ES2347532T3 - Anticuerpos contra vla-1. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti-VLA-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

Description

Anticuerpos contra VLA-1.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a anticuerpos contra la integrina VLA-1 y estos anticuerpos para tratar enfermedades inflamatorias y otros trastornos inmunológicos.

Esta invención describe la estructura cristalina del complejo entre uno de dichos anticuerpos y el dominio \alpha1-I de VLA-1, y el uso de esta información estructural para el diseño computacional de fármacos.

Antecedentes de la invención

Las integrinas son una superfamilia de receptores de superficie celular que median la adhesión célula-célula y célula-matriz. Estas proteínas son conocidas por proporcionar anclaje así como señales para el crecimiento, migración y diferenciación celular durante el desarrollo y la reparación tisular. Se han implicado en procesos inmunes e inflamatorios.

Las integrinas son proteínas heterodiméricas compuestas por dos cadenas polipeptídicas unidas no covalentemente, \alpha y \beta. El extremo amino d cada cadena forma una cabeza globular que contribuye a la unión intercatenaria y a la unión a ligando. Las cabezas globulares están conectadas a los segmentos transmembrana por troncos. Las colas citoplásmicas habitualmente son de menos de 50 restos aminoacídicos de longitud. Las subfamilias de integrinas se definieron originalmente en base a qué subunidad \beta se usaba para formar los heterodímeros. Las integrinas que contiene \beta1 también se llaman moléculas VLA, que se refiere a antígenos de "activación muy tardía (del inglés very late activation)". De VLA-1 a VLA-6 se refiere a miembros de la subfamilia \beta1 que contienen de \alpha1 a \alpha6 (es decir, CD49a a CD49f), respectivamente. Para una revisión general, véase Cellular and Molecular Immunology, eds. Abul K. Abbas et al., W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA, 2000.

El colágeno (ambos tipos I y IV) y la laminina son ligandos conocidos de la integrina \alpha1\beta1 (es decir, VLA-1). VLA-1 se ha implicado en la adhesión y migración celular sobre colágeno (Keely et al., 1995, J. Cell Sci. 108:595-607; y Gotwals et al., 1996, J. Clin. Invest. 97:2469-2477); en la promoción de la contracción y reorganización de matrices de colágeno, un componente crítico de la curación de heridas (Gotwals et al., supra; y Chiro, 1991, Cell 67:403-410); y en la regulación de la expresión de genes implicados en el remodelado de la matriz extracelular (Riikonen et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:1-5; y Langholz et al., 1995, J. Cell Biol. 131:1903-1915). Por tanto, la regulación inapropiada de VLA-1 puede provocar ciertas afecciones patológicas tales como fibrosis.

Además, se ha sugerido que VLA-1 puede desempeñar un papel en enfermedades dirigidas por células T/monocito. Los anticuerpos anti-VLA-1 bloquean la expresión de citoquinas dependiente de células T (Miyake et al., 1993, J. Exp. Med. 177:863-868). La expresión de VLA-1 se aumenta en células T activadas de forma persistente, de 2 a 4 semanas de edad (Hemler et al., 1985, Eur. J. Immunol. 15: 502-508). VLA-1 también se expresa en un elevado porcentaje en células T aisladas del fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Hemler et al., 1986, J. Clin. Invest. 78:692-702).

Se han determinado varias estructuras cristalinas de subunidades \alpha de integrina, incluyendo las estructuras del dominio \alpha2-I de \alpha2\beta1 (código de acceso a PDB laox; Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517); el dominio \alpha1-I de \alpha1\beta1 de rata (número de acceso a PDB 1ck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; documento WO 00/20459); la subunidad \alpha1 de \alpha1\beta1 humana (código de acceso a PDB 1qc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:24906-24913); los dominios \alphaL-I y \alphaM-I; y vWF-A3 (Lee et al., 1995, Cell 80:631-635; Lee et al., 1995, Structure 3:1333-1340; Qu et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:10277-10281; Qu et al., 1996, Structure 4:931-942). La estructura de \alpha2\beta1 reveló una hélice (es decir, la hélice C) que creaba una zanja o surco en un lado de la proteína en el sitio de unión a iones metálicos (Emsley et al., supra). La estructura cristalina del dominio \alpha2-I en complejo con un corto péptido triple helicoide basado en colágeno reveló que el péptido basado en colágeno se unía a esa zanja, donde los aminoácidos de \alpha2-I que hacían los contactos intermoleculares o con el metal incluían Asp151, Asp154, Tyr157, Gln215, Asp219, Leu220, Thr221, Asp254, Glu256, His258, Tyr285, Leu286, Asn289, Leu291, Asn295, y Lys298 (código de acceso a PDB 1dzi; Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56; documento WO 01/73444). La numeración de aminoácidos inmediatamente anterior se basa en el código de acceso a PDB 1dzi y en este documento se menciona como "numeración cristalina". Las estructuras cristalinas de los dominios \alpha1-I de rata y humano revelaron una zanja similar.

Varias investigaciones han descrito anticuerpos anti-VLA-1. De Fougerolles et al. (J. Clin. Invest., 2000, 205:721-729) describe la importancia de las integrinas de unión a colágeno en enfermedades inflamatorias, y describe un anticuerpo monoclonal de hámster creado contra cadenas de integrina murina. Mendrick et al. (Lab. Invest., 1995, 72:367-375) describe varios anticuerpos anti-VLA-1 que reconocen VLA-1 humano y de rata. El documento US-A 5.788.966 describe dos anticuerpos anti-VLA-1, uno de los cuales reconoce VLA-1 humano y de rata. El segundo anticuerpo anti-VLA-1 no afecta a la unión de linfocitos activados a placas tratadas con colágeno IV, como se describe por Fabbri et al. (Tissue Antigens, 1996, 48:47-51). El documento JP-A 08-13118 describe un anticuerpo monoclonal capaz de reaccionar con VLA-1 murino. Fabbri et al. (loc. cit.) describen un anticuerpo monoclonal anti-VLA-1 denominado FB12. FB12 inhibe la unión de linfocitos activados a placas tratadas con colágeno. El efecto inhibidor del anticuerpo se estabiliza a aproximadamente 10 \mug/ml de FB12.

\vskip1.000000\baselineskip

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a los siguientes puntos:

Punto 1. Un anticuerpo anti-VLA-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

Punto 2. El anticuerpo del punto 1, donde el anticuerpo comprende al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: V12, F29, A49, T93 y R94.

Punto 3. El anticuerpo del punto 1, donde el anticuerpo comprende al menos uno de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4 e Y71.

Punto 4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 1, donde el anticuerpo comprende:

(a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 1 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 2; o

(b) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

Punto 5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 1, donde el anticuerpo o fragmento es un anticuerpo humanizado.

Punto 6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 5, donde el anticuerpo o fragmento comprende:

(a) al menos uno de los siguientes restos en su cada ligera: Q1, L4, P46, W47 e Y71; o al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: D1, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (convención de numeración de Kabat); o

(b) una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los restos aminoacídicos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los restos aminoacídicos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; o

(c) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275); o

(d) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356); o

(e) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274).

Punto 7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 5, donde la cadena pesada está mutada en uno o más de los restos aminoacídicos seleccionados entre el grupo compuesto por los restos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 (sistema de numeración EU), causando de este modo una alteración en una función efectora reteniendo al mismo tiempo la unión a VLA-1 en comparación con un anticuerpo no modificado.

Punto 8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 7, donde el anticuerpo o fragmento comprende las mutaciones L234A y L235A (sistema de numeración EU) en su cadena pesada en comparación con un anticuerpo no modificado.

Punto 9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 5, donde el anticuerpo o fragmento está mutado en un resto aminoacídico que es un sitio de glucosilación, eliminando de este modo el sitio de glucosilación.

Punto 10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo del punto 9, donde el anticuerpo o fragmento comprende la mutación N297Q en su cadena pesada (sistema de numeración EU).

Punto 11. Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de uno cualquiera de los puntos 1 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

\newpage

Punto 12. Una secuencia de ácido nucleico aislada que comprende ADN que se selecciona entre el grupo compuesto por:

(a) una secuencia codificante para la SEC ID Nº 1 y una secuencia codificante para la SEC ID Nº 2;

(b) una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273) y una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273);

(c) una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC TA3275) y una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275);

(d) una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274);

(e) una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356);

(f) una secuencia codificante para los restos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3 y una secuencia codificante para los restos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; y

(g) secuencias codificantes para un anticuerpo anti-VLA-1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

Punto 13. Uso de la composición del punto 11 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno inmunológico.

Punto 14. Un método in vitro para determinar el nivel de VLA-1 en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con anticuerpo del punto 1, y detectar la unión del anticuerpo al tejido, determinando de este modo el nivel de VLA-1 en el tejido.

Punto 15. Uso de la composición del punto 11 para la preparación de una composición para la determinación del nivel de VLA-1 en un tejido para su uso en el diagnóstico de un trastorno inmunológico.

Punto 16. Una célula de la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275), haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274), hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356) o del hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

Punto 17. Un método para identificar un inhibidor de un dominio I de una integrina que comprende las etapas de:

(a) usar las coordenadas estructurales de los aminoácidos de hAQC2 que comprenden los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pasada Arg31, His56, Tyr58, Gly100 y Asp101, de acuerdo con la Fig. 19 o \pm una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de dichos aminoácidos de hAQC2 de no más de 1,10 \ring{A}, para generar una estructura tridimensional de un sitio de unión;

(b) emplear dicha estructura tridimensional par diseñar o seleccionar un antagonista potencial;

(c) sintetizar dicho antagonista potencial; y

(d) poner en contacto dicho antagonista potencial con hAQC2 para determinar la capacidad de dicho antagonista potencial de interaccionar con hAQC2, donde la capacidad de dicho antagonista potencial de interaccionar con hAQC2 indica que el antagonista potencial es un inhibidor del dominio I.

Punto 18. El uso del punto 13 ó 15, donde el trastorno inmunológico se selecciona entre el grupo compuesto por un trastorno gastrointestinal, una enfermedad autoinmune, una fibrosis, un trastorno cutáneo, una enfermedad vascular, rinitis alérgica, síndrome de distrés respiratorio, asma, bronquitis, tendinitis, bursitis, una cefalea en migrañas, periarteritis nodosa, tiroiditis, anemia aplásica, enfermedad de Hodgkin, fiebre reumática, osteoartritis, sarcoidosis, síndrome nefrótico, fallo renal, síndrome de Bechet, polimiositis, gingivitis, hipersensibilidad, rechazo de injertos o trasplantes, enfermedad de injerto contra hospedador, conjuntivitis, hinchamiento después de lesión, isquemia miocárdica, y síndrome de choque por endotoxinas.

Punto 19. El anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, de uno cualquier de los puntos 1 a 10, donde el fragmento de unión a antígeno se selecciona entre el grupo compuesto por un Fab, a F(ab')2 y un Fv de cadena sencilla.

La presente invención describe anticuerpos anti-VLA-1 y estos anticuerpos para tratar una diversidad de trastornos inflamatorios e inmunológicos.

Específicamente, la invención describe un anticuerpo que se une específicamente a VLA-1 (por ejemplo, VLA-1 humano). También se describe en el contexto de esta invención que este anticuerpo contiene regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera ("CDR") definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y/o regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2. Se describe en este documento que estas CDR pueden contener mutaciones (por ejemplo, deleciones, inserciones y/o sustituciones) en las partes no de contacto con el antígeno, determinadas a partir de la estructura cristalina descrita en este documento, sin afectar a la actividad de unión a VLA-1 del anticuerpo. Son mutaciones ejemplares S24N, G92S y D101A en las CDR de cadena ligera, y G55S en la CDR2 de cadena pesada. El anticuerpo descrito en el contexto de esta invención puede contener una secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 1 y/o una secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 2.

El anticuerpo descrito en el contexto de esta invención también puede contener las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2, depositado el 18 de abril de 2001 en la American Type Culture Collection ("ATCC"), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209 y que tiene el número de acceso a la ATCC PTA3273. (Todos los depósitos en la ATCC enumerad en este documento se hicieron según el Tratado de Budapest). Este anticuerpo puede producirse por, por ejemplo, el hibridoma mAQC2, o células que contienen secuencias de ácido nucleico aisladas de ese hibridoma que codifican las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal mAQC2.

El anticuerpo descrito en este documento también puede ser un anticuerpo humanizado que comprende al menos uno (por ejemplo, 2, 3, 4 ó 5) de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4, P46, W47 e Y71; o al menos uno (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7) de los siguientes restos en su cadena pesada: D1 V12, S28, F29, A49, T93, R94 (convención de numeración de Kabat). Por ejemplo, el anticuerpo descrito comprende Q1, L4 e Y71 en la cadena ligera; y/o (i) F29, A49, T93 y R94, o (ii) A49 y T93, en la cadena pesada.

El anticuerpo humanizado descrito en el contexto de esta invención puede contener una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los restos aminoacídicos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3, y/o una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los restos aminoacídicos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4. El anticuerpo humanizado descrito también puede comprender las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y/o ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275; depositada el 18 de abril de 2001).

El anticuerpo humanizado descrito en el contexto de esta invención también puede contener una mutación (por ejemplo, deleción, sustitución o adición) en una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8) de ciertas posiciones en la cadena pesada de modo que se altere una función efectora del anticuerpo (por ejemplo, la capacidad del anticuerpo de unirse a un receptor Fc o un factor del complemento) sin afectar a la capacidad del anticuerpo de unirse a VLA-1 (patente de Estados Unidos 5.648.260). Estas posiciones de cadena pesada incluyen, sin limitación, los restos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 (sistema de numeración EU). El anticuerpo humanizado descrito puede contener, por ejemplo, las mutaciones L234A (es decir, el remplazo de leucina en la posición 234 de un anticuerpo no modificado con alanina) y L235A (sistema de numeración EU) en su cadena pesada. El anticuerpo descrito también puede comprender la misma secuencia polipeptídica de cadena pesada que un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356; depositada el 4 de mayo de 2001).

El anticuerpo humanizado descrito en el contexto de esta invención puede contener una mutación (por ejemplo, deleción o sustitución) en un resto aminoacídico que es un sitio para la glucosilación, de modo que se elimine el sitio de glucosilación. Dicho anticuerpo puede ser clínicamente beneficioso para tener funciones efectoras u otras funciones indeseadas reducidas reteniendo al mismo tiempo su afinidad de unión a VLA-1. Las mutaciones de sitios de glucosilación también pueden ser beneficiosas para el desarrollo de procesos (por ejemplo, expresión y purificación de proteínas). Por ejemplo, la cadena pesada del anticuerpo descrito puede contener la mutación N297Q (sistema de numeración EU) de modo que la cadena pesada ya no pueda glucosilarse en este sitio. El anticuerpo humanizado descrito en este documento también puede comprender la misma secuencia polipeptídica de cadena pesada que un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274; depositada el 18 de abril de 2001).

Además, las cadenas pesada y/o ligera del anticuerpo descrito en el contexto de esta invención contienen mutaciones que aumentan la afinidad para la unión a VLA-1 y que aumentan de este modo la potencia para tratar trastornos mediados por VLA-1.

También se describen en el contexto de esta invención una composición que contiene un anticuerpo descrito en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la SEC ID Nº 1; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la SEC ID Nº 2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para los restos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3; un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia codificante para los restos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; células del hibridoma mAQC2; células de la línea celular hAQC2; células de la línea celular haAQC2; y células de la línea celular hsAQC2.

La presente invención también describe el anticuerpo descrito en el contexto de esta invención para tratar un sujeto con un trastorno inmunológico mediado por VLA-1, donde dicho anticuerpo se prepara para la administración al sujeto en una cantidad eficaz. Por ejemplo, este anticuerpo es para tratar un a sujeto humano ara paliar, mejorar, estabilizar, revertir, prevenir, ralentizar o retardar el progreso del trastorno. Como alternativa, este anticuerpo es para tratar profilácticamente a un sujeto humano en riesgo de desarrollar este trastorno inmunológico para prevenir o retardar la aparición del trastorno. Una "cantidad eficaz" de la composición puede administrarse en una o más dosificaciones.

