BRPI0200320B1 - bactéria corineforme transgênica, e, método para produzir l-glutamina - Google Patents

Abstract

"bactéria corineforme, método para produzir l-glutamina, e, dna". l-glutamina é produzida cultivando-se uma bactéria corineforme, que tem capacidade de produzir l-glutamina e foi modificada de modo que sua atividade de glutamina sintetase intracelular seja intensificada, preferivelmente que tenha sido mais modificada de modo que sua atividade de glutamato desidrogenase intracelular fosse intensificada, em um meio para produzir e acumular l-glutamina no meio e coletar a l-glutamina.

Description

“BACTÉRIA CORINEFORME TRANSGÊNICA, E MÉTODO PARA PRODUZIR L-GLUTAMINA”. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Campo da Invenção A presente invenção refere-se a uma bactéria produtora de L-glutamina, pertencente a bactérias corineformes e a um método para produzir L-glutamina. A L-glutamina é um amino ácido industrialmente útil como um ingrediente de condimentos, agentes promotores de função do fígado, transfusões amino ácidas, preparações amino ácidas compreensivas etc.

Arte Relacionada A fim de produzirem-se amino ácidos-L por fermentação, métodos para melhorar microorganismos por reprodução têm sido usados abundantemente. Isto é, uma vez que a capacidade de produção de cepas selvagens por si para produção de amino ácido-L é extremamente baixa em muitos casos, têm sido conhecidos métodos de dar auxotrofia ou resistência análoga por mutação ou de conceder mutação para regulação metabólica e métodos utilizando uma combinação destes. Embora a L-glutamina possa ser obtida com uma apropriada produção pelos método supracitados, é indispensável melhorar mais a produção de fermentação a fim de industrialmente produzir-se L-glutamina em um baixo custo.

Além disso, a fermentação de L-glutamina também sofre do problema de produção-secundária de ácido L-glutâmico. Um método para resolver este problema é proposto, por exemplo, na Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público (Kokai) No. 3-232497. Embora a produção do ácido L-glutâmico possa ser suprimida a uma certa extensão por este método, há ainda produção secundária de Ácido L-glutâmico e a produção de L-glutamina é insuficiente.

Uma vez que tais melhoramentos de bactérias produzindo L-glutamina, como mencionado acima, utiliza métodos de tratar uma bactéria hospedeira com um agente mutagenizante ou similar e selecionar uma cepa apresentando produtividade melhorada para L-glutamina de bactérias aleatoriamente incorporadas com as mutações, eles requerem muito mão-de-obra e ressentem-se de dificuldades.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é encontrar características de bactérias corineformes, provendo melhoramento de produtividade de L-glutamina e supressão de produção secundária de ácido L-glutâmico e, desse modo, prover um método para produzir L-glutamina utilizando uma cepa tendo tais características.

Os inventores da presente invenção estudaram assiduamente, a fim de alcançar o objetivo supracitado. Como resultado, eles constataram que uma cepa de bactéria corineforme, cuja atividade de glutamina sintetase intracelular foi aumentada, apresentou capacidade de produzir L-glutamina mais excelente e pôde notavelmente suprimir a produção secundária do ácido L-glutâmico, em comparação com as cepas apresentando a atividade de glutamina sintetase comparável àquela das cepas selvagens. Além disso, eles verificaram que a taxa de produção de L-glutamina foi melhorada aumentando-se simultaneamente a atividade de glutamina sintetase e atividade glutamato desidrogenase. Além disso, eles sucessivamente isolaram um novo gene codificando para a glutamina sintetase e um novo gene codificando para a glutamina sintetase adenilila transferase e, assim, realizaram a presente invenção.

Isto é, a presente invenção provê o seguinte: (1) uma bactéria corineforme que tem capacidade de produzir L-glutamina e foi modificada para que sua atividade de glutamina sintetase intracelular fosse aumentada. (2) A bactéria de acordo com (1), em que a atividade de glutamina sintetase é aumentada aumentando-se o grau de expressão de um gene da sintetase de glutamina. (3) A bactéria de acordo com (2), em que o grau de expressão do gene da sintetase de glutamina é aumentado aumentando-se o número de cópias de um gene codificando para a glutamina sintetase ou modificando uma seqüência de controle de expressão do gene, para que a expressão do gene codificando para a glutamina sintetase intracelular da bactéria fosse aumentada. (4) A bactéria de acordo com (1), em que a atividade de glutamina sintetase é aumentada pela deficiência no controle de atividade da glutamina sintetase intracelular por adenilação. (5) Bactéria de acordo com (4), em que o controle da atividade da glutamina sintetase intracelular por adenilação é deficiente por um ou mais de glutamina sintetase abrigante, cuja atividade de controle por adenilação é deficiente, diminuição da atividades de glutamina sintetase e de adenilila transferase na célula bacteriana e diminuição de atividade da proteína PII na célula bacteriana. (6) Bactéria de acordo com qualquer uma de (1) a (5), em que a bactéria tem sido mais modificada para que sua atividade de glutamato desidrogenase intracelular seja aumentada. (7) Bactéria de acordo com (6), em que a atividade de desidrogenase glutamato é aumentada aumentando-se o grau de expressão de um gene de glutamato desidrogenase. (8) Bactéria de acordo com (7), em que o grau de expressão do gene da glutamato desidrogenase é aumentada aumentando-se o número de cópias do gene codificando para a glutamato desidrogenase ou modificando-se uma expressão de seqüência de controle do gene, para que a expressão do gene codificando para a glutamato desidrogenase intracelular da bactéria seja aumentada. (9) Método para produzir L-glutamina, que compreende cultivar uma bactéria de acordo com qualquer um de (1) a (8) em um meio para produzir e acumular L-glutamina no meio e coletar a L-glutamina. (10) Um DNA codificando para uma proteína definida no seguinte (A) ou (B): (A) uma proteína que tenha a seqüência amino ácida da SEQ IDNO:2, (B) uma proteína que tenha a seqüência amino ácida da SEQ ID NO: 2, incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou de diversos resíduos amino ácidos e tenha atividade de glutamina sintetase. (11) O DNA de acordo com (10), que é um DNA definido nos seguintes (a) ou (b): (a) um DNA contendo a seqüência de nucleotídeo dos números de nucleotídeo 659-1996 da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, (b) um DNA que seja hibridizável com a seqüência de nucleotídeo dos números de nucleotídeo 659 - 1996 da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 ou uma sonda que possa ser preparada da seqüência sob as rigorosas condições e códigos para uma proteína tendo atividade de glutamina sintetase. (12) Um DNA codificando para uma proteína definida nos seguintes (C) ou (D): (C) uma proteína que tenha a seqüência amino ácida da SEQ IDNO: 3. (D) uma proteína que tenha a seqüência amino ácida da SEQ ID NO: 3 incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou de diversos resíduos amino ácidos e que tenha atividades de glutamina sintetase adenilila transferase. (13) O DNA de acordo com (12), que é um DNA definido nos seguintes (c) ou (d): (c) um DNA contendo a sequência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 2006-5200 da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1, (d) um DNA que é hibridizável com a seqüência de nucleotídeo dos nucleotídeos números 2006-5200 da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 1 ou uma sonda que possa ser preparada da seqüência sob as rigorosas condições e códigos para uma proteína tendo atividades glutamina sintetase adenilila transferase.

De acordo com a presente invenção, a produção secundária do ácido L-glutâmico pode ser suprimida e a eficiência da L-glutamina pode ser melhorada na produção de L-glutamina por fermentação, utilizando-se bactérias corineformes. Além disso, o DNA da presente invenção pode ser usado para procriação de bactérias corineformes produzindo L-glutamina. VERSÕES PREFERIDAS DA INVENÇÃO A seguir a presente invenção será explicada em detalhes. (1) Bactérias corineformes da presente invenção Na presente invenção, “bactérias corineformes” incluem aquelas tendo até agora sido classificadas dentro do gênero Brevibacteríum, porém unidas dentro do gênero Corynebacterium no momento (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) e incluem bactérias pertencentes ao gênero Brevibacteríum intimamente relativo ao gênero Corynebacterium. Exemplos de tais bactérias corineformes são mencionados abaixo: Corynebacterium acetoacidophilum Corynebacterium acetoglutamicum Corynebacterium alcanolyticum Corynebacterium callunae Corynebacterium glutamicum Corynebacterium lilium Corynebacterium melassecola Corynebacterium termoaminogenes Corynebacterium herculis Brevibacterium divaricatum Brevibacteriumflavum Brevibacterium immariophilum Brevibacterium lactofermentum Brevibacterium roseum Brevibacterium saccharolyticum Brevibacterium thiogenitalis Brevibacterium ammoniagenes Brevibacterium album Brevibacterium cerium Microbacterium ammoniaphilum Especificamente, as seguintes cepas podem ser exemplificadas.

