BRPI0113540B1 - meio e processo para detectar campylobacter em uma amostra - Google Patents
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Abstract
"composições e processos para a detecção de microorganismos alvo em uma amostra". a presente invenção se refere genericamente a composições e a processos para a detecção de microorganismos alvo em uma amostra. em particular, a presente invenção se refere a composições compreendendo um marcador condicionalmente detectável e um substrato de enzima que proporcione a detecção de microorganismos alvo, assim como a processos para seu uso. com a invenção aqui exposta, revela-se uma abordagem amplamente aplicável, que utiliza um indicador presumido para o microorganismo alvo e microorganismos não alvo capazes de crescimento e detecção em um meio, seguido por um indicador de confirmação, que substancialmente só seja reagido pelos microorganismos não alvo.
Description
(54) Título: MEIO E PROCESSO PARA DETECTAR CAMPYLOBACTER EM UMA AMOSTRA (51) Int.CI.: C12Q 1/00 (30) Prioridade Unionista: 28/08/2000 US 60/228.956 (73) Titular(es): BIOCONTROL SYSTEMS, INC.
(72) Inventor(es): DAVID TOWNSEND (85) Data do Início da Fase Nacional: 26/02/2003
1/31 “MEIO E PROCESSO PARA DETECTAR CAMPYLOBACTER EM UMA
AMOSTRA”
CAMPO TÉCNICO [001]A presente invenção se refere genericamente a composições e processos para a detecção de micro-organismos alvo em uma amostra. Em particular, a presente invenção se refere a composições compreendendo um marcador condicionalmente detectável e um substrato de enzima que proporcione a detecção do micro-organismo alvo, assim como a processos para seu uso.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002]O desenvolvimento de um teste diagnóstico para a detecção de um tipo específico de micro-organismo em uma amostra de teste é um processo muito lento e difícil devido a vários fatores. Em primeiro lugar, para se desenvolver um teste diagnóstico para um micro-organismo específico, é preciso identificar uma maneira de detectá-lo de maneira que seja altamente sensível e facilmente reconhecível. Genericamente, isso é realizado pela incorporação de uma molécula de detecção no meio de crescimento que interaja com o micro-organismo alvo bioquimicamente para produzir um sinal mensurável. Os melhores tipos de sinais são aqueles que resultam em uma mudança de cor do meio de crescimento. Em segundo lugar, o sinal não deve interagir com a matriz da amostra de teste, resultando emuma reação falsa positiva. Isso é particularmente problemático se a amostra de teste for derivada de uma entidade viva ou que tenha vivido, como um produto alimentar, porque essas entidades possuem muitos dos mesmos processos bioquímicos de um micro-organismo alvo. Finalmente, a maioria dos agentes de teste, por exemplo, um produto alimentar bruto, podem ser contaminados por literalmente bilhões de micro-organismos de diferentes tipos por grama de alimento. Como resultado, um teste diagnóstico útil deve possuir uma alta seletividade para o micro-organismo alvo. Isso é em geral realizado pela incorporação de um “coquetel” de agentes antimicrobianos no meio de cresciPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 11/50
2/31 mento para suprimir o crescimento e a detecção de micro-organismos não alvo ou pela seleção de uma molécula de detecção que não seja reconhecida pela vasta maioria dos micro-organismos não alvo.
[003]Indicadores de crescimento microbiano normalmente reagem quimicamente com um subproduto metabólico produzido por micróbios alvos, resultando em uma mudança de cor no meio. Exemplos de substâncias químicas que mudam de cor na presença de alterações de pH associadas ao crescimento microbiano incluem azul anilina, vermelho fenol, azul bromocresol e vermelho neutro. Por exemplo, Gibson, patente norte-americana n° 4.140.580, usa azul anilina, uma substância química que muda de cor na presença de dejetos metabólicos ácidos produzidos por leveduras.
[004]A catálise enzimática para hidrolisar substratos cromogênicos ou fluorogênicos para fornecer um sinal detectável tem sido usada em inúmeras aplicações diagnósticas de micróbios.
[005]Um exemplo dessa metodologia de detecção utiliza o teste da presença de várias enzimas do(s) micro-organismo(s) alvo. Por exemplo, Townsend e Chen descrevem um processo e uma composição para a detecção de contaminação bacteriana em produtos alimentares no pedido norte-americano n° 08/484.593, depositado em 7 de julho de 1995, que é aqui incorporado por referência. Esse meio de crescimento detecta contaminação bacteriana em uma amostra por detecção de enzimas bacterianas (por exemplo, fosfatase, β-glucosidase e L-alaninaaminopeptidase) de diversas espécies microbianas. As frações fluorescentes liberadas exibem sinais detectáveis com um comprimento de onda de emissão idêntico. Esse procedimento se aproveita da combinação de diferentes atividades de enzimas bacterianas de diversos micróbios para criar um espectro mais amplo de atividades de enzimas, o espectro mais amplo permitindo a detecção das bactérias totais em uma amostra de teste.
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3/31 [006]Koumura et al., na patente norte-americana n° 4.591.554, descrevem o uso da análise fluorogênica de derivados de 4-metiluberiferila para detectar e determinar o número de micro-organismos com base na quantidade de derivados de umbeliferona liberados. De acordo com o processo, micro-organismos a mais de 10.000 ufc/ml podem ser determinados por contato de uma solução de amostra com derivados de umbeliferona e medição da quantidade de derivados de umbeliferona fluorescentes liberados. Na patente de Koumura, é requerida a lise de células para aumentar a quantidade de enzimas liberadas. Em outros casos, o ajuste do pH da mistura e a centrifugação da mistura para remover células insolúveis são requeridos ao término da incubação.
[007]Edberg et al., na patente norte-americana n° 4.925.789, descrevem o uso de substratos de enzimas como indicadores nutrientes contendo uma porção nutriente covalentemente ligada a uma porção detectável não metabolizada, que são especificamente hidrolisados por micro-organismos alvo. Na patente de Edberg, os indicadores nutrientes são especificamente selecionados para serem hidrolisados apenas pelos micro-organismos alvo em virtude de sua presença no meio de crescimento como principal fonte nutriente. Micro-organismos não alvo não são detectados nesse sistema e são suprimidos pela adição de agentes antimicrobianos.
[008]Embora as estratégias acima mencionadas sejam úteis, elas não são particularmente adequadas para todos os tipos de detecção, particularmente quando se deseja evitar agentes antimicrobianos para uma maior sensibilidade. Por exemplo, a maior dos agentes antimicrobianos se destina a ser eficazes contra um amplo espectro de micro-organismos. Como resultado, o uso desses agentes em um teste diagnóstico frequentemente pode ter um impacto negativo sobre o crescimento e a detecção do micro-organismo alvo, resultando em menor sensibilidade do teste. Além disso, muito poucos coquetéis de antimicrobianos são eficazes para suprimir todos o crescimento não alvo, resultando em menor especificidade do teste. Além do
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4/31 mais, embora o uso de uma molécula de detecção altamente seletiva possa superar esses obstáculos, essas moléculas de detecção são raras.
