BRPI0206692B1

BRPI0206692B1 - Técnica e dispositivo de preparação de suspensão de célula

Info

Publication number: BRPI0206692B1
Application number: BRPI0206692-0A
Authority: BR
Inventors: Stoner Marie; Wood Fiona
Original assignee: Mccomb Foundation Inc.
Priority date: 2001-02-07
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2018-06-19
Also published as: EP1357922B1; JP6042377B2; BRPI0206692B8; JP2010269159A; EP1357922A4; JP2014193415A; JP5214085B2; JP2004529872A; EP1357922A1; EP2343079B1; AU2002227802B2; BR0206692A; WO2002062358A1; EP2343079A2; HK1212885A1; PT1357922E; ATE510548T1; HK1057713A1; EP2343079A3

Abstract

"técnica e dispositivo de preparação de suspensão de célula". a invenção proporciona um método único e ou dispositivo adequado para produção de uma suspensão celular transplantável de tecidos adequados para enxerto a um paciente. na aplicação do método e ou no uso do dispositivo o tecido doador é armazenado, sujeitado a tratamento de dissociação de células, células adequadas para enxerto de volta ao paciente são coletadas e dispersas em uma solução que é adequada para dispersão imediata sobre o recipiente de enxerto local.

Description

(54) Título: TÉCNICA E DISPOSITIVO DE PREPARAÇÃO DE SUSPENSÃO DE CÉLULA (51) Int.CI.: A61K 35/36; C12M 3/06; C12M 3/00; A61P 17/02 (30) Prioridade Unionista: 04/04/2001 US 60/281,527, 07/02/2001 AU PR 2989 (73) Titular(es): MCCOMB FOUNDATION INC.

(72) Inventor(es): MARIE STONER; FIONA WOOD

ΡΙ0206692-0

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “TÉCNICA E DISPOSITIVO DE PREPARAÇÃO DE SUSPENSÃO DE CÉLULA”.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere a uma técnica simples, rápida e de custo efetivo para enxerto de células, e em particular a j um dispositivo para a preparação de uma suspensão de células a ; partir de amostra de tecido obtida a partir de um local doador e i, ' aplicação daquela suspensão de células a um recipiente local. i o TÉCNICA ANTERIOR

Existem vários métodos de tratamento de ^ferimentos conhecidos dos técnicos no assunto. Por exemplo, técnicas de enxerto de pele existentes, que ajudam a reconstruir a pele, cobrindo áreas do corpo em que existem ou danos ou 15 defeitos na pele. Em geral, estes tipos de enxertos são . classificados de acordo com suas relações hospedeiro-doadores e por suas espessuras. O enxerto mais clinicamente aplicado é o * enxerto autológo, em que o tecido é tomado a partir de uma área do corpo e aplicado a uma outra área. O tecido enxertado então desenvolve um novo suprimento de sangue e ataca os tecidos subjacentes.

\ ' Existem vários tipos de enxertos de pele ' presentemente usados, incluindo enxertos de espessuras divididas, espessuras completas, e micro-enxertos. Cada um destes tipos de enxertos pode ser preparado usando certas técnicas, e cada um possui suas vantagens inerentes e desvantagens. Enxertos de espessuras divididas freqüentemente requerem prática considerável, tempo e equipamentos caros para realização. Adicionalmente, locais doadores são difíceis, resultando em cicatrizes e limitando a área capaz de ser coberta. Embora eles possam ser mais bem sucedidos que enxertos de espessura completa, eles são usualmente menos atrativos cosmeticamente. Enxerto de espessura completa requer menos prática ou equipamentos caros, e sua aparência cosmética é melhor que a dos enxertos de espessura dividida. Entretanto, enxertos de espessura completa não “pegam” tão bem quanto os enxertos de espessura dividida. Micro-enxertos são mais facilmente efetuados e não requerem instrumentos especiais. Entretanto, sua aparência cosmética não é tão boa quanto as das outras técnicas, quando a cicatriz resultante é inaceitável.

Uma variação das técnicas de enxerto acima é o enxerto malha, que é um tipo de enxerto de pele de espessura dividida ou espessura completa no qual fileiras paralelas de fendas são cortadas nos tecidos que estão sendo tratados. Algumas das vantagens dos enxertos-malha incluem: uma cobertura maior da área resultante, drenagem de sangue ou soro a partir do interior do enxerto, e conformidade aumentada do enxerto para áreas recipientes desiguais. Esta técnica tem sido muito satisfatória, com 90 a 100% de pega quando os enxertos tenham sido aplicados em corpos de granulagens saudáveis.

Uma alternativa ao enxerto de pele dividido é formar uma bolha sob sucção no local doador e transplantar ao local recipiente. A produção de bolhas para tratar ferimentos tem sido usada desde 1960. As bolhas são produzidas por um dispositivo de sucção, tal como Dermavac™, a uma pressão de sucção de aproximadamente 250-300 mmHg por 1-2 horas. As bolhas são então cortadas e colocadas nos ferimentos. O tempo de restabelecimento é cerca de 10-14 dias. Existem várias desvantagens deste método tal como a quantidade de tempo que é requerido para preparar o enxerto, que é muito longo e o enxerto pode não resultar em re-pigmentação da área; ou pigmentação desigual é comum ao redor das bordas da área de tratamento.

Micro-enxertos tem tornado uma tentativa mais comum para cobrir grandes áreas e envolve o “fragmento cortado” de um número de seções muito pequenas de tecidos a partir de um local doador e aplicá-lo então a um curativo, que é de volta aplicado à área dos ferimentos.

A tecnologia mais avançada para a geração de um tecido in vitro é para epidermes de cultura. Auto-enxertos epiteliais cultivados (CEA) são um suplemento importante na cobertura de queimaduras e outras situações em que grandes áreas da superfície do corpo experimentam perda de pele. Existem muitos centros através do mundo com facilidades de cultura de tecidos cujo objetivo é produzir enxertos epiteliais autológos para uso em uma ampla variedade de aplicações. A utilidade e aplicação do CEA são relatadas por sua habilidade para alcançar lâminas de células confluentes adequadas para enxerto. Esta técnica apresenta muitas das desvantagens dos tratamentos prévios descritos acima. Por exemplo, auto-enxertos epiteliais cultivados reduzem a demanda de locais doadores. Entretanto, estes auto-enxertos são de crescimento lento e requerem tempo para cultivo dos enxertos, que freqüentemente excedem o tempo de preparação dos locais recipientes.

A presente invenção provê uma suspensão celular junto com um método para preparação daquela suspensão e a um dispositivo para sua preparação cada um dos quais visando melhorar uma ou mais das desvantagens associadas com a tecnologia de enxerto da técnica anterior.