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806 Corynebacterium alcanolyticum ATCC 21511 Corynebacterium callunae ATCC 15991 Corynebacterium glutamicum ATCC 13020,13032,13060 Corynebacterium lilium ATCC 15990 Corynebacterium melassecola ATCC 17965 Corynebacterium termoaminogenes AJ12340 (FERM-BP- 1539) Corynebacterium herculis ATCC 13868 Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 Brevibacteriumflavum ATCC 13826, ATCC 14067, AJ 12418 (FERM BP-2205) Brevibacterium immariophilum ATCC 14068 Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Brevibacterium roseum TCC 13825 Brevibacterium saccharolyticum ATCC 14066 Brevibacterium thiogenitalis ATCC 19240 Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871, ATCC 6872 Brevibacterium album ATCC 15111 Brevibacterium cerium ATCC 15112 Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354 Para obterem-se estas cepas, pode-se provê-las, por exemplo, da American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, Estados Unidos da América). Isto é, cada cepa é recebe seu número de registro e pode-se solicitar provisão de cada cepa utilizando-se seu número de registro. Os números de registro correspondentes às cepas são indicados no catálogo da American Type Culture Collection. Além disso, a cepa AJ12340 foi depositada em 27 de outubro de 1987 no National Institute of Bioscience and Human Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patente Organismo Depositary (Chuo Daí-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566)) como um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste, e recebeu um número de acesso de FERM BP-1539. A cepa AJ12418 foi depositada em 5 de janeiro de 1989 no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry como um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste e recebeu um número de acesso de FERM BP-2205.

Na presente invenção, “capacidade de produzir L-glutamina” significa uma capacidade de acumular L-glutamina em um meio, quando a bactéria corineforme da presente invenção é cultivada no meio. Esta capacidade de produzir L-glutamina pode ser possuída pela bactéria como uma propriedade de uma cepa selvagem de bactérias corineformes ou pode ser dada ou aumentada por procriação.

Para dar ou aumentar a capacidade de produção de L-glutamina por procriação, pode ser usado o método de isolar a cepa resistente a 6-diazo-5-oxo-norleucina (Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 3-232497), o método de isolar cepa resistente a análogo de purina e/ou cepa resistente a sulfóxido de metionina (Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 61-202694), o método de isolar cepa resistente a ácido α-cetomalônico (Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495), o método de conceder resistência a um ácido glutâmico contendo peptídeo (Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-186994) etc. Como exemplos específicos de bactérias corineformes tendo capacidade de produzir L-glutamina, as seguintes cepas podem ser mencionadas.

Brevibacterium flavum AJ11573 (FERM P-5492, refere-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495) Brevibacterium flavum AJ12210 (FERM P-8123, refere-se a Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 61-202694) Brevibacterium flavum AJ12212 (FERM P-8123, refere-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 61-202694) Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP2205, refere-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-186994) Brevibacterium flavum DH18 (FERM P-11116, refere-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 3-232497) Corynebacterium mellassecola DH344 (FERM P-11117, refere-se a Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 3-232497) Corynébacterium glutamicum AJ11574 (FERM P-5493, refere-se à Patente Japonesa Aberta ao Público No. 56-151495). A expressão “modificado para que a glutamina sintetase intracelular (a seguir também referida como “GS”) seja aumentada” significa que a atividade “GS” por célula tomou-se mais elevada do que a de uma cepa não-modificada, por exemplo, uma bactéria corineforme tipo selvagem. Por exemplo, pode ser mencionado um caso em que o número de moléculas GS por célula aumenta, um caso em que a atividade específica de GS por molécula de GS aumenta etc. Além disso, como uma bactéria corineforme tipo selvagem que serve como um objeto de comparação, por exemplo, a Brevibacterium flavum ATCC 14067 pode ser mencionada. Como resultado do aumento da atividade GS intracelular, são obtidos um efeito em que a quantidade de acúmulo de L-glutamina em um meio aumenta, um efeito em que a produção secundária de ácido glutâmico-L diminui etc. O aumento da atividade GS em uma célula de bactéria corineforme pode ser obtido pelo aumento da expressão de um gene codificando para GS. O aumento do grau de expressão do gene pode ser obtido aumentando-se o número de cópias do gene codificando para GS. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado ligando-se um fragmento de gene codificando para GS com um vetor funcionando na bactéria, preferivelmente um vetor tipo multi-cópias, e introduzido dentro de um hospedeiro tendo capacidade de produzir L-glutamina para transformá-la. Altemativamente, o DNA recombinante supracitado pode ser introduzido dentro de uma bactéria corineforme tipo selvagem para obter-se um transformante e, em seguida, pode ser dado ao transformante a capacidade de produzir L-glutamina.

Quando o gene GS, quaisquer dos genes derivados de bactérias corineformes e genes derivados de outros organismos tais como bactérias pertencentes ao gênero Escherichia podem ser usados. Entre estes, os genes derivados das bactérias corineformes são preferidos, em vista da facilidade de expressão.

Quando o gene codificando para GS de bactérias corineformes, o glnA já foi elucidado (FEMS Microbiology Letters, 81-88, 154,1997). Portanto, um gene GS pode ser obtido por PCR (reação de cadeia de polimerase; reportar-se a White, T. J. e outros, Trends Genet., 5, 185 (1989)), utilizando-se iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeo do gene, por exemplo, os iniciadores mencionados na Seqüência de Listagem como SEQ ID NOS: 4 e 5, e DNA cromossomal de bactéria corineforme como um padrão. Os genes codificando para GS de outros microorganismos podem ser obtidos de uma maneira similar. O DNA cromossomal pode ser preparado de uma bactéria que é um doador de DNA pelo método de Saito e Miura (reporte-se a H. Saito e K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments, editado pela Society for Bioscience and Bioengineering, Japão, págs. 97-98, Baifukan, 1992), por exemplo.

Incidentalmente, uma isozima com ffeqüência existe para uma enzima envolvida em um sistema de biossíntese de amino ácido. Os inventores da presente invenção isolaram e clonaram com sucesso um gene codificando para uma isozima de GS de bactéria corineforme, pela utilização de homologia com respeito à seqüência de nucleotídeo do gene glnA supracitado. Este gene é referido como “glnAT\ O processo para obtê-lo será descrito mais tarde. O glnAl bem como um glnA pode ser usado para aumento da atividade GS das bactérias corineformes.

Se o gene GS amplificado pelo método PCR for ligado a um DNA vetor autonomamente replicável em uma célula de Escherichia coli e/ou bactérias corineformes para preparar um DNA recombinante e este for introduzido dentro de Escherichia coli, os procedimentos subseqüentes tomam-se fáceis. Exemplos do vetor autonomamente replicável de Escherichia coli incluem pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pBR322, pACYC184, pMW219 etc.

Um vetor que funciona em bactérias corineformes significa, por exemplo, um plasmídeo que pode autonomamente replicar em bactérias corineformes. Seus exemplos específicos incluem os seguintes. pAM330 (refere-se a Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 58-67699) pHM1519 (refere-se a Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 58-77895) Além disso, se um fragmento de DNA, tendo uma capacidade de produzir um plasmídeo autonomamente replicável em bactérias corineformes, é for retirado destes vetores e inserido dentro dos vetores supracitados para Escherichia coli, eles podem ser usados como um vetor de transporte, autonomamente replicável tanto em Escherichia coli como em bactérias corineformes.

Exemplos de tal vetor de transporte incluem aqueles mencionados abaixo. São também indicados microorganismos que abrigam cada vetor, e seus números de acesso nos depositários internacionais são mostrados em parênteses, respectivamente. pAJ655 Escherichia coli AJ11882 (FERM BP-136) Corynebacterium glutamicum SR8201 (ATCC 39135) pAJ1844 Escherichia coli AJ11883 (FERM BP-137) Corynebacterium glutamicum SR8202 (ATCC 19136) pAJ611 Escherichia coli AJ11884 (FERM BP-138) pAJ3148 Corynebacterium glutamicum SR8203 (ATCC 39137) pAJ440 Bacillus subtilis AJ11901 (FERM BP-140) pHC4 Escherichia coli AJ 12617 (FERM BP3532) Estes vetores podem ser obtidos dos microorganismos depositados como segue. Isto é, as células microbianas coletadas em sua fase de crescimento exponencial são lisadas utilizando-se lisozima e SDS e centrifugadas a 30000 x g. O sobrenadante obtido do lisado é adicionado com polietileno glicol, fracionado e purificado por centrifugação de gradiente de densidade de equilíbrio de cloreto de brometo de cloreto de etídio. A fim de preparar-se um DNA recombinante ligando-se um gene GS e um vetor que possa funcionar em uma célula de bactéria corineforme, um vetor é digerido com uma enzima de restrição correspondendo ao término do gene contendo o gene GS. A ligação é usualmente realizada utilizando-se uma ligase, tal como uma ligase de DNA T4.