[009]Por poder ser útil para detectar qualquer número de micro-organismos específicos, o exemplo prototípico, apresentado apenas para fins de discussão, é a espécie bacteriana Campylobacter. As espécies Campylobacter são bactérias gramnegativas, oxidase positivas, de formato curvo ou de bastonete espiralado. Campylobacter são uma importante causa de envenenamento alimentar, principalmente por produtos de aves domésticas, e sua incidência em surtos de doença gastrointestinal parece estar crescendo. O Departamento Norte-americano de Agricultura está liderando o esforço para reduzir os níveis de contaminação por Campylobacter em produtos de aves domésticas pelo desenvolvimento de processos para a detecção e quantificação de Campylobacter em amostras de água de enxágue de aves domésticas. No procedimento de uso atualmente mais disseminado (Departamento Norte-americano de Agricultura ARS, Unidade de Pesquisa de Segurança Microbiológica em Aves Domésticas, Processo Para a Enumeração de Espécies de Campylobacter em Enxágues de Aves Domésticas, 15 de março de 2000; veja também Stern et al., J. Food Prot. 55:663-666, 1992, e Stern et al., J. Food Prot. 55:514517, 1992, aqui incorporados por referência em sua inteireza), 400 ml de água tamponada com fosfato (BPW) são adicionados a um saco plástico forte contendo uma carcaça de galinha crua. O saco é torcido, e o conteúdo agitado durante 2 minutos para liberar qualquer Campylobacter da superfície da galinha na BPW. Após o enxágue, pelo menos 40 ml de água de enxágue são transferidos para um recipiente estéril e mantidos em gelo até poderem ser testados quanto à presença de Campylobacter. Para quantificar o Campylobacter, alíquotas de 0,25 ml da água de enxágue são espalhadas sobre quatro placas de meio à base de ágar (ágar CampyLine ou ágar Campy CEFEX, receita disponível no Departamento Norte-americano de Agricultura ARS, Unidade de Pesquisa de Segurança Microbiológica em Aves
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5/31
Domésticas; também disponível na Hadry Diagnostics, Santa Maria, CA). Em seguida, alíquotas de 0,1 ml de água de enxágue são espalhadas sobre duas placas adicionais de meio. Essas seis placas são, então, colocadas em um incubador microaerofílico a 42°C e incubadas durante 48 horas. As colônias resultantes que se assemelhem a espécies de Campylobacter típicas são microscopicamente observadas para se visualizar a forma da célula e a presença de motilidade celular. Células típicas em forma de vírgula são finalmente submetidas a um teste de aglutinação em lâmina para confirmar a presença de Campylobacter.
[0010]Esse processo, embora amplamente aceito, tem inúmeras desvantagens, cuja mais importante é que o processo requer um grande número de etapas complicadas para confirmar que os organismos que cresceram nas placas sejam de fato Campylobacter. Como na maioria dos ensaios de detecção de microorganismos, essas etapas são de operação muito cara, requerem as habilidades de um microbiologista altamente treinado para sua realização e limitam significativamente o número de testes que podem ser realizados em um turno laboratorial normal. Como resultado, atalhos são tomados pelos técnicos que realizam os testes para completar seu trabalho a tempo, o que pode resultar em dados altamente errôneos, afetando, assim, a qualidade do alimentado que está sendo preparado. Consequentemente, há necessidade de testes aperfeiçoados para a detecção de Campylobacter. Se a etapa de confirmação pudesse ser simplificada, e os resultados de teste obtidos de maneira mais depressa e eficaz em termos de custo, isso permitiria que os fabricantes liberassem os produtos com informações mais precisas quanto à verdadeira concentração de Campylobacter. Obviamente, isso representaria uma econômica significativa de trabalho e custos para os fabricantes e também beneficiaria o consumidor, fornecendo alimentos mais seguros.
[0011]A presente invenção resolve as dificuldades acima mencionadas na técnica, proporcionando, ao mesmo tempo, outras vantagens relacionadas.
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6/31
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0012]Em um aspecto da presente invenção, apresenta-se uma composição para a detecção de um micro-organismo alvo em uma amostra, que compreende um marcador condicionalmente detectável, em que o marcador é capaz de fornecer um sinal detectável quando em contato com um micro-organismo viável, e um substrato para uma enzima que esteja substancialmente ausente no micro-organismo alvo. Em uma modalidade, os micro-organismos alvo são bactérias, leveduras, bolores, fungos, protozoários ou vírus. Em certas modalidades, a bactéria é Salmonella, Listeria, E. coli OH157, Campylobacter, Sta-phylococcus aerus, Cryptsporidium ou Giardia.
[0013]Nas várias modalidades, o marcador condicionalmente detectável é detectável por uma mudança de cor. Em modalidades relacionadas, a mudança de cor é produzida pela redução bioquímica de vermelho tetrazólio. Em ainda outras modalidades, o substrato compreende uma porção sinal ligada ao substrato, a porção sinal sendo capaz de fornecer um sinal detectável quando clivada por substancialmente todos os micro-organismos alvo.
[0014]Em ainda outras modalidades adicionais, a enzima é uma aminopeptidase, como uma L-alanina-aminopeptidase. Em modalidades relacionadas, o substrato é L-alanina-7-amido-4-metilcumarina, L-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA, L-alanina-7-amido-4-trifluoro-metilcumarina TFA, L-alanil-L-alanil-L-fenilalanina-7amido-4-metilcumarina ou L-alanil-L-alanil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina
TFA.
[0015]Em outras modalidades, os micro-organismos não alvo incluem substancialmente todas as espécies não Campylobacter. Ainda em modalidades adicionais, a composição também compreende um meio de suporte ao crescimento para o micro-organismo alvo. Em uma modalidade adicional, o meio de suporte ao crescimento contém todos os nutrientes e condições de crescimento necessários para sustentar apropriadamente o crescimento do micro-organismo alvo. Em ainda outras
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7/31 modalidades, o meio de suporte ao crescimento contém antibióticos para suprimir o crescimento de micro-organismos não alvo.
[0016]Em outro aspecto, apresenta-se um meio para a detecção de microorganismos viáveis em uma amostra, que compreende um substrato para uma aminopeptidase, um marcador condicionalmente detectável, em que o marcador é capaz de fornecer um sinal detectável quando em contato com um micro-organismo viável, uma porção sinal ligada ao substrato, a porção fornecendo um sinal detectável quando clivada pela aminopeptidase de um micro-organismo, e um meio de suporte ao crescimento para micro-organismos alvo ou não alvo.