Los trastornos inmunológicos mediados por VLA-1 incluyen, aunque sin limitación, trastornos en los que el nivel de actividad de VLA-1 está elevado en uno o más tejidos en comparación con un sujeto normal. Ejemplos de dichos trastornos son afecciones relacionadas con la piel (por ejemplo, psoriasis, eccema, quemaduras, dermatitis, y proliferación anormal de células foliculares pilosas), fibrosis (por ejemplo, fibrosis renal o pulmonar), rinitis alérgica, síndrome de distrés respiratorio, asma, bronquitis, tendinitis, bursitis, fiebre, cefaleas en migrañas, afecciones gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad de Crohn, gastritis, síndrome del intestino irritable, colitis y cáncer colorrectal), enfermedades vasculares (por ejemplo, aterosclerosis), periarteritis nodosa, tiroiditis, anemia aplásica, enfermedad de Hodgkin, fiebre reumática, osteoartritis, enfermedades autoinmunes (por ejemplo, diabetes tipo I, miastenia grave, artritis reumatoide, lupus sistémico eritematoso, y esclerosis múltiple), sarcoidosis, síndrome nefrótico, fallo renal, síndrome de Bechet, polimiositis, gingivitis, hipersensibilidad (por ejemplo, hipersensibilidad de tipo retardado o hipersensibilidad inmediata), rechazos de injertos y trasplantes, enfermedad de injerto contra hospedador (GVHD), conjuntivitis, hinchamiento que sucede después de lesión, isquemia miocárdica, y síndrome de choque por endotoxinas.

La presente invención también describe un método in vitro para determinar el nivel de VLA-1 en un tejido (por ejemplo, muestra tisular y fluid corporal) que comprende poner en contacto el tejido con el anticuerpo descrito en el contexto de la invención, y después detectar la unión del anticuerpo al tejido, determinando de este modo el nivel de VLA-1 en el tejido.

Como se usa en este documento, el anticuerpo descrito en el contexto de esta invención puede ser, por ejemplo, un anticuerpo murino, un anticuerpo humanizado, o un anticuerpo quimérico. Puede ser un anticuerpo completo (es decir, con dos cadenas ligeras de longitud completa y dos cadenas pesadas de longitud completa) de cualquier isotipo y subtipo (por ejemplo, IgM, IgD, IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgE, IgA_{1} e IgA_{2}; con la cadena ligera kappa o lambda). Como alternativa, el anticuerpo descrito en el contexto de esta invención se refiere a un fragmento de unión a antígeno (por ejemplo, Fab, F(ab')_{2}, y Fv de cadena sencilla) de un anticuerpo completo.

La presente invención describe adicionalmente composiciones cristalizables y cristales de complejos formados por un dominio \alpha1-I quimérico de rata-ser humano (R\DeltaH mutante) y un fragmento Fab de hAQC2, y métodos para usar dichas composiciones y cristales. Esta invención también describe las coordenadas estructurales y los sitios de unión del dominio quimérico y el fragmento Fab de hAQC2. Las coordenadas atómicas obtenidas de la estructura cristalina descrita en este documento proporcionan una base estructural para las actividades biológicas de hAQC2 así como una base para el diseño racional de agonistas o antagonistas de VLA-1 con actividades biológicas predichas (por ejemplo, compuestos de molécula pequeña o anticuerpos tale como hAQC2 variantes).

La estructura cristalina descrita en este documento es la primera estricta cristalina de un dominio \alpha1-I de un complejo integrina \alpha1\beta1/Fab. Esta estructura muestra los restos críticos para la unión de Fab por el dominio \alpha1-I. Además, el Fab se une en el supuesto sitio de unión a colágeno e inhibe la unió del colágeno. Los restos aminoacídicos hallados en el sitio de unión en el dominio \alpha1-I incluyen Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Glu218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina). Los restos en el fragmento Fab que se ha hallado que se unen al dominio \alpha1-I incluyen los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina).

Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de un complejo molecular, donde el complejo molecular está definido por la serie de coordenadas estructurales de un complejo de un dominio I quimérico de una integrina \alpha1\beta1 R\DeltaH y el anticuerpo humanizado hAQC2, de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo del complejo molecular, teniendo el homólogo una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos de no más de 0,65 \ring{A}. El ordenador descrito en este documento incluye un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que incluye un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos contienen al menos una parte de las coordenadas estructurales del complejo de acuerdo con la Fig. 19; una memoria de trabajo para almacenar instrucciones para procesar los datos legibles mecánicamente; una unidad de procesamiento central acoplada a la memoria de trabajo y al medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente para procesar los datos legibles mecánicamente en las representaciones tridimensionales; y una pantalla acoplada a la unidad de procesamiento central para presentar la representación tridimensional.

Esta invención describe adicionalmente un ordenador para producir una representación tridimensional de una molécula o complejo molecular que incluye un sitio de unión definido a por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de hAQC2 que incluyen al menos siete (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ó 16) de los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un sitio de unión que tiene un desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos de hAQC2 de no más de 1,10 \ring{A}. Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos de hAQC2 que incluyen al menos siete (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ó 16) de los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; un sitio de unión de un homólogo que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos de hAQC2 de no más de 1,10 \ring{A}.

Esta invención también describe un método para identificar un inhibidor de un dominio I de una integrina que incluye las etapas de usar las coordenadas estructurales de los aminoácidos de hAQC2 que incluyen al menos siete (por ejemplo, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ó 16) de los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19 o \pm una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos de hAQC2 de no más de 1,10 \ring{A}, para generar una estructura tridimensional de un sitio de unión; emplear la estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un antagonista potencial; sintetizar el antagonista potencial; y poner en contacto el antagonista potencial con hAQC2 para determinar la capacidad del antagonista potencial de interaccionar con hAQC2, donde la capacidad antagonista potencial de interaccionar con hAQC2 indica que el antagonista potencial es un inhibidor del dominio I. Esta invención describe adicionalmente un inhibidor del dominio I de la integrina identificada por este método.

Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de una molécula o complejo molecular que incluye: un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los restos aminoacídicos del dominio I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un segundo sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I de no más de 0,65 \ring{A}. Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de: un primer sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los restos aminoacídicos del dominio I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un sitio de unión de un homólogo que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I de no más de 0,65 \ring{A}.

Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de una molécula o complejo molecular que incluye: un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos del dominio I que incluyen al menos tres de los restos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, y Gly221 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un segundo sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a parir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I de no más de 1,0 \ring{A}. La invención describe adicionalmente un ordenador para producir una representación tridimensional de un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos del dominio I que incluyen al menos tres de los restos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, y Gly221 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un sitio de unión de un homólogo que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I de no más de 1,0 \ring{A}.

Esta invención describe adicionalmente métodos para usar estas representaciones tridimensionales para diseñar entidades químicas que se asocian con el dominio quimérico o el fragmento Fab de hAQC2, o partes del mismo; y actuar como inhibidores potenciales del dominio quimérico o el fragmento Fab de hAQC2, o partes del mismo. Esta invención también describe composiciones que incluyen entidades químicas, tales como inhibidores y variantes del dominio quimérico o variantes del fragmento Fab de hAQC2, donde dichas entidades químicas y variantes se diseñan racionalmente mediante la coordenadas estructurales del dominio quimérico o el fragmento Fab de hAQC2, o sitios de unión. La invención describe adicionalmente las entidades químicas identificadas anteriormente para tratar o prevenir afecciones asociadas con actividad \alpha1\beta1 inapropiada o anormal en un sujeto.

Esta invención describe adicionalmente un método para identificar un inhibidor de un dominio I de una integrina incluyendo las etapas de usar las coordenadas estructurales de los restos aminoacídicos del dominio I Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19, para generar una estructura tridimensional de un sitio de unión; emplear la estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un antagonista potencial; sintetizar el antagonista potencial; y poner en contacto el antagonista potencial con el dominio I para determinar la capacidad del antagonista potencial de interaccionar con el domino I, donde la capacidad del antagonista potencial de interaccionar con el dominio I indica que el antagonista potencial es un inhibidor del dominio I.

Esta invención también describe un método para identificar un inhibidor de un dominio I de una integrina que incluye las etapas de usar las coordenadas estructurales de al menos tres de los aminoácidos del dominio I que incluyen los restos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, y Gly221 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19, o \pm una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I de no más de 0,65\ring{A}, para generar una estructura tridimensional de un sitio de unión; emplear la estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un antagonista potencial; sintetizar el antagonista potencial; y poner en contacto el antagonista potencial con el dominio I para determinar la capacidad del antagonista potencial de interaccionar con el dominio I de integrina, donde la capacidad del antagonista potencial de interaccionar con el dominio I indica que el antagonista potencial es un inhibidor del dominio I. Esta invención también describe un inhibidor del dominio I de integrina identificado por este método.

Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y a partir de las reivindicaciones.

\vskip1.000000\baselineskip

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Integrinas de unión a colágeno \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 sobre leucocitos activados. (A) Análisis citométrico de flujo de la expresión de las integrinas \alpha1 y \alpha2\beta1 sobre esplenocitos IL-2-activados (d 11). Las células se marcaron con mAb anti-\alpha1, mAb anti-\alpha2, o mAb de control no de unión (líneas grises), y seguido de inmunoglobulina anti-hámster-FITC. (B) Efecto de los mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 sobre la adhesión de leucocitos a colágeno. Se trataron 10^{5} esplenocitos IL-2-activados con los mAb indicados durante 15 min. antes de sembrarlos sobre pocillos recubiertos con colágeno tipo IV o tipo I durante 1 h a 37ºC. La adhesión se calculó como se ilustra en el Ejemplo 1, y se expresó como el % de adhesión relativo a células tratadas con mAb de control. Los ensayos de adhesión se hicieron por triplicado, y se realizaron al menos tres experimentos independientes. Se muestra un experimento representativo.

Figura 2. Efecto de mAb anti-integrina sobre la fase efectora de a hipersensibilidad de tipo retardado. A ratones SRBC-sensibilizados se les inyectó i.p. los mAb indicados 1 h antes de la exposición SRBC. Se midió el grosor de la almohadilla plantar 20 h después de la exposición al antígeno, y los resultados se mostraron como el % de aumento en el grosor de la almohadilla plantar \pm SEM como se ilustra en el Ejemplo 2. Estos datos representan un resumen de ocho experimentos con n = 79 (PBS), 68 (Ig de hámster de control), 68 (anti-\alpha1), 29 (anti-\alpha2), 18 (anti-\alpha1 + anti-\alpha2), 45 (anti-\alpha4), 18 (anti-\alpha5), 20 (anti-\alpha6), y 10 (anti-\beta1). Los mAb usados fueron: Ha4/8 (Ig de hámster de control grupo 2), Ha31/8 (anti-\alpha1), Hal/29 (anti-\alpha2), PS/2 (anti-\alpha4), 5H10-27 (anti-\alpha5), GoH3 (anti-\alphaa6), y HM\beta1-1 (anti-\beta1).

Figura 3. Efecto de mAb anti-integrina sobre la fase efectora de la hipersensibilidad por contacto. A ratones FITC-sensibilizados se les inyectó i.p. los mAb indicados 4 h antes de la exposición FITC. Se midió el grosor de la oreja inicialmente y 24 h después, y los resultados se mostraron como el % de aumento en el grosor de la oreja \pm SEM como se ilustra en el Ejemplo 3. Estos datos representan un resumen de nueve experimentos con n = 74 (PBS), 60 (Ig de hámster de control), 26 (anti-ICAM-1), 44 (anti-\alpha1), 44 (anti-\alpha2), 38 (anti-\alpha1 + anti-\alpha2), 36 (anti-\alpha), 16 (anti-\alpha5), 26 (anti-\alpha4 + anti-\alpha5), 24 (anti-\alpha6), y 22 (anti-\beta1). Los mAb de hámster usados fueron: Ha4/8 (Ig de hámster de control grupo 2), Ha31/8 (anti-\alpha1), Hal/29 (anti-\alpha2), HM\beta1-1 (anti-\beta1), 3E2 (anti-ICAM-1); los mAb de rata usados fueron: R35-95 y R35-38 (IgG2a de rata y IgG2b de rata de control, respectivamente), PS/2 (anti-\alpha4), 5H10-27 (anti-\alpha5), GoH3 (anti-\alpha6).

Figura 4. Respuestas de hipersensibilidad por contacto en ratones \alpha1-deficientes en comparación con ratones de tipo silvestre. A ratones FITC-sensibilizados se les inyectó i.p. los mAb indicados 4 h antes de la exposición FITC. Se midió el grosor de la oreja inicialmente y 24 h después, y los resultados se mostraron como el % de aumento en el grosor de la oreja \pm SEM como se ilustra en el Ejemplo 4. Se usaron grupos de cuatro a cinco ratones por condición, y todos los experimentos se realizaron un mínimo de tres veces. Se muestra un experimento representativo.

Figura 5. Efecto de mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 sobre inflamación no específica inducida por aceite de crotón. Se inyectó i.p. a los ratones los mAb indicados 4 h antes de untar la oreja con aceite de crotón. Se midió el grosor de la oreja inicialmente y 24 h después, y los resultados se muestran como el % de aumento en el grosor de la oreja \pm SEM como se ilustra en el Ejemplo 5. Se usaron grupos de cuatro a cinco ratones por condición, y todos experimentos se realizaron un mínimo de tres veces. Se muestra un experimento representativo.

Figura 6. Efecto de mAb anti-\alpha1 y \alpha2 en artritis inducida por mAb contra colágeno. Se inyectó i.p. a los ratones los mAb anti-colágeno en el día 0, seguido de LPS en el día 3. Se inyectó i.p. a los ratones los mAb indicados cada 3 días empezando en el día 0. La artritis clínica fue evidente 2-3 días después de la inyección de LPS y continuó durante varias semanas. Cada extremidad se evaluó en una escala de 0 a 4 cada 3 días como se ilustra en el Ejemplo 6 y los resultados se expresan como el valor artrítico medio entre el día 9 y día 15 (\pm SEM) de las cuatro extremidades. Estos datos representan un resumen de cuatro experimentos constando cada experimento de grupos de tres a cuatro ratones por condición.

Figura 7. Efecto de mAb anti-\alpha1 y \alpha2 en artritis inducida por mAb contra colágeno. A. El tratamiento preventivo de los ratones con mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 disminuye el valor artrítico. Los ratones se trataron con mAb anti-colágeno en el día 0, seguido de LPS en el día 3. La artritis fue evidente en el día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones se trataron con los mAb indicados cada 3 días empezando en el día 0. Cada extremidad se evaluó y se valoró en una escala de 0 a 4 cada 3 días. Los resultados se expresan como el valor artrítico medio entre el día 9 y el día 15 (\pm SEM) de las cuatro extremidades (valor máximo de 16). Se usaron grupos de 4 ratones por condición; se muestra el promedio de 12 experimentos. B. Ratones \alpha1-deficientes tienen un valor artrítico reducido comparable con ratones de tipo silvestre tratados con mAb anti-\alpha1. Los detalles experimentales y la valoración son como se ha resumido anteriormente. Se usaron grupos de 4 ratones por condición; se muestra el promedio de 2 experimentos.

Figura 8. El desarrollo de la artritis se retarda en ausencia de linfocitos y sucede inhibición de la artritis por mAb anti-\alpha1 en ausencia de linfocitos. Ratones B6,129 de tipo silvestre o B6,129 RAG-1-deficientes se trataron con mAb anti-colágeno en el día 0, seguido de LPS en el día 3. La artritis fue evidente en el día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones se trataron con los mAb indicados cada 3 días empezando en el día 0. Cada extremidad se evaluó y se valoró en una escala de 0 a 4 cada 3 días. Los resultados se expresan como el valor artrítico medio por extremidad (valor máximo de 4). Se usaron grupos de 4 ratones por condición.

Figura 9. Respuesta a dosis de la inhibición por mAb anti-a1 de artritis. Ratones Balb/c de tipo silvestre se trataron con mAb anti-colágeno en el día 0, seguido de LPS en el día 3. La artritis fue evidente en el día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones se trataron i.p. con la dosis indicada de mAb Ha4/8 (control de isotipo) o Ha31/8 (anti-\alpha1) cada 3 días empezando en el día 0. Cada extremidad se evaluó y valoró en una escala de 0 a 4 cada 3 días. Los resultados se expresan como el valor artrítico medio por extremidad (valor máximo de 4). Se usaron grupos de 4 ratones por condición.