Para introduzir-se o DNA recombinante preparado como descrito acima em um microorganismo, quaisquer métodos de transformação conhecidos, que foram até agora informado, pode ser empregado. Por exemplo, são empregáveis um método de tratar células recipientes com cloreto de cálcio para aumentar a permeabilidade do DNA, que foi informado para Escherichia coli K-12 (Mandei, M. e Higa, A., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970)) e um método de preparar células competentes de células que estão na fase de crescimento, seguido pela introdução do DNA dentro delas, que foi informado para Bacillus subtilis (Duncan, C. H., Wilson, G.A. e Young, F.E., Gene, 1, 153 (1977)). Além destes, também empregável é um método de produzir células recipientes-DNA dentro de protoplastos ou esferoplastos, que podem facilmente absorver o DNA recombinante, seguido pela introdução do DNA recombinante dentro das células, o que é sabido ser aplicável a Bacillus subtilis, actinomicetos e leveduras (Chang, S. e Choen, S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, M.J., Ward, J.M. e Hopwood, O.A. Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, J.B. e Fink, G.R., Proc. Natl. Sei. USA, 75, 1929 (1978)). A transformação de bactérias corineformes pode também ser realizada pelo método de pulso elétrico (Sugimoto e outros, Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-207791. O aumento de número de cópias do gene GS pode também ser conseguido introduzindo-se múltiplas cópias do gene GS dentro do DNA cromossomal das bactérias corineformes. A fim de introduzirem-se múltiplas cópias do gene GS dentro do DNA cromossomal das bactérias corineformes, a recombinação homóloga é realizada utilizando-se uma seqüência cujas múltiplas cópias existem no DNA cromossomal como alvos. Como as seqüências cujas múltiplas cópias existem no DNA cromossomal, DNA repetitivo, repetições invertidas existentes no final de um elemento transponível podem ser usadas. Também, como descrito na Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-109985, é possível incorporar-se o gene GS dentro do transposon e permitir que ele seja transferido para introduzir múltiplas cópias do gene dentro do DNA cromossomal. O aumento da atividade GS pode também ser obtida, além de ser baseada na amplificação do gene supracitado, substituindo-se uma seqüência de controle de expressão do gene GS do DNA cromossomal ou plasmídeo, tal como um promotor, por uma mais forte. Por exemplo, o promotor lac, promotor trp, promotor trc etc. são conhecidos como fortes promotores. Além disso, é também possível introduzir-se substituição de nucleotídeo para diversos nucleotídeos dentro de uma região promotora para o gene GS, de modo que seja modificada dentro de uma mais forte, como descrito na Publicação de Patente Internacional WOOO/18935. Por tal substituição ou modificação de promotor, a expressão do gene GS é aumentada e, assim, a atividade GS é aumentada. Tal modificação da seqüência de controle de expressão pode ser combinada com o aumento do número de cópias do gene GS. A substituição da seqüência de controle de expressão pode ser realizada, por exemplo, da mesma maneira que a substituição genética, usando-se um plasmídeo sensível à temperatura descrito mais tarde.

Exemplos do plasmídeo sensível à temperatura de bactérias corineformes incluem p48K, pSFKT2 (refere-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-262288 para ambas), pHSC4 (refere-se à Publicação de Patente Francesa Aberta ao Público No. 2667875, 1992 e Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 5-7491) etc. Estes plasmídeos podem pelo menos autonomamente replicar em uma temperatura de 25 °C, porém não podem autonomamente replicar em uma temperatura de 37 °C em bactérias corineformes. Embora pSFKT2 tenha sido usado para a substituição da seqüência promotora do gene GDH do exemplo mencionado anteriormente, a substituição genética pode ser realizada de uma maneira similar utilizando-se pHSC4 em vez de pSFKT2. Escherichia coli AJ12571 abrigando pHSC4 foi depositado em 11 de outubro, 1990 no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patente Organism Depositary (Chuo Daí-6, 11-Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, código postal: 305-8566)) e recebeu um número de acesso FERM P-11763. Em seguida, foi transferido para um depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste de 26 de agosto de 1991, e recebeu um número de acesso de FERM BP-3524. O aumento da atividade GS pode ser conseguida também pela deficiência na regulação pela adenililação da GS intracelular, além de baseado no aumento do grau de expressão do gene GS descrito acima. As mudanças GS em uma forma inativa por adenililação de um resíduo de tirosina da seqüência amino ácida (Proc. Nat. Acad. Sei. USA, 642-649 (58) 1967; J. Biol. Chem., 3769-3771 (243) 1968). Portanto, defeito desta adenililação de GS, a atividade GS intracelular pode ser aumentada. O defeito da adenililação usada aqui significa não somente derregulação substancialmente completo da adenililação, mas também tal redução da adenililação para que a atividade GS intracelular fosse aumentada. A adenililação de GS é geralmente realizada por adenilil transferase (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1703-1710 (58) 196). Foi sugerido que, nas bactérias corineformes, o 405° resíduo de tirosina do produto de gene glnA, que é representado pela seqüência do acesso Y13221 do Genebank, seja adenililado (FEMS Microbiology Letters, 303 - 310, 1999 (173)). Esta inativação pela adenililação de GS pode ser cancelada introduzindo-se uma mutação dentro do gene glnA, de modo que o resíduo de tirosina devesse ser substituído por outro resíduo amino ácido.

Além disso, a inativação de GS pela adenililação pode também ser defeituosa reduzindo-se as atividades da glutamina sintetase intracelular adenilil transferase (ATase). Embora a adenilil transferase das bactérias corineformes fosse desconhecida, os inventores da presente invenção isolaram com sucesso um gene codificando para a adenilil transferase de bactérias corineformes, glnE. O processo para isto será descrito mais tarde.

Para reduzir a atividade de ATase intracelular das bactérias corineformes, pode ser usado, por exemplo, um método de tratar as bactérias corineformes por irradiação ultravioleta ou com um agente mutagenizante, usado para tratamento de mutagênese usual, tal como N-metil-N*-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou um ácido nitroso e selecionar uma cepa mutante em que a atividade ATase seja reduzida. As bactérias corineformes, tendo reduzida atividade de ATase, podem também ser obtidas por rompimento de gene, além do tratamento de mutagênese. Isto é, a bactéria corineforme pode ser transformada com um DNA contendo um gene glnE modificado com deleção de seqüência parcial do gene codificando para ATase, de modo a não produzir ATase funcionamento normalmente (deleção tipo gene glnE), a fim de que a recombinação entre o gene glnE tipo de deleção e o gene glnE do cromossoma ocorresse para romper o gene glnE do cromossoma. Tal desrrupção de gene pela substituição de gene utilizando recombinação homóloga já foi estabelecida e há métodos utilizando um DNA linear, um plasmídeo que contém uma origem de replicação sensível a temperatura etc.

Um gene glnE do cromossoma hospedeiro pode ser substituído pelo gene glnE tipo deleção, por exemplo, como segue. Isto é, um DNA recombinante é preparado inserindo-se uma origem de replicação sensível a temperatura, um gene glnE mutante e um gene marcador para resistência a uma droga, tal como cloranfenicol, e uma bactéria corineforme é transformada com o DNA recombinante. Além disso, o transformante é cultivado em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura não funciona e, em seguida, a cepa transformante pode ser cultivada em um meio contendo a droga, para obter-se uma cepa transformante em que o DNA recombinante é incorporado dentro do DNA cromossomal.

Em tal cepa em que o DNA recombinante é incorporado dentro do DNA cromossomal como descrito acima, o gene glnE mutante é recombinado com o gene glnE originalmente presente no cromossoma e os dois genes de fusão do gene glnE cromossomal e o gene glnE tipo deleção são inseridos dentro do cromossoma, a fim de que as outras partes do DNA recombinante (segmento vetor, origem de replicação sensível à temperatura e marcador de resistência a drogas) estivesse presente entre os dois genes de fusão. Portanto, a cepa transformante expressa ATase normal, porque o gene glnE normal é dominante neste estado.

Em seguida, a fim de deixar somente gene glnE tipo de deleção no DNA cromossomal, uma cópia do gene glnE é eliminada junto com o segmento vetor (incluindo a origem de replicação sensível a temperatura e o marcador de resistência a droga) do DNA cromossomal por recombinação de dois dos genes glnE. Neste caso, o gene glnE normal é deixado no DNA cromossomal e o gene glnE tipo deleção é extirpado do DNA cromossomal ou, ao contrário, o gene glnE tipo deleção é deixado no DNA cromossomal e o gene glnE normal é extirpado do DNA cromossomal. Em ambos os casos, o DNA extirpado pode ser retido na célula como um plasmídeo, quando a célula é cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura pode funcionar. Subseqüentemente, se a célula for cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura não pode funcionar, o gene glnE do plasmídeo é eliminado junto com o plasmídeo da célula. Em seguida, uma cepa em que o gene glnE é rompido pode ser obtida selecionando-se uma cepa em que o gene glnE tipo deleção é deixado no cromossoma usando-se PCR, hibridização Southern ou similar.

Além disso, a inativação da GS pela adenililação pode também ser deficiente reduzindo-se a atividade intracelular da proteína PII. Sabe-se que a proteína PII está também envolvida na adenililação da GS pela ATase. A proteína PII é uma proteína de transferência de sinal para controlar a atividade GS e é conhecida ser uridililada pela uridilila transferase (UTase). A proteína PII uridililada promove a desadenililação da GS pela ATase e a proteína PII desuridililada promove a adenililação de GS por ATase.

Informa-se que a GS é altamente adenililada em uma cepa deficiente de UTase (J. Bacteriology, 569-577 (134) 1978). Este fenótipo de adenililação excessiva é suprimido por mutação da proteína PII (J. Bacteriology, 816-822 (164) 1985). Isto é, a inativação da GS pela adenililação pode também ser deficiente por redução da atividade da proteína PII. A redução da atividade da proteína PII significa redução da função para promover a adenililação por ATase. O gene glnB codificando para a proteína PII das bactérias corineformes já foi isolado e sugere-se que a supressão de GS pela adenililação de GS seja deficiente por deleção do gene (FEMS Microbiology Letters, 303-310 (173) 1999).