[0017]Em certas modalidades do meio, a aminopeptidase é L-alanina aminopeptidase. Ainda em outras modalidades, a porção sinal pode ser orto-nitrofenol,
4-metilumbeliferona, para-nitroanilida, 4-metóxi-beta-naftilamida ou 7-amido-4metilcumarina. Além disso, certas modalidades apresentam um substrato de enzima selecionado em acetato de N-o-acetil-lisina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de N-acetil-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, L-alanina-7-amido-4metilcumarina, e-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA, D-alanina-7-amido-4metilcumarina TFA, L-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA, L-alanina-7-amido-4metilcumarina TFA, L-alanina-7-amido-4-trifluoro-metilcumarina TFA, L-alanil-Lalanil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina, L-alanil-L-alanil-L-fenilalanina-7amido-4-metilcumarina TFA, sal de D-alanil-L-leucil-L-lisina-7-amido-4metilcumarina, cloridrato de L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, tricloridrato de Larginil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, L-asparagina-7-amido-4-metilcumarina TFA, ácido L-aspártico-b-(7-amido-4-metilcumarina), N-alfa-benzoil-DL-arginina-7amido-4-metilcumarina, N-alfa-benzoil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, Nbenzoil-L-fenilalanil-L-valil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, N-benzoil-Lfenilalanil-L-valil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, S-benzil-L-cisteína-7-amido-4metilcumarina, acetato de N-BOC-L-fenilalanil-L-seril-L-arginina-7-amido-4Petição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 17/50
8/31 metilcumarina, cloridrato de N-BOC-L-vanil-glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, sal de N-BOC-L-vanil-L-leucil-L-lisina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de N-alfaCBZ-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, N-CBZ-glicilglicil-L-leucina-7-amido-4metilcumarina, N-CBZ-glicil-L-prolina-7-amido-4-metilcumarina, N-CBZ-glicil-L-propilL-arginina-7-amido-4-metilcumarina, N-beta-CBZ-L-lisina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de N-CBZ-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de NCBZ-L-prolil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de L-citrulina-7-amido-4metilcumarina, cloridrato de L-citrulina-7-amido-4-metilcumarina TFA, ácido Dglutâmico-gama-(7-amido-4-metilcumarina), ácido L-glutâmico-alfa-(7-amido-4metilcumarina), cloridrato de L-glutamina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de glutaril-glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, glutaril-glicilglicil-L-fenilalanina-7amido-4-metilcumarina, glutaril-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de glicina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de glicil-L-alanina-7-amido-4metilcumarina, sal de glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de glicilglicina-7-amido-4-metilcumarina, glicil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de glicil-L-prolina-7-amido-4-metilcumarina, L-histidina-7-amido-4-metilcumarina, L-isoleucina-7-amido-4-metilcumarina, L-isoleucina-7-amido-4-metilcumarina TFA, Lleucina-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de L-leucina-7-amido-4-metilcumarina, Lleucil-L-valil-L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina, acetato de L-lisina-7-amido-4metilcumarina, acetato de L-metionina-7-amido-4-metilcumarina, carbonato de Lornitina-7-amido-4-metilcumarina, L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina TFA, cloridrato de L-prolina-7-amido-4-metilcumarina, sal de L-prolil-L-fenilalanil-L-arginina-7amido-4-metilcumarina, ácido L-piroglutâmico-7-amido-4-metilcumarina, cloridrato de L-serina-7-amido-4-metilcumarina, hidrato de L-seril-L-tirosina-7-amido-4metilcumarina, ou L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina.
[0018]Nas várias modalidades, a ligação entre a porção sinal e o substrato é uma ligação peptídica. Ainda em uma modalidade adicional, a porção sinal é uma
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9/31 porção fluorescente, e a porção fluorescente é capaz de fornecer um sinal fluorescente, ou é uma porção cromogênica, e a porção cromogênica é capaz de fornecer um sinal no espectro visível, ultravioleta ou infravermelho.
[0019]Em ainda outro aspecto, apresenta-se um processo para a detecção de micro-organismos alvo viáveis em uma amostra, compreendendo a formação de um meio compreendendo a composição acima mencionada, inoculação do meio com a amostra a ser testada quanto à presença de micro-organismos alvo, incubação do meio inoculado sob condições adequadas para o crescimento de micro-organismos alvo, em que o substrato de enzima é capaz de sofre uma ação por uma enzima de substancialmente todos os micro-organismos não alvo para produzir um sinal detectável, e comparação da diferença entre o sinal gerado pelo marcador condicionalmente detectável e o substrato de enzima, com o que a ausência ou diminuição do sinal detectável indica a presença de micro-organismos alvo na amostra.
[0020]Esses e outros aspectos da presente invenção ficarão evidentes por referência à descrição detalhada a seguir. Além disso, várias referências são apresentadas abaixo descrevendo em maiores detalhes certos procedimentos ou composições (por exemplo, corantes, substratos, enzimas, bactérias, leveduras, bolores, vírus, plasmídios e outros) e são, portanto, aqui incorporadas por referência em sua inteireza.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0021]A Figura 1 é um gráfico demonstrando a relação correlativa da metodologia da invenção em comparação com uma contagem padrão em ágar CampyCefex de Campylobacter. A comparação foi realizada com 162 amostras de lavagem de aves domésticas submetidas ao ensaio da invenção, em comparação com os resultados conseguidos para as mesmas amostras usando-se o teste em ágar CampyCefex aceito na indústria e pelo USDA.
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DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0022]Antes de expor a invenção, pode ser útil para sua compreensão apresentar definições de alguns termos que serão usados daqui por diante.
[0023]Conforme aqui usado, um “marcador condicionalmente detectável” se refere a uma molécula que sofre uma alteração mensurável (como mudança de cor) quando reagida por um micro-organismo viável em uma amostra. Assim, a condição em “condicionalmente detectável” se refere à condição de viabilidade. Essas moléculas são comumente chamadas de Corantes Vitais na técnica, para designar um corante ou marcador que sofre ação substancialmente apenas de células viáveis, como corantes vermelho-ox (resazurin, XTT, MTT e outros). Uma lista desses corantes é disponível na técnica (veja, por exemplo, Sigma Chemical catálogo 2000-2001, página 1836, 2000, St. Louis, MO, ou Molecular Probes catálogo 2000-2001, Eugene, OR). Em uma modalidade, a atividade bioquímica de um corante é usada para detectar ou medir a concentração de um micro-organismo em uma amostra. Em outra modalidade, o corante específico é vermelho tetrazólio. Conforme aqui exposto, demonstrou-se que esse corante é reduzido por espécies de Campylobacter e é bem conhecido por aqueles versados na técnica que é reduzido pela maioria dos microorganismos. Corante vital é qualquer corante que possa ser usado para determinar a viabilidade.
[0024]Conforme aqui usado, um “substrato de enzima” se refere a uma molécula sobre a qual uma enzima age. A reação enzimática normalmente envolve a hidrólise de uma ou mais ligações covalentes. Em um aspecto, o substrato compreende frações nutriente e detectável ligadas. Ao ser hidrolisado por uma enzima microbiana, o substrato libera uma porção detectável separada no meio. Em outro aspecto, o produto enzimático de uma substância natural é detectável com uma porção detectável separada. Em modalidades preferidas, o substrato de enzima é selecionado no grupo de substratos relacionados na Tabela III. Essa lista não pretende exPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 20/50
11/31 cluir nenhum substrato de enzima que ainda venha a ser descoberto, substratos que possam ser posteriormente identificados e incluídos nessa lista por aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades, o substrato de enzima é L-alanina-7amido-4-metilcumarina.
[0025]Conforme aqui usado, um “meio” se refere a um ambiente, tipicamente líquido ou sólido, no ou sobre o qual micro-organismos possam crescer e se reproduzir. É um ambiente que é construído por aqueles versados na técnica para proporcionar um crescimento detectável do micro-organismo alvo. A composição do meio pode variar dependendo da natureza do micro-organismo alvo, mas, em geral, conterá concentrações eficazes de componentes, que incluem, mas não necessariamente se limitam a, aminoácidos, vitaminas, carboidratos, uma fonte de nitrogênio, lipídios, ácidos graxos, minerais, elementos residuais e agentes antimicrobianos.
[0026]Conforme aqui usado, “porção nutriente” se refere a uma molécula ou substância que seja um nutriente ou fonte metabólica para pelo menos os microorganismos alvo, incluindo, mas não limitados a, aminoácidos (por exemplo, alanina, leucina, arginina, valina e outros), fontes de carbono (por exemplo, D-glicose, Dfrutose, D-lactose e outras), minerais (por exemplo, sulfato, fosfato, cálcio e outros). Em uma modalidade preferida da invenção, a porção nutriente do substrato de enzima é um aminoácido.
