JPH0746994B2 - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法

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JPH0746994B2
JPH0746994B2 JP59208677A JP20867784A JPH0746994B2 JP H0746994 B2 JPH0746994 B2 JP H0746994B2 JP 59208677 A JP59208677 A JP 59208677A JP 20867784 A JP20867784 A JP 20867784A JP H0746994 B2 JPH0746994 B2 JP H0746994B2
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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法に関す
る。更に詳しくは組換えDNA法により育種されたコリネ
ホルム細菌を用いる発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法
に関する。
従来の技術 組換えDNA法によりアミノ酸生産菌を育種した例はすで
に数多く知られている。
これらの例はいずれも一種類のプラスミドベクターに一
または二以上の酵素をコードする遺伝子を挿入して得ら
れた組換えプラスミドを有する微生物を用いるものであ
り、必ずしも高いアミノ酸の生産性が得られてはいな
く、さらに改善する必要があった。
発明が解決しようとする問題点 従ってこの発明の目的は、組換えDNA法によってＬ−ア
ミノ酸の生産性がさらに高いコリネホルム細菌を育種し
ようとするものである。
問題点を解決するための手段 本発明者らは叙上の問題点を解決するため種々研究の結
果、コリネホルム細菌細胞内で自律複製可能であり、相
互に異なる複製開始点を有する二つ以上のプラスミドベ
クターのひとつに所望のＬ−アミノ酸の生合成系路上に
ある酵素の少なくともひとつをコードする遺伝子を挿入
し、上記二つ以上のプラスミドベクターの残りのもの
に、上記Ｌ−アミノ酸の生合成系路上にあり、上記酵素
とは異なる酵素をコードする遺伝子を挿入し、上記二つ
以上の酵素は上記Ｌ−アミノ酸の生合成においていずれ
も高位の律速となっているものであって、得られたそれ
ぞれの組換えプラスミドをコリネホルム細菌の菌株の１
つの細胞に導入することによって、高いＬ−アミノ酸の
生産能を有する細菌を得ることに成功した。
すなわち本願発明は、コリネホルム細菌細胞内で自律複
製可能であり、相互に異なる複製開始点を有する二つ以
上のプラスミドベクターの１つに、所望のＬ−アミノ酸
の生合成系路上にある、少なくとも１つの酵素をコード
する遺伝子を挿入し、上記二つ以上のプラスミドベクタ
ーの残りのものに、上記Ｌ−アミノ酸の生合成系路上に
あり、上記酵素とは異なる酵素をコードする遺伝子を挿
入し、得られたそれぞれの組換えプラスミドをコリネホ
ルム細菌の菌株の１つの細胞に導入して得られかつ上記
Ｌ−アミノ酸の生産能を有する細菌を培養する方法であ
って、上記二つ以上の酵素は、上記Ｌ−アミノ酸の生合
成においていずれも高位の律速となっているものであ
る。酵素法によるＬ−アミノ酸の製造法である。
本発明では、上記のように二つ以上のプラスミドベクタ
ーを用いるが、これは少なくとも二つのプラスミドベク
ターを用いるのであって、三ないし四のプラスミドベク
ターを用いても良い。しかしあまり数が多くなると技術
上困難となる。
この発明では、二つ以上のプラスミドが共存しうること
が必要である。本発明者らの研究によれば共存しうる条
件としては、例えばブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムのもつプラスミドpAM330より得た二つのプラス
ミドは、共存しえず、したがって共存しうるためには複
製開始点が異なることが考えられた。共存しうる条件と
して複製開始点のみが異っていればよく、他の部分は同
じでもかまわない。共存するかどうかを見分けるには、
二つ以上のプラスミドがもつ薬剤耐性がそれぞれ発現し
ているかどうかを調べることにより分かる。複製開始点
とは、プラスミドDNAの複製が開始されるDNA領域をい
う。
あるアミノ酸の生合成系路上にある酵素とは、例えば、
グルコースを炭素源とした場合、スレオニンであればグ
ルコースからホスホエノールピルビン酸さらにピルビン
酸までの一連の酵素、さらにホスホエノールピルビン酸
からオキサロ酢酸、アスパラギン酸へ、又、ピルビン酸
からアセチルCoAを経て、TCA回路を経てオキサロ酢酸、
アスパラギン酸へ、さらに、アスパラギン酸からホモセ
リンを経てスレオニンに至るまでの生合成系をつかさど
る一群の酵素である。又、トリプトファンであれば、グ
ルコースを炭素源とすれば、グルコースからホスホエノ
ールピルビン酸までの酵素、さらにホスホエノールピル
ビン酸からコリスミン酸、さらにアントラニル酸からト
リプトファンへの酵素群である。又、プロリンでは同様
にグルコースからホスホエノールピルビン酸、ピルビン
酸までの酵素、さらに、ホスホエノールピルビン酸から
オキサロ酢酸を経てTCA回路に入る系路、又ピルビン酸
からアセチルCoAを経てTCA回路に入る経路の酵素、さら
にTCA回路からグルタミン酸を経てプロリンに至る一連
の酵素群である。又、フェニルアラニンでは、グルコー
スよりホスホエノールピルビン酸、さらにコリスミン酸
からプレフェン酸を経てフェニルアラニンへ至る一連の
酵素である。又、バリンについては、同様にグルコース
からピルビン酸、スレオニンまでの一連の酵素、さら
に、α‐アセト乳酸を経てバリンに至る系路上の酵素で
ある。
高位の律速であるかどうかを見分けるには、ある酵素の
生産物を添加することにより、最終産物である目的アミ
ノ酸の生合成速度の上昇が見られれば、律速であること
がわかる。さらに、次位の律速も同様にして調べられ
る。使用する酵素は、高位の律速のものより挿入する
が、必ずしも順位の高いものから挿入する必要はない。
挿入する酵素の遺伝子とアミノ酸の例を以下に示す。
スレオニン発酵では、アスパルトキナーゼ（2.7.2.
4）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（6.
4.1.1）、ホモセリンデヒドロゲナーゼ（1.1.1.3）、ホ
モセリンキナーゼ（2.7.1.39）、スレオニンシンターゼ
（4.2.99.2）及びアスパラギン酸トランスアミナーゼ
（2.6.1.1）などがある。
リジン発酵では、アスパルトキナーゼ、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼ、アスパラギン酸トランス
アミナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（1.2.1.11）、ジヒドロジピコリン酸シンターゼ
（4.2.1.52）、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ（1.
