BRPI0114101B1 - “Processo para produzir uma cepa de Escherichia coli que produz entre 95 e 150 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura, cepas de E. coli e processo para produzir L-treonina - Google Patents

Abstract

"cepas de escherichia coli que superproduzem l-treonina e processos para a produção de l-treonina por fermentação". a presente invenção diz respeito aos campos de microbiologia e genética microbiana. mais especificamente, a invenção diz respeito a novas cepas bacterianas e processos que empregam essas cepas para produção fermentativa de aminoácidos tal como treonina.

Description

"PROCESSO PARA PRODUZIR UMA CEPA DE Escherichia coli QUE PRODUZ ENTRE 95 E 150 G/L DE L-TREONINA EM 48 HORAS

DE CRESCIMENTO EM CULTURA, CEPAS DE E. coli e PROCESSO PARA PRODUZIR L-TREONINA" O presente pedido de patente requer o beneficio da prioridade do pedido de patente provisório U.S. 60/235.884 de 28 de setembro de 2000.

Antecedentes da Invenção Campo da Invenção A presente invenção diz respeito aos campos de microbiologia e genética microbiana. Mais especificamente, a invenção diz respeito a novas cepas bacterianas e a processos que empregam essas cepas para produção fermentativa de aminoácidos, tal como L-treonina.

Tecnologia Relacionada Em Escherichia coli, os aminoácidos L-treonina, L- isoleucina, L-lisina e L-metionina derivam todos seus átomos de carbono, ou parte deles, de aspartato (ácido aspártico) via o caminho biossintético comum seguinte (G. N. Gohen, "The Common Pathway to Lysine, Methionine and Threonine", pg. 147-171 em Amino Acids: Biosynthesis and Genetic Regulation, K. M. Herrmann e R. L. Somerville, em seguida,, Addison-Welesley Publishing Co., Inc., Reading, Mass. (1983)) : A primeira reação deste caminho comum é catalisada por uma das três aspartato quinases distintas (AKI, II ou III), cada uma das quais é codificada por um gene separado, e difere das outras na maneira em que suas atividades e sínteses são reguladas. Aspartato quinase I, por exemplo, é codificada por thrA, sua atividade é inibida pela treonina, e sua síntese é reprimida pela treonina e isoleucina em combinação. AKII, entretanto, é codificada por metL, e sua síntese reprimida pela metionina (embora sua atividade não seja inibida pela metionina ou por combinações pareadas de metionina, lisina, treonina e isoleucina (F. Falcoz-Kelly et al., Eur. J. Bíochem. 8:146-152 (1969): J. C. Patte et al., Biochim. Biophys. Acta 136:245-257 (1967). AKIII é codificada por lysC, e sua atividade e síntese são inibidas e reprimidas, respectivamente, pela lisina.

Duas das AKs, I e II, não são proteínas distintas, mas, em vez disso, um domínio de uma enzima complexa que inclui homosserina desidrogenase I ou II, respectivamente, cada uma das quais catalisa a redução de aspartato semialdeído em homosserina (P. Truffa-Bacchi et al., Eur. J.

Biochem. 5:73-80 (12968)). Homosserina desidrogenase I (HD I) é, portanto, também codificada por thrA, sua síntese é reprimida pela treonina mais isoleucina, e sua atividade é inibida pela treonina. Homosserina desidrogenase II (HD II) é similarmente codificada por metL, e sua sínteses é reprimida pela metionina. A biossíntese da treonina inclui as seguintes reações adicionais: homosserina -> fosfato de homosserina -> treonina. A fosforilação de homosserina é catalisada pela homosserina quinase, uma proteína que é composta de duas subunidades de 29 kDa idênticas codificadas pela thrB e cuja atividade é inibida pela treonina (B. Burr et al., J.

Biochem. 62:519-526(1976)). A etapa final, a conversão complexa de fosfato de homosserina em L-treonina é catalisada pela treonina sintase, uma proteína de 47 kDa codificada por thrC (C. Parsot et al., Nucleic Acids Res. 11: 7331-7345 (1983)). A isoleucina pode ser produzida em E. coli utilizando-se treonina como um precursor (ver Haschiguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 63:672-679 (1999). Mais especificamente, a isoleucina é produzida via as seguintes reações: Treonina -> α-cetobutirato -> a-aceto-a- hidroxibutirato -> a,p-diidroxi-p-metilvalerato -> a-ceto-β- metilvalerato -> isoleucina. Essas reações são catalisadas em E. coli, respectivamente, pelas enzimas seguintes: treonina desaminase (ilvA); aceto-hidroxiácido sintetase I, II ou III (ilvBN, ilvGM e ilvIH, respectivamente) ; diidroxiácido redutoisomerase (ilvC); diidroxiácido desidratase (ílvü) e transaminase-B (ilvE). 0 óperon de isoleucina de E. coli é composto de ilvA, ilvGM, ilvD e ilvE. 0 produto do gene ilvA (isto é, treonina desaminase) é inibido pela L-isoleucina, e o produto do gene ilvGM (isto é, aceto-hidroxiácido sintetase II) é inibido pela L-valina. Além do mais, acredita-se que as reações catalisadas pela treonina desaminase e as aceto- hidroxiácido sintetases sejam as principais etapas limitantes da taxa na produção de isoleucina.

Os genes thrA, thrB e thrC todos pertencem ao óperon thr, um óperon único localizado a 0 minuto no mapa genérico de E. coli (J. Thèze e I. Saint-Girons, J.

Bacteriol. 118:990-998 (1974); J. Thèze et al., J.

Bacteriol. 117:133-143 (1974)). Esses genes codificam, respectivamente, para aspartato quinase I - homosserina desidrogenase I, homosserina quinase e treonina sintase. A biossintese dessas enzimas está sujeito à repressão multivalente pela treonina e isoleucina (M. Freunclich, Biochem. Biophys. Res. Coirnun. 10:277-282 (1963)).

Uma região reguladora é encontrada a montante do primeiro gene estrutural no óperon thr, e sua seqüência foi determinada (J. F. Gardner, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:1706-1710 (1979)). O atenuador thr, a jusante do sítio de iniciação de transcrição, contém uma seqüência que codifica um peptídeo líder; esta seqüência inclui oito códons de treonina e quatro códons de isoleucinas. O atenuador thr também contém as estruturas secundárias mutuamente exclusivas clássicas que permitem ou previnem a transcrição de RNA polimerase dos genes estruturais no óperon thr, dependendo dos níveis dos treonil- e isoleucil-tRNAs carregados.

Em virtude dos problemas associados com a obtenção de altos níveis de produção de aminoácido via biossintese natural (por exemplo, repressão do óperon thr pelo produto desejado), foram produzidas cepas bacterianas com plasmídeos que contêm um óperon thr com um gene thrA que codifica uma enzima resistente à retroalimentação. Com tais plasmídeos, a L-treonina foi produzida numa escala industrial por meio de processos de fermentação que empregam uma ampla variedade de microorganismos, tais como Brevibacterium flavum, Serratia marcescens e E. coli.

Por exemplo, a cepa E. coli BKIIM B-3996 (Debabov et al., patente U.S. 5.175.107), que contém o plasmídeo pVIC40, produz cerca de 85 g/L em 36 horas. O hospedeiro é uma cepa que requer treonina, em virtude de uma treonina sintase deficiente. Na BKIIM B-3996, é um plasmídeo recombinante, pVIC40, que fornece as atividades enzimáticas cruciais, isto é, uma homosserina quinase e treonina sintase, AKI-HD I resistente à retroalimentação, necessárias para a biossíntese da treonina. Este plasmídeo também complementa a auxotrofia da treonina hospedeira. A cepa E. coli 29-4 (E. Shimizu et al., Biosci.

Biotech. Biochem: 59:1095-1098 (1995)) é um outro exemplo de um produtor de E. coli treonina recombinante. A cepa 29-4 foi construída clonando-se o óperon thr de uma cepa mutante superprodutora de treonina, E. coli K-12 (βΙΜ-4) (derivada da cepa E. coli Depósito ATCC nr. 21277) , em plasmídeo pBR322, que foi então introduzida na cepa parental (K. Wiwa et al., Agric. Biol. Chem. 47:2329-2334 (1983)). A cepa 29-4 produz cerca de 65 g/L de L-treonima em 72 horas.

Cepas recombinantes construídas similarmente foram produzidas, utilizando-se outros organismos. Por exemplo, a cepa Serratia marcescens T2000 contém um plasmídeo com um óperon thr, o qual codifica um produto do gene thrA resistente à retroalimentação e produz cerca de 100 g/L de treonina em 96 horas (M. Masuda et al.; Applied Biochem.

Biotechn. 37:255-262 (1992)). Todas essas cepas contêm plasmídeos com múltiplas cópias dos genes que codificam as enzimas biossintéticas de treonina, as quais possibilitam a superexpressão dessas enzimas. Esta superexpressão dos genes nascidos de plasmídeos que codificam enzimas biossintéticas de treonina, particularmente um gene thrA que codifica um AK I-HD I resistente à retroalimentação, permite que essas cepas produzam grandes quantidades de treonina. Outros exemplos de microorganismos que contêm plasmídeos encontram- se descritos, por exemplo, nas patentes U.S. 4.321.325, 4.347.318, 4.371.615, 4.601.983, 4.757.009, 4.945.058, 4.946.781, 4.980.285, 5.153.123 e 5.236.831.

Cepas que contêm plasmídeos, tais como as supradescritas, entretanto, apresentam problemas que limitam suas aplicabilidades para produção fermentativa comercial de aminoácidos. Por exemplo, um problema significativo com essas cepas é assegurar que a integridade da cepa que contém plasmídeo seja mantida durante todo o processo de fermentação, em virtude da perda potencial do plasmídeo durante o crescimento e divisão celular. Para evitar este problema, é necessário eliminar seletivamente células isentas de plasmídeo durante a cultura, tal como pelo emprego de genes resistentes a antibiótico no plasmídeo.

Esta solução, entretanto, precisa da adição de um ou mais antibióticos ao meio de fermentação, o que não é comercialmente prático para fermentações em grande escala.

Um outro problema signifícante com cepas que contêm plasmídeo é a estabilidade do plasmídeo. Alta expressão de enzimas cujos genes são codificados no plasmídeo, a qual é necessária para processos fermentativos comercialmente práticos, geralmente leva à instabilidade de plasmídeo (E. Shimizu et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59:1095-1098 (1995)). A estabilidade do plasmídeo também depende de fatores tais como a temperatura de cultura e o nível de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Por exemplo, a cepa que contém plasmídeo 29-4 foi mais estável a temperaturas de cultura mais baixas (30°C contra 37°C) e níveis mais altos de oxigênio dissolvido (E. Shimizu et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59:1095-1098 (1995)).

Microorganismos que contêm não-plasmídeos, embora menos eficazes do que os supradescritos, foram também usados como produtores de treonina. Cepas E. coli, tal como H-8460, que são obtidas de uma série de mutagêneses convencionais e seleção para resistência a diversos análogos metabólicos, produzem cerca de 75 g/L de L-treonina em 70 horas (Kino et al. patente U.S. 5.474.918). A cepa H-8460 não leva um plasmídeo recombinante e tem uma cópia dos genes biossintéticos de treonina no cromossoma. Acredita-se que menor produtividade desta cepa, comparada com as cepas portadoras de plasmídeo, tal como BKIIM B-3996, seja atribuída às atividades enzimáticas mais baixas (particularmente aquelas codificadas pelo óperon thr), já que essas cepas que contêm não-plasmídeo levam somente uma única cópia de genes biossintéticos de treonina.

Uma cepa que produz L-treonina de E. colí, KY10935, produzida por múltiplas sucessões de mutação está descrita em K. Okamoto et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 61:1877-1882 (1997). Quando cultivadas sob condições ideais com L-metionina; está reportado que a cepa KY10935 produz no máximo 100 g/litro de L-treonina depois de 77 horas de cultivo. Acredita-se que o alto nível de L-treonina produzido resulte da incapacidade desta cepa de captar a L- treonina que se acumula extracelularmente, resultando numa diminuição no nível de estado estacionário de L-treonina intracelular e na liberação das etapas reguladoras restantes no caminho de produção de L-treonina a partir da inibição de retroalimentação.

Outros exemplos de microorganismos que contêm não- plasmídeo adequado encontram-se descritos, por exemplo, nas patentes U.S. 5.939.307, 5.474.918, 5.264.353, 5.164.307, 5.098.835, 5.087.566, 5.077.207, 5.017.483, 4.463.094, 3.580.810 e 3.375.173.

Tanto nas cepas que contêm não-plasmídeo como plasmídeo de E. coli, o óperon thr é controlado pela respectiva treonina nativa da cepa particular. Conforme supradescrito, a expressão do promotor nativo é regulada por um mecanismo de atenuação controlado por uma região de DNA que codifica um peptídeo líder e que contém um número de códons de treonina e isoleucina. Esta região é traduzida por um ribossomo que detecta os níveis de treoninil-tRNA e isoleucinil-tRNA. Quando esses níveis são suficientes para que o peptídeo líder seja traduzido, a transcrição não é terminada prematuramente, mas, quando os níveis são insuficientes para que o peptídeo líder seja traduzido, a transcrição não é terminada, e todo o óperon é traduzido, o que, após a transdução, resulta numa maior produção das enzimas biossintéticas de treonina. Assim, quando os níveis de treonil-tRNA e/ou isoleucinil-tRNA estão baixos, o óperon thr é traduzido de forma máxima, e as enzimas biossintéticas de treonina são produzidas de forma máxima.

Na cepa E. coli BKIIM B-3996 de produção de treonina, o óperon de treonina no plasmídeo é controlado pelo seu promotor nativo. Em decorrência disto, o óperon thr somente é expresso de forma máxima quando a cepa sofre privação de treonina e/ou isoleucina. Uma vez que a privação de treonina não é possível em uma cepa que produz treonina, essas cepas têm se tornado auxotróficas para isoleucina, a fim de se obter um maior nível de atividade enzimática.

Uma outra maneira de superar o controle de atenuação é reduzir o(s) nível(s) de treonil-tRNA e/ou isoleucinil-tRNA na célula. Um mutante thrS, por exemplo, com uma treonil-tRNA sintase que apresenta uma afinidade aparente 200 vezes menos para treonina, resulta em superexpressão do óperon thr, presumivelmente por causa do baixo nível de treonil-tRNA (E. J. Johnson et al., J.

Bacteriol. 129:66-70 (1977)).

Entretanto, em processos de fermentação com utilização dessas cepas, as células devem ser suplementadas com isoleucina no estágio de crescimento, em virtude da biossíntese de isoleucina deficiente das mesmas.