RESUMO DA INVENÇÃO

O sujeito da invenção se refere a uma suspensão de células única e método para sua preparação que é rápido, eficiente e simples para preparar e aplicar. Ela também se refere a um método para tratamento de um paciente usando a suspensão de célula única e a um aparelho adequado para uso em um método de preparação. O uso do dispositivo descrito enquanto não essencial para praticar o método da invenção tem sido encontrado como reduzindo significantemente a complexidade associada com o uso da tecnologia de enxerto convencional tal como CEA.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção é provido um método para preparação de uma suspensão de célula adequada para aplicação a um paciente, cujo método compreende as etapas de:

(a) sujeitar a amostra do tecido incluindo células adequadas para enxerto a um paciente, a pelo menos meios de dissociação físicos e químicos capazes de dissociação da camada celular na amostra do tecido;

(b) remover a amostra do tecido a partir da presença dos meios de dissociação do tecido usados na etapa (a) e armazenamento na presença de um nutriente de células em solução a partir da amostra dos tecidos, células adequadas para enxerto em um paciente em que a solução nutriente é (i) livre de soro xenogênico, (ii) capaz de manter a viabilidade das células até a aplicação ao paciente e (iii) ser adequada para aplicação direta à região no paciente submetida ao enxerto de tecido; e.

(c) filtragem da suspensão celular produzida de acordo com a etapa (b) para remover conglomerados celulares grandes.

Na forma preferida da invenção dos meios de dissociação é de uma natureza química tal como uma enzima que é capaz de rompimento da ligação celular como, por exemplo, tripsina. Além disso, preferivelmente a suspensão celular filtrada é diluída para uma densidade de célula apropriada usando uma solução nutriente, que pode ser de qualquer espécie a partir de uma solução de sal básico para uma solução nutriente mais complexa.

De acordo com um segundo aspecto da invenção é provida uma suspensão de células, produzida de acordo com o método acima. Preferivelmente as células na suspensão são células autológas (isto é, elas são isoladas a partir de um paciente requerendo um auto-enxerto). Os inventores têm observado que pela remoção do soro xenogênico a partir da suspensão de células existe menos probabilidade de transmissão de infecção e reações xenogênicas entre o paciente e os soros são eliminados. Uma outra característica da suspensão de células produzida de acordo com o método acima é que a amostra de tecido usada para isolar as células na suspensão é removida a partir da solução de enzima antes das células serem armazenadas. Quando as células são expostas a enzimas capazes de danos à adesão intercelular a viabilidade da suspensão celular diminui com o tempo, reduzindo, portanto, a eficiência do enxerto quando aplicado a um paciente. A suspensão de células produzida de acordo com o método acima tem sido observada como possuindo viabilidade celular maior comparada aos métodos comparativos que armazenam as células em intervalos regulares enquanto o tecido está imerso na presença de enzimas similar a tripsina.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção é provido um método de tratamento de um paciente em necessidade de cirurgia de enxerto, o referido método compreendendo as etapas de:

(a) preparar uma suspensão de células de acordo com o método acima;

(b) administrar a suspensão diretamente em uma região no paciente que requer um enxerto de célula em uma maneira que facilite a propagação da suspensão de células em uma distribuição relativamente uniforme sobre a região do enxerto.

Em uma forma alternativa, a invenção consiste no uso de uma suspensão celular adequada para enxertos, cuja suspensão é preparada de acordo com as seguintes etapas:

(a) sujeitar a amostra do tecido incluindo células adequadas para enxerto a um paciente, a uma enzima adequada para dissociação de peças coesivas da camada de tecido na amostra;

(b) remoção da amostra a partir da solução de enzima usada na etapa (a) e armazenamento na presença de um nutriente de células em solução a partir da amostra dos tecidos, em que as células são adequadas para enxerto em um paciente em que a solução nutriente é (i) livre de soro xenogênico, (ii) capaz de manter a viabilidade das células até a aplicação ao paciente e (iii) ser adequada para aplicação direta à região no paciente submetida ao enxerto de tecido;

(c) filtragem da suspensão celular produzida de acordo com a etapa (b) para remover conglomerados celulares grandes;

para a preparação de medicamentos adequados para o tratamento de doenças de tecidos requerendo enxerto.

De acordo com um quarto aspecto da invenção é provido um aparelho para desenvolvimento de uma solução de regeneração de tecido, o referido aparelho compreendendo:

(a) meios de aquecimento adequados para aquecimento de uma solução de enzima a uma temperatura requerida e que é capaz de manter aquela solução a uma temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo; e.

(b) recesso de filtro compreendendo meios de filtro capazes de separar congregados celulares grandes a partir de uma suspensão celular.

Quando a solução de enzima é colocada em contato com os meios de aquecimento ela é preferivelmente aquecida em uma maneira que evite aquecimento localizado dentro da solução.

Outros aspectos e vantagens da invenção tornarse-ão aparentes aos técnicos no assunto a partir de uma revisão da descrição seguinte, que procede com referência aos desenhos ilustrativos seguintes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 ilustra uma vista em perspectiva do aparelho com a tampa aberta e o segundo membro no lugar.

Figura 2 ilustra uma vista em perspectiva do aparelho com a tampa aberta e o segundo membro removido e invertido.

Figura 3a ilustra uma vista em perspectiva do primeiro membro do aparelho.

Figura 3b ilustra uma vista posterior em perspectiva do primeiro membro do aparelho.

Figura 4 ilustra uma vista em perspectiva da base do aparelho.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Geral

Os técnicos no assunto poderão apreciar que a invenção descrita aqui é suscetível a variações e modificações outras que aquelas especificamente descritas. É para ser entendido que a invenção inclua todas as tais variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos referidos ou indicados no pedido, individualmente ou coletivamente e qualquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das etapas ou características.

A presente invenção não é para ser limitada em escopo pelas concretizações especificas descritas aqui, que são pretendidas para a proposta de exemplificação somente. Produtos de funcionalidade equivalentes, composições e onde métodos apropriados estão claramente dentro do escopo da invenção são descritos aqui.

Através deste pedido e das reivindicações que segue, a menos que o contexto requeira de outra forma, o termo “compreende”, ou variações tais como “compreendem” ou compreendendo”, devem ser entendidos como contendo a inclusão de um inteiro inicial ou grupo de inteiros, mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros.

Descrição das Concretizações Preferidas

Tendo relação com o descrito acima, esta invenção provê um método único e ou dispositivo adequado para produção de uma suspensão celular transplantável de tecidos vivos adequados para enxerto a um paciente. Na aplicação deste método e ou no uso do dispositivo em que o tecido doado é armazenado, sujeitado a meios de dissociação de tecido, células adequadas para enxerto de volta a um paciente são coletadas e dispersadas em uma solução que é adequada para dispersão imediata sobre o local de enxerto no recipiente.

O objeto da invenção possui muitas vantagens sobre a técnica anterior algumas das quais são ilustradas nos seguintes parágrafos.

1. - Provê um método eficiente de tempo para suprimento de cobertura celular a um tecido em uma colocação clínica. Isto é, células estão disponíveis quando necessário no tempo da cirurgia. Isto é obtenível, pois existe um período de preparação muito curto das células, assim permitindo que o enxerto seja realizado peri-operativamente ou nas salas de uma clínica especialista ou Clínica Geral.

