BRPI0209792B1 - anticorpo anti-vla-1, composição que o compreende, ácido nucléico e vetor, bem como métodos in vitro para determinar o nível de vla-1 em tecido e para identificar inibidor de domínio i de integrina - Google Patents

Abstract

"anticorpos para vla-1 ". a presente invenção refere-se a anticorpos que especificamente ligam-se à integrina de vla-1 e métodos de usar estes anticorpos para tratar distúrbios imunológicos em um indivíduo. também incluídas são estruturas cristalinas de complexos formados por anticorpos de vla-1 e seus ligandos, e antagonistas e agonistas vla-1 identificados usando as coordenadas da estrutura destas estruturas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPO ANTI-VLA-1, COMPOSIÇÃO QUE O COMPREENDE, ÁCIDO NUCLÉICO E VETOR, BEM COMO MÉTODOS IN VITRO PARA DETERMINAR O NÍVEL DE VLA-1 EM TECIDO E PARA IDENTIFICAR INIBIDOR DE DOMÍNIO I DE INTEGRINA".

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se aos anticorpos para integrina de VLA-1 e ao uso destes anticorpos no tratamento de doenças inflamatórias e outros distúrbios imunológicos.

Esta invenção também refere-se à estrutura cristalina do complexo entre um tal anticorpo e o domínio I de a1 de VLA-1 e ao uso desta informação estrutural para modelo de droga computacional.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Integrinas são uma superfamília de receptores de superfície celular que medeiam adesão célula-célula e célula-matriz. Estas proteínas são conhecidas fornecer ancoragem como também sinais para o desenvolvimento celular, migração e diferenciação durante o desenvolvimento e reparo dos tecidos. Elas têm estado implicadas nos processos imunes e inflamatórios.

As integrinas são proteínas heterodiméricas compostas de duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas, α e β. O término amino de cada cadeia forma uma cabeça globular que contribui para ligação inter-cadeia e para ligação de ligandos. As cabeças globulares são conectadas aos segmentos da transmembrana através de talos. As caudas citoplásmi-cas são usualmente menores que 50 resíduos de aminoácido de comprimento. As subfamílias de integrina foram originalmente definidas com base em que a subunidade β foi usada para formar os heterodímeros. As integrinas contendo β-1 são também chamadas moléculas de VLA, referindo como antígenos "de ativação muito tardia." VLA-1 a VLA-6 referem-se aos membros da subfamília β1 contendo a1 a a6 (isto é, CD49a a CD49f), respectivamente. Para revisão geral, ver Cellular and Molecular Immunology, eds. Abul K. Abbas et ai., W. B. Saunders Company, Filadélfia, PA, 2000.

Colágeno (ambos os tipos I e IV) e laminina são ligandos conhecidos de integrina α1β1 (isto é, VLA-1). VLA-1 tem estado implicado na adesão celular e migração em colágeno (Keely et al., 1995, J. Cell Sei. 108:595-607; e Gotwals et al., 1996, J. Clin. Invest. 97:2469-2477); na promoção de contração e reorganização das matrizes de colágeno, um componente crítico de cicatrização de ferimento (Gotwals et al., supra; e Chiro, 1991, Cell 67:403-410); e na regulação da expressão de genes envolvidos na remodelagem da matriz extracelular (Riikonen et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:1-5; e Langholz et al., 1995, J. Cell Biol. 131:1903-1915). Desse modo, a regulação imprópria de VLA-1 pode resultar em certas condições patológicas como fibrose.

Além disso, foi sugerido que VLA-1 pode representar um papel nas doenças desencadeadas por células T/monócitos. Anticorpos anti-VLA-1 bloqueiam a expressão de citocina dependente de célula T (Miyake et al., 1993, J. Exp. Med. 177:863-868). Expressão de VLA-1 é aumentada em células T de 2 a 4 semanas de idade cultivadas, persistentemente ativadas (Hemler et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15:502-508). VLA-1 também é expressado em uma porcentagem alta de células T isoladas da sinóvia dos pacientes com artrite reumatóide (Hemler et al., 1986, J. Clin. Invest. 78:692-702). Várias estruturas cristalinas de subunidades α de integrina foram determinadas, incluindo as estruturas do domínio a2-l de α2β1 (código de acesso de PDB 1aox; Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517); o domínio I de a1 de α1β1 de rato (número de acesso de PDB 1ck4; Noite et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; WO 00/20459); a subunidade a1 de α1β1 humana (código de acesso de PDB Igc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:24906-24913); os domínios aL-l e aM-l; e vWF-A3 (Lee et al., 1995, Cell 80:631-635; Lee et al., 1995, Structure 3:1333-1340; Qu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:10277-10281; Qu et al., 1996, Structure 4:931 942). A estrutura de α2β1 revelou uma hélice (isto é, a hélice C) que criou uma trincheira ou sulco em uma face da proteína no sítio de ligação do íon de metal (Emsley et al., supra). A estrutura cristalina do domínio I de a2 com-plexado em um peptídeo helicoidal triplo com base em colágeno curto revelou que o peptídeo com base em colágeno foi ligado àquela trincheira, onde os aminoácidos de a2-l que estabeleceram contatos intermolecular ou contatos de metal incluíam Asp151, Asn154, Tyr157, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295 e Lys298 (código de acesso de PDB 1dzi; Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56; WO 01/73444). A numeração dos aminoácidos imediatamente acima é com base no código de acesso de PDB 1 dzi e aqui referido como "numeração de cristal." As estruturas cristalinas dos domínios I de a1 de rato e humano revelaram uma trincheira similar.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece anticorpos de anti-VLA-1 e métodos de usar estes anticorpos para tratar uma variedade de distúrbios infla-matórios e imunológicos. Especificamente, a invenção abrange um anticorpo que especificamente liga ao VLA-1 (por exemplo, VLA-1 humano). Este anticorpo contém regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve ("CDRs") definidas pelos resíduos de aminoácido 24 a 33, 49 a 55 e 88 a 96 da SEQ ID NO: 1, e/ou regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada definidas pelos resíduos de aminoácido 31 a 35, 50 a 65 e 98 a 107 da SEQ ID NO: 2. Estas CDRs podem conter mutações (por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições) nas porções de contato de não-antígeno, como determinado da estrutura cristalina aqui descrita, sem afetar a atividade de ligação de VLA-1 do anticorpo. Mutações exemplares são S24N, G92S e D101A nas CDRs de cadeia leve, e G55S nas CDRs de cadeia pesada. Em uma modalidade, o anticorpo desta invenção contém uma seqüência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e/ou uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2.

Em uma modalidade relacionada, o anticorpo desta invenção contém as mesmas seqüências polipeptídicas de cadeias pesadas e leves como um anticorpo produzido pelo hibridoma mAQC2, depositado em 18 de abril de 2001 na American Type Culture Collection ("ATCC"), 10801 University Boule-vard, Manassas, VA 20110-2209 e tendo número de acesso de ATCC PTA3273. (Todos os depósitos da ATCC aqui citados foram realizados sob o Tratado de Budapeste). Este anticorpo pode ser produzido, por exemplo, por hibridoma mAQC2, ou células contendo seqüências de ácido nucléico isoladas daquele hibridoma que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo monoclonal de mAQC2.

Em outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo humanizado compreendendo pelo menos um (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) dos resíduos a seguir em sua cadeia leve: Q1, L4, P46, W47 e Y71; ou pelo menos um (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7) dos resíduos a seguir em sua cadeia pesada: D1, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (convenção de numeração de Kabat). Por exemplo, o anticorpo compreende Q1, L4 e Y71 na cadeia leve; e/ou (i) F29, A49, T93 e R94, ou (ii) A49 e T93, na cadeia pesada. O anticorpo humanizado desta invenção pode conter uma se-qüência de domínio variável de cadeia leve definida pelos resíduos de ami-noácido 1 a 106 da SEQ ID NO: 3, e/ou uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada definida pelos resíduos de aminoácido 1 a 118 da SEQ ID NO: 4. O anticorpo humanizado pode compreender as mesmas seqüências de polipeptídeos de cadeia pesada e/ou leve como um anticorpo produzido pela linhagem de células hAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3275; depositado em 18 de abril de 2001).

Em outra modalidade, o anticorpo humanizado desta invenção pode conter uma mutação (por exemplo, deleção, substituição ou adição) na uma ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) de certas posições na cadeia pesada de modo que uma função efetora do anticorpo (por exemplo, a capacidade do anticorpo para ligar a um receptor de Fc ou um fator de complemento) é alterada sem afetar a capacidade do anticorpo para ligar ao VLA-1 (Patente U. S. 5.648.260). Estas posições das cadeias pesadas incluem, sem limitação, os resíduos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 (sistema de numeração de EU). Por exemplo, o anticorpo humanizado pode conter as mutações L234A (isto é, substituindo leucina na posição 234 de um anticorpo inalterado por alanina) e L235A (sistema de numeração de EU) em sua cadeia pesada. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo compreende a mesma seqüência de polipeptídeo de cadeia pesada como um anticorpo produzido pela linhagem de células hsAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3356; depositado em 4 de maio de 2001).

Em ainda outra modalidade, o anticorpo humanizado desta invenção pode conter uma mutação (por exemplo, deleção ou substituição) em um resíduo de aminoácido que é um sítio para glicosilação, de modo que o sítio de glicosilação é eliminado. Um tal anticorpo pode ser clinicamente benéfico por ter função efetora ou outras funções indesejadas reduzidas ao mesmo tempo retendo sua afinidade de ligação ao VLA-1. Mutações de sítios de glicosilação também podem ser benéficas para o desenvolvimento do processo (por exemplo, expressão e purificação da proteína). Por exemplo, a cadeia pesada do anticorpo pode conter a mutação N297Q (sistema de numeração de EU) de modo que a cadeia pesada já não pode ser glicosila-da neste sítio. Em uma modalidade relacionada, o anticorpo humanizado pode compreender a mesma seqüência de polipeptídeo de cadeia pesada como um anticorpo produzido pela linhagem de células haAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3274; depositado em 18 de abril de 2001).

Em ainda outras modalidades, as cadeias pesadas e/ou leves do anticorpo desta invenção contêm mutações que aumentam a afinidade para ligar ao VLA-1 e assim aumentam a potência para tratar distúrbios mediados por VLA-1.

Abrangidos nesta invenção estão também uma composição contendo um anticorpo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável, um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para SEQ ID NO: 1; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para SEQ ID NO: 2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para a cadeia leve de um anticorpo produzido pelo hibridoma mAQC2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para a cadeia pesada de um anticorpo produzido pelo hibridoma mAQC2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para a cadeia leve de um anticorpo produzido pela linhagem de células hAQC2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para a cadeia pesada de um anticorpo produzido pela linhagem de células hAQC2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para a cadeia pesada de um anticorpo produzido pela linhagem de células haAQC2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para a cadeia pesada de um anticorpo produzido pela linhagem de células hsAQC2; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para os resíduos 1 a 106 da SEQ ID NO: 3; um ácido nucléico isolado contendo uma seqüência de codificação para os resíduos 1 a 118 da SEQ ID NO: 4; células do hibridoma mAQC2; células da linhagem de células hAQC2; células da linhagem de células haAQC2; e células da linhagem de células hsAQC2. A presente invenção também fornece um método de tratar um indivíduo com um distúrbio imunológico mediado por VLA-1, incluindo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um anticorpo desta invenção. Por exemplo, este método é usado para tratar um indivíduo humano para paliar, melhorar, estabilizar, inverter, prevenir, diminuir ou retardar a progressão do distúrbio. Alternativamente, este método é profilaticamente usado para tratar um indivíduo humano em risco de desenvolver este distúrbio imunológico para prevenir ou retardar o princípio do distúrbio. Uma "quantidade eficaz" da composição pode ser administrada em uma ou mais dosa-gens.

Distúrbios imunológicos mediados por VLA-1 incluem, mas não são limitados, distúrbios em que o nível de atividade de VLA-1 é elevado em um ou mais tecidos quando comparado a um indivíduo normal. Exemplos de tais distúrbios são condições relacionadas à pele (por exemplo, psoríase, eczema, queimaduras, dermatite e proliferação anormal de células do foií-culo capilar), fibrose (por exemplo, rim ou fibrose de pulmão), rinite alérgica, síndrome de angústia respiratória, asma, bronquite, tendinite, bursite, febre, dores de cabeça de enxaqueca, condições gastrintestinais (por exemplo, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, gastrite, síndrome de intestino irritável, colite e câncer coloretal), doenças vasculares (por exemplo, aterosclerose), periarterite nodosa, tireoidite, anemia aplástica, Doença de Hodgkin, febre reumática, osteoartrite, doenças auto-imunes (por exemplo, diabetes do tipo I, miastenia grave, artrite reumatóide, lúpus sistêmico eritematoso e esclerose múltipla), sarcoidose, síndrome nefrótica, insuficiên- cia renal, Síndrome de Bechet, polimiosite, gengivite, hipersensibilidade (por exemplo, hipersensibilidade do tipo tardia ou hipersensibilidade imediata), rejeições de enxertos e transplantes, doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD), conjuntivite, inchação de ocorrência pós-lesão, isquemia miocárdi-ca e síndrome de choque de endotoxina. A presente invenção também fornece um método de determinar o nível de VLA-1 em um tecido (por exemplo, espécime de tecido e fluido do corpo) compreendendo contatar o tecido (por exemplo, in vivo ou in vitro) com o anticorpo da invenção, e depois detectar a ligação do anticorpo ao tecido, assim determinando o nível de VLA-1 no tecido.

Como aqui usado, o anticorpo desta invenção pode ser, por exemplo, um anticorpo murino, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. Pode ser um anticorpo total (isto é, com duas cadeias leves de comprimento completo e duas cadeias pesadas de comprimento completo) de qualquer isótipo e subtipos (por exemplo, IgM, IgD, IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgE, IgAi e lgA2; com cadeia leve capa ou lambda). Alternativamente, o anticorpo desta invenção refere-se a um fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, Fab, F(ab')2, e cadeia simples Fv) de um anticorpo total. A presente invenção também fornece composições cristalizáveis e cristais de complexos formados por um domínio I de a1 quimérico de rato-humano (mutante RAH) e um fragmento de Fab de hAQC2, e métodos para usar tais composições e cristais. Esta invenção também fornece as coordenadas da estrutura e os sítios de ligação do domínio quimérico e do fragmento de Fab de hAQC2. As coordenadas atômicas derivadas da estrutura cristalina aqui descrita fornecem uma base estrutural para as atividades biológicas de hAQC2 como também uma base para o modelo racional de agonistas ou antagonistas de VLA-1 com atividades biológicas prognosticadas (por exemplo, compostos de moléculas pequenas ou anticorpos como variantes de hAQC2). A estrutura cristalina aqui descrita é a primeira estrutura cristalina de um domínio I de oc1 de um complexo de integrina αΙβΙ/Fab. Esta estrutura mostra os resíduos críticos para a ligação de Fab pelo domínio I de α1. Além disso, o Fab liga no sítio de ligação putativo do colágeno e inibe a ligação do colágeno. Resíduos de aminoácido encontrados no sítio de ligação no domínio I de a1 incluem Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Glu218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal). Resíduos no fragmento de Fab encontrados para ligar ao domínio I de a1 incluem resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 e Asp101 (numeração de cristal).

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de um complexo molecular onde o complexo molecular é definido pelo conjunto de coordenadas da estrutura de um complexo de um domínio I quimérico de uma integrina α1β1 RAH e anticorpo humanizado hAQC2, de acordo com a Figura 19; ou um homólogo do complexo molecular, o homólogo que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos de não mais que 0,65 Á. O computador inclui um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina incluindo um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina onde os dados contêm pelo menos uma porção das coordenadas da estrutura do complexo de acordo com a Figura 19; uma memória operacional para armazenar instruções para o processamento dos dados legíveis por máquina; uma unidade de processamento central acoplada à memória operacional e ao meio de armazenamento de dados legíveis por máquina para o processamento dos dados legíveis por máquina nas representações tridimensionais; e uma tela acoplada à unidade de processamento central para exibir a representação tridimensional.

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular incluindo um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos de hAQC2 incluindo pelo menos sete (por exemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16) dos resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO e Asp101 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos de hAQC2 de não mais que 1,10 À. Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de: um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos de hAQC2 incluindo pelo menos sete (por exemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16) dos resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO e Asp101 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; um sítio de ligação de um homólogo que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos de hAQC2 de não mais que 1,10 Á.

Esta invenção também fornece um método para identificar um inibidor de um domínio I de uma integrina incluindo as etapas de usar as coordenadas da estrutura dos aminoácidos de hAQC2 incluindo pelo menos sete (por exemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ou 16) dos resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO e Asp101 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19 ou ± um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos de hAQC2 não mais que 1,10 Á, para gerar uma estrutura tridimensional de um sítio de ligação; empregar a estrutura tridimensional para designar ou selecionar um antagonista potencial; sintetizar o antagonista potencial; e contatar o antagonista potencial com hAQC2 para determinar a capacidade do antagonista potencial de interagir com hAQC2 onde a capacidade do antagonista potencial para interagir com hAQC2 indica que o antagonista potencial é um inibidor do domínio I. Esta invenção também fornece um inibidor do domínio I da integrina identificada por este método.

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular incluindo: um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos resíduos de aminoácido do domínio I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um segundo sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I não mais que 0,65 Â. Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de: um primeiro sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos resíduos de aminoá-cidos do domínio I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um sítio de ligação de um homólogo que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I não mais que 0,65 Á.

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular incluindo: um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos do domínio I incluindo pelo menos três dos resíduos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um segundo sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I não mais que 1,0 Á. A invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de: um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos do domínio I incluindo pelo menos três dos resíduos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um sítio de ligação de um homólogo que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I não mais que 1,0Á.

Esta invenção também fornece métodos para usar estas três representações dimensionais para projetar entidades químicas que associam com o domínio quimérico ou o fragmento de Fab de hAQC2, ou porções deste; e agem como inibidores potenciais do domínio quimérico ou do fragmento de Fab de hAQC2, ou porções deste. Esta invenção também diz respeito às composições incluindo entidades químicas, como inibidores e variantes do domínio quimérico ou variantes do fragmento de Fab de hAQC2, onde tais entidades químicas e variantes são racionalmente designadas por meio das coordenadas da estrutura do domínio quimérico ou do fragmento de Fab de hAQC2, ou sítios de ligação. A invenção também diz respeito ao uso das entidades químicas acima identificadas para tratar ou prevenir condições associadas com atividade α1β1 imprópria ou anormal em um indivíduo.

Esta invenção também fornece um método para identificar um inibidor de um domínio I de uma integrina incluindo as etapas de usar as coordenadas da estrutura dos resíduos de aminoácidos do dorriínio I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19, para gerar uma estrutura tridimensional de um sítio de ligação; empregar a estrutura tridimensional para designar ou selecionar um antagonista potencial; sintetizar o antagonista potencial; e contatar o antagonista potencial com o domínio I para determinar a capacidade do antagonista potencial de interagir com o domínio I, onde a capacidade do antagonista potencial para interagir com o domínio I indica que o antagonista potencial é um inibidor do domínio I.

Esta invenção também fornece um método para identificar um inibidor de um domínio I de uma integrina incluindo as etapas de usar as coordenadas da estrutura de pelo menos três dos aminoácidos do domínio I incluindo resíduos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19, ou ± um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I não mais que 0,65 Á, para gerar uma estrutura tridimensional de um sítio de ligação; empregar a estrutura tridimensional para designar ou selecionar um antagonista potencial; sintetizar o antagonista potencial; e contatar o antagonista potencial com o domínio I para determinar a capacidade do antagonista potencial de interagir com o domínio I da integrina, onde a capacidade do antagonista potencial para interagir com o domínio I indica que o antagonista potencial é um inibidor do domínio I. Esta invenção também fornece um inibidor do domínio I da integrina identificada por este método.

Outras características e vantagens da invenção serão evidentes da descrição detalhada a seguir, e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Integrinas de ligação ao colágeno α1β1 e α2β 1 em leucócitos ativados. (A). Análise citométrica de fluxo da expressão das integrinas a1 e α2β1 em esplenócitos IL-2-ativados (d 11). As células foram marcadas com qualquer ou com mAb de anti-a1, mAb de anti-α ou mAb de controle de não-ligação (linhas cinzas), e seguido por imunoglobulina de anti-hamster de FITO. (B) Efeito de mAbs de anti-a1 e anti-a2 na adesão de leucócitos ao colágeno. 105 esplenócitos IL-2-ativados foram tratados com os mAbs indicados durante 15 min antes da colocação em placas ou em poços revestidos de colágeno do tipo IV ou do tipo I durante 1 h a 37°C. A adesão foi calculada como ilustrado no Exemplo 1, e expressada como % de adesão relativo às células tratadas com mAb de controle. Os ensaios de adesão foram feitos em triplicata, e pelo menos três experimentos independentes foram executados. Um experimento representativo é mostrado.

Figura 2. Efeito dos mAbs de antiintegrina na fase efetora de hipersensibilidade do tipo tardia. Camundongos sensibilizados com SRBC foram injetados i.p. com os mAbs indicados 1 h antes do desafio de SRBC. Espessura da pata traseira foi medida 20 h após o desafio de antígeno, e os resultados mostrados como % de aumento na espessura da pata traseira ± SEM como ilustrado no Exemplo 2. Estes dados representam um resumo de oito experimentos com n = 79 (PBS), 68 (Ig de hamster de controle), 68 (an-ti-a1), 29 (anti-a2), 18 (anti-a1 + anti-a2), 45 (anti-a4), 18 (anti-a5), 20 (anti-a6), e 10 (anti-βΐ). Os mAbs usados foram: Ha4/8 (Ig de hamster de controle grupo 2), Ha31/8 (anti-a1), Ha1/29 (anti-a2), PS/2 (anti-a4), 5H10-27 (anti- oc5), GoH3 (anti-αθ) e ΗΜβ1-1 (anti-βΐ).

Figura 3. Efeito dos mAbs de antiintegrína na fase efetora de hipersensibilidade de contato. Camundongos sensibilizados com FITC foram injetados i.p. com os mAbs indicados 4 h antes do desafio de FITC. Espessura da orelha foi depois medida na linha da base e 24 h depois, e os resultados mostrados como % de aumento na espessura da orelha ± SEM como ilustrado no Exemplo 3. Estes dados representam um resumo de nove experimentos com n = 74 (PBS), 60 (Ig de hamster de controle), 26 (anti-ICAM-1), 44 (anti-a1), 44 (anti-a2), 38 (anti-a1 + anti-a2), 36 (anti-a4), 16 (anti-a5), 26 (anti-oc4 + anti-a5), 24 (anti-oc6), e 22 (anti-βΐ). Os mAbs de hamster usados foram: Ha4/8 (Ig de hamster de controle grupo 2), Ha31/8 (anti-oc1), Ha1/29 (anti-cx2), ΗΜβ1-1 (anti-βΐ), 3E2 (anti-ICAM-1); os mAbs de rato usados foram: R35-95 e R35-38 (lgG2a de rato de controle e lgG2b de rato, respectivamente), PS/2 (anti-oc4), 5H10-27 (anti-oc5), GoH3 (anti-oc6).

Figura 4. Respostas da hipersensibilidade de contato em camundongos deficientes de a1 comparados aos camundongos do tipo selvagem. Camundongos sensibilizados com FITC foram injetados i.p. com mAbs indicados 4 h antes do desafio de FITC. Espessura da orelha foi depois medida na linha da base e 24 h mais tarde, e os resultados mostrados como % de aumento na espessura da orelha ± SEM como ilustrado no Exemplo 4. Grupos de quatro a cinco camundongos por condição foram usados, e todos os experimentos foram executados um mínimo de três vezes. Um experimento representativo é mostrado.

Figura 5. Efeito de mAbs de anti-a1 e anti-a2 na inflamação não-específica induzida porcróton. Camundongos foram injetados i.p. com mAbs indicados 4 h antes da pintura da orelha com óleo de cróton. Espessura da orelha foi depois medida na linha da base e 24 h mais tarde, e os resultados mostrados como % de aumento na espessura da orelha ± SEM como ilustrado no Exemplo 5. Grupos de quatro a cinco camundongos por condição foram usados, e todos os experimentos foram executados um mínimo de três vezes. Um experimento representativo é mostrado.

Figura 6. Efeito de mAbs de anti-a1 e anti-a2 na artrite induzida por mAb de colágeno. Camundongos foram injetados i.p. com mAbs de anti-colágeno no d 0, seguido por LPS no dia 3. Camundongos foram injetados i.p. com mAbs indicados a cada 3Q dia iniciando no d 0. Artrite clínica foi evidente no 2-3 d seguindo injeção de LPS e continuou durante várias semanas. Cada membro foi avaliado em uma escala de 0 a 4 a cada 3g dia como ilustrado no Exemplo 6 e os resultados são expressados como a classificação artrítica média entre o d 9 e d 15 (± SEM) de todos os quatro membros. Estes dados representam um resumo de quatro experimentos com cada experimento consistindo em grupos de três a quatro camundongos por condição.

Figura 7. Efeito de mAbs de anti-a1 e anti-a2 em artrite induzida por mAb de colágeno. A. Tratamento preventivo de camundongos com ou mAb de anti-oc1 ou anti-a2 diminui a classificação artrítica. Os camundongos foram tratados com mAbs de anticolágeno no d 0, seguido por LPS no d 3. Artrite foi evidente pelo d 6 e continuou durante várias semanas. Camun-dongos foram tratados com os mAbs indicados a cada 3- dia iniciando no d 0. Cada membro foi avaliado e classificado em uma escala de 0 a 4 a cada 3g dia. Os resultados são expressados como a classificação artrítica média entre o d 9 e d 15 (± SEM) de todos os quatro membros (classificação máxima de 16). Grupos de 4 camundongos por condição foram usados; a média de 12 experimentos é mostrada. B. Camundongos deficientes de a1 têm uma classificação artrítica reduzida comparável aos camundongos do tipo selvagem tratados com mAb de anti-a1. Detalhes experimentais e classificação são esboçados como acima. Grupos de 4 camundongos por condição foram usados; a média de 2 experimentos é mostrada.

Figura 8. Desenvolvimento de artrite é retardada na ausência de linfócitos e inibição de artrite por mAb de anti-a1 ocorre na ausência de lin-fócitos. Camundongos do tipo selvagem B6.129 ou B6.129 RAG-1-deficientes foram tratados com mAbs de anticolágeno no dia 0, seguido por LPS no dia 3. Artrite foi evidente pelo dia 6 e continuou durante várias semanas. Os camundongos foram tratados com os mAbs indicados a cada 39 dia iniciando no dia 0. Cada membro foi avaliado e classificado em uma es- cala de 0 a 4 todos a cada 3o dia. Os resultados são expressados como a classificação artrítica média por membro (classificação máxima de 4). Grupos de 4 camundongos por condição foram usados.

Figura 9. Resposta à dose de inibição de mAb de anti-a1 de artrite. Camundongos de Balb/c do tipo selvagem foram tratados com mAbs de anticolágeno no dia 0, seguido por LPS no dia 3. Artrite foi evidente pelo dia 6 e continuou durante várias semanas. Os camundongos foram tratados i.p. com a dose indicada ou de mAbs de Ha4/8 (controle de isótipo) ou Ha31/8 (anti-a1) a cada 3o dia iniciando no dia 0. Cada membro foi avaliado e classificado em uma escala de 0 a 4 a cada 3o dia. Os resultados são expressados como a classificação artrítica média por membro (classificação máxima de 4). Grupos de 4 camundongos por condição foram usados.