Subsequentemente, no estágio de produção, as células são destituídas de isoleucina para induzir a expressão das enzimas biossintéticas de treonina. Um principal inconveniente, portanto, para uso de promotores de treonina nativos para controlar a expressão das enzimas biossintéticas de treonina é que as células devem ser suplementadas com isoleucina. 0 antibiótico borrelidina, um produto natural de Streptomyces rochei, é também conhecido por reduzir a atividade enzimática de treonil tRNA-sintetase e, portanto, inibir o crescimento de E. coli (G. Nass et al., Biochem.

Biophys. Res. Commun. 34:84 (1969)). Em vista desta reduzida atividade, certas cepas sensitivas à borrelidina de E. coli têm sido empregadas para produzir altos níveis de treonina (pedido de patente japonês publicado 6752/76; patente U.S. 5.264.353). Observou-se que a adição de borrelidina à cultura aumenta o rendimento de L-treonina. Cepas sensíveis a borrelidina de Brevibacterium e Corynebacterium foram também usadas para produzir altos níveis de treonina (patente japonesa 53-101591) .

Mutantes resistentes à borrelidina de E. coli similarmente apresentam alterações na atividade treonil tRNA-sintetase. Mais especificamente, tem sido mostrado que E. coli resistente a borrelidina apresenta uma ou mais das seguintes características: (i) níveis constitutivamente aumentados de treonil tRNA-sintetase tipo selvagem; (ii) treonil tRNA-sintetase estruturalmente alterada; ou (iii) alguma alteração celular desconhecida, provavelmente por causa de uma mudança de membrana (G. Nass e J. Thomale, FEBS

Lett. 39:182-186 (1974)). Entretanto, nenhuma dessas cepas mutantes tem sido usada para produção fermentativa de L- treonina.

Recentemente, foram descritas Cepas E. colí que contêm óperons thr cromossomicamente integrados sob o controle regulamentar de um promotor não nativo (Wang et al., patente U.S. 5.939.307, cuja divulgação completa está aqui incorporada como referência). Mostrou-se que uma dessas cepa, ADM Katl3, produz até 102 g/L de L-treonina depois de 48 horas em cultura. A tecnologia ainda prescinde de cepas de microorganismos que sejam facilmente cultiváveis e que produzam eficientemente grandes quantidades de aminoácidos, tais como treonina e isoleucina.

Sumário da Invenção Um objetivo da presente invenção é fornecer microorganismos que produzam eficientemente aminoácidos (por exemplo, L-treonina) em grandes quantidades e altos rendimentos. Em geral, os microorganismos da invenção não exigem nenhum plasmídeo recombinante que contenha genes que codifiquem enzimas na biossíntese do produto aminoácido e, na maioria dos casos, não têm nenhuma exigência nutricional de aminoácido.

Quando cepas bacterianas da invenção superproduzem L-treonina, em muitos casos, essas cepas serão resistentes tanto à própria L-treonina como ao rafinato de treonina (TRF).

Em uma modalidade, a invenção está voltada para processos para produzir cepas de Escherichía coli capazes de produzir entre cerca de 95 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas de crescimento em cultura, compreendendo (a) inserir no cromossomo de uma E. coli, pelo menos, um óperon de treonina operavelmente ligado a um promotor não nativo para produzir uma cepa parental; e (b) realizar, pelo menos, um ciclo de mutagênese na cepa parental, seguido pela seleção das células que sofreram mutagênese para identificar E. coli que produzem entre cerca de 95 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas de crescimento em cultura. A invenção também inclui cepas E. coli produzidas pelos processos citados.

Em modalidades afins, a invenção está voltada para processos para produzir cepas E. coli capazes de produzir entre cerca de 110 e cerca de 120 g/L de L-treonina, entre cerca de 110 e cerca de 130 g/L de L-treonina, ou entre cerca de 100 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas de crescimento em cultura.

Em modalidades afins adicionais, a invenção está voltada para processos para produzir cepas E. coli que empregam agentes tais como agentes alquilantes, agentes intercalantes e luz ultravioleta para induzir mutações.

Em outras modalidades afins, a invenção está voltada para processos para produzir cepas E. coli com dois ou três óperons de treonina inseridos no cromossomo da E. coli. Além do mais, esses óperons de treonina individuais podem ser ligados operacionalmente, pelo menos, a dois promotores não nativos diferentes. Promotores não nativos adequados para uso na invenção incluem promotor tac, o promotor lac, o promotor trp, o promotor lpp, o promotor PL e o promotor Ps.

Modalidades afins também incluem processos para produzir cepas E. coli com óperons de treonina que contenham genes que codificam aspartato quinase - homosserina desidrogenase resistente a retroalimentação. Além disso, cepas E. coli usadas para gerar as cepas da invenção podem conter um gene treonina desidrogenase defeituoso nos seus cromossomos.

As cepas que podem ser usadas nos processos supradescritos incluem aquelas que contêm um óperon de treonina obtido da cepa E. coli depositada como Depósito ATCC nr. 21277.

Os processos supradescritos podem também ser usados para gerar cepas que sejam resistente a rafinato de treonina, resistente a borrelidina ou a ácido ciclopentacarboxílico (CPCA), ou resistente a qualquer combinação de rafinato de treonina, borrelidina e CPCA.

Assim, a invenção também inclui cepas E. coli produzidas pelos processos citados que são resistentes a rafinato de treonina, resistentes a borrelidina ou CPCA, ou resistentes a qualquer combinação de rafinato de treonina, borrelidina e CPCA.

Em outras modalidades, a invenção está voltada para cepas E. coli que compreendem, pelo menos, um óperon de treonina cromossomicamente integrado ligado operacionalmente a um promotor não nativo. Essas cepas são capazes de produzir entre cerca de 110 e cerca de 120 g/L de L- treonina, entre cerca de 110 e cerca de 130 g/L de L- treonina, entre cerca de 100 e cerca de 140 g/L de L- treonina, ou entre cerca de 95 e cerca de 150 g/L de L- treonina em cerca de 48 horas de crescimento em cultura. As cepas da invenção geralmente não incluem as cepas E. coli KY10935, ADM TH1.2 e ADM Katl3.

Em modalidades afins, a invenção inclui cepas E. coli que têm as características citadas e que compreendem um óperon de treonina obtido da cepa E. coli depositada como Depósito ATCC nr. 21277. A invenção também inclui cepas E. coli que são resistentes a rafinato de treonina e que são capazes de produzir entre cerca de 110 e cerca de 120 g/L de raf inato de treonina e que são capazes de produzir entre cerca de 110 e cerca de 120 g/L de L-treonina, entre cerca de 110 e cerca de 130 g/L de L-treonina, entre cerca de 100 e cerca de 140 g/L de L-treonina, ou entre cerca de 95 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas de crescimento em cultura.

Em outras modalidades, o óperon de treonina de cepas E. coli da invenção codifica um gene de aspartato quinase I - homosserina desidrogenase I (thrA), um gene homosserina quinase (thrB) e um gene treonina sintase (thrC) resistentes a retroalimentação.

Em mais outras modalidades, as cepas E. coli da invenção contêm um gene de treonina desidrogenase defeituoso em seus cromossomos. A invenção também inclui cepas E. coli que têm as características da cepa depositada como NRRL B-30319 (Agriculture Research Culture Collection (NRRL), 1815 N.

University Street, Peoria, Illinois, 61604, USA). A invenção inclui ainda as cepas E. coli depositadas como NRRL B-30316, NRRL B-30317, NRRL B-30318 e NRRL B-30319 (Agriculture Research Culture Collection (NRRL), 1815 N. University Street, Peoria, Illinois 61604, USA) .

Adicionalmente, a invenção está voltada para processos para produzir L-treonina que compreendem as etapas de cultivar as cepas supramencionadas e recuperar a L- treonina produzida.

Descrição Resumida das Figuras A figura 1 representa a construção de plasmídeo pAD103 lambda 676 originado de Kohara e do plasmídeo pUC19. A figura 2 representa a construção do plasmídeo pAD106 a partir do plasmídeo pAD103 e do plasmídeo pUC4k. A figura 3 representa a construção do plasmídeo pAD115 a partir do plasmídeo pAD103 e do plasmídeo pkK223-3. A figura 4 representa a construção do plasmídeo pAD123 a partir do plasmídeo pAD115 e do plasmídeo pAD106. A figura 5 representa a integração da região do promotor a partir do plasmídeo pAD123 no cromossomo de E. coli. A figura 6 representa a construção do plasmídeo pAD132 pela inserção da deleção tdh::cat da cepa E. coli SP942 no plasmídeo pUC18. A figura 7 representa a construção do plasmídeo pAD133 pela inserção de ácido nucléico que contém um gene resistente a canamicina e um óperon thr ligado operacionalmente num promotor tac no plasmídeo pAD132. A figura 8 representa uma modalidade específica do processo mutagênico passo-a-passo descrito no exemplo 6 para gerar cepas da invenção que demonstram maior produção de L- treonina.

Descricão Detalhada das Modalidades Preferidas A presente invenção fornece novas cepas de microorganismos que, quando crescidas em cultura, produzem quantidades relativamente grandes de aminoácidos (por exemplo, L-treonina e L-isoleucina). São ainda providos métodos para produzir as cepas supramencionadas e métodos para produzir aminoácidos (por exemplo, L-treonina e L- isoleucína) com utilização dessas cepas. Assim, a invenção está voltada, em parte, para novas cepas bacterianas que podem ser usadas em processos de fermentação para a produção de aminoácido, tais como L-treonina ou L-isoleucina.

De acordo com um aspecto, a invenção fornece cepas bacterianas (por exemplo, cepas E. coli) que demonstram tanto resistência ao rafinato como melhores propriedades de crescimento. Essas cepas bacterianas possibilitam a produção de aminoácidos em grandes quantidades e com altos rendimentos.

Inúmeras alterações podem ser feitas nas células bacterianas as quais alteram seus metabolismos e conferem a elas a capacidade de produzir maiores quantidades de aminoácidos e outros produtos metabólicos. Exemplos de tais alterações incluem o seguinte: 1. Eliminação ou redução de mecanismos de controle de retroalimentação de um ou mais caminhos biossintéticos que levam à produção de aminoácidos ou precursores de aminoácidos. 2. A melhoria do fluxo metabólico, tanto pela amplificação como pelo aumento da expressão de genes que codificam enzimas limitantes da taxa de vias biossintéticas que levam à produção de aminoácido ou precursores de aminoácidos. 3. Inibição da degradação de um produto final de aminoácido desejado ou de um ou mais intermediários e/ou de precursores do produto final aminoácido desejado. 4. Aumento da produção de intermediários e/ou de precursores de aminoácido. 5. Quando a via que leva â produção de um produto final de aminoácido desejado for ramificado, inibição das ramificações que não levam ao aminoácido a aumentar a disponibilidade de intermediário e/ou precursor. 6. Alteração da permeabilidade de membrana para otimizar a captação de moléculas de energia (por exemplo, glicose), intermediários e/ou precursores.

Alteração da permeabilidade de membrana para otimizar a excreção do produto final de aminoácido. 8. Melhoria da tolerância de crescimento a concentrações relativamente altas de produtos finais (por exemplo, aminoácidos), produtos de resíduos metabólicos (por exemplo, ácido acético), ou subprodutos metabólicos (por exemplo, derivados de aminoácido, tanto formados pelas próprias bactérias como formados no meio de cultura) que são inibidores do crescimento celular bacteriano. 9. A melhoria da resistência a alta pressão osmótica durante a cultura, decorrente de altas concentrações de fontes de carbono (por exemplo, glicose) ou de produtos finais (por exemplo, aminoácidos). 10. A melhoria da tolerância de crescimento a alterações em condições ambientais (por exemplo, pressão, temperatura, pH, etc.). 11. Aumento das atividades de enzimas envolvidas na captação e uso de fontes de carbono no meio de cultura (por exemplo, rafinose, estaquiose ou proteínas, bem como outros componentes de licor da maceração de milho). A bactéria otimizada para produção de um produto final particular (por exemplo, L-treonina) geralmente irá diferir da bactéria tipo selvagem por ter múltiplas características (por exemplo, duas ou mais características expostas na lista apresentada) que levam à maior produção do produto final desejado. A invenção assim inclui métodos para produzir cepas bacterianas que apresentam as propriedades supracitadas e que produzem maiores quantidades de aminoácido, comparadas com as cepas tipo selvagem. A invenção também inclui cepas bacterianas produzidas pelos métodos aqui descritos. I. Definições As definições seguintes são fornecidas para esclarecer o assunto objeto que os inventores consideram ser a presente invenção.

Na forma aqui usada, o termo "rendimento" se refere à quantidade de um produto produzido em relação à quantidade de um material de partida. Com relação a aminoácidos produzidos por um microorganismo, rendimento se refere à quantidade de aminoácido produzido com relação à quantidade de intermediário, precursor ou nutriente provida.

Por exemplo, quando 100 gramas de dextrose é suprida a um microorganismo que produz 25 gramas de L-isoleucina, o rendimento de L-isoleucina, com relação à dextrose, é de 25%.

Na forma aqui usada, o termo "rafinato" se refere a produtos residuais gerados nas operações de troca de íons para recuperação de aminoácido do caldo de fermentação no qual a bactéria foi cultivada.

Na forma aqui usada, a expressão "rafinato de treonina (TRF)" se refere a produtos residuais gerados de operações de troca de íons para recuperação de treonina do caldo de fermentação no qual a bactéria que produz treonina foi cultivado.

Como é de conhecimento dos técnicos habilitados, TRF é uma composição heterogênea, cujo teor irá variar de acordo com inúmeros fatores (por exemplo, a composição do meio de cultura inicial, as exigências nutricionais do(s) organismo(s) cultivado(s), produtos metabólicos produzidos pelo(s) organismo(s) cultivado(s) e processos de preparação cromatográfica usados). Com propósitos de selecionar e identificar bactérias que sejam resistentes a TRF, TRF geralmente terá as características apresentadas aqui na seção II.

Na forma aqui usada, o termo "cepa" se refere à bactéria de espécies particulares que têm características comuns. A menos que indicado ao contrário, os termos "cepa" e "célula" são usados indiscriminadamente aqui. Como técnicos habilitados reconhecem, cepas bacterianas são compostas de células bacterianas individuais. Além disso, células bacterianas individuais têm características específicas (por exemplo, um nível particular de resistência a TRF) que as identifica como membros de suas cepas particulares.

Na forma aqui usada, o termo "mutação" se refere a uma inserção, deleção ou substituição em uma molécula de ácido nucléico. Quando presente na região de codificação de um ácido nucléico, uma mutação pode ser "calada" (isto é, não resultar em nenhum efeito fenotípico) ou pode alterar a função do produto de expressão da região de codificação.

Quando ocorre uma mutação na região reguladora de um gene ou óperon, a mutação pode tanto não ter efeito como alterar as características de expressão do ácido nucléico regulado.