Figura 10. El tratamiento terapéutico con mAb anti-\alpha1 puede disminuir el valor artrítico. Ratones Balb/c de tipo silvestre se trataron con mAb anti-colágeno en el día 0, seguido de LPS en el día 3. La artritis fue evidente en el día 6 y continuó durante varias semanas. Los ratones se trataron i.p. con mAb (250 \mug) o proteína de fusión con Ig (200 \mug) cada 3 días empezando en el día 4. Los ratones recibieron mAb (Ha4/8 de control de isotipo o Ha31/8 anti-\alpha1), proteína de fusión con Ig (Ig de control de isotipo o TNF-R55-Ig) o una combinación de ambos (250 \mug de Ha31/8 y 200 \mug de TNF-R55-Ig). Cada extremidad se evaluó y valoró en una escala de 0 a 4 cada 3 días. Los resultados se expresan como el valor artrítico medio por extremidad (valor máximo de 4). Se usaron grupos de 4 ratones por condición.

Figura 11. Localización del epítopo para los mAb de bloqueo del dominio I anti-\alpha1. A. Secuencia de aminoácidos del dominio \alpha1-I de rata (parte superior; SEC ID Nº 63) y ser humano (parte inferior; restos 91-96 de la SEC ID Nº 64). Los residuos que comprenden el motivo MIDAS (sitio de adhesión dependiente de iones metálicos) se muestran en negrita. Los aminoácidos humanos que remplazaron los restos de rata correspondientes (R\DeltaH) se muestran debajo de l secuencia de rata en la región recuadrada. Por claridad, la numeración de los restos en el texto se refiere a esta figura, salvo que s indique de otro modo, por ejemplo, como numeración cristalina. B. Se unieron concentraciones crecientes de mAb AJH10 (ATCC Nº PTA-3580; depositado según el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA el 2 de agosto de 2001) a placas recubiertas con 30 \mug/ml del dominio \alpha1-I humano (círculos), de rata (triángulos) o R\DeltaH (cuadrados). Los datos mostrados son representativos de tres experimentos.

Figura 12. Secuencia de aminoácidos del dominio \alpha1-I humano (SEC ID Nº 64).

Figura 13. Identificación de un mAb de bloqueo contra el dominio \alpha1-I. A. Se unieron concentraciones crecientes de mAb AEF3 (triángulos) o AJH10 (círculos) a placas recubiertas con 30 \mug/ml del dominio \alpha1-I. B. El dominio \alpha1-I se trató con concentraciones crecientes de mAb AJH10 (diamantes) o mAb BGC5 (cuadrados) y se unieron a placas recubiertas con colágeno IV (2 \mug/ml). C. Se trataron células K562-\alpha1 con concentraciones crecientes de mAb AEF3 (triángulos) o AJH10 (círculos) y se unieron a placas recubiertas con colágeno IV (5 \mug/ml). El 45-50% de las células añadidas a cada pocillo se adhirieron al colágeno IV. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

Figura 14. Reactividad cruzada de especie de los mAb de bloqueo analizada por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Se incubaron células de músculo liso de conejo con mAb AJH10 (parte inferior) o IgG murina de control (parte inferior) y se analizaron por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).

Figura 15. El dominio \alpha1-I se une a colágeno. A. Se unieron concentraciones crecientes del dominio \alpha1-I humano a placas previamente recubiertas con 1 \mug/ml de colágeno I (cuadrados) o colágeno IV (círculos). Los valores mostrados se han corregido para la unión de fondo a BSA. B. Se mezclaron 2 \mug/ml de dominio \alpha1-I humano con concentraciones crecientes de un anticuerpo anti-integrina \alpha1 humana 5E8D9 (cuadrados) o un anticuerpo anti-integrina \alpha2 humana A2IIE10 (círculos), y después se unieron a placas recubiertas previamente con 1 \mug/ml de colágeno IV. C. Las placas se recubrieron con 1 \mug/ml de colágeno IV o BSA al 3%. Posteriormente se unió el dominio \alpha1-I (2 \mug/ml) a placas recubiertas en presencia de Mn^{2+} 1 mM, Mg^{2+} 1 mM, o EDTA 5 mM. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes.

\newpage

Figura 16. Caracterización de formas humanizadas de AQC2. Se evaluaron mAQC2 (triángulos), chAQC2 (círculos), hAQC2 (triángulos invertidos) y hAQC2' (cuadrados).

A. Inhibición de la unión de VLA-1 a colágeno tipo IV.

B. Inhibición de la unión del dominio \alpha1-I a colágeno tipo IV.

C. Unión a dominio \alpha1-I inmovilizado.

D. Competición con mAQC2 biotinilado por la unión al dominio \alpha1-I inmovilizado.

Figura 17. Caracterización de formas humanizadas de AQC2 por FACS.

Figura 18. Caracterización de formas humanizadas de AQC2 por FACS.

Figura 19. Coordenadas estructurales atómicas para el complejo dominio \alpha1-I/Fab, obtenidas por cristalografía de rayos X a partir de cristales de ese complejo en el formato del Banco de Datos de Proteína (PDB). Las coordenadas de los dos complejos en la unidad asimétrica se enumeran del siguiente modo.

Complejo 1:

molécula A = dominio I de integrina

\quad

molécula H = cadena pesada de hAQC2 Fab

\quad

molécula L = cadena ligera de hAQC2 Fab

\quad

molécula M = Mn^{+2}

Complejo 2:

molécula B = dominio I de integrina

\quad

molécula X = cadena pesada de hAQC2 Fab

\quad

molécula Y = cadena ligera de hAQC2 Fab

\quad

molécula M = Mn^{+2}

Figura 20. Complejo dominio I-Fab. A. Diagrama de cintas del complejo dominio I-Fab. El dominio I y la cadena pesada y ligera de anticuerpo están marcados. El ión Mn^{+2} se muestra como una esfera. B. Primer plano del sitio MIDAS (Sitio de Adhesión Dependiente de Iones Metálicos) que muestra la coordinación del ión metálico (esfera) por Asp101 (numeración cristalina). Las estructuras proteicas se muestran como cintas y las cadenas laterales en la representación de bolas-y-varillas. Los cilindros representan interaccione entre el ión metálico y los átomos proteicos. Las líneas delgadas representan enlaces de H. La Fig. 20 se hizo con el programa de software RIBBONS (Carson, 1991, J. Appl. Cryst. 24:958-961).

Figura 21. Un diagrama de un sistema usado para llevar a cabo las instrucciones codificadas por el medio de almacenamiento de las Fig. 22 y 23.

Figura 22. Una sección transversal de un medio de almacenamiento magnético.

Figura 23. Una sección transversal de un medio de almacenamiento de datos legible ópticamente.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada de la invención

Un descubrimiento de la presente invención es que un anticuerpo contra una integrina (por ejemplo, VLA-1) y un fragmento de la misma, particularmente, una subunidad \alpha1 de integrina, puede bloquear la interacción de leucocitos pro-inflamatorios con componentes de la matriz extracelular incluyendo, aunque sin limitación, colágenos, laminina y fibronectina. Este descubrimiento ilustra la importancia de las moléculas de adhesión de la familia de la integrina, particularmente \alpha1\beta1, en el entorno del tejido periférico durante afecciones relacionadas con la inflamación. También amplía el papel de la familia de las integrinas y fragmentos de las mismas en la inflamación más allá de la unión y extravasación de leucocitos a la superficie de contacto endotelial poniendo de relieve la importancia del entorno tisular periférico rico en matriz para las respuestas inmunes y revela a los tejidos periféricos como un nuevo punto de intervención para las terapias basadas en adhesión.

I. Anticuerpos Anti-Integrina

Los métodos descritos en el contexto de la presente invención contemplan el uso de anticuerpos contra integrinas, donde las integrinas contempladas incluyen moléculas que comprenden una cadena \beta, incluyendo, aunque sin limitación, \beta1, \beta2, \beta3, \beta4, \beta5, \beta6, \beta7, \beta8, unida no covalentemente a una cadena \alpha, incluyendo, aunque sin limitación, \alpha1, \alpha2, \alpha3, \alpha4, \alpha5, \alpha6, \alpha7, \alpha8, \alpha9, \alpha10, \alphaV, \alphaL, \alphaM, \alphaX, \alphaD, \alphaE, \alphaIIb. Los ejemplos de las diversas integrinas contempladas para su uso en la invención incluyen, aunque sin limitación:

\alpha1\beta1, \alpha2\beta1, \alpha3\beta1, \alpha4\beta1, \alpha5\beta1, \alpha6\beta1, \alpha7\beta1, \alpha8\beta1, \alpha9\beta1, \alpha10\beta1, \alphaV\beta1, \alphaL\beta1, \alphaM\beta1, \alphaX\beta1, \alphaD\beta1, \alphaIIb\beta1, \alphaE\beta1;

\alpha1\beta2, \alpha2\beta2, \alpha3\beta3, \alpha4\beta2, \alpha5\beta2, \alpha6\beta2, \alpha7\beta2, \alpha8\beta2, \alpha9\beta2, \alpha10\beta2, \alphaV\beta2, \alphaL\beta2, \alphaM\beta2, \alphaX\beta2, \alphaD\beta2, \alphaIIb\beta2, \alphaE\beta2;

\alpha1\beta3, \alpha2\beta3, \alpha3\beta3, \alpha4\beta3, \alpha5\beta3, \alpha6\beta3, \alpha7\beta3, \alpha8\beta3, \alpha9\beta3, \alpha10\beta3, \alphaV\beta3, \alphaL\beta3, \alphaM\beta3, \alphaX\beta3, \alphaD\beta3, \alphaIIb\beta3, \alphaE\beta3;

\alpha1\beta4, \alpha2\beta4, \alpha3\beta4, \alpha4\beta4, \alpha5\beta5, \alpha6\beta4, \alpha7\beta4, \alpha8\beta4, \alpha9\beta4, \alpha10\beta4, \alphaV\beta4, \alphaL\beta4, \alphaM\beta4, \alphaX\beta4, \alphaD\beta4, \alphaIIb\beta4, \alphaE\beta4;

\alpha1\beta5, \alpha2\beta5, \alpha3\beta5, \alpha4\beta5, \alpha5\beta5, \alpha6\beta5, \alpha7\beta5, \alpha8\beta5, \alpha9\beta5, \alpha10\beta5, \alphaV\beta5, \alphaL\beta5, \alphaM\beta5, \alphaX\beta5, \alphaD\beta5, \alphaIIb\beta5, \alphaE\beta5;

\alpha1\beta6, \alpha2\beta6, \alpha3\beta6, \alpha4\beta6, \alpha5\beta6, \alpha6\beta6, \alpha7\beta6, \alpha8\beta6, \alpha9\beta6, \alpha10\beta6, \alphaV\beta6, \alphaL\beta6, \alphaM\beta6, \alphaX\beta6, \alphaD\beta6, \alphaIIb\beta6, \alphaE\beta6;

\alpha1\beta7, \alpha2\beta7, \alpha3\beta7, \alpha4\beta7, \alpha5\beta7, \alpha6\beta7, \alpha7\beta7, \alpha8\beta7, \alpha9\beta7, \alpha10\beta7, \alphaV\beta7, \alphaL\beta7, \alphaM\beta7, \alphaX\beta7, \alphaD\beta7, \alphaIIb\beta7, \alphaE\beta7;

\alpha1\beta8, \alpha2\beta8, \alpha3\beta8, \alpha4\beta8, \alpha5\beta8, \alpha6\beta8, \alpha7\beta8, \alpha8\beta8, \alpha9\beta8, \alpha10\beta8, \alphaV\beta8, \alphaL\beta8, \alphaM\beta8, \alphaX\beta8, \alphaD\beta8, \alphaIIb\beta8, \alphaE\beta8.

Los métodos descritos en el contexto de la presente invención también contemplan el uso de anticuerpos contra fragmentos de integrina incluyendo, por ejemplo, anticuerpos contra una cadena \beta sola, incluyendo, aunque sin limitación, \beta1, \beta2, \beta3, \beta4, \beta5, \beta6, \beta7, \beta8, así como una cadena \alpha sola, incluyendo, aunque sin limitación, \alpha1, \alpha2, \alpha3, \alpha4, \alpha5, \alpha6, \alpha7, \alpha8, \alpha9, \alpha10, \alphaV, \alphaL, \alphaM, \alphaX, \alphaD, \alphaE, \alphaIIb. Además, los métodos descritos en el contexto de la presente invención contemplan adicionalmente el uso de anticuerpos contra fragmentos de integrina, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos contra el dominio I de la cadena \alpha, incluyendo, aunque sin limitación, el dominio I de todas (Briesewitz et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:2989); \alpha2\beta1 (Takada y Hemler, 1989, J Cell Biol 109: 391), \alphaL\beta2 (Larson et al., 1989, J Cell Biol 108:703), \alphaM\beta2 (Corbi et al., 1988, J Biol Chem 263:12403), \alphaX\beta2 (Corbi et al., 1987, EMBO J 6:4023), \alphaD\beta2 (Grayson et al., 1988, J Exp Med 188:2187), \alphaE\beta7 (Shaw et al., 1994, J Biol Chem 269:6016). En una realización, el determinante antigénico del dominio \alpha1-I incluye una secuencia de aminoácidos de al menos 6 aminoácidos contiguos, donde la secuencia contigua se encuentra dentro de la secuencia de la Fig. 12. En una realización relacionada, la secuencia contigua es Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (restos 91-96 de la SEC ID Nº 64).

Los métodos para producir integrinas para su uso en la presente invención son conocidos para los especialistas en la técnica (véase, por ejemplo, Springer et al., 1990, Nature 346:425-434).

Las realizaciones de la presente invención incluyen adicionalmente anticuerpos policlonales y monoclonales anti-integrina. Las realizaciones de la presente invención incluyen un anticuerpo monoclonal tal como un anticuerpo monoclonal anti-\alpha1. Los anticuerpos para el tratamiento, en particular para el tratamiento de seres humanos, incluyen anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos completos tales como los fragmentos de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')2 y F(v). Algunos anticuerpos descritos en el contexto de esta invención también pueden incluir proteínas que contienen una o más cadenas ligeras y/o pesadas de inmunoglobulina, tales como monómeros y homo- o hetero-multímeros (por ejemplo, dímeros o trímeros) de estas cadenas, donde estas cadenas están opcionalmente unidas por disulfuro o entrecruzadas de otro modo. Estos anticuerpos pueden ser capaces de unirse a uno o más antígenos (por ejemplo, subunidades de integrina que contienen el dominio \alpha1, \alpha2, \alpha6 o alfa-I).

Un anticuerpo de bloqueo de la función \alpha1\beta1 como se describe en este documento se refiere a un anticuerpo que se une al dominio \alpha1-I, por ejemplo, los restos 91-97 de la Fig. 12, y bloquea la función \alpha1\beta1 ensayada, por ejemplo, por la capacidad de inhibir la adhesión dependiente de K562-\alpha1 a colágeno IV (véase el Ejemplo 15).

A continuación se describen los diversos métodos para crear los anticuerpos descritos en el contexto de esta invención. Los métodos que son conocidos en la técnica pero no se describen específicamente en este documento también están dentro del alcance de esta invención. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en el contexto de esta invención también pueden identificarse usando bibliotecas de anticuerpos presentados en fagos, tales como las descritas en Smith, 1985, Science 228:1315-7; las patentes de Estados Unidos 5.565.332, 5.733.743, 6.291.650, y 6.303.313. Pueden crearse anticuerpos adicionales descritos en el contexto de esta invención por acoplamiento de las cadenas pesadas identificadas en este documento con una cadena ligera no afín, por ejemplo, una cadena ligera identificada por tecnología de presentación en fagos.

II. Anticuerpos de Hibridoma no Humano

Los anticuerpos monoclonales descritos en el contexto de esta invención pueden generarse por tecnología de hibridoma bien conocida. Por ejemplo, pueden inmunizarse ratones \beta_{1} -/- (por ejemplo, ratones, ratas o conejos) con preparaciones \alpha_{1}\beta_{1} purificadas o en bruto, células transfectadas con construcciones de ADNc que codifican \alpha_{1}, \beta_{1} o ambos antígenos, células que expresan de forma constitutiva \alpha_{1}p\beta_{1}, y similares. El antígeno puede suministrarse en forma de proteína purificada, proteína expresada en células, fragmento proteico o péptido de la misma, o en forma de ADN desnudo o vectores virales que codifican la proteína, el fragmento proteico, o péptido. Los sueros de los animales inmunizados después se ensayan para la presencia de anticuerpos anti-\alpha_{1}\beta_{1}. Se aíslan células B de animales que dan ensayo positivo, y se crean hibridomas con estas células B.