Figura 10. Tratamento terapêutico com mAb de anti-a1 pode diminuir classificação artrítica. Camundongos de Balb/c do tipo selvagem foram tratados com mAbs de anticolágeno no dia 0, seguido por LPS no dia 3. Artrite foi evidente pelo dia 6 e continuou durante várias semanas. Os camundongos foram tratados i.p. com mAbs (250 pg) ou proteína de fusão de Ig (200 pg) a cada 3o dia iniciando no dia 4. Camundongos receberam ou mAb (controle de isótipo de Ha4/8 ou anti-a1 de Ha31/8), proteína de fusão de Ig (controle de isótipo de Ig ou TNF-R55-lg) ou uma combinação de ambos (250 ug de Ha31/8 e 200 ug de TNF-R55-lg). Cada membro foi avaliado e classificado em uma escala de 0 a 4 a cada 3o dia. Os resultados são expressados como a classificação artrítica média por membro (classificação máxima de 4). Grupos de 4 camundongos por condição foram usados.

Figura 11. Localização do Epitopo para os mAbs de bloqueio de domínio I de anti-a1. A. Seqüência de aminoácidos do domínio I de a1 de rato (superior; SEQ ID NO: 63) e de ser humano (inferior; resíduos 91-99 da SEQ ID NO: 64). Os resíduos que compreendem o motivo MIDAS (sítio de adesão dependente do íon de metal) são mostrados em negrito. Os aminoácidos humanos que substituíram os resíduos de rato correspondentes (RAH) são mostrados abaixo da seqüência de rato na região com caixas. Para clareza, a numeração dos resíduos no texto refere-se a esta figura, a menos que do contrário designado, por exemplo, como numeração de cristal. B. Concentrações crescentes de mAb AJH10 (ATCC No. PTA-3580; depositado sob o Tratado de Budapeste com a American Type Culture Collection, Ma-nassas, VA, USA, no dia 2 de agosto de 2001) foram ligadas às placas revestidas com 30 pg/ml de domínio I de a1 humano (círculos), rato (triângulos) ou de RAH (quadrados). Dados mostrados são representativos de três experimentos.

Figura 12. Seqüência de aminoácidos do domínio I de a1 humano (SEQ ID NO: 64).

Figura 13. Identificação de um mAb de bloqueio para o domínio I de α 1. A. Concentração crescentes de mAbs AEF3 (triângulos) ou AJH10 (círculos) foram ligadas às placas revestidas com 30 μg/ml de domínio I de α1. B. O domínio I de a1 foi tratado com concentrações crescentes de mAb AJH10 (losangos) ou mAb BGC5 (quadrados) ligadas às placas revestidas com colágeno IV (2 μg/ml). C. Célula de K562-a1 foi tratada com concentração crescente de mAbs AEF3 (triângulos) ou AJH10 (círculos) ligada às placas revestidas com colágeno IV (5 μg/ml). 45-50 % das células adicionadas a cada poço aderiram ao colágeno IV. Dados mostrados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 14. Reatividade cruzada de espécies dos mAbs de bloqueio analisada por separador de células ativadas por fluorescência (FACS). Células do músculo liso vascular de coelho foram incubadas com qualquer mAb AJH10 (inferior) ou controle de IgG murino (superior) e analisados pelo separador de células ativadas por fluorescência (FACS).

Figura 15. O domínio I de a1 liga ao colágeno. A. Concentrações crescentes do domínio I de a1 humano foram previamente ligadas às placas revestidas com 1 pg/ml de colágeno (quadrados) ou colágeno IV (círculos). Os valores mostrados foram corrigidos pela ligação de base para BSA. B. 2 μg/ml do domínio I de a1 humano foram misturados com concentração crescente de um anticorpo de integrina a1 anti-humano 5E8D9 (quadrados) ou um anticorpo de integrina a2 anti-humano A2IIE10 (círculos), e depois ligada às placas previamente revestidas com 1 pg/ml de colágeno IV. C. As placas foram revestidas com 1 pg/ml de colágeno IV ou 3 % de BSA. Domínio I de ct1 (2 pg/ml) foi subseqüentemente ligado às placas revestidas na presença de 1 mM Mn2+, 1 mM Mg2+ ou 5 mM EDTA. Dados mostrados são representativos de três experimentos independentes.

Figura 16. Caracterização de Formas de AQC2 Humanizadas. mAQC2 (triângulos), chAQC2 (círculos), hAQC2 (triângulos invertidos) e hAQC2' (quadrados) foram avaliados. A. Inibição de ligação de VLA-1 ao colágeno do tipo IV. B. Inibição de ligação de domínio I de a1 ao colágeno do tipo IV. C. Ligação ao domínio I de a1 imobilizado. D. Competição com mAQC2 biotinilado para ligação ao domínio I de a1 imobilizado.

Figura 17. Caracterização de formas de AQC2 humanizado por FACS.

Figura 18. Caracterização de formas AQC2 humanizado por FACS.

Figura 19. Coordenadas da estrutura atômica para o complexo de domínio I de a1/Fab, como derivado por cristalografia de raio X de cristais daquele complexo no formato do Banco de Dados de Proteína (PDB). As coordenadas dos dois complexos na unidade assimétrica são listadas como segue. Complexo 1: molécula A = domínio I da integrina molécula H = cadeia pesada de Fab de hAQC2 molécula L = cadeia leve de Fab de hAQC2 molécula M = Mn+2 Complexo 2: molécula B = domínio I da integrina molécula X = cadeia pesada de Fab de hAQC2 molécula Y = cadeia leve de Fab de hAQC2 molécula M = Mn+2 Figura 20. Complexo de domínio l-Fab. A. Diagrama de tiras do complexo de domínio l-Fab. O domínio I e a cadeia leve e pesada do anti- corpo foram marcados, respectivamente. O íon de Mn+2 é a esfera de cor branca. B. Aproximação do sítio de MIDAS (Sítio de Adesão Dependente dos íons de Metal) mostrando a coordenação do íon de metal (esfera) por Asp101 (numeração de cristal). As cadeias principais de proteína são mostradas como tiras e as cadeias secundárias na representação bola-e-bastão. Os cilindros representam interações entre o íon de metal e os átomos de proteína. As linhas finas representam ligação de H. Figura 20 foi feita com programa de software RIBBONS (Carson, 1991, J. Appl. Cryst. 24:958-961).

Figura 21. Um diagrama de um sistema usado para realizar as instruções codificadas pelo meio de armazenamento das Figuras. 22 e 23.

Figura 22. Uma seção transversal de um meio de armazenamento magnético.

Figura 23. Uma seção transversal de um meio de armazenamento de dados opticamente legíveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO É uma descoberta da presente invenção que um anticorpo para uma integrina (por exemplo, VLA-1) e fragmento desta, particularmente, uma subunidade de integrina a.1, podem bloquear a interação dos leucócitos pró-inflamatórios com componentes da matriz extracelular incluindo, mas não limitado a, colágenos, laminina e fibronectina. Esta descoberta ilustra a importância das moléculas de adesão da família de integrinas, particularmente α1β1, no ambiente do tecido periférico durante as condições relacionadas à inflamação. Ela também estende o papel da família das integrinas e fragmentos destas na inflamação além da ligação dos leucócitos e extravasação na interface endotelial realçando a importância do ambiente do tecido periférico rico em matriz às respostas imunes e revela tecidos periféricos como um novo ponto de intervenção para terapias com base em adesão.

I. ANTICORPOS DE ANTIINTEGRINA

Os métodos da presente invenção contemplam o uso de anticorpos para as integrinas onde as integrinas contempladas incluem moléculas que compreendem uma cadeia β, incluindo mas não limitado a β1, β2, β3, β4, β5, β6, β7, β8, não-covalentemente ligadas a uma cadeia, incluindo mas não limitado a al, a2, a3, a4, a5, a6, a7, a8, a9, a10, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Exemplos das várias integrinas contempladas para uso na invenção incluem, mas não são limitados: α1β1, α2β1, α3β1, α4β1, α5β1, α6β1, α7β1, α8β1, α9β1, α10β1, α\/β1, αΙ_β1, αΜβ1, αΧβ1, αϋβ1, αΙΙόβΙ, αΕβ1; α1β2, α2β2, α3β2, α4β2, α5β2, α6β2, α7β2, α8β2, α9β2, α10β2, α\/β2, αΙ_β2, αΜβ2, αΧβ2, αϋβ2, αΙΙόβ2, αΕβ2; α1β3, α2β3, α3β3, α4β3, α5β3, α6β3, α7β3, α8β3, α9β3, α10β3, α\/β3, αΙ_β3, αΜβ3, αΧβ3, αϋβ3, αΙΙόβ3, αΕβ3; α1β4, α2β4, α3β4, α4β4, α5β4, α6β4, α7β4, α8β4, α9β4, α10β4, α\/β4, αΙ_β4, αΜβ4, αΧβ4, αϋβ4, αΙΙόβ4, αΕβ4; α1β5, α2β5, α3β5, α4β5, α5β5, α6β5, α7β5, αδβδ, α9β5, α10β5, α\/βδ, α!_βδ, αΜβ5, αΧβδ, αϋβδ, αΙΙόβδ, αΕβδ; α1β6, α2β6, α3β6, α4β6, αδβ6, α6β6, α7β6, α8β6, α9β6, α10β6, ανβ6, αΙ_β6, αΜβθ, αΧβ6, αϋβθ, αΙΙόβδ, αΕβ6; α1β7, α2β7, α3β7, α4β7, αδβ7, α6β7, α7β7, α8β7, α9β7, α10β7, α\/β7, αΙ_β7, αΜβ7, αΧβ7, αϋβ7, αΙΙόβ7, αΕβ7; α1β8, α2β8, α3β8, α4β8, αδβ8, α6β8, α7β8, α8β8, α9β8, α10β8, α\/β8, αΙ_β8, αΜβδ, αΧβ8, αϋβδ, αΙΙόβδ, αΕβδ.

Os métodos da presente invenção também contemplam o uso de anticorpos para fragmentos de integrina incluindo por exemplo anticorpos para uma cadeia β sozinha, incluindo mas não limitado a, β1, β2, β3, β4, βδ, β6, β7, βδ, como também um uma cadeia α sozinha, incluindo mas não limitado a, α1, α2, α3, α4, αδ, α6, al, α8, α9, α10, aV, aL, aM, aX, aD, aE, allb. Além disso, os métodos da presente invenção também contemplam o uso de anticorpo para fragmentos de integrina incluindo por exemplo anticorpos para o domínio I da cadeia a, incluindo mas não limitado a, domínio I de α1β1 (Briesewitz et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:2989); α2β1 (Takada e Hemler, 1989, J. Cell Biol. 1109:397), αΙ_β2 (Larson et al., 1989, J. Cell Biol. 108:703), αΜβ2 (Corbi et al., 1988, J. Biol Chem 263:12403), αΧβ2 (Corbi et al., 1987, EMBO J 6:4023), αϋβ2 (Grayson et al., 1988, J. Exp Med 188:2187), αΕβ7 (Shaw et al., 1994, J Biol Chem 269:6016). Em uma moda- lidade, o determinante antigênico do domínio I de a1 inclui uma seqüência de aminoácidos de pelo menos 6 aminoácidos contíguos, em que a seqüência contígua é encontrada dentro da seqüência da Figura 12. Em uma modalidade relacionada, a seqüência contígua é Val-GIn-Arg-Gly-Gly-Arg (resíduos 91-97 da SEQ ID NO: 64.

Os métodos para produzir integrinas para o uso na presente invenção são conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Springer et al., 1990, Nature 346:425-434). Modalidades da presente invenção também incluem anticorpos de antiintegrina policlonais e monoclonais. Modalidades da presente invenção incluem um anticorpo monoclonal um anticorpo de anti-a1 monoclonal. Anticorpos para o tratamento, em particular para tratamento de ser humano, incluem anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos e fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos totais como fragmentos de anticorpo Fab, Fab', F(ab')2 e F(v). Alguns anticorpos desta invenção também podem incluir proteínas contendo uma ou mais cadeias leves e/ou cadeias pesadas de imunoglobulina, como monômeros e homo ou hetero-multímeros (por exemplo, dímeros ou tríme-ros) destas cadeias onde estas cadeias são opcionalmente ligadas por dis-sulfeto ou do contrário reticuladas. Estes anticorpos podem ser capazes de ligar um ou mais antígenos (por exemplo, α1, α2, a6 ou domínio alfa-l contendo subunidades de integrina).

Um anticorpo de bloqueio de função α1β1 como aqui usado refere-se a um anticorpo que liga ao domínio I de a1, por exemplo, resíduos 9297 da Figura 12, e bloqueia a função α1β1 como testado, por exemplo, por sua capacidade de inibir adesão K562-a1-dependente ao Colágeno IV (ver Exemplo 15). O seguinte descreve os vários métodos de produzir os anticorpos desta invenção. Métodos que são conhecidos na técnica, mas não especificamente aqui descritos também estão dentro do escopo desta invenção. Por exemplo, os anticorpos desta invenção também podem ser identificados usando bibliotecas de anticorpo exibidas por fago, como aquelas descritas em Smith, 1985, Science 228:1315-7; Patentes U. S. 5.565.332, 5.733.743, 6.291.650 e 6.303.313. Anticorpos adicionais desta invenção podem ser produzidos acoplando as cadeias pesadas aqui identificadas com uma cadeia leve não-cognata, por exemplo, uma cadeia leve identificada pela tecnologia de exibição de fago.

II. ANTICORPOS DE HIBRIDOMAS NÃO-HUMANOS

Os anticorpos monoclonais desta invenção podem ser gerados através de tecnologia bem-conhecida de hibridoma. Por exemplo, animais βτ -/- (por exemplo, camundongos, ratos ou coelhos) podem ser imunizados com preparações αΐβΊ purificadas ou brutas, células transfectadas com codificação de constructos CDNA de oti, βι ou ambos antígenos, células que constitutivamente expressam αιβι e outros. O antígeno pode ser liberado como proteína purificada, proteína expressadas em células, fragmento de proteína ou peptídeo deste, ou como DNA nu ou vetores viróticos que codificam a proteína, fragmento de proteína, ou peptídeo. Os soros dos animais imunizados são depois testados pela presença de anticorpos de anti-αιβι. Células B são isoladas de animais que testam positivo, e hibridomas são produzidos com estas células B.

Os anticorpos secretados pelos hibridomas são triados por sua capacidade de especificamente ligar ao VLA-1 (por exemplo, ligando às células ai-transfectadas e não às células de origem não-transfectadas) e por quaisquer outras características desejadas, por exemplo, tendo as sequências consensuais de CDR desejadas, inibindo (ou não inibindo no caso de não-bloqueadores) a ligação entre o colágeno e o VLA-1. Células de hibridoma que testam positivo nos ensaios de triagem são cultivadas em um meio nutriente sob condições que permitem as células segregar os anticorpos monoclonais no meio de cultura. O sobrena-dante de cultura do hibridoma condicionado é depois colhido e os anticorpos contidos no sobrenadante são purificados. Alternativamente, o anticorpo desejado pode ser produzido injetando as células de hibridoma na cavidade peritoneal de um animal não-imunizado (por exemplo, um camundongo). As células do hibridoma proliferam na cavidade peritoneal, segregando o anticorpo que acumula como fluido de áscites. O anticorpo pode ser depois co- Ihido retirando o fluido de áscites da cavidade peritoneal com uma seringa.

Os anticorpos monoclonais também podem ser gerados isolando os cDNAs de codificação do anticorpo dos hibridomas desejados, transfecci-onando as células hospedeiras mamíferas (por exemplo, células de CHO ou NSO) com os cDNAs, cultivando as células hospedeiras transfectadas e restabelecendo o anticorpo do meio de cultura.

III. ANTICORPOS QUIMÉRICOS

Os anticorpos monoclonais desta invenção também podem ser gerados criando um anticorpo de hibridoma cognato (por exemplo, murino, rato ou coelho). Por exemplo, um anticorpo cognato pode ser alterado através de tecnologia de DNA recombinante de modo que a parte ou toda das regiões da dobradiça e/ou constantes das cadeias pesadas e/ou leves é substituída pelos componentes correspondentes de um anticorpo de outras espécies (por exemplo, ser humano). Em geral, os domínios variáveis do anticorpo criado permanecem idênticos ou substancialmente para os domínios variáveis do anticorpo cognato. Um tal anticorpo criado é chamado um anticorpo quimérico e é menos antigênico que o anticorpo cognato quando administrado a um indivíduo das espécies das quais a região da dobradiça e/ou constante é derivada (por exemplo, um ser humano). Métodos de produzir anticorpos quiméricos são bem-conhecidos na técnica. Regiões constantes humanas incluem aquelas derivadas de lgG1 e lgG4.

IV. ANTICORPOS COMPLETAMENTE HUMANOS

Os anticorpos monoclonais desta invenção também incluem anticorpos completamente humanos. Eles podem ser preparados usando em esplenócitos humanos preparados in vitro, como descrito por Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147:86-95, ou usando bibliotecas de anticorpo exibidas em fago, como descrito, por exemplo, na Patente U. S. 6.300.064.

Alternativamente, anticorpos completamente humanos podem ser preparados por clonagem de repertório como descrito por Persson et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2432 2436; e Huang e Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236. Além disso, a Patente U. S. 5.798.230 (25 de agosto 25 de 1998) descreve a preparação de anticorpos monoclonais humanos de células B humanas, em que as células B humanas produtoras de anticorpo são imortalizadas através de infecção com um vírus de Epstein-Barr, ou um derivado deste, que expressa antígeno 2 nuclear de vírus de Epstein-Barr (EBNA2), uma proteína requerida para imortalização. A função de EBNA2 é subseqüentemente desativada, resultando em um aumento na produção de anticorpos.

Alguns outros métodos para produzir anticorpos completamente humanos envolvem o uso de animais não-humanos que têm loci de Ig endó-gena inativados e são transgênicos para genes de cadeia pesa e de cadeia leve de anticorpo humano não-reagido. Tais animais transgênicos podem ser imunizados com αιβι e hibridomas são depois produzidos de células B deles derivadas. Estes métodos são descritos, por exemplo, nas várias pu-blicações/patentes de GenPharm/Medarex (Paio Alto, CA) que concernem camundongos transgênicos contendo miniloci de Ig humana (por exemplo, Patente U. S. de Lonberg 5.789.650); as várias publicações/patentes de Abgenix (Fremont, CA) com respeito a XENOMICE (por exemplo, Patentes U. S. De Kucherlapati 6.075.181, 6.150.584 e 6.162.963; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; e Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15(2):146-56); e as várias publicações/patentes de Kirin (Japão) relativas aos camundongos "transômicos" (por exemplo, EP 843 961, e Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16:133-1443).

V. ANTICORPOS HUMANIZADOS

Os anticorpos monoclonais desta invenção também incluem versões humanizadas de anti-αιβι cognato, anticorpos derivados de outras espécies. Um anticorpo humanizado é um anticorpo produzido por tecnologia de DNA recombinante em que alguns ou todos os aminoácidos de uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina humana que não são requeridos para a ligação de antígeno (por exemplo, as regiões constantes e as regiões de estrutura dos domínios variáveis) são usados para substituir os aminoácidos correspondentes da cadeia leve ou pesada do anticorpo não-humano cognato. Por via de exemplo, uma versão humanizada de um anticorpo mu-rino para um antígeno dado tem em ambas suas cadeias pesadas e leves (1) regiões constantes de um anticorpo humano; (2) regiões de estrutura dos domínios variáveis de um anticorpo humano; e (3) CDRs do anticorpo muri-no. Quando necessário, podem ser alterados um ou mais resíduos nas regiões de estrutura humana para resíduos nas posições correspondentes no anticorpo murino para preservar a afinidade de ligação do anticorpo humanizado para o antígeno. Esta alteração às vezes denominada "remutação." Anticorpos humanizados em geral são menos prováveis suscitar uma resposta imune em humanos quando comparados aos anticorpos humanos quiméricos porque o anterior contém consideravelmente menos componentes não-humanos.

Os métodos para produzir anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, em Winter EP 239 400; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327 (1988); Verho-eyen et al., 1988, Science 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:10029; Patente U. S. 6.180.370; e Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3833. Em geral, a transplantação de CDRs murinas (ou outras não-humanas) em um anticorpo humano é alcançada como segue.

Os cDNAs que codificam domínios variáveis de cadeia pesada e leve são isolados de um hibridoma. As seqüências de DNA dos domínios variáveis, incluindo as CDRs, são determinadas através de seqüênciação. Os DNAs que codificam as CDRs são transferidos para as regiões correspondentes de uma seqüência de codificação de domínio variável de anticorpo humano de cadeia pesada ou leve através de mutagênese direcionada por sítio. Então os segmentos do gene da região constante humano de um isótipo desejado (por exemplo, γγ1 para CH e κ para CL) são adicionados. Os genes de cadeia pesada e leve humanizados são co-expressados em células hospedeiras mamíferas (por exemplo,células de CHO ou NSO) para produzir o anticorpo humanizado solúvel. Para facilitar a produção em grande escala de anticorpos, é frequentemente desejável produzir tais anticorpos humanizados em biorreatores contendo as células de expressão do anticorpo, ou para produzir mamíferos transgênicos (por exemplo, cabras, vacas ou ovelha) que expressam o anticorpo no leite (ver, por exemplo, Patente U. S 5.827.690). Às vezes, transferência direta das CDRs para uma estrutura humana conduz a uma perda de afinidade de ligação de antígeno do anticorpo resultante. Isto é porque em alguns anticorpos cognatos, certos ami-noácidos dentro das regiões de estrutura interagem com as CDRs e desse modo influenciam a afinidade de ligação do antígeno total do anticorpo. Em tais casos, pode ser crítico introduzir "remutações" (supra) nas regiões de estrutura do anticorpo aceptor para reter a atividade de ligação do antígeno do anticorpo cognato. O método geral de produzir remutações é conhecido na técnica. Por exemplo, Queen et al. (supra), Co et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:2869-2873 e WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) descrevem um método que envolve duas etapas fundamentais. Primeiro, as regiões de estrutura V humanas são escolhidas por análise de computador para homo-logia ideal de seqüência de proteína à estrutura da região V do anticorpo murino cognato. Depois, a estrutura terciária da região V murina é modelada através de computador para visualizar os resíduos de aminoácido da estrutura que são prováveis de interagir com as CDRs murinas, e estes resíduos de aminoácido murinos são depois sobrepostos na estrutura humana homóloga.

Sob este método de duas etapas, há vários critérios para elaborar anticorpos humanizados. O primeiro critério é usar como o aceptor humano a estrutura de uma imunoglobulina humana particular que é usualmente homóloga à imunoglobulina doadora não-humana, ou usar uma estrutura consensual de muitos anticorpos humanos. O segundo critério é usar o aminoácido doador ao invés do aceptor se o resíduo de aceptor humano for incomum e o resíduo doador for típico para seqüências humanas para um resíduo específico da estrutura. O terceiro critério é usar o resíduo de aminoácido da estrutura doadora ao invés do aceptor nas posições imediatamente adjacentes às CDRs.

Pode-se também usar um método diferente como descrito, por exemplo, em Tempest, 1991, Biotechnology 9: 266-271. Sob este método, as estruturas da região V derivadas das cadeias pesadas e leves de NEWM e REI, respectivamente, são usadas para enxertar a CDR sem introduzir o radical dos resíduos de camundongo. Uma vantagem de usar este método é que as estruturas tridimensionais das regiões variáveis de NEWM e REI são conhecidas de cristalografia de raio X e desse modo as interações específicas entre as CDRs e os resíduos da estrutura da região V podem ser facilmente modelados.

VI. OUTRAS PORÇÕES

Os anticorpos monoclonais desta invenção podem também incluir outras porções para realizar as funções desejadas. Por exemplo, os anticorpos podem incluir uma porção de toxina (por exemplo, toxóide de tétano ou ricina) ou um radionuclídeo (por exemplo, 111 In ou 90Y) para matança das células alvejadas pelos anticorpos (ver, por exemplo, Patente U. S 6.307.026). Os anticorpos podem incluir uma porção (por exemplo, biotina, porções fluorescentes, porções radioativas, marcador de histidina ou outros marcadores de peptídeo) para fácil isolamento ou detecção. Os anticorpos também podem incluir uma porção que pode prolongar sua meia vida do soro, por exemplo, uma porção de polietileno glicol (PEG), e um membro da superfamília de imunoglobulina ou fragmento desta (por exemplo, uma porção da região constante de cadeia pesada de lgG1 humana como as regiões da dobradiça, CH2 e CH3).

VII. COMPOSIÇÕES CRISTALIZÁVEIS E CRISTAIS

Esta invenção também fornece uma composição cristalizável contendo um complexo de (1) um domínio I de a1 quimérico de rato-ser humano (por exemplo, mutante RAH), ou uma porção deste (por exemplo, um polipeptídeo incluindo 135 a 336 aminoácidos do domínio I de a1 quimérico de rato-ser humano); e (2) um fragmento de Fab de hAQC2, ou uma porção deste (por exemplo, um polipeptídeo incluindo 3 a 213 aminoácidos da cadeia leve e/ou um polipeptídeo incluindo 3 a 219 aminoácidos da cadeia pesada). Um complexo exemplar é mostrado na Figura 20. O domínio I de a1 de RAH pode incluir, por exemplo, resíduos de aminoácido 145 a 336 (nu- meração de cristal) (SEQ ID NO: 59, infra) da subunidade de a1 de rato. Os fragmentos de Fab de hAQC2 podem incluir resíduos de aminoácido de cadeia leve 1 a 106 (por exemplo, 1-213) da SEQ ID NO: 3 e resíduos de aminoácido de cadeia pesada 1 a 118 (por exemplo, 1-219) da SEQ ID NO: 4. Os fragmentos de Fab de hAQC2 podem ser obtidos por digestão de papaí-na do anticorpo total ou podem ser feitos através de métodos recombinan-tes. Os fragmentos de Fab incluem pelo menos uma porção de ligação do antígeno dos domínios variáveis da cadeia leve e/ou cadeias pesadas de hAQC2.

145 TQLDIV

151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY

191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI

231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI

271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP

311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID NO: 59) Algumas composições cristalizáveis e cristais desta invenção podem conter uma molécula ou complexo molecular que são homólogos ao domínio I de oc1 e/ou o fragmento de Fab de hAQC2 através da seqüência de aminoácidos ou através da estrutura tridimensional. Exemplos de homólogos incluem, mas não são limitados: o domínio I de cc1 e/ou o fragmento de Fab de hAQC2 com mutações, como substituições conservadoras, adições, deleções ou uma combinação destas. "Substituições conservadoras" referem-se aos resíduos de substituição que são fisicamente similares em tamanho, forma, hidrofobicidade, carga e/ou propriedades químicas aos resíduos de referência correspondentes. Métodos para identificar um "aminoácido correspondente" são conhecidos na técnica e são com base na seqüência, alinhamento estrutural, sua posição funcional ou uma combinação destes quando comparados à estrutura cristalina solucionada na presente invenção. Por exemplo, os aminoácidos correspondentes podem ser identificados sobrepondo os átomos da cadeia principal dos aminoácidos no complexo de domínio I de a1/hAQC2 e um domínio I de a1 e/ou homólogo de hAQC2 usando aplicações de software bem-conhecidas, como QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA 01998, 2000). Os aminoácidos correspondentes também podem ser identificados usando programas de alinhamento de seqüência como o programa "bestfit" disponível do Genetics Computer Group, que usa o algoritmo de homologia local descrito por Smith e Waterman em Adv. Appl. Math. 2:482 (1981).