Na forma aqui usada, o termo "mutagênese" se refere a um processo por meio do qual uma ou mais mutações são geradas em um material genético de organismo (por exemplo, DNA). Com mutagênese "aleatória", o sítio exato de mutação não é previsível, ocorrendo em qualquer lugar no cromossomo do microorganismo. Além disso, com mutagênese aleatória, as mutações geralmente ocorrem em decorrência de danos físicos no ácido nucléico do organismo provocados por agentes tais como radiação ou tratamento químico. Conforme discutido em mais detalhe a seguir, inúmeros agentes podem ser usadas para realizar mutagênese.

Na forma aqui usada, a expressão "ciclo de mutagênese" no geral se refere ao tratamento de células com um mutagênico, ou combinação de mutagênicos, seguido por cultura dessas células para permitir que as células sobreviventes se reproduzam. Em muitos casos, as células submetidas a mutagênese serão selecionadas para identificar aquelas com características particulares depois de cada ciclo de mutagênese. Além disso, como parte de um ciclo de mutagênese, as células tratadas com um mutagênico podem ser expostas a um agente seletivo (por exemplo, TRF) imediatamente depois da mutagênese ou enquanto ainda expostas a mutagênico.

Na forma aqui usada, o termo "fenótipo" se refere a características físicas observáveis que dependem da constituição genética de um microorganismo. Exemplos de fenótipos incluem a capacidade de expressar produtos de gene particular e a capacidade de produzir certas quantidades de um aminoácido particular em um certo tempo especificado.

Na forma aqui usada, o termo "superproduzir" se refere â produção de um composto por uma célula em uma quantidade maior do que a quantidade produzida por uma cepa de referência (por exemplo, uma cepa parental). Um exemplo de uma cepa de superprodução seria uma cepa gerada a partir de uma cepa parental (isto é, a cepa de referência) utilizando-se mutagênese que produz mais L-treonina do que a parental. Assim, a cepa gerada por mutagênese "superproduziria" L-treonina, em comparação com a cepa de referência parental.

Na forma aqui usada, o termo "óperon" se refere a uma unidade de expressão e regulação de gene bacteriano. Óperons são geralmente compostos de elementos reguladores e, pelo menos, um quadro de leitura aberta (ORF). Um exemplo de um óperon é o óperon de treonina de E. coli, que é composto de uma região reguladora e três quadros de leitura aberta.

Um outro exemplo de um óperon é o óperon de isoleucina de E. coli, que é composto de uma região reguladora e quatro quadros de leitura aberta.

Na forma aqui usada, a expressão "cepa parental" se refere a uma cepa de um microorganismo sujeito a mutagênese para gerar um microorganismo da invenção. Assim, o uso da expressão "cepa parental" não se adequa necessariamente à expressão "tipo selvagem", nem fornece informação sobre a história da cepa referida. II. Cepas da Invenção e Suas Preparações Novas cepas bacterianas da presente invenção têm as seguintes características: (1) elas contêm, pelo menos, um óperon, que (a) é integrado no cromossomo bacteriano, (b) está sob o controle de um promotor não nativo, e (c) codifica enzimas envolvidas em síntese de aminoácido; e (2) elas são capazes de produzir um ou mais aminoácidos mediante crescimento em cultura.

Em modalidades particulares, as novas cepas bacterianas da presente invenção incluem cepas que têm as seguintes características: (1) elas contêm, pelo menos, um óperon thr (isto é, contêm, pelo menos, um conjunto de genes que codifica enzimas biossintéticas de treonina), que (a) são integradas no cromossoma bacteriano e (b) estão sob o controle de um promotor não nativo; e (2) elas são capazes de produzir tanto L-treonina como L-isoleucina mediante crescimento em cultura. A. Óperons Adequados para Uso Com a Invenção Conforme explicado, embora a invenção possa ser usada para produzir células que superproduzam um número considerável de aminoácidos, a invenção está discutida a seguir basicamente com relação a células que superproduzem L-treonina e L-isoleucina, bem como a processos para produzir esses aminoácidos. 0 óperon de treonina (thr) no cromossomo de células de cepas bacterianas incluídas no escopo da invenção codifica enzimas necessárias para a biossíntese da treonina.

Pelo fato de diversas enzimas serem capazes de catalisar reações para produzir vários intermediários no caminho da treonina, os genes presentes no óperon de treonina empregados podem variar. Por exemplo, o óperon de treonina pode ser composto de um gene AK-HD (thrA ou metL), um gene de homosserina quinase (thrB), e um gene de treonina sintase (thrC) . Além disso, o óperon thr pode ser composto de thrA (o gene AK I-HD I), thrB e trhC. Óperons thr adequados podem ser compostos de thrA (o gene AK I-HD I) , thrB e thrC. Óperons thr adequados podem ser obtidos, por exemplo, a partir de cepas E. coli depositadas na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA e o Depósito ATCC Nos. 21277 e 21530 requerido.

Além disso, múltiplas cópias do óperon thr podem estar presentes nos cromossomos de células bacterianas da invenção. 0 número aumentado de cópias do óperon thr geralmente resultará na maior expressão de genes deste óperon mediante indução.

Em muitos casos, o óperon thr contém, pelo menos, um gene não-atenuado (isto é, a expressão do gene não é suprimida pelos níveis (extra e/ou intracelular) de uma ou mais das enzimas biossintéticas de treonina e/ou os seus produtos (por exemplo, L-treonina e L-isoleucina)). As cepas inventivas podem também conter um óperon thr com um atenuador thr defeituoso (a região reguladora à jusante do sítio de iniciação de transcrição e à montante do primeiro gene estrutural), ou um óperon thr que falta completamente o atenuador thr.

Em uma modalidade específica, o óperon thr codifica uma ou mais enzimas biossintéticas de treonina resistentes à retroalimentação (por exemplo, a atividade da enzima não é inibida pelos níveis extra e/ou intracelular dos intermediários e/ou produtos de biossínteses da treonina). Em uma modalidade mais específica, o óperon thr contém um gene que codifica um AK-HD resistente a retroalimentação AK I-HD I. 0 uso de um AK-HA resistente a retroalimentação fornece um nível mais alto de atividade enzimática para biossíntese da treonina, mesmo na presença da L-treonina que está sendo produzida. A expressão do(s) óperon(s) de treonina em cepas da invenção geralmente será controlada por um promotor não nativo (isto é, um promotor que não controla a expressão do óperon thr em cepas bacterianas normalmente encontradas na natureza). A substituição do promotor nativo das enzimas biossintéticas de treonina por um promotor não nativo resistente para controlar a expressão do óperon thr, não é necessário submeter as cepas bacterianas auxotróficas por isoleucina para conseguir esta maior produção de treonina.

Exemplos ilustrativos de promotores adequados para uso em E. coli incluem, apesar de não se limitarem: o promotor lac, o promotor trp, o promotor PL de λ bacteriófago, o promotor PR, o promotor lpp, e o promotor tac. Em uma modalidade específica, o promotor tac é usado.

Além do óperon de treonina, as células das cepas bacterianas inventivas podem também conter, pelo menos, um gene que codifica aspartato semialdeído desidrogenase (asd), tanto integrado nos seus cromossomos como presente em um elemento extracromossomial (por exemplo, um plasmídeo). Por exemplo, o cromossomo nas células da presente invenção podem conter, pelo menos, um gene asd, pelo menos, um gene thrA, pelo menos, um gene thr B e/ou pelo menos, um gene thrC.

Certamente, uma, duas, três ou mais cópias de cada um desses genes podem estar presentes.

Treonina desidrogenase (tdh) catalisa a oxidação de L-treonina em a-amino-p-cetobutirato. Dessa maneira, em uma modalidade específica, o cromossomo das células inventivas contêm ainda, pelo menos, um gene treonina desidrogenase defeituoso (tdh). 0 gene tdh defeituoso pode ser um gene com um baixo nível de expressão de treonina desidrogenase, ou um gene que codifica uma treonina desidrogenase mutante com baixa atividade enzimática em relação à da treonina desidrogenase nativa. Por exemplo, o gene tdh defeituoso empregado nas cepas inventivas não expressam treonina desidrogenase. Exemplos ilustrativos de genes tdh adequados que não expressam treonina desidrogenase incluem um gene tdh com um gene cloramfenicol acetiltransferase (cat) inserido nele ou. um gene tdh com transposon Tn5 inserido nele, conforme descrito na patente U.S. 5.175.107. A invenção fornece ainda microorganismos que expressam maiores quantidades de enzimas que catalisam a produção de. 1-isoleucina, bem como microorganismos que superproduzem 1-isoleucina. Conforme do conhecimento de técnicos habilitados, as cepas bacterianas da invenção que produzem maiores grandes quantidades de L-treonina, com efeito, possibilitam a produção de quantidades substanciais de L-isoleucina. Isto se dá em virtude de, conforme já discutido, a L-treonina ser um precursor de L-isoleucina.

Assim, óperons adequados para uso com a presente invenção incluem o óperon de isoleucina de E. coli, que é composto de genes de ilvA, ilvGM, ilvD e ilvE.

Em uma modalidade da invenção, um óperon de isoleucina sob o controle de um promotor não nativo é introduzido em microorganismos. Além disso, ácido nucléico que codifica diidroxiácido redutoisomerase (ilvC) pode também ser introduzido nas células. Esses genes podem tanto ser inseridos no DNA cromossomial como levados em plasmídeos.

Além do mais, em virtude de se acreditar que as reações catalisadas pela treonina desaminase e aceto- hidroxiácido sintetase sejam as etapas limitantes de taxa na produção de isoleucina, existirão vantagens, quando se desejar a produção de isoleucina, em superexpressar esses produtos de genes particulares.

Além do mais, em virtude de os produtos de genes do gene ilvA (isto é, treonina deaminase) e o ilvGM (isto é, aceto-hidroxiácido sintetase II) serem inibidos, respectivamente, pela L-isoleucina e L-valina, em diversas circunstâncias, será geralmente vantajoso usar formas resistentes à retroalimentação dessas enzimas.

Modificações similares de células e processos da invenção podem ser facilmente empregados para produzir outros aminoácidos gerados pelos caminhos relacionados a esses para a produção de L-treonina e L-isoleucina. Exemplos de aminoácidos que podem ser produzidos utilizando-se tais modificações incluem L-lisina e L-glicina. A invenção também fornece microorganismos que expressam maiores quantidades de enzimas que catalisam a produção de L-metionina, bem como microorganismos que superproduzem L-metionina. Exemplos de tais microorganismos são os que contêm, pelo menos, um óperon met no cromossomo (isto é, o gene metL que codifica AK II-HD II) , o gene metA (homosserina succiniltransferase), o gene metB (cistationina γ-sintase), o gene metC (cistationina β-liase) e os genes metE e metH (homocisteína metilase)) que foram aqui submetidos a etapas de mutagêneses e seleção. Os genes apresentados na frase anterior, incluindo suas variantes resistentes à retroalimentação, e, opcionalmente, um promotor não nativo, podem ser introduzidos no cromossomo do microorganismo hospedeiro, de acordo com um ou mais dos métodos gerais aqui discutidos e/ou conhecidos pelos técnicos habilitados.

Conforme supraindicado, os microorganismos que superproduzem lisina podem também ser preparados submetendo- se microorganismos que contêm genes que codificam enzimas de lisina biossintética (por exemplo, uma enzima biossintética de lisina resistente à retroalimentação codificada por lysC e/ou dapA) e, opcionalmente, um promotor não nativo a etapas de mutagênese e seleção, conforme aqui descrito.

As cepas bacterianas da presente invenção podem ser preparadas por qualquer um dos métodos e técnicas conhecidos e disponíveis aos técnicos habilitados. Exemplos ilustrativos de métodos adequados para construção das cepas bacterianas inventivas incluem técnicas de integração de gene (por exemplo, mediadas pela transformação linear de fragmentos de DNA e recombinação homóloga) e transdução mediada pelo bacteriófago Pl. Esses métodos são bem conhecidos na tecnologia e encontram-se descritos, por exemplo, em J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Gold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972) ; J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992); M. Singer e P. Berg, Genes &

Genomes, University Science Boocs, Mill Valley, Califórnia (1991); J. Sambrook, E. F. Fristsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P. B. Kaufman et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, B. R. Glick e J. E. Thompson, eds., CRC

Press, Boca Raton, Florida (1993); e P. F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989), cuja descrição completa de cada uma está aqui incorporada como referência. B. Produção de Aminoácidos As cepas bacterianas da presente invenção incluem cepas que são capazes de produzir quantidades substanciais de L-treonina ou L-isoleucina, quando crescidas em cultura.

Em particular, quando crescidas em cultura, as cepas da invenção incluem cepas que são capazes de produzir pelo menos cerca de 65 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 75 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 85 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 95 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 105 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 110 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 115 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, ou, pelo menos cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas. Além do mais, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir, pelo menos cerca de 95 g/L de L- treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 100 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 105 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 110 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 115 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, ou, pelo menos cerca de 150 g/L de L- treonina em cerca de 48 horas.

Além disso, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir L-treonina a uma taxa de, pelo menos cerca de 2 g/L/h, pelo menos cerca de 2,5 g/L/h, pelo menos cerca de 3 g/L/h, pelo menos cerca de 3,6 g/L/h, pelo menos cerca de 4 g/L/h, pelo menos cerca de 4,5 g/L/h, ou, pelo menos cerca de 5 g/L/h.

Além do mais, quando crescidas em cultura, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir entre cerca de 75 e cerca de 95 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 80 e cerca de 100 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 85 e cerca de 105 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 90 e cerca de 110 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 110 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 100 e cerca de 115 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 100 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 100 e cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 100 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 100 e cerca de 135 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 100 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 105 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 110 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 110 e cerca de 125 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 110 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 110 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 110 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 115 e cerca de 130 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 120 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 115 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 125 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 105 e cerca de 125 g/L de L- treonina em cerca de 36 horas, entre cerca de 105 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas, ou entre cerca de 105 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 36 horas.

Ainda, quando crescidas em cultura, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir entre cerca de 80 e cerca de 100 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 85 e cerca de 105 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 90 e cerca de 110 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 110 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 115 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 110 e cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 115 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 120 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 125 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 115 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 95 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 14 0 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 105 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 110 e cerca de 120 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 110 e cerca de 130 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 110 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 110 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 115 e cerca de 125 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 115 e cerca de 135 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 115 e cerca de 140 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, entre cerca de 115 e cerca de 145 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas, ou entre cerca de 115 e cerca de 150 g/L de L-treonina em cerca de 48 horas.

As cepas bacterianas da invenção também incluem cepas que produzem L-treonina com alto rendimento, em relação à fonte de carbono presente no meio de cultura.