[0027]Conforme aqui usado, “porção detectável” se refere a uma molécula ou substância que possa ser afiliada a uma porção nutriente ou existir como uma entidade distinta. A porção detectável não causa nem produz um sinal detectável quando está afiliada (por exemplo, covalentemente ligada a) uma porção nutriente. Entretanto, quando uma enzima de um micro-organismo hidrolisa o substrato, uma porção detectável é liberada e causa ou é capaz de produzir um sinal detectável. Em modalidades preferidas, a porção detectável é um cromógeno que produz, de preferência, uma mudança de cor na faixa de comprimentos de onda visíveis (alternatiPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 21/50
12/31 vamente, nos espectros ultravioleta ou infravermelho), ou fluorógeno que emite fluorescência quando apropriadamente excitado por uma fonte de energia externa. Exemplos de frações detectáveis incluem, mas não se limitam a, orto-nitrofenol, 4metilumbeliferona, para-nitroanilida, 4-metóxi-e-naftilamida ou 7-amido-4metilcumarina.
[0028]Conforme aqui usado, um “sinal detectável” se refere a uma alteração característica em um meio ou amostra que seja observável ou mensurável por meios físicos, químicos ou biológicos conhecidos por aqueles versados na técnica. Esse sinal detectável pode ser ensaiado por meios visuais, táteis ou olfativos. Por exemplo, detecta-se uma alteração na emissão ou absorbância de ondas de luz visíveis ou invisíveis ou de rádio, na condutividade elétrica, emissão de gás ou odor. Um sinal detectável também pode ser uma alteração no estado físico, como entre sólido, líquido e gasoso. Tipicamente, o sinal detectável é medido visualmente. Em modalidades preferidas, sinais detectáveis compreendem uma mudança de cor ou a emissão fluorescente do meio.
[0029]Conforme aqui usado, uma “amostra” se refere a um componente tirado de um produto alimentar, uma amostra de teste humana ou animal, produto farmacêutico ou cosmético, solo, água, ar ou outra fonte ambiental, ou qualquer outra fonte da qual um organismo alvo deva ser detectado. Uma amostra de teste pode ser tirada de uma fonte usando-se técnicas conhecidas por aqueles versados na técinca. Em modalidades preferidas, a amostra de teste é uma amostra de água de enxágue de aves domésticas.
[0030]Conforme aqui usado, um “micro-organismo alvo” se refere a qualquer micro-organismo unicelular viável cuja detecção seja necessária para determinar a qualidade, segurança ou outra especificação de uma amostra de teste particular. Esses micro-organismos alvo incluem, mas não estão necessariamente limitados a,
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13/31 bactérias, leveduras, bolores, fungos, parasitas e vírus. Em modalidades preferidas, os micro-organismos alvo são espécies de Campylobacter.
[0031]Conforme aqui usado, “micro-organismo não alvo” se refere a substancialmente todos os micro-organismos unicelulares viáveis capazes de crescimento e detecção no meio que não sejam os micro-organismos alvo.
[0032]Conforme aqui usado, “concentrações eficazes de componentes” se referem a uma quantidade de nutrientes ou agentes antimicrobianos dentro da faixa que permita ou promova crescimento e reprodução do micro-organismo alvo. Isto é, uma quantidade que permita que o micro-organismo alvo se adapte ao meio, continue o metabolismo ou sintetize os constituintes necessários para a reprodução e, subsequentemente, se reproduzam.
[0033]Conforme aqui usados, os termos “aminoácidos”, “vitaminas”, “carboidratos”, “uma fonte de nitrogênio”, “lipídios”, “ácidos graxos”, “minerais”, “elementos residuais” e “agentes antimicrobianos” incluem todas as moléculas, compostos e substâncias classificadas em cada categoria por aqueles versados na técnica, quer orgânicos ou inorgânicos. A combinação dessas categorias pretende incluir qualquer substância que possa ser necessária para, ou propícia a, manter a vida do microorganismo alvo.
[0034]Conforme aqui usado, o termo “detecção presumida de microorganismos alvo” se refere ao fato de o meio permitir uma detecção sensível (isto é, pelo menos 50%) do micro-organismo alvo, conforme medido com relação a um procedimento de cultura padrão genericamente aceito.
[0035]Conforme aqui usado, o termo “substancialmente” se refere a pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 e 100% do micro-organismo particular capaz de crescimento e reprodução no meio.
[0036]O termo “quantidade eficaz de nutrientes” é uma quantidade de nutrientes dentro da faixa que permita ou promova o crescimento e a reprodução de um
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14/31 micro-organismo alvo. Isto é, uma quantidade que permita que os micróbios alvo ou outros organismos se adaptem ao meio, continuem o metabolismo ou sintetizem os constituintes necessários para a reprodução e, subsequentemente, se reproduzam.
[0037]O termo “meio” significa uma mistura sólida, em pó ou líquida, que contenha todos ou substancialmente todos os nutrientes necessários para permitir que um micróbio cresça e se reproduza. Esta invenção inclui tanto meios que sejam esterilizados, quanto meios que não sejam estéreis.
[0038]O termo “micro-organismo alvo” se refere a um micro-organismo cuja presença ou ausência se busque detectar.
[0039]O termo “aminopeptidase” se refere a uma enzima cuja atividade enzimática seja capaz de hidrolisar uma ligação peptídica covalentemente ligada de um substrato de enzima ou de uma pluralidade de substratos de enzima. Em uma modalidade preferida desta invenção, a atividade enzimática de uma ou mais aminopeptidases é usada para detectar ou medir a concentração de leveduras e bolores em uma amostra. Em uma modalidade preferida, a enzima aminopeptidase é a alanina aminopeptidase.
[0040]O termo “liquefeito”, conforme aqui usado, refere-se a um estado de matéria substancialmente em forma líquida, embora também pretenda incluir amostras pulverizadas ou homogeneizadas de substâncias sólidas com um teor de líquido de pelo menos 10%. Meio liquefeito é distinto de meio em forma de gel, como encontrado no meio à base de ágar.
[0041]“Bactéria”, conforme aqui usado, pretende englobar o termo conforme usado na técnica, incluindo todas as formas bacterianas (veja Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Lippincott, Williams e Wilkins, 1989).
[0042]O termo “levedura”, conforme aqui usado, refere-se a um fungo tipicamente unicelular que se reproduz assexuadamente. Levedura inclui uma ou mais espécies dos seguintes organismos, existentes e coexistentes coletivamente em
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15/31 uma amostra de teste. Por exemplo, leveduras incluem aquelas relacionadas na Tabela I e descritas em Tiber Deak e Larry Beuchat, Handbook of Food Spoilage Yeasts, pp. 3 - 11, 124 - 25 (1996), e James, M. Jay, Modern Food Microbiology, 4â Ed., pp. 26 - 35 (1992), que são aqui incorporadas por referência. O termo “leveduras” também se refere à gama de leveduras encontradas, por exemplo, em uma amostra de teste. O termo são pretende se limitar a qualquer número dado dessas espécies e não pretende excluir espécies que ainda não foram descobertas, mas que possam ser posteriormente identificadas e incluídas nessa definição por aqueles versados na técnica.