As composições cristalizáveis desta invenção podem também incluir um ou mais componentes que promovem cristalização e/ou é compatível com as condições de cristalização. Tais componentes podem incluir, mas não são limitados, tampão, sais, agentes de precipitação e outros rea-gentes. Um componente pode ser 30 % em peso/volume Polietileno Glicol 1500 (PEG1500). A presente invenção também fornece métodos de produzir cristais das composições cristalizáveis incluindo um complexo de domínio I de a1 e uma porção de ligação de antígeno de hAQC2 (por exemplo, Fab, Fab ou outros fragmentos, supra). Várias técnicas de cristalização podem ser usadas na invenção reivindicada, incluindo, mas não limitadas, difusão a vapor, diálise, microbatelada, batelada e difusão de líquido-líquido. Métodos de difusão a vapor incluem, mas também não são limitados, técnicas de gota depositante, gota pendente e gota em sanduíche. Métodos de difusão a vapor podem usar técnicas para controlar a taxa de cristalização, como a adição de óleos nas gotas ou solução do reservatório. Métodos de cristalização podem incluir misturar o agente precipitante com uma solução aquosa de um complexo de domínio I de oc1 e uma porção de ligação de antígeno de hAQC2 para produzir uma composição cristalizável. A mistura ou composição cristalizável podem ser depois cristalizada usando as várias técnicas acima listadas. A composição cristalizável desta invenção pode ser uma solução aquosa de um complexo de domínio I de a1 e uma porção de ligação de antígeno de hAQC2 contendo o complexo a uma concentração de cerca de 1 a 50 mg por ml, como uma concentração de cerca de 5 a 15 mg por ml (por exemplo, 11 mg por ml).

VIII. ESTRUTURAS CRISTALINAS E COORDENADAS DA ESTRUTURA

Esta invenção também fornece a estrutura tridimensional de um cristal incluindo um complexo de mutante RAH, e um fragmento de Fab de hAQC2 a resolução de 2,8 Á (Exemplo 24, infra). As estruturas tridimensionais de outros cristais relacionados também podem ser determinadas usando técnicas aqui descritas e aquelas conhecidas na técnica. A estrutura tridimensional deste complexo é definida por um conjunto de coordenadas da estrutura exposta na Figura 19. Estas coordenadas da estrutura são coordenadas atômicas Cartesianas derivadas das equações matemáticas relacionadas aos padrões obtidos de difração de um feixe monocromático de raios X pelos átomos ou propagando os centros do complexo cristalino do domínio I de a1 e do fragmento de Fab de hAQC2. Os dados de difração são primeiro usados para calcular um mapeamento de densidade de elétron da unidade de repetição do cristal. O mapeamento de densidade de elétron é depois usado para estabelecer as posições dos átomos individuais do complexo.

Esta invenção fornece uma molécula ou um complexo molecular definido por toda ou parte das coordenadas da estrutura de todos os amino-ácidos expostos na Figura 19, como também um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal destes aminoácidos entre 0,00 Â e 0,65 Á, como entre 0,00 Á e 0,60 Á (por exemplo, entre 0,00 Á e 0,50 Á). O termo "desvio médio quadrado de raiz" ou "desvio r.m.s." significa a raiz quadrada da média aritmética dos quadrados dos desvios da média. É um modo para expressar o desvio ou variação de uma tendência ou objeto. Para propósitos desta invenção, o "desvio médio quadrada de raiz" ou "desvio posicionai r.m.s." define a variação na coluna vertebral de uma proteína da porção pertinente da coluna vertebral do polipeptídeo como definido pelas coordenadas da estrutura aqui descritas.

Uma molécula ou um complexo molecular desta invenção também pode incluir um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura de pelo menos sete aminoácidos do fragmento de Fab de hAQC2 selecionado do grupo incluindo os resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO e Asp101 (numeração de cristal) de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal de um ou mais destes ami-noácidos entre 0,00 Á e 1,10 Á, como entre 0,00 Á e 1,00 Á (por exemplo, entre 0,00 Á e 0,50 Á). O termo "sítio de ligação" como aqui usado, refere-se a uma região de uma molécula ou complexo molecular que, como resultado de sua forma e carga, favoravelmente se associa a outra entidade química. O termo "sítio11 inclui, mas não é limitado, trincheira, fenda, canal ou bolsa. Por exemplo, sítios de ligação no domínio I de cc1 podem incluir um sítio de ligação de colágeno (Emsley et al., 1997, supra), um sítio de ligação de anticorpo e um sítio de ligação alostético (ou IDAS) (Huth et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:5231-5236). O termo "entidade química" inclui, mas não é limitado, qualquer molécula, complexo molecular, composto ou fragmento destes. O termo "associar-se a" refere-se a uma associação ou ligação em uma condição de proximidade entre uma entidade química, ou porções desta, e uma bolsa de ligação ou sítio de ligação em uma proteína. A associação pode ser não-covalente - onde a justaposição é energicamente favorecida por ligação de hidrogênio ou van der Waals ou interações ele-trostáticas - ou pode ser covalente.

Uma molécula ou complexo molecular desta invenção pode incluir um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura de aminoá-cidos do domínio I de a1 selecionados do grupo que consiste em resíduos Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19, ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I de a1 entre 0,00 Á e 0,92 Á.

Uma molécula ou complexo molecular desta invenção também pode incluir um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura de aminoácidos do domínio I de a1 selecionados do grupo que consiste em re- síduos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I de a1 entre 0,00 Á e 0,30 Á.

Aqueles versados na técnica entenderão que um conjunto de coordenadas da estrutura para um polipeptídeo é um conjunto relativo de pontos que definem uma forma em três dimensões. Desse modo, é possível que um conjunto completamente diferente de coordenadas que definem uma forma similar ou idêntica possa ser gerado usando manipulações matemáticas das coordenadas da estrutura na Figura 19. Por exemplo, as coordenadas da estrutura podem ser manipuladas por permutações cristalográficas das coordenadas da estrutura, fracionalização das coordenadas da estrutura, adições ou subtrações de número inteiro para os conjuntos das coordenadas da estrutura, inversão das coordenadas da estrutura, ou qualquer combinação destes. Além disso, variações suaves nas coordenadas individuais terão pequeno efeito em forma geral.

Alternativamente, a modificação na estrutura cristalina devido às mutações, como adições, substituições e/ou deleções de aminoácidos, ou outras alterações em quaisquer dos componentes de polipeptídeo (por exemplo, um fragmento de Fab de hAQC2 ou um domínio I de a1) que compõem o cristal, pode ser considerada também para variações nas coordenadas da estrutura. Se tais variações estiverem dentro de um erro padrão aceitável quando comparadas às coordenadas originais, é considerado que a forma tridimensional resultante é igual à do cristal inalterado. É, portanto, necessário determinar se uma entidade é suficientemente similar a toda ou partes da estrutura aqui descrita para ser considerada a mesma. Tais análises podem ser realizadas usando aplicativos de software atuais, como QUANTA (Accelrys, Inc., e Moleculars Simulations, Inc., San Diego, CA ©1998, 2000) e O (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47:110-119), e Guias do Usuário anexados. O aplicativo de Similaridade Molecular de QUANTA e o aplicativo de LSQ de O permitem comparações entre as estruturas diferentes, conformações diferentes da mesma estrutura e partes diferentes da mesma estrutura. O procedimento geral usado em ambos os aplicativos é introduzir as estruturas a serem comparadas, definir as posições atômicas equivalentes nestas estruturas, executar uma operação de ajuste e analisar os resultados.

Quando cada estrutura for inserida no aplicativo, é dado um nome e identificado como a estrutura fixa ou umas estruturas móveis. Equivalência atômica é usualmente definida através de átomos equivalentes como átomos da cadeia principal da proteína (N, Ca, C e O) para todos os resíduos conservados entre as duas estruturas a serem comparadas. A estrutura móvel é transladada e girada para obter um ajuste de quadrados ótimo ou mínimo com a estrutura fixa. A diferença do quadrado médio de raiz do ajuste nos pares especificados de átomo equivalentes é informada através de ambos os programas em angstrõms.

Para o propósito desta invenção, qualquer complexo molecular que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos resíduos conservados (N, Ca, C, O) entre 0,00 Á e 1.50 À, como entre 0,00 Â e 1,00 À (por exemplo, entre 0,00 Á e 0,50 Â), quando sobreposto nos átomos da cadeia principal pertinente descritos pelas coordenadas da estrutura listadas na Figura 19 é considerado idêntico.

IX. DETERMINAÇÃO DE OUTRAS ESTRUTURAS DE CRISTAL

As coordenadas da estrutura exposta na Figura 19 podem também ser usadas para ajudar a obter a informação estrutural sobre a outra entidade molecular cristalizada, como outras substituições de aminoácido contendo hAQC2 em uma de suas CDRs. Isto pode ser alcançado por qualquer técnica bem-conhecida, incluindo substituição molecular, um método especialmente útil para determinar as estruturas de mutantes e homólogos do domínio I de a1/Fab.

As coordenadas da estrutura exposta na Figura 19 também podem ser usadas para determinar pelo menos uma porção da estrutura tridimensional das entidades moleculares contendo pelo menos algumas características estruturais similares a pelo menos uma porção do domínio I de a1 ou do Fab de hAQC2. Portanto, outra modalidade desta invenção fornece um método de utilizar substituição molecular para obter informação estrutural sobre uma molécula cristalizada ou complexo molecular com estrutura desconhecida incluindo as etapas de (a) gerar um padrão de difração de raio X da molécula cristalizada ou complexo molecular; e (b) aplicar pelo menos uma porção das coordenadas da estrutura exposta na Figura 19 ao padrão de difração de raio X para gerar um mapeamento de densidade de elétron tridimensional da molécula ou complexo molecular com estrutura desconhecida.

Usando substituição molecular, toda ou parte das coordenadas da estrutura exposta na Figura 19 pode ser usada para determinar a estrutura desconhecida de uma entidade molecular cristalizada mais rápida e eficazmente que tentando determinar tal informação ab initio. A substituição molecular fornece uma estimação precisa das fases para uma estrutura desconhecida. As fases são um fator em equações usadas para solucionar as estruturas cristalinas que não podem ser determinadas diretamente. Os valores precisos para obter as fases, por métodos diferentes de substituição molecular, podem freqüentemente ser um processo demorado que envolve ciclos iterativos de aproximações e refinamentos e grandemente impede a solução das estruturas cristalinas. Porém, quando a estrutura cristalina de uma proteína contendo pelo menos uma porção homóloga foi solucionada, as fases da estrutura conhecida podem freqüentemente fornecer uma estimativa satisfatória das fases para a estrutura desconhecida.

Desse modo, a substituição molecular envolve gerar um modelo preliminar de uma molécula ou complexo molecular cujas coordenadas da estrutura são desconhecidas, orientar e posicionar a porção pertinente do complexo de acordo com a Figura 19 dentro da célula de unidade do cristal da molécula desconhecida ou complexo molecular, para melhor responder ao padrão de difração de raio X observado do cristal da molécula ou complexo molecular cuja estrutura é desconhecida. As fases podem ser depois calculadas deste modelo e combinadas com as amplitudes de difração de raio X padrão observadas para gerar um mapeamento de densidade de elé- tron da estrutura cujas coordenadas são desconhecidas. Este, por sua vez, pode ser submetido a quaisquer técnicas de construção de modelo e refinamento da estrutura bem-conhecidas para fornecer uma estrutura precisa final da molécula ou complexo molecular cristalizado desconhecido (Lattman, 1985, Meth. Enzymol. 115:55-77; Rossmann, ed., "The Molecular Replacement Method", Int. Sei. Rev. Ser., Ne 13, Gordon & Breach, Nova Iorque, 1972). A estrutura de qualquer porção de qualquer molécula ou complexo molecular cristalizado que é suficientemente homóloga a qualquer porção do domínio I de a1 e/ou do fragmento de Fab de hAQC2 (de acordo com a Figura 19) pode ser solucionada por este método.

X. COMPUTADOR E MEIO DE ARMAZENAMENTO

Para usar as coordenadas da estrutura desta invenção, por exemplo, aquela exposta na Figura 19, é usualmente necessário converter as coordenadas em uma representação ou forma tridimensional. Programas de software de gráfico comercialmente disponíveis incluindo, mas não limitado, O (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47:110-119) e INSIGHTII (© Accel-rys, Inc., e Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA) são capazes de gerar representações tridimensionais de moléculas ou complexos moleculares, ou porções destes, de um conjunto de coordenadas da estrutura.

De acordo com a presente invenção, as coordenadas da estrutura das entidades moleculares desta invenção são armazenadas em um meio de armazenamento legível por máquina (por exemplo, um computador). Usando um computador e software apropriados, tais dados podem ser usados para uma variedade de propósitos, como descoberta de droga e análise cristalográfica de raio X de outros cristais de proteína.

Conseqüentemente, um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina pode incluir um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina incluindo pelo menos uma porção das coordenadas da estrutura exposta na Figura 19. O computador pode também incluir instruções para produzir representações tridimensionais dos complexos moleculares de domínio I de a1 e do fragmento de Fab de hAQC2 através de processamento dos dados legíveis por máquina desta invenção. O computador desta invenção também pode incluir uma exibição, uma interface gráfica para exibir, ou um dispositivo de entrada para mover e manipular a representação gráfica tridimensional das coordenadas da estrutura.

Esta invenção também fornece um computador para determinar pelo menos uma porção das coordenadas da estrutura correspondendo aos dados de difração de raio X obtidos de um complexo molecular de uma inte-grina α1β1 e do fragmento de Fab do anticorpo hAQC2, onde o computador inclui um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina incluindo um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina onde os dados incluem pelo menos uma porção das coordenadas da estrutura do complexo molecular de um domínio I de oc1 e do fragmento de Fab de hAQC2 de acordo com a Figura 19, ou dados de difração de raio X obtidos do complexo molecular cristalino. O computador também inclui instruções para executar uma transformação de Fourier dos dados das coordenadas legíveis por máquina, e instruções para processamento destes dados de difração legíveis por máquina para as coordenadas da estrutura. Este computador pode também incluir: uma memória operacional para armazenar instruções para processamento dos dados legíveis por máquina; uma unidade de processamento central acoplada à memória operacional e aos dados legíveis por máquina; e opcionalmente uma interface gráfica ou exibição acoplada à unidade de processamento central para exibir a representação gráfica tridimensional das coordenadas da estrutura da molécula ou complexo molecular.

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou um complexo molecular definido por pelo menos uma porção ou todas das coordenadas da estrutura de todos os aminoácidos do domínio I de a1 e do fragmento de Fab de hAQC2 exposta na Figura 19, ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos dentre 0,00 Á e 1,50 Á, como entre 0,00 Á e 1,00 Á, (por exemplo, entre 0,00 Á e 0,50 Á). Também nesta invenção, o computador inclui: um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina incluindo um material de armazenamento de dados codificado com os dados legíveis por máquina onde os dados incluem pelo menos uma porção ou todas as coordenadas da estrutura de todos os aminoácidos do domínio I de a1 e do fragmento de Fab de hAQC2 exposta na Figura 19.

Um computador desta invenção também pode produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular, incluindo um sítio de ligação. O sítio de ligação pode ser definido pelas coordenadas da estrutura de pelo menos sete aminoácidos do fragmento de Fab de hAQC2 selecionado do grupo incluindo resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, GlylOO e Asp101 (numeração de cristal) de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal do pelo menos um aminoácido do fragmento de Fab de hAQC2 dentre 0,00 À e 1,10 Á, como entre 0,00 Á e 1,00 Â, (por exemplo, entre 0,00 Á e 0,50 Á). Também, o computador desta invenção inclui: um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina incluindo um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina, onde os dados incluem as coordenadas da estrutura de pelo menos sete aminoácidos do fragmento de Fab de hAQC2 selecionados do grupo que consiste em resíduos da cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 e Trp95, e resíduos da cadeia pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 e Asp101 (numeração de cristal) de acordo com a Figura 19.

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular incluindo um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura de aminoácidos do domínio I selecionados do grupo que consiste em resíduos Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular, onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I entre 0,00 À e 0,92 Á. Também nesta invenção, o computador inclui: um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina incluindo um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina, onde os dados incluem as coordenadas da estrutura dos aminoácidos do domínio I selecionados do grupo que consiste em resíduos Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19.

Esta invenção também fornece um computador para produzir uma representação tridimensional de uma molécula ou complexo molecular incluindo um sítio de ligação definido pelas coordenadas da estrutura dos aminoácidos do domínio I selecionados do grupo que consiste em resíduos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19; ou um homólogo da molécula ou complexo molecular onde o homólogo inclui um sítio de ligação que tem um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos aminoácidos do domínio I entre 0,00 Á e 0,30 Á. Também nesta invenção o computador inclui: um meio de armazenamento de dados legíveis por máquina incluindo um material de armazenamento de dados codificado com dados legíveis por máquina onde os dados incluem as coordenadas da estrutura de aminoácidos do domínio I selecionados do grupo que consiste em resíduos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal), de acordo com a Figura 19.

Figura 21 demonstra uma tal modalidade. Sistema 10 inclui um computador 11 incluindo uma unidade de processamento central (''CPU") 20, uma memória operacional 22 que pode ser, por exemplo, RAM (memória de acesso aleatório) ou memória "central", memória de armazenamento de massa 24 (como um ou mais "drives" de disco ou fita ou "drives" de CD-ROM ou DVD-ROM), um ou mais terminais de exibição de tubo de raios cá-todos ("CRT") 26, um ou mais teclados 28, uma ou mais linhas de entrada 30 e uma ou mais linhas de saída 40 todos destes são interconectados por um barramento de sistema bidirecional convencional 50.

Hardware de entrada 36, acoplado ao computador 11 através das linhas de entrada 30, pode ser implementado em uma variedade de modos. Os dados legíveis por máquina desta invenção podem ser introduzidos por meio do uso de um modem ou modens 32 conectados por uma linha telefônica ou linha de dados dedicados 34. Alternativa ou adicionalmente, o hardware de entrada 36 pode incluir "drives" de CD-ROM ou DVD-ROM ou "drives" de fita ou disco 24. Junto com o terminal de exibição 26, teclado 28 também pode ser usado como um dispositivo de entrada. O hardware de entrada 46, acoplado ao computador 11 através de linhas de saída 40, pode ser implementado similarmente através de dispositivos convencionais. Por via de exemplo, o hardware de saída 46 pode incluir terminal de exibição de CRT 26 para exibir uma representação gráfica de um sítio de ligação desta invenção usando um programa, tal como QUANTA como aqui descrito. Hardware de saída também pode incluir uma impressora 42, de forma que saída de cópia rígida possa ser produzida, ou um "drive" de disco 24, para armazenar a saída do sistema para uso posterior.

Em operação, a CPU 20 coordena o uso dos vários dispositivos de entrada e de saída 36, 46, coordena os acessos dos dados de memória de massa 24 e acessos para e da memória operacional 22 e determina a seqüência de etapas do processamento de dados. Vários programas podem ser usados para processar os dados legíveis por máquina desta invenção. Tais programas são debatidos em referência aos métodos computacionais de descoberta de droga como aqui descritos. Referências específicas para componentes do sistema de hardware 10 são incluídas à medida que apropriado ao longo da descrição a seguir do meio de armazenamento de dados.

Figura 22 mostra um corte transversal de um meio magnético de armazenamento de dados 100 que pode ser codificado com dados legíveis por máquina que podem ser realizados por um sistema como sistema 10 da Figura 21. O meio 100 pode ser um disquete flexível convencional ou disco rígido, embora tendo um substrato adequado 101, que pode ser convencional, e um revestimento adequado 102, que pode ser convencional, em um ou ambos os lados, contendo domínios magnéticos (não visíveis) cuja polaridade ou orientação pode ser alterada magneticamente. O meio 100 também pode ter uma abertura (não-mostrada) para receber o pino de um "drive" de disco ou outro dispositivo de armazenamento de dados 24.

Os domínios magnéticos de revestimento 102 do meio 100 são polarizados ou orientados para codificar de maneira que pode ser convencional, dados legíveis por máquina como aqueles aqui descritos, para execução por um sistema como sistema 10 da Figura 21.

Figura 23 mostra um corte transversal de um meio de armazenamento de dados opticamente legível 110 que também pode ser codificado com tais dados legíveis por máquina, ou um conjunto de instruções que pode ser realizado por um sistema como sistema 10 da Figura 21. O meio 110 pode ser uma memória exclusiva de leitura de disco compacto convencional ou DVD (CD-ROM ou DVD-ROM) ou um meio regravável, como um disco magneto-óptico que é opticamente legível e magneto-opticamente gra-vável. O meio 100 tem um substrato adequado 111, que pode ser convencional, e um revestimento adequado 112, que pode ser convencional, usualmente de um lado do substrato 111.

No caso de CD-ROM, como é bem-conhecido, o revestimento 112 é refletivo e é impresso com uma pluralidade de cavidades 113 para codificar os dados legíveis por máquina. O arranjo de cavidades é lido refletindo a luz a laser para fora da superfície de revestimento 112. Um revestimento protetor 114 que é substancialmente transparente, é fornecido em cima do revestimento 112.

No caso de um disco magneto-óptico, como é bem-conhecido, o revestimento 112 não tem nenhuma cavidade 113, mas tem uma pluralidade de domínios magnéticos cuja polaridade ou orientação pode ser mudada magneticamente quando aquecida acima de uma certa temperatura, como por um laser (não-mostrado). A orientação dos domínios pode ser lida medindo a polarização de luz a laser refletida do revestimento 112. O arranjo dos domínios codifica os dados como acima descrito.

XI. PLANO DE DROGA RACIONAL A presente invenção permite o uso de técnicas com base na estrutura e em plano de droga racional para projetar, selecionar e sintetizar ou isolar entidades químicas, como inibidores do um domínio I de a1 e melhorar os inibidores conhecidos deste domínio. Estes inibidores podem ser capazes de bloquear o sítio de ligação de colágeno de VLA-1. Esta invenção também permite o uso de técnicas com base na estrutura e de modelo de droga racional para projetar variantes que podem agir como inibidores de ligação de colágeno. A representação tridimensional desta invenção pode ser usada experimental ou computacionalmente para projetar inibidores potenciais, outras entidades químicas, variantes do fragmento de Fab ou combinações de entidades químicas que podem ligar e podem realizar as funções biológicas do fragmento de Fab de hAQC2 ou do domínio I de a1 quimérico da invenção atual.

Alguém versado na técnica pode usar um dos vários métodos de triar entidades químicas por sua capacidade de associar ao complexo do fragmento de Fab de hAQC2 ou do domínio I de oc1 quimérico da invenção atual e mais particularmente com um sítio de ligação ou do domínio I ou do fragmento de Fab. Este processo pode começar por inspeção visual, por exemplo, do sítio de ligação ou o domínio I ou o fragmento de Fab na tela de computador, baseado nas coordenadas do complexo na Figura 19. As entidades químicas selecionadas podem depois ser posicionadas em uma variedade de orientações, ou ancoradas, dentro de um sítio de ligação individual ou do domínio I ou do fragmento de Fab. Ancoragem pode ser realizada usando software como QUANTA, seguido por minimização de energia e dinâmica molecular com campos de força da mecânica molecular padrão, como CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA® 1994) e AMBER (P.A. Kollman, Universidade da Califórnia em São Francisco, ©1994). Programas de computação especializados também podem ajudar no processo de selecionar as entidades químicas. Estes incluem, interalia: 1. GRID (Goodford, P. J. 1985, J. Med. Chem. 28:849-857). GRID está disponível da Universidade de Oxford, Oxford, UK. 2. MCSS (Miranker, A. e M. Karplus, 1991, Proteins: Structure, Function, and Genetics 11:29-34). MCSS está disponível de Molecular Si-mulations, Burlington, MA. 3. AUTODOCK (Goodsell, D. S. e A. J. Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:195-202). AUTODOCK está disponível de Scripps Research Institute, La Jolla, CA. 4. DOCK (Kuntz, I. D. et al., 1982, J. Mol. Biol. 161:269-288). DOCK está disponível da Universidade da Califórnia, São Francisco, CA.

Uma vez as entidades químicas adequadas foram selecionadas, elas podem ser montadas em um único composto. A montagem pode prosseguir por inspeção visual da relação das entidades uma com a outra na imagem tridimensional exibida em uma tela de computador em relação às coordenadas da estrutura do complexo de fragmento de Fab de hAQC2 e do domínio I de a1 quimérico. Isto é seguido por construção de modelo manual usando software como Quanta ou Sybyl. O processo de avaliação acima descrito para as entidades químicas pode ser executado em uma forma similar para os compostos ou para as variantes que podem ligar o domínio I de a1.

Programas úteis para ajudar alguém de habilidade na técnica com respeito às entidades químicas individuais incluem: 1. CAVEAT (Bartlett, P. A. et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". Em "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems" e Publ. Especial, 1989, Royal Chem. Soc., 78:182-196). CAVEAT está disponível da Universidade da Califórnia, Berkeley, CA. 2. Sistemas e banco de dados 3D como MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Esta área é revisada em Martin, Y. C., 1992, J. Med. Chem. 35:2145-2154. 3. HOOK (disponível de Molecular Simulations, Burlington, MA).

Em vez de prosseguir construindo um inibidor ou composto de ligação em uma forma em etapas uma entidade química por vez, conforme acima descrito, os compostos de ligação podem ser designados como um total ou "de novo" usando ou um sítio de ligação vazio (como um sítio de ligação domínio I de a1 ou do fragmento de Fab de hAQC2) ou opcionalmente incluindo alguma(s) porção(ões) de um composto de ligação conhecido do domínio I de a1 ou o fragmento de Fab de hAQC2. Estes métodos incluem: 1. LUDI (Bohm, H. -J. 1992, J. Comp. Aid. Molec. Design 6:61-78). LUDI está disponível de Biosym Technologies, San Diego, CA. 2. LEGEND (Nishibata, Y. e A. Itai, 1991, Tetrahedron 47:8985). LEGEND está disponível de Molecular Simulations, Burlington, MA. 3. LeapFrog (disponível de Tripos Associates, St. Louis, MO).

Outras técnicas de modelagem molecular podem ser empregadas de acordo com esta invenção. Ver, por exemplo, Cohen, N. C. et al., 1990, J. Med. Chem. 33:883-894. Também ver Navia, Μ. A. e Μ. A. Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210.

Uma vez uma entidade foi designada ou foi selecionada pelos métodos acima, a eficiência com a qual aquela entidade pode ligar ao domínio I de oc1 ou o fragmento de Fab de hAQC2 pode ser testada e otimizada através de avaliação computacional. Por exemplo, um composto que foi designado ou selecionado para funcionar como um composto de ligação do domínio I de a1 pode atravessar um volume que não sobrepõe aquele ocupado pelo sítio de ligação quando ele for ligado ao domínio I de cc1 quiméri-co. Um composto de ligação eficaz do domínio I de a1 pode demonstrar uma diferença relativamente pequena em energia entre seus estados ligados e livres (isto é, uma energia de deformação pequena de ligação). Desse modo, o mais eficiente composto de ligação do domínio I de a1 deve ser designado com uma energia de deformação de ligação de não mais que cerca de 10 kcal/mol, por exemplo, de não mais que 7 kcal/mol. Os compostos de ligação do domínio I de a1 podem interagir com o domínio I de a1 em mais de uma conformação que é similar em energia de ligação geral. Naqueles casos, a energia de deformação de ligação considerada como sendo a diferença entre a energia do composto livre e a energia comum das conformações observadas quando o composto liga à proteína.