Assim, as cepas da invenção incluem cepas que, com referência ao teor de dextrose do meio de cultura, produzem L-treonina com os seguintes rendimentos (p/p): cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, ou cerca de 50%.

Cepas da invenção incluem cepas que, com referência ao teor do meio de cultura, produzem L-treonina nas seguintes faixas de rendimentos (p/p) : entre cerca de 25% e cerca de 40%, entre cerca de 30% e cerca de 35%, entre cerca de 30% e cerca de 45%, entre cerca de 30% e cerca de 50%, entre cerca de 35% e cerca de 40%, entre cerca de 35% e cerca de 45%, entre cerca de 35% e cerca de 50%, entre cerca de 40% e cerca de 45%, e entre cerca de 40% e cerca de 50%.

Cepas da invenção incluem cepas que são capazes de produzir pelo menos cerca de 65 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 75 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 85 g/L de L- isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 95 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 105 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 115 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 125 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 130 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 135 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, ou pelo menos cerca de 140 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas. Além disso, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir pelo menos cerca de 90 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 100 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 110 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 120 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 130 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, pelo menos cerca de 140 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, ou pelo menos cerca de 150 g/L de L- isoleucina em cerca de 48 horas.

Além disso, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir L-isoleucina a uma taxa de pelo menos cerca de 2 g/L/h, pelo menos cerca de 2,5 g/L/h, pelo menos cerca de 3 g/L/h, pelo menos cerca de 3,6 g/L/h, pelo menos cerca de 4,0 g/L/h, pelo menos cerca de 4,5 g/L/h, ou pelo menos cerca de 5,0 g/L/h.

Além do mais, quando crescidas em culturas, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir entre cerca de 75 e cerca de 95 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, entre cerca de 85 e cerca de 105 g/L de L- isoleucina em cerca de 36 horas, entre cerca de 95 e cerca de 115 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, entre cerca de 105 e cerca de 125 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, entre cerca de 115 e cerca de 135 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas, ou entre cerca de 125 e cerca de 145 g/L de L-isoleucina em cerca de 36 horas.

Além disso, quando crescidas em cultura, as cepas inventivas incluem cepas que são capazes de produzir entre cerca de 80 e cerca de 100 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, entre cerca de 85 e cerca de 105 g/L de L- isoleucina em cerca de 48 horas, entre cerca de 90 e cerca de 110 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, entre cerca de 100 e cerca de 120 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, entre cerca de 110 e cerca de 130 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, entre cerca de 120 e cerca de 140 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas, ou entre cerca de 130 e cerca de 150 g/L de L-isoleucina em cerca de 48 horas.

As cepas bacterianas da invenção também incluem cepas que produzem L-isoleucina com alto rendimento, em relação à fonte de carbono presente no meio de cultura.

Assim, as cepas da invenção incluem cepas que, com referência ao teor de dextrose do meio de cultura, produzem L-isoleucina nos seguintes rendimentos (p/p) : cerca de 26%, cerca de 27%, cerca de 28%, cerca de 29%, cerca de 30%, cerca de 31%, cerca de 32%, cerca de 33%, cerca de 34%, cerca de 35%, cerca de 36%, cerca de 37%, cerca de 38%, cerca de 39%, cerca de 40%, cerca de 41%, cerca de 42%, cerca de 43%, cerca de 44%, cerca de 45%, cerca de 46%, cerca de 47%, cerca de 48%, cerca de 49%, ou cerca de 50%.

Cepas da invenção incluem cepas que, com referência ao teor de dextrose do meio de cultura, produzem L-isoleucina nas seguintes faixas de rendimentos (p/p): entre cerca de 25% e cerca de 40%, entre cerca de 30% e cerca de 35%, entre cerca de 30% e cerca de 45%, entre cerca de 30% e cerca de 50%, entre cerca de 35% e cerca de 40%, entre cerca de 35% e cerca de 45%, entre cerca de 35% e cerca de 50%, entre cerca de 40% e cerca de 45%, e entre cerca de 40% e cerca de 50%. A quantidade de L-treonina ou de L-isoleucina, bem como de outros aminoácidos, presentes no meio de cultura, pode ser medida por inúmeros métodos. Por exemplo, conforme indicado a seguir nos exemplos 2 e 5, a quantidade de L- treonina, bem como de outros aminoácidos presentes no meio de cultura, pode ser determinada por meio de HPLC. Os níveis de L-treonina ou de L-isoleucina podem também ser determinados por métodos tais como cromatografia de papel com detecção de ninhidrina, cromatografia de camada fina, ou ensaio microbiano. C. Preparação de Cepas Bacterianas Capazes de Superproduzir Aminoácidos Conforme supradiscutido, cepas bacterianas bem adequadas para produção comercial de aminoácidos geralmente serão alteradas em mais de uma característica fenotípica relacionada à produção/excreção dos aminoácidos particulares, comparado com cepas tipo selvagem. Conforme também supradiscutido, as cepas bacterianas da invenção que superproduzem aminoácidos incluem cepas que contêm, pelo menos, um óperon thr que (a) é integrado no cromossomo bacteriano e (b) fica sob controle de um promotor não nativo. Essas cepas também geralmente conterão alterações fenotípicas relacionadas a um, dois, três, quatro ou mais dos seguintes: (1) eliminação ou redução de mecanismos de controle de retroalimentação para um, dois, três ou mais vias biossintéticas que levam à produção de aminoácidos ou de precursores de aminoácidos; (2) a melhoria do fluxo metabólico tanto pela amplificação como pelo aumento da expressão de genes que codificam enzimas que limitam a taxa de vias biossintéticas que levam â produção de aminoácidos (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina) ou precursores de aminoácidos (por exemplo, aspartato); (3) a inibição de vias de degradação que envolve tanto o produto final de aminoácido desejado (por exemplo, L-treonina ou L- isoleucina), intermediários (por exemplo, homosserina) e/ou precursores (por exemplo, aspartato); (4) maior produção de intermediários e/ou precursores; (5) quando a via que leva a produção de um produto final aminoácido desejado for ramificado, a inibição de ramificações que não levam ao produto final desejado ou a um intermediário e/ou a um precursor do produto final desejado (por exemplo, inibição de caminho de metionina E. coli, quando o produto final desejado for L-treonina ou L-isoleucina); (6) alterações na permeabilidade da membrana para otimizar a captação de moléculas de energia (por exemplo, glicose), intermediários j e/ou precursores; (7) alterações na permeabilidade da membrana para otimizar a excreção do produto final aminoácido (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina); (8) a melhoria da tolerância de crescimento a concentrações relativamente altas de produtos finais (por exemplo, ) aminoácidos), produtos de perda metabólica (por exemplo, ácido acético), ou produtos colaterais metabólicos (por exemplo, derivados de aminoácido) que são inibidores do crescimento celular bacteriano; (9) melhoria da resistência a alta pressão osmótica durante o cultivo decorrente de j maiores concentrações de fontes de carbono (por exemplo, glicose) ou produtos finais (por exemplo, aminoácidos); (10) a melhoria da tolerância de crescimento a alterações nas condições ambientais (por exemplo, pressão, temperatura, pH, etc.); e (11) atividades crescentes de enzimas envolvidas na ) captação e uso de fontes de carbono no meio de cultura (por exemplo, rafaninose, estaquiose ou proteínas, bem como outros componentes de licor da maceração de milho). A invenção também inclui métodos para selecionar células bacterianas para identificar células que foram > submetidas à mutagênese e que têm um,dois, três, quatro ou mais das características supra-apresentadas. Ainda incluídas na invenção são cepas bacterianas que têm uma, duas, três, quatro ou mais das características referidas.

Conforme técnicos habilitados percebem, o uso de mutagênese aleatória seguido de seleção para identificar células da invenção que superproduzem um aminoácido desejado (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina) resulta na seleção de células com alterações fenotípicas que não necessariamente fornecem uma indicação do mecanismo pelo qual a célula superproduz o aminoácido. Por exemplo, a superprodução de aminoácido pode estar relacionada ao efeito pleiotrópico de uma alteração fenotípica não-relacionada.

Assim, a invenção não está limitada a células que superproduzem aminoácidos e que apresentam uma ou mais alterações metabólicas apresentadas na lista anterior. Em outras palavras, a invenção inclui células que são caracterizadas pela capacidade de produzir quantidades especificadas dos aminoácidos particulares pelo crescimento em cultura por períodos de tempo especificados.

Em modalidades específicas, as cepas da invenção são produzidas submetendo-se células bacterianas que contêm, pelo menos, um óperon thr no cromossomo sob o controle de um promotor não nativo, a um, dois, três, quatro, cinco ou mais ciclos de mutagênese seguido pela seleção para identificar células que demonstram maior produção de aminoácidos (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina).

Um número considerável de métodos para realizar mutagênese é conhecido na tecnologia, e podem ser usados para gerar cepas bacterianas da invenção. Em geral, esses métodos envolvem o uso de agentes químicos ou radiação para induzir mutações.

Exemplos de classes de compostos químicos usados nos procedimentos mutagênicos são agentes alquilantes e etilantes, tais como N-metil-N-nitrosouréia N-nitroso-N,N- dietilamina (NDEA) e N-etil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (ENNG), que já são conhecidos há algum tempo por induzir mutações em moléculas de ácido nucléico (Hince et al., Mutat. Res. 46:1-10 (1977); J. Jia et al., Mutat. Res. 352:39-45 (1996)).

Agentes intercalantes, tais como brometo de etídio, bem como outros agentes que se ligam a moléculas de ácido nucléico, têm também mostrado ter atividade mutagênica. Por exemplo, a cepa SYBR Green I, um corante de ácido nucléico não-intercalante, tem sido mostrada usando o teste Ames para induzir mutações (Singer et al., Mutat. Res. 439:37-47 (1999)).

Outros agentes que podem ser usados para induzir mutações incluem hidroxilamina, bissulfetos, nitrofuranos (por exemplo, 7-metóxi-2-nitronafto [2,1-β] furam (R7000)), e agentes que induzem tensão oxidativa (P. Quillardet et al., Mutat. Res. 358:113-122 (1996); G. Wang et al., Mol.

Gen. Genet. 251:573-579 (1996)). Técnicos habilitados entenderão como ajustar as concentrações do agente mutagênico e/ou as condições particulares para se conseguir uma taxa de mutação desejada.

Por exemplo, quando for usada radiação ionizante para produzir células que sofreram mutagênese, a intensidade da radiação ou a duração da exposição podem ser ajustada para induzir um número particular de mutações por célula. Além disso, a intensidade da radiação ou duração da exposição podem também ser ajustadas de maneira tal que uma porcentagem particular (por exemplo, 5%) das células tratadas sobreviva.

Depois de as células terem sido submetidas à mutagênese, elas podem ser selecionadas para determinar se elas têm características particulares. Nota-se que, ao longo dessas linhas, diversas características foram associadas com a produção aumentada de L-treonina ou de L-isoleucina pelas células bacterianas. Exemplo de tais características incluem resistência a análogos de cisteína, treonina, metionina e purina; resistência a antagonistas de isoleucina; captação obstruída de captação de L-treonina; e inibição de retroalimentação alterada de enzimas nas vias biossintéticas de treonina e de isoleucina (ver, por exemplo, Takano et al., patente U.S. 5.087.566; Yamada et al., patente U.S. 5.098.835; Yamada et al., patente U.S. 5.264.353; Kino et al., patente U.S. 5.474.918; K. Okamoto et al., Biosci.

Biotechnol. Biochem. 61:1877-1882 (1997); Sahm et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 782:25-39 (1996): Hashiguchi et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 63:672-679 (1999)). Outras características tidas como correlacionadas com maior produção de L-treonina incluem resistência a L-treonina e TRF.

Além disso, seleção/triagem de células com um fenótipo resistente a L-treonina pode ser feita em meio contendo cerca de 1% a cerca de 15% (peso/volume) de L- treonina. Por exemplo, microorganismos da invenção pode ser selecionados com uso de meio de cultura que contenha cerca de 1%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2%, 2,1%, 2,2%, 2,3%, 2,4%, 2,5%, 2,6%, 2,7%, 2,8%, 2,9%, 3%, 3,2%, 3,4%, 3,6%, 3,8%, 4%, 4,2%, 4,4%, 4,6%, 4,8%, 5%, 5,2%, 5,4%, 5,6%, 5,8%, 6%, 6,2%, 6,4%, 6,6%, 6,8%, 7%, 7,2%, 7,4%, 7,6%, 7,8%, 8%, 8,2%, 8,4%, 8,6%, 8,8%, 9%, 9,2%, 9,4%, -9,6%, 9,8%, 10%, 10,2%, 10,4%, 10,6%, 10,8%, 11%, 11,2%, 11,4%, 11,6%, 11,8%, 12%, 12,2%, 12,4%, 12,6%, 12,8%, 13%, 13,2%, 13,4%, 13,6%, 13,8%, 14%, 14,2%, 14,4%, 14,6%, 14,8%, 15%, 15,2%, 15,4%, 15,6%, 15,8%, ou 16% de L- treonina.

Cepas da invenção podem ser geradas por meio de múltiplos ciclos de mutagênese e seleção. Depois de cada tratamento mutagenético, as células que sofreram mutagênese podem ser selecionadas tanto com relação a (1) maior produção de um produto final aminoácido desejado (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina) como (2) uma, duas, três, quatro, cinco ou mais características associadas com maior produção do produto final (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina), seguido pela seleção com relação a maior produção do produto final aminoácido desejado (por exemplo, L-treonina ou L-isoleucina).

Conforme supranotado, uma característica associada com maior produção de treonina é a resistência a TRF. Assim, a invenção inclui cepas bacterianas que são resistentes a TRF, bem como métodos para produzir e identificar mutantes resistentes a TRF. TRF pode ser preparado, por exemplo, por protocolos similares aos seguintes. A matéria particular é removida por ultrafiltração a partir do caldo de fermentação de treonina condicionado preparado, por exemplo, na forma descrita a seguir no exemplo 9 com utilização do meio de fermentação do fermentador. 0 permeado é então evaporado para concentrar treonina. A treonina cristalizada é então recuperada do caldo concentrado por centrifugação, com utilização, por exemplo, de um rotor de fluxo contínuo. 0 líquido separado da treonina é então processado através de um sistema de separação cromatográfica de troca de íons, tais como C-SEP ou I_SEP (Advanced Separation Technologies, Inc., St. Petersburg, FL) . 0 efluente perdido obtido daí é referido como uma solução "TRF".

Conforme técnicos habilitados podem reconhecer que outros métodos de separação, além de C-SEP ou I-SEP, poderíam também ser empregados. Sistema de separação cromatográfica de troca de íons são normalmente conhecidos na tecnologia, conforme exemplificado nas patentes U.S. 4.808.317 e 4.764.276, que estão aqui incorporadas como referência.