Se exploran anticuerpos secretados por los hibridomas para su capacidad de unirse específicamente a VLA-1 (por ejemplo, de unirse a células \alpha_{1}-transfectadas y no a células parentales no transfectadas) y para cualquier otra característica deseada, por ejemplo, que tengan las secuencias consenso CDR deseadas, que inhiban (o no inhiban en el caso de no bloqueantes) la unión entre el colágeno y VLA-1.

Las células de hibridoma que dan ensayo positivo en los ensayos de exploración se cultivan en un medio nutriente en condiciones que permiten que las células secreten los anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo. El sobrenadante de cultivo de hibridoma condicionado después se recoge y se purifican los anticuerpos contenidos en el sobrenadante. Como alternativa, el anticuerpo deseado puede producirse inyectando las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de una animal o inmunizado (por ejemplo, un ratón). Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando el anticuerpo que se acumula en forma de fluido ascítico. El anticuerpo después puede recogerse extrayendo el fluido ascítico de la cavidad peritoneal con una jeringa.

Los anticuerpos monoclonales también pueden generarse aislando los ADNc que codifican los anticuerpos de los hibridomas deseados, transfectando las células hospedadoras de mamífero (por ejemplo, células CHO o NSO) con los ADNc, cultivando las células transfectadas, y recuperando el anticuerpo del medio de cultivo.

III. Anticuerpos Quiméricos

Los anticuerpos monoclonales descritos en el contexto de esta invención también pueden generarse diseñando un anticuerpo de hibridoma afín (por ejemplo, murino, de rata o de conejo). Por ejemplo, puede alterarse un anticuerpo afín por tecnología de ADN recombinante de modo que se remplace parte o toda la región bisagra y/o constante de las cadenas pesadas y/o ligeras con los componentes correspondientes de un anticuerpo de otra especie (por ejemplo, ser humano). Generalmente, los dominios variables del anticuerpo diseñado permanecen idénticos o sustancialmente idénticos a los dominios variables del anticuerpo afín. Dicho anticuerpo diseñado se llama anticuerpo quimérico y es menos antigénico que el anticuerpo afín cuando se administra a un individuo de la especie de la que se obtiene la región bisagra y/o constante (por ejemplo, ser humano). Los métodos para crear anticuerpos quiméricos son bien conocidos en la técnica. Las regiones constantes humanas incluyen las obtenidas de IgG1 e IgG4.

IV. Anticuerpos Completamente Humanos

Los anticuerpos monoclonales descritos en el contexto de esta invención también incluyen anticuerpos completamente humanos. Pueden prepararse usando esplenocitos humanos sensibilizados in vitro, como se describe por Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147:86-95, o usando bibliotecas de anticuerpos presentados en fagos, como se describe en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.300.064.

Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos completamente humanos por clonación de repertorio como se describe por Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 2432-2436; y Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141: 227-236. Además, la patente de Estados Unidos 5.798.230 (25 de agosto de 1998) describe la preparación de anticuerpos monoclonales humanos a partir de células B humanas, donde se inmortalizan células B productoras de anticuerpos humanos por infección con un virus Epstein-Barr, o un derivado del mismo, que expresa el antígeno nuclear 2 del virus Epstein-Barr (EBNA2), una proteína necesaria para la inmortalización. La unión de EBNA2 posteriormente se aísla, provocando un aumento en la producción de anticuerpos.

Algunos otros métodos para producir anticuerpos completamente humanos implican el uso de animales no humanos que tienen loci de Ig endógenos inactivados y son transgénicos para los genes de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo humano no reordenados. Dichos animales transgénicos pueden inmunizarse con \alpha_{1}\beta_{1} y después se crean hibridomas a partir de células B obtenidas de los mismos. Estos métodos se describen en, por ejemplo, las diversas publicaciones/patentes GeiiPharm/Medarex (Palo Alto, CA) que se refieren a ratones transgénicos que contienen miniloci de Ig humana (por ejemplo, patente de Estados Unidos 5.789.650 de Lonberg); las diversas publicaciones/patentes Abgenix (Fremont, CA) con respecto a XENOMICE (por ejemplo, patentes de Estados Unidos 6.075.181, 6.150.584 y 6.162.963 de Kucherlapati; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; y Mendez et al., 1997; Nature Genetics 15(2):146-56); y las diversas publicaciones/patentes Kirin (Japón) que se refieren a ratones "transómicos" (por ejemplo, el documento EP 843 961, y Tomizuka et al., 1997, Nature Genetics 16:133-1443).

V. Anticuerpos Humanizados

Los anticuerpos monoclonales descritos en el contexto de esta invención también incluyen versiones humanizadas de anticuerpos anti-\alpha_{1}\beta_{1} afines obtenidos de otras especies. Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo producido por tecnología de ADN recombinante, en la que algunos o todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que no son necesarios para la unión al antígeno (por ejemplo, las regiones constantes y las regiones flanqueantes de los dominios variables) se usan para sustituir los aminoácidos correspondientes de la cadena ligera o pesada del anticuerpo no humano afín. A modo de ejemplo, una versión humanizada de un anticuerpo murino contra un antígeno dado tiene tanto en su cadena pesada como en su cadena ligera (1) regiones constantes de un anticuerpo humano; (2) regiones flanqueantes de los dominios variables de un anticuerpo humano; y (3) CDR del anticuerpo murino. Cuando sea necesario, puede cambiarse uno o más restos en las regiones flanqueantes humanas para los restos en las posiciones correspondientes en el anticuerpo murino para conservar la afinidad de unión del anticuerpo humanizado contra el antígeno. Este cambio a veces se llama "mutaciones inversas". Los anticuerpos humanizados generalmente tienen menos probabilidad de provocar una respuesta inmune en seres humanos en comparación con anticuerpos humanos quiméricos porque el primero contiene considerablemente menos componentes no humanos.

Los métodos para crear anticuerpos humanizados se describen en, por ejemplo, Winter documento EP 239 400; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536; Queen et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:10029; patente de Estados Unidos 6.180.370; y Orlandi et al., 1989, Proc. Natl. Acad Sci. USA 86:3833. Generalmente, el transplante de CDR murinas (u otro animal no humano) en un anticuerpo humano se consigue del siguiente modo. Los ADNc que codifican los dominios variables de cadena pesada y ligera se aíslan de un hibridoma. Las secuencias de ADN de los dominios variables, incluyendo las CDR, se determinan por secuenciación. Los ADN que codifican las CDR se transfieren a las regiones correspondientes de una secuencia codificante de dominio variable de cadena pesada o ligera de anticuerpo humano por mutagénesis dirigida al sitio. Después, se añaden los segmentos génicos de la región constante humana de un isotipo deseado (por ejemplo, \gamma1 para CH y \kappa para CL). Los genes de cadena pesada y ligera humanizados se co-expresan en células hospedadoras de mamífero (por ejemplo, células CHO o NSO) para producir anticuerpo humanizado soluble. Para facilitar la producción a gran escala de anticuerpos, a menudo es deseable producir dichos anticuerpos humanizados en biorreactores que contienen las células que expresan el anticuerpo, o para producir mamíferos transgénicos (por ejemplo, cabras, vacas, u ovejas) que expresa el anticuerpo en la leche (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5.827.690).

A veces, la transferencia directa de CDR a una región flanqueante humana conduce a una pérdida en la afinidad de unión al antígeno del anticuerpo resultante. Esto es porque en algunos anticuerpos afines, ciertos aminoácidos dentro de las regiones flanqueantes interaccionan con las CDR y por tanto influyen en la afinidad de unión global al antígeno del anticuerpo. En dichos casos, sería crítico introducir "mutaciones inversas" (supra) en las regiones flanqueantes del anticuerpo aceptor para retener la actividad de unión al antígeno del anticuerpo afín.

El enfoque general para crear mutaciones inversas es conocido en la técnica. Por ejemplo, Queen et al. (supra), Co et al., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88:2869-2873, y el documento WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) describen un enfoque que implica dos etapas clave. Primero, las regiones flanqueantes V humanas se eligen por análisis informático para la homología óptima de secuencia proteica a la región V flanqueante del anticuerpo murino afín. Después, se modela la estructura terciaria de la región V murina por ordenador para visualizar los restos aminoacídicos flanqueantes que tienen probabilidad de interaccionar con las CDR murinas, y estos restos aminoacídicos murinos después se superponen sobre la región flanqueante humana homóloga.

En este enfoque de dos etapas, hay varios criterios para diseñar anticuerpos humanizados. El primer criterio es usar como aceptor humano la región flanqueante de una inmunoglobulina humana particular que habitualmente es homóloga a la inmunoglobulina donante no humana, o usar una región flanqueante consenso de muchos anticuerpos humanos. El segundo criterio es usar el aminoácido donante en lugar del aceptor si el resto aceptor humano es inusual y el resto donante es típico de secuencias humanas en un resto específico de la región flanqueante. El tercer criterio es usar el resto aminoacídico de la región flanqueante donante en lugar del aceptor en posiciones inmediatamente adyacentes a las CDR.

También puede usase un enfoque diferente como se describe en, por ejemplo, Tempest, 1991, Biotechnology 9: 266-271. En este enfoque, las regiones V flanqueantes derivadas de las cadenas pesada y ligera NEWM y REI, respectivamente, se usan para el injerto de CDR sin la introducción radical de restos de ratón. Una ventaja de usar este enfoque es que las estructuras tridimensionales de las regiones variables NEWM y REI son conocidas a partir de cristalografía de rayos X y por tanto pueden modelarse fácilmente interacciones específicas entre las CDR y los restos flanqueantes de la región V.

VI. Otros Restos

Los anticuerpos monoclonales descritos en el contexto de esta invención pueden incluir adicionalmente otros restos para realizar las funciones deseadas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden incluir un resto de toxina (por ejemplo, toxoide tetánico o ricina) o un radionúclido (por ejemplo, ^{111}In o ^{90}Y) para eliminar la células abordadas por los anticuerpos (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6.307.026). Los anticuerpos pueden incluir un resto (por ejemplo, biotina, restos fluorescentes, restos radiactivos, marcas de histidina u otras marcas peptídicas) para facilitar el aislamiento o detección. Los anticuerpos también pueden incluir un resto que puede prolongar su vida media en suero, por ejemplo, un resto de polietilenglicol (PEG), y un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas o fragmento del mismo (por ejemplo, una parte de la región constante de cadena pesada de IgG1 humana tal como las regiones de bisagra, C2 y CH3).

VII. Composiciones Cristalizables y Cristales

Esta invención también describe una composición cristalizable que contiene un complejo de: (1) un dominio \alpha1-I quimérico de rata-humano (por ejemplo, R\DeltaH mutante), o una parte del mismo (por ejemplo, un polipéptido que incluye los aminoácidos 135 a 336 del dominio \alpha1-I quimérico de rata-humano); y (2) un fragmento Fab de hAQC2, o una parte del mismo (por ejemplo, un polipéptido que incluye los aminoácidos 3 a 213 de la cadena ligera y/o un polipéptido que incluye los aminoácidos 3 a 219 de la cadena pesada). Se muestra un complejo ejemplar en la Fig. 20. El dominio \alpha1-I de R\DeltaH puede incluir, por ejemplo, los restos aminoacídicos 145 a 336 (numeración cristalina) (SEC ID Nº 59, infra) de la subunidad \alpha1 de rata: los fragmentos Fab de hAQC2 pueden incluir los restos aminoacídicos de cadena ligera 1 a 106 (por ejemplo, 1-213) de la SEC ID Nº 3 y los restos aminoacídicos de cadena pesada 1 a 118 (por ejemplo, 1-219) de la SEC ID Nº 4. Los fragmentos Fab de hAQC2 pueden obtenerse por digestión con papaína del anticuerpo completo o crearse por métodos recombinantes. Los fragmentos Fab incluyen al menos una parte de unión a antígeno de los dominios variables de la cadena ligera y/o la cadena pesada de hAQC2.

1001

Algunas composiciones cristalizables y cristales descritos en el contexto de esta invención pueden contener una molécula o complejo molecular que es homólogo al dominio \alpha1-I y/o el fragmento Fab de hAQC2 en la secuencia de aminoácidos p en la estructura tridimensional. Los ejemplos de homólogos incluyen, aunque sin limitación: el dominio \alpha1-I y/o el fragmento Fab de hAQC2 con mutaciones, tales como sustituciones, adiciones, deleciones conservativas o una combinación de las mismas. "sustituciones conservativas" se refiere al remplazo de restos que son físicamente similares en tamaño, forma, hidrofobicidad, carga, y/o propiedades químicas a los restos de referencia correspondientes. Los métodos para identificar un aminoácido "correspondiente" son conocidos en la técnica y se basan en la secuencia, alineación estructural, su posición funcional o una combinación de las mismas en comparación con la estructura cristalina resuelta en la presente invención. Por ejemplo, los aminoácidos correspondientes pueden identificarse superponiendo los átomos estructurales de los aminoácidos del complejo dominio \alpha1-I/hAQC2 y un dominio \alpha1-I y/o homólogo de hAQC2 usando aplicaciones de software bien conocidas, tales como QUANTA (Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA ©1998,2000). Los aminoácidos correspondientes también pueden identificarse usando programas de alineación de secuencia tales como programa "bestfit" disponible en el Genetics Computer Group, que usa el algoritmo de homología local descrito por Smith y Waterman en Adv. Appl. Math. 2:482 (1981).

Las composiciones cristalizables descritas en el contexto de esta invención pueden incluir adicionalmente uno o más componentes que promueven la cristalización y/o son compatibles con las condiciones de cristalización. Dichos componentes pueden incluir, aunque sin limitación, tampones, sales, agentes de precipitación y otros reactivos. Un componente puede ser Polietilenglicol 1500 (PEG1500) al 30% en peso/volumen.

La presente invención también describe métodos para crear cristales a partir de composiciones cristalizables que incluyen un complejo del dominio \alpha1-I y una parte de unión a antígeno de hAQC2 (por ejemplo, Fab, Fab' u otros fragmentos, supra). Pueden usarse diversas técnicas de cristalización en la invención reivindicada, incluyendo, aunque sin limitación, difusión por vapor, diálisis, difusión en micro-lotes, en lotes, y en líquido-líquido. Los métodos de difusión por vapor incluyen, aunque sin limitación, técnicas gota posada, gota colgante y gota intercalada. Los métodos de difusión por vapor pueden usar técnicas para controlar la velocidad de cristalización, tal como la adición de aceites en las gotas o la solución de depósito. Los métodos de cristalización pueden incluir mezclar una solución de depósito que contiene agente de precipitación con una solución acuosa de un complejo del dominio \alpha1-I y una parte de unión a antígeno de hAQC2 para producir una composición cristalizable. La mezcla o composición cristalizable después puede cristalizarse usando las diversas técnicas enumeradas anteriormente. La composición cristalizable de esta invención puede ser una solución acuosa de un complejo del dominio \alpha1-I y una parte de unión a antígeno de hAQC2 que contiene el complejo a una concentración de aproximadamente 1 a 50 mg por ml, tal como una concentración de aproximadamente 5 a 15 mg por ml (por ejemplo, 11 mg por ml).

VIII. Estructuras Cristalinas y Coordenadas Estructurales

Esta invención describe adicionalmente la estructura tridimensional de un cristal que incluye un complejo de R\DeltaH mutante, y un fragmento Fab de hAQC2 a resolución de 2,8 \ring{A} (Ejemplo 24, infra). Las estructuras tridimensionales de otros cristales relacionados también pueden determinarse usando técnicas descritas en este documento y aquellas conocidas en la técnica. La estructura tridimensional de este complejo se define por una serie de coordenadas estructurales expuestas en la Fig. 19. Estas coordenadas estructurales son coordenadas atómicas cartesianas obtenidas de ecuaciones matemáticas relacionadas con los patrones obtenidos de difracción de un haz monocromático de rayos X por los átomos o centros de dispersión del complejo cristalino del dominio \alpha1-I y el fragmento Fab de hAQC2. Los datos de difracción se usan primero para calcular un mapa de densidad electrónica de la unidad repetitiva del cristal. El mapa de densidad electrónica después se usa para establecer las posiciones de átomos individuales del
complejo.