Um composto designado ou selecionado como ligando do domínio I de a1 pode ser também computacionalmente otimizado de forma que em seu estado ligado faltaria interação eletrostática repulsiva com a proteína alvo. Tais interações não-complementares (por exemplo, eletrostáticas) incluem interações de carga-carga repulsivas, dipolo-dipolo e de carga-dipolo. Especificamente, a soma de todas as interações eletrostáticas entre o composto e a proteína quando o composto está ligado ao domínio I de a1, deve fazer uma contribuição neutra ou favorável à entalpia de ligação.

Software de computador específico está disponível na técnica para avaliar a energia de deformação e interação eletrostática do composto. Exemplos de programas designados para tais usos incluem: Gaussian 92, revisão C (M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA ©1992); AMBER, versão 4.0 (P. A. Kollman, Universidade da Califórnia em São Francisco, ©1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA, ©1994); e Insight ll/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA © 1994). Por exemplo, estes programas podem ser implementados usando uma estação de trabalho Silicion Graphics. Outros sistemas de hardware e pacotes de software serão conhecidos por aqueles versados na técnica.

Uma outra técnica de plano de droga útil permitida por esta invenção é plano de droga iterativo. Plano de droga iterativo é um método para otimizar as associações entre uma proteína e um composto (cujo composto inclui um anticorpo) determinando e avaliando as estruturas tridimensionais de conjuntos sucessivos de complexos de proteína/composto. Em plano de droga iterativo, uma série de cristais é obtida de uma proteína complexada com entidades que ligam a proteína e depois a estrutura tridimensional de cada complexo molecular é solucionada. Um tal método fornece discernimento nas associações entre as proteínas e outras entidades de cada complexo. Isto é realizado selecionando as entidades químicas com atividade inibidora, obtendo os cristais destes novos complexos, solucionando a estrutura tridimensional dos complexos e comparando as associações entre os novos complexos e o complexo previamente solucionado. Associações dentro de um complexo podem ser otimizadas observando como as alterações nos componentes do complexo afetam as associações.

Em alguns casos, o modelo de droga iterativo é realizado formando complexos sucessivos e depois cristalizando cada complexo novo. Alternativamente, um cristal de proteína pré-formado é intumescido na presença de outra entidade química, assim formando um complexo e obviando a necessidade de cristalizar cada complexo individual.

XII. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

As composições farmacêuticas desta invenção contêm um ou mais antagonistas de VLA-1 da presente invenção (por exemplo, anticorpos de anti-VLA-1 e os antagonistas de VLA-1 moleculares pequenos identificados pelos métodos de plano de droga racional acima descritos), ou derivados farmaceuticamente aceitável destes. As composições podem também conter um veículo farmaceuticamente aceitável, como um adjuvante, um veículo, um tampão e um estabilizante.

As composições farmacêuticas desta invenção podem ser dadas oralmente, topicamente, intravenosamente, subcutâneamente, intraperitone-almente, intramuscularmente, intramedularmente, intra-arterialmente, intra-articularmente, intra-sinovialmente, intra-estemalmente, intratecalmente, in-tra-hepaticamente, intra-espinhalmente, intracranialmente como desejado, ou apenas localmente nos locais de inflamação ou desenvolvimento do tumor. As composições farmacêuticas desta invenção também podem ser administradas através de inalação pelo uso de, por exemplo, um nebulizador, um inalador de pó seco ou um inalador de dose medida, ou por implantação de uma bomba de infusão ou um implante de liberação sustentada biocom-pátivel no indivíduo.

As composições farmacêuticas podem ser na forma de uma preparação injetável estéril, por exemplo uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com as técnicas conhecidas na técnica usando agentes dispersantes, umectantes e de suspensão adequados. Se dadas oralmente, as composições farmacêuti- cas podem ser administradas na forma de cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. Para aplicações tópicas, as composições farmacêuticas podem ser formuladas em um ungüento adequado. A dosagem e taxa de dose dos antagonistas de VLA-1 desta invenção eficaz para produzir os efeitos desejados dependerão de uma variedade de fatores, como da natureza da doença a ser tratada, do tamanho do indivíduo, do objetivo do tratamento, da composição farmacêutica específica usada e do julgamento do médico do tratamento. Níveis de dosagem dentre cerca de 0,001 e cerca de 100 mg/kg do peso do corpo por dia, por exemplo entre cerca de 0,1 e cerca de 50 mg/kg do peso do corpo por dia, do composto de ingrediente ativo são úteis. Por exemplo, um anticorpo da invenção será administrado em uma dose que varia entre cerca de 0,01 mg/kg do peso do corpo/dia de cerca de 20 mg/kg do peso do corpo/dia, por exemplo, variando entre cerca de 0,1 mg/kg do peso do corpo/dia e cerca de 10 mg/kg do peso do corpo/dia, e em intervalos a cada um a quatorze dias. Em outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 0,3 a 1 mg/kg do peso do corpo quando administrado intraperitonialmente. Em ainda outra modalidade, o anticorpo é administrado em uma dose de cerca de 5 a 12,5 mg/kg do peso do corpo quando administrado intravenosamente. Em uma modalidade, uma composição de anticorpo é administrada em uma quantidade eficaz para fornecer um nível de plasma de anticorpo de pelo menos 1 mg/ml.

XIII. CONDIÇÕES DA DOENÇA E MODELOS DE ANIMAL

Os antagonistas de VLA-1 da invenção são úteis no tratamento, incluindo prevenção, de doenças mediadas por αιβι como aquelas acima enumeradas. Os tratamentos desta invenção são eficazes em indivíduos humanos e animais afligidos com estas condições. Indivíduos animais aos quais a invenção é aplicável estendem-se a animais domésticos e de criação, ou desenvolvidos como animais de estimação ou para propósitos comerciais. Exemplos são cachorros, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos e cabras. A eficácia dos antagonistas de VLA-1 da invenção pode ser testada em vários modelos animais. Por exemplo, modelos de psoríase e artrite úteis incluem aqueles descritos em WO 00/72881. Modelos de fibrose de rim incluem aqueles descritos em WO 99/61040, o modelo de rim da sín-drome do Alport descrito em Cosgrove et al., 2000, J. Am. Path. 157:1649-1659, e o modelo de nefrite de lúpus de camundongo SNF1 descrito em Kalled et al., 2001, Lupus 10:9-22. Modelos de fibrose vascular para reste-nose incluem um modelo de lesão de balão da carótida de rato descrito em Smith et al., 1999, Circ. Res. 84:1212-1222. Modelos de fibrose pulmonar para fibrose pulmonar idiopática e fibrose pulmonar associada a escleroder-ma incluem um modelo de fibrose pulmonar induzida por bleomicina descrito em Wang et al., 1999, Thorax 54:805-812. Modelos de cirrose hepática para hepatite C - ou cirrose induzida por álcool incluem o modelo de ligação do tubo da bílis descrito em George et al., 1999, Proc. Natl. Acad Sei. USA. 96:12719-12724 e o modelo de fibrose hepática induzida por CCL4 descrito em Shi et al., 1997, Proc. Natl. Acad Sei. USA 94:10663-10668. A eficácia dos tratamentos desta invenção pode ser medida por várias ferramentas diagnosticas disponíveis, incluindo exames físicos, exames de sangue, medições de proteinúria, níveis de creatinina e liberação de creatinina, testes de função pulmonar, raios X do tórax, broncoscopia, lavagem broncoalveolar, biópsia pulmonar, níveis de nitrogênio de uréia do sangue do plasma (BUN), observação e classificação de cicatrização ou lesões fibróticas, deposição de matriz extracelular como colágeno, actina de músculo liso e fibronectina, testes de função renal, ultra-som, formação de imagem de ressonância magnética (MRI) e varredura de CT.

XIV. MÉTODOS DIAGNÓSTICOS

Os anticorpos desta invenção podem ser usados para diagnosticar condições de doença associada com níveis de expressão αιβι. Uma amostra de tecido de um indivíduo, como uma biópsia de tecido, amostra ou lavagem de fluido do corpo (por exemplo, lavagem alveolar), pode ser testada em um ensaio de captura de antígeno, ELISA, ensaio de imunoistoquími-ca, e semelhantes usando os anticorpos. Uma amostra de tecido de um indivíduo normal é usada como controle.

Prática da presente invenção empregará, a menos que do contrário indicado, técnicas convencionais de biologia celular, cultura de células, biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, química de proteína e imunologia que estão dentro da capacidade da técnica. Tais técnicas são descritas na literatura. Por exemplo, ver Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- edição (Sambrook et al., Eds.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, Ed.), 1984; Patente U. S. 4.683.195 de Mullis et al.; Nucleic Acid Hybridization, (B.D. Hames e S. J. Higgins), 1984; Transcription and Trans-lation, (B.D. Hames e S. J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, Ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymo-logy, Volumes 154 e 155 (Wu et al., Eds.), Academic Press, Nova Iorque; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller e Μ. P. Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer e Walker, Eds.), 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes l-IV (D. M. Weir e C. C. Blackwell, Eds.), 1986; Manipulating the Mouse Em-bryo, 1986. A menos que do contrário definido, todos termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém versado na técnica ao qual esta invenção refere-se. Métodos e materiais exemplares são descritos abaixo, embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos também podem ser usados na prática ou teste da presente invenção. Todas as publicações e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, controlará. Os materiais, métodos e exemplos apenas são ilustrativos e não são intencionados ser limitativos. Em todo este relatório descritivo e reivindicações, a palavra "compreende" ou variações como "compreendem" ou "compreendendo" será entendida insinuar a inclusão de um número inteiro declarado ou grupo de números inteiros mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.

Os Exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar a presente invenção, e não devem ser interpretados como limitação desta.

EXEMPLOS

REAGENTES QUÍMICOS

Isotiocianato de fluoresceína (FITC) foi comprado de Sigma Chemical Co (St. Louis, MO). Óleo de cróton foi comprado de ICN Biochemicals (Aurora, OH). Sangue de ovelha total em solução de Alsevers foi obtido de East Acres Biologicals (Southbridge, MA). Colágeno de cauda de rato do tipo I e de camundongo do tipo IV foram comprados de Collaborative Research Inc. (Bedford, MA) e Gibco (Gaithersburg, MD), respectivamente.

Camundongos fêmea de Balb/c de 6-8 semanas de idade foram comprados de Taconic (Germantown, NY) e camundongos deficientes de integrina α1β1 em uma base de Balb/c foram como anteriormente descrito (3). EXEMPLO 1 ANTICORPOS MONOCLONAIS. MAbs de bloqueio de função para antígenos murinos foram preparados em um formato livre de azida e de baixa endotoxina: Ha31/8 (anti-CD49a de hamster; integrina a1) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest. 72:367-375), Ha1/29 (anti-CD49b de hamster; integrina oc2) (β1) (Mendrick et al. 1995. Lab. Invest 72:367-375; Mendrick, D. L. e D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69:690-702), mAb de controle de hamster do grupo II Ha4/8 (anti-KLH de hamster) (Mendrick, D. L. e D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69:690-702) e PS/2 (anti-CD49d de rato; cadeia de integrina α4β1) (Miyake et al. 1991 J. Exp. Med. 173:599-607). Além disso, os mAbs de bloqueio de função a seguir para antígenos murinos foram comprados como preparações sem azi-da/de baixa endotoxina de Pharmingen (San Diego, CA): ΗΜβ1-1 (anti-CD29 de hamster; cadeia de integrina β1) (Noto et al. 1995 Int. Immunol. 7:835-842), Ha2/5 (anti-CD29 de hamster; cadeia de integrina β1) (Mendrick, D. L. e D. M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69:690-702), 3E2 (anti-CD54 de hamster, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150:655-663), 5H10-27 (anti-CD49e de rato; integrina a5) (Kinashi, T., e T. A. Springer. 1994. Blood Cells. 20:25-44), GoH3 (anti-CD49f de rato, integrina cc6) (Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383), e os mAbs de controle de isótipo de rato R35-95 (lgG2a de rato) e R35-38 (lgG2b de rato). ENSAIO DE ADESÃO.

Esplenócitos de camundongos de Balb/c foram cultivados com 20 ng/ml de IL-2 durante 7-12 d. Adesão das células para o colágeno do tipo I e do tipo IV foi como anteriormente descrito (Gotwals et al. 1996 J. Clin. Invest. 97:2469-2477). Brevemente, placas de Maxisorp de 96 cavidades (Nunc, Napierville, IL) foram revestidas com 10 pg/ml de colágeno do tipo IV ou 5 pg/ml de colágeno do tipo I e os sítios não-específicos bloqueados com 1 % de BSA. Os esplenócitos ativados com IL-2 foram marcados com 2 μΜ de BCECF [pentaacetoximetiléster de fluoresceína de 2',7'-bis(carboxietil)-5(6) carboxila] (Molecular Probes, Eugene, OR) e incubados com 10 pg/ml dos mAbs indicados durante 15 min. 105 células em 0,25 % de BSA em RPMI foram depois adicionadas às cavidades revestidas e incubadas durante 60 min a 37°C. As células não ligadas foram removidas lavando três vezes com 0,25 % de BAS em RPMI. A adesão foi quantificada usando uma leitora de placas fluorescentes CytoFIuor 2350 (Millipore, Bedford, MA). A razão de células ligadas para células introduzidas foi medida e o percentual de adesão relativo às células tratadas com mAb de controle (normalizada para 100 %) calculado. Os valores de base devido à adesão celular nas cavidades revestidas com BSA sozinho foram subtraídos.

EXPRESSÃO E BLOQUEIO FUNCIONAL DE α1β1 E α2β1 NOS LEUCÓCI-TOS ATIVADOS

Dada a representação dos leucócitos de papel fundamental em inflamação, decidiu-se testar se mAbs de anti-a1 e anti-cx2 eram capazes de bloquear a adesão dos leucócitos aos colágenos. Para obter níveis altos de expressão de leucócitos de tanto oc1 quanto a2, células T murinas foram estimuladas in vitro com IL-2 durante 7-12 d. Estas células expressaram níveis altos tanto de a1 e cc2 (Figura 1A) e ligou a cavidade a ambas superfícies revestidas com colágenos do tipo IV e do tipo I (Figura 1B). Adesão ao colágeno do tipo IV foi parcialmente inibida por mAb de anti-a1 sozinho e não foi inibida por mAb de anti-a2 sozinho. Em contraste, a adesão ao colágeno do tipo I foi completamente inibida por mAb de anti-oc2 sozinho e mAb de anti-ai mostrou apenas inibição parcial. MAb de anti-βΐ e a combinação de mAbs de anti-a1 e de anti-a2 inibiram adesão completamente aos colágenos do tipo I e IV. Tendo demonstrado que as integrinas α1β1 e α2β1 são expressadas em células T ativadas e que mAbs de anti-a1 e de a2 podem bloquear a adesão de leucócitos funcionalmente aos colágenos, usou-se este mAbs para investigar o papel in vivo destas integrinas em modelos animais de distúrbios inflamatórios. EXEMPLO 2 INIBIÇÃO DE RESPOSTAS DE DTH POR MABS DE ANTIINTEGRINA.

Respostas de hipersensibilidade do tipo tardia induzida por SRBC (DTH) foram adaptadas de um protocolo previamente publicado (Hur-trel et al., 1992, Cell. Immunol. 142:252-263). Brevemente, camundongos foram imunizados s.c. nas costas com 2 x 107 SRBC em 100 ul de PBS no d 0. Os camundongos foram desafiados no d 5 injetando 1 x 108 SRBC em 25 ul de PBS s.c na pata traseira direita. A espessura da pata traseira foi medida com um calibrador de engenheira (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) 20 h após o desafio de antígeno, e o inchaço da pata traseira calculado. Os resultados estão informados como o aumento percentual da espessura média da pata traseira ± SEM e calculado como % de aumento = [1 - (espessura da pata traseira direita 20 h após desafio de antígeno/espessura da pata traseira esquerda não injetada 20 h após o desafio de antígeno)] x 100. Para bloquear a fase efetora da resposta de DTH induzida por SRBC, mAb terapêutico ou de controle (100 ug), que foram preparados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1, foi dado i.p 1 h antes do desafio de antígeno no d 5. DTH induzida por SRBC é um modelo in vivo bem-caracterizado de inflamação, e em particular psoríase que foi usada para demonstrar a importância de uma variedade de citocinas e moléculas de adesão em inflamação (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med. 181:2259-2264, Terashita et a1., 1996, J. Immunol. 156:4638-4643). Camundongos sensibilizados com SRBC receberam mAbs de antiintegrina 1 h antes do desafio de antígeno da pata traseira e inflamação foi avaliada 20 h mais tarde quando medida pela espessura da pata traseira aumentada. Camundongos tratados com PBS e Ig de hamster de controle mostraram uns 60-70 % de aumento na espessura de pata traseira 20 h após o desafio de antígeno (Figura 2). Comparado ao tratamento de Ig de hamster de controle, mAbs de anti-oc1 ou anti-a2 resultou em uma inibição de 68 % e 60 % na espessura da pata, respectivamente. A combinação de mAbs de anti-a1 e anti-a2 resultou em 71 % de inibição, demonstrando pequeno efeito aditivo em mAbs de anti-a1 ou anti-a2 sozinho. Tratamento com outros mAbs de antiintegrina também foi eficaz para inibir resposta efetora de DTH. O grau de inibição visto com os vários tratamentos de mAb foi 49 % (anti-a4), 23 % (anti-oc5) e 57 % (anti-oc6). Por fim, o bloqueio de mAb da subunidade de integrina de β1 comum (mAb HMBI-1) inibiu a resposta efetora de DTH em 67 %. EXEMPLO 3 INIBIÇÃO DE RESPOSTAS EFETORAS DE CHS POR mABS DE ANTIIN-TEGRINA.

Hipersensibilidade de contato (CHS) para FITG foi ensaiado como previamente descrito (Gaspari et al., 1991, em Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach e W. Strober, editores. John Wiley & Sons, Nova Iorque, Seção 4.2:1). Brevemente, os camundongos foram sensibilizados pintando 100 ul de 0,5 % de FITC em acetona/dibutilftalato 1:1 nas costas raspadas no d 0. 10 d depois, os animais foram desafiados aplicando 5 ul de 0,5 % de FITC sobre ambos os lados de cada orelha. A resposta de inchação da orelha foi determinada pela espessura da orelha medida com um calibrador de engenharia (Mitu-toyo/MTI, Paramus, NJ) na hora do desafio de antígeno (d 10) e 24 h depois, e os resultados informados como aumento percentual médio na espessura da orelha da linha de base ± SEM. O aumento na espessura da orelha foi calculado como % de aumento = [1 - (Espessura de orelha 24 h após desafio de espessura/Espessura da orelha na hora de desafio de antígeno)] x 100. Para bloquear a fase efetora da resposta de CHS, terapêutico ou mAb de controle (250 ug) foi dado i.p. 4 h antes do desafio de antígeno no d 10.

Os camundongos que foram sensibilizados do antígeno e submetidos ao desafio da orelha com veículo apenas (controle de veículo) ou camundongos que foram desafiados na orelha sem sensibilização anterior (controle de irritação) serviram como controles negativos (nunca excedeu a 2 % de aumento na espessura da orelha).

Dado CHS ser mecanicamente distinto de DTH e envolver células efetoras diferentes, investigou-se que efeito os mAbs de antiintegrina tiveram na fase efetora da resposta de CHS. Camundongos foram sensibilizados com hapteno usando FITC aplicado em suas costas raspadas, seguido 10 d depois com desafio de FITC para a orelha resultando em uma resposta inflamatória no próximo dia. Os camundongos sensibilizados com FITC demonstraram um aumento de 60-70 % na espessura 24 h após o desafio de antígeno (Figura 3). Consistente com os resultados publicados (Scheynius et a!., J. Immunol. 150:655-663), tratamento de mAb de anti-ICAM-1 resultou em 51 % de inibição da inchaço da orelha. Comparado ao mAb de hamster de controle, o tratamento dos camundongos com mAb de anti-oc1 ou de anti-oc2 4 h antes do desafio de antígeno resultou em 37 % e 57 % de inibição do inchaço da orelha, respectivamente (Figura 3). A combinação de mAbs de anti-a1 e de anti-oc2 resultou em inibição ligeiramente maior do inchaço da orelha (65 %). Tratamento com outros mAbs para inte-grinas β1 revelou que embora mAbs de anti-a4 e anti-a5 resultassem em nenhuma inibição de resposta efetora de CHS induzida por FITC quando comparada ao mAb de rato de controle, o tratamento com mAb de anti-a6 resultou em uma inibição de 86 % das respostas efetoras. Por fim, o bloqueio de mAb da subunidade de integrina β1 comum inibiu as respostas efetoras de CHS em 74 %. Os resultados de CHS similares foram obtidos usando cepas diferentes de camundongos (C57/BL6, 129/Sv) e um agente sensibilizante diferente (oxazolona) (dados não-mostrados). Similares aos resultados vistos no modelo de DTH induzido por SRBC, a análise histológi-ca das orelhas inflamadas revelou que a formação de edema e infiltração leucocítica foram inibidas por tratamento de mAb de anti-a1 e de anti-a2.

Consistente com a descoberta que α1β1 e α2β1 podem ser ex- pressos em esplenócitos ativados com IL-2, análise de linfonodos de ca-mundongos sensibilizados para o antígeno (FITC ou oxazolona) revelou α1β1 e α2β1 sendo expresaos exclusivamente em células T de CD4+ e CD8+ ativadas com CD44hl LFA-1hl (dados não-mostrados). Tratamento de camundongos com mAbs de anti-a1 e de anti-a2 não resultaram na deleção destas células, uma vez que os números de células T ativadas tanto no baço quanto nos linfonodos vistos em resposta à sensibilização do antígeno no modelo de CHS não foram afetados. Além disso, as células efetoras não foram funcionalmente excluídas uma vez que o tratamento prolongado de camundongos sensibilizados para o antígeno com mAbs de anti-a1 e de an-ti-a2 (d 10-16) não afeta a resposta inflamatória de camundongos desafiados com antígeno no d 20 (dados não-mostrados). EXEMPLO 4 RESPOSTAS EFETORAS DE CHS SÃO DIMINUÍDAS EM CAMUNDON-GOS DEFICIENTES DE α1 β1 Para excluir a possibilidade que o papel inibidor de α1β1 na resposta efetora de CHS mediada por FITC foi mediada por mAb, experimentos foram realizados em camundongos do tipo selvagem e deficientes de inte-grina α1β1 (Figura 4). Inibição de MAb da fase efetora em camundongos do tipo selvagem foram consistentes com os resultados anteriores, com 56 % de inibição na espessura da orelha visto com anti-a1, 56 % com anti-oc2 e 62 % com uma combinação de anti-a1 e anti-cc2. A fase efetora de CHS foi significativamente reduzida em camundongos deficientes de α1β1 não-tratados quando comparada aos camundongos do tipo selvagem não-tratados (30 % vs 71 % de aumento na espessura da orelha, respectivamente). Como esperado, o nível de inchação da orelha em camundongos deficientes de α1β1 não-tratados foi equivalente ao nível de inchação da orelha visto em camundongos do tipo selvagem tratados com mAb de anti-ai. Por fim, bloqueio com mAb de α2β1 em camundongos deficientes de α1β1 resultou em inibição apenas levemente aumentada da inchação da orelha, consistente com os resultados vistos em camundongos do tipo selvagem tratados com uma combinação de mAbs de anti-a1 e de anti-a2. EXEMPLO 5 Para também excluir a possibilidade que o efeito inibidor dos mAbs de antiintegrina vistos tanto nos modelos de DTH e de CHS de inflamação é causado por um efeito antiinflamatório geral mediado pelo mAbs de anti-a1 e de anti-oc2, o efeito destes mAbs em dermatite irritante foi estudado.

Para avaliar dermatite irritante, os camundongos foram pintados com 5 ul de 0,8 % de óleo de cróton em acetona em ambos os lados de cada orelha. Anticorpos terapêuticos ou de controle foram dados 4 h antes da aplicação do irritante. Inchação da orelha foi medido 24 h depois como descrito acima e comparada com a espessura da orelha antes da aplicação de óleo de crótón. Os resultados estão informados como percentual de aumento médio na espessura da orelha de linha de base ± SEM como acima descrito. Camundongos apenas pintados com acetona (controle de veículo) serviram como um controle negativo. 24 h depois, as orelhas de camundongos tratadas com óleo de cróton mostraram um aumento significativo na espessura da orelha (48 %), quando comparados aos camundongos que recebem o veículo apenas (acetona). A inchação da orelha tóxica causada pelo óleo de cróton não foi significativamente afetada em camundongos pré-tratados com mAbs de anti-ai ou de anti-a2 quando comparada tanto aos animais tratados com PBSE ou com mAb de controle (Figura 5). Exame histológico das orelhas tratadas com óleo de cróton não revelou nenhuma diferença nos números ou tipos de infiltrar as células ou formação de edema em camundongos tratados com mAbs de anti-a1 ou de anti-a2, como comparado aos camundongos tratados com mAg de controle ou camundongos tratados com PBS (dados não-mostrados). EXEMPLO 6 INIBIÇÃO DE ARTRITE POR α1β1 E α2β1.

Uma vez que α1β1 é bem-expresso nas células de infiltração na sinóvia de pacientes de artrite, decidiu-se examinar se os mAbs de anti-a1 ou de anti-a2 poderíam ser inibidores em um modelo acelerado da artrite previamente descrita (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoímmunity 22:137-147).

Os kits de Anticorpo de Artrogen-CIA foram comprados de Stra-tagene (La Jolla, CA) e artrite induzida usando um protocolo bem-estabelecido (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoímmunity 22:137-147). Brevemente, artrite foi induzida através de injeção i.p. de um coquetel de 4 mAbs do tipo II de anticolágeno (1 mg cada) no d 0, seguido por injeção i.p. de 50 ug de LPS no d 3. No curso do próximo 3-4 d, os camundongos desenvolveram pulsos, tornozelos e dedos inchados. mAb terapêutico ou de controle (250 ug) foi administrado i.p. 4 h antes da injeção dos mAbs de anticolágeno no d 0, e novamente 4 h antes da administração de LPS no d 3, e depois continuando a cada 3Q dia para o comprimento do experimento. Começando no d 3, camundongos foram avaliados pelo desenvolvimento de artrite. Severidade da artrite em cada membro foi classificada usando um sistema de quatro pontos. 0 = normal; 1 = vermelhidão moderada, inchação suave do tornozelo ou pulso; 2 = inchação moderada do tornozelo ou pulso; 3 = inchação severa incluindo alguns dedos, tornozelo e pé; 4 = inflamado de forma máxima.

Artrite severa em camundongos de Balb/c desenvolveu dentro de 72 h após injeção de LPS e persistiu por mais de 3 semanas. Nenhuma injeção de mAbs de anticolágeno sozinho nem LPS sozinho induziu artrite. Camundongos recebendo tratamento de mAb de controle apresentaram artrite igualmente severa que quando visto nos camundongos tratados com PBS (Figura 6). Em contraste, tratamento com mAb de anti-a1 sozinho resultou em uma redução notável (78 %) na artrite, durando o tempo do experimento. Tratamento com mAb de anti-cc2 sozinho também teve um efeito benéfico, resultando em uma diminuição de 32 % na classificação artrítica quando comparado aos camundongos de controle tratados com mAb. A combinação de mAbs de anti-a1 e de anti-a2 resultaram em um grau similar de inibição como visto com mAb de anti-oc1 sozinho. EXEMPLO 7 ANÁLISE HISTOLÓGICA DE EFEITO DE TRATAMENTO DE MAB DE AN- ΤΙ-α1 Ε ΑΝΤΙ-α2 NO INFILTRADO INFLAMATÓRIO CELULAR.