3.1.26）、スクシニルジアミノピメリン酸トランスアミ
ラーゼ（2.6.1.17）、スクシニルジアミノピメリン酸デ
アシラーゼ（3.5.1.18）、ジアミノピメリン酸エピメラ
ーゼ（5.1.1.7）及びジアミノピメリン酸デカルボキシ
ラーゼ（4.1.1.20）などがある。
トリプトファン発酵では、ホスホエノールピルビン酸に
いたるまでの生合成酵素に加え、デオキシアラビノヘプ
ツロン酸リン酸シンターゼ、３−デヒドロキナ酸シンタ
ーゼ（4.6.1.3）、３−デヒドロキナ酸デヒドラターゼ
（4.2.1.10）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（1.1.1.2
5）、シキミ酸キナーゼ（2.7.1.71）、５−エノールピ
ルビルシキミ酸シンターゼ（2.5.1.19）、コリスミン酸
シンターゼ、アントラニル酸シンターゼ（4.1.3.27）、
アントラニル酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、Ｎ
−（５′−ホスホリボシル）アントラニル酸イソメラー
ゼ、インドール３−グリセロールリン酸シンターゼ（4.
1.1.48）、及びトリプトファンシンターゼ（4.2.1.20）
がある。
フェニルアラニン発酵では、トリプトファンと同様にデ
オキシ−アラビノ−ヘプツロン酸リン酸シンターゼより
コリスミン酸シンターゼまでの酵素に加えコリスミン酸
ムターゼ及びプレフェン酸デヒドラターゼ（4.2.1.51）
がある。
コリネホルム細菌は、好気性、グラム陽性桿菌であり、
非抗酸性でバーヂース・マニュアル・オブ・デターミネ
イティブバクテリオロジー第８版599頁（1974）に記載
されていて、そのうち特に以下に例示するようなＬ−グ
ルタミン酸を大量に生産するものが知られている。
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC 14020 ブレビバクテリウム・サッカロリティクム ATCC 14066 ブレビバクテリウム・インマリオフィルム ATCC 14068 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC 13869 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC 13825 ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 13826 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC 19240 コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム ATCC 13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミクム ATCC 15806 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC 15991 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 13032,13060 コリネバクテリウム・リリウム ATCC 15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC 17965 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC 15354 コリネホルム細菌には上記のようなグルタミン酸生産性
を有するもののほかに、リジン、アルギニン等のアミノ
酸を生産する変異株も含まれる。
アミノ酸生合成に関与する遺伝子を単離する方法は、コ
リネホルム細菌のうちより健全なアミノ酸生合成に関与
する遺伝子を有している株より、まず染色体遺伝子を抽
出し（例えばＨ・Saito and K・Miura Biochem.Biophy
s.Acta 72 619（1963）の方法が利用できる）、これを
適当な制限酵素で切断する。ついで、コリネホルム細菌
で増殖し得るプラスミドベクターに接続し、得られた組
換えDNAを用いてコリネホルム細菌のアミノ酸要求性変
異株を形質転換せしめ、アミノ酸要求性を消失するにい
たった菌株を単離し、それよりアミノ酸生合成に関与す
る遺伝子を分離できる。
染色体遺伝子を、切断するには切断反応時間等を調節し
て、切断の程度を調節すれば巾広い種類の制限酵素が使
用できる。
本発明にて使用されるプラスミドベクターは、コリネ型
細菌細胞内において増殖し得るものであればどのような
ものでも良い。具体的に例示すれば、以下のものがあ
る。
(1)pAM 330 特開昭58−67699参照 (2)pHM 1519 特開昭58−77895参照 (3)pAJ 655 特開昭58−192900参照 (4)pAJ 611 特開昭58−192900参照 (5)pAJ 1844 特開昭58−192900参照 コリネホルム細菌細胞内で増殖可能なプラスミドのその
他の例としてはpCG1（特開昭57−134500）、pCG2（特開
昭58−35197）、pCG4,pCG11（特開昭57−183799）があ
る。
これらのプラスミドのうち２種類以上のプラスミドを用
いれば本発明の目標を達することができる。
ベクターDNAは、染色体遺伝子を切断した際に用いられ
た制限酵素により切断され、または染色体DNA切断フラ
グメント及び切断されたベクターDNAのそれぞれの両端
に相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを接続
せしめて、ついでプラスミドベクターと染色体DNAフラ
グメントとのライゲーション反応に付される。
このようにして得られた、染色体DNAとベクタープラス
ミドとの組換えDNAをコリネホルム細菌に属する受容菌
へ導入するには、エシェリヒア・コリＫ−12について報
告されている様な（Mandel,M.and Higa,A.,J.Mol.Bio
l.,53,159（1970））受容菌細胞を塩化カルシウムで処
理してDNAの透過性を増す方法、またはバチルス・ズブ
チリスについて報告されている様に（Duncan,C.H.,Wils
on,G.A.and Young,F.E.,Gene,1,153（1977））細胞がDN
Aを取り込み得る様になる増殖段階（いわゆるコンビテ
ントセル）に導入する方法により可能である。あるい
は、バチルス・ズブチリス、放線菌類および酵母につい
て知られている様に（Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.G
en.Genet.,168.111（1979）;Bibb,M.J.,Ward,J.M.and H
opwood,O.A.,Nature,274,398（1978）;Hinnen,A.,Hiek
s,J.B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.sci.USA,75 1929
（1978））、DNA受容菌を、プラスミドDNAを容易に取り
込むプロトプラストまたはスフェロプラストにしてプラ
スミドをDNA受容菌に導入することも可能である。
プロトプラスト法では上記のバチルス・ズブチリスにお
いて使用されている方法でも充分高い頻度を得ることが
できるし、特開昭57−183799に記載されたコリネバクテ
リウム属またはブレビバクテリウム属のプロトプラスト
にポリエチレングリコールまたはポリビニルアルコール
と二価金属イオンとの在存下にDNAをとり込ませる方法
も当然利用できる。ポリエチレングリコールまたはポリ
ビニルアルコールのかわりに、カルボキシメチルセルロ
ース、デキストラン、フイコール、プルロニックF68
（セルバ社）などの添加によってDNAのとり込みを促進
させる方法でも同等の結果が得られる。
アミノ酸生合成に関与する遺伝子がベクタープラスミド
に接続された組換えDNAを有する菌株を得るには、Ｌ−
アミノ酸要求株を受容菌として、上記のように組換えた
DNAを形質転換してアミノ酸要求性が消失したような形
質転換株を分離すればよい。該アミノ酸生合成に関与す
る遺伝子の導入によりアナログ耐性などの形質が付与さ
れる場合にはその形質をアミノ酸要求性形質のかわりに
指標としても容易に目的の組換えDNAを含む形質転換株
が得られる。
上記のようにして得られた形質転換株よりアミノ酸生合
成に関与する遺伝子が接続された組換えDNAを分離し、
上記と同様にして得られたアミノ酸生合成に関与する他
の遺伝子が接続されたような組換えDNAを有する菌株に
導入すれば、効率よくアミノ酸を生産する菌株を得るこ
とができる。
組換えDNAを単離する方法は、例えば菌体をリゾチームS
DS処理により溶菌させ、フェノール処理ののち、２容の
エタノールを加えてDNAを沈澱回収する。
