias. Cada detector requer diversos componentes óticos que conduzem luz da área de interesse para o detector. Como no caso da formação do feixe, custos significantes são incorridos pela exigência de numerosos componentes óticos, cada um dos quais necessita ser mantido no espaço e cuidadosamente alinhado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Este dispositivo é um sistema de hematologia com base na citometria de fluxo que tem alto nível de confiabilidade e utiliza volumes muito baixos de reagentes de método para determinar pelo menos uma contagem sangüínea completa (CBC), uma contagem de célula sangüínea branca diferencial de cinco partes e uma contagem de reticulócito. O sistema da presente invenção utiliza um conjunto selecionado de características que, em combinação, cria um dispositivo que é capaz de produzir uma análise de hematologia completa, mas que não têm as desvantagens da técnica anterior. O sistema é um citômetro de fluxo que inclui um sistema de detecção ótico sem lente para a coleta da luz emitida a partir de uma fonte de luz de laser, depois de interagir com uma célula ou partícula. A fonte de luz de laser é uma fonte de luz de laser de diodo padrão que é formada para produzir uma linha fina, como divulgado na Patente US N2 6,612,719. A forma do feixe de luz de laser é bem adaptada para a detecção da luz dispersa. A luz de laser é ainda Além disso, a confiabilidade do sistema é ainda realçada pelo uso de uma série de fotodetectores que não inclui nenhuma parte móvel, nem requer qualquer lente. A série de fotodetector é tal que a luz dispersa é detectável e estes dados coletados fornecem uma análise hematológica completa, quando usados em combinação com uma técnica de abertura numérica alta. Finalmente, o sistema usa um sistema único de tubos reagentes consumíveis que atuam como câmaras de reação, câmaras de mistura e câmaras de refugo para as análises da amostra sangüínea. Os tubos consumíveis incorporam partículas de látex ou coisa parecida (células fixas), que atuam como padrões internos para garantir que as diluições feitas durante o processamento das amostras foram corretamente realizadas. O uso destes tubos consumíveis resulta em menos desperdício e precisão e validação enormemente melhorada dos resultados.

Conseqüentemente, um objetivo da presente invenção é fornecer um sistema de coleta de luz sem lente para um citômetro de fluxo. É um outro objetivo da presente invenção fornecer um recipiente de reação de amostra de sangue de propósito múltiplo para o uso na citometria de fluxo, que compreenda um tubo fechado, um número de partículas conhecido no tubo fechado, cada uma das partículas tendo um dos diversos diâmetros tal que as partículas caiam em um de uma pluralidade de canais de dispersão de luz conhecidos; e pelo menos um reagente. r E um outro objetivo da presente invenção fornecer um método para analisar uma amostra de sangue ou uma amostra derivada do sangue, que compreenda as etapas de misturar a amostra de sangue ou a amostra derivada do sangue com um reagente em um recipiente de reação fechado que contenha um número de partículas conhecido no recipiente de reação fechado, as partículas tendo um de diversos diâmetros tal que as partículas caiam em um de uma pluralidade de canais de dispersão de luz conhecidos; padronizar a amostra usando as partículas pela medição da dispersão da luz em uma direção para a frente e da dispersão da luz em uma direção lateral e comparar as medições com os valores obtidos para as partículas; contar e dimensionar as células da amostra; medir a dispersão da luz em uma direção para a frente e a dispersão da luz em uma direção lateral de cada célula na amostra; e analisar a luz dispersa para classificar uma célula com base nos seus sinais de dispersão da luz. E um outro objetivo da presente invenção fornecer um sistema de citometria de fluxo para classificar e contar as células biológicas em uma amostra, que compreenda um tubo consumível, o tubo consumível contendo um número conhecido de partículas em uma suspensão aquosa, as partículas tendo um de diversos diâmetros de tal modo que as ditas partículas caiam em um de uma pluralidade de canais de dispersão de luz conhecidos e pelo menos um reagente; um tubo de lise, o tubo de lise contendo pelo menos um reagente de lise capaz de lisar células sangüíneas vermelhas na amostra enquanto deixa as células sangüíneas brancas na amostra substancialmente intactas; um recipiente de revestimento, o recipiente de revestimento contendo uma solução capaz de atuar como um reagente de diluição de amostra, um reagente de revestimento para a citometria de fluxo e um reagente de lavagem para um caminho hidráulico do sistema de citometria de fluxo; uma célula de fluxo; um sistema hidráulico, o sistema hidráulico sendo capaz de misturar os conteúdos da amostra, o tubo consumível, o tubo de lise e o recipiente de revestimento e mover uma ou mais das misturas resultantes através da célula de fluxo; um laser de diodo, o laser de diodo produzindo luz para irradiar as células na célula de fluxo; um módulo ótico sem lente, o módulo ótico sem lente tendo uma primeira parte capaz de coletar luz dispersa em duas ou mais faixas de ângulo de dispersão avançadas e uma segunda parte capaz de coletar a luz dispersa em uma abertura numérica alta; um processador de sinal, o processador de sinal sendo capaz de analisar um ou mais sinais gerados a partir da primeira parte e da segunda parte do módulo ótico sem lente e gerar dados a partir destes; e um processador de dados para analisar os dados.