2. - Provê um método e um aparelho que reduz significantemente a complexidade associada com o uso de CEA’s convencionais e é particularmente útil em casos de machucados de queimaduras que tenham apresentado posteriormente. Em alguns exemplos, células estão indisponíveis no momento da cirurgia, tanto devido ao atraso referido do paciente com uma queimadura não-cicatrizada ou simplesmente por causa do tempo necessário para cultivo de um enxerto ter excedido aquele para a preparação do recipiente de assentamento. A presente invenção melhora a questão do tempo de preparação do enxerto.

3. — Isto auxilia na realização de cobertura rápida de células em áreas machucadas e locais doadores. É provido um meio para a redução do tamanho dos locais doadores - o local doador de biópsia é marcadamente menor que um local doador de enxerto de pele dividido e reduz ou elimina o uso de locais doadores de enxerto de pelo dividido; aumenta a taxa de expansão da cobertura de células; aumenta a taxa de restabelecimento das queimaduras pequenas; é útil para áreas pequenas de reconstrução de pele como cicatrizes; e aperfeiçoa a qualidade das cicatrizes.

4. - Melhora o problema associado com o uso das soluções usadas durante processos de cultura de tecidos convencional. De acordo com o método de preparação e tratamento das células usadas em um enxerto são suspensas em uma solução nutriente livre de soro xenogênico. Aquela suspensão é então colocada diretamente em um recipiente local.

5. - Provê um meio para tratamento de várias enfermidades ou doenças de pele. Por exemplo, pode ser usado para o seguinte: dar nova superfície epidermal, substituição após perda de pele, igualar localmente durante re-pigmentação de uma área da pele, tratamento de ferimentos de queimaduras, leucoderma, vitiligo, piebaldismo, no tratamento de cicatrizes por exemplo, causada através da cicatrização de ferimentos incorreta, direção de cicatriz imprópria ou distorção de cicatriz a partir de contração de ferimentos, cicatrizes de acne; dermoabrasão cosmética dando nova superfície, dar nova superfície após tratamento a laser e em associação com reconstrução dermal. Adicionalmente o método pode ser usado para terapia de substituição celular, incluindo, por exemplo, tratamento de substituição de células nervosas, células epiteliais (tais como células urotelial, células da mucosa bucal e células epiteliais respiratórias), tratamento de substituição, tratamento de substituição de células endotelial e tratamento de substituição de células precursoras osteogênicas.

6. - Provê um meio para produzir uma suspensão de células em uma taxa para cada outra comparável com aquelas vistas in situ. Isto é, devido à maneira de preparação da suspensão celular, células são tais como células basais ceratinocite, células Langerhans, fibroblastos e melanócitos tipicamente tendo taxas de sobrevivência aumentadas em comparação às técnicas de cultura de tecidos padrão, em que cultura de células seletivas podem resultar em perda de certos tipos de células. Isto possui a vantagem de possibilitar a repigmentação correta da pele após o enxerto de pele.

7. - Permite cirurgia e cicatrização mais rápida - desta forma reduzindo trauma no pacientes durante a fase de seus cuidados medicinais.

De acordo com o primeiro aspecto da invenção é provido um método para preparação de uma suspensão de célula adequada para uso em novas superfícies e regeneração do tecido danificado.

De acordo com este método, tecido (preferivelmente de uma natureza autológa) é armazenada a partir de um paciente por meios conhecidos na técnica de enxerto de tecidos. Preferivelmente isto é alcançado tomando uma biópsia de tecido. Com o armazenamento da biópsia consideração pode ser feita com a profundidade da biópsia e o tamanho da área de superfície. A profundidade e tamanho da biópsia influenciam o bem-estar no qual o procedimento pode ser empreendido e velocidade com a qual um paciente recupera a partir do procedimento. Em uma forma altamente preferida da invenção, o local doador pode ser escolhido para equiparar apropriadamente o local recipiente, por exemplo, pós-auricular para cabeça e pescoço, coxa para membros inferiores, membro superior para braço inferior e superior, ou palma para sola ou vice-versa.

Uma vez que a biópsia tenha sido armazenada a partir de um paciente, a amostra do tecido é sujeitada a meios de dissociação física e química capaz de dissociação da camada celular na amostra de tecido.

Métodos para dissociação da camada celular com os tecidos são bem conhecidos no campo. Por exemplo, os meios de dissociação podem ser tanto meios de rompimento físico e químico. Meios de dissociação físicos podem incluir, por exemplo, raspagem da amostra de tecido com um escapelo, cortar o tecido, cortar fisicamente as camadas, ou por aspergimento do tecido. Meios de dissociação químicos podem incluir, por exemplo, digestão com enzimas tais como tripsina, dispase, colagenase, tripsina-edta, thermolisina, pronase, hialuronidase, elastase, papaína e pancreatina. Soluções não-enzimáticas para a dissociação de tecidos podem também ser usadas.

Preferivelmente, dissociação da amostra de tecido é realizada por colocação da amostra em uma solução de enzima pré-aquecida contendo uma quantidade de enzima suficiente para dissociação da camada celular na amostra do tecido. Isto pode ser realizado, por exemplo, usando uma solução de tripsina, entretanto, qualquer outra enzima tal como dispase, colagenase, tripsina-edta, thermosilina, pronase, hialuronidase, pancreatina, elastase e papaína que fazem as células destacarem das outras células ou de superfícies sólidas podem ser usadas para esta proposta. Quando a enzima usada é tripsina a solução de enzima usada no método é preferivelmente cálcio e magnésio livre. Uma tal solução é preferivelmente íon livre de cálcio e magnésio em salina tamponada de fosfato.

Onde a biópsia de tecido é derivada da pele de um paciente (compreendendo células epiteliais-dermais) a quantidade de tripsina que pode ser usada no método está preferivelmente entre cerca de 5 e 0.1% de tripsina por volume de solução. A concentração de tripsina desejável da solução é cerca de 2.5 a 0.25%, com cerca de 0.5% de tripsina sendo mais preferida.

O período de tempo sobre o qual a amostra de tecido é sujeitada à solução de tripsina pode variar dependendo do tamanho da amostra de biópsia tomada. Preferivelmente a amostra de tecido é colocada na presença da solução de tripsina por tempo suficiente para enfraquecer as ligações coesivas entre a camada de tecido. Por exemplo, onde a amostra de tecido é tomada a partir da pele do paciente na amostra pode ser colocada em tripsina por um período de 5 a 60 minutos. Preferivelmente, a amostra de tecido está imersa na solução de tripsina por entre 10 e 30 minutos com 15 a 20 minutos sendo ótima para a maior parte das amostras de tecidos.

Após a amostra de tecido ter sido imersa na solução de tripsina por uma quantidade apropriada de tempo, a amostra é removida a partir da tripsina e lavada com solução nutriente. Lavagem da amostra de tecido pode envolver tanto imersão parcial ou completa da amostra tratada na solução nutriente. Alternativamente, e mais preferivelmente, a solução de lavagem é gotejada na amostra de tecido em um volume suficiente para remover e ou diluir significantemente qualquer excesso de solução de tripsina a partir da superfície da amostra. Preferivelmente qualquer diluição que pudesse ocorrer poderia conduzir a menos que 0.05% de tripsina na solução nutriente.