複数のプラスミドを導入するには、一個づつを順次上記
のような方法により導入するのがよいが、複数個を混合
して導入してもよい。
上記のようにして得られた複数の組換えDNAを有する形
質転換株はそれ自体が各種のアミノ酸を生産する場合が
多いが、より生産性の高いアミノ酸生産菌を得るには、
所望のアミノ酸より生産性の高い菌株を用いて組換えDN
Aにより形質転換すれば良い。組換えDNA受容菌として、
例えば、代表的なものを例示すればリジン生産菌を得た
い時にはホモセリン要求菌、Ｓ−（２−アミノエチー
ル）システイン耐性株等を用いる。アルギニン生産にお
いては２−チアゾールアラニン耐性菌、スレオニン生産
においてはαアミノβヒドロキシバレリアン酸耐性株イ
ソロイシン生産においてはαアミノβヒドロキシバレリ
アン酸耐性株、プロリン生産においては、２−４デヒド
ロプロリン耐性株、グルタミン酸生産においては、ケト
マレイン酸耐性株等が用いられる。
得られたＬ−アミノ酸生産菌を培養する方法は、従来の
Ｌ−アミノ酸生産菌の培養方法と特に変らない。即ち、
培地としては、炭素源、窒素源、無機イオン、更に必要
に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有す
る通常のものである。炭素源としては、グルコース、シ
ユクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加
水分解液、ホエイ、糖密等が用いられる。窒素源として
は、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩そ
の他が使用できる。
培養は好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつ
つ、実質的にＬ−アミノ酸の生産蓄積が停止するまで行
なわれる。
かくして培養液中には著量のＬ−アミノ酸が生成蓄積さ
れる。培養液よりＬ−アミノ酸を採取する方法は通常の
方法が適用できる。
実施例１ (1)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PEP
C）遺伝子を含む染色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
を１のCMG培地（ペプトン1g/dl、酵母エキス1g/dl、
グルコース0.5g/dl、及びNacl0.5g/dlを含み、pH7.2に
調整したもの）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行
ない、対数増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチー
ム・SDSで溶菌させたのち、通常のフェノール処理法に
より、染色体DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgのDNAを
得た。
(2)ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ43（分子量3.4メガダルトンブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ11997、（FERM P
−6857,FERM BP−591）として寄託）を用い、そのDNAを
pAJ655（特開昭58−192900参照）から次の様にして調製
した。
pAJ655は、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ATCC13869が有していたpAM330より得られたものであ
る。
pAJ655を保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメ
ンタムNo.64（宿主No.64はATCC39134として寄託）はク
ロラムフェニコール100μg/mlを含むCMG寒天培地（ペプ
トン10g/l、酵母エキス10g/l、グルコース5g/l、NaCl5g
/l、寒天20g/lを含みpH7.2に調製したもの）上で生育不
可能であるが、本菌をCMG培地で培養し、クロラムフェ
ニコール100μg/mlを含むCMG液体培地に30℃で一晩培養
後、同濃度のクロラムフェニコールを含むCMG培地に適
当量塗布し、30℃１〜２日間培養することによりクロラ
ムフェニコール100μg/mlに耐性を示す株を１株得た。
本株のクロラムフェニコール耐性度をCMG培地で調べた
ところ200μg/mlまで耐性を示した。
上記の結果、得られたクロラムフェニコール高濃度耐性
株からpAJ43DNAを次のようにして調製した。まず本株を
クロラムフェニコールを10μg/ml含む１のCMG液体培
地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養し、集菌し
た。常法によりリゾチームとSDSにより溶菌せしめた
後、30,000×g,30分の超遠心により上清を得た。これに
ポリエチレングリコール（最終濃度10％）を添加してDN
Aを沈澱せしめ、これを濃縮後、沈澱物をトルス・EDTA
・NaClバッファー（pH8.0）10mlに溶解した。DNAをリボ
ヌクレアーゼで処理（リボヌクレアーゼI 50μg/mlで37
℃,30分間反応）後、フェノール抽出し、ついで２倍量
のエタノールを加え−20℃でDNAを沈澱させ、沈澱物を1
mlのトリス・EDTA・NaClバッファーに溶解した。このDN
A溶液をアガロースゲル電気泳動法（電圧ゲル1cm当り5
V,15時間）によって最終150μｇの純粋なpAJ43プラスミ
ドDNAを分画採取した。
pAJ43DNAの性質は次のとおりである。
pAJ43の分子量の決定はアガロースゲル電気泳動によっ
た。
アガロースゲル電気泳動はシャープ（P.A.Sharp）らの
方法（Biochemistry12,3055（1973））により、0.8％ゲ
ルを用い、ゲル長さcm当り、5Vで15時間、定電圧で泳動
した。分子量はpAJ43を１ケ所切断する制限酵素Hind II
I 0.5ユニットをpAJ43,0.5μｇに37℃、１時間反応さ
せ、切断し、直線状にした後、分子量既知の分子量マー
カー、λファージのHind IIIフラグメント（BRLから購
入）との移動度の比較によって算出し、3.4Mdと計算さ
れた。
制限酵素切断後のDNA断片をアガロースゲル電気泳動で
解析した結果、pAJ43はpAJ655からin vivoでdeletionに
より生じ、pBR325のクロラムフェニコール耐性遺伝子領
域を含む約1MdとpAM330の複製維持に必須の領域を含む
約2.4Mdのフラグメントから成る小型プラスミドである
ことが判明した。
(3)染色体DNA断片のベクターへの挿入 (1)で得た染色体DNA20μｇと(2)で得たプラスミドDNA10
μｇとを制限エンドヌクレアーゼHind IIIでそれぞれを
37℃、１時間処理し、完全に切断した。65℃、10分の熱
処理後、両反応液を混合し、ATR及びジチオスレイトー
ル存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって10
℃、24時間DNA鎖の連結反応を行った。65℃、５分の熱
処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応
終了後のDNAを沈澱採取した。
(4)PEPC遺伝子のクローニング PEPC活性が50％に減少したブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム（AJ12061）を受容菌として用いた。
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を5mlのCMG液体培
地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを0.6
ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分
離により菌体を集め、菌体を0.5Mシュークロース、20mM
マレイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％「ペナッセ
イブロス」（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5ml
で洗浄した。次いで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培
地に懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。60
00×ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗
浄し0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと(3)で調製したDNA10μｇを5mM EDTA
存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃度が
30％になる様に添加した後、DNAをプロトプラストに取
り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロトプラ
ストをSMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁し、
形質発現の為、30℃で２時間培養した。この培養液をpH
7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロトプ
ラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、M
gCl2・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O 2.2g、ペプトン4g、粉
末酵母エキス4g、「カザミノ酸」（Difco社）1g、K2HPO
4 0.2g、グルタミン酸10g、ビオチン500μｇ、コハク酸
ナトリウム135g、寒天8g及びクロラムフェニコール３μ
g/mlを含む。
30℃で２週間培養後、約500個のクロラムフェニコール
耐性コロニーが出現してきたのでこれをグルタミン酸を
含まない培地（Glu欠培地:2％グルコース、１％硫酸ア
ンモニウム、0.25％尿素、0.1％りん酸二水素カリウ
ム、0.04％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2p
pmマンガンイオン、200μg/lサイアミン塩酸塩、５μg/
lビオチン、pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール耐性でかつグルタミン酸要求性の消失し
た１株を得た。この株をAJ12066（FERM-P7176）（FARM-
BP590）と名付けた。
(5)形質転換株のプラスミド解析 AJ12066を(2)で述べた方法により、溶菌液を調製し、ア
ガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDNAを検出
したところ、ベクターのpAJ43よりも明らかに大きな分
子量10.5メガダルトンのプラスミドが検出された。この
組換えプラスミドをpAJ200と名付けた。
(6)再トランスホーメーション (5)で検出された7.1メガダルトンのDNA断片を含む組換
えプラスミド上にPEPC遺伝子が存在することを確認する
ためこのプラスミドDNAを用いブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムAJ12061を再度、形質転換した。
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうちそれぞ
れ30個を釣り上げグルタミン酸要求性をしらべると、す
べてのコロニーについて要求性が回復しており、上記の
組換えプラスミド上にPEPC遺伝子が存在することが明ら
かとなった。
(7)安定化プラスミド保持株の採取とプラスミド解析 上記プラスミドは、非常に不安定であったので小型化し
た安定なプラスミドを保持する菌株の採取を試みた。
コリネ型細菌のプロトプラスト形質転換では分子量の大
きいプラスミドを菌体内に導入すると、DNA鎖の一部脱
落をおこしプラスミドが小型化することがあり、再形質
転換株100株のプラスミド検索をおこなった。その結
果、８株中に小型化プラスミドが検出された。これら小
型化プラスミドは、菌株に安定に保持された。そのうち
１株よりプラスミドを大量に調製し、pAJ201と名付け
た。
(8)ホモセリンデヒドロゲナーゼ（HD）遺伝子を含む染
色体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869
のα−アミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性突然変異株
AJ11188（FERM-P4190）（特公昭56−3038）を１のCNG
培地（ペプトン1g/dl、酵母エキス1g/dl、グルコース0.
5g/dl、及びNaCl0.5g/dlを含み、pH7.2に調整したも
の）に植菌し、30℃で約３時間振盪培養を行ない、対数
増殖期の菌体を集めた。この菌体をリゾチーム・SDSで
溶菌させたのち、通常のフェノール処理法により、染色
体DNAを抽出精製し、最終的に3.6mgのDNAを得た。
(9)ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（特開昭58−192900参照）（分
子量5.4メガダルトン）を用い、そのDNAを次の様にして
調製した。
pAJ1844は、コルネバクテリウム・グルタミカムATCC130
58が有していたプラスミドpHM1519より誘導されたもの
である。
まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ12037（FERM-P7234）
（FERM-BP577）を100mlのCNG培地に接種し、30℃で対数
増殖期後期まで培養したのち、リゾチールSDS処理によ
り溶菌させ、30,000×g30分の超遠心により上清を得
た。フェノール処理ののち、２容のエタノールを加えて
DNAを沈澱回収し、pAJ1844プラスミドDNA約80μｇを得
た。
(10)染色体DNA断片のベクターへの挿入 (8)で得た染色体DNA40μｇを、制限酵素PstI、0.124ユ
ニットで30℃,10分間部分消化した。
(9)で得たプラスミドDNA10μｇは制限エンドヌクレアー
ゼPst Iで37℃、２時間処理し、完全に切断した。65℃1
0分の熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレ
イトール存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによっ
て22℃、15時間DNA鎖の連結反応を行った。65℃５分の
熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反
応終了後のDNAを沈澱採取した。
(11)HD遺伝子のクローニング HD遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムAJ12019（NRRLB-15346）を受容菌として用い
た。(4)で述べた方法で形質転換をおこなった。
30℃で10日間培養後、クロラムフェニコール耐性であっ
てかつホモセリン要求性が消失したAJ12020（FERM-BP26
9）を得た。
(12)形質転換株のプラスミド解析 これらの株より(2)で述べた方法により、溶菌液を調製
し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDNA
を検出したところ、7.64Mdのプラスミドを検出し、pAJ2
10と名づけた。
(13)カナマイシン耐性遺伝子を含むDNA断片の調製とプ
ラスミドpAJ201への挿入 プラスミドpUC4K（Veriera,J and Messing,J Gene 19:2
59 1982.ファルマシア社より購入）20μｇに、20ユニッ
トの制限酵素Bam H1を37℃で２時間反応させ、完全に消
化した。アガロースゲル電気泳動によりカナマイシン耐
性遺伝子を含むDNA断片約1400塩基対を分離し、精製し
た。
(7)で得たプラスミドpAJ201DNA2μｇを制限酵素Bgl II
で完全に切断した。このDNAとカナマイシン耐性遺伝子
を含むDNA断片を混合し、ATP及びジチオスレイトール存
在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼにより10℃,24時間
DNA鎖の連結反応を行った。65℃,5分の熱処理後、反応
液に２倍容のエタノールを加えて、連結反応終了後のDN
Aを沈澱採取した。
得られたプラスミドDNAを(4)に記載した形質転換法によ
りブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036
（FERM P−7559,FERM BP−734）に導入した。プロトプ
ラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10g、M
gCl2・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O 2.2g、ペプトン4g、粉
末酵母エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K2HPO4 0.