Para reduzir-se a atividade da proteína ΡΠ de bactérias corineformes, pode ser usado, por exemplo, um método de tratar as bactérias corineformes por irradiação ultravioleta ou com um agente mutagenizante usado para tratamento usual de mutagênese, tal como N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) ou um ácido nitroso e selecionando-se uma cepa mutante em que a atividade da proteína PII seja reduzida. As bactérias corineformes tendo reduzida atividade de proteína PII podem também ser obtidas por rompimento de gene, além do tratamento de mutagênese. Isto é, uma bactéria corineforme pode ser transformada com DNA contendo um gene glnB modificado com deleção de seqüência parcial do gene codificando para a proteína PII, a fim de não produzir proteína PII funcionando normalmente (gene glnB tipo deleção), de modo que a recombinação entre o gene glnB tipo deleção e o gene glnB do cromossoma ocorra para romper o gene glnB do cromossoma. Tal destruição de gene pela utilização de recombinação homóloga já foi estabelecida e há métodos utilizando um DNA linear, um plasmídeo que contém uma origem de replicação sensível a temperatura etc.

Um gene glnB de cromossoma hospedeiro pode ser substituído pelo gene glnE tipo deleção, por exemplo, como segue. Isto é, um DNA recombinante é preparado inserindo-se um origem de replicação sensível a temperatura, um gene glnB mutante e um gene marcador para resistência a uma droga tal como cloranfenicol, e uma bactéria corineforme é transformada com o DNA recombinante. Além disso, a cepa transformante resultante é cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura não funciona e, em seguida, a cepa transformante pode ser cultivada em um meio contendo a droga para obter uma cepa transformante em que o DNA recombinante é incorporado dentro do DNA cromossomal.

Em tal cepa em que o DNA recombinante é incorporado dentro do DNA cromossomal como descrito acima, o gene glnB mutante é recombinado com o gene glnB originalmente presente no cromossoma e os dois genes de fusão do gene glnB cromossomal e o gene glnE tipo deleção são inseridos dentro do cromossoma, de modo que as outras partes do DNA recombinante (segmento vetor, origem de replicação sensível a temperatura e marcador de resistência a droga) estejam presentes entre os dois genes de fusão. Portanto, o transformante expressa proteína PII normal, porque o gene glnB normal é dominante neste estado.

Em seguida, a fim de deixar somente o gene glnE tipo deleção no DNA cromossomal, uma cópia do gene glnB é eliminada junto com o segmento vetor (incluindo a origem de replicação sensível a temperatura e o marcador de resistência a droga) do DNA cromossomal, por recombinação de dois dos genes glnB. Neste caso, o gene glnB normal é deixado no DNA cromossomal e o gene glnE tipo deleção é extirpado do DNA cromossomal ou, ao contrário, o gene glnE tipo deleção é deixado no DNA cromossomal e o gene glnB normal é extirpado do DNA cromossomal. Em ambos os casos, o DNA extirpado pode ser estavelmente retido na célula como um plasmídeo, quando a célula é cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura pode funcionar. Subseqüentemente, se a célula for cultivada em uma temperatura em que a origem de replicação sensível a temperatura não funcione, o gene glnB do plasmídeo é eliminado junto com o plasmídeo da célula. Em seguida, uma cepa em que o gene glnB é rompido pode ser obtida selecionando-se uma cepa em que o gene glnE tipo deleção é deixado no cromossoma usando-se PCR, hibridização Southern ou similar. A eliminação da adenililação da GS pode também ser obtida por uma combinação de dois ou três itens de tal mutação de GS que deve eliminar a adenililação supracitada, redução da atividade de ATase e redução da atividade de proteína PII.

Embora o aumento da atividade GS possa também ser realizada por eliminação da adenililação de GS por ATase, ela também pode ser obtida por uma combinação dela com os meios supracitados, para aumentar o número de cópias do gene da GS ou meios para modificar uma seqüência de controle de expressão. A fim de eficientemente produzir-se L-glutamina utilizando-se a bactéria corineforme da presente invenção, é preferível utilizar-se uma cepa que tenha aumentada atividade de glutamato desidrogenase (a seguir também referida como “GDH”) concomitantemente com a atividade GS aumentada. O termo “modificado de modo que a atividade GDH intracelular seja aumentada” significa que a atividade GDH por célula tomou-se mais alta do que a de uma cepa não modificada, por exemplo, uma bactéria corineforme tipo selvagem. Por exemplo, pode ser mencionado um caso em que o número de moléculas GDH por célula aumenta, um caso em que a atividade específica de número por molécula de GDH aumenta etc. Além disso, como uma bactéria corineforme tipo selvagem, que serve como um objeto para comparação, por exemplo, pode ser mencionada Brevibacterium flavum ATCC 14067. Como resultado do aumento da atividade GDH intracelular, é obtido um efeito a em que o tempo de cultura de uma bactéria corineforme, tendo capacidade de produzir L-glutamina, é encurtado. O aumento da atividade GDH em uma célula de bactéria corineforme pode ser obtido por aumento da expressão de um gene codificando para GDH. O aumento do grau de expressão do gene pode ser obtido aumentando-se o número de cópias do gene codificando para GDH. Por exemplo, um DNA recombinante pode ser preparado ligando-se um fragmento de gene codificando para GDH com um vetor funcionando na bactéria, preferivelmente um vetor tipo multi-cópias, e introduzido dentro de um hospedeiro tendo capacidade de produzir L-glutamina para transformá-lo.

Altemativamente, o DNA recombinante supracitado pode ser introduzido dentro de uma bactéria corineforme tipo selvagem, para obter-se uma cepa transformante e, em seguida a cepa transformante obtida pode receber capacidade de produção de L-glutamina.

Como o gene codificante para GDH, qualquer um dos genes derivados de bactérias corineformes e genes derivados de outros organismos tais como bactérias pertencentes ao gênero Escherichia pode ser usado. Entre estes, genes derivados de bactérias corineformes são preferidos em vista da facilidade de expressão. A seqüência de nucleotídeo de um gene codificando para GDH (gene gdh) de bactérias corineformes já foi elucidada (Molecular Microbiology, 6 (3), 317-326 (1992)). Portanto, um gene GDH pode ser obtido por PCR, utilizando-se iniciadores preparados com base na seqüência de nucleotídeo, por exemplo, os iniciadores mencionados na Listagem de Seqüência como as SEQ ID NOS: 12 e 13, e DNA cromossomal de bactéria corineforme, como um padrão. Genes codificando para GDH de microorganismos que não bactérias corineformes, podem também ser obtidos de uma maneira similar. O gene gdh pode ser introduzido dentro das bactérias corineformes de uma maneira similar à usada para o gene GS supracitado.

Na bactéria corineforme da presente invenção, as atividades de enzimas, que não as reações de catalisação de GS e GDH da biossíntese de L-glutamina, podem ser aumentadas. Exemplos das enzimas catalisando reações da biossíntese da L-glutamina incluem isocitrato desidrogenase, aconitato hidratase, citrato sintase, piruvato desidrogenase, fosoenolpiruvato carboxilase, piruvato carboxilase, piruvato cinase, fosfofrutocinase etc.

Além disso, as atividades das enzimas que catalisam reações ramificando-se do trajeto de biossíntese de L-glutamina e produzindo compostos que não L-glutamina podem ser reduzidas ou eliminadas.

Exemplos das enzimas catalisando tais reações incluem isocitrato liase, a-cetoglutarato desidrogenase, glutamato sintase etc. (2) Produção de L-glutamina empregando microorganismo da presente invenção Cultivando-se uma bactéria corineforme obtida como descrito acima, em um meio para produzir e acumular L-glutamina no meio e corrigindo-se a L-glutamina do meio, a L-glutamina pode ser eficientemente produzida e a produção secundária do ácido glutâmico-L pode ser suprimida. A fim de produzir-se L-glutamina utilizando-se a bactéria corineforme da presente invenção, a cultura pode ser realizada de uma maneira convencional, usando-se um meio usual contendo uma fonte de carbono, fonte de nitrogênio e sais minerais, bem como nutrientes de traços orgânicos, tais como amino ácidos e vitaminas, como necessário. Um meio sintético ou um meio natural pode ser usado. Quaisquer espécies de fonte de carbono e fonte de nitrogênio podem ser usadas, contanto que elas possam ser utilizadas por uma cepa a ser cultivada.

Como fonte de carbono, são usados açúcares tais como glicose, glicerol, frutose, sacarose, maltose, manose, galactose, hidrolisado de amido e melaços, e ácidos orgânicos tais como ácido acético e ácido cítrico, e álcoois tais como etanol podem ser usados cada um sozinho ou em uma combinação com outras fontes de carbono.

Como fonte de nitrogênio, são usados amônia, sais de amônio tais como sulfato de amônio, carbonato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio e acetato de amônio, sais de nitrato etc.