Análise histológica adicional da resposta de DTH induzida por SRBC confirmou a capacidade do tratamento de mAb de anti-a1 e anti-oc2 para modular a resposta inflamatória eliciada. Uma pata traseira não submetida ao desafio de um camundongo sensibilizado com SRBC virtualmente não mostrou nenhum infiltrado inflamatório celular quando comparada a uma pata traseira desafiada com SRBC do mesmo camundongo. Tratamento de camundongos sensibilizados com SRBC com mAbs de anti-oc1 e de anti-a2 sozinhos ou combinados grandemente reduziu o número destas células de infiltração encontradas nas patas traseiras desafiadas com SRBC quando comparados aos camundongos de controle tratados com mAb. Exame mais íntimo das células de infiltração revelou que a maioria das células é composta de neutrófilos, com alguns monócitos e linfócitos presentes, e confirmou que o tratamento de mAb de anti-a1 e anti-oc2 grandemente diminuiu os números destas células. EXEMPLO 8 DEMONSTRAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE CÉLULAS DE EXPRESSÃO DE a1 NO INFILTRADO CELULAR INFLAMATÓRIO.

Imunoistoquímica foi executada para determinar a natureza das células de infiltração mais precisamente e se elas expressam integrinas de ligação a colágeno. As células de infiltração de uma pata traseira inflamada de um camundongo sem tratar foram examinadas por expressão de uma integrina α1β1 e marcadores da linhagem de células. Integrina α1β1 foi observada ser expressa em muitos leucócitos de infiltração. Imunoistoquímica dual foi utilizada para identificar a natureza das células de infiltração e a distribuição de uma expressão cc1 β1. Usando os marcadores da linhagem celular, o infiltrado foi observado ser composto em grande parte de granulóci-to/monócitos (Mac-1+), com muitas destas células sendo neutrófilos (Gr1+), junto com um número menor de linfócitos T (CD3+). Expressão de integrina α1β1 foi encontrada entre todos os três subconjuntos de células, com a1 expressa em um subconjunto de granulócito/monócitos de Mac-1+, um subconjunto de neutrófilos de Gr1+, e na maioria dos linfócitos T CD3+ infiltran- tes. Análise de imunoistoquímica detalhada revelou que embora tratamento de mAb de anti-a1 e de anti-a2 reduziu os números de células de infiltração, nenhuma alteração na composição celular do infiltrado foi vista (dados não-mostrados). Manchação imunoistoquímica com um mAb de anti-hamster de FITC confirmou a capacidade do mAb de anti-a1 e de anti-oc2 de localizar a pata traseira inflamada (dados não-mostrados). EXEMPLO 9 INIBIÇÃO DE ARTRITE POR MABS PARA α1β1 E «2β1 E EM CAMUN-DONGOS DEFICIENTES DE cc1 Uma vez que oc1 é bem-expressa nas células de infiltração na sinóvia de pacientes com artrite, decidiu-se examinar se mAbs de anti-a1 ou de anti-a2 podem ser inibidores em um modelo acelerado de artrite previamente descrito (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). Este modelo envolve injeção de um coquetel de mAbs de anticolágeno do tipo II em camundongos, seguido depois por administração de LPS, resultando no desenvolvimento de artrite nos próximos 3-7 d. Camundongos foram dados mAb a cada 3- dia iniciando no d 0, e classificados pelo desenvolvimento de artrite a cada 3Q dia. Artrite severa desenvolveu em todos os camundongos dentro de 72 h após injeção de LPS e persistiu por mais de 3 semanas. Nenhuma injeção de mAbs de anticolágeno sozinha nem LPS sozinho induziu artrite. Camundongos recebendo tratamento de mAb de controle apresentaram artrite severa igualmente que visto nos camundongos tratados com PBS (Figura 7). Em contraste, tratamento com mAb de anti-oc1 sozinho resultou em uma redução notável (79 % e mais alto) em artrite, durando o tempo do experimento. Tratamento com mAb de anti-a2 sozinho também teve um efeito benéfico, resultando em uma diminuição de 37 % na classificação artrítica quando comparada aos camundongos de controle tratados com mAb. A combinação de mAbs de anti-a1 e de anti-a2 resultaram em um grau similar de inibição como visto com mAb de anti-a1 sozinho. Redução da classificação artrítica com tratamento de mAb de anti-a1 foi visto em todos os camundongos e compara favoravelmente com vários outros tratamentos com base em mAb para ar- trite como proteína de fusão de Ig de receptor de TNF solúvel (Mori et al., 1996, J. Immunol. 157:3178 3182), anti-Mac-l (Taylor et al., 1996, Immunology. 88:315-321), anti-cx4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23:2086-2091) e anti-ICAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Celi Immunol. 142:326-337). De acordo com os dados com base em mAb mostrando um papel importante para α1 β1 em artrite, camundongos deficientes de oc1 não tratados mostraram redução significativa na classificação artrítica quando comparados aos camundongos do tipo selvagem. EXEMPLO 10 EFEITO DE TRATAMENTO DE MAB DE ANTI-a1 NA IMUNOPATOLOGIA DE JUNTAS ARTRÍTICAS.

As juntas de camundongos artríticos do tipo selvagem (dia 8) recebendo tratamento de mAb de controle ou mAb de anti-a1 foi comparado visual e histologicamente para as juntas de um camundongo não tratado normal. Visualmente, as juntas dos camundongos de controle tratados com mAb demonstraram vermelhidão e inchação do pé inteiro incluindo dedos, enquanto camundongos tratados com mAb de anti-a1 mostraram pouco ou nenhum sinal de inflamação nas juntas ou dedos. Exame histológico mostrou alterações severas nas juntas artríticas tratadas com mAb de controle, com infiltração extensa do tecido subsinovial com células inflamatórias, aderência de células à superfície das juntas e destruição notável da cartilagem como comprovado pela perda de proteoglicano. Consistente com os relatórios anteriores (Terato et al:, 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147), a maioria das células de infiltração neste modelo é neutrófilos. Tratamento de mAb de anti-a1 dos camundongos dramaticamente reduziu a quantidade de infiltrado inflamatório e o grau de destruição da cartilagem. EXEMPLO 11 DESENVOLVIMENTO DE ARTRITE É RETARdaDO NA AUSÊNCIA DE LINFÓCITOS E INIBIÇÃO DE ARTRITE POR MAB DE ANTI-oc1 OCORRE NA AUSÊNCIA DE LINFÓCITOS.

Para determinar quais tipos de células poderíam ser importantes no modelo de artrite induzida por mAb de colágeno, comparou-se a capacidade de camundongos de B6-129 do tipo selvagem e camundongos de B6-129 deficientes de RAG-1 de desenvolver artrite (Figura 8). Deleção genética do gene de RAG-1 (gene-1 de ativação de recombinação) resulta em uma perda completa de linfócitos maduros T e B (Mombaerts et al., 1992, Cell 68:869-877). Ambos camundongos do tipo selvagem e deficientes de RAG-1 desenvolveram artrite, entretanto a cinética de indução nos camundongos deficientes de RAG-1 é significativamente mais lenta (Figura 8). Estes resultados sugerem que embora os linfócitos estavam envolvidos neste modelo de artrite, eles não são requeridos para o desenvolvimento e progressão da doença. Relatórios publicados que examinam o efeito dos ca-mundongos deficientes de RAG-1 em outros modelos de artrite também encontram aquela perda de linfócitos de T e B retardados no princípio de artrite (Planos et al., 1999, J. Immunol. 162:1018-1023). Tratamento dos camun-dongos do tipo selvagem ou deficientes de RAG-1 com mAb de anti-oc1 inibiram artrite por completo (Figura 8). Estes resultados demonstram que a eficácia de mAb de anti-a1 neste modelo não é dependente na presença dos linfócitos, e que como sugerido por experimentos anteriores (Figura 7), a eficácia de mAb de anti-a1 na prevenção da doença pode ser de sua ação em outras células expressando a1, tais como macrófagos e neutrófilos. EXEMPLO 12 RESPOSTA À DOSE DE INIBIÇÃO DE mAb DE ANTI-a1 DE ARTRITE.

Dado os efeitos notáveis de tratamento de mAb de anti-a1 na prevenção de artrite, estendeu-se estes estudos para incluir uma análise de resposta de dose (Figura 9). Doses diferentes de mAb foram administradas intraperitonealmente a cada 39 dia iniciando no dia 0. De acordo com os dados anteriores, uma dose de 250 ug de mAb de anti-oe1 resultou em prevenção quase completa de artrite. Uma dose mais baixa de 100 ug de mAb de anti-a1 foi parcialmente eficaz para prevenir artrite neste modelo, doses mais baixas não tiveram nenhum efeito discernível na classificação artrítica (Figura 9). EXEMPLO 13 TRATAMENTO TERAPÊUTICO COM mAb DE ANTI-a1 PODE DIMINUIR CLASSIFICAÇÃO ARTRÍTICA.

Dada a eficácia de mAb de anti-a1 em prevenir artrite, tentou-se tratar camundongos que estão a caminho de desenvolver a doença. Artrite foi induzida em camundongos por injeção de um coquetel de mAbs de anti-colágeno do tipo II no dia 0, seguido por administração de LPS no dia 3. Camundongos foram depois tratados com mAb de anti-a1 ou uma proteína de fusão de Ig de receptor de TNF solúvel iniciando no dia 4. Progressão de artrite foi completamente bloqueada em camundongos que recebem mAb de anti-a1 iniciando no dia 4, quando comparados aos camundongos que receberam mAb de hamster de controle iniciando no dia 4 (Figura 10). O grau de inibição visto com administração terapêutica de mAb de anti-a1 foi completo e foi igual àquele visto com tratamento preventivo de mAb de anti-oc1 (iniciado no dia 0) (Figura 10). Em comparação, tratamento com proteína de fusão de Ig de receptor de TNF do dia 4 em diante resultou em apenas uma inibição de 60-70 % na classificação artrítica quando comparada à proteína de fusão de Ig de controle (Figura 10). Tratamento combinado de mAb de anti-ai e receptor de proteína de fusão de Ig de TNF foi juntos foram eficazes em inibir completamente a classificação artrítica, que não é surpreendente dado à eficácia completa do tratamento de mAb de anti-a1 sozinho na supressão de artrite. Em resumo, estes resultados indicam que o tratamento terapêutico com mAb de anti-a1 é eficaz em inibir a classificação artrítica, e compara favoravelmente o tratamento terapêutico com um antagonista de TNF. EXEMPLO 14 CLONAGEM E MUTAGÊNESE DO DOMÍNIO I DE a1.

As seqüências do domínio I da integrina α1β1 humano e de rato foram amplificadas de cDNAs de comprimento total (Kem, et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22811-22816; Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709720) pela reação de cadeia da polimerase (PCR) (PCR CORE Kit; Boehrin-ger Mannheim, GmbH Alemanha), usando quaisquer iniciadores específicos humanos, S^CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-S' [à frente] (SEQ ID NO: 7) e 5’-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3’ [reverso] (SEQ ID NO: 8), ou iniciadores específicos de rato, 5'-CAGGATCCGTCAGTCCTACA TTTCAA-3' [à frente] (SEQ ID NO: 9) e 5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCG AATAT-3' [inverso] (SEQ ID NO: 10).

Os produtos amplificados por PCR resultantes foram purificados, ligados em pGEX4t-Í (Pharmacia) e transformados em células de DH5a competentes (Life Technologies). Colônias resistentes à ampicilina foram triadas para a expressão da proteína de fusão do domínio I de glutationa S-transferase de ~45 kDa. As sequências de inserções do DNA do plasmídeo de clones que foram selecionados para outra caracterização, foram confirmadas por seqüenciação de DNA.

Um domínio I de a1 quimérico de rato/humano (RAH) foi gerado (kit de Mutagênese MORPH; 5 iniciadores - 3 iniciadosres), permutando os resíduos de rato G92, R93, Q94 e L97 (Figura 11) para os resíduos humanos correspondentes, V, Q, R e R, respectivamente. Clones que abrigam o domínio I de RAH foram identificados pela perda de um sítio de enzima de restrição Stu 1 de diagnóstico, e as inserções confirmadas através de seqüenciação de DNA. A seqüência de aminoácidos do domínio I de a1 humano é mostrada na Figura 12. EXEMPLO 15 GERAÇÃO DE mAbS ESPECÍFICOS PARA O DOMÍNIO I DE <x1.

Anticorpos monoclonais foram provados ser sondas muito úteis estudando a relação entre estrutura e função das subunidades de integrina. Por exemplo, mAbs foram extensivamente usados para estudar regiões da subunidade β1 associada com uma conformação ativada (Qu, A., e Leahy, D. J. (1996) Structure 4, 931-942). Desse modo, para identificar as sondas potenciais para as alterações conformacionais do domínio I de ai, gerou-se um painel de mAbs para o domínio I de a1 humano. GERAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DO DOMÍNIO I DE ANTI-a1.

Camundongos Robertsonianos fêmeas (Jackson Labs) foram intraperitonialmente imunizados (i.p.) com 25 pg de α1β1 humano purificado (Edwards et al., 1995, J. Biol. Chem. 270,12635-12640; Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:8280-8) emulsificado com o adjuvante de Fruend completo (Life Technologies). Eles foram reforçados três vezes i.p. com 25 pg de α1β1 emulsificado com o adjuvante de Freunds incompleto (Life Technologies). O camundongo com a mais alta titulação do domínio I de anti-a1 foi reforçado i.p. com 100 pg de α1β1 três dias antes da fusão, e intravenosa-mente com 50 pg de α1β1 um dia antes da fusão. Células do baço foram fundidas com células do mieloma FL653 a uma razão 1:6 e foram colocadas em placas a 100.000 e 33.000 por cavidade em placas de cultura de tecido de 96 cavidade.

Os sobrenadantes foram avaliados pela ligação à integrina α1 β1 por FACS de cor simples. Antes da análise de FACS, os sobrenadantes foram incubados com células de K562 não-transfectadas para eliminar IgG que ligou somente à subunidade β. Subsequentemente, 3-5 X 104 células de K562 transfectadas com a subunidade de integrina α1 (K562-a1) suspensa em tampão de FACS (1 % de soro de bezerro fetal (FCS) em PBS contendo 0,5 % de NaN3) foram incubadas com sobrenadante durante 45 minutos a 4o C, lavadas e incubadas com conjugado de IgG de anticamundongo para fi-coeritrina. Após lavar duas vezes com tampão de FACS, as células foram analisadas em um Citômetro de Fluxo da Becton Dickinson.

Os sobrenadantes foram variados dos hibridomas resultantes para ligar ao domínio I de oc1. Brevemente, 50 pl de 30 mg/ml da fusão de domínio I de a1-GST humano em PBS foram revestidos em cavidades de uma placa de 96 cavidades (Nunc) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas com PBS, bloqueadas com 1 % de BSA em PBS e o sobrenadante do hibridoma foi incubado com o domínio I em temperatura ambiente durante 1 hora. Após lavagem extensiva com PBS contendo 0,03 % de Tween 20, IgG de anti-camundongo ligada a alcalina fosfatase (Jackson Immuno-Research) foi adicionada durante uma hora adicional. Após uma lavagem final, 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato (pNPP) em 0,1 M de glicina, 1 mM de ZnCI2 e 1 mM de MgCI, foi adicionado durante 30 minutos em temperatura ambiente, e as placas foram lidas a O.D. 405.

Os sobrenadantes selecionados foram testados por sua capacidade de inibir adesão dependente de K562-a1 ao Colágeno IV. Células de K562-a1 foram rotuladas com 2 mM de pentaacetoximetiléster 2',7'-(bis-2-carboxietil-5 e 6)-carboxifluoresceína (BCECF; Molecular Probes) em DMEM contendo 0,25 % de BSA a 37°C durante 30 minutos. As células rotuladas foram lavadas com tampão de ligação (10 mM Hepes, pH 7,4; 0,9 % de NaCI; e 2 % de glicose) e ressuspensas em tampão de ligação mais 5 mM MgCI2 a uma concentração final de 1 X 106 células/ml. 50 μΙ de sobrena-dante foram incubados com um volume igual de 2 X 105 células de K562-a1 em cavidades de uma placa de 96 cavidades. A placa foi depois centrifugada e os sobrenadantes removidos. Células foram ressuspensas em tampão de ligação e transferidas para poços de uma placa revestida com colágeno e incubadas durante 1 hora a 37° C. Seguindo incubação, as células não-aderentes foram removidas lavando três vezes com tampão de ligação. As células ligadas foram analisadas em um Cytofluor (Millipore).

Identificou-se 19 hibridomas inicialmente, os sobrenadantes destas ligações às células de K562 de leucemia humana que expressam a integrina α1β1 (Κ562-α1) e para o domínio I de oc1. As imunoglobulinas foram purificadas de cada um destes hibridomas e testadas para a capacidade de bloquear a ligação de K562-a1 ou de domínio I de a1 ao colágeno IV. Os mAbs entram em duas classes: aqueles que bloqueiam e aqueles que não bloqueiam uma função αΤβ1. Por exemplo, enquanto os mAbs produzidos pelos clones AEF3, BGC5, AGC2 e AJH10 ligam o domínio I de a1 (Figura 13A, dados não-mostrados para BGC5), apenas mAbs AJH10 e AQC2 inibem a adesão dependente de domínio I de a1 (Figura 13B; Figura 16B) ou de K562-a1 (Figura 13C; Figura 16C) ao colágeno IV.

SEQÚENCIAÇÃO DAS REGIÕES DE DETERMINAÇÃO DE COMPLEMENTARIDADE

Para estabelecer a origem clonal deste painel de mAbs, ampliou-se por PCR e seqüenciou-se as CDRs de 12 dos 19 anticorpos (dados não-mostrados). 2 pg de mRNA, isolado de 107 hibridomas (kit de isolamento de mRNA FastTrack, Invitrogen), foram transcritos reverso (kit Ready-To-Go You Prime First Strand, Pharmacia Biotech) usando 25 pM de cada um dos iniciadores ã seguir: cadeia pesada VH1FOR-2 (Michishita et al, 1993, Cell 72:857-867); cadeia leve, VK4FOR, que define quatro oligos separados (Kern et al., 1994, J. Mol. Chem. 269:22811-22816). Para cada hibridoma, foram ampliadas cadeias pesadas e leves em quatro reações de PCR separadas usando várias combinações dos oligos a seguir: 1) cadeia pesada: VHIFRIK (Kamata et al., 1995, J. of Biol. Chem 270:12531-12535), VH1BACK, VH1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), VHfr1a, VHfr1b, VHfr1e, VHfr1f, VHfr1g (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 709720) ou VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., e Arnaout, Μ. A. (1993) Cell 72, 857-867); 2) cadeia leve: VK1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), VK4FOR, oligos VK2BACK (Kern et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 22811-22816), ou V«fr1a, VHfr1c, VHfr1e, VHfr1f (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 709-720). Os produtos foram amplificados (5 minutos a 95°C, 50 ciclos de 1 minutos a 94° C, 2 minutos a 55° C, 2 minutos a 72°C e um ciclo final de 10 minutos a 72° C), purificados e gel (QIAquick, Qiagen) e diretamente seqüenciados usando vários dos oligos listados em um Seqüenciador ABI 377.

As sequências dos clones produzindo mAbs de bloqueio de função foram quase idênticas ao longo das regiões de determinação de complementaridade (CDRs) e as regiões de estrutura intervenientes sugerindo que estes hibridomas estão clonalmente relacionados. EXEMPLO 16 IMUNOMANCHAMENTO E ANÁLISE DE FACS.

As seqüências das regiões variáveis dos anticorpos de não-bloqueio eram notadamente diferentes da família clonalmente relacionada das seqüências encontradas para os anticorpo de bloqueio. Uma vez os anticorpos de bloqueio surgem para originar de um clone simples, foram escolhidos dois (AJH10 e AQC2) para também caracterizar. IMUNOMANCHAMENTO A camada de células do músculo liso dissecada da aorta da ovelha, e células K562-a1 foram extraídas com 1 % de Triton X-100 em 50 mM de Hepes, pH 7,5, 150 mM de NaCI, 10 mM de fluoreto de fenilmetilsul-fonila (PMSF), 20 pg/ml de aprotinina, 10 pg/ml de leupeptina, 10 mM de ácido de etilenodiaminotetraacético (EDTA). As amostras foram submetidas a 4-20 % de SDS-PAGE de gradiente, e eletromanchadas em membranas de nitrocelulose. As manchas foram bloqueadas com 5 % de leite seco em TBS; lavadas em TBS contendo 0,03 % de Tween-20, e incubadas com anticorpos em tampão de 0,05 % de NaN3 durante 2 horas. As manchas foram depois lavadas como antes, incubadas com peroxidase de rábano silvestre conjugado com IgG de anti-camundongo durante uma hora, lavadas novamente e depois tratadas com reagente de ECL (Amersham). As manchas foram depois expostas à membrana (Kodak) durante 30 a 60 segundos, e desenvolvidas.

Oimunomanchamento e análise de FACS (Figura 14) demonstram que AJH10 reage com integrina α1β1 humana, de coelho e de ovelha, mas não de rato, que sugere que os mAbs de bloqueio ligam a um epitopo linear evolucionariamente conservado. Os mAbs de não-bloqueio não foram nem eficientes no imunomanchamento nem reagiram com espécies diferentes de ser humano. EXEMPLO 17 LIGAÇÃO DO DOMÍNIO I DE cc1 AO COLÁGENO É DEPENDENTE DE CÁTION DIVALENTE A. PURIFICAÇÃO DOS DOMÍNIOS I DE a1 Os domínios I de a1 foram expressados em E. coli como proteínas de fusão de GST (glutationa S-transferase) contendo um sítio de cliva-gem de trombina na junção das seqüências. O sobrenadante clarificado de células lisadas em PBS foi carregado em uma coluna de glutationa Sepha-rose 4B (Pharmacia) que foi extensivamente lavada com PBS. O domínio I de a1 -proteína de fusão de GST foi eluído com 50 mM de Tris-HCI, pH 8,0, 5 mM de glutationa (reduzido). Para estudos de desnaturação, o domínio I foi clivado com trombina em 50 mM de Tris, pH 7,5 e purificados do par de fusão de GST. DTT foi adicionado a 2 mM e a amostra foi carregada em um coluna de glutationa Sepharose 4B. As frações do fluxo e lavagem foram agrupadas e carregadas em uma coluna de Q Sepharose FF (Pharmacia). O domínio I de oc1 foi eluído com 50 mM de Tris HCI, pH 7,5, 10 mM de 2-mercaptoetanol, 75 mM de NaCI. O domínio I purificado apresentou sua massa prognosticada (Lee et al. (1995) Structure 3, 1333-1340, 871 Da) através de espectrometria de massa de ionização por eletroporação (ESI-EM), migrado como uma única banda através de SDS-PAGE, e a proteína eluída como um único pico de tamanho apropriado através de cromatografia de exclusão por tamanho em uma coluna de FPLC de Superose 6 (Pharmacia).

B. ANÁLISE FUNCIONAL

Placas de 96 cavidades foram revestidas durante a noite a 4°C com 1 μg/ml de colágeno IV (Sigma) ou colágeno do Tipo I (Collaborative Biomedical), lavadas com tampão de Triton (0,1 % de Triton X-100; 1 mM de MnCl2; 25 mM de Tris-HCI; 150 mM de NaCI), e bloqueadas com 3 % de al-bumina de soro bovino (BSA) em 25 mM de Tris-HCI; 150 mM de NaCI (TBS). Diluições seriais do domínio I de a1-Proteína de fusão de GST em TBS contendo 1 mM de MnCI2 e 3 % de BSA foram incubados nas placas revestidas em temperatura ambiente durante 1 hora, e lavadas em tampão de Triton. O domínio I de a1 ligado foi detectado com adições seriais de 10 pg/ml de anticorpo policlonal de anti-GST biotinilado (Pharmacia); ExtrAvidi-na-peroxidase de rábano silvestre (Sigma) diluído 1:3000 em TBS contendo 1 mM de MnCI2 e 3 % de BSA, e ABTS de 1 Etapa (2,2'-Azino-di[sulfonato de 3-etilbenztiazolina]; Pierce). As placas foram lidas a O.D. 405 em uma leitora de microplacas (Molecular Devices). RESULTADOS.

Os domínios I de a1 humano e de rato (95 % de identidade ao humano) foram expressados em E. coli como proteínas de fusão de GST e purificados em glutationa sefarose. Ambas as proteínas foram examinadas por ligação ao colágeno I e IV usando uma variação de um ensaio com base em ELISA previamente descrito (Qu, A., e Leahy, D. J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 10277-10281). O domínio I de a1 humano liga ao colá- geno IV com eficiência melhor que ao colágeno I (Figura 15A). Um anticorpo específico para o domínio I de a1, mas não um anticorpo específico para o domínio I de a2 (Figura 15B) anulou a ligação em ambos ligandos (dados para colágeno I não-mostrados). Tanto Mn2+ quanto Mg2+ estimularam ligação, e EDTA reduziu ligação para níveis de base (Figura 15C). Não foi detectada nenhuma diferença mensurável na ligação de ligando entre os domínios I de a1 humano e de rato que sugerem que as diferenças de seqüência entre as espécies não são funcionalmente relevantes (dados não-mostrados). Desse modo, o domínio I de <x1, especifica mente, requer cátion para ligação de ligando eficiente. EXEMPLO 18 UM EPÍTOPO DEPENDENTE DE CÁTION RESIDE PERTO DO MOTIVO DE MIDAS.

Foi explorada a observação que AJH10 reconhece as seqüên-cias do domínio I de a1 humano, mas não o de rato, para mapear o epítopo para os mAbs de bloqueio de função de α1β1. As seqüências humanas e de rato diferem-se em apenas 12 aminoácidos, 4 destes ficam em um filamento de 6 aminoácidos (aa 92-97, Figura 11 A) adjacentes à treonina crítica (Figura 11 A, aa 98) dentro do motivo de MIDAS. Para testar a hipótese que os 6 resíduos de aminoácido, Val-GIn-Arg-Gly-Gly-Arg, (resíduos 91-97 da SEQ ID NO.: 64) compreendem o epítopo para os mAbs de bloqueio, construiu-se um domínio I quimérico (RAH), trocando os resíduos de rato G92, R93, Q94 e L97 pelos resíduos humanos correspondentes, V, Q, R e R, respectivamente. AJH10, junto com todos os mAbs de bloqueio de função, reconhece o domínio I quimérico (RAH; Figura 11 B).

Para orientar estes resíduos com respeito ao domínio de MIDAS na estrutura terciária do domínio I de a1, modelou-se o domínio I de a1 usando as coordenadas da estrutura de cristal do domínio I de a2.

Um modelo de homologia do domínio I de a1 humano foi construído usando a estrutura cristalina de raio X do domínio I de a2 humano (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546). O modelo foi construído usando o módulo de modelagem de homologia de Insight II (versão 2.3.5; Biosym Te- chnologies). O programa CHARMM (Clackson et al. (1991) Nature 352, 624628) foi usado com o conjunto de parâmetros de todos-hidrogênio 22 com uma constante de dielétrica dependente distante de duas vezes a distância de separação de átomo. Primeiramente, foram feitas 1000 etapas de minimi-zação descendente mais acentuada com constrangimentos posicionais harmônicos ponderados em massa de 1 kcal/(mol Á2) em todos os átomos do domínio I de a1. Esta minimização foi seguida por outras 1000 etapas de descida mais acentuada e 5000 etapas de Adopted-Basis Newton Raphson com constrangimentos de 0,1 kcal/(mol Â2) nos átomos C-α do domínio I de a1 para evitar desvios significativos da estrutura de cristal de raio X do domínio I de cc2.