Uma preparação TRF preparada pelos inventores foi analisada e encontraram-se os seguintes componentes: ácido aspártico (63 ppm), treonina (438 ppm), ácido glutâmico (24 ppm), prolina (<14 ppm), glicina (40 ppm), alanina (16 ppm), cistina (42 ppm), valina {<18 ppm), metionina (232 ppm) , isoleucina (297 ppm), leucina (25 ppm), tirosina (31 mmp) , fenilalanina (22 ppm), lisina (152 ppm), serina (<1 ppm) , histidina (1 pm) , arginina (<22 ppm), amônia (1,791 ppm), rafinose (5,036 ppm), sacarose (1,885 ppm), glicose (1,344 ppm) e frutose (725 ppm).

Conforme se pode ver pelo exposto, TRF contém uma quantidade considerável de sulfato de amônio, L-treonina, outros aminoácidos, sais e carboidratos. Assim, TRF contém fontes de nitrogênio, tal como sulfato de amônio, e nutrientes, tais como aminoácidos e carboidratos, que podem ser metabolizados por microorganismos. A concentração TRF pode ser determinada, medindo- se a concentração de um componente de referência presente no TRF. Um exemplo de um componente de referência é sulfato de amônio. A menos que de outra forma aqui estabelecida, a concentração de uma solução TRF se baseia na porcentagem de sulfato de amônio presente (p./vol.). Por exemplo, uma solução TRF a 5% deve conter 5 gramas de sulfato de amônio por 100 mililitros de soluto. A concentração de sulfato de amônio de uma solução pode ser determinada por inúmeros métodos. Por exemplo, uma sonda seletiva de íons pode ser usada para medir a concentração de íons de amônia (por exemplo, ORION Research, Inc., 500 Cummings Center, Beverly, MA 01915, Catalog No. 931801) .

Quando TRF é usado, tanto para (1) gerar cepas bacterianas que superproduzem L-treonina como para (2) identificar cepas bacterianas resistente a TRF, o TRF geralmente será preparado na forma descrita a seguir no exemplo 10.

Soluções de rafinato podem ser esterilizadas por qualquer quantidade de meios, antes do uso em protocolos para gerar e selecionar cepas bacterianas resistentes a rafinato. Os inventores determinaram que a esterilização do meio que contém rafinato, especialmente a altas concentrações de solutos, por meio de tratamento térmico, produz derivados de aminoácido e outros antagonistas metabólicos que inibem o crescimento da cultura. Entretanto, TRF esterilizado a quente que contém o meio pode ser usado para selecionar mutantes que sejam resistentes a derivados de aminoácido, especialmente derivados de L-treonina, por meio da melhoria da produção de treonina dos mesmos. Para se evitarem alterações nas propriedades do rafinato associado com a esterilização a quente, o meio de cultura pode ser esterilizado, por exemplo, por ultrafiltração.

As cepas da invenção incluem cepas com um fenótipo resistente a rafinato melhorado, que é determinado pela concentração de rafinato, conforme medida pelo teor de sulfato de amônio, no meio de seleção empregado. Conforme supradiscutido, a seleção para mutantes resistentes a rafinato pode ser feita em um meio de cultura contendo rafinato. A concentração particular de rafinato presente no meio de seleção irá variar em função de fatores tais como o próprio meio, as células que estão sendo selecionadas quanto à resistência ao rafinato, e a própria preparação do rafinato. Por exemplo, E. coli resistente a TRF pode ser selecionado com utilização do meio mínimo E (ver exemplos 6 e 7) que contém de cerca de 0,2% a cerca de 0,5% de rafinato. Como técnicos habilitados entenderíam, as concentrações de TRF usadas irão variar também em função de fatores tais como o gênero e espécie de bactéria usados e da sensibilidade inicial da cepa bacteriana ao TRF.

Cepas bacterianas da invenção podem ser produzidas realizando-se mutagêneses em uma cepa bacteriana parental, seguido pela seleção de células que apresentam um fenótipo resistente a TRF. Microorganismos parentais podem ser selecionados de qualquer organismo usado para a produção fermentativa de aminoácidos (por exemplo, L-treonina); entretanto, na maioria dos casos, o organismo será uma cepa E. coli. A seleção/triagem de células com um fenótipo resistente a TRF pode ser feita em meio de cultura contento cerca de 0,05% a cerca de 5% de TRF. Por exemplo, microorganismos da invenção podem ser selecionados utilizando-se meio de cultura que contém cerca de 0,05%, 0,1% 0,15%, 0,2%, 0,25%, 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45%, 0,5%, 0,55%, 0,6%, 0,65%, 0,7%, 0,75%, 0,8%, 0,85%, 0,8%, 0,85%, 0,9%, 0,95%, 1,0%, 1,1%, 1,2%, 1,3%, 1,4%, 1,5%, 1,6%, 1,7%, 1,8%, 1,9%, 2,0%, 2,1%, 2,2%, 2,4%, 2,6%, 2,8%, 30,0%, 3,2%, 3,4%, 3,6%, 3,8%, 4,0%, 4,2%, 4,4%, 4,6%, 4,8%, ou 5,0% de TRF.

Como notado acima, a concentração de TRF é determinada com respeito â quantidade de sulfato de amônio presente.

Em uma modalidade específica da invenção, a cepa E. coli 472T23, que requer treonina para crescer, pode ser convertida em um produtor de treonina por meio de transdução Pl-mediada para introduzir o óperon de treonina da cepa E. coli Depósito ATCC nr. 21277, que pode ser obtida da American Type Culture Collection, 10801 University Blvd, Manassas, VA 20110-22209, USA. Este óperon thr composto de um gene aspartato quinase - homosserina desidrogenase (thrA), um gene homosserina quinase (thrB), e um gene treonina sintase resistente a retroalimentação. Esta cepa pode então ser submetida a um, dois, três, quatro ou mais ciclos de mutagênese, conforme supradescrito, seguido pela seleção para identificar células que produzem maiores quantidades de L-treonina ou L-isoleucina.

Para aumentar a produção de treonina, o gene treonina desidrogenase defeituoso da cepa E. coli CGSC6945 (genótipo relevante: tdh-l::catl212, obtido da E. coli Genetic Stock Center, 355 Osborne Memorial Laboratory Departmente of Bioloby, Yale University, New Haven, Connecticut 06520-8104, USA) pode ser introduzida nas células pela transdução Pl. Novamente, o produtor de treonina resultante pode ser melhorado ainda mais por mutagênese, seguido pela identificação de células que produzem maiores quantidades de L-treonina ou L-isoleucina.

Plasmídeos que levam um gene marcador resistente a antibiótico, tal como kan (que codifica para resistência a canamicina) , e um promotor forte, tal como PL ou tac, opcionalmente flanqueado pelo DNA à montante de thrA e algumas centenas de pares de base do gene thrA tipo selvagem (isto é, não todo o gene thrA), podem ser reconstruídos e usados como um veículo para entregar o fragmento de DNA desejado no cromossomo. O fragmento de DNA pode ser isolado pela digestão com uma enzima de restrição adequada e purificado, e, em seguida, introduzido, por meio de transformação ou eletroporação, numa cepa para remover a região de controle de óperon de treonina e substituí-lo pela recombinação homóloga com o fragmento desejado (por exemplo, um fragmento que contenha um gene marcador de resistência a antibiótico e um promotor forte no início do gene thrA) .

Este fragmento pode então ser transferido para as células da cepa pela transdução Pl.

Quando se deseja uma maior produção de L-treonina, a exigência de isoleucina da cepa do hospedeiro específico, 472T23, pode ser eliminada, por exemplo, introduzindo-se um alelo tipo selvagem do marcador por meio de transdução Pl.

Exigências nutricionais indesejadas de outros hospedeiros podem ser removidas de uma maneira similar ou de acordo com outros métodos conhecidos e disponíveis aos técnicos habilitados.

Cepas resistentes a borrelidina ou a CPCA da invenção podem conter um ou mais plasmídeos recombinantes, na forma desejada. Por exemplo, os microorganismos inventivos podem conter plasmídeos recombinantes que codificam enzimas biossintéticas do caminho da treonina. As cepas bacterianas inventivas podem igualmente conter plasmídeos recombinantes que codificam outras enzimas envolvidas na biossíntese da treonina, tais como aspartato semialdeído desidrogenase (asd), ou enzimas que aumentam o crescimento.

Adicionalmente, as cepas resistentes a borrelidina ou a CPCA podem ser modificadas, caso desejado, por exemplo, a fim de aumentar a produção de treonina, remover exigências nutricionais, e outros mais, utilizando-se qualquer um dos métodos e técnicas conhecidas e disponíveis aos técnicos habilitados. Exemplos ilustrativos de métodos adequados para modificar mutantes E. coli resistentes a borrelidina ou a CPCA e variantes incluem, mas não se limitam: mutagênese por irradiação com luz ultravioleta ou raios-X, ou pelo tratamento com um mutagênico químico, tal como nitrosoguanidina (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidia), metilmetanessulfonato, nitrogênio mostarda e similares; técnicas de integração de gene, tais como as mediadas por transformação de fragmentos lineares de DNA e recombinação homóloga; e transdução mediada por bacteriófagos, tal como Pl. Esses métodos são bem conhecidos na tecnologia e estão descrito, por exemplo, em J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Hew York (1972) ; J. H. Miller, A short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992) ; M. Singer e P.

Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mil Valley, Califórnia (1991); J. Sambrook, E. F. Fritsch e T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); P. B. Kaufman et al., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995); Methods in Plant Molecular Biology and Bíotechnology, B. R. Glick and J. E. Thompson, eds., CRC

Press, Boca Raton, Florida (1993); e P. F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989) . A presente invenção também inclui o uso de cepas bacterianas resistentes a borrelidina ou a CPCA em processos de fermentação para a produção de L-treonina (por exemplo, mutantes de E. coli resistentes a borrelidina ou a CPCA.).

Modalidades específicas da invenção incluem derivados mutantes de cepa E. coli ADM Katl3, que foi depositada na Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, em 28 de junho de 1996 e acesso requerido número NRRL B- 21953 e que está descrita em Wang et al., patente U.S. 5.939.307. Assim, a cepa ADM Katl3 pode ser submetida a um, dois, três, quatro ou mais ciclos de mutagênese, conforme supradescrito, seguido por seleção para identificar células que produzem maiores quantidades de L-treonina ou L- isoleucina. A resistência a borrelidina ou a CPCA pode ser determinada por qualquer um dos métodos aceitos conhecidos pelos técnicos habilitados. Por exemplo, cepas resistentes a borrelidina ou a CPCA podem ser isoladas revestindo-se com as cepas candidatas o meio mínimo contendo cerca de 139 μΜ de borrelidina ou de CPCA, conforme descrito em G. Nass e J. Thomale, FEBS Lett. 39:182-186 (1974). Além do mais, a resistência a borrelidina ou CPCA em certas cepas é manifestada como uma alteração em uma ou mais características fenotípicas das células. Por exemplo, mutantes resistentes a borrelidina de cepa E. coli 6-8 e seus derivados parecem redondas, em vez de bastões. Em tais casos, a evidência de uma alteração em uma característica fenotípica pode ser suficiente para identificar adequadamente cepas resistentes a borrelidina.

Os mutantes resistentes a borrelidina ou a CPCA usados nesta modalidade da presente invenção são capazes de produzir treonina. Os genes que codificam as enzimas biossintéticas de treonina podem estar presente no cromossomo ou contido em plasmídeos ou suas misturas. Múltiplas cópias desses genes podem também estar presentes.

Por exemplo, os genes que codificam as enzimas biossintéticas de treonina podem ser resistentes ao controle de atenuação e/ou codificar enzimas resistentes a retroalimentação.

Além disso, mutantes resistentes a borrelidina ou a CPCA podem também ser submetidos a um ou mais ciclos de mutagênese, seguido por seleção para identificar células com características desejadas, conforme supradescrito. Assim, a invenção também inclui mutantes resistentes a borrelidina ou CPCA de E. coli que são também resistentes a TRF.

Em uma modalidade, os mutantes resistentes a borrelidina ou a CPCA da presente invenção são modificados de maneira a incluir um promotor não nativo à montante e em ligação operável com um ou mais dos genes que codificam as enzimas biossintéticas de treonina, independente se esses genes estão no cromossomo e/ou contidos em plasmídeos. D. Cepas da Invenção Exemplos de organismos, além de E. coli, que podem ser usados para preparar cepas da invenção que produzem maiores quantidades de aminoácidos incluem Brevibacterium flabum, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium saccharolyticum, Corynebacterium glutamicum, Cornynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium lilum, Corynebacterium melassecola, Microbacterium ammoniaphilum e Serratia marcesens.

Em muitos casos, as cepas bacterianas inventivas são cepas E. coli. Além disso, conforme supranotado, a invenção inclui cepas bacterianas (por exemplo, cepas E. coli) que apresentam resistência a borrelidina antibiótica de macrolídeo ou a ácido ciclopentanocarboxílico. Exemplos específicos de cepas bacterianas da invenção incluem cepas E. coli ADM Kat69.9 (NRRL B-30316), ADM TH14.97 (NRRLB- 30317), ADM TH21.97 (NRRLB-30318) e ADM TH25.79 (NRRL B- 30319), cada uma das quais foi depositada na Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, em 27 de junho de 2000.

As cepas da invenção também incluem cepas que têm as características das cepas depositadas requeridas de número de acesso NRRL B -30316, NRRL B-30317, NRRL B-30318 e NRRL B-30319. Características particulares dessas cepas estão apresentadas a seguir no exemplo 7.

Ainda incluídas no escopo da invenção estão cepas bacterianas que não requerem nenhum plasmídeo recombinante que contenha um, dois ou mais genes que codifiquem enzimas biossintéticas de treonina para produção de treonina (isto é, cepas capazes de produzir treonina sem a necessidade de uma ou mais das enzimas biossintéticas de treonina para ser codificada pelos genes contidos em um plasmídeo recombinante) .

As cepas inventivas, certamente, podem conter opcionalmente plasmídeos recombinantes, caso desejado. Por exemplo, embora tais plasmídeos geralmente não sejam necessários para a produção de treonina, as cepas inventivas podem, entretanto, conter plasmídeos recombinantes que codificam enzimas biossintéticas de treonina, a fim de aumentar a produção de treonina. As cepas inventivas podem igualmente conter plasmídeos recombinantes que codificam outras enzimas envolvidas na biossíntese de treonina, tal como aspartato semialdeído desidrogenase (asd).

As cepas da invenção também incluem cepas que são resistentes a TRF e outros agentes, resistência a qual se correlaciona com a maior produção de treonina (por exemplo, análogos de cisteína, treonina e metionina; antagonistas de isoleucina e análogos de purina).