A solução nutriente usada no método poderia ser capaz de reduzir significantemente e mais preferivelmente remover o efeito da tripsina tanto por diluição ou neutralização. A solução nutriente usada no método pode também preferivelmente ter as características de ser (i) livre de soro xenogênico, (ii) capaz de manter a viabilidade das células até a aplicação ao paciente e (iii) adequada para aplicação direta à região no paciente submetida ao enxerto de tecido. A solução pode ser qualquer a partir de uma solução de sal básico a uma solução nutriente mais complexa. Preferivelmente, a solução nutriente é livre de todo o soro, mas contém vários sais que são parecidos com as substancias encontradas nos fluidos corpóreos; este tipo de solução é freqüentemente chamado de solução salina fisiológica. Fosfato ou outras substâncias não-tóxicas podem também tamponar a solução de maneira a manter o pH em níveis aproximadamente fisiológicos. Uma solução nutriente adequada que é particularmente preferida é uma solução Hartmamfis.

Após aplicação da solução nutriente à amostra de tecido, as camadas celulares da amostra são separadas permitindo que células capazes de reprodução sejam removidas a partir do material celular e suspensas na solução nutriente. Onde a amostra de tecido é pele, a derme e a epiderme são preferivelmente separadas para permitir o acesso à junção dermalepitelial de ambas as superfícies.

Células capazes de reprodução são então removidas a partir da camada separada por quaisquer meios conhecidos na técnica. Preferivelmente, as células reprodutivas são raspadas fora da superfície das camadas usando um instrumento tal como um escalpelo. Células capazes de reprodução dentro da junção dermal-epitelial incluem, mas não estão limitadas as células basais ceratinocites, células Langerhans, fibroblastos e melanócitos. Seguindo a liberação das células a partir da amostra de tecido elas são suspensas na solução nutriente. Preferivelmente somente um pequeno volume de solução nutriente é aplicado à amostra de tecido durante esta etapa de armazenamento de outra maneira a suspensão pode tornar-se muito fluida desta forma provendo dificuldades na aplicação da suspensão ao enxerto.

Para evitar conglomerados celulares excessivamente grandes na suspensão celular a suspensão é preferivelmente filtrada. Qualquer filtro capaz de separação dos congregados celulares excessivamente grandes a partir da suspensão pode ser usado nesta etapa preferida da invenção. Em uma forma altamente preferida da invenção o tamanho do filtro está entre 50 pm e 200 pm. Mais preferivelmente está entre 75 pm e 150 pm, com 100 pm sendo um exemplo específico.

Antes da aplicação a um local de enxerto ou imediatamente após filtragem, a suspensão celular pode ser diluída para produzir uma densidade de célula apropriada para a proposta na qual a suspensão é para ser usada.

De acordo com um segundo aspecto da invenção é provida uma suspensão de célula aquosa produzida pelo método descrito no primeiro aspecto da invenção. A suspensão de célula provida por este método é altamente adequada para regeneração de tecido e técnicas de enxerto. Uma vantagem importante da utilização de tal suspensão na tecnologia de enxerto é que pode ser usada para expandir grandemente a área ou volume de um ferimento que pode ser tratado rapidamente por multiplicação in situ de um número limitado de células. O número e concentração das células visando o local de enxerto pode ser variado por modificação da concentração das células em suspensão, ou por modificação da quantidade de suspensão que é distribuída em uma dada área ou volume do local do enxerto.

Por suspensão das células em uma solução nutriente que é pelo menos (i) livre de soro xenogênico, (ii) capaz de manter a viabilidade das células até a aplicação ao paciente e (iii) adequada para aplicação direta à região no paciente submetida ao enxerto de tecido, os inventores encontraram que o resultado dos enxertos do paciente é aperfeiçoado. Uma explicação parcial para este aparecimento a ser atribuível à remoção do soro xenogênico e mais preferivelmente todo o soro a partir da suspensão de célula. Soro xenogênico é um aditivo comum em meio de cultura de enxerto e é bem conhecido como causador de problemas de infecção potencial e hipersensibilidade. Tal soro é, entretanto, geralmente requerido para a expansão in vitro das células e para neutralizar a ação da enzima se a enzima usada é tripsina. A solução nutriente usada na presente invenção não requer tal soro, pois a população da célula dentro da suspensão não é expandida antes da aplicação ao local do enxerto. A multiplicação celular é encorajada no paciente antes que em um sistema in vitro. Quando a tripsina é usada neutralização é alcançada por outros meios.

Uma característica única da suspensão de células produzida de acordo com o método do primeiro aspecto da invenção é que a composição das células na preparação celular é comparável àquela vista in situ comparado com a preparação celular da técnica anterior. Uma explanação possível para isto é que na técnica anterior, cultura de preparação celular utiliza cultura seletiva para ceratinócitos, portando perda de constituintes celulares tais como fibroblastos e melanócitos ocorrem considerando que a suspensão celular produzida a partir de um primeiro aspecto da invenção possui uma composição celular comparável à população celular in situ. Uma outra característica da suspensão celular produzida a partir de um primeiro aspecto da invenção é que as células enxertadas são mais viáveis quando elas estão armazenadas em uma solução nutriente quando distintos dos procedimentos de armazenamento de células da técnica anterior que utiliza técnicas onde as células são armazenadas enquanto expostas a enzimas digestivas potentes por períodos excessivos de tempo. Quando as células são expostas a tais enzimas por períodos de tempo excessivos a viabilidade da suspensão celular diminui.

De acordo com o terceiro aspecto da invenção é provido um método de tratamento de um paciente requerendo um enxerto de tecido. Por este método a suspensão celular produzida de acordo com o primeiro aspecto da invenção é aplicado a um local de enxerto. Uma suspensão líquido contendo células pode ser manualmente distribuída no local de enxerto por qualquer das várias técnicas, que incluem pulverização, difusão, pipetação e pintura.

Um uma forma altamente preferida da invenção a suspensão é pulverizada em um local de enxerto. A suspensão pode ser pulverizada através de qualquer tipo de bocais que transformam líquido em pequenas gotinhas transportadas pelo ar.

Esta concretização está sujeita a dois constrangimentos. Primeiro, ela pode não sujeitar as células em solução as forças de cisalhamento ou pressões que poderiam danificar ou matar números substanciais de células. Segundo, ela poderia não requerer que a suspensão celular pode ser misturada com um

- 10 fluido propelente que é tóxico ou detrimental às células ou leitos de ferimentos. Uma variedade de bocais que estão comumente disponíveis satisfaz ambos os constrangimentos. Tais bocais podem ser conectados em qualquer maneira convencional a um reservatório que contém a suspensão celular.