As seqüências de integrina de α1 β1 e α2β1 apresentam 51 % de identidade sem inserções ou deleções, sugerindo que a estrutura geral dos dois domínios I são similares. O sítio de coordenação de metal é prognosticado ser o mesmo no domínio I de oc1 como no domínio I de a2, e os resíduos que compreendem o epitopo para os mAbs de bloqueio ficam em um laço entre a hélice a3 e a hélice a4 que contém a treonina dentro do motivo de MIDAS crítico para a ligação do cátion. O modelo de domínio I de oc1 prediz que o nitrogênio da amida do hidrogênio de Q92 (Figura 11 A) liga com o grupo carbonila de I33, o resíduo adjacente a S32. Desse modo, o laço contendo o epitopo pode representar um papel funcional na estabilização da região de MIDAS. EXEMPLO 19 O anticorpo monoclonal AQC2 (isto é, mAQC2; "m" para murino) (Exemplo 15, supra) é um IgGi, anticorpo kappa. Para identificar as seqüências de nucleotídeos que codificam as cadeias pesadas e leves deste anticorpo, RNA celular total de células murinas de AQC2 de hibridoma foram obtidas usando um kit QIAGEN RNEASY midi de acordo com as instruções do fabricante. Depois os cDNAs que codificam as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves foram clonados por RT-PCR de RNA celular total usando um Sistema de Pré-Amplificação GIBCO BRL SUPERSCRIPT para o Primeiro cDNA da Síntese do Filamento seguindo o protocolo indicado do fabricante. Hexâmeros aleatórios foram usados para o iniciador. O domínio variável de cadeia pesada de mAQC2 foi amplificado por PCR do cDNA do primeiro filamento com os iniciadores: 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCTTGG CCC C 3' (SEQ ID NO: 11) e 5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (S=C/G, M=A/C, R=A/G e W=A/T) (SEQ ID NO: 12). A PCR foi submetida a 30 ciclos usando polimerase Advantage Taq da Clontech: desnaturar 30 segundos a 94° C, recozer 1 minutos a 50° C e prolongar 1,5 minutos a 68° C. A cadeia leve de mAQC2 com sua seqüência de sinal foi ampliada por PCR usando os iniciadores: 5' ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C 3' (W=A/T) (SEQ ID NO: 13) e 5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3' (SEQ ID NO: 14). A PCR foi submetida a 30 ciclos usando Pfu polimerase clona-das de Stratagene: desnaturar 1 minutos a 94° C, recozer 1 minutos a 50° C e prolongar 2 minutos a 72° C. Os produtos de PCR foram purificados em gel para as cadeias pesadas e leves usando um kit de extração em gel Ql-AGEN QIAQUICK seguindo o protocolo indicado do fabricante. O produto de cadeia pesada purificado foi subclonado no vetor pCR2.1-TOPO TA da Invitrogen usando seu kit de clonagem TOPO TA. A cadeia leve purificada foi subclonada no vetor de pCRbluntlITOPO da Invitrogen usando seu kit de clonagem Zero blunt TOPO seguindo o protocolo indicado do fabricante. Inserções de subclones independentes múltiplos foram seqüenciadas. Com á exceção de posições degeneradas dentro dos iniciadores de PCR, as seqüências de inserção dos subclones independentes eram idênticas.

As seqüências de polipeptídeos de mAQC2 foram deduzidas de suas seqüências de codificação. A seqüência de aminoácidos N-terminais para a cadeia leve madura prognosticada pela seqüência de cDNA do produto de PCR amplificado com uma seqüência sinal exatamente combinada com a seqüência N-terminal de cadeia leve purificada de mAQC2 derivada da degradação de Edman (DVKVVESGG; SEQ ID NO: 15). Análise de BLAST das seqüências de domínio variável confirmou a identidade de sua imunoglobulina. A seqüência de polipeptídeo do domínio variável de cadeia leve de mAQC2 é mostrada abaixo: 1 QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASSSVN HMFWYQQKPK

41 SSPKPWIYLT SNLASGVPAR FSGSGSGTSY SLTISSMEAE 81 DAATYYCQQW SGNPWTFGGG TKLEIK 106 (SEQ ID NO: 1) As CDRs são mostradas em negrito. As CDRs são definidas de acordo com Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ã Edição, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. Usando o sistema de numeração de Kabat, SEQ ID NO: 1 é representada como segue, onde um hífen denota a ausência de um aminoácido: 1 QIVLTQFPAL MSASPGEKVT MTCSASS-SV NHMFWYQQKP

41 KSSPKPWIYL TSNLASGVPA RFSGSGSGTS YSLTISSMEA 81 EDAATYYCQQ WSGNPWTFGG GTKLEIK 107 A seqüência de polipeptídeo do domínio variável de cadeia pesada de mAQC2 é: 1 DVKVVESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI

41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL

81 QMSSLRSEDT AMYYCTRGFG DGGYFDVWGQ GTTVTVSS (SEQ ID NO: 2) As CDRs são mostradas em negrito. Usando o sistema de numeração de Kabat SEQ ID NO: 2 é representado como segue, onde posiciona números são numerais consecutivos a menos que do contrário indicado: 1 DVKVVESGGG LVKPGGSLKL ACAASGFSFS RYTMSWVRQI

41 PEKRLEWVAT ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNAKNTLYL

81 QM

82a-c SSL

83 RSEDTAMY YCTRGFGDGG

100a-b YF 101 DVWGQGTTVT VSS 113 Como aqui usado, os números da posição dos resíduos dos do- mínios variáveis são designados de acordo com o sistema de numeração de Kabat a menos que do contrário indicado. EXEMPLO 20 Este exemplo descreve a geração de um anticorpo quimérico murino-humano, chAQC2.

Os cDNAs codificando as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves de mAQC2 foram usados para construir vetores de expressão de chAQC2, em que as regiões variáveis de mAQC2 foram ligadas à IgG humana e às regiões constantes de kappa. A quimera de cadeia pesada foi construída como segue. Um fragmento de Pstl-BstEII de 0,33 kb do plasmídeo de cadeia pesada de mAQC2 pÁND083 foi subclonado no fragmento de vetor Pstl-BstEII de 2,82 kb fosfatado do plasmídeo de cadeia pesada de 5a8 pLCB7, para adicionar uma seqüência de codificação de sinal de cadeia pesada murina e um sítio doador de junção murino ao cDNA da região variável de cadeia pesada de mAQC2. 5a8 é um mAb CD4-específico molecularmente clonado (ver, por exemplo, Boon et al., 2002, Toxicology 172:191-203). Na cadeia pesada matura codificada pelo plasmídeo resultante (pAND092), o N-terminal diferido por cinco resíduos do N-terminal (DVKVVE; SEQ ID NO: 16) da cadeia pesada de mAQC2 cognata.

Para corrigir o N-terminal da cadeia pesada, pAND092 foi submetido à mutagênese de eliminação do único sítio (USE) usando um kit de mutagênese de USE (Amersham Pharmacia Biotech) seguindo o protocolo indicado do fabricante. As substituições de Q1D, Q3K, L4V, Q5V, Q6E foram codificadas pelo iniciador mutagênico 5' GCA CCA GGT GCC CAC TCC GAC GTC AAG GTG GTG GAG TC A GGG GGA GGC TTA GTG 3‘ (SEQ ID NO: 17). Clones do plasmídeo transformado foram identificados por seus novos sítios Aatll e Hinfl e o sítio Pstl eliminado. A seqüência de codificação de cadeia pesada foi depois confirmada através da seqüenciação de DNA. O plasmídeo corretamente transformado foi chamado pAND094. O fragmento de Notl-Hindlll de 0,43 kb do plasmídeo pAND094 e o fragmento de Hindlll-Notl de 1,21 kb do plasmídeo pEAG964 (contendo uma seqüência de codifi- cação para uma IgGi humana, região constante) foi subclonado no sítio de Notl de pCH269, um plasmídeo derivado do vetor de expressão EBV de pCEP4 (Invitrogen). O plasmídeo resultante foi nomeado pAND099. A quimera de cadeia leve foi gerada como segue. Um fragmento de EcoRI de 0,46 kb da cadeia leve de mAQC2 do plasmídeo pAND081 de domínio variável foi subclonado no fragmento de vetor de 2,7 kb fostatado do vetor de clonagem de pNN09 pUC-derivado, para adicionar um sítio 5' Notl. O plasmídeo resultante, pAND091, foi submetido à mutagênese usando o kit de USE da Amersham (supra) para introduzir um sítio de Bg1 II nas extremidade 3' da sequência de codificação. O iniciador mutagênico tinha a seqüência 5' GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3' (SEQ ID NO: 18). O plasmídeo corretamente transformado foi identificado por suas alterações de sítio Bglll e BstYI. A seqüência de codificação de cadeia leve no plasmídeo resultante pAND093 foi confirmada através de seqüenciação de DNA. Depois o fragmento de 0,44 kb de Notl-Bglll de cadeia leve do domínio variável de pAND093 e o fragmento de 0,68 kb de Bcll-Notl do plasmídeo pEAG963 (contendo uma seqüência de codificação para um domínio constante de cadeia leve kappa humana) foi subclonado no sítio de Notl de pCH269 (supra), produzindo o plasmídeo pAND102. Para criar uma cadeia leve desbloqueada kappa (Q1E), pAND093 foi submetido à mutagênese de USE com o iniciador mutagênico 5' CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCT CAC CCA G 3' (SEQ ID NO: 19), para introduzir um sítio de Xmnl. O plasmídeo transformado foi identificado varrendo por uma alteração no sítio Xmnl. A seqüência de cadeia leve no plasmídeo pAND097 resultante foi confirmada através de seqüenciação de DNA. O fragmento de 0,44 kb de cadeia leve de domínio variável Notl-Bglll do pAND097 e o fragmento de 0,68 kb Bcll-Notl do plasmídeo pEAG963 (contendo uma domínio constante de cadeia leve humana kappa) foram subclo-nados no sítio Notl do pCH269, produzindo o plasmídeo pAND098.

Para gerar os anticorpos de chAQC2, os vetores de expressão (vetor de cadeia pesada de chAQC2 pAND099 + vetor de cadeia leve de chAQC2 pAND102, e vetor de cadeia pesada de chAQC2 pAND099 + vetor de cadeia leve desbloqueado de chAQC2 pAND098) foram co-transfectados em células de 293-EBNA. Os transfectantes foram testados por secreção de anticorpo e especificidade. Os controles eram células transfectadas com os vetores correspondentes sem uma inserção ou com constructos de DNA codificando ch5c8 (um mAb CD154-específico molecularmente clonado descrito, por exemplo, em Elster et al., 2001, Transplantation 72:1473-1478) ou chCBE11 (um mAb LTpR-específico molecularmente clonado descrito, por exemplo, Browning et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:24934-24938).

Depois os transfectantes com a secreção do anticorpo desejada foram lisados, e imunoprecipitação da proteína A foi executada nos lisados e meio condicionados. Análise de western blot dos precipitados executada com anticorpos anti-humanos de cadeia pesada e leve indicou que as células chAQC2-transfectadas sintetizaram e eficazmente segregaram cadeias pesadas e leves em níveis similares à células ch5c8-transfectadas e chCBE11-transfectadas. Também, células de K562a1 de expressão de hu-VLA-1 foram manchadas com o meio condicionado das células transfectadas, e análise de FACS foi executada nas células manchadas. Os resultados indicaram que o anticorpo de chAQC2 produziu padrões similares de man-chamento a aqueles de mAQC2, enquanto os meios condicionados de células falsmente-transfectadas e ch5c8-transfectadas falharam em manchar células de K562a1. AQC2 quimérico produzido de transfecção transiente aumentada foi purificado e mostrado ligar ao VLA-1 através de titulação de FACS. AQC2 quimérico com um tipo selvagem ou uma cadeia leve geneticamente desbloqueada ligou ao VLA-1. Também ver Figura 16A-D (debatida abaixo). EXEMPLO 21 Este exemplo descreve um método de humanizar o anticorpo monoclonal de mAQC2. ANÁLISE DOS DOMÍNIOS VARIÁVEIS DE mAQC2.

Os domínios variáveis nas cadeias leves e pesadas de mAQC2 foram comparados com as seqüências de consenso para os subgrupos de camundongo e humano (Kabat et al, supra) usando o programa de software FASTA. O domínio variável de cadeia leve foi observado ser um membro do subgrupo de camundongo VI com 89 % de identidade em uma sobreposição de 109 aminoácidos. Este domínio também correspondeu ao subgrupo humano I com 72 % de identidade em uma sobreposição de 113 aminoácidos. O domínio variável de cadeia pesada foi observado ser um membro do subgrupo de camundongo llld com 86 % de identidade em uma sobreposição de 129 aminoácidos. Este domínio variável de cadeia pesada também correspondeu ao subgrupo humano III com 79 % de identidade em uma sobreposição de 130 aminoácidos.

As CDRs foram categorizadas em classes canônicas de acordo com Chothia et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989). Os resíduos principais que definem cada classe canônica determinam em grande parte a conformação estrutural do laço da CDR, e desse modo deve ser retido no anticorpo remodelado. O laço L1 de mAQC2 entra na classe canônica 1 (laço de 10 resíduos), L2 na classe 1 (laço de 7 resíduos) e L3 na classe 1 (laço de 9 resíduos). O laço H1 entrou na classe 1 (laço de 5 resíduos) e o laço H2 nos resíduos da classe 1 (laço de 16 resíduos). O laço H3 não parece pertencer a qualquer classe canônica. Os resíduos canônicos importantes para estas classes foram todos incluídos nos anticorpos humanizados.

Os resíduos de estrutura incomuns em mAQC2 foram determinados analisando todas as seqüências de cadeia variável de camundongo e humana na versão de setembro de 1999 do banco de dados de Kabat. Acredita-se que as diferenças mAQC2-específicas possam indicar mutações somáticas que intensificam a afinidade de ligação se estas diferenças estiverem perto do sítio de ligação. Os resíduos de mAQC2 incomuns também distantes do sítio de ligação e os resíduos de estrutura humanos incomuns foram removidos no caso deles criarem epitopos imunogênicos no anticorpo humanizado. Os resíduos de estrutura incomuns encontrados em mAQC2 foram 7(F), 10(L) e 41 (K) na cadeia leve; e 4(V), 21 (A) e 40(1) na cadeia pesada. Nenhum destes resíduos de estrutura de camundongo incomuns foi retido nos anticorpos humanizados. MODELAGEM DA ESTRUTURA DAS REGIÕES VARIÁVEIS.

As cadeias leves e pesadas de mAQC2 foram alinhadas contra um banco de dados não-redundante para determinar quais estruturas estruturais usar para construir os modelos tridimensionais das cadeias leves e pesadas de mAQC2. Usando FASTA, a cadeia leve foi observada ter 82 % de identidade de seqüência ao anticorpo murino monoclonal ab57 (1CLOL), enquanto a cadeia pesada foi observada ter 76 % de identidade de seqüência ao fragmento de Fab murino 6d9 (1HYY). Usando o pacote de software de modelagem molecular SYBYL (Tripos Inc.), as estruturas tridimensionais aproximadas das cadeias leves e pesadas mAQC2 foram construídas usando a cadeia leve de ab57 e a cadeia pesada de 6d9, respectivamente. A integridade estrutural dos modelos foi avaliada no consolo e foi observada ser razoável. MODELO DAS REGIÕES VARIÁVEIS REMODELADAS.

Duas semelhanças foram usadas para selecionar as estruturas de aceptor humano para "aceitar" as CDRs de mAQC2. O primeiro método foi por combinação de homologia e o outro usando seqüências de consenso de Ig humana. Sob a semelhança de homologia, o banco de dados de Ka-bat, o banco de dados não-redundante de NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health) e o banco de dados de Incyte foram pesquisados usando os programas de software FASTA e BLAST. A escolha das estruturas aceptoras humanas foi feita baseado na identidade da seqüência entre as estruturas de mAQC2 e as estruturas humanas (excluindo estruturas dos anticorpos previamente humanizados) e a fonte do anticorpo.

As estruturas de um gene de região variável de imunoglobulina tendo um número de acesso GENBANK de gi:587330 (subgrupo kappa humano I Vk-Ic147) foram eventualmente escolhidas para a cadeia leve do anticorpo humanizado (Welschof et al., J. Immunol. Meth. 179:203-14 (1995)). As estruturas de Amulc11 (ID de Kabat 044469; subgrupo humano III) foram escolhidas para a cadeia pesada do anticorpo humanizado (Huang et al., J. Immunol. 151:5290-300 (1993)). REMUTAÇÕES DAS ESTRUTURAS HUMANAS.

Estratégias para determinar quais remutações fazer estão disponíveis na Humanization pelos websites Design sob as uris refletidas: http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan e http://www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s.

Experimentos anteriores mostraram que é importante reter resíduos canônicos, resíduos de pacotes de interfaces e resíduos murinos incomuns que estão próximos do sítio de ligação. Além disso, os resíduos na "Vemier Zone," que forma uma plataforma na qual as CDRs repousam (Foote et al., J. Mol. Biol. 224, pág., 487 (1992)) e aqueles próximos da CDR H3 devem ser considerados.

Quatro versões remodeladas foram designadas para cada uma das cadeias leves e pesadas variáveis, como mostrado na Tabela 1. Duas das quatro versões para cada cadeia foram designadas por combinação de homo-logia (designadas huAQC2-h1 e -h2) e as outras duas versões por combinação consenso (huAQC2-c1 e -c2). Deve ser observado que as seqüências para a cadeia pesada de huAQC-h1 e a cadeia pesada de huAQC-c1 são idênticas. TABELA 1.

SEQÜÊNCIAS DE mAQC2, huAQC2 E ESTRUTURAS HUMANAS

Algumas das remutações são debatidas abaixo. (1) cadeia leve: 1 D->Q Esta mutação foi feita em todas as versões uma vez que experimentos anteriormente remodelados (por exemplo Kolbinger et al, Protein Eng. 6, pág., 971 (1993)) sugeriram sua importância para a ligação de antí-geno. 4 M->L Este é um resíduo de vernier e foi retido em todas as versões. 46 L->P Este resíduo é um resíduo tanto interfacia! quanto de vernier e apenas foi retido em h1 e c1. 47 L->W Este é um resíduo de vernier e apenas foi retido em h1 e c1. 71 F->Y Este resíduo é em uma posição canônica importante e foi retido em todas as versões. (2) cadeia pesada: 1 E->D Esta remutação foi feita em h1 (isto é, c1) apenas. 12I->V 0 resíduo I é incomum em ser humano e apenas foi retido no h2. 28 T->S Este é um resíduo de vemier e apenas foi retido em h1. 29 V->F Este é um resíduo canônico e foi retido em todas as versões. 49 S->A Este é um resíduo de vemier e foi retido em todas as versões. 93 A->T Este é um resíduo de vernier e interfacial e foi retido em todas as versões. 94 S->R Este é um resíduo canônico e foi retido em ambas as versões.

As regiões variáveis de huAQC2 foram feitas através de muta-gênese de USE como acima descrito, usando o plasmídeo de domínio variável chAQC2 como modelos de partida. As seqüências de cDNA da estrutura aceptora humana ("FR") foram Kabat #Z37334 para a cadeia leve e Kabat #U00490 para a cadeia pesada. Para facilitar a identificação dos plasmídeos transformados, mutações silenciosas foram introduzidas para alterar os sítios de restrição. Os plasmídeos transformados foram identificados pelas alterações do sítio de restrição. As seqüências de cDNA de região variável nos plasmídeos resultantes foram confirmadas através de seqüenciação de DNA.

As versões de h1 e c1 da cadeia pesada (que foram idênticas) foram feitas usando o plasmídeo pAND094 como modelo. Os iniciadores mutagênicos foram: iniciador de FR1 5'GGT GCC CAC TCC GAC GTC CAG CTG GTC GAG TC A GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC 3‘ (SEQ ID NO: 20) que introduziu os sítios de Taql e Pvull e eliminou um sítio de Ddel; iniciador de FR2 5' ATG TCT TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3' (SEQ ID NO: 21) que introduziu um sítio de Ncil, e eliminou os sítios de BspEI e Earl; iniciador de FR3 5' TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA 3' (SEQ ID NO: 22) que introduziu sítios de Pstl e Ddel; e iniciador de FR4 5' TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TC A GGT GAG 3’ (SEQ ID NO: 23), que introduziu sítios de Kpnl e Eco0109l. O plasmídeo de cadeia pesada resultante de h1 (isto é, c1) foi designado pAND104. A versão de c2 de cadeia pesada foi feita usando pAND104 como modelo com os iniciadores mutagênicos a seguir: iniciador de FR1 5' TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGG TAT ACT ATG TCT TGG GTT 3' (SEQ ID NO: 24), que introduziu um sítio de Accl; e iniciador FR1 5' GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC CAG CTG GTC GAG TCA 3' (SEQ ID NO: 25), que introduziu um sítio de Fsp1 e eliminou um sítio de Aatll. O plasmídeo de cadeia pesada resultante c2 foi designado pAND115. A versão de h2 de cadeia pesada foi feita usando pAND115 como modelo com o iniciador a seguir: iniciador de FR1 5' GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC CTG 3' (SEQ ID NO: 26), que eliminou um sítio de Ddel. O plasmídeo de h2 resultante de cadeia pesado foi designado pAND113.

Para gerar os vetores de expressão para as cadeias pesadas de huAQC2, o fragmento de domínio variável de cadeia pesada de 0,43 kb No-tl-Hindlll de pAND104, pAND115 ou pAND113, e o fragmento de 1,21 kb de Hindlll-Notl de pEAG964 (supra) foi subclonado no sítio de Notl de PCH269 (supra). Os plasmídeos de expressão de cadeia pesada resultantes foram designados pAND114 (h1), pAND121 (c2) e pAND124 (h2), respectivamente.

A versão de h1 de cadeia leve foi feita usando plasmídeo pAND093 como modelo. Os iniciadores mutagênicos foram: iniciador de FR1 5' CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3' (SEQ ID NO: 27) que removeu os sítios de BstEII e Pstl; iniciador de FR2 5' TTC TGG TAT CAG CAG AAG CCC GGG AAA GCC CCC AAA CCC TGG ATT 3' (SEQ ID NO: 28), que introduziu um sítio de Ncil; iniciador de FR3 5' GCT TCT GGA GTC CCT TCA CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 3’ (SEQ ID NO: 29) que introduziu um sítio de Ddel e EcoO1091 e eliminou os sítios de Avall; e iniciador de FR4 5‘ GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 30) que introduziu sítios de Ddel e Styl. O plasmídeo de cadeia leve de h1 resultante foi designado pAND103. A versão de h2 de cadeia leve foi feita usando pAND103 como modelo com o iniciador a seguir: iniciador de FR2 5' CCC GGG AAA GCG CCC AAA CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3' (SEQ ID NO: 31), que introduziu os sítios de Hhal e Haell. O plasmídeo de cadeia leve de h2 resultante foi designado pAND116. A versão de c1 de cadeia leve usou o modelo de plasmídeo pAND103 com os iniciadores a seguir: iniciador de FR1 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEQ ID NO: 32), que introduziu os sítios de Smal, Ncil e Hpall; iniciador de FR4 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 33), que introduziu um sítio de Bsp1286l. O plasmídeo de cadeia leve de c1 resultante foi designado pAND118. A versão de cadeia leve de c2 foi feita usando modelo de plasmídeo pAND116 com os iniciadores a seguir: iniciador de FR1 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEQ ID NO: 34), que introduziu os sítios de Smal, Ncil e Hpall; iniciador de FR4 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEQ ID NO: 35), que introduziu um sítio de Bsp1286l. O plasmídeo de cadeia leve de c2 resultante foi designado pANDI 19.

Para gerar os vetores de expressão para as cadeias leves de huAQC2, o fragmento de domínio variável de cadeia leve de 0,44 kb de Notl-Bg1 II de pAND103, pAND116, pAND118 ou pAND119, e o fragmento de 0,68 kb de Bc1l-Notl de pEAG963 (supra) foram subclonados no sítio de Notl de pCH269 (supra). Os vetores de expressão de cadeia leve resultantes foram designados pAND117 (h1), pAND120 (h2), pAND122 (c1) e pAND 123 (c2), respectivamente.

Os vetores de expressão foram co-transfectados em células de 293-EBNA, e as células transfectadas foram testadas por secreção de anticorpo e especificidade. As células transfectadas com um vetor vazio serviram como controle de negativo. Os lisados de célula totais e o meio condicionado foram imunoprecipitados com proteína A. Análise de western blot dos precipitados (desenvolvidos com anticorpos de cadeia pesada e leve anti-humanos) indicou que as células huAQC2-transfectadas sintetizaram e eficazmente segregaram cadeias pesadas e leves em níveis similares às células chAQC2-transfectadas.

Análise de FACS de células de K562a1 de expressão de VLA-1 manchadas com meio condicionado das células transfectadas foi depois executada. Fazendo assim, as células de K562a1 foram incubadas com o meio condicionado em gelo durante 120 minutos. As células foram depois lavadas três vezes com um tampão de FACS (PBS com 5 % de FBS e 0,05 % de azida de sódio). As células lavadas foram resuspensas no tampão e incubadas com IgG anti-humana conjugada com PE (H + L) (Jackson Im-munoResearch Laboratories, Inc.) em gelo durante 30 min em gelo. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com o tampão de FACS, e resuspendidas no tampão de FACS para análise. Os dados estão mostrados na Tabela 2 em que HuAQC2-h1 refere-se a um mAb que consiste na versão de h1 da cadeia pesada de huAQC2 (HC) e a versão de h1 da cadeia leve de huAQC2 (LC) (ver Tabela 1). Igualmente, huAQC-h2 é um mAb que consiste nas versões de h2 das cadeias pesadas e leves, huAQC2-c1 as versões de c1, e huAQC2-c2 as versões de c2. Na tabela, MFI relativo refere-se ao MFI médio normalizado àquele observado para chAQC2 bloqueado. Dados mostrados representam a média de duas transfecções independentes. Estes dados indicaram que mAbs de huAQC2-h2 e -c2 ligaram bem menos que huAQC2-h1 e -c1 relativo a chAQC2. TABELA 2. MANCHAMENTO DE FACS DE CÉLULAS DE K562a1 POR chAQC2 E huAQC2 Co-transfecções de células de 293-EBNA com chAQC2 e huAQC2-h1, -h2, -c1 e -c2 foram aumentadas. Os anticorpos nos meios condicionados foram purificados com Proteína A-Sefarose. mAbs purificados foram submetidos a ensaios por FACS para atividade. O protocolo foi como segue. 1. Contar as células do frasco que foi dividido 1:4 no dia antes do ensaio. 2. Peletizar as células e resuspender a 2,5e5 células/ml em tampão de FACS (5 % de PBS em PBS com 0,02 % de NaAzida). 3. Pipetar 100 μΙ de células nas cavidades de uma placa de 96 cavidades em fundo V. 4. Preparar diluições seriais de 1:3 de AQC2 iniciando a 3 pg/ml em tampão de FACS. 5. Peletizar as células durante 5 minutos a 800 X ge bater levemente na placa para remover o tampão. 6. Resuspender as células em 100 μΙ da série de anticorpo diluído. 7. Incubar durante 2 horas em gelo. 8. Lavar a placa. Peletizar as células durante 3 minutos a 800 X g e bater levemente na placa para remover o tampão. 9. Ressuspender as células em 100 μΙ de anticorpo secundário (diluído 1:100 em tampão de FACS). 10. Incubar durante 30 minutos em gelo. 11. Lavar a placa (ver acima). 12. Ressuspender as células em 25 μΙ de tampão de FACS. 13. Centrifugar os tubos de FACS brevemente para assegurar que os 50 μΙ estão no fundo dos tubos. 14. Submeter a vórtice cada tubo vigorosamente e colher 5000 eventos.