TABELA I
Gêneros de Leveduras Alimentares Comuns 60 Cepas de Leveduras Comuns (93% de Frequência Combinada em Alimentos)
Gêneros Principais 60 Cepas de Leveduras Alimentares
Candida Candida boidinii Kluyveromuyces marxaanus Cryptococcus Candida apicola Metschnikowia pulcherrima Debaryomyces Candida albicans Pichia angusta Galactomyces Candida zeylanoides Pichia subpelliculosa Hanseniaspora Candida vini Pichia mambranaefaciens Issatchenkia Candida versatilia Pichia jadinii Kluyveromyces Candida tropicalis Pichia guilliermondii Metschnikowia Candida stellata Pichia fermentans
Pichia Candida sake Pichia farinosa Rhodotorula Candida rugosa Pichia burtonii Saccharomyces Candida parapsilosis Pichia anomala Saccharomycodes Candida norvergica Rhodotorula glutinis Schizossacharomyces Candida magnoliae Rhodotorula mucilaginosa Sporobolmyces Candida intermedia Rhodotorula minuta
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Torulaspora Candida incospicua Saccharomyces bayanus Trichosporon Candida glabrata Saccharomyces kluyveri Yarrowia lipolytica Candida etchellsii Saccharomyces exiguus Zygosacchromyces Candida catenulata Saccharomyces cerevisiae Cryptococcus albidus Saccharomyces ludwigii Cryptococcus laurentii Saccharomycopsis fibuligera Cryptococcus humicolus Saccharomycopsis pombe Debaryomyces etchellsii Sporobolmyces roseus Debaryomyces polymorphus Torulaspora delbrueckii Debaryomyces hansenii Trichosporon moniliforme Galactomyces geotrichum Trichosporon pullulas Haneniaspora guilliermonii Yarrowia lipolytica Haneniaspora uvaum Zygosacchromyces bailii Issatchenkia orientalis Zygosacchromyces rouxii Kluyveromyces lactis Zygosacchromyces microellipsoides Kluyveromyces thermotolerans Zygosacchromyces bisporus [0043]O termo “bolor”, conforme aqui usado, refere-se a um fungo. Por exemplo, bolores incluem uma ou mais espécies dos seguintes micro-organismos, existentes ou coexistentes coletivamente em uma amostra de teste: Aspergillus, Penicilina e outros. Esse termo não pretende se limitar a qualquer número dado dessas espécies e não pretende excluir espécies que ainda não foram descobertas, mas que possam ser posteriormente identificadas e incluídas nessa definição por aqueles versados na técnica. Os bolores incluem aqueles relacionados na Tabela II e descritos ou citados em Modern Food Microbiology, 4â Ed., supra.
TABELA II
Gêneros de Bolores Alimentares Comuns
Gênero Importantes Cepas de Bolores Alimentares
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Alternaria Alternaria citri Fusarium graminearum Aspergillus Alternaria alternata Fusarium tricinctum Botrytis Alternaria solani Geotrichum candidum Byssochlamys Alternaria tenuissima Geotrichum albidum Cladosporium Aspergillus niger Monilia sitophila Colletotrichum Aspergillus alliaceus Mucor miehei Fusarium Aspergillus ostianus Penicillium roqueforti Geotrichum Aspergillus mellus Penicillium cyclopium Monilia Aspergillus clavatus Penicillium patulum Mucor Aspergillus terreus Penicillium expansum Penicillium Aspergillus soyae Penicillium claviforme Pullularia Aspergillus glaucus Penicillium viridicatum Rhizopus Aspergillus oryzae Penicillium citrinum Thamnidium Aspergillus parasiticus Pullularia pullulans Trichothecium Botrytis cinerea Rhizopus stolonifer Byssochlamys fluva Rhizopus oligosporus Byssochlamys nivea Thamnidium elegans Cladosporium herbarum Trichothecium roseum Cladosporium Colletotrichum cladosporiodes gloeosporioides [0044]Nas várias modalidades, aminopeptidases microbianas incluem, mas não se limitam a alanina aminopeptidase. Em certas modalidades, os substratos de peptidase são selecionados no grupo de substratos fluorogênicos de aminopeptidase que estão relacionados na Tabela III. Deve-se entender que essa lista não exclui outros substratos enzimáticos conhecidos, incluindo substratos cromogênicos de aminopeptidase (por exemplo, espécies marcadas com p-nitroanilina) e substratos
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18/31 de aminopeptidase que ainda não tenham sido descobertos, mas que sejam posteriormente identificados e incluídos nessa lista por aqueles versados na técnica.
TABELA III
Substratos de AMC (7-amido-4-metilcumarina) aminopeptidase acetato de N-o-acetil-lisina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de N-acetil-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina L-alanina-7-amido-4-metilcumarina beta-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA
D-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA
L-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA
L-alanina-7-amido-4-metilcumarina TFA
L-alanina-7-amido-4-trifluoro-metilcumarina TFA
L-alanil-L-alanil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina
L-alanil-L-alanil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina TFA sal de D-alanil-L-leucil-L-lisina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de L-arginina-7-amido-4-metilcumarina tricloridrato de L-arginil-L-arginina-7-amido-4-metilcuma- rina
L-asparagina-7-amido-4-metilcumarina TFA ácido L-aspártico-beta-(7-amido-4-metilcumarina)
N-alfa-benzoil-DL-arginina-7-amido-4-metilcumarina
N-alfa-benzoil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina
N-benzoil-L-fenilalanil-L-valil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina
S-benzil-L-cisteína-7-amido-4-metilcumarina acetato de N-BOC-L-fenilalanil-L-seril-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de N-BOC-L-vanil-glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina sal de N-BOC-L-vanil-L-leucil-L-lisina-7-amido-4-metilcumarina
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19/31 cloridrato de N-alfa-CBZ-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina
N-CBZ-glicilglicil-L-leucina-7-amido-4-metilcumarina
N-CBZ-glicil-L-prolina-7-amido-4-metilcumarina
N-CBZ-glicil-L-propil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina
N-beta-CBZ-L-lisina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de N-CBZ-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-me-tilcumarina cloridrato de N-CBZ-L-prolil-L-arginina-7-amido-4-metilcu- marina cloridrato de L-citrulina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de L-citrulina-7-amido-4-metilcumarina TFA ácido D-glutâmico-gama-(7-amido-4-metilcumarina) ácido L-glutâmico-alfa-(7-amido-4-metilcumarina) cloridrato de L-glutamina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de glutaril-glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcu- marina glutaril-glicilglicil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina glutaril-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de glicina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de glicil-L-alanina-7-amido-4-metilcumarina sal de glicil-L-arginina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de glicilglicina-7-amido-4-metilcumarina glicil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de glicil-L-prolina-7-amido-4-metilcumarina
L-histidina-7-amido-4-metilcumarina
L-isoleucina-7-amido-4-metilcumarina
L-isoleucina-7-amido-4-metilcumarina TFA
L-leucina-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de L-leucina-7-amido-4-metilcumarina
L-leucil-L-valil-L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina
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20/31 acetato de L-lisina-7-amido-4-metilcumarina acetato de L-metionina-7-amido-4-metilcumarina carbonato de L-ornitina-7-amido-4-metilcumarina
L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina TFA cloridrato de L-prolina-7-amido-4-metilcumarina sal de L-prolil-L-fenilalanil-L-arginina-7-amido-4-metilcu- marina ácido L-piroglutâmico-7-amido-4-metilcumarina cloridrato de L-serina-7-amido-4-metilcumarina hidrato de L-seril-L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina
L-tirosina-7-amido-4-metilcumarina [0045]Em um aspecto, esta invenção apresenta um meio para a detecção de um micro-organismo alvo em uma amostra. Em uma modalidade preferida, o meio compreende um substrato de enzima (por exemplo, uma aminopeptidase), um marcador condicionalmente detectável e um meio de suporte ao crescimento.