Alternativamente a suspensão pode ser distribuída via uma pipeta, “conta-gotas olho” comum, seringa e agulha e ou outros dispositivos similares para colocar pequenas quantidades de suspensão celular em um local de enxerto.

Após a suspensão de células ter sido aplicada ao recipiente do local de enxerto, os ferimentos podem ser vestidos com uma vestimenta de ferimentos. Em uma concretização preferida à vestimenta é Surfasoft™, uma vestimenta de nylon tecido. Preferivelmente, o restabelecimento das ferimentos é seguido por protocolos padrão para tratamento de enxerto de pele conhecidos aos técnicos na assunto.

De acordo com um quarto aspecto da invenção é prover um aparelho para desenvolvimento de uma solução de regeneração de tecido, que possui meios de aquecimento adequados para aquecimento de uma solução de enzima a uma temperatura requerida e que é capaz de manter aquela solução na temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo; e um recesso de filtro compreendendo meios de filtro capazes de separar congregados de células grandes a partir de uma suspensão celular.

Em uma forma preferida do quarto aspecto da invenção o aparelho também inclui um reservatório capaz de manter uma amostra de tecido e uma solução nutriente, cuja solução é também capaz de manter a viabilidade das células na amostra de tecido. Mais preferivelmente o reservatório é de tamanho suficiente para permitir manipulação das amostras de tecido permitindo separação das camadas celular de tecido e armazenamento daquelas células a partir da camada adequada para enxerto.

Este aparelho também pode incluir um ou mais reservatórios de contenção de fluidos para estocagem de fluidos tais como a solução nutriente. Os reservatórios podem alternativamente servir como um receptáculo para um Container tal como um frasco de plástico ou de vidro que mantém a solução nutriente. Preferivelmente, o reservatório é capaz de manter pelo menos 10 ml de volume. Tais reservatórios permitem fácil aplicação de fluido à amostra de tecido. Estocagem de tais fluidos fechados na proximidade de seus locais de aplicação também provê a vantagem de redução do risco de vazamento acidental do fluido e provê meios fáceis para acesso ao fluido para distribuí-lo acuradamente tanto à amostra de tecido ou à suspensão de célula.

Em uma forma altamente preferida da invenção o aparelho compreende um primeiro e um segundo membro em que:

(1) o primeiro membro inclui:

(a) pelo menos meios de aquecimento adequados para aquecimento de uma solução de enzima a uma temperatura requerida e que é capaz de manter aquela solução a uma temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo;

(b) pelo menos recesso de filtro compreendendo meios de filtro capazes de separar congregados celulares grandes a partir de uma suspensão celular;

(c) pelo menos um reservatório de contenção de fluido para estocagem de solução de nutriente;

(2) o segundo membro forma um reservatório capaz de conter uma amostra de tecido e solução nutriente na retenção de fluido; e.

em que o primeiro membro proporciona um lugar em que o segundo membro pode ser colocado durante a manipulação do tecido.

Em uma forma adicionalmente preferida da invenção o primeiro membro provê um compartimento de estocagem no qual utensílios e soluções usadas no método descrito acima pode ser estocado. Onde tal compartimento é provido no aparelho o segundo membro pode prover a tampa ou fechamento daquele compartimento. Em uso a tampa é preferivelmente removida a partir do topo do compartimento e invertida. O lado de dentro da tampa preferivelmente forma o reservatório que possibilita que o segundo membro sirva para uma proposta dupla. Utensílios e soluções usadas no método podem ser acessados a partir do compartimento. A tampa invertida pode então ser colocada de volta sobre o compartimento, provendo õ reservatório para o aparelho.

O aparelho pode ser feito de metal, plástico ou qualquer outro material. Além disso, o Container pode ser de qualquer tamanho. Preferivelmente o tamanho do Container é somente limitado pelo seu uso pretendido e a necessidade para esterilização tal como pelo uso de irradiação gama e ou óxido de etileno.

Deve ser apreciado que meios de aquecimento empregados no aparelho podem simplesmente constituir uma almofada de aquecimento ou almofadas no topo do primeiro membro. Existem, entretanto, problemas resultantes de tais arranjos, sendo um dos quais a possibilidade de derramamento acidental do Container submetido a aquecimento. Portanto, em uma concretização, um ou mais meios de aquecimento podem ser alojados dentro de um recesso no primeiro membro. Também localizado dentro daquele recesso está pelo menos um Container no qual tecidos podem ser colocados para exposição à solução enzimática. Em uma concretização alternativa um ou mais meios de aquecimento podem ser alojados na base do aparelho. Em tal configuração o primeiro membro contém pelo menos uma abertura adequada para recebimento do Container capaz de manter o fluido, cuja abertura provê acesso ao Container para os meios de aquecimento.

Deve ser apreciado que se o aparelho é designado para mais que um uso os meios de aquecimento podem ser capazes de ser repetidamente aquecidos e resfriados. Alternativamente, cada unidade de aquecimento pode ser capaz de um uso simples, mas unidades de aquecimento múltiplas podem ser providas com o aparelho para facilitar eventos de aquecimento múltiplos.

Em uma configuração altamente preferida do aparelho um anel de aquecimento é localizado dentro de um recesso formando um recesso de aquecimento no primeiro membro entro do qual é colocado um Container (por exemplo, um frasco) para a enzima. O Container é preferivelmente mantido no lugar por pelo menos um meio restringente, que circunda desejavelmente partes da porção superior do Container evitando liberação acidental do Container para o aparelho. Em circunstâncias onde o aparelho é pretendido para uso simples, os meios restringentes podem ser formados como uma parte integral do primeiro membro, assim significando que a remoção do

Container pode somente ser alcançada quebrando fisicamente o primeiro membro.

Os meios de aquecimento usados no aparelho é preferivelmente controlado pelo circuito permitindo ativação do elemento de aquecimento quando requerido. Por exemplo, os meios de aquecimento podem ser ligados por pressão no botão de partida localizado, por exemplo, na superfície do primeiro membro. Alternativamente os meios de aquecimento podem ser ativados por compressão do Container para baixo com força suficiente para ativar o comutador localizado na base do aparelho. Um técnico de conhecimento comum no capo poderá apreciar que uma ampla faixa de meios eletrônicos pode ser usada para ativar a unidade de aquecimento provido no aparelho.

Desejavelmente a unidade de aquecimento é também operavelmente ligada a um mecanismo de tempo, que é adaptado para aquecer a solução de enzima por um período de tempo pré-definido. Em circunstâncias onde o aparelho é pretendido para usos múltiplos, preferivelmente o timer pode ser ajustado para desativar o elemento de aquecimento quando uma quantidade particular de tempo é alcançada. No mesmo ponto um alarme pode ser ativado para informar ao usuário que o tempo foi atingido. O alarme pode ser audível ou estar na forma de um mostrador luminoso.