Como nutrientes traço orgânicos, são usados amino ácidos, vitaminas, ácidos graxos, ácidos nucleicos, aqueles contendo aquelas substâncias tais como peptona, ácido casamino, extrato de levedura e produto de decomposição de proteína de soja etc. Quando um mutante auxotrófico que requer um amino ácido ou similar para seu crescimento é usado, prefere- se suplementar o nutriente requerido.

Como sais minerais, são usados fosfatos, sais de magnésio, sais de cálcio, sais de ferro, sais de manganês etc. A cultura é realizada como cultura de aeração, enquanto a temperatura de fermentação é controlada para ser 20 - 45 °C, e o pH para ser 5-9. Quando o pH cai durante a cultura, o meio é neutralizado pela adição de carbonato de cálcio ou com um álcali tal como gás de amônia. Uma quantidade substancial de L-glutamina é acumulada na calda de cultura após 10 h a 120 h de cultura, de uma tal maneira como descrita acima. A coleta de L-glutamina da calda de cultura após a cultura pode ser realizada de uma maneira convencional. Por exemplo, após as células terem sido removidas da calda de cultura, L-glutamina pode ser coletada concentrando-se a calda para cristalizar L-glutamina. (3) DNA codificando para proteína tendo atividade de glutamina sintetase (gene glnA2) e DNA codificando para proteína tendo atividades de glutamina sintetase e adenilil transferase (gene glnE) de acordo com a presente invenção. O primeiro DNA da presente invenção é um gene codificando para GS. O segundo DNA da presente invenção é um gene codificando para ATase. Estes genes podem ser obtidos de uma biblioteca de DNA cromossomal de Brevibacterium lactofermentum por hibridização, usando-se um fragmento parcial de um gene glnA como uma sonda. O fragmento parcial de um gene glnA conhecido pode ser obtido por amplificação PCR, usando-se DNA cromossomal de Brevibacterium lactofermentum, por exemplo, cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, como um padrão, e os inciadores mostrados como SEQID NOS: 18 e 19. Métodos de produção de biblioteca de DNA genômico, hibridização, PCR, preparação de DNA de plasmídeo, digestão e ligação de DNA, transformação etc. para obtenção do DNA da presente invenção e aumento da atividade GS e atividade GDH, são descritos em Sambrook, J., Fritsh, E.F. e Maniatis, T., “Molecular Cloning”, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1.21,1989.

As seqüências de nucleotídeo dos iniciadores supracitados foram projetadas com base na seqüência de nucleotídeo de um gin A de Corynebacterium glutamicum (acesso do GenBank Y13221). Utilizando-se estes iniciadores, um fragmento de DNA, contendo uma região correspondendo aos nucleotídeos números 1921 - 2282 do gene glnA (acesso do GenBank Y13221), pode ser obtido.

Exemplos de seqüência de nucleotídeo de fragmento de DNA contendo glnA2 de acordo com a invenção, que é obtida como descrito acima, e seqüência amino ácida que pode ser codificada pela seqüência, são mostradas como SEQ ID NO: 1. Além disso, somente uma seqüência de aminoácido da proteína tendo atividade glutamina sintetase, que é codificado por glnA2, é mostrado na SEQ ID NO: 2.

Além disso, no fragmento de DNA supracitado, outra ORF foi encontrada imediatamente a jusante da ORF do glnA2. Com base na comparação de homologia com respeito às seqüências conhecidas, aquela ORF foi esperada ser um gene (jglnE) codificando para uma proteína tendo atividades glutamina sintetase adenilil transferase (ATase). Somente a seqüência amino ácida da proteína tendo a atividade ATase é mostrada como SEQ ID NO: 3.

As seqüências de nucleotídeo dos fragmentos de DNA contendo glnA2 e glnE de acordo com a presente invenção, foram purificadas pela presente invenção. Portanto, as podem ser isoladas de DNA cromossomal de Brevibacterium lactofermentum pelo método PCR, usando-se iniciadores produzidos com base nas seqüências de nucleotídeo. O primeiro DNA da presente invenção pode ser um codificando para glutamina sintetase, incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou de diversos amino ácidos em um ou mais sítios, contanto que a atividade de glutamina sintetase da proteína codificada não seja defeituosa. Embora o número de “diversos” amino ácidos referidos aqui difira na estrutura tridimensional da proteína, ele pode ser especificamente 2 a 90, preferivelmente 2 a 50, mais preferivelmente 2 a 20. O segundo DNA da presente invenção pode ser um codificando para glutamina sintetase adenilil transferase, incluindo substituição, deleção, inserção, adição ou inversão de um ou de diversos amino ácidos em um ou mais sítios, contanto que as atividades da glutamina sintetase adenilil transferase da segunda proteína não sejam defeituosas. Embora o número de “diversos” amino ácidos referidos aqui difira, dependendo da posição ou tipo de resíduos amino ácidos da estrutura tridimensional da proteína, ele pode ser especificamente 2 a 350, preferivelmente 2 a 50, mais preferivelmente 2 a 20. Mesmo em um caso em que as atividades de glutamina sintetase adenilil transferase sejam prejudicadas, tal DNA situa-se dentro do escopo da presente invenção, contanto que provoque recombinação homóloga.

Um DNA codificando para substancialmente a mesma proteína que a GS ou ATase supracitadas pode ser obtido, por exemplo, modificando-se a seqüência de nucleotídeo de glnA2 ou glnE, por meio do método de mutagênese dirigida ao sítio, de modo que um ou mais resíduos amino ácidos de um sítio especificado envolva a substituição, deleção, inserção, adição ou inversão. Um DNA modificado como descrito acima pode também ser obtido por um tratamento de mutagênese convenientemente conhecido. O tratamento de mutagênese inclui um método de tratar um DNA antes de o tratamento de mutagênese in vitro com hidroxilama ou similar, e um método para tratar um microorganismo, tal como um genero Escherichia abrigando um DNA antes do tratamento de mutagênese por irradiação ultravioleta ou com um agente mutagenizante usado para um tratamento de mutagênese usual, tal como N-metil-N ’ -nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso.

Um DNA codificando para substancialmente a mesma proteína que glutamina sintetase ou sintetase glutamina adenilil transferase pode ser obtido expressando um DNA, tendo tal mutação como descrito acima, em uma apropriada célula, e investigando-se a atividade de um produto expresso. Um DNA codificando substancialmente a mesma proteína que GS ou ATase pode também ser obtido isolando-se um DNA que é hibridizável com uma sonda tendo uma sequência de nucleotídeo compreendendo, por exemplo, a seqüência de nucleotídeo correspondendo aos nucleotídeos números 659 a 1996 ou 2066 a 5200 da seqüência de nucleotídeo mostrada na Listagem de Sequências como SEQ ID NO: 1, sob as rigorosas condições e códigos para uma proteína tendo uma glutamina sintetase ou uma proteína tendo a atividade de glutamina sintetase e adenilil transferase de DNA codificando para glutamina sintetase ou glutamina sintetase adenilil transferase tendo uma mutação ou de uma célula abrigando-a. As “rigorosas condições” referidas aqui é uma condição sob a qual o chamado híbrido específico é formado e o híbrido não específico não é formado. É difícil expressar claramente esta condição pelo uso de qualquer valor numérico. Entretanto, por exemplo, as condições rigorosas são exemplificadas por uma condição sob a qual os DNAs tendo alta homologia, por exemplo, DNAs tendo homologia não menor do que 50%, são hibridizados entre si, porém os DNAs tendo homologia menor do que a acima não são hibridizados entre si. Altemativamente, as rigorosas condições são exemplificadas por uma condição sob a qual os DNAs são hibridizados entre si em uma concentração de sal correspondendo a uma condição ordinária de lavagem em hibridização Southern, isto é, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS, a 60 °C.

Como uma sonda, uma seqüência parcial da seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 pode também ser usada. Tal sonda pode ser preparada por PCR usando-se oligonucleotídeos produzidos com base na seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1 como um padrão. Quando um fragmento de DNA de um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem para a hibridização consiste de, por exemplo, 50 °C, 2 x SSC e 0,1% SDS.

Os genes que são hibridizáveis sob tais condições como descrito acima incluem aqueles tendo um códon de parada nos genes e aqueles não tendo atividade devida à mutação do centro ativo. Entretanto, tais mutações podem ser facilmente removidos ligando-se cada gene com um vetor de expressão de atividade comercialmente disponível e medindo-se a glutamina sintetase ou atividades de glutamina sintetase adenilil transferase. A atividade de glutamina sintetase pode ser medida, por exemplo, pelo método descrito em Methods in Enzimology, vol., XVIIA, 910-925, ACADEMIC PRESS (1970) e as atividades de glutamina sintetase adenilil transferase podem ser medidas, por exemplo, pelo método descrito em Methods in Enzimology, Yol. XVIIA, 922-923, ACADEMIC PRESS (1970). Mesmo um DNA codificando para glutamina sintetase adenilil transferase, cujas atividades são reduzidas ou deletadas, pode também ser usado na presente invenção.