Esta invención describe una molécula o un complejo molecular definido por todas o parte de las coordenadas estructurales de todos los aminoácidos expuestos en la Fig. 19, así como un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de estos aminoácidos entre 0,00 \ring{A} y 0,65 \ring{A}, tal como entre 0,00 \ring{A} y 0,60 \ring{A} (por ejemplo, entre 0,00 \ring{A} y 0,50 \ring{A}). La expresión "desviación del cuadrado medio de la raíz" o "desviación r.m.s." significa la raíz cuadrada de la media aritmética de los cuadrados de las desviaciones de la media. Es un modo de expresar la desviación o variación de una tendencia u objeto. Para propósitos de esta invención, la "desviación del cuadrado medio de la raíz" o "desviación posicional r.m.s." define la variación en la estructura de una proteína a partir de la parte relevante de la estructura del polipéptido definido por las coordenadas estructurales escritas en este documento.

Una molécula o un complejo molecular descrito en el contexto de esta invención también puede incluir un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de al menos siete aminoácidos del fragmento Fab de hAQC2 seleccionados entre el grupo que incluye los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina) de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de uno o más de estos aminoácidos entre 0,00 \ring{A} y 1,10 \ring{A}, tal como entre 0,00 \ring{A} y 1,00 \ring{A} (por ejemplo, entre 0,00 \ring{A} y 0,50 \ring{A}). La expresión "sitio de unión" como se usa en este documento, se refiere a una región de una molécula o complejo molecular que, como resultado de su forma y carga, se asocia de forma favorable con otra entidad química. El término "sitio" incluye, aunque sin limitación, zanja, hendidura, canal o bolsillo. Por ejemplo, los sitios de unión en el dominio \alpha1-I pueden incluir un sitio de unión a colágeno (Emsley et al., 1997, supra), un sitio de unión a anticuerpo, y sitio de unión alostérico (o IDAS) (Huth et al., 2000, Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 97:5231-5236). La expresión "entidad química" incluye, aunque sin limitación, cualquier molécula, complejo molecular, compuesto o fragmento del mismo. La expresión "asociar con" se refiere a una asociación o unión en un estado de proximidad entre una entidad química, o partes de la misma, y un bolsillo de unión o sitio de unión en una proteína. La asociación puede ser no covalente donde la yuxtaposición está energéticamente favorecida por enlaces de hidrógeno o interacciones de van der Waals o electrostáticas - o puede ser covalente.

Una molécula o complejo molecular descrito en el contexto de esta invención puede incluir un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos dominio \alpha1-I seleccionados entre el grupo compuesto por los restos Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19, o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio \alpha1-I entre 0,00 \ring{A} y 0,92 \ring{A}.

Una molécula o complejo molecular descrito en el contexto de esta invención también puede incluir un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos del dominio \alpha1-I seleccionados entre el grupo compuesto por los restos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, y Gly221 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig.19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio \alpha1-I entre 0,00 \ring{A} y 0,30 \ring{A}.

Los especialistas en la técnica entenderán que una serie de coordenadas estructurales para un polipéptido es una serie relativa de puntos que define una forma en tres dimensiones. Por tanto, es posible que pudiera generarse una serie completamente diferente de coordenadas que definen una forma similar o idéntica usando manipulaciones matemáticas de las coordenadas estructurales de la Fig. 19. Por ejemplo, las coordenadas estructurales podrían manipularse por permutaciones cristalográficas de las coordenadas estructurales, fraccionación de las coordenadas estructurales, adiciones o sustracciones de enteros a las series de las coordenadas estructurales, inversión de las coordenadas estructurales, o cualquier combinación de las mismas. Además, ligeras variaciones en las coordenadas individuales tendrán poco efecto sobre la forma global.

Como alternativa, la modificación en la estructura cristalina debido a mutaciones, tales como adiciones, sustituciones, y/o deleciones de aminoácidos, u otros cambios en cualquiera de los componentes polipeptídicos (por ejemplo, un fragmento Fab de hAQC2 o un dominio \alpha1-I) que componen el cristal también pueden suponer variaciones en las coordenadas estructurales. Si dichas variaciones están dentro de un error típico aceptable en comparación con las coordenadas originales, la forma tridimensional resultante se considera que es igual que la del cristal no
modificado.

Por lo tanto, es necesario determinar si una entidad es suficientemente similar a todo o partes de la estructura descrita en este documento para considerarse igual. Dichos análisis pueden realizarse usando aplicaciones de software actuales, tales como QUANTA (Accelrys, Inc. Y Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA ©1998, 2000) y O (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47:110-119), y guías de usuario adjuntas. La aplicación Molecular Similarity de QUANTA y la aplicación LSQ de O permiten comparaciones entre diferentes estructuras, diferentes conformaciones de la misma estructura, y diferentes partes de la misma estructura. El procedimiento general en ambas aplicaciones es introducir las estructuras a comparar, definir las posiciones atómicas equivalentes en estas estructuras, realizar una operación de ajuste y analizar los resultados.

Cuando se introduce cada estructura en la aplicación, se le da un nombre y se identifica como estructura fija o una estructura en movimiento. La equivalencia de átomos habitualmente se define por los átomos equivalentes tales como los átomos estructurales de la proteína (N, Ca, C y O) para todos los restos conservados entre las dos estructuras que se están comparando. La estructura en movimiento se traslada y rota para obtener un ajuste óptimo o de mínimos cuadrados con la estructura fija. La diferencia del cuadrado medio de la raíz del ajuste sobre los pares especificados del átomo equivalente se presenta por ambos programas en ángstrom.

Para el propósito de esta invención, se considera idéntico cualquier complejo molecular que tenga una desviación del cuadrado medio de la raíz de los átomos estructurales (N, Ca, C, O) del resto conservado entre 0,00 \ring{A} y 1,50 \ring{A}, tal como entre 0,00 \ring{A} y 1,00 \ring{A} (por ejemplo, entre 0,00 \ring{A} y 0,50 \ring{A}), cuando se superponen sobre los átomos estructurales relevantes descritos por las coordenadas estructurales enumeradas en la Fig. 19.

IX. Determinación de Otras Estructuras Cristalinas

Las coordenadas estructurales expuestas en la Fig. 19 también pueden usarse para ayudar a obtener información estructural acerca de otra entidad molecular cristalizada, tal como otro hAQC2 que contenga sustituciones de aminoácidos en una de sus CDR. Esto puede conseguirse por cualquier técnica bien conocida, incluyendo remplazo molecular, un método especialmente útil para determinar las estructuras de mutantes y homólogos de dominio \alpha1-I/Fab.

Las coordenadas estructurales expuestas en la Fig. 19 también pueden usarse para determinar al menos una parte de la estructura tridimensional de entidades moleculares que contienen al menos algunas características estructurales similares a al menos una parte del dominio \alpha1-I o el Fab de hAQC2. Por lo tanto, otra realización de esta invención proporciona un método para utilizar el remplazo molecular para obtener información estructural acerca de una molécula o complejo molecular cristalizado con estructura desconocida que incluye las etapas de: (a) generar un patrón de fracción de rayos X a partir de la molécula o complejo molecular cristalizado; y (b) aplicar al menos una parte de las coordenadas estructurales expuestas en la Fig. 19 al patrón de difracción de rayos X para generar un mapa de densidad electrónica tridimensional de la molécula o complejo molecular con estructura desconocida.

Usando remplazo molecular, pueden usarse todas o parte de las coordenadas estructurales expuestas en la Fig. 19 para determinar la estructura desconocida de una entidad molecular cristalizada más rápidamente y de forma más eficaz que intentando determinar dicha información ab initio. El remplazo molecular proporciona una estimación precisa de las fases para una estructura desconocida. Las fases son un factor en ecuaciones usadas para resolver las estructuras cristalinas que no pueden determinarse directamente. Obtener valores precisos para las fases, por métodos diferentes del remplazo molecular, a menudo puede ser un proceso que lleva mucho tiempo que implica ciclos iterativos de aproximaciones y refinamientos y obstaculiza enormemente la solución de estructuras cristalinas. Sin embargo, cuando se ha resuelto la estructura cristalina de una proteína que contiene al menos una parte homóloga, las fases de la estructura conocida a menudo pueden proporcionar una estimación satisfactoria de las fases para la estructura desconocida.

Por tanto, el remplazo molecular implica generar un modelo preliminar de una molécula o complejo molecular cuyas coordenadas estructurales son desconocidas, orientando y posicionando la parte relevante del complejo de acuerdo con la Fig. 19 dentro de la celda unitaria del cristal de la molécula complejo molecular desconocido, de la mejor manera para justificar el patrón de difracción de rayos X observado del cristal de la molécula o complejo molecular cuya estructura es desconocida. Después pueden calcularse las fases a partir de este modelo y combinarse con las amplitudes del patrón de difracción de rayos X observadas para generar un mapa de densidad electrónica de la estructura cuyas coordenadas son desconocidas. Esto, a su vez, puede someterse a cualquier técnica de construcción de modelos y refinamiento estructural conocida para proporcionar una estructura precisa final de la molécula o complejo molecular cristalizado desconocido (Lattman, 1985, Meth. Enzymol. 115:55-77; Rossmann, ed., "The Molecular Replacement Method", Int. Sci. Rev. Ser., Nº 13, Gordon & Breach, New York, 1972). La estructura de cualquier parte de cualquier molécula o complejo molecular cristalizado que es suficientemente homóloga a cualquier parte del dominio \alpha1-I y/o el fragmento Fab de hAQC2 (de acuerdo con Fig. 19) puede resolverse por este método.

X. Ordenador y Medio de Almacenamiento

Para usar las coordenadas estructurales descritas en el contexto de esta invención, por ejemplo, las expuestas en la Fig. 19, habitualmente es necesario convertir las coordenadas en una representación tridimensional o forma. Los programas de software gráfico disponibles en el mercado incluyendo, aunque sin limitación, O (Jones et al., 1991, Acta Cryst. A47:110-119) y INSIGHTII (©Accelrys, Inc. y Molecular Simulations, Inc., San Diego, CA) son capaces de generar representaciones tridimensionales de moléculas o complejos moleculares, o partes de los mismos, a partir de una serie de coordenadas estructurales.

De acuerdo con el contexto descrito de la presente invención, las coordenadas estructurales de las entidades moleculares de esta invención se almacenan en un medio de almacenamiento legible mecánicamente (por ejemplo, por un ordenador). Usando un ordenador y el software apropiado, dichos datos pueden usarse para una diversidad de propósitos, tale como descubrimiento de fármacos y análisis cristalográfico de rayos X de otros cristales de proteína.

Por consiguiente, un medio del almacenamiento de datos legible mecánicamente puede incluir un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente que incluyen al menos una parte de las coordenadas estructurales expuestas en la Fig. 19. El ordenador puede incluir adicionalmente instrucciones para producir representaciones tridimensionales de los complejos moleculares de dominio \alpha1-I y el fragmento Fab de hAQC2 procesando los datos legibles mecánicamente de esta invención. El ordenador de esta invención también puede incluir una pantalla, una interfaz gráfica para presentación, o un dispositivo de entrada para mover y manipular la representación gráfica tridimensional de las coordenadas estructurales.

Esta invención también describe un ordenador para determinar al menos una parte de las coordenadas estructurales correspondientes a datos de difracción de rayos X obtenidos de un complejo molecular de integrina \alpha1\beta1 y el fragmento Fab del anticuerpo hAQC2, donde el ordenador incluye un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que incluye un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos incluyen al menos una parte de las coordenadas estructurales del complejo molecular del dominio \alpha1-I y el fragmento Fab de hAQC2 de acuerdo con la Fig. 19, o los datos de difracción de rayos X obtenidos del complejo molecular cristalino. El ordenador incluye adicionalmente instrucciones para realizar una transformación de Fourier de los datos de coordenadas legibles mecánicamente, e instrucciones para procesar estos datos de difracción legibles mecánicamente en coordenadas estructurales. Este ordenador puede incluir adicionalmente: una memoria de trabajo para almacenar instrucciones para procesar los datos legibles mecánicamente; una unidad de procesamiento central acoplada a la memoria de trabajo y a los datos legibles mecánicamente; y opcionalmente una interfaz gráfica o pantalla acoplada a la unidad de procesamiento central para presentar las representación gráfica tridimensional de las coordenadas estructurales de la molécula o complejo molecular.

Esta invención describe adicionalmente un ordenador para producir una representación tridimensional de una molécula o un complejo molecular definido por al menos una parte o todas las coordenadas estructurales de todos los aminoácidos del dominio \alpha1-I y el fragmento Fab de hAQC2 expuestos en la Fig. 19, o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos entre 0,00 \ring{A} y 1,50\ring{A}, tal como entre 0,00 \ring{A} y 1,00 \ring{A} (por ejemplo, entre 0,00 \ring{A} y 0,50 \ring{A}). Adicionalmente en esta invención, el ordenador incluye: un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que incluye un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos incluyen al menos una parte o todas las coordenadas estructurales de todos los aminoácidos del dominio \alpha1-I y el fragmento Fab de hAQC2 expuestos en la Fig. 19.

Un ordenador descrito en el contexto de esta invención también puede producir una representación tridimensional de una molécula o complejo molecular incluyendo un sitio de unión. El sitio de unión puede estar definido por coordenadas estructurales de al menos siete aminoácidos de: el fragmento Fab de hAQC2 seleccionado entre el grupo que incluye los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina) de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales del al menos un aminoácido del fragmento Fab de hAQC2 entre 0,00 \ring{A} y 1,10 \ring{A} tal como entre 0,00 \ring{A} y 1,00 \ring{A} (por ejemplo, entre 0,00, \ring{A} y 0,50 \ring{A}). Además, el ordenador de esta invención incluye: un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que incluye un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos incluyen las coordenadas estructurales de al menos siete aminoácidos del fragmento Fab de hAQC2 seleccionados entre el grupo compuesto por los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Ser91, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Ser30, Arg31, Trp47, Ser52, Gly53, His56, Tyr58, Phe99, Gly100 y Asp101 (numeración cristalina) de acuerdo con la Fig. 19.

Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de: una molécula o complejo molecular incluyendo un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos del dominio I seleccionados entre el grupo compuesto por los restos Asp154, Ser156, Asp157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde l homólogo incluye un sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I entre 0,00 \ring{A} y 0,92 \ring{A}. Adicionalmente en esta invención, el ordenador incluye: un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que incluye un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos incluyen las coordenadas estructurales de los aminoácidos del dominio I seleccionados entre el grupo compuesto por los restos Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19.

Esta invención también describe un ordenador para producir una representación tridimensional de una molécula o complejo molecular incluyendo un sitio de unión definido por las coordenadas estructurales de los aminoácidos del dominio I seleccionados entre el grupo compuesto por los restos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, y Gly221 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19; o un homólogo de la molécula o complejo molecular, donde el homólogo incluye un sitio de unión que tiene una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de los aminoácidos del dominio I entre 0,00 \ring{A} y 0,30 \ring{A}. Adicionalmente en el contexto de esta invención, el ordenador incluye: un medio de almacenamiento de datos legible mecánicamente que incluye un material de almacenamiento de datos codificado con datos legibles mecánicamente, donde los datos incluyen las coordenadas estructurales de los aminoácidos del domino I seleccionados entre el grupo compuesto por los restos Glu192, Gln218, Arg219; Gly220, y Gly221 (numeración cristalina), de acuerdo con la Fig. 19.

La Fig. 21 muestra una de dichas descripciones. El sistema 10 incluye un ordenador 11 que incluye una unidad de procesamiento central ("CPU") 20, una memoria de trabajo 22 que puede ser, por ejemplo, RAM (memoria de acceso aleatorio) o memoria "núcleo", memoria de almacenamiento masivo 24 (tal como una o más unidades de disco o cinta o unidades de CD-ROM o DVD-ROM), uno o más terminales de pantalla de tubo de rayos catódicos ("CRT") 26, uno o más teclados 28, una o más líneas de entrada 30, y una o más líneas de salida 40, todas las cuales están interconectadas por un bus de sistema bidireccional convencional 50.

El hardware de entrada 36, acoplado al ordenador 11 por las líneas de entrada 30, puede implementarse de diversos modos. Los datos legibles mecánicamente de esta invención pueden introducirse mediante el uso de un módem o módems 32 conectados por una línea de teléfono o línea de datos exclusiva 34. Como alternativa o adicionalmente, el hardware de entrada 36 puede incluir unidades de CD-ROM o DVD-ROM o unidades de cinta o disco 24. Junto con el terminal de pantalla 26, también puede usarse el teclado 28 como dispositivo de entrada.