2g、グルタミン酸10g、ビオチン500μｇ、コハク酸ナト
リウム135g、寒天8g及びカナマイシン75μg/mlを含む。
30℃で２週間培養したところ、10株のカナマイシン耐性
コロニーが出現してきた。これらの株より溶菌液を調製
し(9)で述べた方法によりアガロースゲル電気泳動によ
ってプラスミドDNAを検出したところ、明らかにpAJ201
より大きいプラスミドが検出された。このプラスミドを
pAJ201Kとした。pAJ201KをPEPC活性の低下が原因でグル
タミン酸要求性を示すブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタム（AJ12061）に形質転換した。生じたカナマ
イシン耐性コロニーのうち25株をグルタミン酸を含まな
い培地に釣りあげたところカナマイシン耐性でかつ、グ
ルタミン酸要求性を消失していた。よってpAJ201K上にP
EPC遺伝子が存在し発現することを確認した、 (14)形質転換株のスレオニン生産能 pAJ210を形質転換法により、スレオニン生産菌、α−ア
ミノ−β−ハイドロキシ吉草酸耐性突然変異株ブレビバ
クテリウム・ラクトファーメンタムAJ11188（FERM-P419
0）中に導入し、形質転換株をクロラムフェニコール耐
性で選択し、菌株AJ12021（FERM-BP270）株を得た。さ
らに(13)で得たプラスミドpAJ201KをpAJ12021に導入
し、クロラムフェニコール耐性かつカナマイシン耐性で
選択し、二種のプラスミドpAJ201KとpAJ210を含むAJ121
67（FERM-P7879）を得た。
AJ11188株、AJ12021株及びAJ12167株をスレオニン生産
培地（グルコース10g/dl,(NH4)2SO4 3g/dl,KH2PO4 0.1g
/dl,MgSO4・7H2O 0.04g/dl,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・5
H2O 10mg,チアミン・HCl 300μg/l,ビオチン100μg/l,
大豆蛋白酸加水分解液（「味液」）45mg/dl（全窒素と
して），イソロイシン25mg/dl,ロイシン30mg/dl,pH7.0,
CaCO3 5g/dl（別に殺菌した）30℃にて72時間振盪培養
した。培養後、遠心上清中のＬ−スレオニンを高速液体
クロマトグラフィーで定量した。その結果を第１表に示
した。
(15)pAJ210を、形質転換法により、コルネバクテリウム
・グルタミカムのホモセリン要求株ATCC13287に導入
し、SR8301（NRRL B−15348）株を得た。これに更にpAJ
201Kを形質転換し、カナマイシン耐性かつクロラムフェ
ニコール耐性で選択し、pAJ210とpAJ201K両者を含むAJ1
2168（FERM P−7880,FERM BP−895）を得た。(14)のス
レオニン生産培地にて、同様に、スレオニン生産を行っ
た。培養後遠心上清中のＬ−スレオニンを高速液体クロ
マトグラフィーで定量した。結果を第２表に示した。
実施例２ トリプトファンシンターゼ遺伝子を有するプラスミドと
３−デヒドロキナ酸シンターゼ及びシキミ酸キナーゼ遺
伝子を有するプラスミドの共存によるＬ−トリプトファ
ンの生産 １ シキミ酸キナーゼ（SK）遺伝子及び３−デヒドロキ
ナ酸シンターゼ遺伝子のクローニング １−１ 共与体DNAの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ11225（F
ERM P−4370,FERM BP−1219）を１のCMG培地（ペプト
ン1g/dl、酵母エキス1g/dl、グルコース0.5g/dl及びNaC
l0.5g/dlを含み、pH7.2に調製したもの）に植菌し、30
℃で振盪培養を行ない、対数増殖期の菌体を集めた。こ
の菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させたのち、通常のフ
ェノール処理法により、染色体DNAを抽出精製し、最終
的に3.5mgのDNAを得た。
１−２ ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（Escherichia coli AJ11883FER
M-BP137として寄託されている。）（分子量5.4メガダル
トン）を用い、そのDNAを次の様にして調製した。
まずpAJ1844をプラスミドとして保有するブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムAJ12037を100mlのCMG培
地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養したのち、
リゾチームSDS処理により溶菌させ、30,000×g,30分の
超遠心により上清を得た。フェノール処理ののち、２容
のエタノールを加えてDNAを沈澱回収した。これを少量
のTEN緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl,1mM EDTA
（pH8.0）溶解後、アガロースゲル電気泳動にかけ分離
後、切り出してpAJ1844プラスミドDNA約15μｇを得た。
１−３ 染色体DNA断片のベクターの挿入 (1)で得た染色体DNA10μｇと(2)で得たプラスミドDNA5
μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst Iでそれぞれを37
℃に１時間保持し、完全に切断した。65℃に10分間加熱
した後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレイトー
ル存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって10℃
に24時間保持しDNA鎖を連結せしめた。ついで反応液
を、65℃にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノー
ルを加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。
１−４ SK遺伝子のクローニング SK遺伝子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトフェル
メンタムAJ12157（ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムAJ12036（FERM P−7559,FERM BP−734）を親株
とし、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ンにより変異処理することによりフェニルアラニン、ト
リプトファン、チロシンの３アミノ酸を生育に要求する
変異株として選択した。）を受容菌として用いた。
形質転換の方法としては、プロトプラストトランスフォ
ーメーション法を用いた。まず、菌株を5mlのCMG液体培
地で対数増殖期の初期まで培養し、ペニシリンＧを0.6
ユニット/ml添加後、さらに1.5時間振盪培養し、遠心分
離により菌体を集め、菌体を0.5Mシュークロース、20mM
マレイン酸、20mM塩化マグネシウム、3.5％ペナッセイ
ブロス（Difco）からなるSMMP培地（pH6.5）0.5mlで洗
浄した。ついで10mg/mlのリゾチームを含むSMMP培地に
懸濁し30℃で20時間プロトプラスト化を図った。6000×
ｇ、10分間遠心分離後、プロトプラストをSMMPで洗浄
し、0.5mlのSMMPに再度懸濁した。この様にして得られ
たプロトプラストと１−３で調製したDNA10μｇを5mM E
DTA存在下で混合し、ポリエチレングリコールを最終濃
度が30％になる様に添加した後、DNAをプロトプラスト
に取り込ませる為に室温に２分間放置した。このプロト
プラストをSMMP培地1mlで洗浄後、SMMP培地1mlに再懸濁
し、形質発現の為、30℃で２時間培養した。この培養液
をpH7.0のプロトプラスト再生培地上に塗布した。プロ