Exemplos específicos do DNA codificando para uma proteína substancialmente a mesma que GS, incluem DNA codificando para uma proteína que tem homologia de preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 85 ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais, com respeito à seqüência amino ácida mostrada como SEQ ID NO: 2 e tem atividade GS. Exemplos específicos do DNA codificando para uma proteína substancialmente a mesma que ATase, incluem DNA codificando para uma proteína que tem homologia de preferivelmente 65% ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais, com respeito à seqüência amino ácida mostrada como SEQ ID NO: 3 e têm atividade ATase.

Melhor Modo de Realizar a Invenção A seguir, a presente invenção será explicada mais especificamente com referência aos seguintes exemplos.

Exemplo 1: Avaliação da cena amplificada por gene GS (1) Clonagem do gene glnA da bactéria corineforme A seqüência glnA da Corynebacterium glutamicum já tinha sido purificada (FEMS Microbiology Letters, 81-88 (154) 1997). Com base na seqüência de nucleotídeo informada, os iniciadores mostrados na Listagem de Seqüência como SEQ ID NOS: 4 e 5 foram sintetizados e um fragmento de glnA foi amplificado pelo método PCR usando-se DNA de cromossoma de cepa Brevibacíerium flavum ATCC 14067 como um padrão. O DNA cromossomal da cepa Brevibacíerium flavum ATCC 14067 foi preparado utilizando-se Kit de Purificação de DNA de Genoma Bacteriano (Advanced Genetic Technologies Corp.). PCR foi realizada por 30 ciclos, cada um consistindo de reações a 94 °C por 30 segundos para desnaturação, a 55 °C por 15 segundos para anelamento e 72 °C por 2 minutos para extensão, utilizando-se DNA Polimerase Pyrobest (Takara Shuzo). O produto PCR produzido foi purificado de uma maneira convencional, digerido com uma enzima de restrição SalI, ligado com pMW219 (Nippon Gene) digerido com Saíl pela utilização de um kit de ligação (Takara Shuzo) e usado para transformar células competentes de Escherichia coli JM109 (Takara Shuzo). As células foram revestidas em meio L contendo 10 pg/ml de IPTG, 40 μg/ml de X-Gal e 25 μg/ml de canamicina e cultivadas durante a noite. Em seguida as colônias brancas que apareceram foram colhidas e separadas em colônias simples para obterem-se os transformantes.

Os plasmídeos foram preparados dos transformantes pelo método alcalino e um plasmídeo em que o gene glnA foi inserido dentro do vetor foi designado como pMW219GS. (2) Construção de plasmídeo tendo glnA e origem de replicação de bactéria corineforme Ademais, a fim de construírem-se um plasmídeo tendo o gene glnA e uma origem de replicação de bactérias corineformes, o plasmídeo pHK4 (reportar-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 5-7491) contendo origem de replicação do plasmídeo pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), que tinha sido já obtida e foi autonomamente replicável em bactérias corineformes, foi digerido com as enzimas de restrição BamHl e Kpnl para obter-se um fragmento de gene contendo a origem de replicação. O fragmento obtido foi embotado nas extremidades utilizando-se Kid de Embotamento de Extremidade de DNA (Takara Shuzo) e inserido dentro do sítio Kpnl de pMW219GS, usando-se um ligador Kpnl (Takara Shuzo). Este plasmídeo foi designado como pGS. (3) Introdução de pGs dentro de bactéria corineforme e avaliação de cultura Uma bactéria produtora de L-glutamina, Brevibacterium flavum AJ12418 (FERM BP-2205: reportar-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-186994), foi transformada com o plasmídeo pGS pelo método de pulso elétrico (reportar-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-207791), para obter-se um transformante. Utilizando-se o transformante obtido AJ12418/pGS, a cultura para produção de L-glutamina foi realizada como segue. Células de cepa AJ12418/pGS, obtidas pela cultura em um meio de placa CM2B contendo 25 pg/ml de canamicina, foram inoculadas dentro de um meio contendo 100 g de glicose, 60 g de (NH^SCU, 2,5 g de KH2P04, 0,4 g de MgS04. 7H20, 0,01 g de FeS04. 7H20, 350 pg de VBr HC1, 4 pg de biotina, 200 mg de hidrolisados de soja e 50 g de CaCC>3 em 1 litro de água pura (ajustado a pH 6,8 com NaOH) e cultivados a 31,5 °C com agitação, até o açúcar do meio ter sido consumido.

Após o término da cultura, a quantidade de L-glutamina acumulada na calda de cultura foi analisada por cromatografia líquida quanto à calda de cultura apropriadamente diluída, CAPCELL PAK Cl8 (Shiseido) foi usado como uma coluna e a amostra foi eluída com um eluente contendo 0,095% de ácido fosfórico, 3,3 mM de ácido heptanossulfônico e 5% de acetonitrila em 11 de água destilada. A quantidade de L-glutamina acumulada foi analisada com base na variação de absorvência a 210 nm. Os resultados desta análise são mostrados na Tabela 1. TABELA 1 Na cepa pGS-introduzida, o acúmulo de L-glutamina (L-Gln) foi notavelmente melhorado e a produção secundária de ácido L-glutâmico (L-Glu) foi consideravelmente suprimida. Por estes resultados, demonstramos que o aumento da GS foi efetivo para melhoria do rendimento da produção de L-glutamina. Os dados para a atividade enzimática de GS são mostrados na Tabela 2 do Exemplo 2.

Exemplo 2: Avaliação de cena modificada no sítio de adenililacão GS (1) Construção de plasmídeo modificado no sítio de adenililação O sítio de adenililação do produto de gene glnA da bactéria corineforme já tinha sido purificado (FEMS Microbiology Letters, 303-310 (173) 1999). Portanto, uma cepa sítio-modificada de adenilação foi obtida substituindo-se o gene glnA no cromossoma com um glnA cujo sítio de adenililação foi modificação. Procedimentos específicos serão descritos abaixo.

Primeiro, a PCR foi realizada usando-se DNA cromossomal de cepa de Brevibacterium flavum ATCC 14067 como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados na Listagem de Seqüências como SEQ ID NOS: 6 E 7 como iniciadores para obter-se um produto de amplificação para o lado do N-terminal do gin A. Separadamente, a fim de obter-se um produto de amplificação para o lado do C-terminal do gene gin A, foi realizada PCR utilizando-se DNA cromossomal de cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados na Listagem de Seqüências como SEQ ID NOS: 8 E 9 como iniciadores. Uma vez que desigualdades foram introduzidas dentro das seqüências mostradas na Listagem de Seqüências como SEQ ID NOS: 7 e 8, uma mutação foi introduzida dentro da parte terminal de cada um dos produtos de amplificação. Em seguida, a fim de obter-se um fragmento de gene glnA introduzido com uma mutação, PCR foi realizada utilizando-se os produtos genéticos supracitados para os lados dos N e C terminais de glnA misturados em quantidades equimolares como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados na Listagem de Seqüências como SEQ ID NOS: 10 e 11 como iniciadores, para obter-se um produto de amplificação de gene glnA introduzido com uma mutação no sítio de adenililação. O produto PCR produzido foi purificado de uma maneira convencional, digerido com Hincll e inserido dentro do sítio Hincll de pHSG299 (Takara Shuzo). Este plasmídeo foi designado como pGSA. (2) Construção de cepa modificada no sítio de adenililação e avaliação da cultura Uma vez que o pGSA acima não contém uma região que possibilita sua replicação autônoma dentro das células de bactérias corineformes, quando uma bactéria corineforme é transformada com este plasmídeo, uma cepa em que o plasmídeo é incorporado dentro do cromossoma por recombinação homóloga é obtido como um transformante, embora isto ocorra em uma freqüência extremamente baixa. A bactéria produzindo L-glutamina, Brevibacterium flavum AJ12418, foi transformada com o plasmídeo pGSA em uma alta concentração pelo método de pulso elétrico (reportar-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2-207791) e os transformantes foram obtidos utilizando-se resistência a canamicina como um marcador. Em seguida, estes transformantes foram subcultivados e as cepas que se tomaram sensíveis à canamicina foram obtidas. Além disso, as seqüências do gene glnA das cepas sensíveis à canamicina foram determinadas e uma cepa, em que o sítio de adenililação da seqüência foi substituído por aquela região de glnA derivada de pGSA, foi designada como QA-1. A cultura para produção de L-glutamina foi realizada da mesma maneira descrita no Exemplo 1, (3) usando-se as cepas AJ12418, AJ12418/pGS e QA-1. Os resultados são mostrados na Tabela 2. TABELA 2 Para a cepa QA-1, a melhoria do acúmulo de L-glutamina foi observada em comparação com AJ12418.

Os resultados para a medição da atividade GS destas cepas são também mostrados na Tabela 2. A atividade GS foi medida pela adição de uma solução enzimática bruta em uma solução contendo 100 mM de imidazol-HCl (pH 7,0), 0,1 mM NH^Cl, 1 mM de MnCl2, 1 mM de ácido fosfoenolpirúvico, 0,3 mM de NADH, 10 U de lactato desidrogenase, 25 U de piruvato cinase, 1 mM de ATP e 10 mM de MSG e medindo-se a variação de absorvência a 340 nm a 30 °C, com referência ao método descrito no Journal of Fermentation and Bioengineering, Vol. 70, No. 3, 182-184, 1990. Para a medição do modelo, a solução de reação supracitada, não contendo MSG, foi usada. A solução de enzima bruta foi preparada separando-se as células da calda de cultura supracitada por centrifugação, lavando-se as células com 100 mM de imidazol-HCl (pH 7,0), sonicando-se as células e removendo-se células não rompidas e proteínas não solúveis por centrifugação. A concentração de proteína da solução de enzima bruta foi quantificada com Ensaio de Proteína (BioRad) utilizando-se albumina de soro bovino como uma amostra padrão.