Os objetivos, características e vantagens acima e outros da presente invenção tomar-se-ão evidentes a partir da seguinte descrição lida em conjunção com os desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG 1 é uma representação esquemática das hidráulicas do sistema, que mostra as válvulas do sistema (1, 2, 3, 4, 5), seringas (6, 7), frascos de reagente volumosos (8, 9) e outros componentes principais do sistema. A FIG 2 é um desenho da montagem da célula de fluxo usada no sistema de detecção ótica. Este contém três orifícios de tubo (20, 21, 23) que permitem o fluxo laminar através do canal de fluxo de quartzo (22) onde o laser interatua com as células. A FIG 3 A e a FIG 3 B são representações esquemáticas da ótica que forma o feixe de laser. A Figura 3 A da uma representação de vista de topo e a Figura 3 B dá uma representação de vista lateral. O diodo de laser bruto, 30, emite luz que é divergente em dois eixos separados. Uma lente de colimação, 31, elimina a divergência em ambos os eixos e ilumina a lente 32. A lente 32 atua para convergir o feixe em um eixo tal que quase toda a luz do feixe de laser possa passar através da largura do canal de fluxo de 22. W representa esta largura. Uma terceira lente, 33 é introduzida entre 32 e W, tal que ela produza um foco nítido em W. O ponto focal da lente 33 é a interseção desejada da luz de laser e da partícula ou célula de interesse. O ponto focal da lente 32 é o plano desejado para colocar fotodetectores para medir os parâmetros de dispersão, visto que este é onde o laser convergiu ao seu ponto menor naquele eixo. A FIG 4 é uma ilustração do sistema de detecção de célula, que mostra células ou partículas fluindo através de 22, que é mantido no espaço em tomo de pelo menos dois, mas preferivelmente quatro detectores de fotodiodo, sem quaisquer lentes de coleta ou produção de imagem. Estes detectores coletam a dispersão ortogonal, 42, a dispersão para a frente de ângulo baixo, 45, a perda ou extinção da luz axial, 44 e a dispersão para a frente de ângulo alto, 43. A luz de laser é iluminada em 22 por intermédio de 41, que contém a ótica que forma feixe da Figura 3. A FIG 5 é um desenho da máscara de fotodiodo que acomoda três medições óticas independentes na direção para a frente do laser. A dispersão para a frente de ângulo baixo é mascarada por 51, a perda de luz axial por 52 e a dispersão para a frente de ângulo alto por 53. A forma de realização preferida destas três áreas estão em uma fabricação única 50, de material semicondutor onde apenas a geometria desejada é uma parte ativa do material semicondutor. Outros métodos podem ter 50 sendo uma máscara metálica que pode assentar em três fotodiodos diferentes. A FIG 6 é uma representação esquemática do que acontece no consumível durante o ciclo do sistema. O tubo consumível, 60, começa com uma pequena quantidade de reagente do método, à qual quantidades precisamente medidas de sangue integral por intermédio de 6 ou outro material desconhecido é adicionado com os sistemas de fluido de revestimento, de 8, por intermédio de 7, através da agulha hidráulica 11. Isto cria 60, que é depois analisado através das óticas da Figura 4. Para criar 62, mais sangue integral ou outro material desconhecido é adicionado ao tubo consumível. Para analisar células sangüíneas brancas um agente lítico e fluído de revestimento são adicionados para criar 63, que é depois analisado com a ótica da Figura 4. Finalmente, as linhas hidráulicas são limpas pelo retro-fluxo no tubo consumível para criar 64, que é agora um tubo de resíduo. A FIG 7 é um desenho da montagem de posicionamento do tubo que move os tubos mostrados na Fig 6. Quatro tubos de teste podem ser simultaneamente mantidos. A fenda A, é intencionada para a amostra de sangue integral do paciente ou outro tipo de espécime apropriado. A fenda B é intencionada para o tubo consumível representado na Figura 6. A fenda C é para um tubo que contenha lise que permanece dentro do sistema na fenda C, durante numerosas rodadas de consumíveis (um por conjunto de mais do que 20, idealmente 50 consumíveis). A fenda D é para um tubo limpo embarcado, que também é intencionado a funcionar como um tubo imprimador, para posicionar apropriadamente os fluidos na partida do sistema. A FIG 8 é um desenho da montagem de mistura e penetração. Para realizar a elaboração das diluições descritas na Figura 6, as fendas de tubo da Figura 7 são movidos entre uma central de perfuração onde as agulhas 11 e 12 são simultaneamente inseridas nos tubos de teste tampados por meio de um motor 81. Quando um fluido é injetado em um tubo pelas seringas 6 ou 7, através da agulha 11, a agulha 12 ventila a mudança de pressão para um filtro de ar 13, que está na pressão atmosférica. Uma vez que a nova solução é criada no consumível, o carro da Figura 7, move o consumível sob 80, onde através do uso de diversos motores, incluindo 82, o consumível é misturado, tomando a solução dentro dele homogênea. A FIG 9 é um desenho da forma de realização preferida da Figura 1. Um bloco múltiplo mantém as válvulas que têm caminhos hidráulicos apropriados e integra as seringas e a mecânica de acionamento do motor. A FIG 10 demonstra os dados de histograma da célula vermelha (C), da plaqueta (A) e do látex (B) obtidos de uma forma de realização do sistema. A Figura 10 A representa os dados de histograma do canal de alta dispersão para frente digitalizada, 43, no eixo x (0 até 1023 ou 8 bits) contra o número de eventos (ou ocorrências) coletados para cada um dos canais individuais. A Figura 10 B mostra a mesma rodada de dados, exceto que ela representa o canal de extinção ou de perda de luz axial, 44. A Figura 10 C mostra a mesma rodada de dados, exceto que ela representa o canal de dispersão de ângulo reto, 42. A Figura 10 D mostra a mesma rodada de dados, exceto que ela representa o tempo de vôo ou medição da largura de pulso. As medições da largura de pulso podem ser feitas a partir de qualquer um dos outros canais que utilizam um fotodetector, mas é preferido o uso da extinção, 44 ou dispersão para frente baixa, 45. A FIG 11 demonstra os mesmos dados de célula vermelha, plaqueta e látex da Figura 10, exceto que na forma de ponto de dispersão. Os pontos de dispersão são simplesmente uma representação dos dados que são coletados simultaneamente a partir de uma célula ou partícula, de uma medição, plotados no eixo x, contra uma outra medição plotada no eixo y. As partículas de látex são distinguíveis em A na Figura 11 A e em B na Figura 11 B. A FIG 12 A demonstra dados do histograma de célula branca para o canal de extinção que claramente mostra três populações, A são os linfócitos, B são os monócitos e C são os granulócitos. A Figura 12 B mostra a mesma amostra de paciente, exceto que esta rodada de dados incorporou partículas de látex. Mais uma vez, A são os linfócitos, B são os monócitos e C são os granulócitos. As partículas de látex são indicadas por D e são facilmente distinguidas das células brancas. A Figura 12 C e 12 E mostram a mesma amostra de paciente para o parâmetro de dispersão para a frente baixa 12 C e a dispersão em ângulo reto 12 E, sem partículas de látex adicionadas. As Figuras 12 D e 12 F mostram a mesma amostra de paciente para os parâmetros de dispersão para a frente baixa 12 D e dispersão de ângulo reto 12 F, com partículas de látex adicionadas. A FIG 13 A e 13 B demonstram os mesmos dados de célula branca e látex das Figuras 12 B, 12De 12 F, exceto que na forma de ponto de dispersão. A FIG 14 demonstra os dados de histograma de célula vermelha e reticulócito para a dispersão de ângulo reto, a Figura 14 A e para extinção, Figura 14 B obtidos de uma forma de realização do sistema. A FIG 15 demonstra os dados de ponto de dispersão de célula vermelha e reticulócito obtidos da mesma amostra como representado nas Figuras 14 A e 14 B. Aqui, quando plotadas uma contra a outra, a extinção (eixo y) e a dispersão de ângulo reto (eixo x) mostram a separação de reticulócitos da população principal de células sangüíneas vermelhas maduras. O valor de 1,72 % de reticulócitos está em excelente concordância com o método de referência manual de 1,60 %. A FIG 16 demonstra os dados de histograma diferencial de célula branca obtidos a partir da dispersão de ângulo reto, Figura 16 A e para o tempo de vôo ou largura de pulso, a Figura 16 B, de uma forma de realização do sistema. A FIG 17 demonstra os dados de ponto de dispersão diferencial de célula branca obtidos a partir da mesma amostra como descrita na Figura 16 A e na Figura 16 B. Aqui, quando plotadas uma contra a outra, a extinção (eixo y) e a dispersão de ângulo reto (eixo x) mostram a separação de diversas partes da célula branca diferencial. A área indicada por a representa linfócitos, a área indicada por B representa monócitos, a área indicada por C representa neutrófilo (um subconjunto dos granulócitos) e a área indicada por D representa eosinófilos (um outro subconjunto dos granulócitos). As células eosinófilas presentes em D são responsáveis por 20,63 % do total, que está em excelente concordância com um método de referência de 21,70 % de eosinófilos. A FIG 18 demonstra uma varredura de espectrofotômetro da solução de corante de reticulócito, que podería ser representativo de 61, sem a presença de sangue. A FIG 19 A demonstra uma varredura de espectrofotômetro de lise de uma solução de sangue integral, que é lida a 540 nm para um método de referência de hemoglobina (ciano-hemoglobina). A Figura 19 B demonstra uma varredura de espectrofotômetro de lise de uma solução de sangue integral, que quando lida a 540 nm para uma hemoglobina, indica a óxi-hemoglobina e a 580 representa a desóxi-hemoglobina. A FIG 20 demonstra uma varredura de espectrofotômetro de solução de sangue integral diluída. A FIG 21 demonstra uma varredura de espectrofotômetro de uma lise de sangue integral e solução corante de reticulócito. A FIG 22 demonstra uma varredura de espectrofotômetro de uma solução de sangue integral diluída e de corante de reticulócito. A FIG 23 demonstra o rendimento do analisador de espectro de um laser de diodo que opera no modo único da Figura 23 A e no mesmo laser operando com modulação de alta freqüência, Figura 23 B. Os picos na Figura 23 A mostra níveis altos de ruído em muitas ffeqüências diferentes. Enquanto a linha de base para isto é excelente os picos de ruído de alta freqüência causam problemas significantes quando da tentativa de implementar uma medição de extinção e um sistema de coleta de dispersão sem lente. O efeito líquido é a contagem de evento falso e a quantificação inapropriada de altura ou área de pulso. O espectro do laser modulado em freqüência alta na Figura 23 B não tem um nível de linha de base tão baixo, mas não tem pontas altas. Isto ajuda a permitir a quantificação de extinção exata e a implementação de um sistema de coleta sem lente para os outros canais. A FIG 24 demonstra um ponto de ruído (quadrado médio da raiz) contra a temperatura para um diodo de laser dirigido por energia constante ou modo único e o mesmo dispositivo direcionado com modulação de alta freqüência. Isto mostra que um laser de modo único que é direcionado em uma energia constante, pode alcançar níveis de ruído nos ou abaixo daqueles de laseres modulados com freqüência alta em algumas faixas de temperatura. Assim, um laser de modulação de alta freqüência ou um controlado pela temperatura é capaz de permitir a quantidade de extinção precisa e a implementação de um sistema de coleta sem lente para os outros canais. Porque o custo de controlar a temperatura, é muito maior do que o custo de oscilar (modular) um laser, a forma de realização preferida é a modulação de alta freqüência. A FIG 25 é um diagrama de bloco dos eletrônicos do sistema. A FIG 26 é um diagrama de bloco dos eletrônicos de processamento de sinal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

PREFERIDAS A presente invenção divulga um sistema hematológico com base na citometria de fluxo que é capaz de determinar pelo menos uma contagem sangüínea completa (CBC), um diferencial de célula sangüínea branca de cinco partes e uma contagem de reticulócito. O sistema tem alto nível de confiabilidade e utiliza volumes muito baixos de reagentes de método. O sistema é muito barato para construir e ainda é utilizável sem a necessidade de níveis significantes de treinamento de operador. O sistema é particularmente bem adaptado para o uso em ambientes onde existe uma necessidade para um instrumento que possa analisar grandes números de amostras de sangue rapidamente e de modo barato e forneça uma análise de sangue completa para cada amostra. Tais ambientes podem incluir, por exemplo, clinicas médicas, consultórios médicos e consultórios veterinários. O sistema hematológico com base na citometria de fluxo da presente invenção combina um sistema de detecção ótico sem lente único com o uso de tubos consumíveis que contêm partículas de referência que são usadas para a padronização ótica e para checar se o instrumento está realizando as diluições corretamente. O sistema também utiliza um laser de diodo tendo uma certa forma de feixe que é crítica para a operação bem sucedida do sistema. O uso de um laser de diodo para a análise de biopartícula nos sistemas com base na citometria de fluxo tem sido até agora amplamente evitado, devido à propensão destes sistemas para exibir fenômeno de ruído periódico. Os presentes inventores descobriram que tais problemas podem ser superados através do uso de uma técnica de modulação de alta freqüência, debatida em maiores detalhes abaixo. A combinação destes elementos cria um sistema que é muito mais baixo em custo e superior em confiabilidade do que os sistemas de hematologia com base na citometria de fluxo existentes e que podem medir pelo menos uma contagem sangüínea completa (CBC), uma contagem de célula sangüínea branca diferencial de cinco partes e uma contagem de reticulócito, sem a necessidade para as medições de fluorescência ou absorção de luz. Entretanto, o sistema da presente invenção não está impedido de incorporar as medições de fluorescência ou de absorção de luz para medir um ou mais parâmetros desejados, como aqui descrito.

TUBO CONSUMÍVEL O primeiro item a ser considerado como parte do sistema hematológico com base na citometria de fluxo da presente invenção é o tubo consumível. Cada tubo consumível tem um rótulo codificado único, como cada tubo colocado no instrumento. Preferivelmente, o rótulo codificado é um rótulo codificado por barras. O tubo consumível contém um ou mais tipos distintos de partículas que são usados para as checagens da quantificação por contagem, bem como para a padronização ótica. Cada lote de reagentes é aliquotado nos tubos consumíveis, junto com um número definido de partículas de referência. Tais partículas de referência são conhecidas por aqueles na técnica e podem ser, por exemplo, grãos de pólen, células fixas ou partículas de látex. A chave para selecionar as partículas apropriadas para o sistema é que as partículas devem ser distinguíveis das células alvo da amostra, em pelo menos um dos eixos de medições óticas. As partículas de látex têm um índice diferente de refração do que os componentes celulares e muitos tamanhos de partículas de látex estão comercialmente disponíveis. No caso de partículas de 4,1 mícrons, estas são distinguidas das células sangüíneas vermelhas e das plaquetas em canais de extinção (EXT), dispersão de luz para a frente de ângulo baixo (FSL) e dispersão de ângulo reto (RAS), mas sobrepõe-se com as células sangüíneas vermelhas nos canais de dispersão de luz para a frente de ângulo alto (FSH) e de tempo de vôo (TOF). Funcionalmente, não importa que o eixo tenha a melhor separação da(s) partícula(s) de referência. Contanto que pelo menos um dos cinco canais mostre separação, a população de partículas inteira pode ser desviada e analisada completa e separadamente de qualquer um dos componentes celulares da amostra.

As células sangüíneas vermelhas fixas de uma variedade de espécies diferentes são freqüentemente utilizadas como partículas de referência. Estas células pode ser completamente ocultas em todos os canais durante a análise de célula sangüínea vermelha e portanto podem não ser apropriadas para o uso na detecção e contagem de células sangüíneas vermelhas. Entretanto, elas são ainda utilizáveis na detecção e contagem de células sangüíneas brancas, porque visto que o processo de fixação as tomam imunes aos sistemas de lise, elas podem ser facilmente distinguidas em todos os canais durante a análise da célula branca. As células sangüíneas vermelhas fixas da espécie aviária oferecem a característica adicional de ter um núcleo, que ajuda a distingui-las das células vermelhas de mamífero exclusivamente pela dispersão de ângulo reto.