Em uma concretização preferida adicional da presente invenção os meios de aquecimento podem ser providos com um controle de temperatura ajustável. Onde um ajuste de temperatura é requerido tal variação pode ser alcançada por adaptação do circuito de controle de aquecimento para incluir ou comunicar com o mecanismo de controle de temperatura permitindo que a temperatura da unidade de aquecimento possa ser constantemente variada com uma faixa constante, ou pode apresentar uma faixa de temperaturas selecionadas que os meios de controle de aquecimento possam ser regulados. Os meios de controle de temperatura podem estar beneficamente incluídos no aparelho onde o aparelho é para ser usado no armazenamento e preparação de diferentes tipos de células e ou onde diferentes enzimas são usadas no método de armazenamento para que o aparelho tenha aplicação única.

Em uma forma alternativa mais preferida, o aparelho é designado para uso simples. Em tais instâncias o mecanismo de tempo é parte do circuito que controla os meios de aquecimento. Uma vez que os meios de aquecimento tenham sido ativados eles aquecem a solução por um período de tempo prédeterminado e então se destroem. Deve ser apreciado que aqueles técnicos no assunto que tal aparelho possa ser adaptado com vários meios de monitoração que são capazes de indicação de tais coisas como: as enzimas tenham alcançado a temperatura requerida; a quantidade de tempo que a enzima tenha estado na solução; e ou a quantidade de tempo menor antes do circuito se destruir, etc. Por meio de exemplos somente, os meios de monitoração podem consistir de uma serie de LED’s que ativam quando certos eventos ocorrem. Em uma concretização altamente preferida ο elemento de aquecimento preferivelmente permanece no modo de aquecimento por um máximo de 45 minutos até 1 hora.

Os meios de aquecimento podem ser ligados por quaisquer meios conhecidos na técnica. Preferivelmente, o suprimento de energia é provido por bateria/baterias. Em uma forma da invenção, o suprimento de energia é uma bateria ou uma pluralidade de baterias localizadas na base do aparelho.

Em uma concretização adicional da invenção o aparelho pode ser provido com um ou mais meios para facilitar a mistura das soluções usadas na invenção tal como, por exemplo, uma solução de enzima. A este respeito, e por meio de exemplo somente, o aparelho pode incluir um meio para turbilhonar a solução; tal como um sistema eletromagnético que é adaptado para agitar uma banda magnética é preferivelmente provido no Container (por exemplo, frasco) no qual a solução é estocada no aparelho. Alternativamente a banda magnética pode ser adicionada a uma solução quando mistura é desejada.

Em uma forma alternativamente preferida da invenção o meio de mistura é combinado com os meios de aquecimento tanto como uma unidade simples ou como unidades separadas para facilitar o aquecimento constante em uma maneira igual. O uso de tal meio de mistura evita o possível superaquecimento da solução fechada em uma unidade de aquecimento enquanto a solução é aquecida. Tal sistema poderá prover um aquecimento mais constante da solução. Meios alternativos para mistura da solução podem ser conhecidos na técnica e incluem, meios mecânicos, físicos, elétricos e eletromagnéticos, como exemplo. Enquanto o meio de mistura pode ser empregado no aparelho, preferivelmente o meio de mistura é tanto selecionado para minimizar vibração do aparelho ou incorporado ao aparelho em uma maneira que minimiza tal vibração. A este respeito os meios de mistura podem ser alojados em um ou mais abafadores de vibração ou o aparelho pode incluir um ou mais abafadores de vibração em sua base.

Onde um meio de mistura é incorporado no aparelho os meios podem ser automaticamente ativados após ativação da unidade de aquecimento ou alternativamente podem ser um sistema de ativação separado. Adicionalmente, a velocidade de mistura pode tanto ser fixada ou variável. Preferivelmente, existe um sistema de ativação separado para o meio de mistura.

O recesso de filtro incorporado no aparelho pode ser de qualquer tamanho ou forma que facilite a filtração de uma suspensão celular. Adicionalmente o recesso pode ser adaptado para receber e manter pelo menos um tubo no qual a suspensão de célula pode ser filtrada. Preferivelmente o recesso possui uma base cônica provendo meios fáceis para acessar o volume completo da suspensão de célula após ele ter sido filtrado.

Desejavelmente, o terceiro recesso é designado para receber um filtro de célula de 100 pm. O terceiro recesso pode acomodar um filtro de célula de 100 pm conectado a um tubo cônico. Preferivelmente, o tubo possui graduações de área/volume marcadas na lateral.

O aparelho pode também incluir um conjunto de utensílios requeridos para armazenamento de células. Deve ser apreciado pelos técnicos no assunto que quaisquer ferramentas necessárias para armazenamento celular devem estar incluídas com o dispositivo. Preferivelmente, o conjunto das ferramentas é estéril. Como um exemplo somente, o conjunto das ferramentas pode incluir um vaso de vidro de enzimas de separação; uma solução estéril para suspensão da enzima; uma solução nutriente estéril; escalpelo, fórceps; seringa, conta-gotas medicinal, filtro de célula, curativo de ferimentos e/ou bocais de aspergimento. Em uma concretização altamente preferida, o conjunto de ferramentas é estocado em um compartimento formado no primeiro membro do aparelho, que é coberto pelo segundo membro quando não é usado.

Em uma concretização altamente preferida, o dispositivo é usado para armazenar uma suspensão de células e aplicar as células a um local recipiente na seguinte maneira.

Uma alíquota de água estéril é misturada com uma porção de enzima de separação liofilizada e colocada no recesso de aquecimento. Os meio de aquecimento é então ativado o que eleva o teor (isto é, a solução da enzima) do Container para uma temperatura de trabalho de entre 30 e 37°C, preferivelmente entre 33 e 37°C e por meio de exemplo 37°C dentro de 2 minutos e manter a temperatura de trabalho por pelo menos 45 minutos.

Uma vez que a temperatura operacional tenha sido alcançada, uma amostra de tecido tomada a partir de um local doador é colocada na solução de enzima e incubada na temperatura de trabalho. A amostra de tecido é incubada por entre 5 a 45 minutos. Aqueles técnicos no assunto poderão apreciar que o tempo tomado para alcançar a separação das camadas da amostra de tecido é dependente da espessura e tamanho da amostra de tecido e temperatura de incubação. Uma vez que a separação enzimática das camadas de tecido é alcançada, a amostra de tecido é removida para o reservatório e as camadas de tecido são separadas usando instrumentos cirúrgicos.

Uma alíquota cuidadosamente medida da segunda solução é então retirada dos reservatórios de contenção do fluido por aspiração em uma seringa e então aplicada às camadas. As células entre as camadas de tecido são raspadas e suspensas por mistura com a solução nutriente. A suspensão de células é então coletada, preferivelmente usando uma seringa ou uma cânula.

- 20 A suspensão armazenada de células é então passada através de um filtro de célula localizado no recesso de filtro e a suspensão filtrada de células é coletada no recesso de filtro. O reservatório pode opcionalmente ser lavado com um volume adicional de segunda solução e esta solução resultante de células também são filtradas e coletadas no recesso de filtro.

A suspensão filtrada de células pode então opcionalmente ser aspirada em uma seringa e aplicada ao local recipiente.

MELHOR MODO DE REALIZAR A

INVENÇÃO.