Os dados estão mostrados na Figura 17. Estes dados confirmam que huAQC2-h2 e -c2 ligaram bem menos que huAQC2-h1 e -c1 relativo a chAQC2.

As versões de consensa de huAQC2 também foram estudadas porque elas podem ser menos imunogênicas quando usadas para tratar os pacientes com indicações crônicas. Co-transfecções de misturar-e-comparar foram executadas para identificar se uma única cadeia foi responsável pela diminuição evidente na ligação vista com huAQC2-c2. As co-transfecções sugeriram que a redução poderia ser atribuída à cadeia leve de c2 (codificada por pAND123), que diferiu da cadeia leve de c1 (codificada por pAND122) a apenas dois resíduos na região de FR2: P46L e W47L.

Para examinar as contribuições individuais de cada destas duas alterações, novos vetores de expressão de cadeia leve de c2 foram construídos. Plasmídeo pAND125, a variante L47W da cadeia leve de c2 foi feita usando pAND119 como um modelo com o iniciador mutagênico a seguir: iniciador de FR2 5' GGG AAA GCA CCC AAA CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEQ ID NO: 36), que introduziu sítios de Hhal e Haell. Plasmídeo pAND126, a variante de L46P da cadeia leve de c2, foi feito usando pAND 119 como um modelo com o iniciador mutagênico a seguir: iniciador de FR2 5' AAG CCC GGG AAG GCG CCC AAA CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEQ ID NO: 37), que introduziu os sítios de BsaHI, Bani e Narl. Os vetores de expressão para estas novas cadeias leves de huAQC2 foram feitos subclonando o fragmento de domínio variável de cadeia leve de 0,44 kb de Notl-Bg1 II pAND125 ou pAND126, e o fragmento de 0,68 kb de Bc1l-Notl de pEAG963 (supra) no sítio de Notl de pCH269 (supra). Os plasmídeos resultantes foram designados pAND132 (c2 com L47W) (SEQ ID NO: 47) e pAND133 (c2 com L46P) (SEQ ID NO: 70), respectivamente.

As co-transfecções dos novos plasmídeos de cadeia leve com cada um dos plasmídeos de cadeia pesada de huAQC2 foram executadas. Ligação de VLA-1 foi examinada por FACS. Os dados demonstram que a remuta-ção de L47W não melhorou a ligação. A mutação de L46P melhorou o pico da curva de ligação, mas o EC50 ainda foi desviado para direita relativo ao comportamento da versão 1 de huAQC2 (Tabela 2, supra). Estes resultados sugeriram que ambas remutações foram necessárias para atividade de ligação total.

Uma cadeia leve de c1 geneticamente desbloqueada também foi feita, uma vez que a variante de Q1D poderia ser um resíduo mais "humanizado." O mutante Q1D, designado pAND148, foi feito com o modelo pAND118 com o iniciador mutagênico a seguir: iniciador de FR1 5' GTC ATA ATG TCC CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3' (SEQ ID NO: 38), que introduziu um novo sítio de EcoRI e removeu um sítio de Apol. Um vetor de expressão para esta última variante da cadeia leve de huAQC2 foi feito subclonando o fragmento de domínio variável de cadeia leve de 0,44 kb de No-tl-Bg1 II pAND148 e o fragmento de 0,68 kb de Bc1l-Notl pEAG963 no sítio de Notl de pCH269, produzindo o vetor de expressão de cadeia leve pAND150 (c1 com N-terminal desbloqueado Q1D). Co-expressão da cadeia leve geneticamente desbloqueada com a cadeia pesada de c2 (isto é, "huAQC2 LC c1 des-bloqueada/HC c2"; designada huAQC2-c4) foi equivalente àquela de "huAQC2 LC c1/HC c2" (designada como huAQC2-c3). Ligação de VLA-1 foi confirmada por FACS em células de K562a1 de expressão de VLA-1 (Tabela 2).

Co-transfecções de células de 293-EBNA com chAQC2 e hu-AQC2-h1, -h2, -c1, -c2, -c3 e -c4. Os anticorpos nos meios condicionados foram purificados em Proteína A-Sefarose. Os mAbs purificados foram en- saiados para atividade (Figura 17 e 18). HuAQC2-c3 foi escolhido como o candidato de droga, uma vez que suas propriedades foram mais similares ao chAQC2. Os vetores foram depois designados para expressão estável de huAQC2-c3 em células de CHO. Os vetores continham um cDNA para o huAQC2 c1 LC ou c2 HC, com os UTRs 5' e 3' eliminados e a lisina C-terminal de cadeia pesada excluída geneticamente para assegurar homogeneidade do produto. Os vetores finais foram pAND162 (cadeia leve), pAND160 (cadeia pesada). Como aqui usado, huAQC2-c3 também é chamado hAQC2.

As seqüências de polipeptídeos completas de hAQC2 são como segue.

Cadeia leve (Plasmídeo: pAND162) 1 QIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASSSVN HMFWYQQKPG

KAPKPWIYLT

51 SNLASGVPSR FSGSGSGTDY TLTISSLQPE DFATYYCQQW

SGNPWTFGQG

101 TKVEIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP RE-AKVQWKVD

151 NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YA-CEVTHQGL 201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO: 3) Cadeia pesada (Plasmídeo: pAND160) 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA

PGKGLEWVAT

51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT

AVYYCTRGFG

101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT

AALGCLVKDY

151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP

SSSLGTQTYI

201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS

VFLFPPKPKD 251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE- QYNST

301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPRE-PQVY

351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD 401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ 1D NO:4) Outras seqüências de polipeptídeo e nucleotídeo de cadeia pesada e leve são mostradas abaixo. A. cadeia pesada de chAQC2 (Pand099) (SEQ ID NOs: 39 e 40. O penúltimo Ns refere-se à seqüência de nucleotídeo e o último à seqüência de polipeptídeo. A mesma ordem é usada na seguinte numeração.) 1 GACGTCAAGGTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAG GGTCCCTGAAACTC

DVKVVESGGGLVKPGGSLKL 61 GCCT GTGCAGCCT CT GG ATTCAGTTT CAGT AGAT AT ACT AT GT CTTG GGTTCGCCAGATT

ACAASGFSFSRYTMSWVRQI 121 CCGGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGGT CACACCTACTATCTA

PEKRLEWVATISGGGHTYYL 181 G ACAGT GTG AAGG GCCG ATT CACCATCT CCAG AG ACAAT GCCAAG AACACCCT GT ACCT G

DSVKGRFTISRDNAKNTLYL 241 C AAAT G AGC AGT CT G AG GT CT G AGG AC AC AGCC AT GT ATT ACT GT A CAAGAGGTTTTGGA

QMSSLRSEDTAMYYCTRGFG 301 GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCAC CGTCTCCTCA

DGGYFDVWGQGTTVTVSS B. h1 e c1 de HC de hAQC2 (pAND114) (SEQ ID NOs:41 e 42) 1 GACGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGA- GGGTCCCTGAGACTC

DVQLVESGGGLVQPGGSLRL 61 T CCTGT G C AGCCTCT GG ATT C AGTTT C AGT AG AT AT ACT AT GT CTT G GGTTCGCCAGGCT

SCAASGFSFSRYTMSWVRQA 121 CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGG T CACACCT ACT AT CT A

PGKGLEWVATISGGGHTYYL 181 GACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAG AACACCCT GT ACCT G

DSVKGRFTISRDNSKNTLYL 241 CAG AT G AAC AGT CT G AGGGCCG AGG AC AC AGCCGTGT ATT ACT GT ACAAGAGGTTTTGGA

QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG 301 GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCAC-CGTCTCCTCA

DGG YFDVWGQGTLVTVSS C. Cadeia pesada de h2 de hAQC2 (pAND124) (SEQ ID NOS:43 e 44) 1 GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAATCCAGCCTGGA-GGGTCCCTGAGACTC

EVQLVESGGGLIQPGGSLRL 61 T CCT GT G C AGCCT CT G G ATT C ACCTT C AGT AG GT AT ACT AT GT CTTG GGTTCGCCAGGCT

SCAASGFTFSRYTMSWVRQA 121 CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGG T CACACCT ACTATCT A

PGKGLEWVATISGGGHTYYL 181 G ACAGT GTG AAGGGCCG ATT CACCAT CT CCAG AG ACAATT CCAAG AACACCCTGTACCTG

DSVKGRFTISRDNSKNTLYL 241 CAG ATG AACAGT CT G AGGGCCG AGG ACACAGCCGT GT ATT ACT GT ACAAGAGGTTTTGGA

QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG 301 GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTC

TCCTCAGG

DGGYFDVWGQGTLVTVSS D. Cadeia pesada de c2 de hAQC2 (pAND121) (SEQ ID NOs:45 e 68) 1 GAGGTCCAGCTGGTCGAGTCAGGGGGAGGCTTAGTCCAGCCTGGAGG GTCCCT GAGACTC

EVQLVESGGGLVQPGGSLRL 61 TCCT GTGCAGCCT CTGG ATT CACCTT CAGT AGGT AT ACT ATGT CTT G GGTTCGCCAGGCT

SCAASGFTFSRYTMSWVRQA 121 CCGGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAGTGGTGGTGG T CACACCT ACT AT CT A

PGKGLEWVATISGGGHTYYL 181 G ACAGT GT G AAGGGCCG ATT CACCAT CT CCAG AG ACAATT CCAAG AACACCCT GTACCTG

DSVKGRFTISRDNSKNTLYL 241 CAGATGAACAGTCTGAGGGCCGAGGACACAGCCGTGTATTACTGT ACAAGAGGTTTTGGA

QMNSLRAEDTAVYYCTRGFG 301 GACGGGGGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTC

TCCTCAGG

DGGYFDVWGQGTLVTVSS E. Cadeia leve bloqueada de chAQC2 (Pand102) (SEQ ID NOs: 46 e 47) 1 CAAATT GTT CT CACCCAGTTT CCAGCACT CAT GTCTGCGTCT CCAGGG GAGAAGGTCACC

QIVLTQFPALMSASPGEKVT 61 AT G ACCTGCAGTGCCAGCT CAAGT GTAAAT CACAT GTTCTGGTAT CA GCAGAAGCCAAAA

Segue-se folha 88a MTCSASSSVNHMFWYQQKPK 121 T CCT CCCCCAAACCCTGGATTT AT CTCACAT CCAACCTGGCTT CT G GAGTCCCTGCTCGC

SSPKPWIYLTSNLASGVPAR 181 TT C AGT G GC AGTG G GTCTG G G ACCT CTT ACT CT CT C ACAAT C AG C A GCATGGAGGCTGAA

FSGSGSGT S Y SLTISSMEAE 241 GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGA CGTTCGGTGGAGGC

DAATYYCQQWSGNPWTFGGG 301 ACCAAGCTGGAGATCAAA T K L E I K F. Cadeia leve de h1 de hAQC2 (pAND117) (SEQ ID NOs: 48 e 49) 1 C AAATT GTT CTC ACCC AGT CT CC AT CCT CCCT GTCTGCGTCTGTAG G G GACAGAGTCACC

QIVLTQSPSSLSASVGDRVT 61 AT C AC ATGC AGTGCC AGCT C AAGT GT AAAT C ACAT GTT CTGGT AT CA GCAGAAGCCCGGG

ITCSASSSVNHMFW YQQKPG 121 AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTG GAGTCCCTTCACGC

KAPKPW I YLTSNLASGVPSR 181 TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCA GCCTGCAACCTGAA

FSGSGSGTDYTLTISSLQPE 241 G ATTTT G CC ACTT ATT ACT G CC AGC AGT G G AGT GGT AACCCGT G G A CGTTCGGTGGAGGC

DFATYYCQQWSGNPWTFGGG 301 ACTAAGGTGGAGATCAAA TKVEI K G. Cadeia leve de h2 de hAQC2 (pAND120) (SEQ ID NOs: 50 e 51)/ 1 C AAATT GTTCT C ACCC AGT CTCC ATCCT CCCTGTCT G CGTCTGT AG G G GACAGAGTCACC

QIVLTQSPSSLSASVGDRVT 61 AT C AC ATGC AGT GCC AGCT CAAGT GT AAAT C AC AT GTT CT G GT AT CA GCAGAAGCCCGGG

ITCSASSSVNHMFWYQQKPG 121 AAAGCGCCCAAACTCCTGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTG GAGTCCCTTCACGC

KAPKLLIYLTSNLASGVPSR 181 TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCA GCCTGCAACCTGAA

FSGSGSGTDYTLTISSLQPE 241 GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGA CGTTCGGTGGAGGC

DFATYYCQQWSGNPWTFGGG 301 ACTAAGGTGGAGATCAAA TKVEIK H. Cadeia leve de c1 de hAQC2 (pAND122) (SEQ ID NOs: 52 e 66) 1 CAAATT CAGCT CACCCAGT CT CCAT CCTCCCTGTCTGCGTCTGT AGG GGACAGAGTCACC

QIQLTQSPSSLSASVGDRVT 61 AT CACATGCAGTGCCAGCT CAAGT GTAAAT CACAT GTT CTGGT AT CA GCAGAAGCCCGGG

ITCSASSSVNHMFWYQQKPG 121 AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTG GAGTCCCTTCACGC

KAPKPWIYLTSNLASGVPSR 181 TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGCA GCCTGCAACCTGAA

FSGSGSGTDYTLTISSLQPE 241 GATTTTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGA CGTTCGGTCAGGGC

DFATYYCQQWSGNPWTFGQG 301 ACTAAGGTGGAGATCAAA TKVEIK I. Cadeia leve de c2 de hAQC2 (pAND123) (SEQ ID NOs: 53 e 54) J. Cadeia leve não-bloqueada de chAQC2 (pAND098) (SEQ ID NOs: 55 e 56) 1 GAAATTGTTCTCACCCAGTTTCCAGCACTCATGTCTGCGTCTCCAGGG GAGAAGGTCACC

El VLTQFPALMSASPGEKVT 61 AT G ACCTGCAGTGCCAGCT CAAGT GT AAATCACAT GTTCTGGTATC A GCAGAAGCCAAAA

MTCSASSSVNHMFWYQQKPK 121 TCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTG GAGTCCCTGCTCGC

SSPKPWIYTSNLASGVPAR 181 TT C AGT G GC AGTG GGT CTGGG ACCT CTT ACT CT CT CAC AAT C AG C A GCATGGAGGCTGAA

FSGSGSGTSYSLTISSMEAE 241 GATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTGGAGTGGTAACCCGTGGA CGTTCGGTGGAGGC

DAATYYCQQWSG N PWTFGGG 301 ACCAAGCTGGAGATCAAA TKL EIK K. Cadeia leve de c1 não-bloqueada de huAQC2 (pAND150) (SEQ ID NOs: 57 e 58) 1 GATATCCAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCGTCTGTAGG GGACAGAGTCACC

DIQLTQSPSSLSASVGDRVT 61 ATC AC AT GC AGT G CC AGCT CAAGT GT AAAT CAC AT GTTCTG GTATC A GCAGAAGCCCGGG

ITCSASSSVNHMFWYQQKPG 121 AAAGCCCCCAAACCCTGGATTTATCTCACATCCAACCTGGCTTCTG GAGTCCCTTCACGC

KAPKPWIYLTSNLASGVPSR 181 TTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTACACTCTCACAATCAGC AGCCTGCAACCTGAA

FSGSGSGTDYTLTISSLQPE

241 G ATTTT GCCACTT ATT ACTGGC AGCAGT GG AGT GGT AACCCGTGG A CGTTCGGTCAGGGC DFATYYCQQWSG N PWTFGQG 301 ACTAAGGTGGAGATCAAA TKVE I K EXEMPLO 22 Este exemplo descreve a caracterização de vários anticorpos de AQC2 da invenção. ENSAIO DE FASE SÓLIDA PARA LIGAÇÃO DE DOMÍNIO i DE oc1 Cinqüenta μΙ de 10 mg/ml de domínio I de a1-proteína de fusão de GST foram adicionados a uma placa de 96 cavidades de poliestireno de CORNING COSTAR EASY WASH (Gotwals et al„ Biochemistry, 38, 8280-8 (1999)). Seguindo incubação a 4o C durante 16 h, a placa foi lavada quatro vezes com 350 μΙ de 0,1 % de Tween-20 em PBS em uma lavadora de placa. A placa foi bloqueada mediante a adição de 180 μΙ de 3 % de BSA em TBS a 25° C durante 60 minutos, e depois lavada como acima. Diluições de anticorpos (50 μΙ/cavidades) em TBS contendo 1 mg/ml de BSA (tampão de ensaio) foram preparadas em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades, transferidas para a placa revestida de domínio I de a1 e incubadas durante 60 minutos a 25°C. Seguindo uma lavagem final, 100 μΙ/cavidade de rea-gente de TMB (Pierce) foram adicionados. Após 10 minutos, 100 μΙ de ácido sulfúrico a 1 M foram adicionados, e a absorbância a 450 nm foi lida em um espectrofotômetro de 96 cavidades de UV-Vis. ENSAIOS DE ELECTROQUIMILUMINESCÊNCIA PARA LIGAÇÃO DE IN-TEGRINA α1β1 OU DOMÍNIO I DE a1 AO COLÁGENO. DYNABEADS M-280 ativadas com tosila (Dynal, Inc.) foram revestidas com 100 mg/ml de colágeno do tipo IV (Sigma) de acordo com as instruções do fabricante. Lisados celulares de células K562 a1-transfectadas foram preparados como segue. As células foram colhidas através de centri-fugação, ressuspensas em 108 células/ml em um tampão de lise contendo 25 mM de Tris, pH 7,4, 1 % de NP-40, 1 mM de CaCI2, 1 mM de MnCl2, I mM de MgCh, 2 % de BSA e 1 mM de PMSF, e incubadas a 4o C durante 60 mi- nutos. Restos celulares foram removidos através de centrifugação a 12.000 rpm durante 30 minutos e o sobrenadante resultante foi usado nos experimentos subseqüentes. Anticorpo de ativação de anti-βΐ TS2/16 e anticorpo de anti-GST policlonal (Pharmacia) foram marcados com éster de TAG-NHS (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) de acordo com as instruções do fabricante. Anticorpos marcados foram purificados através de cromatografia de filtração em gel em SEPHADEX G25M (Pharmacia).

Para realizar o ensaio de ligação, as contas revestidas de colá-geno (1 mg/ml) foram bloqueadas durante 5 minutos com 8 % de plasma de rato de Lewis em um tampão de ensaio contendo 50 mM de HEPES, pH 7,5, 150 mM de NaCI e 0,1 % de Triton X-100. Para o ensaio de ligação de α1β1, diluições seriais de anticorpos foram incubadas com 10 pg de contas, lisado de células preparado de 105 células K562 a1-transfectadas (supra), e 0,1 pg/ml de TAG-TS2/16 em um tampão de ensaio contendo 1 mM de MnCI2. Para o ensaio de ligação de domínio I de a1, os anticorpos foram incubados com 10 pg de contas, 0,1 pg/ml de domínio I de oc1 -proteína de fusão de GST e 1 pg/ml de Tag-anti-GST em um tampão de ensaio contendo 1 mM de MnCI2. Após uma a duas horas de agitação em temperatura ambiente, 200 pl foram adicionados do tampão de ensaio e as amostras foram lidas em um detector de electroquimiluminescência ORIGEN 1.5 (IGEN). Os diagramas estão apresentados com unidades de electroquimiluminescência arbitrárias (ECL) no eixo da ordenada.

ENSAIO DE COMPETIÇÃO DE mAQC2 BIOTINILADO

Uma placa de 96 cavidades foi revestida com 50 pl de 5 pg/ml de domínio I de a1 -proteína de fusão de GST e bloqueadas com 3 % de BSA em TBS conforme descrito acima. As diluições de anticorpos (60 pl/cavidade) no tampão de ensaio foram preparadas em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades, e 60 pl de 0,1 pg/ml de AQC2 murino biotinilado no tampão de ensaio foram adicionados. Cinqüenta microlitros de cada cavidade foram transferidos para a placa revestida e incubados durante 3 h a 25°C. A placa foi depois lavada conforme acima, 50 pl de 1 pg/ml de EX-TRAVIDIN conjugada com peroxidase (Sigma) foram adicionados, e a placa foi incubada mais 2 h a 25° C. Após uma lavagem final, 100 μΙ/cavidade de reagente de TMB (Pierce) foram adicionados. Após 10 minutos, foram adicionados 100 μΙ de ácido sulfúrico a 1 M,ea absorbância a 450 nm foi lida em um espectrofotômetro de 96 cavidades de UV-Vis.

RESULTADOS EXPERIMENTAIS

Os resultados experimentais estão mostrados na Figura 16A-D e na Tabela 3. A capacidade de mAQC2, chAQC2, hAQC2 e hAQC2' (isto é, huAQC2-c4; apenas diferindo de hAQC2 naquele resíduo 1 da cadeia leve de hAQC2 foi D ao invés de Q) para (1) ligar células de k562 a1-transfectadas humanas (por FACS); (2) ligar ao domínio I de a1 imobilizado (por ELISA); (3) competir com mAQC2 para ligar ao domínio I de a1 (ELISA); (4) bloquear a ligação do domínio I de a1 ao colágeno (ensaio de elec-troquimiluminescência); ou (5) bloquear a ligação da integrina α1β1 ao colágeno (ensaio de electroquimiluminescência) foi determinada. Os resultados estão mostrados nas Figuras 16A-D, e os valores calculados de IC50 (para inibição) ou EC50 (para ligação) são dados na Tabela 3. Em cada ensaio, cada uma das formas de AQC2 humanizadas mostrou uma capacidade similar para ligar ao VLA-1 (ou o domínio de a1) ou bloquear a ligação ao colágeno (Observe que no painel C, a diferença observada na intensidade entre mAQC2 e as formas humanizadas derivam do uso de um anticorpo anti-murino-lgG secundário, em vez de um anti-humano-lgG). TABELA 3. SUMÁRIO DOS RESULTADOS DO ENSAIO (todos os valores emnM) A seguir, foi testado se alterações em certos resíduos conservadores nas CDRs poderíam conservar a atividade de ligação de VLA-1 de hAQC2. Variantes de codificação de constructos de DNA de hAQC2 com as mutações a seguir foram feitas através de mutagênese sítio-direcionada: (1) G55S na CDR2 de cadeia pesada; (2) S24N na CDR1 de cadeia leve (introduzindo um sítio de glicosilação N-ligado ocupado); (3) G92S na CDR3 de cadeia leve; (4) uma combinação de (1) e (2); e (5) uma combinação de (1) e (3). Os constructos de DNA que codificam ambas cadeias leve e pesada foram depois co-transfectados em células de 293-EBNA, e o meio condicionado dos transfectantes foi ensaiado para expressão do anticorpo por western blot e ELISA. Os resultados indicaram que as variantes de hAQC2 foram expressadas tão eficazmente quanto hAQC2 cognato. Análise de FACS usando células de K562 de expressão de VLA-1 também mostrou que as atividades de ligação de VLA-1 destas variantes eram similares ao hAQC2 em si. Em suma, as substituições de aminoácido não alteraram a atividade de ligação de VLA-1 de hAQC2. De fato, estrutura cristalina de raio X do complexo de RAH/Fab de hAQC2 (infra) mostra que S24 e G92 da cadeia leve e G55 da cadeia pesada não estão no bolso de ligação que está em contato com o domínio I de a1. EXEMPLO 23 As funções efetoras de uma imunoglobulina acoplam a atividade de ligação de antígeno da imunoglobulina às armas inflamatórias, citotóxicas e estimulantes do sistema imune. Funções efetoras podem prejudicar a segurança e eficácia de um produto terapêutico de imunoglobulina. Para reduzir as funções efetoras potenciais de hAQC2, mutações de L235A e L236A foram feitas para sua cadeia pesada para gerar hsAQC2. Pela mesma razão, uma única mutação de N298Q foi feita na cadeia pesada de hAQC2 para gerar uma forma aglicosilada de hAQC2, nomeado haAQC2. Estudos podem ser feitos para comparar sua eficácia, função efetora residual, estabilidade e imunogenicidade quanto ao hAQC2 cognato. A menos que do contrário indicado, os números de posição do resíduo nas regiões constantes como aqui usados são designados de acordo com a convenção de numera- ção de EU. A seqüência de polipeptídeo de cadeia pesada de hsAQC2 é como segue (Plasmídeo: pAND161): 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA

PGKGLEWVAT

51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT

AVYYCTRGFG

101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT

AALGCLVKDY

151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP

SSSLGTQTYI

201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPELLGGPS

VFLFPPKPKD

251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE-QYQST

301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPRE-PQVY

351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN

NYKTTPPVLD

401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 5) A seqüência de polipeptídeo de cadeia pesada de hsAQC2 é como segue (Plasmídeo: pAND171): 1 EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS RYTMSWVRQA

PGKGLEWVAT

51 ISGGGHTYYL DSVKGRFTIS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDT

AVYYCTRGFG

101 DGGYFDVWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVFPLA PSSKSTSGGT

AALGCLVKDY

151 FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP

SSSLGTQTYI

201 CNVNHKPSNT KVDKKVEPKS CDKTHTCPPC PAPEAAGGPS

VFLFPPKPKD

251 TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREE-QYNST

301 YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPRE-PQVY

351 TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN

NYKTTPPVLD

401 SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPG (SEQ ID NO: 6) EXEMPLO 24 Este exemplo descreve um método para determinar a estrutura cristalina do complexo de um domínio I de oc1 quimérico de rato/humano da integrina α1 β1 e o fragmento de Fab de hAQC2.

PREPARAÇÃO DO COMPLEXO DE PROTEÍNA O fragmento de Fab de hAQC2 foi preparado do anticorpo de hAQC2 usando uma variação do procedimento do kit de preparação de Fab IMMUNOPURE® (Cat Nõ44885, Pierce, Rockford, IL). O anticorpo de hAQC2 intacto foi concentrado a 12 mg/ml em um tampão contendo 20 nM de fosfato, 10 mM de EDTA e 25 nM de cisteína (pH 7,0). Papaína imobilizada foi adicionada a uma enzima em razão de substrato de 1:50, e digestão foi permitida ocorrer durante a noite a 37° C. A papaína imobilizada foi removida e o digesto bruto foi submetido à diálise junto com 20 mM de tampão de acetato de sódio (pH 4,5). O fragmento de Fab foi separado do anticorpo intacto residual, fragmento de Fab dimérico e fragmento de Fc através de cromatografia de permuta de cátions usando uma coluna S (Poros HS/M, PERSEPTIVE Biosytems NeP042M26) com um gradiente de sal insípido. O fragmento de Fab foi depois trocado por 0,1 M de tampão de Hepes (pH 8,0). O domínio I de a1 quimérico usado na presente invenção é um construção de domínio I quimérico de rato/humano (RAH mutante) contendo resíduos Thr145-Phe336 da cadeia de integrina oc1 de rato onde os resíduos Gly217, Arg218, Gln219 e Leu222 (numeração de cristal) foram substituídos por resíduos humanos equivalentes Vai, Gin, Arg e Arg, respectivamente para restabelecer a ligação do anticorpo. As seqüências de aminoácido dos domínios I de a1 quiméricos de RAH, rato e de ser humano são dados abaixo na SEQ ID NOs: 59, 60 e 61, respectivamente. Domínio I de a1 recombi-nante foi expresso em E. coli como uma proteína de fusão de GST. O domínio I de a1 de RAH foi clivado com trombina e purificado de um clone Pichia pastoris como previamente descrito (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:8280-8288).