トプラスト再生培地は蒸留水１あたりトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノメタン12g、KCl0.5g、グルコース10
g、MgCl2・6H2O 8.1g、CaCl2・2H2O 2.2g、ペプトン4
g、粉末酵母エキス4g、カザミノ酸（Difco社）1g、K2HP
O4 0.2g、コハク酸ナトリウム135g、寒天8g及びクロラ
ムフェニコール３μg/mlを含む。
30℃で２週間培養後、約25000個のクロラムフェニコー
ル耐性コロニーが出現してきたのでこれを最少培地（２
％グルコース、１％硫酸アンモニウム、0.3％尿素、0.1
％りん酸二水素カリウム、0.04％硫酸マグネシウム７水
塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガンイオン、200μg/lサイ
アミン塩酸塩、50μg/lビオチン、クロラムフェニコー
ル10μg/ml,pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、クロラ
ムフェニコール耐性でかつフェニルアラニン、トリプト
ファン、チロシン要求性の消失した５株を得た。
１−５ 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より１−２で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、全ての株でベクターのpAJ1844より
も明らかに大きなプラスミドが検出された。
５株のプラスミドをそれぞれ組換えに用いた制限酵素Ps
t Iで切断すると全てのプラスミドに共通な2.9kb.のDNA
挿入断片が認められた。従ってSK遺伝子は2.9kb.のPst
I DNA断片上に存在すると思われる。ベクターpAJ1844の
Pst I切断点に2.9kb.のDNA断片が挿入された組換えプラ
スミドをpAJ927と名付け、pAJ927を保持する株をAJ1215
8（FERM P−7865,FERM BP−888）と名付けた。
１−６ 再トランスホーメーション １−５で検出された2.9キロベースのDNA断片を含む組換
えプラスミド上にSK遺伝子が存在することを確認するた
めこのプラスミドDNA pAJ927を用い、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムAJ12157を再度、形質転換し
た。
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうち10個を
釣り上げフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
要求性をテストしたところ、これらのいずれも要求性が
消失しており、上記の組換えプラスミド上にSK遺伝子が
存在することが明らかとなった。
１−７ pAJ927上の３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝
子の同定 pAJ927を大腸菌Ｋ−12株由来の３−デヒドロキナ酸シン
ターゼ欠損株AB2847（J.Pittardet.al.,J.Bacteriol.,1
494,91,1966）に形質転換した。
AB2847へのpAJ927の導入方法は、DNA受容細胞を塩化カ
ルシウムで処理してDNAの透過性を増す方法を用いた。
生じたクロラムフェニコール耐性コロニーのうち10個を
釣り上げフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
の要求性を調べた。
その結果すべてのコロニーが全ての要求性を消失してい
た。従ってpAJ927にはSK遺伝子、３−デヒドロキナ酸シ
ンターゼ遺伝子が2.9kb.の挿入Pst I DNA断片上にクロ
ーニングされていることが明らかとなった。
2.SK遺伝子、及び３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子
を有する2.9kb.Pst I DNA断片のpAJ226への移し変え ２−１ トリメトプリム耐性を有するベクタープラスミ
ドpAJ228の造成 (1)ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムAJ12036
より変異誘導されたトリメトプリム耐性異変株AJ12146
（FERM P−7672,FERM BP−785）を１のCMG培地（ペプ
トン1g/dl、酵母エキス1g/dl、グルコース0.5g/dl、及
びNaCl0.5g/dlを含み、pH7.2に調整したもの）に植菌
し、30℃で約３時間振盪培養を行ない、対数増殖期の菌
体を集めた。この菌体をリゾチーム・SDSで溶菌させた
のち、通常のフェノール処理法により、染色体DNAを抽
出精製し、最終的に3.0mgのDNAを得た。
(2)ベクターとしてpAM330を用いた。pAM330は次の様に
して調製した。
まずpAM330をプラスミドとして保有するブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムATCC13869を100mlのCMG培
地に接種し、30℃で対数増殖期後期まで培養したのち、
リゾチームSDS処理により溶菌させ、30,000×g30分の超
遠心により上清を得た。フェノール処理ののち、２容の
エタノールを加えてDNAを沈澱物として回収した。これ
を少量のTEN緩衝液（20mMトリス塩酸塩、20mM NaCl、1m
M EDTA（pH8.0）に溶解後、アガロースゲル電気泳動に
かけ分離後、切り出してpAM330プラスミドDNA約15μｇ
を得た。
(3)(1)で得た染色体DNA20μｇと(2)で得たプラスミドDN
A10μｇとを制限エンドヌクレアーゼMbo Iでそれぞれ37
℃,30分間処理し、部分切断した。65℃,10分の熱処理
後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレイトール存
在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって10℃,24時
間DNA鎖の連結反応を行った。65℃,5分の熱処理後、反
応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のDN
Aを沈澱採取した。
(4)トリメトプリム感受性のブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムAJ12036を受容菌として用いた。
形質転換の方法としては、１−４で述べた方法を用い
た。トリメトプリム（Sigma社）25μg/mlを含む再生培
地にて、30℃で１週間培養後、約100個のコロニーが出
現してきたので、これをトリメトプリムを含む最小培地
（２％グルコース、１％硫酸アンモニウム、0.25％尿
素、0.1％りん酸二水素カリウム、0.04％硫酸マグネシ
ウム７水塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガンイオン、200
μg/lサイアミン塩酸塩、50μg/lビオチン、pH7.0、寒
天1.8％、トリメトプリム50μg/ml）にレプリカし、ト
リメトプリム耐性１株を得た。
(5)この株より１−２で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、ベクターのpAM330よりも明らかに
大きなプラスミドが検出された。この株をAJ12147（FER
M P−7673,FERM BP−786）と名付けた。
(6)AJ12147が有するプラスミド（pAJ228）上にトリメト
プリム耐性遺伝子が存在することを確認するため、この
プラスミドDNAを用いブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムAJ12036を再度、形質転換した。
生じたトリメトプリム耐性を有するコロニーのうちそれ
ぞれ10個を釣り上げアガロースゲル電気泳動法によりプ
ラスミドDNAを検出したところ、これらのいずれにもpAJ
228と同じ大きさのプラスミドが存在していた。上記組
換えプラスミド上にトリメトプリム耐性を表現する遺伝