Em certas modalidades, as cepas da invenção não incluem uma ou mais das cepas seguintes de E. coli: KY10935, ADM TH1.2, BKIIM B-3996, H-8460, ADM Katl3, tac3, 6-8, 6- 8tac3, e 6-8tac3ile+. Em outras modalidades, as cepas da invenção não incluem a cepa Serratia narcescens T2000.

Em muitos casos, as novas cepas bacterianas também não têm exigências nutricionais de aminoácido para produção fermentativa de treonina (isto é, as células não requerem suplementos de aminoácidos para crescimento e para produção de treonina). Alternativamente, cepas bacterianas da invenção podem requerer metionina ou isoleucina para crescimento. III. Uso das Cepas da Invenção para Produzir Aminoácidos A presente invenção está também voltada para o uso das cepas bacterianas supradescritas em processos de fermentação para a produção de aminoácidos, aminoácidos da família do aspartato em particular. L-treonina e L- isoleucina, por exemplo, podem ser obtidas pela cultura das cepas bacterianas inventivas em um meio sintético ou natural que contenha, pelo menos, uma fonte de carbono, pelo menos, uma fonte de nitrogênio e, quando apropriado, sais inorgânicos, fatores de crescimento e similares.

Exemplos ilustrativos de fontes de carbono adequadas incluem, apesar de não se limitarem: carboidrato, tais como dextrose, frutose, sacarose, amido hidrolisado, celulose hidrolisada e melaço; ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido propiônico, ácido fórmico, ácido málico, ácido cítrico e ácido fumárico, e álcoois, tais como glicerol e etanol.

Exemplos ilustrativos de fontes de nitrogênio adequadas incluem, mas não se limitam: amônia, incluindo gás amônia e amônia aquosa; sais de amônia de ácidos inorgânicos ou orgânicos, tais como cloreto de amônio, fosfato de amônio, sulfato de amônio e acetato de amônio; e outros que contêm nitrogênio, incluindo extrato de carne, peptona, licor da maceração do milho, caseína hidrolisada, bolo de soja hidrolisado e extrato de levedura. 0 meio de cultura adequado para uso com a presente invenção inclui o seguinte: 1. Meio Minimo E (descrito a seguir no exemplo 1). 2. Extrato de levedura 2 g/L, ácido cítrico 2 g/L, (NH4)2S04 25 g/L, KH2P04 7,46 g/L, CaC03 20g/L, dextrose 40 g/L, e MgS04.7H20 2 g/L, suplementado com traços de metais, pH 7,2. 3. Extrato de levedura 5 g/L e caldo de soja tríptico 30 g/L.

Aminoácidos podem ser produzidos comercialmente com utilização das cepas da invenção, por exemplo, em processos de fermentação tipo batelada ou de batelada alimentada. Em fermentações tipo batelada, todos os nutrientes são adicionados no início da fermentação. Em fermentações tipo batelada alimentada, ou batelada alimentada prolongada, um ou mais nutrientes são fornecidos (1) continuamente na cultura, (2) logo no início da fermentação, ou depois que a cultura tiver atingido uma certa idade, ou (3) quando o(s) nutriente (s) que foram alimentados tiverem sido exauridos do meio de cultura.

Uma variação da batelada prolongada da fermentação tipo batelada alimentada é a fermentação de batelada alimentada repetida ou tipo enchimento e retirada, em que parte do conteúdo do fermentador é removido num tempo particular (por exemplo, quando o fermentador estiver cheio), enquanto a alimentação de um nutriente tem continuidade. Desta maneira, a fermentação pode ser prolongada por um maior tempo, comparada a quando não se usam tais métodos.

Um outro tipo de fermentação, a fermentação contínua ou cultura chemostat, usa alimentação contínua de um meio, enquanto o fluido de cultura é retirado contínua ou semicontinuamente, de uma maneira tal que o volume do caldo no fermentador permaneça aproximadamente constante. Uma fermentação contínua pode, em princípio, ser mantida por um período de tempo infinito.

Em fermentação em bateladas, os organismos cultivados crescem até que qualquer um dos nutrientes essenciais no meio se torne exausto, ou que as condições de fermentação se tornem desfavoráveis (por exemplo, se o pH diminuir até um valor inibitório do crescimento microbiano).

Em fermentações de batelada alimentada, normalmente são tomadas medidas para manter condições de crescimento favoráveis (por exemplo, por meio do controle do pH), e a exaustão de um ou mais nutrientes essenciais é prevenida pela alimentação desses nutrientes(s) na cultura. Assim, o microorganismo cultivado normalmente continuará a crescer a uma taxa determinada pela taxe de alimentação de nutrientes.

Na maioria dos casos, um único nutriente, muito comumente a fonte de carbono, se tornará limitante para o crescimento. 0 mesmo princípio se aplica durante fermentação contínua, normalmente um nutriente no meio alimentado é limitante, e todos os outros nutrientes estão em excesso.

Depois que os microorganismos tiverem parado de crescer, o nutriente limitante geralmente estará presente no fluido de cultura em uma concentração extremamente baixa.

Embora diferentes tipos de limitação de nutrientes possam ser empregados, a limitação de fonte de carbono é mais freqüentemente usada. Outros exemplos são nutrientes limitantes que incluem o nitrogênio, enxofre, fósforo, traços de metais e outras fontes de oxigênio. Vitaminas e aminoácidos (em casos em que o microorganismo que está sendo cultivado é auxotrófico para o aminoácido limitante) podem também ser nutrientes limitantes.

Depois da cultura, os aminoácidos (por exemplo, L- treonina ou L-isoleucina) que se acumularam no caldo de cultura podem ser separados de acordo com uma variedade de métodos. Por exemplo, resinas de troca de íons para purificar L-treonina de acordo com os métodos descritos na patente U.S. 5.342.766. Este método envolve primeiro a remoção dos microorganismos do caldo de cultura por centrifugação e, então, o ajuste do pH do caldo em cerca de 2 usando-se ácido clorídrico. A solução acidifiçada passa subseqüentemente por uma resina de troca de cátion fortemente acidificada e o eluente adsorvente por meio de amônia aquosa diluída. A amônia é removida por evaporação a vácuo, e a solução resultante é condensada. A adição de álcool e o resfriamento subseqüente fornecem cristais de L- treonina. Um método de purificação de L-isoleucina do meio de cultura similar encontra-se descrito na patente U.S. 5.474.918.

Outros aminoácidos da família aspartato podem ser produzidos por métodos similares aos supradescritos.

Isoleucina, por exemplo, pode ser preparada a partir das cepas bacterianas inventivas que contenham, no cromossomo ou em um plasmídeo, um gene ilvA ou um gene tdc amplificado, ambos os quais codificam treonina desaminase, a primeira enzima envolvida na bioconversão de treonina em isoleucina. A amplificação deste gene, por exemplo, pelo uso de um gene ilvA que codifica uma enzima resistente a retroalimentação, leva a uma maior biossíntese de isoleucina.

Similarmente, a metionina pode ser preparada por microorganismos, tal como E. coli, que contenham, pelo menos, um óperon met no cromossomo (isto é, o gene metL (que codifica AK II-HD II), o gene metA (homosserina succiniltransferase) , o gene metB (cistationina γ-sintase), o gene metC (cistationina β-liase) e os genes metE e metH (homocisteína metilase)). Esses genes, incluindo suas variantes resistentes a retroalimentação, e, opcionalmente, um promotor não nativo, podem ser introduzidos no cromossomo do microorganismo hospedeiro de acordo com os métodos gerais supradiscutidos e/ou conhecidos pelos técnicos habilitados. A lisina pode igualmente ser preparada por microorganismos que contenham um gene que codifica as enzimas biossintéticas de lisina (por exemplo, uma enzima biossintética de lisina resistente a retroalimentação codificada por lysC e/ou dapA) e, idealmente, um promotor não-adaptativo. A presente invenção também inclui o uso de cepas bacterianas resistentes a borrelidina ou a CPCA em processos de fermentação para a produção de L-treonina (por exemplo, mutantes de E. coli resistentes a borrelidina ou a CPCA).

Em modalidades específicas da presente invenção, L-treonina ou L-isoleucina é obtida pela cultura de microorganismos resistentes a borrelidina ou CPCA em um meio sintético ou natural que contenha, pelo menos, uma fonte de carbono, pelo menos, uma fonte de nitrogênio e, quando apropriado, sais inorgânicos, fatores de crescimento e outros mais, conforme supradescrito. Aminoácidos que se acumulam no meio de cultura podem ser recuperados por qualquer um dos métodos conhecidos pelos técnicos habilitados.

Os exemplos seguintes são apenas ilustrativos, e não se destinam a limitar o escopo da invenção, na forma definida pelas reivindicações anexas. Ficará aparente aos técnicos habilitados que várias modificações e variações podem ser feitas nos métodos da presente invenção, sem fugir do espírito e escopo da invenção. Assim, pretende-se que a presente invenção englobe as modificações e variações desta invenção, desde que elas se enquadrem no escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

Todas as patentes e publicações aqui referidas estão expressamente incorporadas como referência.

Exemplo 1 Preparação da cepa E. coli ADM Katl3 A. Transferência do óperon de treonina de cepa E. coli Depósito ATCC Nr. 21277 para o cromossomo da cepa E. coli 472T23. A cepa E. coli Depósito ATCC nr. 21277 (patente U.S. 3.580.810), disponível pela American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA, é ácido amino^-hidroxivalérico (AHV) resistente, mas requer prolina, tiamina, isoleucina e metionina para crescer em um meio mínimo. Está documentado que o Depósito ATCC nr. 21277 acumula 6,20 g/L de treonina em um processo de fermentação. O óperon de treonina do Depósito ATCC nr. 21277 é composto de um gene aspartato quinase I - homosserina desidrogenase I (thrA) que codifica uma enzima resistente a retroalimentação, um gene homosserina quinase (thrB) e um gene treonina sintase (thrC).

Está documentado que a cepa E. coli 472T23, que está depositada na USSR Collection of Commercial Microorganisms no USSR Antibiotics Research Institute sob Reg. Nr. BKIIM B-2307, requer treonina e isoleucina que crescem em um meio mínimo que contenha glicose, amônia, vitamina BI e sais minerais. Esta cepa não pode produzir treonina, em virtude de ela carregar um gene thr defeituoso, um gene essencial para a biossíntese de treonina. A cepa 472T23 também carrega um gene treonina desaminase defeituoso, ilvA, que codifica para a primeira enzima na biossíntese de isoleucina. 0 bacteriófago PI lisato foi preparado pelo crescimento do fago em Depósito ATCC nr. 21277. A cepa 472T23 foi então infectada com este PI lisato, no qual um pequeno número de partículas de fago carregou o óperon de treonina do Depósito ATCC nr. 21277. Seguindo-se à infecção, a bactéria que sintetiza treonina foi selecionada pelo espalhamento em meio mínimo E (glicose 0,05 g/L, MgS04.7H20 0,2 g/L, ácido cítrico H20 2,0 g/L, K2HP04 10,0 g/L, NaHNH4P04.4H20 3,5 g/L, agar 15,0 g/L) placas de agar suplementadas com 0,25 g/L de isoleucina. Diversos transdutores prototróficos de treonina, que levaram o óperon de treonina do Depósito ATCC nr. 21277, ficaram agora capazes de crescer em placas mínimas suplementadas somente com isoleucina.

Esses transdutores foram selecionados por fermentação em incubador rotativo para produção de treonina, conforme descrito a seguir no exemplo 2. Um deles, G9, produzindo treonina, foi selecionado para continuidade do desenvolvimento de cepa. B. Transferência de um gene treonina desidrogenase defeituoso (tdh) inserido com um gene cloramfenicol acetiltransferase (cat) no cromossomo da ceoa E. coli G9. A cepa CGSC6945, que leva um gene treonina desidrogenase defeituoso (tdh), foi obtido do E. coli Genetic Stock Center, 355 Osborne Memorial Laboratory, Department of Biology, Yale University, New Haven, Conecticut 06520-8104, USA. 0 gene treonina desidrogenase é defeituoso em virtude de ser inserido no gene cloranfenicol acetiltransferase (cat). Para transferir este gene defeituoso para G9, o fago PI cresceu em CSCG6945, e o lisato foi usado para infetar G9. Vários transdutores resistentes a cloranfenicol de G9 foram triados e selecionados em função da produção de treonina com fermentação em incubador rotativo, conforme descrito a seguir no exemplo 2. Um deles, G909, com maior titulação de treonina do que o G9, foi selecionado para posterior desenvolvimento. G. Inserção de um promotor não nativo no cromossomo da cepa E. coli G909. A fim de entregar o promotor tac no cromossomo de G909, recombinação homóloga entre um fragmento linear de DNA e o cromossomo de uma cepa exonuclease V menos {recD) foi empregada. 0 fragmento de DNA linear tinha 1,5 kb da seqüência à montante (terminação 5') do óperon de treonina, um marcador resistente a canamicina, a seqüência do promotor tac, e cerca de 480 bp do gene thrA. Este fragmento, que forneceu homologia da terminação 5', um marcador de seleção (resistência a canamicina), um promotor forte e controlável para o óperon de treonina (tac), e homologia da terminação 3', respectivamente, foram gerados da seguinte maneira. 0 óperon de treonina do E. coli tipo selvagem W3110 foi clonado no sítio Sphl da enzima de restrição do plasmídeo pUC19 utilizando-se o DNA do clone lambda 676 de Dr. Yuji Kohara, Department of Molecular Biology, School of Science, Nagoya University, Chikusa-ku, Nagoya, Japão. Os DNA de clone lambda 676 e pUC19 foram então digeridos com Sphl. 0 fragmento pUC19 foi subsequentemente desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão (SAP) e gel de agarose purificado. 0 fragmento 6,9 kb de óperon de treonina do clone lambda foi também purificado. Esses dois fragmentos foram subseqüentemente ligados por T4 DNA ligase para gerar plasmídeo pAD103. A região de flanco à montante para recombinação homóloga e marcador de resistência de canamicina foi então construída. 0 pAD103 foi digerido com enzima de restrição BstEII, Xbal e terminada com ponta cega com tratamento de fragmento Klenow. 0 fragmento 1,5 kb contendo somente a extremidade 5' (â montante) do óperon de treonina (mas não o próprio óperon thr ou sua região de controle) foi isolado e ligado ao fragmento do gene de resistência de canamicina do pUC4K (Pharmacia), que foi digerido com enzima de restrição Sall e fragmento Kenow tratado para encher os ressaltos 3' para gerar o plasmídeo intermediário pAD106. 0 pAD103 foi também digerido com enzima de restrição Taql e terminado com ponta cega com tratamento de fragmento Kenow. 0 fragmento contendo o sítio de ligação de ribossomo nativo e cerca de 480 bp da seqüência de codificação do gene thrA foi isolado e então ligado a um fragmento de pKK233-3 (Pharmacia), que foi digerido com enzima de restrição Smal e desfosforilado com SAP, para se obter o plasmídeo pAD115, que apresentou a seqüência de DNA do promotor tac, os sítios de ligação de ribossomo e algumas centenas de base do gene thrA. O pAD115 foi subseqüentemente digerido com enzima de restrição BamHI e 0,75 kb do fragmento de DNA que continha as seqüências de DNA desejadas foram isolados. O pAD106 foi também digerido com BamHI e, por exemplo, desfosforilado com SAP. Os dois fragmentos foram então ligados para fornecer o plasmídeo pAD123, que continha a seqüência de DNA à montante do óperon de treonina, um gene marcador de resistência de canamicina, o promotor tac e cerca de 480 bp do início do gene thrA. O pAD123 foi então digerido com Spel, Bgrll, e o fragmento contendo as seqüências de DNA foi isolado. A cepa exonuclease V menos (recD) foi preparada pelo crescimento de fago PI na cepa E. coli KW251 (genótipo relevante: argA81:\TnlO, recD1014; obtido da Pharmacia}, que apresentou um gene recD com uma inserção de transposon co- transdutível TnlO em argA. O lisato que foi preparado do fago foi então usado para infectar a cepa G9 e o transdutor resistente a tetraciclina G9T7 foi isolado. O fragmento de DNA do plasmídeo pAD123 foi entregue à cepa E. coli G9T7 por eletroporação. Uma cepa resistente a canamicina de G9T7 foi isolada e um lisado fágico PI foi então usado para transduzir G909. Um dos transdutores resistentes, resistentes a canamicina G909, tac3, que apresentou uma titulação de treonina mais alta na presença de IPTG no estudo em incubador rotativo, foi isolado. O lisado fágico PI foi subseqüentemente preparado com a cepa tac3 e, em seguida, usado para infectar a cepa 6- 8 (descrita a seguir). Os transdutores resistentes a canamicina foram selecionados e um deles, a cepa 6-8tac3, que produziu uma titulação ainda maior do que o tac3 no estudo em incubador rotativo, foi isolado. D. Mutaaênese NTG e o isolamento de mutantes resistentes a borrelidina a partir de cepas E. coli G909 e 6-8 As células da cepa G909 foram submetidas a mutagênese pelo tratamento de N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidia (NTG) (50 mg/L, 30 minutos a 36°C) utilizando-se métodos convencionais. As células resultantes foram então espalhadas em chapa agar do meio mínimo contendo 0. 25 g/L de L-isoleucina e 0,1% V/v de CPCA Depois da incubação por 3-5 dias a 36°C, as colônias grandes que se formaram na placa, que incluíram a cepa 6-8, foram selecionadas para teste de resistência a CPCA e produção de L-treonina.