El hardware de salida 46, acoplado al ordenador 11 por las líneas de salida 40, puede implementarse de forma similar por dispositivos convencionales. A modo de ejemplo, el hardware de salida 46 puede incluir el terminal de pantalla CRT 26 para presentar una representación gráfica de un sitio de unión de esta invención usando un programa tal como QUANTA como se describe en este documento. El hardware de salida también puede incluir una impresora 42, de modo que pueda producirse una salida de copia impresa, o una unidad de disco 24, para almacenar la salida del sistema para su uso posterior.

En funcionamiento, la CPU 20 coordina el uso de los diversos dispositivos de entrada y salida 36, 46, coordina los accesos a los datos desde el almacenamiento masivo 24 y los accesos a y desde la memoria de trabajo 22, y determina la secuencia de etapas de procesamiento de datos. Pueden usarse varios programas para procesar los datos legibles mecánicamente de esta invención. Dichos programas se analizan en referencia a los métodos computacionales de descubrimiento de fármacos descritos en este documento. Se incluyen referencias específicas a componentes del sistema de hardware 10 según sea apropiado en toda la siguiente descripción del medio de almacenamiento de datos.

La Fig. 22 muestra una sección transversal de un medio de almacenamiento de datos magnético 100 que puede estar codificado con datos legibles mecánicamente que puede realizarse por un sistema tal como el sistema 10 de la Fig. 21. El medio 100 puede ser un disquete flexible convencional o disco duro, que tiene un sustrato adecuado 101, que puede ser convencional, y un recubrimiento adecuado 102, que puede ser convencional, en uno o ambos lados, que contiene dominios magnéticos (no visibles) cuya polaridad u orientación puede alterarse magnéticamente. El medio 100 también puede tener una abertura (no mostrada) para recibir el eje de una unidad de disco u otro dispositivo de almacenamiento de datos 24.

Los dominios magnéticos del recubrimiento 102 del medio 100 están polarizados u orientados para codificar, de un modo que puede ser convencional, datos legibles mecánicamente tal como los descritos en este documento, para su ejecución por un sistema tal como el sistema 10 de la Fig. 21.

La Fig. 23 muestra una sección transversal de un medio de almacenamiento de datos legible ópticamente 110 que también puede codificarse con dichos datos legibles mecánicamente, o una serie de instrucciones, que puede realizarse por un sistema tal como el sistema 10 de la Fig. 21. El medio 110 puede ser un disco compacto convencional o memoria solamente de lectura de disco DVD (CD-ROM o DVD-ROM) o un medio de re-escritura, tal como un disco magneto-óptico que es legible ópticamente y de escritura magneto-óptica. El medio 100 tiene un sustrato adecuado 111, que puede ser convencional, y un recubrimiento adecuado 112, que puede ser convencional, habitualmente de un lado del sustrato 111.

En el caso de CD-ROM, como se sabe bien, el recubrimiento 112 es reflexivo y está impreso con una pluralidad de orificios 113 para codificar los datos legibles mecánicamente. La disposición de los orificios se lee reflejando luz láser desde la superficie de recubrimiento 112. Se proporciona un recubrimiento protector 114, que es habitualmente transparente, sobre la parte superior del recubrimiento 112.

En el caso de un disco magneto-óptico, como se sabe bien, el recubrimiento 112 no tiene orificios 113, pero tiene una pluralidad redominios magnéticos cuya polaridad u orientación puede cambiarse magnéticamente cuando se calienta por encima de una cierta temperatura, como por un láser (no mostrado). La orientación de los dominios puede leerse midiendo la polarización de la luz láser reflejada desde el recubrimiento 112. La disposición de los dominios codifica los datos como se ha descrito anteriormente.

XI. Diseño Racional de Fármacos

La presente invención permite el uso de técnicas de diseño de fármacos basadas en estructura y racionales para diseñar, seleccionar, y sintetizar o aislar entidades químicas, tales como inhibidores del dominio \alpha1-I y para mejorar inhibidores conocidos de este dominio. Estos inhibidores pueden ser capaces de bloquear el sitio de unión a colágeno de VLA-1. Esta invención también permite el uso de técnicas de diseño de fármacos basadas en estructura y racionales para diseñar variantes que puedan actuar como inhibidores de la unión de colágeno.

La representación tridimensional descrita en el contexto de esta invención puede usarse experimental o computacionalmente para diseñar inhibidores potenciales, otras entidades químicas, variantes del fragmento Fab o combinaciones de entidades químicas que pueden unirse a y realizar las funciones biológicas del fragmento Fab de hAQC2 o el dominio \alpha1-I quimérico de la presente invención.

Un especialista en la técnica puede usarse uno de varios métodos para explorar entidades químicas para su capacidad de asociarse con el complejo del fragmento Fab de hAQC2 o el dominio \alpha1-I quimérico de la presente invención y más particularmente con un sitio de unión del dominio I o el fragmento Fab. Este proceso puede empezar por inspección visual de, por ejemplo, el sitio de unión para el dominio I o el fragmento Fab en la pantalla del ordenador, en base a las coordenadas del complejo de la Fig. 19. Las entidades químicas seleccionadas después pueden posicionarse en una diversidad de orientaciones, o acoplarse, dentro de un sitio de unión individual del dominio I o el fragmento Fab. El acoplamiento puede conseguirse usando un software tal como QUANTA, seguido de minimización de la energía y dinámica molecular con campos de fuerza mecánicos moleculares convencionales, tales como CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA ©1994) y AMBER (P.A. Kollman, University of California at San Francisco, ©1994).

Programas informáticos especializados también pueden ayudar en el proceso de seleccionar entidades químicas. Estos incluyen, inter alia:

1.

GRID (Goodford, P.J., 1985, J. Med. Chem. 28:849-857). GRID está disponible en Oxford University, Oxford, UK.

2.

MCSS (Miranker, A. y M. Karplus, 1991, Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34). MCSS está disponible en Molecular Simulations, Burlington, MA.

3.

AUTODOCK (Goodsell, D.S. y A.J. Olsen, 1990, Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:195-202). AUTODOCK está disponible en Scripps Research Institute La Jolla, CA.

4.

DOCK (Kuntz, I.D. et al., 1982, J. Mol. Biol. 161:269-288). DOCK está disponible en University of California, San Francisco, CA.

Una vez se han seleccionado las entidades químicas adecuadas, pueden ensamblarse en un único compuesto. El ensamblaje puede proceder por inspección visual de la relación de las entidades entre sí sobre la imagen tridimensional presentada en una pantalla de ordenador en relación con las coordenadas estructurales del complejo del fragmento Fab de hAQC2 y el dominio \alpha1-I quimérico. Esto está seguido por la construcción manual del modelo usando un software tal como Quanta o Sybilo.

El proceso de evaluación descrito anteriormente para entidades químicas puede realizarse de un modo similar para compuestos o para variantes que pueden unirse al dominio \alpha1-I.

Los programas útiles para ayudar a los especialistas en la técnica en la conexión de las entidades químicas individuales incluyen:

1.

CAVEAT (Bartlett, P.A. et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". En "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., 1989, Royal Chem. Soc., 78:182-196). CAVEAT está disponible en la University of California, Berkeley, CA.

2.

Sistemas de base de datos 3D tales como MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, CA). Esta área se revisa en Martin, Y.C., 1992, J. Med. Chem. 35:2145-2154.

3.

HOOK (disponible en Molecular Simulations, Burlington, MA).

En lugar de proceder a construir un inhibidor o compuesto de unión en un modo por etapas de una entidad química cada vez, como se ha descrito anteriormente, puede diseñarse un compuesto de unión como un conjunto o "de novo" usando un sitio de unión vacío (tal como un sitio de unión del dominio \alpha1-I o el fragmento Fab de hAQC2) u opcionalmente incluyendo alguna parte o partes de un dominio \alpha1-I conocido o el compuesto de unión al fragmento Fab de hAQC2. Estos métodos incluyen:

1.

LUDI (Bobin, H.J., 1992, J. Comp. Aid Molec. Design 6:61-78). LUDI está disponible en Biosym Technologies, San Diego, CA.

2.

LEGEND (Nishibata, Y. y A. Itai, 1991, Tetrahedron 47:8985). LEGEND está disponible en Molecular Simulations, Burlington, MA.

3.

LeapFrog (disponible en Tripos Associates, St. Louis, MO).

También pueden emplearse otras técnicas de modelado molecular de acuerdo con el contenido de la descripción de esta invención. Véase, por ejemplo, Cohen, N.C. et al., 1990, J. Med. Chem. 33:883-894. Véase también Navia, M.A. y M.A. Murcko, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2:202-210.

Una vez se ha diseñado o seleccionado una entidad por los métodos anteriores, puede ensayarse la eficacia con la que puede unirse esa entidad al dominio \alpha1-I o el fragmento Fab de hAQC2 y optimizarse por evaluación computacional. Por ejemplo, un compuesto que se ha diseñado o seleccionado para que funcione como un compuesto de unión al dominio \alpha1-I puede atravesar un volumen que no solapa con el ocupado por el sitio de unión cuando está unido al dominio \alpha1-I quimérico. Un compuesto de unión al dominio \alpha1-I eficaz puede mostrar una diferencia relativamente pequeña en la energía entre sus estados unido y libre (es decir, una pequeña energía de deformación de unión). Por tanto, el compuesto de unión al dominio \alpha1-I más eficaz debe diseñarse con una energía de deformación de unión de no más de aproximadamente 10 kcal/mol, por ejemplo, de no más de 7 kcal/mol. Los compuestos de unión al dominio \alpha1-I pueden interaccionar con el dominio \alpha1-I en más de una conformación que sea similar en energía de unión global. En esos casos, la energía de deformación de unión resulta ser la diferencia entre la energía del compuesto libre y la energía promedio de las conformaciones observadas cuando el compuesto se une a la proteína.

Un compuesto diseñado o seleccionado que se une al dominio \alpha1-I, puede optimizarse adicionalmente de forma computacional de modo que en su estado unido carezca de interacción electrostática repulsiva con la proteína diana. Dichas interacciones no complementarias (por ejemplo, electrostáticas) incluyen interacciones carga-carga, dipolo-dipolo y carga-dipolo repulsivas. Específicamente, la suma de todas las interacciones electrostáticas entre el compuesto y la proteína cuando el compuesto está unido al dominio \alpha1-I, debe hacer una contribución neutra o favorable a la entalpía de la unión.

Está disponible en la técnica software informático adecuado para evaluar la energía de deformación del compuesto y la interacción electrostática. Los ejemplos de programas diseñados para dichos usos incluyen: Gaussian 92, revisión C (M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA ©1992); AMBER, versión 4.0 (P.A. Kollman, University of California at San Francisco, ©1994); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA ©1994); y Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA ©1994). Estos programas pueden implementarse, por ejemplo, usando una estación de trajo Silicon Graphics. Serán conocidos otros sistemas de hardware y paquetes de software para los especialistas en la técnica.

Otra técnica útil de diseño de fármacos posibilitada por esta invención es el diseño iterativo de fármacos. El diseño iterativo de fármacos es un método para optimizar las asociaciones entre una proteína y un compuesto (ese compuesto incluye un anticuerpo) determinando y evaluando las estructuras tridimensionales de series sucesivas de complejos proteína/compuesto. En el diseño iterativo de fármacos, se obtiene una serie de cristales de una proteína en complejo con entidades que se unen a la proteína y después se resuelve la estructura tridimensional de cada complejo molecular. Dicho enfoque proporciona una idea de las asociaciones entre las proteínas y otras entidades de cada complejo. Esto se consigue seleccionando entidades químicas con actividad inhibidora, obteniendo cristales de estos nuevos complejos, resolviendo la estructura tridimensional de los complejos, y comparando las asociaciones entre los nuevos complejos y el complejo resuelto previamente. Las asociaciones dentro de un complejo pueden optimizarse observando cómo afectan nuevos cambios en los componentes del complejo.

En algunos casos, el diseño iterativo de fármacos se realiza formando sucesivos complejos y después cristalizando cada nuevo complejo. Como alternativa, se impregna un cristal de proteína preformado en presencia de otra entidad química, formando de este modo un complejo y obviando la necesidad de cristalizar cada complejo individual.

XII. Composiciones Farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas descritas en el contexto de esta invención contienen uno o más antagonistas de VLA-1 de la presente invención (por ejemplo, anticuerpos anti-VLA-1 y los antagonistas de VLA-1 de molécula pequeña identificados por los métodos de diseño racional de fármacos descritos anteriormente), o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las composiciones pueden contener adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como un adyuvante, un vehículo, un tampón, y un estabilizador.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el contexto de esta invención pueden darse por vía oral, tópica, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular, intramedular, intra-arterial, intra-articular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intraespinal, intracraneal según se desee, o justo localmente en los sitios de inflamación o crecimiento tumoral. Las composiciones farmacéuticas descritas en el contexto de esta invención también pueden administrarse por inhalación a través del uso de, por ejemplo, un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador de dosis medida, o por implante de una bomba de infusión o un implante de liberación sostenida biocompatible en el sujeto.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con técnicas conocidas en la técnica usando agentes dispersantes, humectantes, y de suspensión adecuados. Si se dan por vía oral, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en forma de cápsulas, comprimidos, suspensiones o soluciones acuosas. Para aplicaciones tópicas, las composiciones farmacéuticas pueden formularse en una pomada adecuada.

La dosificación y la tasa de dosis de los antagonistas de VLA-1 descritos en el contexto de esta invención eficaces para producir los efectos deseados dependerán de una diversidad de factores, tales como la naturaleza de la enfermedad a tratar, el tamaño del sujeto, el objetivo del tratamiento, la composición farmacéutica específica usada, y el criterio del médico que está tratando. Son útiles niveles de dosificación entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día, por ejemplo entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal por día, del compuesto de ingrediente activo. Por ejemplo, un anticuerpo descrito en el contexto de la invención se administrará a una dosis que varía entre aproximadamente 0,01 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día, por ejemplo, que varía entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, y a intervalos de cada uno a cada catorce días. En otra realización, el anticuerpo se administra a una dosis de aproximadamente 0,3 a 1 mg/kg de peso corporal cuando se administra por vía intraperitoneal. En otra realización más, el anticuerpo se administra a una dosis de aproximadamente 5 a 12,5 mg/kg de peso corporal cuando se administra por vía intravenosa. En una realización, una composición de anticuerpo se administra en una cantidad eficaz para proporcionar un nivel plasmático de anticuerpo de al menos 1 mg/ml.

XIII. Enfermedades y Modelos Animales

Los antagonistas de VLA-1 descritos en el contexto de la invención son para el tratamiento, incluyendo la prevención, de enfermedades mediadas por \alpha_{1}\beta_{1} tales como las enumeradas anteriormente. Los tratamientos definidos en el contexto de esta invención son eficaces sobre sujetos tanto humanos como animales afectados de dichas afecciones. Los sujetos animales a los que es aplicable la invención se extiende tanto a animales domésticos como a ganado, criados como mascotas o para propósitos comerciales. Son ejemplos perros, gatos, vacas, caballos, ovejas, cerdos y cabras.

La eficacia de los antagonistas de VLA-1 descritos en el contexto de la invención puede ensayarse en diversos modelos animales. Por ejemplo, los modelos de psoriasis y artritis útiles incluyen los descritos en el documento WO 00/72881. Los modelos de fibrosis renal incluyen los descritos en el documento WO 99/61040, el modelo renal de síndrome de Alport descrito en Cosgrove et al., 2000, Am. J. Path. 157:1649-1659, y el modelo de ratón SNF1 de nefritis por lupus descrito en Kalled et al., 2001, Lupus 10:9-22. Los modelos de fibrosis vascular para reestenosis incluyen un modelo de rata de lesión con globo en la carótida descrito en Smith et al., 1999, Circ. Res. 84:1212-1222. Los modelos de fibrosis pulmonar para fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis pulmonar asociada a esclerodermia incluyen un moldeo de fibrosis pulmonar inducida por bleomicina descrito en Wang et al., 1999, Thorax 54:805-812. Los modelos de cirrosis hepática para cirrosis inducida por hepatitis C o alcohol incluyen el modelo de ligamiento del conducto biliar descrito en George et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:12719-12724 y el modelo de fibrosis hepática inducida por CCLA descrito en Shi et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10663-10668.

La eficacia de los tratamientos definidos en el contexto de esta invención puede medirse por varias herramientas de diagnóstico disponibles, incluyendo examen físico, ensayos sanguíneos, mediciones de proteinuria, niveles de creatinina y eliminación de creatinina, ensayos de la función pulmonar, rayos X del pecho, broncoscopia, lavado broncoalveolar, biopsia pulmonar, niveles plasmáticos de nitrógeno de urea en sangre (BUN), observación y valoración de cicatrización o lesiones fibróticas, deposición de matriz extracelular tal como colágeno, actina de músculo liso y fibronectina, ensayos de la función renal, ultrasonidos, formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), y exploración CT.