[0046]Antes desta invenção, os microbiologistas empregavam uma de duas estratégias para aumentar a especificidade do teste diagnóstico microbiano que estivesse sendo desenvolvido. O processo mais popular é o uso de agentes antimicrobianos para suprimir o crescimento e a detecção de micro-organismos não alvo. O segundo processo, muito menos popular, é o uso de um indicador específico, altamente seletivo, para o próprio micro-organismo alvo. Infelizmente, essa estratégia tem uma aplicabilidade muito limitada, porque, na prática, é muito difícil encontrar esse indicador para cada micro-organismo que esteja sendo detectado. Com a invenção aqui exposta, revela-se uma abordagem muito mais amplamente aplicável, que utiliza um indicador presumido para o micro-organismo alvo e micro-organismos não alvo capazes de crescimento e detecção no meio, seguido por um indicador de confirmação, que é substancialmente apenas reagido pelos micro-organismos não alvo. Essa estratégia tem ampla aplicabilidade. Conforme acima mencionado, devido
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21/31 à necessidade imediata na técnica, a bactéria Campylobacter é aqui usada como o exemplo prototípico. Entretanto, aqueles versados na técnica concluirão prontamente que o esquema genérico pode ser estendido a todos os micro-organismos.
[0047]A enzima L-alanina aminopeptidase era considerada presente em todas as bactérias gram-negativas. Trabalhos anteriores chegaram a sugerir que a medição da atividade dessa enzima por incorporação de um substrato de enzima apropriado diretamente a um meio de crescimento bacteriano poderia ser usada para detectar especificamente e quantificar a concentração de bactérias gramnegativas em uma amostra. Surpreendentemente, espécies de Campylobacter não expressam essa atividade de enzima em ensaios bioquímicos padronizados. A presente invenção compreende a detecção presumida de um micro-organismo alvo (por exemplo, espécies de Campylobacter), que pode ser conseguida colorimetricamente em um meio adequado contendo um marcador condicionalmente detectável (por exemplo, o corante vermelho tetrazólio), e sua identidade confirmada pela ausência de atividade enzimática (por exemplo, L-alanina aminopeptidase) que se saiba que esteja presente em substancialmente todos os micro-organismos não alvo.
[0048]Portanto, apresenta-se um meio para a detecção de micro-organismos alvo, exemplificando especificamente a detecção de espécies de Campylobacter em uma amostra de teste. Em certas modalidades preferidas, o meio fornece um resultado eficaz empregando um marcador condicionalmente detectável para detecção presumida de espécies de Campylobacter e um substrato de enzima detectável para uma enzima não expressa em espécies de Campylobacter, cuja ausência confirme a presença de espécies de Campylobacter. Além disso, ingredientes de tampão, carboidratos, aminoácidos, elementos residuais, sais e estimuladores do crescimento são fornecidos ao meio para permitir um crescimento suficiente desses organismos alvo, de modo que sinais detectáveis na amostra, devidos à redução bioquímica de vermelho tetrazólio pelas espécies de Campylobacter e à hidrólise do substrato de LPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 31/50
22/31 alanina aminopeptidase pelas espécies não Campylobacter, sejam mais eficazmente observados. Em modalidades preferidas adicionais, agentes antimicrobianos são adicionados ao meio para suprimir o crescimento de certas espécies não Campylobacter, por exemplo, polimixina B, vancomicina, cicloheximida, rifampicina, anfotericina B (para leveduras e bolores), cefaperazona e outros, quando apropriado.
[0049]Com relação à amostra prototípica, Campylobacter, demonstrou-se que essa espécie reduz bioquimicamente o corante vermelho tetrazólio, resultando na produção de uma cor vermelha intensa. O ágar Campy Line foi desenvolvido pelo USDA como um ágar de seleção de Campylobacter à base de ágar e contém vermelho tetrazólio para tingir colônias de Campylobacter e não Campylobacter após um período de incubação de 48 horas. A supressão de bactérias não alvo (isto é, não Campylobacter) nesse ágar é conseguida apenas com o uso de antibióticos que são incorporados ao meio durante a produção. Veja, por exemplo, Janet E. L. Corry, International Journal of Food Microbiology 26:43-76, 1995. A supressão dos organismos não alvo não é muito precisa, portanto, reações suplementares ainda são requeridas para confirmar a presença de espécies de Campylobacter nesse meio. De fato, assim como em muitos processos de detecção de micro-organismos, todos os processos existentes para a detecção de Campylobacter têm a exigência absoluta da presença de antibióticos no meio de crescimento para suprimir crescimento não alvo e reações suplementares complicadas para confirmar a identidade de colônias de Campylobacter presumidas.
[0050]Uma maneira de evitar as complicadas etapas de confirmação é descobrir uma maneira para distinguir espécies de Campylobacter de organismos não Campylobacter diretamente no meio de crescimento (por exemplo, colorimetricamente). Para fazer isso, seria necessário incorporar um substrato de enzima contendo uma porção detectável no meio de crescimento que as espécies de Campylobacter não pudesses hidrolisar, mas que substancialmente todos os organismos não
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Campylobacter pudessem. Um exemplo é o substrato de enzima L-alanina-7-amido4-metilcumarina, que é hidrolisado pela enzima L-alanina aminopeptidase, que desempenha essa função.
[0051]Com esta invenção, os problemas e questões encontrados com o desenvolvimento de testes diagnósticos microbianos foram significativamente reduzidos. Isso é conseguido pela incorporação de um esquema de detecção diretamente ao meio de crescimento contendo indicadores positivos presumidos e positivos confirmados para um micro-organismo alvo. O indicador presumido é reagido pelo micro-organismo alvo e por quaisquer micro-organismos não alvo capazes de crescer no meio, resultando na produção de um sinal mensurável. O indicador confirmado é reagido substancialmente por apenas micro-organismos não alvo, resultando em um sinal detectável diferente. A ausência de um sinal desse indicador é indicativa da presença do micro-organismo alvo. Um exemplo desse esquema de detecção que foi posto em prática é descrito abaixo para a detecção de espécies de Campylobacter em amostras de água de enxágue de aves domésticas. Entretanto, esta invenção pode ser estendida a qualquer micro-organismo em que o micro-organismo alvo tenha substancialmente menos de uma enzima particular, em oposição aos organismos não alvo provavelmente presentes na amostra.
[0052]Pela primeira vez na técnica, a presença de um micro-organismo alvo em uma amostra pode ser detectada com um alto grau de sensibilidade e seletividade por combinação de etapas de presunção e confirmação diretamente no meio de crescimento, sem necessidade de etapas de transferência, testes suplementares, um coquetel de agentes antimicrobianos ou uso de indicadores nutrientes. Nesta invenção, o teste de presunção é um indicador generalizado que pode ser bioquimicamente alterado por substancialmente todos os micro-organismos capazes de crescimento no meio, e o teste de confirmação é a ausência de alguma atividade metabólica única no micro-organismo alvo, que esteja presente nos microPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 33/50
24/31 organismos não alvo. Essa abordagem foi posta em prática para a detecção de espécies de Campylobacter em uma amostra por sua capacidade de reduzir o corante vermelho tetrazólio e sua incapacidade de hidrolisar o substrato de aminopeptidase L-alanina-7-amido-4-metilcumarina. Conforme aqui exposto, essas substâncias químicas podem ser incorporadas em um meio de crescimento adequado, cujo desenvolvimento é bem conhecido por aqueles versados na técnica.