Exemplo 3: Avaliação de CEPA amplificada-gene GDH (1) Construção de cepa amplificada-gí//* e avaliação da cultura A construção de um plasmídeo pGDH dentro do qual o gene gdh de bactérias corineformes foi clonado, foi realizada como segue. Primeiro, o DNA cromossomal da cepa de Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi extraído e PCR foi realizada utilizando-se o DNA cromossomal como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados na Listagem de Sequência como SEQID NOS: 12 e 13 como iniciadores. O fragmento de DNA obtido foi embotado nas extremidades e inserido dentro do sítio Smal de pHSg399 (Takara Shuzo). Este plasmídeo foi designado como pHSG399GDH.

Em seguida, uma origem de replicação, derivada do plasmídeo pHM1519 (Agric. Biol. Chem., 48, 2901-2903 (1984)), que pode replicar-se autonomamente em bactérias corineformes, foi introduzida dentro do sítio Sall de pHSG399GDH. Especificamente, o pHK4 supracitado foi digerido com enzimas de restrição BamHl e Kpril para obter-se um fragmento de gene contendo a origem de replicação e o fragmento obtido foi embotado nas extremidades e inserido dentro do sítio Saã de pHSG399GDH utilizando-se um ligador SalI (Takara Shuzo). Este plasmídeo foi designado como pGDH. A bactéria produzindo L-glutamina, cepa Brevibacterium flavum AJ12418, foi transformada com pGDH para obter-se um transformante. A cultura para a produção de L-glutamina foi realizada pelo método descrito no Exemplo 1, utilizando-se o transformante obtido AJ12418/pGDH. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Na cepa intensificada-GDH, a produção de L-glutamina diminuiu e a produção secundária do ácido L-glutâmico aumentou, porém o tempo de cultura foi consideravelmente encurtado.

Tabela 3 Exemplo 4: Construção e avaliação da cepa em que GS e GDH são intensificados simultaneamente (1) Construção de promotor modificado por plasmídeo gdh DNA cromossomal de cepa Brevibacterium flavum ATCC 14067 foi extraído e PCR foi realizada utilizando-se o DNA cromossomal como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados na Listagem de Sequência como SEQ ID NOS: 14 e 15 como iniciadores. O fragmento de DNA obtido foi digerido com enzimas de restrição Stul e PvwII e inserido dentro do sítio Smal de pHSG399. Este plasmídeo foi digerido com uma enzima de restrição .Saci para obter-se um fragmento de DNA contendo o promotor gdh e um fragmento parcial do gene gdh, e foi inserido dentro do sítio Saci de pKF19k (Takara Shuzo). Este plasmídeo foi designado como pKF19GDH.

Uma mutação foi introduzida dentro da região promotora utilizando-se Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo). LA-PCR foi realizada utilizando-se pkF19GDH como um padrão, um iniciador de seleção ligado a Mutan-super Express Km e um DNA sintético fosforilado na extremidade 5’, mostrado na Listagem de Seqüência como SEQ ID NOS: 16 ou 17, como um iniciador para mutagênese. O produto de reação foi purificado por precipitação de etanol e células competentes de Escherichia coli MV1184 (Takara Shuzo) foram transformadas com o produto para obterem-se transformantes.

Os plasmídeos foram extraídos dos transformantes e as seqüências da região promotora gdh foram determinadas. Entre estas, aquelas tendo as seqüências mostradas na Tabela 4 foram designadas como pKF19GDHl e pKF19GDH4. Espera-se que a atividade GDH possa ser melhorada em cerca de 3 vezes substituindo-se a seqüência promotora gdh por aquela do tipo pKF19GDHl, ou em cerca de 5 vezes substituindo-se a seqüência promotora de gdh por aquela do tipo pKF19GDH4, em comparação com gdh tendo um promotor de um tipo selvagem (reportar-se à Publicação de Patente Internacional WOOO/18935).

Estes plasmídeos foram digeridos com uma enzima de restrição Saci, para obter-se um fragmento de DNA contendo o promotor de gdh e um fragmento parcial do gene gdh e foi inserido dentro do sítio Saci de pSFKT2 (reportar-se à Publicação de Patente Japonesa Aberta ao Público No. 2000-262288). Estes plasmídeos foram designados como pSFKTGDHl e pSFKTGDH4, respectivamente. pSFKT2 era um derivativo do plasmídeo pAM330, derivado da cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, e é um plasmídeo cuja replicação autônoma em bactérias corineformes tomou-se sensível a temperatura.

Tabela 4 (2) Introdução da mutação de promotor de gdh dentro do cromossoma Uma mutação foi introduzida dentro da seqüência promotora de gdh do cromossoma como segue. Primeiro, a cepa QA-1 foi transformada com o plasmídeo pSFKTGDHl ou pSFKTGDH4 pelo método de pulso elétrico, para obter-se um transformante, respectivamente. Após a transformação, a cultura foi realizada a 25 °C. Em seguida, estes transformantes foram cultivados a 34 °C e as cepas apresentando resistência a canamicina a 34 °C foram selecionadas. Uma vez que os plasmídeos supracitados não podem replicar-se autonomamente a 34 °C, somente aqueles em que estes plasmídeos foram incorporados dentro do cromossoma por recombinação homóloga apresentam resistência a canamicina. Além disso, as cepas em que estes plasmídeos foram incorporados dentro do cromossoma foram cultivadas na ausência de canamicina e as cepas que se tomaram sensíveis a canamicina foram selecionadas. Entre aquelas, as cepas em que a mesma mutação que a de pSFKTGDHl ou pSFKTGDH4 foi introduzida dentro da região promotora de gdh do cromossoma foram designadas como QB-1 e QB-4, respectivamente. (3) Construção de cepa amplificada-gene gdh e medição da atividade GDH. A bactéria produzindo L-glutamina, cepa Brevibacterium flavum QA-1, foi transformada com o plasmídeo pGDH descrito no Exemplo 3, (2) para obter-se um transformante. A cultura para produção de L-glutamina foi realizada pelo método descrito no Exemplo 1, utilizando-se o transformante obtido QA-l/pGDH. A atividade GDH foi medida adicionando-se uma solução enzimática bruta a uma solução contendo 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 20 mM NH4CI, 10 mM de ácido α-cetoglutárico e 0,25 mM NADPH e medindo-se a mudança de absorvência a 340 nm com referencia a Mol. Microbiology, 317-326 (6) 1992. A solução de enzima bruta foi preparada separando-se as células da calda de cultura supracitada por centrifugação, lavando-se as células com 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), sonicando-se as células e removendo-se as células não rompidas por centrifugação. A concentração de proteína da solução de enzima bruta foi quantificada com Protein Assay (Bio-Rad) utilizando-se albumina de soro bovino como uma amostra padrão. Os resultados são mostrados na Tabela 5.

Quanto à produção de L-glutamina, as cepas modificadas-promotor GDH, QB-1 e QB-4, apresentaram alta produção. Além disso, a cepa QA-l/pGDH também apresentaram mais alta produção do que aquela obtida com a cepa AJ12418. O tempo de cultura da cepa AQ-l/pGDH foi a mais curta. A produção secundária de ácido L-glutâmico foi notavelmente melhorada nas cepas QB1 e QB-4. Por estes resultados foi demonstrado que o aumento simultâneo de GS e GDH foi eficaz para melhoria da produção de L-glutamina e encurtamento do tempo de cultura.

Tabela 5 Exemplo 5: Isolamento do gene codificando para isozima de GS

No trabalho que informou a aquisição de glnA de Corynebacterium glutamicum (FEMS Microbiol. Letter, 154 (1997) 81-88) é descrito que uma cepa -rompida transformou-se ara mostrar auxotropia de glutamina e perdeu a atividade GS e são também informados dados mostrando os resultados de Southern blot e sugerindo a existência de uma isozima. Além disso, “Amino Acid Fermentation”, Japan Science Societies Publication (Gakkai Shuppan Center), págs. 232-235 descreve que há duas espécies de GS para Corynebacterium glutamicum. Portanto, foi tentado obter-se uma codificação genética para a segunda isozima GS. (1) Preparação de Sonda Um gene codificando para uma isozima de GS (glnA2) foi obtido por hibridização de colônia. Primeiro, PCR foi realizada utilizando-se os iniciadores mostrados na Listagem de Seqüência como SEQ ID NOS: 18 e 19 e DNA cromossomal da cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 como um padrão para obter-se um fragmento parcial do gene glnA. Este fragmento de DNA foi marcado utilizando-se DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I (Boehringher Mannheim) e usado como uma sonda. (2) Hibridização de colônia DNA cromossomal da cepa Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 foi extraído e parcialmente digerido com uma enzima de restrição SauòAl, e o fragmento de DNA obtido foi inserido dentro do sítio BamHl do vetor de pHSG299 e usado para transformar a cepa Escherichia coli JM109. O transformante obtido foi transferido para Hybond-N+ (Amersham Pharmacia Biotech), desnaturado, neutralizado e em seguida hibridizado com a sonda preparada no Exemplo 5, (1) utilizando-se DIG-High Prime DNA Labeling & Detection Starter Kit I. Nesta ocasião, um transformante que hibridizou fortemente e um transformante que hibridizou fracamente foram reconhecidos. Os DNAs de plasmídeo foram preparados destes transformantes e as sequências de nucleotídeo das inserções foram determinadas. Como resultado, os clones contendo um gene mostrando alta homologia com respeito a uma conhecida glutamina sintetase de bactérias corineformes puderam ser obtidos. A seqüência de nucleotídeo total da inserção da última foi mostrada na Listagem de Seqüência como SEQID NO: 1.