145 TQLDIV

151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY

191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIVQRG GRQTMTALGI

231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI

271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP

311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID NO: 59) 145 TQLDIV

151 IVLDGSNSIY PWESVIAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY

191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAANKIGRQG GLQTMTALGI

231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNYRLKQVI

271 QDCEDENIQR FSIAILGHYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP

311 TEKHFFNVSD ELALVTIVKA LGERIF (SEQ ID NO: 60) 145. TQLDIV

151 IVLDGSNSIY PWDSVTAFLN DLLKRMDIGP KQTQVGIVQY

191 GENVTHEFNL NKYSSTEEVL VAAKKIVQRG GRQTMTALGI

231 DTARKEAFTE ARGARRGVKK VMVIVTDGES HDNHRLKKVI

271 QDCEDENIQR FSIAILGSYN RGNLSTEKFV EEIKSIASEP

311 TEKHFFNVSD EIALVTIVKT LGERIF (SEQ ID NO: 61) O fragmento de Fab de hAQC2 foi misturado com domínio I de a1 quimérico em excesso e incubado a 37°C durante 15 minutos. Os complexos de a1/Fab saturados foram separados do domínio I de oc1 não- complexado através de cromatografia de exclusão por tamanho usando uma coluna S200 Sephacryl (Pharmacia, Gibco). O complexo foi também concentrado a 11 mg/ml em 20 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCI, 1 mM MnCh, 5 mM β-mercaptoetanol.

PREPARAÇÃO DOS CRISTAIS

Condições de cristalização foram encontradas usando os Kits de CRYSTAL SCREEN® de Hampton Research (Laguna Niguel, CA). Cristais do complexo acima descrito foram desenvolvidos a 20°C por difusão a vapor usando uma quantidade igual de solução complexa de proteína e uma solução de reservatório de 20-30 % de PEG 1500. Tipicamente, 2 μΙ de complexo de proteína foram adicionados a 2 pL de solução da cavidade para render gotas de 4 pL. Cristais desenvolveram em dois a sete dias como bastões hexagonais com dimensões 0,8 x 0,05 x 0,05 mm3. A presença do domínio I de oc1 e fragmento de Fab de hAQC2 foi confirmada por análise de SDS-PAGE dos cristais dissolvidos. Para reduzir o dano de radiação inerente durante a coleta dos dados, os dados de difração de raio X foram colhidos em aproximadamente -173,15 (100 K). Para preparar os cristais para coleta dos dados nesta temperatura baixa, os cristais foram gradualmente equilibrados em uma solução crioprotetora contendo 25 % de PEG 400 e 30 % de PEG 1500, e rapidamente esfriada em nitrogênio líquido.

DETERMINAÇÃO DA ESTRUTURA

Dados de difração de raio X nativos para resolução de 2,8 Â foram colhidos de um cristal simples a cerca de -173,15°C (100 K) usando um detector de dispositivo de carga acoplada ADSC Quantum 4 na linha de feixe X4A do Brookhaven National Laboratory (BNL) National Synchrotron Light Source (NSLS). Os dados foram processados usando os programas de software DENZO e SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997, Methods in Enzymol. 276:307-326). Cristais pertenciam ao grupo espacial P61 ou seu enantiomorfo P65, com dimensões de célula de unidade a = b = 255,09 À, c = 38,64 Á. O conjunto de dados foi 96,6 % completo e tinha uma fusão R de 8,3 %. O coeficiente de Matthews (Matthews, 1968, J. Mol. Biol. 33:491-497) foi 2,59 Â3 Da'1 com um teor de solvente de 52,1 %, que indicou que havia dois complexos na unidade assimétrica. Os dois complexos na unidade assimétrica estavam relacionados por simetria de 2 dobras não-cristalográficas. Os dados estatísticos estão mostrados na Tabela 4.

Pesquisas de substituições molecular foram feitas com o programa AMoRe (Navaza, 1994, Acta Cryst. A50:157-163) do pacote de programa de CCP4 (Collaborative Computational Project No.4. The CCP4 Suite: programs for protein crystallography. 1994, Acta Cryst. D50:760-763), e manipulações de gráficos moleculares foram feitas com o programa QUANTA. Um domínio I de oc1 simples da estrutura do domínio I de a1 de rato da inte-grina α1β1 (número de acesso do Banco de Dados de Proteína (PDB) Ick4; Noite et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385) foi usado como um modelo ou sonda para pesquisas de rotação e translação. A pesquisa de função de translação indicou que os 1g e 9Q mais elevados picos da função de rotação corresponderam às soluções corretas para os dois domínios I de a1 na unidade assimétrica (coeficiente de correlação (cc) = 21,1 %, R = 53,1 %) e que o grupo espacial foi P65. Subseqüentemente, pesquisas para os fragmentos de Fab de hAQC2 foram feitos, mantendo as soluções do domínio I fixas e usando um modelo do domínio de Fv do Fab de hAQC2 como uma sonda de pesquisa. Uma solução clara foi encontrada para um dos dois domínios de Fv (cc = 22,1 %, R = 52,6 %), mas o segundo Fv não pôde ser localizado. A posição do segundo Fv foi derivada usando a simetria de 2-dobras não-cristalográficas. Refinamento de corpo rígido dos dois domínios I e dos dois domínios de Fv reduziu o fator R para 43,6 % (livre de R = 42,7 %). Um mapeamento de densidade de elétron de 2Fo-Fc mostrou densidade de elétron suave para o domínio constante (Fconst) do primeiro fragmento de Fab, mas nenhuma densidade para o domínio de Fconst do segundo fragmento de Fab. Um modelo do domínio de Fconst do primeiro Fab foi ajustado manualmente na densidade de elétron observada. Refinamento de corpo rígido subseqüente com o programa de software CNX (Accelrys Inc., San Diego, CA ©2000; Brunger, 1998, Acta Cryst. D54:905-921), usando dados na faixa de resolução de 500-2,8 Á, otimizou a posição de todos os domínios, reduzindo o fator R para 39,7 % (livre de R = 38,9 %).

Todas as etapas de refinamento subseqüentes foram realizadas com o programa de CNX. Para reduzir influência do modelo, modelos parciais foram usados para cálculo de mapeamento de 2Fo-Fc e refinamento do modelo. O modelo parcial inicial, foi submetido ao tratamento a calor simulado e refinamento de fator B agrupado com restrições de simetria não-cristalográficas. Os fatores de trabalho com R e livre de R caíram para 28,3 % e 32,9 %, respectivamente. Vários ciclos consistindo em construção de modelo iterativo, refinamento posicionai de probabilidade máxima e refinamento de fator B seguiram. Apenas ajustes de modelo que resultaram em uma queda no fator livre de R foram aceitos. Uma correção de solvente de massa foi empregada após o modelo completo ser construído. Os fatores de trabalho com R e livre de R do modelo final são 21,3 % e 27,2 %, respectivamente para os dados (F > 2σ) na faixa de resolução de 500-2,8 Á. O mapeamento de densidade de elétron de 2Fo-Fc final é de qualidade boa para a maior parte do complexo com a exceção dos resíduos de aminoácido 288-295 de um fragmento do domínio I (molécula A na Figura 19) que estão associados com a densidade de elétron fraca e não estão incluídos no modelo. Além disso, o domínio constante inteiro de um fragmento de Fab não tem nenhuma densidade de elétron visível, que indica que é desordenado. Isto parece ser consequência da ausência de contatos cristalinos com o domínio constante do fragmento de Fab devido a sua posição dentro de um canal de solvente grande. Este domínio também não foi incluído no modelo final que consiste em 1030 resíduos de aminoácido, embora constituindo de 6 cadeias de polipeptídeo, e 2 íons de manganês. O desvio posicionai de r.m.s. entre os resíduos equivalentes dos dois complexos na unidade assimétrica é pequeno (0,37 Á para 1660 átomos equivalentes da cadeia principal). Estatísticas estereoquímicas foram calculadas com os programas de software PROCHECK (Laskowski et al., 1993, J. Appl. Cryst. 26:283-291; Morris et al., 1992, Proteins 12:345-364) e CNX. Ligações de hidrogênio (< 3,6 Â) foram encontradas com o programa CONTACT (Tadeusz Skarzynski, Imperial College, Londres, 1.12.88; Collaborative Computational Project No.4. The CCP4 Suite: programs for protein crystallography. 1994, Acta Cryst. D50, 760-763). Todos os resíduos de não-glicina (exceto o resíduo Thr50 da cadeia L que foi debatida abaixo) estão nas regiões permitidas do diagrama de Ramachandran e 86 % dos resíduos estão nas regiões mais favorecidas. O fator B comum dos átomos da cadeia principal é 38,5 À2. Os dados da análise cristalográfica estão na Tabela 4. TABELA 4: SUMÁRIO DA ESTATÍSTICA DOS DADOS E ANÁLISE CRIS- TALOGRÁFICA

COLETA DOS DADOS

Dimensões da célula a, b, c (Á) 255,09, 255,09, 38,64 Grupo espacial P65 Resolução (Á) 500-2,8 (2,9-2,8)+ Reflexões únicas 35275 Perfeição (%) 96,6 (87,7)f Média l/S 11,92 (2,29)f Fusão R* (%) 8,3 (30,9)1 MODELO Número de átomos de não-H 7950 Número de resíduos de proteína 1030 Conteúdos de unidade assimétrica 2 domínios I, 1 fragmento de Fab, 1 domínio de Fv Fator B médio (Á2) 38,5 REFINAMENTO

Faixa de resolução usada (F>2o) 500-2,8 Fator R (trabalhando com R) (%) 21,3 Livre de Rn (%) 27,2 ESTEREOQUÍMICA Desvios de RMS

Comprimentos das ligações (À) 0,007 Ângulos (2) 1,43 Fusão R = íIhi-1hi12^hjIhi f Valores para cápsula de resolução mais alta dada em parêntese. n 8 % dos dados foram alocados para o cálculo de fator livre de R. EXEMPLO 25 Este exemplo descreve a estrutura cristalina do complexo de um domínio I de a1 quimérico de ràto/humano da integrina α1β1 e o fragmento de Fab de hAQC2.

ARQUITETURA DA ESTRUTURA CRISTALINA A estrutura cristalina do complexo do domínio I de a1 quimérico de rato/humano da integrina α1 β1 e o fragmento de Fab de hAQC2 tem uma forma alongada (Figura 20). As dimensões do complexo são 100 Á x 50 Á x 35 Á. O fragmento de Fab apresenta a dobra de imunoglobulina típica. A cadeia leve e as cadeias pesadas do fragmento de Fab cada uma forma duas lâminas largas dos β-filamentos antiparalelos que se acondicionam firmemente entre si para formar uma estrutura para os laços da região determinante de complementaridade (CDR) que se estendem das lâminas acondicionadas. A cadeia leve e a cadeia pesada contêm três laços da CDR. Os laços de cadeia leves são chamados L1, L2 e L3, enquanto os laços das cadeias pesadas são referidos como Η1, H2 e H3. Os laços da região de determinação de complementaridade (CDR) correspondem à estrutura canônica 1 para os laços da cadeia leve L1, L2 e L3 e para os laços da cadeia pesada H1 e H2 (Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883). O laço da cadeia pesada H3 tem uma conformação semelhante ao grampo β que é estabilizada através de ligações de hidrogênio internas como também dois resíduos aromáticos (Tyr104 e Phè105) que são acondicionados junto à cadeia leve. O resíduo Thr50 de L2 adota ângulos diédricos da cadeia principal que caem nas regiões não permitidas do diagrama de Ramachandran. A mesma observação para o resíduo correspondente foi feita para outros anticorpos (Muller et al., 1998, Structure 6, pp.1153-11567) que indica que esta é uma característica natural dos laços de L2. O domínio I de a1 na presente invenção tem uma estrutura bem parecida ao domínio I de a1 não-complexado (número de acesso de PDB Ick4; Noite et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; código de acesso de PDB Iqc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:24906-24913). A estrutura do do- mínio I apresenta uma dobra de "ligação de dinucleotídeo" ou "Rossman" (Rao & Rossman, 1973, J. Mol. Biol. 76:241-256) em que uma lâmina central de cinco β-filamentos paralelos e um filamento antiparalelo pequeno é rodeada em ambos os lados por um total de sete α-hélices. Os seis β-filamentos da estrutura nesta invenção serão referidos como βΑ, βΒ, βΟ, βϋ, βΕ e βΡ e as sete α-hélices são chamadas al, a2, a3, a4, a5, a6 e a7.

Três aspectos estruturais característicos existem para os domínios I. O primeiro aspecto característico é a presença de uma hélice pequena inserida no laço βΕ-α6, denominada como a hélice C. A maior parte do laço da hélice C da molécula A (Figura 19) na presente invenção está associada com densidade de elétron fraca, o que sugere distúrbio. Isto parece ser uma conseqüência da ausência de contatos cristalinos ou contatos com o Fab que pode ter estabilizado no laço. Porém, o mesmo laço na molécula B (Figura 19) na presente invenção tem densidade de elétron bem definida e foi incluído no modelo. O segundo aspecto característico dos domínios I de a1 é o MIDAS ou Sítio-de-Adesão-Dependente-de-íon-de-Metal onde íons de metal e ligandos são implicados para ligar o domínio I. Cinco resíduos principais que formam parte do MIDAS são referidos como o motivo "DxSxS-T-D." Estes resíduos, que são completamente conservados entre os domínios I, coordenam o íon de metal (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:82808288). Os cristais na presente invenção foram desenvolvidos na presença de manganês e o sítio de MIDAS do domínio I nesta estrutura é observado conter um íon de metal de Mn+2. O íon é coordenado diretamente pelas cadeias laterais de resíduos Ser156, Ser158 e Thr224. O mapeamento de densidade de elétron de 2Fo-Fc não mostra nenhuma evidência que os resíduos de MIDAS Asp154 e Asp257 fazem coordenação indireta mediada por água do íon de metal (Figura 20). Porém, a ausência evidente das moléculas de água pode ser uma conseqüência da resolução limitada (2,8 À) do mapeamento de densidade de elétron. O terceiro aspecto dos domínios I é que todas as estruturas determinadas dos domínios I pertencem a uma de duas conformações chamadas "aberta" e "fechada." As diferenças entre a conformação aberta e fechada incluem um modo diferente de coordenação do íon de metal e uma alteração posicionai significativa (cerca de 10 À) da hélice C-terminal do domínio I. O domínio I no complexo na presente invenção encontra-se na conformação fechada.

Na estrutura do complexo na presente invenção, o fragmento de Fab liga ao seu epitopo na superfície superior dianteira do domínio I com uma impressão digital de 35 Á por 30 Á. A área de superfície total enterrada na interface de anticorpo-antígeno é 1534 Á2 que é típico de outros complexos de anticorpo-antígeno (Davies et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7-12; Jones & Thornton, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:13-20). A superfície é 25 % hidrofóbica e 75 % hidrófila no caráter. A cadeia pesada contribui 65 % da área de superfície enterrada para o complexo, embora os 35 % restantes sejam contribuídos pela cadeia leve. O epitopo de anticorpo consiste em resíduos localizados em quatro laços do domínio I (Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56). Três dos laços formam o sítio de MIDAS: laço 1 (βΑ-α1) contendo a sequência de DXSXS conservada, laço 2 (cc3-oc4) que contém o MIDAS Thr224 e laço 3 (βϋ-α5) que contém o resíduo de MIDAS Asp257. O quarto laço é o laço da hélice C e está envolvido em apenas contatos secundários. O aspecto central da interação de antígeno-anticorpo é a coordenação do sítio de íon de metal MIDAS por Asp101 do H3 da CDR do anticorpo (Figura 20). A distância entre o íon e Οδ1 de Asp101 é 2,4 Á. Além disso, o átomo Οδ2 de Asp101 está interagindo com His261 do domínio I. De forma interessante, ο H3 da CDR contém vários resíduos de glicina adjacentes ao Asp101 (sequência GFGDGGY) (SEQ ID NO: 62), presumivelmente para permitir flexibilidade suficiente ao laço da CDR para permitir coordenação própria do íon de metal. A seqüência do H3 da CDR é essencialmente invariante nos anticorpos monoclonais que foram desenvolvidos contra o mesmo antígeno e observados pertencer à mesma classe. A maioria dos resíduos de anticorpo que estão envolvidos nos contatos de anticorpo-antígeno fica localizada nos laços L3, H1, H2 e H3 da CDR. Alguns resíduos dos laços L1 (Asn30) e L2 (Tyr48) parecem formar contatos secundários de Van Der Waals. L3 contribui primariamente para contatos através de dois resíduos hidrofóbicos grandes, Trp90 e Trp95. Além disso, Asn93 do L3 forma ligações de hidrogênio com Gln223 do domínio I. As cadeias laterais de His56 e Tyr58 do laço H2 formam ligações de hidrogênio com os átomos da cadeia principal do laço 2 do domínio I. Arg31 de H1 entra em contato com Arg291 do laço 4 do domínio I. Arg222 do laço 2 do domínio I é intercalado entre vários resíduos do anticorpo incluindo Tyr58, Trp95 e Asn93. Este é o único resíduo fora os quatro transformados no domínio I de RAH que está envolvido nos contatos com o Fab. É portanto provável que ele seja o único resíduo responsável em restabelecer a ligação do anticorpo após a mutagênese.

COMPARAÇÃO DA ESTRUTURA CRISTALINA DO COMPLEXO DE UM DOMÍNIO I DE a1 QUIMÉRICO DE RATO/HUMANO E FRAGMENTO DE Fab DE hAQC2 COM OUTRAS ESTRUTURAS DO DOMÍNIO I O domínio I de a1 quimérico de RAH tem quatro diferenças de seqüência com o domínio I de a1 de rato (resíduos de rato: 217G, 218R, 219Q e 222L), oito diferenças de seqüência com o domínio I de a1 humano (resíduos humanos: 163D, 166T, 214K, 264H, 268K, 288S, 322I e 380T), e dez diferenças de seqüência com o clone usado nos estudos de estrutura cristalina do domínio I de a1 humano (resíduos do clone: 163D, 166T, 174E, 214K, 230I, 264H, 268K, 288S, 322I e 380T). Na estrutura cristalina não-ligada do domínio I de α1α1β1 de rato (código de acesso de PDB Ick4; Noite et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), o domínio I de a1 não contém nenhum íon de metal ligado e adota a conformação "fechada." Na estrutura cristalina não-ligada do domínio I de a1 humano (código de acesso 1qc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem 274:24906-24913), o domínio I de a1 contém Mg+2 ligado e similarmente adota a conformação fechada. Superimposição destas duas estruturas com o domínio I de a1 quimérico complexado indica que há apenas alterações conformacionais secundárias na ligação do anticorpo de hAQC2. O desvio posicionai de r.m.s. entre o domínio I de a1 de rato e quimérico é 1,04 Á para todos os 768 átomos da cadeia principal. O desvio posicionai de r.m.s. entre o domínio I de a1 humano e quimérico é 0,69 Á para todos os 764 átomos da cadeia principal. As diferenças maiores (par de domínios I de a1 humano e quimérico) são observadas no laço 1 (desvios de r.m.s. 1,24 Á para os átomos da cadeia principal dos resíduos 154-161) e no laço 4 (laço da hélice C) do domínio I de oc1 (desvios de r.m.s. 1,55 Á para os átomos da cadeia principal dos resíduos 288-296). Porém, estas diferenças podem ser descritas mais com precisão como trocas dos elementos da estrutura secundária totais que alterações conformacionais complexas. É provável que estas estejam dentro da faixa normal de flexibilidade conformacional de proteínas. O desvio posicionai de r.m.s. entre o domínio I de a1 humano e quimérico para os átomos da cadeia principal dos resíduos de aminoácido Glu192, Gln218, Arg219, Gly220 e Gly221 (numeração de cristal) é 0,33 Á. O desvio posicionai de r.m.s. entre o domínio I de otl de rato e quimérico dos átomos da cadeia principal dos resíduos de ami-noácido Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291 e Leu294 (numeração de cristal) é 0,97 Á. O domínio I mantém a conformação do domínio I "fechada" que apenas foi observada para domínios I não-ligados cristalizados na ausência dos ligandos ou pseudo-ligandos ligados ao sítio de MIDAS. O desvio posicionai de r.m.s. das hélices C-terminal dos domínios I humano e quimérico (calculado para os átomos da cadeia principal dos resíduos 321-335) é 0,64 À. Um mapeamento de omissão de tratamento simulado calculado para o modelo refinado final de forma não-ambígua confirma que a posição dos elementos estruturais da hélice C-terminal e adjacentes são consistentes com a conformação fechada.

Para investigar os efeitos da ligação do ligando aos modos de coordenação do íon de metal, a estrutura da presente invenção foi sobreposta nas estruturas do domínio I de a2 não-ligado (código de acesso de PDB 1aox; Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517) e do domínio I de a2 complexado com um peptídeo de colágeno (código de acesso de PDB 1dzi; Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56). A coordenação do íon de metal por Asp101 do anticorpo é notavelmente similar à coordenação do íon de metal do domínio I de a2 por um ácido glutâmico do peptídeo de coláge- no. Outra característica que é conservada é a interação simultânea do grupo acídico com His261 (His258 no domínio I de oc2). Todos os resíduos de Ml-DAS do complexo de domínio l-Fab exceto Ser156 e Ser158 adotam conformações bem parecidas àquelas observadas no domínio I não-ligado. Em contraste, as cadeias laterais de Ser156 e Ser158, como também o metal, adotam conformações similares àquelas do domínio I não-ligado. Está claro que a coordenação do íon de metal por Asp101 não permite o íon manter a posição e distâncias de coordenação que são observadas no estado não-ligado. Desse modo, o íon de metal não é coordenado diretamente por Asp257, um fato que permite ao íon manter eletrofilicidade alta. IMPLICAÇÕES BIOLÓGICAS

Na presente invenção, não há nenhuma coordenação direta do metal por Asp257, que pode permitir ligação de alta afinidade diminuindo a barreira de energia entre uma conformação fechada (nenhum ligando ligado) e aberta (ligando ligado). Porém, a coordenação do metal por um ácido as-pártico do anticorpo não é suficiente para induzir a conformação aberta ao domínio I na presente invenção. A estrutura do complexo do domínio I - Fab indica que é possível ter ligação forte ao domínio I adotando a conformação fechada e que a coordenação do íon de metal por um resíduo acídico do ligando pode ser necessária mas não suficiente para induzir uma alteração conformacional para o estado aberto. Ligação do anticorpo é esperada estabilizar o estado de baixa afinidade da integrina e evitar a sinalização externa que pode acompanhar a ligação da integrina ao colágeno.

Embora a invenção anterior tenha sido descrita em algum detalhe por via de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será evidente àqueles versados na técnica que certas alterações e modificações serão praticadas. Portanto, a descrição e exemplos não devem ser interpretados como limitação do escopo da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims (23)

1. Anticorpo anti-VLA-1 ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que as regiões de determinação de com-plementariedade de cadeia leve são definidas pelos resíduos de aminoáci-dos 24 a 33, 49 a 55 e 88 a 96 de SEQ ID NO: 1, e as regiões de determinação de complementariedade de cadeia pesada são definidas pelos resíduos de aminoácidos 31 a 35, 50 a 65, e 98 a 107 de SEQ ID NO: 2.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes resíduos em sua cadeia pesada: V12, F29, A49, Y93 e Y94 (convenção de numeração de Kabat).

3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um dos seguintes resíduos em sua cadeia leve: Q1, L4 e S71 (convenção de numeração de Kabat).

4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma sequência de domínio variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 1 e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2; ou (b) as mesmas sequências de polipeptídeos de cadeias pesada e leve como um anticorpo produzido pelo hibridoma mAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3273).

5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é humanizado.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende pelo menos um dos seguintes resíduos em sua cadeia leve: Q1, L4, P45, W46 e S71; ou pelo menos um dos seguintes resíduos em sua cadeia pesada: D1, V12, S28, F29, A49, Y93, Y94 (convenção de numeração de Kabat).

7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende uma sequência de domínio variável de cadeia leve definida pelos resíduos de aminoácidos 1 a 106 da SEQ ID NO: 3, e uma sequência de domínio variável de cadeia pesada definida pelos resíduos de aminoácidos 1 a 118 da SEQ ID NO: 4.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende as mesmas sequências de polipeptídeos de cadeias pesada e leve como um anticorpo produzido pela linhagem celular hAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3275).

9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende as mesmas sequências de polipeptídeos de cadeias pesada e leve como um anticorpo produzido pela linhagem celular hsAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3356).

10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende as mesmas sequências de polipeptídeos de cadeias pesada e leve como um anticorpo produzido pela linhagem celular haAQC2 (número de acesso de ATCC PTA3274).

11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende mutações L235A e L236A (sistema de numeração de EU) em sua cadeia pesada em comparação com anticorpo inalterado.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento é mutado em um resíduo de aminoácido que é um sítio de glicosilação, assim eliminando o sítio de glicosilação.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende a mutação N298Q em sua cadeia pesada (sistema de numera- ção de EU).

14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende uma sequencia de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia de SEQ ID NO: 4.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende uma sequencia de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma sequencia de cadeia de SEQ ID NO: 6.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento compreende uma sequencia de cadeia leve de SEQ ID NO: 3 e uma sequencia de cadeia de SEQ ID NO: 5.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 49 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 42; (ii) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 51 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 44; (iii) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 66 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 42; (iv) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 54 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 68; (v) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 66 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 68; (vi) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 54 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 42; (vii) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 58 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 68; (viii) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 70 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 68; ou (ix) uma cadeia leve compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 47 e uma cadeia pesada compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 68.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o fragmento de ligação a antígeno é selecionado do grupo consistindo em um Fab, um F(ab)2 e uma cadeia única Fv.

19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

20. Ácido nucléico, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de SEQ ID NO: 39, 41,43, 45, 46, 48, 50, 52, 53, ou 57.

21. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o ácido nucléico, como definido na reivindicação 20.

22. Método in vitro para determinar o nível de VLA-1 em um tecido, caracterizado pelo fato de que compreende contatar o tecido com o anticorpo, como definido na reivindicação 1, e detectar a ligação do anticorpo ao tecido, assim determinando o nível de VLA-1 no tecido.

23. Método para identificar um inibidor de um domínio I de uma integrina, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) usar as coordenadas da estrutura dos aminoácidos de hAQC2 compreendendo resíduos de cadeia leve Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 and Trp95 de acordo com a SEQ ID NO: 3 e resíduos de cadeia pesada Arg31, His56, Tyr58, Gly100 e Asp101 de acordo com a SEQ ID NO: 4, ou um desvio médio quadrado de raiz dos átomos da cadeia principal dos ditos aminoácidos de hAQC2 de não mais que ± 1,10 Á, para gerar uma es- trutura tridimensional de um sítio de ligação; (b) empregar a dita estrutura tridimensional para designar ou selecionar um antagonista potencial; (c) sintetizar o dito antagonista potencial; e(d) contatar o dito antagonista potencial com um domínio I de a1 de VLA-1 para determinar a capacidade do dito antagonista potencial de se ligar ao domínio I de a1, em que a capacidade do dito antagonista potencial de se ligar ao domínio I de a1 indica que o antagonista potencial é um inibidor do domínio I de a1 de VLA-1.