Características adicionais da presente invenção são mais completamente descritas nos seguintes exemplos não limitativos. É para ser entendido, entretanto, que esta descrição detalhada é incluída somente para a proposta de exemplificação da presente invenção. Não deve ser entendido de qualquer modo como restrição da descrição ampla da invenção como demonstrado acima.

Exemplo 1

Preparação do local recipiente

Para otimizar o sucesso do enxerto de pele, o ferimento foi lavado e avaliado para ser da profundidade apropriada. Adicionalmente, hemóstase de sangue foi estabelecida e o ferimento checado para evidência de celulite circundante ou infecção. Técnicas para preparação da área incluindo dissecação da agulha, dermo-abrasão ou dar nova superfície a laser.

Biópsia do local doador

O local doador foi escolhido por igualar aproximadamente o local de recepção. O local doador foi infiltrado com anestésico local e adrenalina sob a pele próximo ao tecido subcutâneo. Isto permite que o local doador seja firmado e auxiliado ao se tomar à biópsia de espessura dividida fina. As dimensões da biópsia foram determinadas pelo tamanho da área de superfície do local recipiente a ser coberto.

Tipicamente, o tamanho da biópsia possui uma taxa de expansão de 1:10-1:80. Neste caso, um tamanho de biópsia de 2 cm x 2 cm foi tomado a partir do local doador dando uma taxa de expansão de 1:60.

Dar Nova Superfície à Célula Usando a

Técnica Rápida

Tratamento de ferimentos foi realizado usando io um aparelho de armazenamento de células de Técnica Rápida ReCell®, que é explicado em mais detalhes no Exemplo 2 abaixo. O aparelho contendo todos os instrumentos, soluções, enzimas e curativos requeridos para tratamento de ferimentos.

O elemento de aquecimento foi ativado por 15 depressão do “botão de partida”. Solução (água estéril para injeção) (10 ml) foi transferida a partir do vaso plástico suprido denominado Solução A em um vaso de vidro contendo a enzima de separação (tripsina liofilizada) para dar uma concentração final de 0.5% de tripsina. A solução de enzima foi então misturada junto, transferida para um vaso já localizado no recesso do elemento de aquecimento e aquecido a 37°C.

O vaso contendo a solução B (meio nutriente) foi transferido a partir de seu vaso de suprimento no reservatório de supressão de fluido.

A amostra de tecido previamente obtida foi então colocada na solução de enzima e incubada a 37°C por entre ο ο:

a 15 minutos. Após este tempo, a amostra de tecido foi removida a partir da solução de enzima com um par de fórceps, lavado por mergulho no reservatório de contenção de fluido contendo a Solução B e colocado dentro do lado dermal inferior e lado epidermal superior no reservatório.

A Solução B foi então aspirada a partir do reservatório em uma seringa e mergulhada, a partir da seringa, em ambas as camadas da biópsia.

As camadas de pelo foram separadas usando fórceps. Isto permite acessar a zona da junção dermal-epidermal de ambas as superfícies. Células foram raspadas a partir das superfícies para desenvolver uma plumagem de células no reservatório. As células foram então misturadas na Solução B. À plumagem de células foi então tirada em uma seringa via uma cânula medida 19.

O filtro suprido (filtro de célula 100 pm) foi montado no recesso de filtro e a plumagem de células na Solução B foi passada através do filtro. Uma quantidade pequena adicional da Solução B foi então usada para lavar o reservatório (por exemplo, um disco petri) e coletar quaisquer células remanescentes, os quais foram também passadas através do filtro.

A suspensão de células resultante coletada no recesso cônico foi aspirada em uma seringa e um bocal foi fixado à seringa para pulverização ou gotejamento em uma área de ferimento.

O ferimento foi re-checado para assegurar que ele foi limpo e está livre de fragmentos e que não existe evidência de contaminação com bactérias. Adicionalmente, o ferimento foi checado para determinar se hemóstase tinha sido alcançada. Uma vez que o local recipiente esteja pronto, a suspensão de células foi aplicada à superfície do ferimento usando um bocal.

O ferimento foi revestido com Surfasoft™ um curativo de nylon trançado, que foi suprido com o aparelho. O restabelecimento do ferimento foi seguido usando protocolos padrões para tratamento de enxerto de pele.

Exemplo 2

A concretização mostrada na figura 1 é dirigida a um aparelho de armazenamento de células de Técnica Rápida Re-Cell® 10 para uso na produção de uma suspensão celular transplantável de tecidos vivos para enxerto a um paciente.

Como ilustrado na figura 1 o aparelho inclui uma tampa de fechamento 12 possuindo um mecanismo de travamento 14 adaptado para encaixar com possibilidade de liberação uma porção base 16. O mecanismo de travamento 14 provê um meio para fechamento do aparelho 16 quando o mesmo não está em uso. Localizado dentro da porção base 16 está um primeiro membro 18 dentro do quão está provido uma abertura 20 na qual está colocado um frasco 22 para a enzima. Adjacente à abertura está provido um comutador de ativação 24 capaz de ativar os meios de aquecimento (não mostrados). O primeiro membro também provê um reservatório de contenção de fluido 26 e um recesso de filtro 28. Como apresentado nesta ilustração o filtro 29 é mostrado localizado no recesso de filtro. Ordinariamente o filtro é um item opcional incluído como um item separado no aparelho.

A abertura 20 no primeiro membro 18 é desejavelmente de tal diâmetro que permite que o gargalo do frasco 22 ressalte através e acima do primeiro membro 18. a periferia da abertura 20 é ajustada com um colar 21 que é ligeiramente menor que o diâmetro do corpo do frasco 22. Assim, quando em uso, o frasco 22 não pode ser removido a partir do aparelho 10 quando ele é mantido no local pelo calor 21 localizado ao redor da periferia da abertura 20.

Localizado adjacente à abertura 20, o reservatório de contenção de fluido 26 e o recesso de filtro 28 está no segundo membro 30 que está posicionado em um lugar (não mostrado) localizado dentro de um compartimento de estocagem (não mostrado) dentro do primeiro membro 18. Quando invertido o segundo membro 30 forma um reservatório dentro do qual as manipulações de tecido podem ser realizadas. Para facilitar a separação do segundo membro 30 a partir do primeiro membro 18 um entalhe 32 é provido no lado de uma porção do segundo membro 30, que é de tal tamanho que uma pessoa pode levantar o segundo membro do local o qual ele reside no primeiro membro 18.

Dentro do recesso de filtro 28 está localizado um filtro 29 (provido separadamente com outros componentes) tendo uma malha capaz de separação de material celular maior que 100 pm a partir de uma célula sobrenadante.