Para testar a resistência a CPCA, cada cepa foi cultivada em 20 ml do meio de semente SM (32,5 g/L de glicose; 1 g/L de MgS04.7H20; 24,36 g/L de K2HP04; 9,52 g/L de KHP04; 5 g/L de (NH4)2S04; 15 g/L de extrato de levedura; pH 7,2) a 36°C por 17 horas com vibração. As células foram colhidas e lavadas com o meio mínimo E. A suspensão de células foi então inoculada em um tubo esterilizado contendo 3 ml de meio mínimo E e 0,01, 0,5 ou 1 mM de CCPA. Depois de 24 horas de cultura a 36°C com vibração, o crescimento foi determinado, medindo-se a densidade ótica a 660 (não mostrada). Os resultados estão mostrados a seguir na tabela 1, relativa ao crescimento na ausência de CPCA. TABELA 1 E. Remoção da exigência de isoleucina e gene repressor de lactose (lacl) Com a introdução do promotor tac não nativo e um gene thrA resistente a retroalimentação, a expressão do óperon thr (thrA, thrB, thrC) não é mais controlada pelo mecanismo de atenuação. Em decorrência disto, a privação de isoleucina e/ou a presença de um marcador auxotrófico ilvA não é mais necessária para a produção de treonina.

Dessa maneira, o marcador ilvA tipo selvagem foi introduzido pela transdução em 6-8tac3 para fixar a necessidade de isoleucina da cepa (isto é, eliminar a necessidade de meio suplementado de isoleucina para o crescimento celular). 0 lisato fágico PI produzido a partir de CGSC7334 (genótipo relevante: lacI42::TnlO, lacZU118, obtido do E. coli Genetic Stock Center, 355 Osborne Memorial Laboratory, Department of Biology, Yale University, New Haven, Connecticut 06520-8104, USA) foi usado para infectar 6-8tac3, e transdutores positivos para biossíntese de isoleucina foram selecionados. Esses transdutores produziram aproximadamente a mesma quantidade de L-treonina que a cepa 6-8tac3 em um estudo em incubador rotativo. Um desses transdutores, 6-8tac3ile+, foi selecionado para desenvolvimento posterior.

Uma vez que o óperon de treonina de 6-8tac3ile está sob o controle do promotor tac, foi necessário isopropil-p-D-tioglactosídeo (IPTC) para induzir as células a expressar totalmente o óperon thr.

Dessa maneira, para eliminar este obstáculo regulador desnecessário, é introduzido um gene repressor lac defeituoso (lacl) pela infecção de 6-8tac3ile+ com fago PI feito de CGSC7334. Os transdutores resultantes (6-8tac3lacI- ) foram testados em relação à resistência a tetraciclina, e colônias resistentes a tetraciclina foram selecionadas.

Exemplo 2 Estudo de Fermentação em incubador rotativo de Produção de Treonina Foi determinada uma comparação de produção de treonina entre as várias cepas E. coli por meio de seus desempenhos em fermentação em incubador rotativo.

As cepas em teste cresceram em meio agar LB (10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato, 15 g/L de agar) . Depois de 1 a 2 dias de crescimento, as células foram suspensas em 5 ml de meio de semente (dextrose 32,5 g/L; K2HP04 24,35 g/L; KH2P04 9,5 g/L; extrato de levedura 15 g/L; (NH4)2S04 5 g/L; MgS04.7H20 1 g/L) a pH 7,2. A semente cresceu por 24 horas com uma velocidade de agitação de 250 rpm a 37°C. 15 ml de meio de fermentação (dextrose 40 g/L; extrato de levedura 2 g/L; ácido cítrico 2 g/L; (NH4)2S04 25 g/L; MgS04.7H2) 2,8 g/L; CaC03 20 g/L; solução de traços de metais 2 ml) a pH 7,2 foram então adicionados à semente e o processo de fermentação realizado a 37°C com uma velocidade de agitação de 250 rpm. Depois da cultura, a quantidade de L-treonina que se acumulou no caldo de cultura foi analisada por HPLC (bomba ISCO Model 2353, detector de índice refrativo Rainin Model RI-1, e coluna aminex Hp87-CA. A quantidade de L-treonina produzida em cada uma das cepas testadas está apresentada na tabela 2 a seguir. TABELA 2 Exemplo 3 Estudo de Fermentação As cepas E. coli da presente invenção e suas respectivas cepas precursoras foram testadas com relação à produção de L-treonina por fermentação.

G909 foi testada sob as seguintes condições. 0,5 L de meio de cultura aquoso contendo 30 g/L de broto de soja tríptico e 5 g/L de extrato de levedura em um incubador rotativo abafado de 2L foram inoculados com 1,5 ml de G909 e incubados em uma batedeira a 35°C e 200 rpm por 8,5 horas. 0,9 ml (0,03%) do inóculo maduro foi adicionado a um fermentador de vidro contendo 3,0 L do meio fermentador de semente, 10 g/L d.s. de licor da maceração do milho, 0,4 g/L de L-isoleucina, 2,5 g/L de KH2P04, 2,0 g/L de MgS04.7H20, 0,5 g/L de (NH4)2S04, 0,192 g/L de ácido cítrico anidro, 0,03 g/L de FeS04.7H20, 0,021 g/L de MnS04.H20 e 80 g/L de dextrose). A incubação foi conduzida sob as seguintes condições: uma temperatura de 39°C para as primeiras 18 horas e, em seguida, 37 °C para o restante; pH de 6,9 (mantido pela adição de NH4OH) ; vazão de ar de 3,5 LPM; agitação de 500 rpm inicialmente, que foi então aumentada de forma a manter o D.O. a 20%; e contrapressão de 6894,76 a 13.790 Pa (1-2 psi). A complementação do estágio fermentador de semente foi determinada pela diminuição da quantidade de dextrose. 315 ml (15%) do inóculo maduro do fermentador de semente foram adicionados a um fermentador de vidro contendo o mesmo meio (meio do fermentador principal) listado anteriormente com as seguintes exceções: o volume foi de 2,1 L e 0,34 g/L de L-isoleucina foi adicionado. A incubação foi conduzida por 48 horas sob as seguintes condições: temperatura de 37°C; pH de 6,9 (mantido com NH4OH); vazão de ar de 3,5 LPM até 20 horas e, em seguida, aumentado para 4,0 LPM; agitação de 500 rpm inicialmente, que foi então aumentada de forma a manter o D.O. em 20%; contrapressão de 6894,76 a 13.790 Pa (1-2 psi); e nível de dextrose de 10 g/L (mantido pela alimentação com uma solução de dextrose de 50% w/w) . A fermentação terminou depois de 48 horas. G909 produziu os seguintes resultados: uma titulação final de 62,3 g/L de treonina com uma produtividade total de 274 g e um rendimento de 23,2%. tac3 foi testada nas mesmas condições supradescritas para o G909, com a seguinte exceção: 1 mg/L de IPTG foi adicionado no início do estágio principal do fermentador. Com a adição de IPTG, tac3 produziu uma titulação final de 85,7 g/L de treonina com uma produtividade total de 355 g e um rendimento de 28,8%. 6-8 foi testada nas mesmas condições da G909 supradescrita. 6-8 produziu os seguintes resultados: uma titulação final de 74,1 g/L de treonina com uma produtividade total de 290 g e um rendimento de 28,3%. 6-8tac3 foi testada nas mesmas condições da tac 3 supradescrita, incluindo a adição de IPTG. 6-8tac3 produziu os seguintes resultados: uma titulação final de 99,3 g/L de treonina com uma produtividade total de 421 g e um rendimento de 35,1%. 6-8tac3ile+ foi testada nas mesmas condições de 6- 8tac3 supradescrita, com a seguinte exceção: não foi necessária L-treonina, tanto no estágio de semente do fermentador como no estágio principal do fermentador. Por causa de uma falha na agitação a 22,5 horas, somente um título em 22 horas foi registrado (62 g/L de treonina). ADM Katl3 foi testada nas mesmas condições da 6- 8tac3 supradescrita, com a seguinte exceção: não foi adicionado IPTG. Nessas condições, ADM Katl3 produziu uma titulação final de 102 g/L de treonina com uma produtividade total de 445 g e um rendimento de 33,1%.

Os genótipos relevantes das cepas construídas, suplementos necessários para a produção fermentativa de treonina, e as titulações registradas estão apresentadas na tabela 3. TABELA 3 Bor-R: resistência a borrelidina ND: não realizado NA: não disponível ptachtABC: os genes thrA, thrB e thrC sob controle do promotor tac Exemplo 4 Preparação de Cepa E. coli ADM Kat69.9 A. Transferência do óperon de treonina de uma cepa 5 E. coli. ADM Kat26. para o cromossomo da cepa E. coli W3110 A cepa ADM Kat26 foi construída previamente a partir da E. coli Depósito ATCC nr. 21277, conforme mostrado na tabela 4. 0 promotor de treonina nativa desta cepa foi substituído pelo promotor tac, ao mesmo tempo em que um gene de canamicina foi introduzido no cromossomo. Um PI lisato foi preparado pelo crescimento do fago em ADM Kat26. A cepa W3110 (Depósito ATCC Nr. 27325) foi infectada com este lisato, no qual uma pequena quantidade de partículas de fago levou o óperon de treonina de ADM Kat26. Seguindo-se à infecção, a transferência do óperon de treonina foi selecionada para um meio rico contendo canamicina. Diversos desses transdutores foram selecionados em fermentação em incubador rotativo para produção de treonina e inducibilidade do óperon de treonina. Um dos transdutores, ADM Kat60.6, foi selecionado para posterior desenvolvimento da cepa. B. Transferência de um crene de treonina desidroaenase defeituoso (tdh) inserido com gene cloranfênico acetiltransferase (cat) e uma cópia adicional do óperon de treonina sob o controle do promotor tac no cromossomo da cepa E. coli ADM Kat60.6 A fim de introduzir uma segunda cópia do óperon de treonina no cromossomo, foi construído um vetor que nocauteou o gene tdh pela inserção de uma cópia do óperon de treonina. A primeira etapa deste processo foi construir um vetor contendo os genes apropriados. A deleção de tdh::cat da cepa SP942 foi clonada, digerindo-se o DNA genômico com EcoRI, isolando a região de aproximadamente 4,8 kb, e clonando no sítio EcoRI do plasmídeo pucl8 (figura 6) . Este plasmídeo foi então digerido com Nael e o óperon de treonina com o gene de canamicina e promotor tac foram clonados no gene tdh (figura 7) . Esta nova construção foi linearizada pela digestão com enzimas de restrição MluI e JíindII. 0 pedaço linear que contém o tdh com a segunda cópia do óperon thr foi eletroporada numa cepa recD. As transformações foram selecionadas em meio rico contendo cloramfênico. Um lisato PI foi feito a partir de um desses transformantes, e foi usado para infectar ADM Kat31, um produtor derivado de treonina do Depósito ATCC nr. 21277. Um lisato foi produzido a partir desta cepa, e este lisato foi usado para infectar ADM Kat60.6. Os transdutores foram selecionados em meio rico contendo cloramfênico. Foram realizados estudos em incubador rotativo para selecionar o melhor produtor. Uma cepa, ADM

Kat68, foi escolhida para manipulações posteriores. C. Remoção do gene repressor de lactose (lacl) Uma vez que ambos os óperons de treonina de ADM

Kat68 estão sob o controle do promotor tac, foi necessário que o isopropil-B-D-tiogalactosídeo (IPTG) induzisse as células a expressar completamente o óperon thr. 0 uso de IPTG para induzir expressão do óperon thr ê menos preferido.