As partículas de referência interna devem ser usadas em concentração conhecida e devem atuar como um substituto celular. Este substituto deve ter propriedades tais que o instrumento em pelo menos uma técnica de medição possa distingui-las unicamente dos constituintes celulares da amostra. Este substituto celular atua como uma intra-amostra, padrão interno com propósitos de controle da qualidade. Isto garante que as medições do instrumento sejam apropriadamente realizadas e que todas as diluições sejam feitas apropriadamente. A forma de realização preferida deste substituto são partículas de poliestireno. Entretanto, outras partículas, tais como pólen, vidro, células fixas ou colóides grandes podem ser usados, contanto que as condições acima sejam satisfeitas. A faixa de tamanho da partícula é preferivelmente de cerca de 1 mícron a cerca de 10 mícrons e têm características óticas que as separam unicamente das plaquetas, células brancas e células vermelhas em pelo menos um eixo de medição do instrumento.

As partículas de poliestireno são comercialmente disponíveis através de diversos fabricantes, tais como Seradyn e Duke. O tamanho preferido é 4,0 mícrons, que é facilmente distinguido dos componentes celulares do sangue ao longo dos diversos eixos de coleta de dados no instrumento. A escolha deste tamanho para as partículas permite que a concentração da partícula seja facilmente determinada. Os sistemas de reagente dentro do consumível são sensíveis a uma medição de sólidos percentual (o volume da partícula vezes a concentração de partículas); assim, quanto mais baixo o volume escolhido, mais alta a concentração de partículas e mais ampla a faixa que pode ser praticada. A forma de realização preferida é ter a concentração de partículas no consumível em 10.000 por μΐ. Neste nível, o número de eventos de partícula de referência contados estará dentro da mesma faixa como o número de células sangüíneas brancas contadas. A concentração das partículas e as suas características óticas são determinadas por um método de referência. As características das partículas, tais como contagens por microlitro para cada tipo de partícula, o sinal médio para uma medição ótica para cada tipo de partícula e o coeficiente de variação para uma medição ótica para cada tipo de partícula, são obtidas. Uma pessoa de habilidade na técnica pode avaliar que outros parâmetros associados com cada tipo de partícula também podem ser medidos e vantajosamente usados no sistema da presente invenção, como desejado e a presente invenção não está intencionada a ser limitada de qualquer modo aos parâmetros específicos listados acima. A partir desta informação, um rótulo de código de barra cifrado é gerado que dá referências de qualquer um ou de qualquer combinação de pelo menos os seguintes parâmetros: 1. Tipo de teste 2. Número do Lote 3. Data de expiração 4. Número de série 5. Concentração da Partícula 1 (expressa em termos do número de partículas x 103 / μΐ) 6. Concentração da Partícula 2 (expressa em termos de número de partículas x 103 / μΐ) 7. EXT média da Partícula 1 8. EXT média da Partícula 2 9. FSL média da Partícula 1 10. FSL média da Partícula 2 11. FSH média da Partícula 1 12. FSH média da Partícula 2 13. RAS média da Partícula 1 14. RAS média da Partícula 2 15. TOF média da Partícula 1 16. TOF média da Partícula 2 17. EXT CV da Partícula 1 18. EXT CV da Partícula 2 19. FSL CV da Partícula 1 20. FSL CV da Partícula 2 21. FSH CV da Partícula 1 22. FSH CV da Partícula 2 23. RAS CV da Partícula 1 24. RAS CV da Partícula 2 25. TOF CV da Partícula 1 26. TOF CV da Partícula 2 27. Densidade ótica do fluido a 488 nm 28. Densidade ótica do fluido a 540 nm 29. Densidade ótica do fluido a 580 nm 30. Densidade ótica do fluido a 635 nm Para cada tipo de partícula usada no sistema uma tabela de valores de referência é gerada e armazenada no PC ligado ao instrumento. A tabela de valores de referência pode conter, como parâmetros, um ou mais dos seguintes: 1. Número da Partícula 2. EXT média 3. FSL média 4. FSH média 5. RAS média 6. TOF média 7. EXT CV

8. FSL CV

9. FSH CV

10. RAS CV

11. TOF CV

Como um exemplo, as partículas de látex de 4,1 mícrons adotadas são designadas de partícula 7. Os seguintes valores de referência associados com estas partículas de referência podem ser armazenados no PC: 1. Partícula = 7 2. EXT média = 520 3. FSL média = 430 4. FSH média = 824 5. RAS média = 941 6. TOF média = 252 7. EXT CV = 3,1 8. FSL CV = 2,9 9. FSH CV = 4,2 10. RAS CV = 7,9 11. TOF CV = 2,1 Adicionalmente, para cada corante que é usado no sistema, existe um espectro de absorção de luz característico associado que também é armazenado em uma tabela no PC ligado ao sistema. Para cada lote, o fluido corante será testado quanto a absorção em um ou mais comprimentos de onda característicos destes espectros, isto é, um comprimento de onda em que a absorção do corante esteja em um ponto máximo ou mínimo ou que seja unicamente identificado com o corante. Como um exemplo, um reagente que contém um corante pode ser testado quanto a absorção nos seguintes comprimentos de onda: 1. Densidade ótica do fluido a 488 nm 2. Densidade ótica do fluido a 540 nm 3. Densidade ótica do fluido a 580 nm 4. Densidade ótica do fluido a 635 nm A medição a 635 nm é útil para detectar corantes azuis, que absorvem a luz neste comprimento de onda. A hemoglobina absorve fortemente a luz verde, de modo que uma medição a 540 nm é usada para medir a concentração de hemoglobina. As medições a 580 nm são úteis para detectar os produtos de alguns ensaios químicos clínicos, que absorvem a luz amarela. Finalmente, uma medição a 488 nm é útil como um comprimento de onda de calibração verdadeira, visto que nem a hemoglobina nem qualquer um dos corantes de reticulócito habitualmente usados absorvem neste comprimento de onda e assim interferem minimamente com esta medição.

Como um exemplo, o azul de metileno novo adotado é designado de corante 3 e tem os seguintes valores de absorção na tabela de referência: 1. Densidade ótica do fluido a 488 nm = 0,85 2. Densidade ótica do fluido a 540 nm = 0,62 3. Densidade ótica do fluido a 580 nm = 0,73 4. Densidade ótica do fluido a 635 nm = 0,20 Agora adotando-se que o quarto lote de tubos para os testes de CBC, fabricados em março de 2001 (4c01) que expiraram em 2 anos (2), contém dois conjuntos diferentes de partículas de referência. O primeiro conjunto de partículas de referência provê com referência a entrada 7 da tabela, que se refere às partículas de 4,1 mícrons a uma concentração de 1.200 partículas por microlitro (0712). O segundo conjunto de partículas de referência provê com referência a entrada 25 da tabela, que se refere a uma partícula de célula fixa a uma concentração de 32.500 por microlitro (25325), em uma nova solução de azul de metileno, que é a entrada D da tabela (d). Os tubos consumíveis que contêm a solução descrita acima são postos em série de 0 a 50.000. Assim, os seguintes códigos de barra pode ser criados: 4c012071225325d00000 até 4c012071225325d50000 Este exemplo de código de barra de referência é para demonstração. Pode ser óbvio a uma pessoa de habilidade na técnica que o número de dígitos pode ser significantemente reduzido sem a perda de informação.

Colocando-se estes códigos de barra nos tubos consumíveis proverá o sistema com a informação necessária para realizar as determinações de controle de qualidade nas amostras individuais para mostrar que as diluições foram feitas apropriadamente e que todas as medições óticas foram precisas.

Como um exemplo do uso dos dados codificados por barra nas determinações do controle de qualidade, adota-se que quando uma diluição de RBC é feita, o volume de reagente do consumível é diluída pela metade. Assim no exemplo acima, a contagem de célula fixa durante esta parte de contagem de RBC deve ser 16.250 (32.500/2). Se a contagem de célula fixa não está dentro de uma faixa de tolerância em tomo de 16.250, os resultados contados não serão reportados. Similarmente, visto que o sistema supõe que partículas de látex de 4,1 mícrons estejam no tubo consumível, uma contagem de 600 (1200/2) confirmará uma diluição correta. Entretanto, se uma diluição incorreta é detectada, o sistema pode comparar o valor obtido para as partículas de célula fixa com aquele obtido para as partículas de látex. Se o desvio relativo dos valores esperados são os mesmos para cada medição de partícula, então um erro de diluição é suspeitado. O sistema também pode prover com referência os valores óticos esperados nas tabelas, que são independentes de diluição. As comparações dos dados das médias e dos coeficientes de variação (CV) das partículas, quando são comparados com as tabelas de referência, permitem uma determinação de se um erro de diluição ocorreu e também dá discernimento de quanto as características de alinhamento ótico, estabilidade da energia do laser e direção de fluxo. Como com o exemplo de diluição, se os dados de dispersão da luz recuperados não se igualam aos dados esperados dentro de uma tolerância pré ajustada, alguma ou toda da análise de classificação de célula não será reportada. Neste modelo, uma mensagem de erro precisa pode ser mostrada ao operador que auxiliará nas medidas de remediação apropriadas. Além disso, o sistema pode gravar o seu desempenho com o tempo e manter uma base de dados do desempenho do sistema com o tempo para registrar as tendências no sistema. Com base nos dados obtidos e nas tendências recentes, as recomendações de manutenção, recalibração ou técnicas de reparo de defeitos podem ser automaticamente geradas.

SISTEMA DE DETECÇÃO ÓTICA A LASER E SEM LENTE

Para se obter dados razoavelmente precisos de qualquer sistema hematológico com base na citometria de fluxo, as células individuais ou partículas devem passar individualmente através da zona de senso de uma célula de fluxo. Para se obter isto usando contadores de célula de impedância padrão, o sangue integral é usualmente diluído da ordem de 1:10.000, por causa do volume grande da zona de senso da abertura da célula de fluxo (isto é, 60 mícrons de largura por 100 mícrons de comprimento). Um sistema de hematologia com base na citometria de fluxo, entretanto, pode funcionar em concentrações mais altas de sangue integral porque a zona de senso nos instrumentos típicos é usualmente em tomo de 10 mícrons de largura (fluxo de núcleo) por 20 mícrons de comprimento (altura do feixe de laser). Conseqüentemente, as diluições de sangue integral da ordem de 1:500 a 1:1.000 podem ser usadas.

Para o tubo consumível descrito acima, a diluição de sangue integral ideal é de 1:100 para a análise de RBC’s, que utiliza menos do que 20 % do volume do tubo consumível. Isto deixa 80 % ou mais do volume do tubo para realizar uma diluição de WBC e um enxágüe final do sistema (câmara de resíduo). Para se obter isto, a zona de senso deve ser ainda comprimida a partir dos métodos correntemente disponíveis. Isto pode ser realizado de duas maneiras. A primeira é controlar a taxa de fluxo da massa até muito baixa, mas taxas compatíveis (0,05 microlitros por segundo), para manter o fluxo de núcleo da ordem de 7 mícrons de largura. A segunda é limitar a altura do feixe de laser até em tomo de 3 mícrons.