XIV. Métodos de Diagnóstico

Los anticuerpos descritos en el contexto de esta invención pueden ser para diagnosticar enfermedades asociadas con niveles alterados de la expresión de \alpha_{1}\beta_{1}. Puede ensayarse una muestra tisular de un sujeto, tal como una biopsia tisular, muestra o lavado de fluido corporal (por ejemplo, lavado alveolar), en un ensayo de captura de antígeno, ELISA, ensayo inmunohistoquímico, y similares usando los anticuerpos. Se usa una muestra tisular de un individuo normal como control.

La práctica de la presente invención empleará, salvo que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química proteica, e inmunología, que están dentro de la experiencia habitual de la técnica. Dichas técnicas se describen en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición (Sambrook et al., Eds.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, Ed.), 1984; patente de Estados Unidos 4.683.195 de Mullis et al.; Nucleic Acid Hybridization, (B.D. Hames y S.J. Higgins), 1984; Transcription and Translation, (B.D. Hames y S.J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volúmenes 154 y 155 (Wu et al., Eds.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds.), 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volúmenes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, Eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, 1986.

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por un especialista en la técnica a la que pertenece esta invención. A continuación se describen métodos y materiales ejemplares, aunque también pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente invención. En caso de conflicto, dominará la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. Los materiales, métodos, y ejemplos son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitantes. En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, se entenderá que la palabra "comprender" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende" implica la inclusión de un entero indicado o grupo de enteros pero no la exclusión de ningún otro entero o grupo de enteros.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invención, y no deben entenderse como limitantes de la misma.

Ejemplos Reactivos químicos

Se adquirió isotiocianato de fluoresceína (FITC) de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Se adquirió aceite de crotón de ICN Biochemicals (Aurora, OH). Se obtuvo sangre completa de oveja en solución Alsevers de East Acres Biologicals (Southbridge, MA). Se adquirieron colágeno tipo I de cola de rata y colágeno tipo IV de ratón de Collaborative Research Inc. (Bedford, MA) y Gibco (Gaithersburg, MD), respectivamente.

Se adquirieron ratones hembra Balb/c de 6-8 semanas de edad de Taconic (Germantown, NY) y los ratones deficientes en integrina \alpha1\beta1 en un fondo Balb/c fueron como se ha descrito previamente (3).

Ejemplo 1

Anticuerpos Monoclonales. Se prepararon mAb de bloqueo de función contra antígeno murinos en un formato libre de azida y de bajo contenido en endotoxina: Ha31/8 (anti-CD49a de hámster; integrina \alpha1) (Mendrick et al. 1995 Lab. Invest. 72:367-375), Hal/29 (anti-CD49b de hámster; integrina \alpha2) (\beta1) (Mendrick et al. 1995 Lab. Invest. 72:367-375; Mendrick, D.L. y D.M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69:690-702), mAb Ha4/8 de hámster de control grupo II (anti-KLH hámster) (Mendrick, D.L. y D.M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69:690-702), y PS/2 (anti-CD49d de rata; cadena \alpha4\beta1 de integrina) (Miyake et al. 1991 J. Exp. Med. 173: 599-607). Además, se adquirieron los siguientes mAb de bloqueo de función contra antígenos murinos en forma de preparaciones sin azida/de bajo contenido en endotoxina en Pharmingen (San Diego, CA): HM\beta1-1 (anti-CD29 de hámster; cadena \beta1 de integrina) (Noto et al. 1995 Int. Immunol. 7:835-842), Ha2/5 (anti-CD29 de hámster; cadena \beta1 de integrina) (Mendrick, D.L. y D.M. Kelly 1993 Lab. Invest. 69: 690-702), 3E2 (anti-CD54 de hámster, ICAM-1) (Scheynius et al. 1993 J. Immunol. 150:655-663), 5H10-27 (anti-CD49e de rata; integrina \alpha5) (Kinashi, T., y T.A. Springer. 1994, Blood Cells. 20:25-44), GoH3 (anti-CD49f de rata; integrina \alpha6) (Sonnenberg et al. 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383), y los mAb de control de isotipo de rata R35-95 (IgG2a de rata) y R35-38 (IgG2b de rata).

Ensayo de Adhesión. Se cultivaron esplenocitos de ratones Balb/c con 20 ng/ ml de IL-2 durante 7-12 días. La adhesión de células a colágeno de tipo I y tipo IV se ha descrito previamente (Gotwals et al. 1996 J. Clin. Invest. 97:2469-2477). En resumen, se recubrieron placas Maxisorp de 96 pocillos (Nunc, Napierville, IL) con 10 \mug/ml de colágeno tipo IV o 5 \mug/ml de colágeno tipo I y se bloquearon los sitios no específicos con BSA al 1%. Los esplenocitos activados con IL-2 se marcaron con BCECF [pentaacetoximetiléster de 2',7'-bis(carboxietil)-5(6)carboxil fluoresceína] 2 \muM (Molecular Probes, Eugene, OR) y se incubaron con 10 \mug/ml de los mAb indicados durante 15 min. Después se añadieron 10^{5} células en BSA al 0,25% en RPMI a los pocillos recubiertos y se incubaron durante 60 min. a 37ºC. Las células no unidas se retiraron lavando tres veces con BSA al 0,25% en RPMI. La adhesión se cuantificó usando un lector de placa fluorescente CytoFluor 2350 (Millipore, Bedford, MA). Se midió la proporción de células unidas a células introducidas y se calculó el porcentaje de adhesión con relación a las células tratadas con mAb de control (normalizado al 100%). Se restaron los valores de fondo debidos a la adhesión celular en pocillos recubiertos con BSA sola.

Expresión y bloqueo funcional de \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 en leucocitos activados. Dado el papel clave que los leucocitos desempeñan en la inflamación, se decidió ensayar si los mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 eran capaces de bloquear la adhesión de los leucocitos a los colágenos. Para obtener leucocitos que expresen elevados niveles tanto de \alpha1 como de \alpha2, se estimularon células T murinas in vitro con IL-2 durante 7-12 días. Estas células expresaron elevados niveles tanto de \alpha1 como de \alpha2 (Fig. 1A), y se unieron bien a superficies recubiertas con colágeno tanto tipo IV como tipo I (Fig. 1B). La adhesión al colágeno tipo IV se inhibió parcialmente por mAb anti-\alpha1 solo y no se inhibió por mAb anti-\alpha2 solo. En contraste, la adhesión a colágeno tipo I se inhibió completamente por mAb anti-\alpha2 y mAb anti-\alpha1 solo mostró inhibición solamente parcial. Tanto el mAb anti-\beta1 como la combinación de mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 inhibieron completamente la adhesión a colágeno tipos I y IV. Habiendo demostrado que las integrinas \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 se expresan en células T activadas y que los mAb anti-\alpha1 y \alpha2 son capaces de bloquear funcionalmente la adhesión de leucocitos a colágenos, se usaron estos mAb para investigar el papel in vivo de estas integrinas en modelos animales de trastornos inflamatorios.

Ejemplo 2

Inhibición de respuestas DTH por mAb anti-integrina. Las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) inducidas por SRBC se adaptaron a partir de un protocolo publicado previamente (Hurtrel et al., 1992, Cell. Immunol. 142:252-263). En resumen, los ratones se inmunizaron s.c. en el lomo con 2 x 10^{7} SRBC en 100 \mul de PBS en el día 0. Los ratones se expusieron en el día 5 inyectando 1 x 10^{8} SRBC en 25 \mul de PBS s.c en la almohadilla plantar de la pata trasera derecha. Se midió el grosor de la almohadilla plantar con un calibre antropométrico (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) 20 h después de la exposición a antígeno, y se calculó el grado de hinchamiento de la almohadilla plantar. Los resultados se presentan como el porcentaje medio de aumento en el grosor de la almohadilla plantar \pm SEM y se calculó como el % de aumento = [1- (grosor de la almohadilla plantar derecha 20 h después de la exposición al antígeno/grosor de la almohadilla plantar izquierda sin inyectar 20 h después de la exposición a antígeno)] x 100. Para bloquear la fase efectora de la respuesta DTH inducida por SRBC, se dieron i.p. mAb terapéuticos o de control (100 \mug), que se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1, 1 h antes de la exposición a antígeno en el día 5.

DTH inducida por SRBC es un modelo in vivo bien caracterizado de inflamación, y en particular psoriasis, que se ha usado para demostrar la importancia de una diversidad de citoquinas y moléculas de adhesión en la inflamación (Tedder et al., 1995, J. Exp. Med. 181:2259-2264, Terashita et al., 1996, J. Immunol. 156:4638-4643). Los ratones sensibilizados con SRBC recibieron mAb anti-integrina 1 h antes de la exposición a antígeno en la almohadilla plantar y se evaluó la inflamación 20 h después medida por el grosor aumentado de la almohadilla plantar. Os ratones tratados con PBS e Ig de hámster de control mostraron un aumento del 60-70% en el grosor de la almohadilla plantar 20 h después de la exposición a antígeno (Fig. 2). En comparación con el tratamiento de Ig de hámster de control, los mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 provocaron una inhibición del 68% y el 60% en el grosor de la almohadilla plantar, respectivamente. La combinación de mAb anti-\alpha1 y \alpha2 provocaron una inhibición del 71%, que demuestra poco afecto aditivo sobre los mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 solos. El tratamiento con otros mAb anti-integrina también fue eficaz en la inhibición de la respuesta efectora de DTH. El grado de inhibición observado con los diversos tratamientos con mAb fue del 49% (anti-\alpha4), del 23% (anti-\alpha5), y del 57% (anti-\alpha6). Finalmente, el bloqueo por mAb de la subunidad común \beta1 de integrina (mAb HMBI-1) inhibió la respuesta DTH efectora en un 67%.

Ejemplo 3

Inhibición de las respuestas efectoras CHS por mAb anti-integrina. Se ensayó la hipersensibilidad por contacto (CHS) a FITC como se ha descrito previamente (Gaspari et al., 1991, En Current Protocols in Immunology. J.E. Coligan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach, and W. Strober, editors. John Wiley & Sons, New York. Sección 4.2:1). En resumen, los ratones se sensibilizaron untando 100 \mul de FITC al 0,5% en acetona/dibutilftalato 1:1 sobre el lomo afeitado en el día 0. A los 10 días después, se expuso a los animales aplicando 5 \mul de FITC al 0,5% sobre ambos lados de cada oreja. Se determinó la respuesta de hinchamiento de la oreja por el grosor de la oreja medida con un calibre antropométrico (Mitutoyo/MTI, Paramus, NJ) a el momento de la exposición a antígeno (día 10) y 24 h después, y los resultados se presentaron como el porcentaje medio de aumento en el grosor de la oreja de la medida inicial \pm SEM. El aumento en el grosor de la oreja se calculó como el % de aumento = [1- (grosor de la oreja 24 h después de la exposición a antígeno/grosor de la oreja en el momento de la exposición a antígeno)] x 100. Para bloquear a fase efectora de la respuesta CHS, se dieron i.p. mAb terapéuticos o de control (250 \mug) 4 h antes de la exposición a antígeno en el día 10. Los ratones que se sensibilizaron con antígeno y se expusieron en la oreja con vehículo solamente (control de vehículo) o ratones que se expusieron en la oreja sin sensibilización previa (control irritante) sirvieron como controles negativos (nunca excedieron el 2% de aumento en el grosor de la oreja).

Dado que CHS es mecanísticamente distinta de DTH e implica diferentes células efectoras, se investigó qué efecto tenían los mAb anti-integrina sobre la fase efectora de la respuesta CHS. Los ratones se sensibilizaron con hapteno usando FITC aplicado a sus lomos afeitados, seguido 10 días después con exposición a FITC en la oreja provocando una respuesta inflamatoria el siguiente día. Los ratone sensibilizados con FITC mostraron un aumento del 60-70% en el grosor 24 h después de la exposición a antígeno (Fig. 3). Coherente con los resultados publicados (Scheynius et al., J. Immunol. 150:655-663), el tratamiento con mAb anti-ICAM-1 provocó una inhibición del 51% del hinchamiento de la oreja. En comparación con el mAb de hámster de control, el tratamiento de los ratones con mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 4 h antes de la exposición a antígeno provocó una inhibición del 37% y el 57% del hinchamiento de la oreja, respectivamente (Fig. 3). La combinación de mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 provocó una inhibición ligeramente mayor del hinchamiento de la oreja (65%). El tratamiento con otros mAb contra integrinas \beta1 reveló que aunque mAb anti-\alpha4 y anti-\alpha5 provocaban ausencia de inhibición de la respuesta efectora de CHS inducida por FITC en comparación con el mAb de rata de control, el tratamiento con mAb anti-\alpha6 provocaba una inhibición del 86% de las respuestas efectoras. Finalmente, el bloqueo con mAb de la subunidad común \beta1 de integrina inhibía las respuestas efectoras de CHS en un 74%. Se obtuvieron resultados de CHS similares usando diferentes cepas de ratones (C57/BL6, 129/Sv) y un agente sensibilizante diferente (oxazolona) (datos no mostrados). Similar a los resultados observados en el modelo de DTH inducida por SRBC, el análisis histológico de las orejas inflamadas reveló que tanto la formación de edema como la infiltración leucocitaria se inhibían por el tratamiento con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2.

Coherente con el hallazgo de que \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 pueden expresarse en esplenocitos activados con IL-2, el análisis de los ganglios linfáticos de ratones sensibilizados con antígeno (FITC o oxazolona) reveló que \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 se expresan exclusivamente en células T CD4+ y CD8+ activadas con CD44^{hi} LFA-1^{hi} (datos no mostrados). El tratamiento de ratones con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 no provocó eliminación de estas células, ya que las cantidades de células T activadas tanto en bazo como en ganglios linfáticos observadas en respuesta a sensibilización con antígeno en el modelo CHS estuvieron sin afectar. Además, las células efectoras no se eliminaban funcionalmente ya que el tratamiento prolongado de ratones sensibilizados con antígeno con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 (día 10-16) no afectaba a la respuesta inflamatoria de ratones expuestos con antígeno en el día 20 (datos no mostrados).

Ejemplo 4

Las respuestas efectoras CHS se disminuyen en ratones \alpha1\beta1-deficientes. Para excluir la posibilidad de que el papel inhibidor de \alpha1\beta1 en la respuesta efectora de CHS mediada por FITC estuviera mediada por mAb, se realizaron experimentos en ratones de tipo silvestre y deficientes en integrina \alpha1\beta1 (Fig. 4). La inhibición con mAb de la fase efectora en ratones de tipo silvestre era coherente con los resultados previos, con una inhibición del 56% en el grosor de la oreja observada con anti-\alpha1, del 56% con anti-\alpha2, y del 62% con una combinación de anti-\alpha1 y anti-\alpha2. La fase efectora de CHS se reducía significativamente en ratones \alpha1\beta1-deficientes no tratados en comparación con ratones de tipo silvestre no tratados (aumento del 30% frente al 71% en el grosor de la oreja, respectivamente). Como se esperaba, el nivel de hinchamiento de la oreja en ratones \alpha1\beta1-deficientes no tratados era equivalente al nivel de hinchamiento de la oreja observado en ratones de tipo silvestre tratados con mAb anti-\alpha1. Finalmente, el bloqueo por mAb de \alpha2\beta1 en los ratones \alpha1\beta1-deficientes provocó una inhibición solamente aumentada ligeramente del hinchamiento de la oreja, coherente con los resultados observados en ratones de tipo silvestre tratados con una combinación de mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2.

Ejemplo 5

Para excluir adicionalmente la posibilidad de que el efecto inhibidor de los mAb anti-integrina observado en los modelos tanto de DTH como de CHS de inflamación esté causado por un efecto anti-inflamatorio general mediado por los mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2, se estudió el efecto de estos mAb sobre dermatitis irritante.

Para evaluar la dermatitis irritante, los ratones se untaron con 5 \mul de aceite de crotón al 0,8% en acetona en ambos lados de cada oreja. Se dieron anticuerpos terapéuticos o de control 4 h antes de la aplicación del irritante. Se midió el hinchamiento de la oreja 24 h después como se ha descrito anteriormente y se comparó con el grosor de la oreja antes de la aplicación del aceite de crotón. Los resultados se presentan como el porcentaje medio del aumento en el grosor de la oreja de la medida inicial \pm SEM como se ha descrito anteriormente. Los ratones untados con acetona solamente (control de vehículo) sirvieron como control negativo.