Para eliminar este problema, foi introduzido um gene repressor lac (lacl) pela infecção de ADM Kat68 com fago PI feito a partir de CAG 18439. Todas as cepas envolvidas na construção de ADM Kat69.9 (NRRL B-30316) e seus genótipos foram apresentados na tabela 4. Os transdutores resultantes foram selecionados em meio rico contendo tetraciclina, e então selecionados em incubador rotativo para uma mesma produção de treonina com ou sem IPTG. TABELA 4 Exemolo 5 Estudo de Fermentação em Incubador Rotativo da Produção de Treonina Foi feita uma comparação de várias cepas E. coli, utilizando-se suas produções de treonina na fermentação em incubador rotativo. As cepas foram crescidas em meio agar LB por toda a noite e, em seguida, transferidas para 20 ml de meio do incubador rotativo (dextrose 32,5 g/L; KjHPO* 24,35 g/L; KH2P04 9,5 g/L; extrato de levedura 15 g/L; (NH4)2S04 5 g/L, MgS04.7H20 1 g/L) a pH 7,2. A semente cresceu por 24 horas com uma velocidade de agitação de 300 rpm a 37°C. 2 ml desta cultura foram transferidos para o meio de fermentação (extrato de levedura 2 g/L; ácido cítrico 2 g/L; (NH4)2S04 25 g/L, KH2P04 7,46°C, solução de traços de metais 2 ml/L; CaC03 20 g/L; dextrose 40 g/L; MgS04.7H20 2 g/L) a pH 7,2. A fermentação se desenvolveu por 24 horas a 37°C e 300 rpm em uma batedeira. Depois da cultura, a quantidade de treonina acumulada no caldo foi analisada por HPLC (conforme mostrado na tabela 5). TABELA 5 Exemplo 6 Mutaaênese e Seleção de Mutantes com Maior Produção de L- treonina a partir da Cepa ADM Kat69.9 As células da cepa ADM Kat69.9 (NRRL B-30316) ou seus mutantes foram colhidos de culturas na fase log- intermediária crescida em LB e, em seguida, sofreram mutagênese com tratamento de N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (NTG) (50 mg/L, 36°C, 25 minutos) em 3 ml de TM tampão (Tris.HCl 6,0 g/L, ácido maléico 5,8 g/L, (NH4)2S04 1,0 g/L, Ca(N03) 2 5 mg/L, MgS04.7H20 0,1 g/L, FeS04.7H20 0,25 mg/L, ajustado ao pH 6,0 por meio de KOH) .

Depois de 25 minutos de reação, as células tratadas NTG foram precipitadas por centrifugação. As células tratadas foram lavadas duas vezes em TM tampão e espalhadas em meio mínimo E (glicose 0,05 g/L, MgS04.7H20 0,2 g/L, ácido cítrico H20 2,0 g/L, K2HP04 10,0 g/L, Na (HN4) P04.4H20 3,5 g/L) placas de agar contendo 4-8% de treonina ou 0,2-0,5% de rafinato de treonina (TRF) com base em gramas de sulfato de amônio por litro de meio, determinado utilizando-se uma sonda sensível a íons que mede íons de amônia.

Depois da incubação por 3-5 dias a 36°C, as colônias em crescimento nessas placas foram colhidas e testadas em relação à maior produção de L-treonina em incubadores rotativos e fermentadores. Os mutantes com maior produção de treonina foram submetidos ao ciclo seguinte de mutagênese e de seleção. Conforme mostrado na figura 8, a cepa ADM TH21.97 (NRRLB-30318) se desenvolveu a partir de ADM Kat69.9 (NRRL B-30316) pelo uso de critério de seleção projetado para identificar células que poderíam crescer mais depressa, produzir mais L-treonina no meio de fermentação formulado, e tolerar maiores concentrações de L-treonina e de TRF, comparada com suas cepas parentais.

Exemplo 7 Seleção de Cepas Mutantes de Rafinato de Treonina Tanto ADM TH14.97 (NRRL B-30317) como ADM TH25.79 (NRRL B-31319) são mutantes que foram selecionados de placas de agar de meio E contendo 0,2-0,4% de TRF, descrito no exemplo 6. A cepa ADM TH14.97 é um mutante TRF de ADM TH8.102 desenvolvido a partir de ADM Kat69.9 (NRRL B-30316) conforme descrito na figura 8. E a cepa ADM TH25.79 (NRRL B- 30319) é um mutante TRF de ADM TH1.2 que foi desenvolvido a partir de ADM Katl3 (NRRL B-21593), (patente U.S. 5.939.307). Para estudar o efeito de TRF no crescimento em cultura, mutantes TRF selecionados e suas cepas parentais cresceram em meio contendo TRF. Cerca de 0,1 ml de cultura preparado a partir de cada uma das cepas testadas foi inoculado num incubador rotativo abafado de 250 ml contendo 20 ml de meio mínimo E e TRF a 0,1-0,4%, com base em gramas de sulfato de amônio por litro de meio. Depois de vibração a 37°C e 240 rpm por 24 horas, seus crescimentos O. D. foram medidos a 660 nm. Conforme mostrado na tabela 6, ADM TH14.97 e ADM TH25.79 cresceram melhor, com maior O.D. em meio mínimo E contendo TRF, do que suas respectivas cepas parentais ADM TH8.102 e ADM TH1.2. TABELA 6: O.D. a 660 nm depois de crescimento em meio mínimo E a 37°C e 240 rpm oor 24 horas Exemplo 8 Consumo de Dextrose, Crescimento, e Produção de L-treonina em uma Fermentação em Incubador Rotativo A L-treonina produzida por cepas E. coli foi determinada pelos seus desempenhos na fermentação em incubador rotativo. As cepas em teste cresceram em meio agar LB (triptofam 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, NaCl 10 g/L, e agar 15 g/L). Depois e 1 a 2 dias de crescimento, as células foram inoculadas a 20 ml de meio de semente A (K2HP04 24,36 g/L, KH2P04 g/L, KH2P04 9,5 g/L, extrato de levedura 15 g/L, (NH4) 2S04 5 g/L, MgS04.7H20 1 g/L, dextrose 32,5 g/L, pH 7,2) em um incubador rotativo abafado de 250 ml. Depois de crescimento a 37°C, 240 rpm, vibração por 18 horas, 2 ml de semente foram inoculados em 20 ml de meio de fermentação A (dextrose 40 g/L, MgS04.7H20) 2 g/L, CaC03 20 g/L, solução de traços de metais 2 mm/L, pH 7,2) em um incubador rotativo abafado de 250 ml. Depois de cultura a 37°C, 240 rpm com vibração por 24 horas, a quantidade de L-treonina que se acumulou no caldo de cultura foi analisada por HPLC.

Nas mesmas condições de incubação supraindicadas, o meio de semente B (MgS04.7H20 2 g/L, (NH4)2S04 25 g/L, FeS04.7H20 0,03 g/L, MnS04H20 0,02 g/L, KH2P04 2,5 g/L, ácido cítrico 0,2 g/L, licor da maceração de milho 20 g/L d.s. (sólido dissolvido), dextrose 40 g/L, CaC03 40 g/L, pH 7,0) e meio de fermentação B (MgS04.7H20 1,75 g/L, (NH4)2S04 0,88 g/L, K2HP04 1,75 g/L, licor da maceração de milho 1,76 g/L d.s., dextrose 40 g/L, uréia 20 g/L, CaC03 17,5 g/L, pH 6,8) foram também usados nesses estudos para determinar a produção de treonina de mutantes selecionados.

Os resultados de suas produções de L-treonina e rendimentos % na fermentação em incubador rotativo foram mostrados na tabela 7. TABELA 7 Exemplo 9 Produção de L-treonina em Fermentação no Fermentador A produção de L-treonina de cepas E. coli foi também determinada a partir de seu desempenho em fermentação no fermentador. A cepa em teste cresceu em um meio em incubador rotativo contendo 30 g/L de caldo de soja tríptico e 5 g/L de extrato de levedura. Cerca de 1,5 ml de cultura foi inoculado em um incubador rotativo abafado de 2 L contendo 0,5 ml de meio em incubador rotativo e incubado a 37°C e 220 rpm por 8 horas. Cerca de 0,9 ml da cultura do incubador rotativo foi então transferido para um fermentador de 5 L contendo 3,0 L do meio fermentador de semente/principal (licor da maceração de milho 10 g/L d.s. (sólidos dissolvidos), KH2P04 2,5 g/L, MgS04.7H20 0,5 g/L, (NH4)2S04 0,5 g/L, FeS04.7H20 0,03 g/L, MnS04H20 0,021 g/L, ácido cítrico anidro 0,192 g/L, dextrose 80 g/L). A cultura de semente do fermentador foi conduzida nas seguintes condições: temperatura a 39°C, vazão de ar a 3,5 LPM, agitação a 500 rpm inicialmente, em seguida, aumentada de forma a manter o D.O. em 20%, pH em 6,9 mantido pela adição de NH40H, e contrapressão em 6894,76 a 13.790 Pa (1-2 psi).

Depois do encerramento do estágio de semente com base na diminuição na quantidade de dextrose, 315 ml de cultura de semente foram inoculados em um outro fermentador de 5L contendo 1,6 L do mesmo meio fermentador de semente/principal supradescrito. A fermentação foi conduzida por 48 horas nas seguintes condições: temperatura em 33°C, vazão de ar em 3,5 LPM, agitação em 800 rpm inicialmente, em seguida, aumentada de forma a manter o D.O. em 20%, pH em 6,9 mantido pela adição de NH4OH, e contrapressão em 6894,76 a 13.790 Pa (1-2 psi) . A cultura da fermentação foi alimentada com uma solução de dextrose de 50% w/w para manter o nível de dextrose em 10 g/L no fermentador. Depois de 48 horas, amostras foram retiradas para medir a quantidade de L- treonina produzida por meio de HPLC (tabela 8) .

Claims (41)

1. Processo para produzir uma cepa de Escherichia coli que produz entre 95 e 150 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura, CARACTERIZADO por compreender: (a) inserir no cromossomo de uma E. coli, pelo menos um óperon de treonina operavelmente ligado a um promotor não nativo para produzir uma cepa parental, em que o óperon de treonina compreende genes e codifica enzimas necessárias para a biossintese da treonina; e (b) realizar pelo menos dois ciclos de mutagênese na cepa parental, seguido por (c) selecionar as células que sofreram mutagênese para identificar E. coli que produz entre 95 e 150 g/L de L- treonina em 48 horas de crescimento em cultura; e (d) selecionar as células que são resistentes a rafinato de treonina compreendendo de 0,05% a 5% de sulfato de amônio, em que o rafinato de treonina é o produto residual gerado de operações de troca de ions para recuperação de treonina do caldo de fermentação.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a cepa de E. coli produzir entre 100 e 140 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de a cepa de E. coli produzir entre 110 e 130 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de a cepa de E. coli produzir entre 100 e 120 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pela mutagênese ser feita por meio de um agente selecionado do grupo que consiste em: (a) um agente alquilante; (b) um agente intercalante; e (c) luz ultravioleta.

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de dois ou três óperons de treonina serem inseridos no cromossomo da E. coli.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelos óperons de treonina individuais serem operavelmente ligados a, pelo menos, dois promotores não nativos diferentes.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo promotor não nativo ser selecionado do grupo que consiste de o promotor tac, o promotor lac, o promotor trp, o promotor Ipp, o promotor PL e o promotor PR.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de o promotor não nativo ser o promotor tac.

10. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo óperon de treonina conter um gene que codifica uma aspartato quinase - homosserina desidrogenase resistente à retroalimentação.

11. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli conter um gene treonina desidrogenase defeituoso no cromossomo.

12. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo óperon de j treonina ser obtido da cepa depositada como ATCC Depósito nr. 21277.

13. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelas células que sofreram mutagênese serem selecionadas para identificar E. coli que sejam resistentes à borrelidina.

14. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de as células que sofreram mutagênese serem selecionadas para identificar E. coli que sejam resistentes a ácido ciclopentanocarboxílico.

15. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli ter as características da cepa depositada como NRRL B-30318.

16. Processo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de a cepa de E. coli ter as características da cepa depositada como NRRL B-30319.

17. Cepa de E. coli, CARACTERIZADA por ser produzida pelo processo definido na reivindicação 1.

18. Processo para produzir L-treonina, CARACTERIZADO por compreender as etapas de: (a) cultivar uma cepa de E. coli definida na reivindicação 17 em um meio de cultura; e (b) recuperar L-treonina do meio de cultura, onde a cepa de E. coli é resistente a rafinato de treonina compreendendo de 0,05% a 5% de sulfato de amônio, em que o rafinato de treonina é o produto residual gerado de operações de troca de ions para recuperação de treonina do caldo de fermentação.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli produzir entre 100 e 140 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

20. Processo de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli produzir entre 110 e 130 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

21. Processo de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli produzir entre 110 e 120 g/L de L-treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

22. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo promotor não nativo ser selecionado do grupo que consiste de o promotor tac, o promotor lac, o promotor trp, o promotor Ipp, o promotor PL e o promotor PR.

23. Processo de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo promotor não nativo ser o promotor tac.

24. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo óperon de treonina conter um gene que codifica um aspartato quinase - homosserina desidrogenase resistente à retroalimentação.

25. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli conter um gene treonina desidrogenase defeituoso no cromossomo.

26. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo óperon de treonina ser obtido da cepa depositada como ATCC Depósito nr. 21277.

27. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli ser resistente à borrelidina.

28. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli ser resistente ao ácido ciclopentanocarboxilico.

29. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli ter as características da cepa de E. coli depositada como NRRL B-30319.

30. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli ter as caracter!sticas de uma cepa selecionada do grupo que consiste em: (a) a cepa depositada como NRRL B-30318; e (b) a cepa depositada como NRRL B-30319.

31. Processo de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pela cepa de E. coli ser uma cepa selecionada do grupo que consiste de: (a) a cepa depositada como NRRL B-30318; e (b) a cepa depositada como NRRL B-30319.

32. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA por produzir entre 100 e 140 g/L de L- treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

33. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADA por produzir entre 110 e 130 g/L de L- treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

34. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADA por produzir entre 110 e 120 g/L de L- treonina em 48 horas de crescimento em cultura.

35. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo óperon de treonina codificar um gene homosserina quinase (thrB), um gene de treonina sintase (thrC) e um gene de aspartato quinase I - homosserina desidrogenase I (thrA) resistente a retroalimentação.

36. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo óperon de treonina ser obtido de uma cepa depositada como ATCC Deposit No. 21277.

37. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de conter um gene de treonina desidrogenase defeituoso no cromossomo.

38. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA por ser resistente a borrelidina ou ácido ciclopentacarboxilico.

39. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de ter as características da cepa depositada como NRRL B-30319.

40. Cepa de E. coli, CARACTERIZADA por ser selecionada do grupo que consiste de: (a) a cepa depositada como NRRL B-30316; e (b) a cepa depositada como NRRL B-30317.

41. Cepa de E. coli de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA por produzir L-treonina e ser resistente ao ácido ciclopentanocarboxílico.