Isto foi realizado através do uso de um sistema emissor de linha de laser de diodo, como descrito no Pedido de Patente pendente US N2 09/*******. O aparelho contém um laser semicondutor que produz saída de luz que é orientada nos eixos primeiro e segundo mutuamente perpendiculares que são ambos perpendiculares à direção de propagação da luz. O aparelho também inclui um sistema ótico que é disposto de uma maneira de modo a focalizar a saída do laser nos eixos primeiro e segundo nas partes focais primeira e segunda que são espaçadas na direção da propagação da luz de laser. Em um plano que intercepta cada um dos pontos focais, a luz é formada em uma linha tendo uma largura em um eixo e um comprimento no outro eixo.

Os citômetros de fluxo clássicos e os sistemas hematológicos com base na citometria de fluxo coletam a luz que é dispersa a partir das células em uma variedade de ângulos. Estes sistemas convencionais utilizam uma lente de coleta que produz a imagem do fluxo de núcleo, coleta toda a luz dispersa a partir de um componente celular de uma amostra e depois a passa através de uma abertura que determina o ângulo de coleta. Esta luz filtrada é depois focalizada para baixo para um fotodetector, que coleta o cone de luz dispersa inteiro nos ângulos desejados. Se mais do que um ângulo para a frente de coleta de luz é desejado, divisores de feixe e espelhos são usados para separar cones de luz distintos. Para a coleta de dispersão de ângulo reto, convencionalmente uma lente é usada para produzir a imagem na direção de fluxo, de modo a manter baixo os níveis da luz de fundo.

No método planejado sem lente, detectores, sem qualquer lente anexa ou outros elementos óticos, são fixados no espaço para coletar os sinais apropriados induzidos pela célula que passa através do feixe de laser. Estes sinais incluem a extinção (EXT) (0o a -0,5°); a dispersão para a frente de ângulo baixo (FSL) (~1° a ~3°); a dispersão para a frente de ângulo alto (FSH) (~4° a ~9°); e dispersão de ângulo reto (RAS) (-50° a -130°). De modo a coletar três medições diferentes em ângulos baixos do caminho do feixe de laser, a ótica que forma feixe forma dois focos da luz do laser de diodo. Ver o Pedido de Patente copendente US N2 09/*******, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência. O primeiro foco é o plano no qual a luz de laser intercepta o fluxo de núcleos de células / partículas. Este foco é perpendicular ao plano de percurso das células e às dispersões da luz devido à passagem das células ortogonalmente através do centro fino (plano focal) de um feixe largo.

Como um resultado de se ter um feixe com uma altura mínima (isto é, uma dimensão mínima na direção do fluxo de partícula através da célula de fluxo), grandes números de células, em concentrações altas, podem ser analisados sem a interferência dos eventos coincidentes. Isto minimiza os volumes d e líquido e a necessidade para manusear grandes volumes de líquidos. Além disso, este arranjo produz uma distribuição de energia luminosa alta nas células neste primeiro foco, de modo que a dispersão de ângulo reto da luz (RAS) possa ser medida usando-se um detector muito menos caro do que aquele que é utilizado nos sistemas convencionais. Em particular, um fotodiodo pode substituir o uso de um tubo fotomultiplicador. A distribuição de energia horizontal permite que a corrente de fluxo vagueie naquele eixo sem impulso apreciável e ainda minimiza a dispersão da luz das bordas da célula de fluxo mantendo-se a distribuição da energia luminosa paralela à célula do canal de fluxo. O segundo foco está no plano onde os detectores são colocados. Aqui, a parte de feixe amplo da célula de fluxo é reduzida para baixo até um mínimo (isto é, é focalizada) e a luz que passou através do primeiro foco expandiu, formando uma linha longa de luz tendo uma certa altura. Dentro desta linha longa de luz, um detector de fotodiodo é colocado no ponto onde o nível de luz é maior. Este é o detector de extinção (EXT), que mede toda a luz axial que é perdida (a soma da luz absorvida e da luz dispersa) conforme a célula cruza o feixe de laser. Esta medição mantém uma parte enorme de informação, mas esta informação pode ser extraída apenas quando existe uma relação de sinal para ruído (S/N) alta. Os laseres a gás convencionalmente utilizados nos sistemas de hematologia com base na citômetro de fluxo produzem sinais fortes, mas níveis altos de ruído associados com estes laseres têm minimizado a sua utilidade para as medições de EXT. Estes podem ser compensados pela utilização de tubos de plasma mais longos, quanto mais longo o tubo de plasma mais baixo o nível de ruído e assim maior a relação S/N. Os laseres de diodo têm inerentemente níveis de ruído mais baixos do que os laseres a gás, mas exibem níveis altos de ruído periódicos. Estas explosões intermitentes de ruído são chamadas de “ajuste de modo”. As mudanças sutis de temperatura ou de corrente elétrica fazem com que o diodo de laser mude abruptamente de um estado de modo único para outro estado de modo único. Quando saltos de modo ocorrem, a relação S/N da medição de extinção é muito baixa, tomando-a inútil para a medição de partículas pequenas ou para distinguir diferenças sutis nas maiores.

Para eliminar os saltos de modo, o controle cuidadoso da temperatura e o controle preciso da corrente podem ser implementados. Se isto é feito, cada diodo de laser deve ser individualmente caracterizado para se encontrar uma área de temperatura/corrente calma onde os saltos de modo não ocorram. Esforços laboriosos devem ser incorridos para caracterizar cada diodo de laser individual, para os ajuste de temperatura e corrente ideais. Além disso, visto que o laser fica velho, a área de temperatura/corrente calma muda e reajusta os controles de temperatura e corrente. Além disso, mesmo se a temperatura apropriada é determinada, quando um laser de diodo é primeiro ligado, ele gera o seu próprio calor. O equilíbrio da temperatura do laser de diodo pode levar até 30 minutos para estabilizar. Este tempo de equilíbrio diminui a vida útil do laser. Por fim, a implementação do controle de temperatura limita gravemente as temperaturas de operação em que uma unidade pode ser usada e adiciona custo e tamanho significantes a um diodo de laser relativamente barato e pequeno.

Para se obter as medições da extinção exatas usando-se um laser de fotodiodo, a modulação de alta freqüência pode ser utilizada. A modulação de alta freqüência elimina os saltos de modo permitindo que o laser exista em um estado de modo múltiplo. Quando a temperatura ou a corrente mudam, o modo primário do diodo muda, mas visto que o laser de diodo está funcionando em muitos modos em primeiro lugar, estas mudanças não produzem qualquer ponta de ruído. Além disso, a freqüência de modulação pode ser escolhida para ser muito, muito maior do que as freqüências de interesse para os eventos celulares, de modo que a modulação é invisível para o sistema. A modulação de alta freqüência resolve os problemas associados com o uso do controle de temperatura e corrente tratando-se do salto de modo. Um sistema de modulação de alta freqüência é estável dentro de segundos, assim não existe nenhuma necessidade para controlar a temperatura gerada pelo laser de diodo na ativação. Assim, a vida útil do laser é prolongada. Além disso, diferente dos sistemas de esfriamento da temperatura, os sistemas de modulação de alta freqüência são estáveis em uma faixa grande de temperaturas de operação. Com a modulação de alta freqüência, não existe nenhuma necessidade para encontrar a área de temperatura/corrente calma e nenhuma necessidade para reajustar o equipamento conforme o laser fica velho. Assim, o custo de trabalho incorrido na descoberta e manutenção de uma área de temperatura/corrente calma para o laser de diodo é evitado. A modulação de alta freqüência é imposta em um laser de diodo da seguinte maneira. Um laser de diodo que funciona no modo de comprimento de onda (CW) contínuo tem um fotodiodo incorporado que é usado para a retroalimentação, de modo que a energia não varia com a temperatura. Este circuito muda a entrada de corrente para o diodo do laser de modo que a energia luminosa é mantida constante. Em uma forma de realização, o ponto de fixação do CW do acionador do laser é ajustado de modo que produza metade da saída de energia calculada do laser. Em seguida, um circuito de modulação, que usa um oscilador de cristal para produzir uma corrente elétrica com um saída de onda senoidal, é “somada” com a corrente CW. Como um resultado, a saída de energia do laser toma uma forma de onda senoidal, com um máximo de energia próximo do nível de energia calculado máximo do laser no pico da onda senoidal e quase energia zero no mínimo da onda senoidal.

Visto que o feixe de laser converge para um foco no plano detector, a dispersão da luz de ângulo baixo (FSL) pode ser escolhida em distancias lineares pequenas do eixo do feixe convergente sem a necessidade para lentes, como é requerido nos sistemas convencionais. A FSL pode ser usada para medir os tamanhos da partícula. A FSL é medida colocando-se um fotodetector de FSL tão próximo do fotodetector de EXT quanto seja fisicamente possível. Isto pode ser feito com fotodiodos diferentes ou com uma série de fotodiodo que seja é apropriadamente dimensionada para as duas medições independentes (EXT & FSL). A informação que diz respeito ao índice de retração e a complexidade interna das partículas é obtida usando-se ângulos de dispersão de luz avançada (FSH) maiores. Esta medição de dispersão é feita no geral na região de cerca de 4o a 9o, medida a partir do eixo do laser. Esta medição pode ser feita sem o uso de lentes posicionando-se um fotodiodo diferente para coletar aquela área de dispersão da luz ou usando-se uma série de fotodiodo com componentes ativos que correspondam à geometria apropriada. Em uma forma de realização, uma série de fotodiodo é feita de modo que seja eficaz para medir EXT, FSL e FSH, todas na mesma série.

No sistema da presente invenção, o fotodetector está preferivelmente na forma de uma fotossérie em um chip único, com os detectores espaçados e orientados para coletar a luz dispersa nos ângulos apropriados. Esta configuração permite que três ou mais medições independentes sejam feitas, sem a exigência de quaisquer lentes de coleta ou produção de imagem. Embora a série de fotodetector tenha sido descrita para a coleta de EXT, FSL e FSH, tal série pode ser prolongada a ângulos de coleta tão altos quanto ~40°. Acima deste valor, o canal do fluxo quadrado pode interferir com as medições.

Para garantir o alinhamento de todos os diodos nos ângulos apropriados e para coletar apenas os ângulos puros de interesse, uma máscara, que atua como um filtro de luz, pode ser colocado sobre os diodos diferentes ou a série de fotodiodo. Esta máscara preferivelmente tem aberturas com formas curvas, para preservar os ângulos verdadeiros de dispersão da luz cobrindo-se os cantos de qualquer fotodiodo quadrado ou retangular que sejam usados. Uma máscara fabricada com precisão da geometria apropriada, que é fixada nos fotodiodos, reduz a exigência para o alinhamento ótico do conjunto de diodos múltiplos a apenas o alinhamento do diodo detector de EXT, simplificando assim a construção e calibração.