[0053]A capacidade de espécies de Campylobacter de reduzir bioquimicamente vermelho tetrazólio em uma molécula de cor vermelha foi bem documentada. Entretanto, até a inesperada descoberta de que espécies de Campylobacter não possuem a capacidade de expressar atividade de L-alanina aminopeptidase, não era possível confirmar que esses micro-organismos produtores de cor vermelha fossem de fato Campylobacter, a menos que se realizasse uma série de complicadas etapas de confirmação. Era inesperado que espécies de Campylobacter não tivessem a capacidade de expressar essa atividade de enzima, porque a técnica ensina que a atividade de L-alanina aminopeptidase está presente em todas as bactérias gramnegativas em forma de bastonete e, portanto, sua presença seria esperada em espécies de Campylobacter. Consequentemente, pode-se aplicar uma análise de falta de função similar para outros sistemas de detecção microbiana, para aplicação dessa triagem enzimática presumida/de confirmação.
[0054]Assim, vários aspectos da presente invenção apresentam um meio de composição para a detecção presumida de espécies de Campylobacter por sua capacidade de reagir a um marcador condicionalmente detectável. Em uma modalidade, o marcador é o corante vermelho tetrazólio, a identidade desses organismos sendo confirmada pela ausência de uma atividade de enzima. Em uma modalidade, a enzima é a L-alanina aminopeptidase. A detecção presumida de espécies de Campylobacter é conseguida pelo aparecimento de uma cor vermelha no meio, que é confirmada pela ausência de fluorescência.
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25/31 [0055]Em uma modalidade preferida, pelo menos um marcador condicionalmente detectável é incluído em um meio de crescimento capaz de reagir com espécies de Campylobacter, juntamente com pelo menos um substrato de enzima hidrolisado por uma enzima não encontrada em espécies de Campylobacter, mas comum em espécies não Campylobacter capazes de crescimento e reprodução no meio. Em modalidades preferidas, o sinal produzido pelo marcador condicionalmente detectável e pelo substrato de enzima hidrolisado são diferentes. Em certas modalidades, o marcador condicionalmente detectável é vermelho tetrazólio. Em outras modalidades, o substrato de enzima é L-alanina-7-amido-4-metilcumarina. Em modalidades preferidas, o meio contém uma quantidade eficaz de tampões biológicos, carboidratos, vitaminas, aminoácidos, elementos, sais, estimuladores de crescimento e agentes seletivos para conferir viabilidade e enriquecimento específico de espécies de Campylobacter na presença de vermelho tetrazólio e L-alanina-7-amidometilcumarina. Além disso, embora o substrato de L-alanina aminopeptidase aqui preferido seja a L-alanina-7-amido-4-metilcumarina, deve-se entender que isso não exclui outros substratos cromogênicos, fluorogênicos ou de outra forma detectáveis para essa enzima e substratos que ainda não foram descobertos, mas que sejam posteriormente identificados por aqueles versados na técnica como sendo alternativas adequadas para esse substrato.
[0056]A invenção também apresenta um processo para detectar espécies de Campylobacter em uma amostra de teste. O meio é inoculado com a amostra de teste e incubado sob condições adequadas para o crescimento de espécies de Campylobacter durante um certo período de tempo, de preferência entre 12 e 60 horas, e mais preferivelmente entre 18 e 52 horas, incluindo todos os inteiros na faixa de números entre 12 e 60 e 18 e 52 horas. A produção, por exemplo, de vermelho tetrazólio bioquimicamente reduzido e a ausência de fluorescência de L-alaninaPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 35/50
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7-amido-4-metilcumarina hidrolisada indicam a presença de espécies de Campylobacter confirmadas na amostra de teste.
[0057]Em uma modalidade preferida, o meio é apresentado em forma de pó. O pó é, de preferência, liquefeito com diluente estéril antes de uma amostra de teste ser inoculada no meio. A incubação pode ser realizada microaerofilicamente a 42°C.
[0058]Em outra modalidade preferida, o processo usa um meio em forma de gel. Um meio preferido é um meio de ágar que compreenda tetrazólio (ou um composto relacionado) e L-alanina-7-amido-4-metilcumarina (ou um substrato relacionado).
[0059]Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um processo para quantificar o número de espécies de Campylobacter em uma amostra de teste. Neste aspecto, a invenção é um processo para enumerar a quantidade de espécies de Campylobacter em uma amostra por contato da amostra com o presente meio, colocação da mistura de amostra e meio em recipientes, incubação da mistura de amostra e meio, observação da quantidade e da qualidade dos sinais característicos detectáveis e comparação da quantidade de sinais característicos detectáveis com valores numéricos mais prováveis. O processo de quantificação compreende a comparação da quantidade e da qualidade da característica que tenha sido alterada, de preferência uma mudança de cor e/ou mesmo uma alteração fluorescente, para determinar estatisticamente o número mais provável de espécies de Campylobacter na amostra de teste. Essas determinações estatísticas ocorrem de acordo com metodologias conhecidas por aqueles versados na técnica. A técnica do número mais provável (MPN) se baseia em estatística de probabilidade. Os resultados de qualquer tipo de uma análise MPN estão diretamente relacionados à frequência de ocorrência de uma série de resultados positivos que mais provavelmente ocorrerão quando certos números de organismos estiverem presentes em uma amostra de teste.
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27/31 [0060]A composição da invenção é, de preferência, adicionada ao meio, que é, de preferência, usado para conduzir ensaios em placas de microtitulação de múltiplos poços. Em modalidades preferidas, a invenção é usada com o aparelho descrito por Croteau et al., na patente norte-americana n° 5.985.594, ou aquele descrito por Croteau et al., na patente norte-americana n° 5.700.655, que são aqui incorporadas por referência. Dispositivos de ensaio incorporando essa tecnologia são comercializados sob o nome comercial SimPlate® (BioControl Systems, Inc., Bellevue, WA). A etapa de quantificação envolve, de preferência, a introdução de uma amostra ambiental ou biológica em um meio liquefeito da invenção, colocação ou distribuição da mistura de amostra e meio em um dispositivo descrito por Croteau et al., incubação da amostra, detecção da quantidade e qualidade da porção de detecção característica e, opcionalmente, comparação da quantidade do sinal característico com os valores numéricos mais prováveis. De preferência, a etapa de incubação é realizada a 42°C durante um período de 48 a 52 horas em um incubador microaerofílico, usando o meio acima descrito, ou outras temperatura e tempo favoráveis, quando apropriado para o micro-organismo particular.
[0061]Usando-se o meio e os processos desta invenção, a concentração de Campylobacter em uma amostra de teste pode ser determinada muito mais fácil e rapidamente do que pelos processos atualmente disponíveis.
[0062]Nas várias modalidades, o número de micróbios alvo presentes em uma amostra líquida pode ser quantificado por misturação de uma amostra líquida com o meio acima descrito, colocação da amostra líquida incluindo o meio em recipientes adequados para incubação, incubação da mistura de amostra e meio líquida, observação da quantidade e da qualidade do sinal característico detectável e comparação da quantidade e da qualidade do sinal característico detectável com os valores numéricos mais prováveis. Esse processo de quantificação apresenta a comparação da quantidade e da qualidade da característica que tenha sido alterada, de
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28/31 preferência uma mudança de cor, aos valores numéricos mais prováveis obtidos de amostras em que a concentração e a alteração característica tenham sido correlacionadas com amostras cuja concentração de bactérias seja conhecida. Veja, por exemplo, Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3â ed., editado por Vandezant e Splittstoesser, 1992. A técnica de número mais provável permite estimativas de concentrações bacterianas que estejam abaixo dos limites detectáveis de outros processos. O número mais provável é estimado a partir de respostas em que os resultados sejam relatados como positivos ou negativos em uma ou mais diluições da amostra. O processo requer que nem todas as amostras forneçam um resultado positivo, e normalmente pelo menos três amostras de cada diluição são requeridas. Há muitos gráficos de número mais provável disponíveis. Uma dessas séries é fornecida por de Man, Eur. J. Appl. Microbiol. 1:67 (1975), aqui incorporada por referência. Estimativas do número mais provável podem ser feitas usando-se a fórmula genérica relatada por Thomas, J. Am. Water Works Assoc. 34:572 (1942), a seguir:
MPN/g = P/(NT) em que P é o número de tubos positivos, N é a quantidade total de amostra em todos os tubos negativos, e T é a quantidade total de amostra em todos os tubos. As quantidades são relatadas em termos de gramas.