子が存在することが明らかとなった。
２−2 pAJ228へのPst Iリンカーの挿入 pAJ228DNA0.5μｇを制限エンドヌクレアーゼHpa Iで37
℃,1時間処理し、完全切断した。70℃,5分の熱処理後、
pPst Iリンカー（宝酒造）１μｌ（100pmole）と混合
し、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4ファージ由
来のDNAリガーゼ（宝酒造）によって16℃，一晩DNA鎖の
連結反応を行なった。70℃,5分の熱処理後、反応液に２
倍容のエタノールを加えて連結反応終了後のDNAを沈澱
採取した。このDNAを用い、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムAJ12036を形質転換後、生じたトリメ
トプリム耐性コロニーからランダムに５個を選び溶菌液
を調製し、制限エンドヌクレアーゼPst I10ユニットを3
0℃,1時間反応させた。各DNAを0.8％アガロースゲル電
気泳動にかけ、分子量既知のλファージのHind IIIフラ
グメント（BRL社）との移動度を比較したところ、Pst I
で１ケ所に切断される分子量5.1Mdのプラスミドを１個
検出した。このプラスミドを１−２で述べた方法によ
り、調製後、各種制限エンドヌクレアーゼを反応させた
ところ、Hpa Iで切断されず、Pst Iで一ケ所に切断さ
れ、Bcl I,BstE II,Hae II,Hind III,Mlu Iなど他の制
限エンドヌクレアーゼによる切断箇所はpAJ228と同じで
あった。以上の結果から、pAJ228のHpa I切断部位にPst
Iリンカーが挿入されたことを確認し、このプラスミド
をpAJ226と名付けた。
２−3 pAJ927の2.9kb.Pst I DNA断片のpAJ226のPst Iサ
イトへの移し変え pAJ927 5μｇを制限酵素Pst Iで完全に切断し、アガロ
ースゲル電気泳動にかけ2.9kb.のPst I DNA断片をゲル
から切り出し、フェノール処理、クロロホルム処理後、
２倍容のエタノールを加えてDNAを沈澱物として回収し
た。一方pAJ226 2μｇを同酵素で完全に切断し、65℃,1
0分間の熱処理後、２倍容のエタノールを加えてDNAを沈
澱物として回収した。回収した両DNAを各々20μｌのTEN
緩衝液に溶解し両者を混合後、ATP及びジチオスレイト
ール存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって10
℃に24時間保持しDNA鎖を連結せしめた。ついで反応液
を65℃にて５分間加熱し、反応液に２倍容のエタノール
を加えて連結されたDNAの沈澱を採取した。次にSK遺伝
子が欠損したブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタ
ムAJ12157を受容菌として、１−４で使用した形質転換
法により上述のDNAを用いて形質転換した。トリメトプ
リムを100μg/ml含む再生培地にて、10日間,30℃で培養
後生じたコロニーをトリメトプリム50μg/mlを含む最少
培地にレプリカしフェニルアラニン、チロシン、トリプ
トファン要求性が消失しかつトリメトプリム耐性を示す
株を多数得た。これらの株の代表株からプラスミドDNA
検出したところpAJ226よりも明らかに大きなプラスミド
を有していた。本プラスミドを組換えに用いた制限酵素
Pst Iで切断したところpAJ226 7.6kb.以外に2.9kb.のDN
A断片が検出された。本プラスミドをpAJ1220と名付け
た。
3.トリプトファンシンターゼ遺伝子のクローニング ３−１ トリプトファンシンターゼ（TS）遺伝子を含む
染色体DNAの調製 Ｌ−トリプトファンによるフィードバック阻害に耐性を
示すTSの遺伝子を有するブレビバクテリウム・ラクトフ
ェルメンタムAJ12030（FERM-BP276）から１−１と同じ
方法を用いて染色体DNAを抽出精製し、最終的に3.5mgの
DNAを得た。
３−２ ベクターDNAの調製 ベクターとしてpAJ1844（分子量5.4メガダルトン）を用
い、そのDNAを１−２の方法を用いて精製し、最終的に1
2μｇのDNAを得た。
３−３ 染色体DNA断片のベクターへの挿入 ３−１で得た染色体DNA20μｇと３−２で得たプラスミ
ドDNA10μｇとを制限エンドヌクレアーゼPst Iでそれぞ
れを37℃,1時間処理し、完全に切断した。65℃,10分の
熱処理後、両反応液を混合し、ATP及びジチオスレイト
ール存在下、T4ファージ由来のDNAリガーゼによって10
℃,24時間DNA鎖の連結反応を行った。65℃,5分の熱処理
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結反応終了
後のDNAを沈澱採取した。
３−４ TS遺伝子のクローニング TSのαサブユニット（以下TSAと略す）の遺伝子が欠損
したブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムNo.21
株をDNA受容菌として、３−３で調製したDNA10μｇを１
−４で用いた方法により、形質転換した。クロラムフェ
ニコール３μg/mlを含む再生培地で30℃にて２週間培養
後、約10,000個のクロラムフェニコール耐性コロニーが
出現してきたので、これをトリプトファンを含まない培
地（Trp欠培地）（２％グルコース、１％硫酸アンモニ
ウム、0.25％尿素、0.1％りん酸二水素カリウム、0.04
％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガ
ンイオン、200μg/lサイアミン塩酸塩、50μg/lビオチ
ン、pH7.0、寒天1.8％）にレプリカし、クロラムフェニ
コール耐性であってかつトリプトファン要求性が消失し
た菌株３株を得た。
３−５ 形質転換株のプラスミド解析 これらの株より１−２で述べた方法により、溶菌液を調
製し、アガロースゲル電気泳動法により、プラスミドDN
Aを検出したところ、ベクターのpAJ1844よりも大きなプ
ラスミドを有する形質転換株１株を得、本株保有の組換
えプラスミド上にTSA遺伝子が存在することを確認し
た。本株をAJ12140（FERM P−7749,FERM BP−846）、本
組換えプラスミドをpAJ319と命名した。
またpAJ319をTSのβサブユニット（以下TSBと略す）欠
損のＢ−５株に導入すると上述と同様に、トリプトファ
ン要求性が消失することより、pAJ1844のPst Iサイトに
挿入された3.0kb.フラグメント上にtrp A及びtrp B遺伝
子が存在することが判明した。
4.pAJ1220とpAJ319の共存によるＬ−トリプトファンの
生産 ｍ−フルオロフェニルアラニン及び５−フルオロトリプ
トファンに耐性示す変異株ブレビバクテリウム・ラクト
フェルメンタムM247にpAJ1220とpAJ319を１−(4)で用い
た方法を用いて形質転換した。
クロラムフェニコール３μg/ml、トリメトプリム100μg
/mlを含む再生培地上で10日間30℃にて培養後生じたコ
ロニーを適当に選択した。かくして得られた株はトリメ
トプリムとクロラムフェニコールの両者に耐性を示し、
プラスミドの検出結果２種類プラスミドpAJ319,pAJ1220
を有していた。この株AJ12172（FERM P−7881,FERM BP
−896）を培養しＬ−トリプトファン生産能を調べたと
ころ第３表に示す結果を得た。培養はグルコース130g、
(NH4)2SO4 25g、フマル酸12g、酢酸3g、KH2PO4 1g、MnS
O4・4H2O 8mg、MgSO4・7H2O 1g、ビオチン50μｇ、サイ
アミン塩酸塩2000μｇ、Ｌ−チロシン650mg、DL−メチ
オニン400mg及びCaCO3 50gを水１に含むpH6.5の培地3
mlを試験管ないし20mlを肩付フラスコに分注したものに
被検株を植え、30℃にて72時間振盪下で行なった。培養
後遠心上清中のＬ−トリプトファンをマイクロバイオア
ッセイにより定量した。
尚pAJ319,pAJ1220は寄託されたAJ12172から通常の方法