Este conjunto de fotodiodos mascarados é preferivelmente posicionado tal que o sensor de extinção tenha o nível máximo de luz incidente, isto é, no segundo foco do feixe de luz de laser. A posição do fotodiodo de dispersão de ângulo reto (RAS) é essencial para preservar uma abertura numérica alta, que apenas pode ser alcançada sem o uso de uma lente. Portanto, o fotodiodo é fixado próximo à célula de fluxo, paralelo ao plano do laser. Toda a luz que é ortogonalmente dispersa pela célula ou partícula voltada para um dos lados da célula de fluxo intercepta o fotodiodo de RAS. Isto dá ângulos de aceitação ortogonal de -50° a 130° ou uma abertura numérica (NA) de 0,9.

Este fotodiodo RAS de abertura numérica alta ocupa uma face lateral inteira da célula de fluxo, de modo que nenhuma outra medição pode ser feita neste lado da célula de fluxo. Entretanto, a face oposta do detector de RAS está ainda disponível e pode ser usada para se obter outras medições. Por exemplo, este lado da célula de fluxo pode ser usado para gerar dados de citômetro de fluxo fluorescente padrão, utilizando-se detectores capazes de detectar a luz fluorescente emitida. Este lado também pode conter um ou mais dos seguintes: uma lente de coleta (abertura numérica baixa) que produzirá a imagem da direção do fluxo no centro da célula de fluxo; divisores de fluxo e filtros de interferência, para separar diversos eixos de informação fluorescente; lentes que produzem imagem para focalizar a luz em um detector; e tubos foto multiplicadores para detectar níveis baixos de emissões florescentes. O uso de um sistema de detecção de luz sem lente elimina a necessidade de elementos óticos associados, tais como lentes, obstáculos e espelhos. O sistema de detecção de luz resultante é significantemente menor, mais leve, menos caro e mais seguro do que os sistemas de detecção de luz convencionais que contam com tais elementos óticos para direcionar feixes de luz dentro do instrumento.

Uma desvantagem de usar um sistema de coleta de luz sem lente é que a luz extraviada facilmente entra nos detectores. As lentes são convencionalmente usadas para direcionar a luz que produz imagem do fluxo de núcleo, de modo que apenas a luz que emana do fluxo de núcleo entra em um detector. As lentes também são usadas para focar a luz coletada de ângulos de cone completo abaixo de um ponto onde um pequeno fotodetector é colocado. O uso de um fotodetector relativamente pequeno minimiza o ruído de corrente escura, que é proporcional à área do fotodiodo. Entretanto, visto que um sistema sem lente mantém um nível constante de luz da luz de fundo em todos os detectores no sistema, uma linha de base de ruído de corrente escura não é obtenível. O fundo constante de luz nos fotodiodos gera uma foto-corrente constante, nos eletrônicos de processamento de sinal. Esta foto-corrente constante eletronicamente é análoga à corrente contínua ou CC, assim o sistema sem lente gera um nível de luz CC em cada fotodiodo. Assim, é mais difícil com tal sistema sem lente eliminar a contribuição do nível de luz CC e impossível de se obter o ruído de corrente escura mínimo r do fotodetector. E entretanto necessário que a luz CC não interfira com os sinais gerados pelas células ou partículas. Isto é eletronicamente realizado com o uso de um servo circuito de retroalimentação, de modo que as partes de sinal desejadas (corrente alternada ou componente AC) possam ser medidas acuradamente e com reprodutibilidade, independente da mudança de temperatura, mudança da energia do laser ou outra mudança ambiental ou eletrônica que possa afetar o nível da luz CC.

De modo a manter as saídas em um valor de linha de base quando nenhum sinal está presente existe uma servo volta local para cada um dos circuitos preamp associados com os canais óticos (EXT, FSL, FSH, RAS). As correntes escuras de fotodiodo, entradas de correntes enviesadas ou voltagens compensadas podem causar desvios ou tendências nas saídas dos circuitos preamp. Existem dois métodos de retroalimentação usados nos preamps. O primeiro método consiste de um FET de Canal P com a sua porta conectada à saída do segundo estágio. Devido à corrente escura maior do sensor de EXT, uma voltagem de retroalimentação de FET para o conversor de corrente é usada para manter a impedância alta na junção de adição do primeiro estágio op-amp. O resistor de retroalimentação produz uma corrente proporcional à voltagem na saída do segundo estágio. O segundo método de retroalimentação usa um op-amp configurado como um integrador para retomar uma proparte do retro sinal para o primeiro estágio op-amp para reduzir os níveis de desvio através do primeiro e segundo estágios op-amp. As servo voltas locais reduzem os sinais de baixa freqüência. A equação (1) pode ser usada para determinar a freqüência de canto em que a servo volta fornecerá atenuação (-3dB).

Equação (1) £3<íb = Rdiodo * G2/(2 π Rt Rf Cf) onde Rdiodo = Resistor de retroalimentação através do primeiro estágio op-amp G2 = Ganho do segundo estágio Rt = Corrente para o resistor de conversão de Voltagem Rf = Servo resistor de entrada Cf = Servo capacitor de integração MÓDULO HGB A concentração de hemoglobina é um parâmetro de hematologia muito comum que é no geral medido pela absorção de luz a 540 nm. Para realizar esta medição, as células sangüíneas vermelhas são no geral lisadas em uma solução que contenha 1 parte de sangue integral para 250 partes de solução. Esta solução no geral também contém um nível baixo de um sal de cianeto (isto é, KCN). O cianeto reduz toda a hemoglobina (óxi- e desóxi-) para hemoglobinacianeto, que absorve em máximo a 540 nm. Esta medição de absorção é convencionalmente feita em uma cubeta de 1,0 cm quadrado (NCCLS), mas outras variantes do padrão também trabalham com correlação alta ao método de referência.

Nos instrumentos de hematologia convencionais, a concentração de hemoglobina é no geral medida em uma solução de outro modo clara e é sempre aludida como um fluido claro. A lise de células vermelhas permite que a hemoglobina seja medida no mesmo canal fluídico como as células sangüíneas brancas. Altemativamente, em alguns sistemas, o teor de hemoglobina é medido em um canal separado.

No instrumento da presente invenção, o teor de hemoglobina (HGB) é medido de uma maneira não convencional. O método da presente invenção envolve duas medições separadas, que não apenas se combinam para dar um valor de HGB preciso, mas também verificam a precisão da diluição que o sistema fez. A primeira medição de HGB ocorre depois que uma parte do sangue integral é diluída 100 vezes com uma solução de tingimento de reticulócito. Esta é chamada de a “solução de célula vermelha”. Esta solução de tingimento de reticulócito tem um espectro de absorção específico associado com ela. A solução de célula vermelha é aspirada em um bloco de distribuição. Este bloco contém pelo menos três fontes que emitem luz, configurados para iluminar um furo cilíndrico, onde a solução de célula vermelha é mantida. Fotodetectores são colocados em linha com a fonte de luz e o furo cilíndrico, com provisões para filtros de interferência. Esta configuração permite a medição de pelo menos três comprimentos de onda de absorção diferentes. Três comprimentos de onda de absorção diferentes são usados por causa da presença de um corante na solução de tingimento de reticulócito.

As medições de absorção iniciais da solução de célula vermelha não fornecem uma medição tão precisa da concentração de HGB como as outras técnicas convencionais. Entretanto, o valor desta medição consiste no seu uso como um ponto de dados para a determinação da precisão da diluição do sangue integral. Conforme o instrumento continua o seu ciclo depois de fazer a medição inicial da hemoglobina “não lisada”, as medições de RBC total e volume de célula médio são feitas na parte do citômetro do instrumento. Isto permite o cálculo do seguinte: • Hematócritos (HCT) = RBC * MCV /10 • Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (MCHC) = 100 * (HGB / HCT) • Hemoglobina Corpuscular Média (MCH) = HGB / RBC

Conforme o ciclo do instrumento continua, mais sangue integral é adicionado à solução original, bem com um agente lítico. O agente lítico destrói as membranas da célula sangüínea vermelha (lise), liberando a HGB para estar livre em solução. Isto produz aproximadamente 1 parte de sangue integral para entre 15 e 50 partes de solução, que é chamada de a “diluição de célula branca”. A solução de célula branca contém todo o corante da solução célula vermelha previamente medida. A concentração original da solução corante foi agora diluída por um fator entre 1:1 e 1:4, com um fluido oticamente claro. A solução de célula branca é aspirada no bloco de distribuição onde as medições de absorção múltipla são feitas e um valor de HGB calculado. A partir deste segundo valor de HGB, a HCT, MCHC e MCH podem ser recalculadas. Além do valor de HGB, a concentração de corante pode ser medida e comparada aos valores obtidos da solução de célula vermelha. Se, dentro de uma tolerância definida, as duas medições de HGB independentes (HCT, MCHC, MCH) se igualam e as relações de corante entre as duas soluções se igualam, o instrumento, pela medição, verificou se todas as suas diluições foram realizadas com precisão.

Os cálculos de HGB da célula sangüínea branca, devido à lise das RBCs, produz uma medição precisa da concentração de HGB. Os cálculos de HGB de célula sangüínea vermelha não são tão precisas quanto os cálculos de HGB da célula sangüínea branca, porque as membranas da célula vermelha intactas dispersam a luz. Entretanto, uma comparação das diferenças nas absorbâncias que são devidas ao corante que tinge o reticulócito em cada medição permite uma checagem da precisão das diluições. Isto é, a amostra que contêm RBCs não lisadas (a solução de célula vermelha) tem um certo nível de absorção de luz que é com base na concentração do corante no tubo consumível. Mais tarde no ciclo, a amostra que contêm RBCs lisadas (a solução de célula branca) é medida quanto a absorção de luz devido ao corante. Porque os caminhos hidráulicos para as análises RBC e WBC são comuns, a precisão das diluições pode ser determinada sem a necessidade para uma solução de referência separada. A faixa aceitável de relações das medições HGB é conhecida, sendo impressa em um rótulo em código de barra no tubo consumível ou de um código no rótulo em código de barra do tubo consumível que dá como referência um valor em uma tabela de relações armazenada no PC. Como uma segunda checagem da precisão das diluições, as medições de HGB também devem se igualar dentro de uma certa tolerância. De outro modo, um erro de diluição deve ser suspeito. O único caso em que o erro de diluição não poderia ser detectado é a situação altamente improvável em que erros de diluição idênticos são feitos em ambas as amostras.

Em uma forma de realização preferida do método acima, o código de barra no tubo consumível contém informação de referência nos valores esperados de absorção de corante para amostras não diluídas (CAL). O instrumento verifica esta informação para cada número de lote em uso.