EXEMPLOS
EXEMPLO I
DETECÇÃO DE CAMPYLOBACTER EM AMOSTRAS DE LAVAGEM DE
AVES DOMÉSTICAS [0063]Um total de vinte amostras de água de enxágue de aves domésticas foi coletado de uma instalação para aves domésticas canadense. Alíquotas de um ml de cada amostra de água de enxágue foram adicionadas a amostras de 9 ml de um meio contendo o corante vermelho tetrazólio e o substrato de aminopeptidase LPetição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 38/50
29/31 alanina-7-amido-4-metilcumarina. Cada mistura de 10 ml foi transferida para dispositivos SimPlate também vendidos pela BioControl Systems, Inc., e colocada em um incubador microaerofílico (5% de O2 e 10% de CO2) a 42°C. Alíquotas de um ml de cada amostra de água de enxágue também foram espalhadas sobre 4 placas de ágar Campy Line (0,25 ml por placa). Essas placas também foram colocadas em um incubador microaerofílico a 42°C. Todos os testes foram incubados durante 48 horas.
[0064]As SimPlates foram removidas do incubador após 48 horas, e o número de poços vermelhos (positivo presumido para Campylobacter) foram contados em cada placa. A seguir, uma luz UV portátil (366 nm) iluminou cada poço vermelho para se verificar a fluorescência. A ausência de fluorescência em cada poço positivo presumido foi considerada um positivo confirmado para Campylobacter. O número de poços positivos confirmados de cada placa foi convertido no número de organismos por ml de amostra de água de enxágue usando-se a Tabela de Conversão SimPlate fornecida pelo fabricante.
[0065]As placas de ágar Campy Line foram removidas do incubador após 48 horas, e o número de colônias vermelhas foi contado para cada conjunto de placas com água de enxágue. Colônias suspeitas de Campylobacter foram espalhadas sobre placas AHB e incubadas durante uma noite em um incubador microaerofílico a 42°C. Isolados que cresceram nas placas AHB foram submetidos a reações de imunoprecipitação para confirmar a presença de espécies de Campylobacter. Isolados confirmados de Campylobacter foram enumerados para cada conjunto de placas e expressos como o número de unidades formadoras de colônia (UFC) por ml de amostra de água de enxágue. Os resultados desse estudo são mostrados abaixo:
| Amostra | SimPlate (organismos/ml) | Ágar Line (UFC/ml) |
| 1 | 80 | 104 |
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30/31
| 2 | 414 | 302 |
| 3 | 392 | 381 |
| 4 | 288 | 227 |
| 5 | 50 | 67 |
| 6 | 56 | 82 |
| 7 | 124 | 120 |
| 8 | 440 | 367 |
| 9 | 86 | 79 |
| 10 | 40 | 46 |
| 11 | 100 | 111 |
| 12 | 86 | 76 |
| 13 | 624 | 673 |
| 14 | 112 | 78 |
| 15 | 132 | 207 |
| 16 | 116 | 126 |
| 17 | 84 | 79 |
| 18 | 184 | 145 |
| 19 | 68 | 87 |
| 20 | 104 | 110 |
EXEMPLO II
CORRELAÇÃO DA DETECÇÃO EM ÁGAR CAMPY-CEFEX DE
CAMPYLOBACTER EM AMOSTRAS DE LAVAGEM DE AVES DOMÉSTICAS COM
O PROCESSO DA INVENÇÃO [0066]Realizaram-se ensaios como acima, exceto que, em vez de placas de Ágar Campy-Line, foram utilizadas placas de ágar Campy-Cefex. Foram comparadas 162 lavagens de aves domésticas como acima. O ensaio em ágar Campy-Cefex foi realizado conforme descrito pelo Departamento Norte-americano de Agricultura
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31/31
ARS, Unidade de Pesquisa de Segurança Microbiológica em Aves Domésticas, Processo Para a Enumeração de Espécies de Campylobacter em Enxágues de Aves Domésticas, 15 de março de 2000, e confirmado positivo para Campylobacter por ensaios de aglutinação subsequentes. Os resultados dessa comparação são representados na Figura 1. Conforme se pode notar na observação da figura, os dados foram altamente correlativos e demonstram a utilidade do ensaio da invenção para se obterem resultados similares em um tempo muito mais curto, sem as trabalhosas etapas requeridas pelos processos padronizados.
[0067]Do exposto, ficará claro que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido aqui descritas para fins de ilustração, várias modificações podem ser feitas sem desviar do espírito e âmbito da invenção. Além disso, todas as referências, incluindo publicações, artigos de jornais, patentes e pedidos de patente, aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência em sua inteireza. Portanto, a invenção só se limita às reivindicações anexas.
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1/2
Claims (4)
- REIVINDICAÇÕES1. Meio para detectar Campylobacter em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) um substrato para uma L-alanina aminopeptidase;b) um marcador condicionalmente detectável que sofre uma mudança de cor quando reagido sobre um micro-organismo viável na amostra, e um substrato para uma L-alanina aminopeptidase, em que a dita L-alanina aminopeptidase está substancialmente ausente do micro-organismo alvo;c) uma porção sinal ligada ao substrato, a dita porção fornecendo um sinal detectável quando clivada pela dita L-alanina aminopeptidase de micro-organismos não alvo na amostra; ed) um meio de suporte ao crescimento para o enriquecimento específico de Campylobacter, em que o dito meio de suporte ao crescimento contém antibióticos para suprimir o crescimento de micro-organismos não alvo, e em que o dito marcador condicionalmente detectável e o dito substrato para a L-alanina aminopeptidase não são a mesma molécula.
- 2. Meio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito substrato é L-alanina-7-amido-4-metilcumarina, L-alanina-7-amido-4metilcumarina TFA, L-alanina-7-amido-4-trifluoro-metilcumarina TFA, L-alanil-Lalanil-L-fenilalanina-7-amido-4-metilcumarina ou L-alanil-L-alanil-L-fenilalanina-7amido-4-metilcumarina TFA.
- 3. Meio, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito substrato é L-alanina-7-amido-4-metilcumarina.
- 4. Processo para detectar Campylobacter em uma amostra CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:a) fornecer um meio como definido na reivindicação 1;Petição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 42/502/2b) inocular o meio com a amostra a ser testada quanto à presença de Campylobacter,c) incubar o meio inoculado sob condições adequadas para o crescimento de Campylobacter; ed) comparar a diferença entre a mudança de cor produzida pela redução bioquímica do marcador condicionalmente detectável e o sinal detectável produzido pela clivagem da porção sinal do substrato da L-alanina aminopeptidase, em que a ausência ou diminuição no sinal detectável indica a presença de Campylobacter na amostra.Petição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 43/501/1Petição 870170086615, de 09/11/2017, pág. 44/501/1
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