As estruturas de leitura aberta foram deduzidas e seqüências amino ácidas foram mostradas na Listagem de Seqüência como SEQ ID NOS: 2 e 3. Cada uma destas seqüências amino ácidas foi comparada com as seqüências conhecidas para homologia. O banco de dados usado foi Genbank. Como resultado, tomou-se claro que as seqüências amino ácidas codificadas por ambas estruturas de leitura aberta foram novas proteínas de bactérias corineformes.

As seqüências de nucleotídeo e as seqüências amino ácidas foram analisadas utilizando-se programa de computador Genetyx-Mac (Software Development, Tóquio). A análise de homologia foi realizada de acordo com o método de Lipman e Pearson (Science, 227,1435-1441,1985).

A seqüência amino ácida mostrada na Listagem de Seqüência como SEQ ID NO: 2 apresentou 34,6%, 65,6% e 60% de homologia com respeito à GS já informada de Corynebacterium glutamicum (FEMS

Microbiology Letters, 81-88, (154) 1997), GS de Mycobacterium tuberculosis (acesso do GenBank Z70692) e GS de Streptomyces coelicolor (Acesso de GenBank AL136500), respectivamente (Tabela 6) e foi constatada ser uma isozima de GS de bactérias corineformes.

Por outro lado, a seqüência mostrada na seqüência de listagem como SEQ ID NO: 3 mostrou 51,9% e 33,4% de homologia com respeito à já informada ATase de Mycobacterium tuberculosis (Acesso ao GenBank Z70692) e ATase de Streptomyces coelicolor (acesso ao GenBank Y17736), respectivamente (Tabela 7) e foi constatada ser ATase de bactérias corineformes. Portanto, verificou-se que, na seqüência de nucleotídeo mostrada como SEQ ID NO: 1, a codificação da estrutura de leitura aberta para a seqüência amino ácida mostrada como SEQ ID NO: 2 foi glnA2, e a codificação de estrutura de leitura aberta para a seqüência amino ácida mostrada como SEQ ID NO: 3 foi glnE.

Tabela 6 Tabela 7 Exemnlo 6: Produção de L-glutamina nor cena deficiente de ATase Uma vez que a codificação do gene glnE para ATase foi elucidada no Exemplo 5 supracitado, uma cepa deficiente de glnE foi construída da bactéria AJ12418 produtora de L-glutamina. O procedimento específico será mostrado abaixo.

Primeiro, PCR foi realizada utilizando-se DNA cromossomal de cepa de Brevibacterium flavum ATCC 14067 como um padrão e os DNAs sintéticos da SEQ ID NOS: 23 e 24 como iniciadores para obter-se um fragmento parcial do gene glnE. O produto PCR produzido foi purificado em uma maneira convencional, em seguida embotado nas extremidades e inserido dentro do sítio Hincll de pHSG299 (Takara Shuzo). Este plasmídeo foi designado como pGLNE. Em seguida, a fim de deletar uma região parcial do gene glnE neste plasmídeo, pGLNE foi digerido com Hincll e auto-ligado e o plasmídeo obtido foi designado como pAGLNE. Este plasmídeo continha os 2341° ao 4650° nucleotídeos da seqüência de nucleotídeo mostrada na Listagem de Seqüência como SEQ ID NO: 1, porém ele tinha deleção de cerca de 300 pb do 3343° sítio de reconhecimento Hincll ao 3659° sítio de reconhecimento Hincll.

Uma vez que pAGLNE não contém uma região que possibilite sua replicação autônoma dentro das células das bactérias corineformes, quando uma bactéria corineforme é transformada com este plasmídeo, uma cepa em que o plasmídeo é integrado dentro do cromossoma por recombinação homóloga pode ser produzida como um transformante, embora isto ocorra em uma freqüência extremamente baixa. A bactéria produzindo L-glutamina, Brevibacterium flavum AJ12418, foi transformada com o plasmídeo pAGLNE em uma alta concentração pelo método de pulso elétrico e os transformantes foram obtidos utilizando-se resistência a canamicina como um marcador. Em seguida, estes transformantes foram subcultivados para obterem-se cepas que tomaram-se sensíveis à canamicina. Além disso, os DNAs cromossomais das cepas sensíveis à canamicina obtidas foram extraídos e PCR foi realizado utilizando-se cada DNA cromossomal como um padrão e os DNAs sintéticos mostrados na Listagem de Seqüência como SEQ ID NOS: 23 e 24 como iniciadores, para obterem-se fragmentos parciais do gene glnE. Uma cepa cujo produto PCR não proveu fragmento de cerca de 300 pb quando foi digerida com HincII foi determinada como uma cepa g/nis-rompida. Esta cepa foi designada como AQ-T. A cultura para a produção de L-glutamina foi realizada da mesma maneira descrita no Exemplo 1, (3) utilizando-se cepas ATI2418 e QA-T. Os resultados são mostrados na Tabela 8. A cepa QA-T mostrou melhoria do acúmulo de L-glutamina, em comparação com a cepa AJ12418. Os resultados da medição da atividade GS destas cepas são também mostrados na Tabela 8. Foi confirmado que a atividade GS foi melhorada na cepa QA-T, em comparação com a cepa AJ12418.

Tabela 8 (EXPLICAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS) SEQ ID NO: 1: sequências de nucleotídeo glnA2 e glnE SEQ ID NO: 2: seqüência de nucleotídeo glnA2 SEQ ID NO: 3: seqüência de nucleotídeo glnE SEQ ID NO: 4: Iniciador N para amplificação glnA SEQ ID NO: 5: Iniciador C para amplificação glnA SEQ ID NO: 6: Io iniciador PCRNN de glnA SEQ ID NO: 7: Io iniciador PCRNC de glnA SEQ ID NO: 8:1° iniciador PCR CN de glnA SEQ ID NO: 9: Io iniciador PCR CC de glnA SEQ ID NO: 10: 2o iniciador PCR N de glnA SEQ ID NO: 11:2° iniciador PCR C de glnA SEQ ID NO: 12: Iniciador N para amplificação gdh SEQ ID NO: 13: Iniciador C para amplificação gdh SEQID NO: 14: Iniciador N2 para amplificação gdh SEQ ID NO: 15: Iniciador C2 para amplificação gdh SEQ ID NO: 16: Iniciador Ml para mutação de promotor gdh SEQ ID NO: 17: Iniciador M4 para mutação de promotor gdh SEQ ID NO: 18: Iniciador N para preparação de sonda glnA SEQ ID NO: 19: Iniciador C para preparação de sonda glnA SEQ Π) NO: 20: Seqüência promotora gdh tipo selvagem SEQ ID NO: 21: Seqüência promotora gdh tipo mutante SEQ ID NO: 22: Seqüência promotora gdh tipo mutante SEQ ID NO: 23: Iniciador N para rompimento glnE SEQ ID NO: 24: Iniciador C para rompimento glnE

REIVINDICAÇÕES

Claims (2)

1. Bactéria corineforme transgênica» caracterizada pelo fato de ter capacidade de produzir L-glutamina e ter sido modificada de modo que sua atividade de glutamina sintetase e sua atividade de glutamato desidrogenase intracelulares devam ser intensificadas simultaneamente» em que a atividade de glutamina sintetase é aumentada por um ou mais de A) a E) a seguir: A) aumento do número de cópias de um gene codificando para glutamina sintetase, B) modificação de um promotor do gene derivado da bactéria corineforme, de modo que a expressão do gene codificando para a glutamina sintetase intracelular da bactéria deva ser aumentado» C) abrigo da glutamina sintentase cuja atividade de controle por adenilação é defeituosa em uma célula bacteriana, D) diminuição das atividades de glutamina sintetase e adenilil transferase na célula bacteriana, E) diminuição da atividade de proteína Pll na célula bacteriana, e em que a atividade de glutamato desidrogenase é aumentada por a) e/ou b) a seguir: a) aumento do numero de cópias do gene codificando para glutamato desidrogenase, b) modificação de um promotor do gene derivado da bactéria corineforme, de modo que a expressão do gene codificando para glutamato desidrogenase intracelular da bactéria deva ser aumentada.

2. Método para produzir L-glutamina, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma bactéria como definida na reivindicação 1 em um meio para produzir e acumular L-glutamina no meio e coletar a L-glutamina.