Depois da primeira diluição, a solução de célula vermelha deve ter um valor de absorção de corante e um valor de concentração de HGB que caia dentro de um primeiro conjunto de faixas esperadas. Estas faixas devem ser o produto de CAL x um primeiro fator de diluição (Dl). Depois a segunda diluição, a solução de célula branca deve ter um valor de absorção de corante e uma concentração de HGB que caiam dentro de um segundo conjunto de faixas esperadas. Estas faixas deve ser o produto de CAL x Dl x um segundo fator de diluição (D2). Contanto que ambos os conjuntos de medição estejam dentro das faixas aceitáveis, os resultados das medições são reportadas sem as mensagens de erro associadas.

REAGENTES

Na determinação da composição celular de uma amostra de sangue, o instrumento da presente invenção utiliza pelo menos dois reagentes de método primários e um terceiro reagente de sistema. Estes três reagentes trabalham juntos para a primeira contagem e classificação de plaquetas e célula vermelhas e então, depois de mais manipulação de reagente, a contagem e classificação de células sangüíneas brancas. A contagem e classificação ocorrem em duas fases diferentes e em cada uma das duas fases diferentes as misturas de sangue-reagente são passadas através de um citômetro de fluxo e as células nas amostras são identificadas e contadas. Um reagente de método, designado RBC / reagente de método Retic, é colocado em um tubo de teste padrão, tampado, chamado de “consumível”. O consumível contém o seguinte: • Azul de metileno novo, em uma faixa de concentração de 0,1 a 0,5 grama por litro. Este componente serve para tingir o RNA residual nos reticulócitos de uma cor azul. A concentração preferida é 0,3 grama por litro. • Purafac-A-39-Pric, em uma faixa de concentração de 0,1 a 0,6 grama por litro. Este componente atua para modificar a forma bicôncava normal das células sangüíneas vermelhas, pela interação com a membrana celular e a hemoglobina interna, para formar células esféricas. A concentração preferida é 0,3 grama por litro. • Partículas de referência interna que têm uma concentração conhecida, que é nominalmente a 104 partículas por μΐ, mas pode 1 c ser usada em uma faixa de 10 a 10 por μΐ. • Tampões e preservantes. Os tampões e preservantes consistem de bicarbonato de sódio (preferivelmente 8,0 gramas por litro, mas pode variar de 6,0 a 10,0 gramas por litro); cloreto de sódio (preferivelmente a 3,1 gramas por litro); Tricina (preferivelmente a 1,8 grama por litro, mas variando de 1,0 a 5,0 gramas por litro); EDTA di-sódico (preferivelmente a 1,0 grama por litro, mas variando de 0,5 a 3,0 gramas por litro); etil parabeno (0,3 grama por litro) e metil parabeno (0,2 grama por litro). O pH desta solução deve estar em uma faixa levemente básica entre 7,2 e 8,9, com uma osmolaridade entre 275 e 294 miliosmoles e uma condutividade entre 11,0 e 13,0.

As partículas de referência interna devem ser usadas na concentração conhecida e são para atuar como um substituto celular. Este substituto deve ter propriedades tais que o instrumento em pelo menos uma técnica de medição possa distingui-la unicamente dos constituintes celulares da amostra. Este substituto celular atua como uma intra-amostra, padrão interno com propósitos de controle de qualidade. Isto garante que as medições do instrumento estão sendo realizadas de modo apropriado e que todas as diluições foram feitas de maneira apropriada. A forma de realização preferida deste substituto é partículas de poliestireno. Entretanto, outras partículas, tais como células fixas, pólen, vidro ou colóides grandes podem ser usados, contanto que as condições acima sejam satisfeitas. A faixa de tamanho da partícula é preferivelmente de cerca de 1 mícron a cerca de 10 mícrons e têm as características óticas que as separa unicamente das plaquetas, célula brancas e célula vermelhas em pelo menos um eixo de medição do instrumento. As partículas de poliestireno estão comercialmente disponível através de diversos fabricantes, tais como Seradyn e Duke. O tamanho preferido é 4,0 mícrons, que é facilmente distinguido dos componentes celulares do sangue ao longo de diversos eixos de coleta de dados no instrumento. A escolha deste tamanho para as partículas permite que a concentração da partícula seja facilmente determinada. Os sistemas de reagente dentro do consumível são sensíveis a uma medição da porcentagem de sólidos (volume de partícula vezes a concentração de partículas); assim, quanto mais baixo o volume escolhido, mais alta a concentração de partículas e mais ampla a faixa de concentrações de partículas que pode ser praticada. A forma de realização preferida é ter a concentração de partículas no consumível em 10.000 por μΐ. Neste nível, o número de eventos de poliestireno contados estarão dentro da mesma faixa como o número de células sangüíneas brancas contado. O segundo reagente de método é designado de “lise”. A lise atua para destruir as células sangüíneas vermelhas enquanto deixa as células sangüíneas brancas intactas. Neste modelo, as células sangüíneas brancas podem ser analisada, sem a interferência dos vastos números de células sangüíneas vermelhas. Este reagente pode ser embalado em um tubo de teste padrão, tampado, preferivelmente em uma forma que o permita ser usado com até cinqüenta testes de consumível separados. A lise preferivelmente contém: • Saponina, que pode ser usada em concentrações entre 6,0 e 20,0 gramas por litro. A concentração preferida é de 18 gramas por litro. • Tampões e preservantes, que consistem de sulfato de sódio (preferivelmente a 12,0 gramas por litro, mas eficaz em uma faixa de 10,0 a 16,0 gramas por litro); EDTA dissódico (preferivelmente a 1,0 grama por litro, mas eficaz de 0,5 a 3,0 gramas por litro); pro-clin 300 (preferivelmente a uma concentração de 0,5 ml por litro); e germabox II (preferivelmente a 1,0 ml por litro). Este pH deste reagente deve estar em uma faixa entre 4,2 e 5,2, com uma osmolaridade entre 235 e 285 miliosmoles e uma condutividade entre 14 e 16. O reagente do sistema primariamente atua como um diluente do sangue integral, como uma solução de revestimento e como um reagente de lavagem. O reagente do sistema também é chamado de “solução de revestimento”. A solução de revestimento desempenha diversas funções, tais como reagente de diluição do sangue integral, reagente de revestimento para a análise citométrica de fluxo, reagente de lavagem para o caminho hidráulico do instrumento e ajudante lítico para o reagente de lise para clarear as células sangüíneas vermelhas. O revestimento é preferivelmente embalado em um recipiente que manterá o bastante para rodar cinqüenta testes de consumível separados. O revestimento contém o seguinte: • Solução salina tamponada por fosfato (preferivelmente tendo uma osmolaridade de 25 miliosmoles, mas pode ser usada em uma faixa de 5 a 50 miliosmoles). • Tensoativo para ajudar tanto na limpeza dos componentes internos do sistema quanto para manter as superfícies internas umedecidas tendo bolhas de ar aderidas a elas. O tensoativo preferido é o Plurafac-A-39, que pode ser usado em uma faixa de 0,1 grama por litro a 0,3 grama por litro e preferivelmente a uma concentração de cerca de 0,1 grama por litro.

Além do Plurafac, outros tensoativos não iônicos tais como podem ser usados. • Preservantes Para criar automaticamente as diluições de sangue integral com os reagentes de método descritos, um sistema hidráulico e vários mecanismos são usados. O usuário apresenta ao instrumento um tubo consumível rotulado com código de barras, bem como uma amostra de sangue integral apropriadamente anti-coagulada. O instrumento lê a informação necessária a partir do código de barras, depois automaticamente retira uma alíquota de uma pequena quantidade de sangue integral no consumível, junto com um volume de solução de revestimento. Este idealmente cria uma diluição total de uma parte de sangue para 100 partes de solução (RBC / reagente retic e de revestimento), mas a diluição pode variar de 1:50 a 1:5.000.

Um volume conhecido desta solução é depois puxada para dentro do instrumento a partir do tubo consumível e movido para uma posição próxima da entrada da célula ótica de fluxo. A solução é depois passada, em uma razão de fluxo de massa lenta de menos do que 0,25 microlitros por segundo pela focalização hidrodinâmica, através de um sistema de detecção ótica, onde a dispersão da luz e a absorção da luz para células sangüíneas vermelhas, plaquetas e micropartículas individuais, bem como a absorção da luz por um corante na solução, são medidas.

Depois que a análise de célula vermelha/plaqueta está completa, o instrumento retira uma segunda alíquota, de quantidade maior de sangue integral no tubo consumível, junto com uma alíquota de lise e quantidades apropriadas de solução de revestimento, para formar uma diluição de preferivelmente uma parte de sangue para vinte partes de solução. Esta diluição pode variar de 1:10a 1:100. a intenção é fornecer uma solução que possa lisar as células sangüíneas vermelhas, mas mantém intacta as células brancas da amostra de sangue integral por um período de pelo menos um minuto.

Um volume conhecido desta segunda solução é depois puxada para dentro do instrumento a partir do tubo consumível e movida para uma posição próxima da entrada da célula ótica de fluxo. A solução é depois passada, a uma razão de fluxo de massa moderada de até cerca de um microlitro por segundo usando a focalização hidrodinâmica, através de um sistema de detecção ótica, onde a dispersão da luz e a absorção da luz para células sangüíneas brancas, micropartículas e corante individuais são medidas. A seguinte descrição descreve o sistema da presente invenção em relação às Figuras anexas. Será entendido por aqueles de habilidade na técnica que certas modificações podem ser feitas na invenção como descrito abaixo sem divergir do escopo ou espírito das reivindicações anexas. O usuário abre uma porta do sistema, quando ele está no estado PRONTO, que expõe as fendas de tubo abertas (Figura 7 fenda A e Figura 7 fenda B). Nestas fendas vazias, o usuário coloca um tubo consumível (60) e uma amostra de sangue integral, que contém um anti-coagulante (isto é EDTA, Citrato e Heparina). O usuário então fecha a porta. O sistema verifica a presença e a identidade dos dois tubos adicionados e move o carro que sustenta o frasco (70) de modo que o consumível seja posicionado sob o misturador (80). O motor 82 posiciona o misturador de modo que ele esteja em contato com o topo do tubo consumível (60). Girando-o em uma direção e depois revertendo a direção de mistura do tubo. Durante o processo de rotação, o rótulo de código de barra é lido que contém a informação de calibração do lote. Depois de misturar adequadamente o tubo consumível para homogeneizar as partículas, o carro 70 posiciona a amostra de sangue integral sob o misturador e de uma maneira similar mistura o tubo de sangue integral de modo a garantir a homogeneidade da amostra. O carro então posiciona o tubo de sangue integral por debaixo da agulha hidráulica 11 e da agulha pneumática 12. Pela movimentação do motor 81, as agulhas furam então o septo do tubo de sangue integral e continua a penetrar o tubo até que ambas as agulhas entrem em contato com a superfície do sangue. Isto garante que o orifício da agulha hidráulica 11 esteja completamente imersa, mas o orifício da agulha de ventilação pneumática 12 não esteja.