Figura 2 provê uma vista em perspectiva parcialmente explodida do aparelho 10 em que o segundo membro 30 é removido do primeiro membro 18 e invertido. Inversão do segundo membro 30 revela as paredes laterais 32 do segundo membro 30, que forma uma barreira de contenção de fluido do reservatório e uma área de reservatório 34 no qual manipulações de tecido podem ser realizadas.

io Remoção do segundo membro 30 a partir do primeiro membro 18 também revela um compartimento de estocagem 36 no primeiro membro 18 no qual soluções e ferramentas podem ser estocadas quando o aparelho 10 não está em uso. Dentro do compartimento de estocagem 36 está localizado um lugar 38 dentro do qual soluções e ferramentas podem ser estocadas quando o aparelho 10 não está em uso. Dentro do compartimento de estocagem 36 está localizado um lugar dentro do qual o segundo membro 30 pode residir. O lugar é preferivelmente localizado ao redor da periferia do compartimento de estocagem 36 e uma profundidade abaixo da superfície do primeiro membro 18 que é equivalente ao peso das paredes laterais 32 do segundo membro 30.

Figura 3a provê uma vista em perspectiva do primeiro membro 18 mostrando o compartimento de estocagem

36, o comutador de ativação do aquecedor 24, a abertura 20, o reservatório de contenção de fluido 26 e o recesso de filtro 28 formado dentro do primeiro membro. Figura 3b provê uma vista lateral do primeiro membro 18 mostrando o recesso de filtro 28, o reservatório de contenção de fluido 26, o comutador de ativação do aquecedor 24, o calor de abertura 21 e a parede posterior do compartimento de estocagem 36. Como visto nesta figura o recesso de filtro possui uma base cônica desta forma provendo meios para fácil acesso à suspensão de célula que é filtrada nele. Localizado adjacente a reservatório de contenção de fluido e no lado oposto do reservatório de contenção do filtro é provido um membro de posicionamento da bateria 40 que ressalta através da base 16 do aparelho (não mostrado) e provê meios para manutenção da bateria no lugar, que são requeridos para ativação dos meios de aquecimento.

Figura 4 provê uma vista em perspectiva da base 16 do aparelho 10 mostrando um frasco 22 localizado dentro do campo de contenção 42. Entre o campo de contenção 42 e o frasco 22 está localizado um colar de aquecimento 44, que circunda o corpo do fiasco. Adjacente ao campo de retenção existe uma borda circuito 46, que é mantida em posição por meios de contenção da borda circuito 48, 50 e 52. A referida borda circuito está em comunicação elétrica com os colares de aquecimento 44 por fios 54. A borda circuito está também em comunicação elétrica via fios 58 com o comutador de ativação do aquecedor (não mostrado). Adjacente à borda circuito 46 está provido um meio de contenção de bateria 58, que mantém 4 baterias AA em posição imóvel (não mostrados). As baterias estão em comunicação elétrica com a borda circuito 46 pelos fios 60. Quando o primeiro membro 18 é ajustado à base 16 as baterias são mantidas no local por meios de contenção de bateria 58, os meios de posicionamento da bateria 40 e a base de cada um dos reservatórios de contenção do fluido 26 e o recesso de filtro 28. Preferivelmente, a base cônica do recesso de filtro 28 também ressalta entre as baterias provendo um meio adicional para segurar as baterias em posição imóvel.

Modificações e variações dos métodos descritos io e dispositivos da invenção tornar-se-ão aparentes aos técnicos no assunto sem sair do escopo e espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conexão com as concretizações específicas preferidas, deve ser entendido que a invenção como reivindicada não poderia ser indevidamente limitada a tais concretizações especificas. Realmente, varias modificações dos modos descritos para realização da invenção que são óbvias àqueles conhecedores no campo relevante no qual está invenção reside são pretendidos para estarem dentro do escopo das reivindicações seguintes.

1/3

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 /4 ο

1. - Método para preparação de uma suspensão de célula adequada para aplicação a um paciente, cujo método é caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(b) remoção da amostra do tecido a partir dos meios de dissociação usados na etapa (a) e armazenamento na presença de um nutriente de células em solução a partir da amostra dos tecidos, células adequadas para enxerto em um paciente em que a solução nutriente é (i) livre de soro xenogênico, (ii) capaz de manter a viabilidade das células até aplicação ao paciente e (iii) ser adequada para aplicação direta à região no paciente submetida ao enxerto de tecido; e.

2/4

CO

Fuq-,2

Tur.Sa jSSOEBSBW——¹

I

2/3 (a) Sujeitar a amostra do tecido incluindo células adequadas para enxerto a um paciente, a uma enzima adequada para dissociação de peças coesivas da camada de tecido na amostra;

(b) Remoção da amostra do tecido a partir da solução de enzima usada na etapa (a) e armazenamento na presença de um nutriente de células em solução a partir da amostra dos tecidos, em que as células são adequadas para enxerto em um paciente em que a solução nutriente é (i) livre de soro xenogênico, (ii) capaz de manter a viabilidade das células até a aplicação ao paciente e (iii) ser adequada para aplicação direta à região no paciente submetida ao enxerto de tecido;

para a preparação de preparação terapêutica adequada para o tratamento de doenças de tecidos requerendo enxerto.

6. - Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato da solução nutriente ser uma solução Hartmann's.

7. - Aparelho para desenvolvimento de uma solução de regeneração de tecidos, o referido aparelho sendo caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) meios de aquecimento adequados para aquecer uma solução de enzima a uma temperatura requerida e que é capaz de manutenção daquela solução a uma temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo;

e (b) suspensão de filtro compreendendo meios de filtro capazes de separar congregados celulares grandes a partir de uma suspensão celular.

8. - Aparelho de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende um reservatório capaz de manter uma amostra de tecido e uma solução nutriente.

Petição 870170091512, de 27/11/2017, pág. 6/7

2. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima adequada para dissociação de peças coesivas da camada de tecido na amostra é tripsina ou uma enzima similar à tripsina.

3/3

9. - Aparelho, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que inclui um ou mais reservatórios de retenção de fluidos para estocagem de fluidos.

10. - Aparelho para desenvolvimento de uma solução de regeneração de tecido, caracterizado pelo fato de compreender um primeiro e um segundo membro em que:

(i) o primeiro membro inclui:

(a) meios de aquecimento adequados para aquecimento de uma solução de enzima a uma temperatura requerida e que é capaz de manter aquela solução a uma temperatura desejada por uma quantidade adequada de tempo;

(b) suspensão de filtro compreendendo meios de filtro capazes de separar congregados celulares grandes a partir de uma suspensão celular;

(ii) o segundo membro forma um reservatório capaz de conter uma amostra de tecido e solução nutriente na retenção de fluido; e.

Petição 870170091512, de 27/11/2017, pág. 7/7

3. - Método, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a enzima é selecionada a partir do grupo consistindo de tripsina, tripsina-EDTA, dispase, colagenase, thermolisina, pronase, hialuronidase, pancreatina, elastase e papaína.

4. - Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução nutriente é uma solução Hartmann's.

5. - Uso de uma suspensão adequada para enxertos, caracterizado pelo fato de que a suspensão é preparada de acordo com as seguintes etapas:

Petição 870170091512, de 27/11/2017, pág. 5/7

4/4

I .jtKBffSiiKW'