を用いて分離しうる。
又、AJ12061,AJ12157,M247を得るには寄託されたAJ1206
6,AJ12158,AJ12172各々より宿主細胞を損なうことなく
宿主細胞中の複合プラスミドを除去することが可能であ
る。即ち、プラスミドは宿主より自然に失われることも
あるし、除去操作によって除くこともできる（Bact.Re
v.,36,p361-405（1972））。他の除去操作の例は以下の
通りである。AJ12172をCMG液体培地に接種し、37℃で一
晩培養後、培養液を適当に希釈し、クロラムフェニコー
ル、トリメトプリムを含有する、又は含有しないCMG寒
天培地に塗布し、30℃で１〜３日間培養する。かくして
クロラムフェニコールかつトリメトプリム感受性株とし
て分離される株がM247AJ12066,AJ12157である。
比較例 トリプトファンシンターゼ、３−デヒドロキナ酸シンタ
ーゼ及びシキミ酸キナーゼ遺伝子を有するプラスミドを
利用したＬ−トリプトファンの生産 pAJ927 5μｇをPatIで完全に切断し、アガロースゲル電
気泳動にかけ2.9KbのDNA断片をゲルから回収し、フェノ
ール処理、クロロホルム処理後、２倍容のエタノールを
加えてDNAを沈澱させ、20μｌのTEN緩衝液に溶解した。
一方、pAJ319 15μｇをPatIで部分分解した。65℃、10
分の熱処理の後、pAJ927から調製した2.9KbのPatI断片
と混合し、ATP及びジチオスレイトール存在下、T4ファ
ージ由来のDNAリガーゼによって10℃、24時間保持しDNA
鎖の連結反応を行った。ついで65℃、10分の熱処理の
後、反応液に２倍容のエタノールを加えて連結されたDN
Aを回収し、TEN緩衝液10μｌに溶解した。
SK遺伝子が欠損したAJ12157をDNA受容菌として上述の連
結されたDNA10μｇを用いて形質転換を行った。形質転
換方法としては実施例２、１−４で述べた方法を用い
た。クロラムフェニコール３μg/mlを含む再生培地にて
30℃で２週間培養後、約20,000個のコロニーが出現した
のでこれを最少培地（２％グルコース、１％硫酸アンモ
ニウム、0.3％尿素、0.1％リン酸二水素カリウム、0.04
％硫酸マグネシウム７水塩、2ppm鉄イオン、2ppmマンガ
ンイオン、200μg/lサイアミン塩酸塩、50μg/lビオチ
ン、クロラムフェニコール10μg/ml、pH7.0、寒天1.8
％）にレプリカし、クロラムフェニコール耐性でかつフ
ェニルアラニン、トリプトファン、チロシン要求性の消
失した98株を得た。
これらの株よりプラスミドを調製しアガロースゲル電気
泳動によりプラスミドDNAを検出したところ98株の内２
株がpAJ319よりも明らかに大きなプラスミドを有してい
た。そこでこれら２株のプラスミドとpAJ319及びpAJ927
をそれぞれ組換えに用いた制限酵素PatIで切断してとこ
ろ、pAJ319では9.0Kb、2.1Kb及び1.9KbのDNA断片が、pA
J927では9.0Kb及び2.9KbのDNA断片が検出され、一方、
これら２株由来のプラスミドではいずれもpAJ319に由来
すると推察される9.0Kb、2.1Kb及び1.9KbのDNA断片に加
えて３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子とSK遺伝子が
存在する2.9KbのPatI断片が認められた。
次にこれら２株のプラスミド上に存在すると考えられる
TS遺伝子の発現を確認するためこれら２株から調製した
プラスミドを用いてTSのαサブユニットが欠損したブレ
ビバクテリウム・ラクトファーメンタムNo.21株、及びT
Sのβサブユニットが欠損したＢ−５株を形質転換し
た。プロトプラスト再生培地上に出現したクロラムフェ
ニコール耐性コロニーをランダムにそれぞれ10個ずつ拾
い上げその栄養要求性を確認したところ、いずれも最少
培地上で生育しトリプトファン要求性を消失していた。
以上の結果からこれら２株のいずれのプラスミド上にも
TS遺伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子とSK遺
伝子が存在することが明らかとなった。これら２株のプ
ラスミドの制限酵素地図を作成したところ、pAJ319への
2.9KbのPatIDNA断片の挿入位置は同じで同一の構造であ
ったので、pAJ1222と名付け以後の実験に用いた。
pAJ1222のＬ−トリプトファン生産に及ぼす効果を調べ
るため、実施例２、１−４で述べた方法を用いてｍ−フ
ルオロフェニルアラニン及び５−フルオロトリプトファ
ンに耐性を示す変異株ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムM247にpAJ1222を導入した。
クロラムフェニコール３μg/mlを含むプロトプラスト再
生培地上に生じたコロニーをランダムに選択し、実施例
２、4.の方法により形質転換株のＬ−トリプトファン生
産能を培養評価した。30℃にて72時間振とう培養した
後、遠心上清中のＬ−トリプトファンを定量した結果、
M247/pAJ1222によるＬ−トリプトファン蓄積量は、0.53
g/dlであり、実施例２、4.に記載したAJ12172（M247/pA
J319,pAJ1220）による蓄積量0.59g/dlに比べて有意に少
なかった。すなわち、TS遺伝子、SK遺伝子及び３−デヒ
ドロキナ酸シンターゼ遺伝子を同一プラスミド上に組込
んで発見させた場合は、TS遺伝子を一方のプラスミド
に、SK遺伝子と３−デヒドロキナ酸シンターゼ遺伝子を
他方のプラスミドに組込み共存させた場合に比し、Ｌ−
トリプトファンの生産量が少なかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ 2121−4Ｂ 13/22 Ａ 2121−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:15） Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:15） 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２６９ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２７０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ ＢＰ−２７６ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−４１９０ 微生物の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−７８７９ (56)参考文献 特開 昭59−156292（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−126789（ＪＰ，Ａ) 日本農芸化学会編「物質生産のための遺 伝子工学」（株）朝倉書店（1983）Ｐ. 187−189，197−198

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】コリネホルム細菌細胞内で自律複製可能で
    あり、相互に異なる複製開始点を有する二つ以上のプラ
    スミドベクターの１つに、所望のＬ−アミノ酸の生合成
    系路上にある、少なくとも１つの酵素をコードする遺伝
    子を挿入し、上記二つ以上のプラスミドベクターの残り
    のものに、上記Ｌ−アミノ酸の生合成系路上にあり、上
    記酵素とは異なる酵素をコードする遺伝子を挿入し、得
    られたそれぞれの組換えプラスミドをコリネホルム細菌
    の菌株の１つの細胞に導入して得られかつ上記Ｌ−アミ
    ノ酸の生産能を有する細菌を培養する方法であって、上
    記二つ以上の酵素は、上記Ｌ−アミノ酸の生合成におい
    ていずれも高位の律速となっているものである、発酵法
    によるＬ−アミノ酸の製造法。
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