Abrindo-se a válvula 3 e movendo-se a seringa 6 puxa-se sangue extraído na ponta da agulha 11. Idealmente, 5 microlitros de sangue integral serão aspirados desta parte. A válvula 3 é depois fechada. As agulhas são depois retraídas da amostra de sangue integral do paciente. Conforme as agulhas são retiradas através do septo, as agulhas são esfregadas quase completamente limpas pelo septo. O carro 70 agora posiciona o tubo consumível 60 sob as agulhas. Como antes, movendo-se o motor 81, as agulhas 11 e 12 perfuram o septo do tubo consumível 60 e penetram o tubo até que ambas as agulhas entrem em contato com a superfície do reagente.

As válvulas 5 e 3 são então abertas, enquanto a seringa 7, que é enchida com o diluente do sistema começa a dispensá-lo. Esta empurra o sangue da ponta da agulha 11 e um volume de fluído de revestimento para dentro do consumível, que é agora representado por 61. Enquanto se realiza a dispensa, o motor 81 moveu as agulhas 11 e 12 para cima de modo a impedir o orifício da agulha 12 de entrar em contato com a solução. Esta solução é agora razoavelmente homogênea, mas para garantir a homogeneidade, as válvulas 3 e 5 são fechadas e as agulhas são retiradas de 61, que é então movido para a posição de mistura sob 80 e misturado por rotação, como descrito acima. Durante este processo a válvula 3 e a válvula 5 abrem e a seringa 7 cria um intervalo de ar na ponta da agulha. O tubo consumível 61 é em seguida colocado sob a agulha 11 e a agulha 12. Movendo-se o motor 81, as agulhas 11 e 12 perfuram o septo do consumível e penetram o tubo até que ambas as agulhas entrem em contato com a superfície da solução. A seringa 7 aspira então um volume conhecido de solução para dentro da ponta da agulha. As agulhas 11 e 12 são depois retiradas da solução, mas não são removidas do tubo consumível 61, pelo motor 81. Isto cria uma cápsula do sangue integral diluído na agulha 11. A seringa 7 empurra esta cápsula através do módulo de HGB 10, onde ela é avaliada quanto a absorção em quatro comprimentos de onda de luz separados. Tais dados espectrais estão representados na Figura 22. O volume da cápsula também pode ser avaliado aqui pela avaliação dos valores de absorção dos canais detectores, que mudam conforme os intervalos de ar em cada lado da cápsula passa através. A seringa 7 continua a empurrar a cápsula para além da válvula 3 e a posiciona próximo da válvula 5. A válvula 3 fecha enquanto a válvula 2 abre, em cujo ponto a seringa 7 reverte a sua direção e empurra a cápsula através da válvula 2, até a ponta da montagem de célula de fluxo 20. A válvula 2 então fecha e a válvula 4 abre, o que permite que as seringas 6 e 7 sejam enchidas a partir do reservatório de diluente do sistema 8. A válvula 5 então fecha, a válvula 1 abre e as seringas 6 e 7 dispensam muito lentamente. A solução de revestimento da seringa 7 é dispensada através de 21 e a cápsula de sangue integral diluído é empurrada pela seringa 6 até 20. Isto forma um fluxo de núcleo confinado no revestimento de sangue integral diluído em 25, que transporta o fluxo para o funil de célula de fluxo 22, onde as células são interrogadas pelas fontes de luz que emitem a partir da montagem ótica 41. Esta corrente de fluido passa completamente através da célula de fluxo 22 e na tubulação de 23, que é fixada à célula de fluxo 22 pela tampa da célula de fluxo 24. Este caminho leva ao sistema de resíduo 9.

Enquanto a corrente de fluido está passando através da célula de fluxo 22, a montagem ótica 41 ilumina as células do sangue integral diluído individualmente. As células passam através de um ponto focal ótico 34 do laser 30, que maximiza a energia incidente nas células. Este foco estreito é gerado pela lente 33. A luz efetuada pela passagem da célula através do ponto focal 34, muda as quantidades de luz que é incidente nos fotodiodos 42, 43, 44 e 45. Estas mudanças são capturadas pelos eletrônicos de processamento de sinal da Figura 26 e armazenadas por intermédio dos eletrônicos do sistema da Figura 25. Os exemplos de dados coletados desta maneira são mostradas nas FIGs 10 A a 10 D. A Fig 10 A, mostra os dados que foram coletados para o sinal de dispersão para a frente baixa (FSL), a partir do detector 45. A 10 B mostra dados, que foram coletados para o sinal de extinção ou perda de luz axial (EXT), a partir do detector 44. A Fig 10-C mostra os dados, que foram coletados para o sinal de dispersão de ângulo reto (RAS) ou detector 42. A Fig 10 D mostra os dados da largura de pulso que foram coletados dos sinais de dispersão para a frente baixa (FSL) ou detector 45, mas medida do tempo de vôo ou o tempo em que a célula está em frente do feixe de laser. Para as Figuras 10 A, 10 B, 10 C e 10 D, os picos mostrados por A representam eventos de plaqueta, os picos mostrados por B representam os eventos de partícula de látex e os picos mostrados por C representam os eventos de célula sangüínea vermelha. Estes mesmos dados são mostrados em uma forma de ponto de dispersão nas Figuras 11 A e 11 B. Para a Figura 11 A, os pontos na caixa A representam os eventos da partícula de látex e em 11 B, o círculo B representa os eventos de partícula de látex. Os dados de pontos de dispersão podem ser representados por qualquer par de até quatro detectores e tempo de vôo.

Os reagentes usados na criação desta diluição devem usar um corante de tingimento de RNA, tal como o azul de metileno novo, os dados podem ser ainda analisados examinando-se apenas as porções de sangue vermelho, C, nas Figuras 10 A a 10 D para avaliar os reticulócitos. Os histogramas de tal análise estão apresentados nas Figuras 14Ael4Be um ponto de dispersão está apresentado na Figura 15. A Figura 15 mostra uma população calculada de 1,72 %, que são os reticulócitos. Isto compara favoravelmente com um método de referência manual de 1,60 % de contagem de reticulócito.

Depois da contagem e classificação bem sucedidas da célula sangüínea vermelha, reticulócitos, plaquetas e látex, as agulhas 11 e 12 são retiradas do consumível 61. O carro 70 move a amostra de sangue integral de modo a posicioná-la sob as agulhas 11 e 12. Movendo-se o motor 81, as agulhas perfuram o septo do tubo de sangue integral e continua a penetrar o tubo até que ambas as agulhas 11 e 12 entrem em contato com a superfície do sangue. Isto garante que o orifício da agulha hidráulica 11 esteja completamente imersa, mas o orifício da agulha de ventilação pneumática 12 não esteja. Abrindo a válvula 3 e movendo a seringa 6, faz com que o sangue seja puxado para dentro da ponta da agulha 11. Idealmente, 100 microlitros serão aspirados nesta parte. A válvula 3 é então fechada. As agulhas 11 e 12 são depois retraídas da amostra de sangue integral do paciente. Conforme as agulhas 11 e 12 são retiradas através do septo, as agulhas são esfregadas quase completamente limpas pelo septo. O carro 70 agora posiciona o tubo consumível 61 sob as agulhas 11 e 12. Movendo-se o motor 81, as agulhas 11 e 12 perfuram o septo do consumível 61 e penetram o tubo até que ambas as agulhas 11 e 12 entrem em contato com a superfície da solução.

A válvula 5 e válvula 3 são abertas, enquanto a seringa 7, que é enchida com o diluente do sistema começa a dispensá-lo. Esta empurra os 100 microlitros de sangue através da ponta da agulha 11. Um volume de fluído de revestimento segue o sangue integral dentro do consumível, que é agora representado por 62. Durante a dispensa o motor 81 moveu as agulhas para cima, de modo a impedir que o orifício da agulha 12 entre em contato com a solução. As agulhas 11 e 12 são agora extraídas do tubo consumível 62 e o carro 70 se move para a posição da Figura 7 fenda C, que contém um tubo de reagente de lise, sob as agulhas 11 e 12. Movendo-se o motor 81, as agulhas 11 e 12 perfuram o septo do tubo de lise e continua a penetrar o tubo até que ambas as agulhas 11 e 12 entrem em contato com a superfície da lise. Abrir a válvula 3 e mover a seringa 6, puxa a lise para dentro da ponta da agulha 11. Idealmente, 100 microlitros de lise serão aspirados nesta parte, que são depois seguidos por um intervalo de ar. Removendo-se a agulha 11 da solução, depois movendo-se a seringa 6 cria-se este intervalo de ar. A válvula 3 é depois fechada. As agulhas 11 e 12 são depois retraídas do tubo de lise. Conforme as agulhas são retiradas através do septo, as agulhas são esfregadas quase completamente limpas pelo septo. O carro 70 posiciona o consumível 62 sob as agulhas 11 e 12. A válvula 5 e 3 são então abertas, enquanto a seringa 7, que é enchida com o diluente do sistema começa a dispensá-lo. Esta empurra os 100 microlitros de lise através da ponta da agulha 11. Um volume de fluído de revestimento segue estes para dentro do consumível, que é agora representado por 63. Durante a dispensa, o motor 81 moveu as agulhas para cima, de modo a impedir que o orifício da agulha 12 entre em contato com a solução. A solução no tubo consumível 63 razoavelmente homogênea, mas para garantir a homogeneidade, as válvulas 3 e 5 são fechadas e as agulhas são retiradas de 63, que é então movido para a posição de mistura sob 80 e misturada por rotação, como descrito acima. Durante este processo as válvulas 3 e 5 abrem e a seringa 7 cria um intervalo de ar na ponta da agulha. O consumível 63, é colocado sob as agulhas 11 e 12. Movendo-se o motor 81, as agulhas 11 e 12 perfuram o septo do consumível 63 e penetram o tubo até que ambas as agulhas 11 e 12 entrem em contato com a superfície da solução. A seringa 7 então aspira um volume de solução conhecido na ponta da agulha 11. As agulhas 11 e 12 são então retiradas da solução, mas não completamente do tubo consumível 61, pelo motor 81. Isto cria uma cápsula do sangue integral lisado na agulha 11. A seringa 7 puxa esta cápsula de sangue integral lisado através do módulo HGB 10, onde ele é avaliado quanto a absorção em quatro comprimentos de onda de luz separados. As células sangüíneas vermelhas foram lisadas neste caso, liberando a hemoglobina das células. Os dados de absorção podem ser mostrados pela Figura 19 A se cianeto foi usado no agente de lise, na Figura 19 B se apenas um agente lítico foi usados e pela Figura 21, se a lises da célula ocorreu na presença de uma tintura de reticulócito. O volume da cápsula também pode ser avaliada aqui avaliando-se os valores de absorção dos canais detectores, que muda conforme os intervalos de ar em cada lado da cápsula passa através. A seringa 7 continua a puxar a cápsula para além da válvula 3 e próximo da válvula 5. A válvula 3 fecha e a válvula 2 abre, em cujo ponto a seringa 7 reverte a sua direção e empurra a cápsula através da válvula 2, para a ponta da montagem de célula de fluxo 20. A válvula 2 então fecha e a válvula 4 abre, o que permite que as seringas 6 e 7 sejam enchidas a partir do reservatório de diluente do sistema 8. A válvula 5 então fecha, a válvula 1 abre e as seringas 6 e 7 dispensam muito lentamente. A solução de revestimento da seringa 7 é dispensada através de 21, e a cápsula de sangue integral lisado é empurrada pela seringa 6 até 20. Isto forma um fluxo de núcleo confinado no revestimento de sangue integral lisado em 25, que transporta o fluxo para o funil de célula de fluxo 22, onde as células são interrogadas pelas fontes luz de emissores da montagem ótica 41. Esta corrente de fluido passa completamente através da célula de fluxo 22 e na tubulação de 23, que é fixada à célula de fluxo 22 pela tampa da célula de fluxo 24. Este caminho leva ao sistema de resíduo 9.

Enquanto a corrente de fluido está passando através da célula de fluxo 22, a montagem ótica 41 ilumina a célula do sangue integral diluído individualmente. As células passam através de um ponto focal ótico 34 do laser 30, que maximiza a energia incidente nas células. Este foco estreito é gerado pela lente 33. A luz efetuada pela célula passa através do ponto focal 34, muda as quantidades de luz que são incidentes nos fotodiodos 42, 43, 44 e 45. Estas mudanças são capturadas pelos eletrônicos de processamento de sinal da Figura 26 e armazenadas por intermédio do sistema de eletrônicos da Figura 25. Os exemplos de dados coletados desta maneira são mostrados nas Figuras 12 A a 12 F. A Fig 12 A, mostra dados que foram coletados para o sinal de extinção ou perda de luz axial (EXT), a partir do detector 44, sem látex presente, a 12 B mostra a mesma amostra com látex presente. A 12 C mostra dados, que foram coletados para o sinal de dispersão para a frente baixa, a partir do detector 45 sem látex presente e a 12 D mostra a mesma amostra com látex presente. A Fig 12 E mostra dados que foram coletados para o sinal de dispersão de ângulo reto (RAS) ou detector 42 sem látex presente e a Figura 12 F mostra a mesma amostra com látex presente.

Para as Figuras 12 A, 12 B, 12 C, 12 D, 12 E e 12 F, o pico mostrado para A representa eventos de linfócito, o pico mostrado para B representa eventos de monócito e o pico mostrado para C representa eventos de granulócito e o pico mostrado para D representa eventos dè látex. Estes mesmos dados são mostrados em uma forma de ponto de dispersão nas Figuras 13 A e 13 B. Para a Figura 11 A, os pontos no círculo D representam os eventos de partícula de látex e em 11 B, o círculo D também representa os eventos de partícula de látex. Os dados de ponto de dispersão podem ser representados por qualquer par de até quatro detectores e tempo de vôo.

Para as amostras que contêm eosinófilos na sua população de granulócitos, a separação da sub-população é obtida no canal de dispersão de ângulo reto do detector 42. A Figura 16 A mostra o histograma de dados onde A representa linfócitos, B monócitos, C neutrófilos e D eosinófilos. A Figura 17 mostra os mesmos dados como a Figura 16, mas na forma de plotagem por dispersão. As populações cercadas de A representam linfócitos, B monócitos, C neutrófilos e D eosinófilos. Qualquer par de até quatro detectores e tempo de vôo podem representar pelos dados de plotagem por dispersão, mas para distinguir eosinófilos, a dispersão de ângulo reto é necessária.

Depois que as células sangüíneas brancas foram contadas e classificadas, a seringa 7 é carregada com fluido do reservatório de reagente 8, pela abertura da válvula 4. A válvula 4 fecha, 3 e 5 abrem, o que permite que a seringa 7 limpe as linhas de amostra pelo fluido que flui de volta para dentro do tubo consumível 63 através da agulha 11. A agulha 12 atua para ventilar o tubo através do filtro 13, para a atmosfera. Isto produz um tubo consumível que é da configuração mostrada em 64. O carro 70 move-se agora para a sua posição inicial, onde o usuário pode abrir a porta do sistema e remover os tubos das fendas A e B da Figura 7. O consumível é agora um tubo de resíduo e é descartado.

Outros modos de operação, ao longo das mesmas linhas como descrito acima podem permitir que imunoensaios sejam realizados pelas técnicas de aglutinação de látex. Aqui o consumível pode conter látex que é revestido com um anticorpo, tal que as partículas poderíam formar grumos juntas na presença do analisado apropriado. Esta mistura de látex pode ser conduzida através do canal ótico descrito na Figura 4 e os dados podem ser avaliados para grumos de partícula duplos ou triplos. Quanto mais alta a concentração destes grumos mais alta a concentração do analisado de interesse. Várias patentes e publicações são aqui citadas e suas divulgações são por meio deste incorporadas por referência em suas totalidades. A presente invenção não está intencionada a ser limitada no escopo pelas formas de realização específicas aqui descritas. Embora a presente invenção fosse descrita em detalhes com o propósito de ilustração, várias modificações da invenção como divulgada, além daquelas aqui descritas, tomar-se-ão evidentes àqueles de habilidade na técnica a partir da descrição precedente. Tais modificações são intencionada a estarem abrangidas dentro do escopo das presentes reivindicações.

Claims (21)

1. Recipiente de reação de amostra de sangue de múltiplas finalidades para uso em um sistema de hematologia baseado em citometria de fluxo, caracterizado pelo fato de que compreende: um tubo descartável tendo duas extremidades fechadas, em que uma extremidade fechada do tubo descartável é definida por uma porção do tudo descartável e a outra extremidade fechada é definida por um septo de borracha perfuravel por uma agulha, cm que o dito tubo descartável único é utilizado como uma câmara de mistura, uma câmara de reação e uma câmara de refugo; um número conhecido de partículas de referência no dito tubo descartável, cada uma das ditas partículas de referência tendo um diâmetro predeterminado, tal que quando as ditas partículas de referência são iluminadas por luz, a dita luz é dispersa pelas ditas partículas de referência, tal que a dita luz dispersada caía em pelo menos um de uma pluralidade de cauais de dispersão de luz predeterminados; e pelo menos um reagente no dito tubo descartável

2. Recipiente de reação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fito de que o dito diâmetro predeterminado de cada uma das ditas partículas de referência está entre 1 mícron e 10 mícrons.

3. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito número conhecido de partículas de referência está entre cerca de 1G3 e cerca IO3 por μΙ de uma solução de amostra,

4. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as ditas partículas de referência são selecionadas do grupo que consiste em partículas de látex, células fixas, pólen, vidro ou colóides grandes,

5. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito reagente é eficaz em permitir que o dito sistema de hematologia baseado em citometria de fluxo conte pelo menos uma contagem de células sanguíneas vermelhas, reticulócitos e células sanguíneas brancas, um diferencial de células sanguíneas brancas de cinco partes e níveis de hemoglobina em uma amostra de sangue ou amostra derivada de sangue.

6. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito reagente inclui um reagente capaz de corar o ácido ribonucléico (RNA) nos reticulócitos.

7. Recipiente de reação de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito reagente capaz de corar o ácido ribonucléico (RNA) nos reticulócitos é o azul de metileno novo.

8. Recipiente de reação de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o dito azul de metileno novo está presente em uma concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5 grama por litro da solução de amostra.

9. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito reagente inclui um reagente capaz de modificar a forma das células sanguíneas vermelhas mas, de outro modo, deixando as ditas células sanguíneas vermelhas substancialmente intactas.

10. Recipiente de reação de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o dito reagente capaz de modificar a forma das células sanguíneas vermelhas mas, de outro modo, deixando as ditas células sanguíneas vermelhas substancialmente intactas é um tensoativo não zwiteriônico.

11. Recipiente de reação de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o dito tensoativo não zwiteriônico está presente em uma concentração entre 0,1 e 0,6 grama por litro, e em que o referido tensoativo é Plurafac-A-39.

12. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito reagente inclui azul de metileno novo e o dito Plurafac-A-39.

13. Recipiente de reação de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o dito azul de metileno novo está presente em uma concentração entre 0,1 e 0,5 grama por litro e o dito Plurafac-A-39 está presente em uma concentração entre 0,1 e 0,6 grama por litro.

14. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito reagente inclui: a) azul de metileno novo, em uma concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5 grama por litro de uma solução de amostra; b) um tensoativo não zwiteriônico, Plurafac-A-39, em uma concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 0,6 grama por litro de uma solução de amostra; c) bicarbonato de sódio, em uma concentração entre cerca de 6.0 e cerca de 10,0 gramas por litro de uma solução de amostra; d) cloreto de sódio, em uma concentração entre cerca de 1,0 e cerca de 5,0 gramas por litro de uma solução de amostra; e) Tricina, em uma concentração entre cerca de 1,0 e cerca de 5.0 gramas por litro de uma solução de amostra; f) EDTA dissódico, em uma concentração entre cerca de 0,5 e cerca de 3,0 gramas por litro de uma solução de amostra; g) etil parabeno em uma concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5 grama por litro de uma solução de amostra; e h) metil parabeno em uma concentração entre cerca de 0,1 e cerca de 0,3 grama por litro de uma solução de amostra.

15. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito reagente inclui saponina, em uma concentração entre 6,0 e 20,0 gramas por litro.

16. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que ainda compreende: a) sulfato de sódio, em uma concentração entre 10,0 e 16,0 gramas por litro; b) EDTA dissódico, em uma concentração entre 0,5 e 3,0 gramas por litro; c) um conservante ProClin 300, em uma concentração entre 0,1 e 1,0 grama por litro; e d) um conservante germaben II, em uma concentração entre 0,5 e 3,0 ml por litro.

17. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as ditas partículas são partículas de látex de poliestireno.

18. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito diâmetro de cada uma das ditas partículas é 4,0 ± 0,5 mícrons.

19. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito número conhecido de partículas é 10.000 ± 1.000 por μΐ.

20. Recipiente de reação de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o tubo descartável compreende um rótulo com código de barras afixado em uma superfície externa do mesmo.

21. Sistema de citometria de fluxo, caracterizado por compreender um recipiente de reação de amostra de sangue de múltiplas finalidades como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, e um sistema de detecção ótico.