A las 24 h después, las orejas de ratones tratados con aceite de crotón mostraron un aumento significativo en el grosor de la oreja (48%), en comparación con ratones que recibieron solamente vehículo (acetona). El hinchamiento tóxico de la oreja causado por aceite de crotón no estuvo significativamente afectado en ratones pretratados con mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 en comparación con animales tratados con PBS o mAb de control (Fig. 5). El examen histológico de las orejas tratad con aceite de crotón reveló ausencia de diferencias en las cantidades o tipos de células infiltrantes o formación de edema en ratones tratados con mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2, en comparación con ratones tratados con mAb de control o ratones tratados con PBS (datos no mostrados).

Ejemplo 6

Inhibición de artritis por \alpha1\betaa y \alpha2\beta1. Como \alpha1\beta1 se expresa bien en células infiltrantes en el fluido sinovial de pacientes con artritis, se decidió examinar si los mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 serían inhibidores en un modelo acelerado de artritis previamente descrito (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147).

Se adquirieron kits Arthrogen-CIA Antibody en Stratagene (La Jolla, CA) y se indujo la artritis usando un protocolo bien establecido (Terato et al., 1992, J. Immunol. 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). En resume, se indujo la artritis a través de inyección i.p. de un cóctel de 4 mAb anti-colágeno tipo II (1 mg cada uno) en el día 0, seguido de inyección i.p. de 50 \mug de LPS en el día 3. Durante el transcurso de los siguientes 3-4 días, los ratones desarrollaron muñecas, tobillos y dedos hinchados. Se administró mAb terapéutico o de control (250 \mug) i.p. 4 h antes de la inyección de los mAb anti-colágeno en el día 0, y de nuevo 4 h antes de la administración de LPS en el día 3, y después continuando cada 3 días durante el transcurso del experimento. Empezando en el día 3, los ratones se evaluaron para el desarrollo de artritis. Se valoró la gravedad de la artritis en cada extremidad usando un sistema de cuatro puntos. 0=normal; 1=rojez leve, ligero hinchamiento de tobillos o muñecas; 2=hinchamiento moderado de tobillos o muñecas; 3=hinchamiento severo incluyendo algunos dedos, tobillos, y patas; 4=máximamente
inflamados.

La artritis severa en ratones Balb/c se desarrollo en 72 h después de la inyección de LPS y persistió durante más de 3 semanas. Ni la inyección de mAb anti-colágeno solos ni LPS solo indujeron artritis. Los ratones que recibieron tratamiento con mAb de control presentaron artritis igual de severa que la observada en ratones tratados con PBS (Fig. 6). En contraste, el tratamiento con mAb anti-\alpha1 solo provocó una marcada reducción (78%) en la artritis, que duró el trascurso del experimento. El tratamiento con mAb anti-\alpha2 solo también tuvo un efecto beneficioso, provocando una disminución del 32% en el valor artrítico en comparación con los ratones tratados con mAb de control. La combinación de mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 provocó un grado similar de inhibición al observado con mAb anti-\alpha1 solo.

Ejemplo 7

Análisis histológico del efecto del tratamiento con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 sobre el infiltrado celular inflamatorio. El análisis histológico adicional de la respuesta DTH inducida por SRBC confirmó la capacidad del tratamiento con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 de modular la respuesta inflamatoria provocada. Una almohadilla plantar no expuesta de un ratón sensibilizado con SRBC mostró casi ausencia de infiltrado celular inflamatorio en comparación con una almohadilla plantar expuesta a SRBC del mismo ratón. El tratamiento de ratones sensibilizados con SRBC con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 solos o combinados redujo enormemente la cantidad de estas células infiltrantes halladas en las almohadillas plantares expuestas a SRBC en comparación con ratones tratados con mAb de control. Un examen más cercano de las células infiltrantes reveló que la mayoría de las células estaba compuesta por neutrófilos, con algunos monocitos y linfocitos presentes, y confirmó que el tratamiento con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 disminuía enormemente las cantidades de estas células.

Ejemplo 8

Demostración inmunohistoquímica de células que expresan \alpha1 en el infiltrado celular inflamatorio. Se realizó inmunohistoquímica para determinar de forma más precisa la naturaleza de las células infiltrantes y si expresan integrinas de unión a colágeno. Se examinaron las células infiltrantes de una almohadilla plantar infamada de un ratón no tratado para la expresión de integrina \alpha1\beta1 y marcadores de linaje celular. Se descubrió que la integrina \alpha1\beta1 se expresa en muchos leucocitos infiltrantes. Se utilizó inmunohistoquímica doble para identificar la naturaleza de las células infiltrantes y la distribución de la expresión de \alpha1\beta1. Usando marcadores de linaje celular, se descubrió que el infiltrado estaba compuesto en gran medida por granulocitos/monocitos (Mac-1+), siendo muchas de estas células neutrófilos (Grl+), junto con una pequeña cantidad de linfocitos T (CD3+). Se halló expresión de integrina \alpha1\beta1 entre los tres subconjuntos de células, con \alpha1 expresado en un subconjunto de granulocitos/monocitos Mac-1+, un subconjunto de neutrófilos Grl+, y en la mayoría de los linfocitos T CD3+ infiltrantes. El análisis inmunohistoquímico detallado reveló que aunque el tratamiento con mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 reducía las cantidades de células infiltrantes, no se observó ningún cambio en la composición celular del infiltrado (datos no mostrados). La tinción inmunohistoquímica con un mAb anti-hámster-FITC confirmó la capacidad del mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 de localizarse en la almohadilla plantar inflamada (datos no mostrados).

Ejemplo 9

Inhibición de la artritis por mAb contra \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 y en ratones \alpha1-deficientes. Como \alpha1\beta1 se expresa bien en células infiltrantes en el fluido sinovial pacientes con artritis, se decidió examinar si los mAb anti-\alpha1 o anti-\alpha2 serían inhibidores en un modelo acelerado de artritis descrito previamente (Terato et al., 1992, J. Immunol 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147). Este modelo implica la inyección de un cóctel de mAb anti-colágeno tipo II en ratones, seguido después por la administración de LPS, provocando el desarrollo de artritis durante los siguientes 3-7 días. Se dio a los ratones mAb cada 3 días empezando en el día 0, y se valoraron para el desarrollo de artritis cada 3 días. Se desarrolló artritis severa en todos los ratones en las 72 h después de la inyección de LPS y persistió durante más de 3 semanas. No la inyección de mAb anti-colágeno solos no LPS solo indujeron artritis. Los ratones que recibieron tratamiento con mAb de control presentaron artritis igual de severa que la observada en ratones tratados con PBS (Fig. 7). En contraste, el tratamiento con mAb anti-\alpha1 solo provocó una marcada reducción (79% y mayor) en la artritis, que duró el transcurso del experimento. El tratamiento con mAb anti-\alpha2 solo también tuvo un efecto beneficioso, provocando una disminución del 37% en la el valor artrítico en comparación con los ratones tratados con mAb de control. La combinación de mAb anti-\alpha1 y anti-\alpha2 provocó un grado similar de inhibición al observado con mAb anti-\alpha1 solo. Se observó reducción del valor artrítico con tratamiento con mAb anti-\alpha1 en todos los ratones y se compara de forma favorable con varios tratamientos basados en mAb diferentes para artritis tales como proteína de fusión soluble de Ig con receptor de TNF (Mori et al., 1996, J. Immunol. 157:3178-3182), anti-Mac-1 (Taylor et al., 1996, Immunology. 88:315-321), anti-\alpha4 (Seiffge, 1996, J. Rheumatol. 23:2086-2091), y anti-ICAM-1 (Kakimoto et al., 1992, Cell Immunol. 142:326-337). De acuerdo con los datos basados en mAb que muestran un papel importante para \alpha1\beta1 en artritis, ratones \alpha1-deficiente no tratados mostraron una reducción significativa en el valor artrítico en comparación con ratones de tipo silvestre.

Ejemplo 10

Efecto de tratamiento con mAb anti-\alpha1 sobre la inmunopatología de articulaciones artríticas. Se compararon articulaciones de de ratones artríticos de tipo silvestre (día 8) que recibieron mAb de control o tratamiento con mAb anti-\alpha1 visual e histológicamente con articulaciones de un ratón no tratado normal. Visualmente, las articulaciones de ratones tratados con mAb de control mostraron rojez e hinchamiento de la pata completa incluyendo los dedos, mientras que los ratones tratados con mAb anti-\alpha1 mostraron pocos, si los hay, signos de inflamación en las articulaciones o los dedos. El examen histológico mostró cambios importantes en articulaciones artríticas tratadas con mAb de control, con infiltración extensiva del tejido subsinovial con células inflamatorias, adherencia de células a la superficie articular, y destrucción marcada del cartílago como reevidencia por la pérdida de proteoglucano. Coherente con los informes previos (Terato et al., 1992, J. Immunol 148:2103-2108; Terato et al., 1995, Autoimmunity 22:137-147), la mayoría de las células infiltrantes en este modelo son neutrófilos. El tratamiento con mAb anti-\alpha1 de ratones redujo drásticamente la cantidad de infiltrado inflamatorio y el grado de destrucción de cartílago.

Ejemplo 11

El desarrollo de la artritis se retarda en ausencia de linfocitos y la inhibición de la artritis por mAb anti-\alpha1 sucede en ausencia de linfocitos. Para determinar qué tipos celulares pueden ser importantes en el modelo de artritis inducida por mAb, se comparó la capacidad de ratones B6-129 de tipo silvestre y ratones B6-129 RAG-1-deficientes de desarrollar artritis (Fig. 8). La deleción genética del gen RAG-1 (gen de activación de la recombinación-1) provoca una pérdida completa de linfocitos T y B maduros (Mombaerts et al., 1992, Cell 68:869-877). Tanto los ratones de tipo silvestre como los ratones RAG-1-deficientes desarrollaron artritis, aunque la cinética de inducción en los ratones RAG-1-deficientes es significativamente más lenta (Fig. 8). Estos resultados sugieren que aunque los linfocitos están implicados en este modelo de artritis, no son necesarios para el desarrollo y progreso de la enfermedad. Los informes publicados que examinan el efecto de los ratones RAG-1-deficientes en otros modelos de artritis también hallaron que la pérdida de linfocitos T y B retardaba la aparición de artritis (Plows et al., 1999, J. Immunol. 162:1018-1023). El tratamiento de ratones de tipo silvestre o RAG-1-deficientes con mAb anti-\alpha1 inhibió completamente la artritis (Fig. 8). Estos resultados demuestran que la eficacia de mAb anti-\alpha1 en este modelo no depende de la presencia de linfocitos, y que como se sugiere por experimentos previos (Fig. 7), a eficacia del mAb anti-\alpha1 en la prevención de la enfermedad puede ser a través de su acción sobre otras células que expresan \alpha1, tales como macrófagos y neutrófilos.

Ejemplo 12

Respuesta a dosis de la inhibición por mAb anti-\alpha1 de artritis. Dados los impactantes efectos del tratamiento con mAb anti-\alpha1 sobre la prevención de la artritis, se ampliaron estos estudios para incluir un análisis de respuesta a dosis (Fig. 9). Se administraron i.p. diferentes dosis de mAb cada 3 días empezando en el día 0. De acuerdo con los datos anteriores, una dosis de 250 \mug de mAb anti-\alpha1 provocó una prevención casi completa de artritis. Una dosis inferior de 100 \mug de mAb anti-\alpha1 fue parcialmente eficaz para prevenir la artritis en este modelo, mientras que dosis inferiores no tuvieron ningún efecto distinguible sobre valor artrítico (Fig. 9).

Ejemplo 13

El tratamiento terapéutico con mAb anti-\alpha1 puede disminuir el valor artrítico. Dada la eficacia del mAb anti-\alpha1 en la prevención de la artritis, se intentó tratar a ratone que están en proceso de desarrollar enfermedad. La artritis se indujo en los ratones por inyección de un cóctel de mAb anti-colágeno tipo II en el día 0, seguido de administración de LPS en el día 3. Después los ratones se trataron con mAb anti-\alpha1 o una proteína de fusión soluble de Ig con receptor de TNF empezando en el día 4. El progreso de la artritis se bloqueó completamente en ratones que recibieron mAb anti-\alpha1 empezando en el día 4, en comparación con ratones que recibieron mAb de hámster de control empezando en el día 4 (Fig. 10). El grado de inhibición observado con la administración terapéutica de mAb anti-\alpha1 fue completo y fue igual al observado con tratamiento preventivo de mAb anti-\alpha1 (empezado en el día 0) (Fig. 10). En comparación, el tratamiento con proteína de fusión de Ig con receptor de TNF desde el día 4 en adelante provocó una inhibición de solamente el 60-70% en el valor artrítico en comparación con la proteína de fusión de Ig de control (Fig. 10). El tratamiento combinado de mAb anti-\alpha1 y fusión de Ig con receptor de TNF junto fue eficaz para inhibir completamente el valor artrítico, que no es sorprendente dada la eficacia completa del tratamiento con mAb anti-\alpha1 solo para suprimir la artritis. En resumen, estos resultados indican que el tratamiento terapéutico con mAb anti-\alpha1 es eficaz para inhibir el valor artrítico, y se compara de forma favorable con el tratamiento terapéutico con un antagonista de TNF.

Ejemplo 14

Clonación y mutagénesis del dominio \alpha1-I. Se amplificaron las secuencias del dominio I de integrina \alpha1 humana y de rata a partir de ADNc de longitud completa (Kern, et al., 1994, J. Biol. Chem. 269, 22811-22816; Ignatius et al., 1990, J. Cell Biol. 111, 709-720) por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (PCR CORE Kit; Boehringer Mannheim, GmbH Alemania), usando cebadote específicos de ser human, 5'-CAGGATCCGTCAGCCCCACATTTCAA-3' [directo] (SEC ID Nº 7), y 5'-TCCTCGAGGGCTTGCAGGGCAAATAT-3' [inverso] (SEC ID Nº 8), o cebadores específicos de rata, 5'-CAGGATCCGTCAGTCCTACATTTCAA-3' [directo] (SEC ID Nº 9), y 5'-TCCTCGAGCGCTTCCAAAGCGAATAT-3' [inverso] (SEC ID Nº 10).

Los productos amplificados por PCR resultantes se purificaron, se ligaron en pGEX4t-i (Pharmacia), y se introdujeron por transformación en células DH5\alpha competentes (Life Technologies). Se exploraron colonias resistentes a ampicilina para la expresión de la proteína de fusión de -45 kDa de glutatión S-transferasa-dominio I. Las secuencias de insertos del ADN plasmídico de clones que se seleccionaron para caracterización adicional se confirmaron por secuenciación de ADN.

Se generó un dominio \alpha1-I quimérico de rata/ser humano (R\DeltaH) (kit MORPH Mutagenesis; cebado 5 - cebado 3), intercambiando los restos de rata G91, R92, Q93, y L96 (Fig. 11) por los restos humanos correspondientes, V, Q, R, y R, respectivamente. Se identificaron los clones que albergan el dominio I R\DeltaH por la pérdida de un sitio de enzima de restricción Stu 1 de diagnóstico, y los insertos se confirmaron por secuenciación de ADN. La secuencia de aminoácidos del dominio \alpha1-I humano se muestra en la Fig. 12.

Ejemplo 15

Generación de mAb específicos contra el dominio \alpha1-I. Los anticuerpos monoclonales han demostrado ser sondas muy útiles para estudiar la relación entre la estructura y la función de subunidades de integrina. Por ejemplo, se usaron mAb extensivamente para estudiar regiones de la subunidad \beta1 asociada con una conformación activada (Qu, A., y Leahy, D. J. (1996) Structure 4, 931-942). Por tanto, para identificar sondas potenciales para cambios conformacionales del dominio \alpha1-I, se generó un panel de mAb contra el dominio \alpha1-I humano.

Generación de Anticuerpos Monoclonales anti-dominio \alpha1 I. Se inmunizaron por vía intraperitoneal (i.p.) ratones Robertsonianos hembra (Jackson Labs) con 25 \mug de \alpha1\beta1 humano purificado (Edwards et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 12635-12640; Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:8280-8) emulsionado con adyuvante completo de Freund (LifeTechnologies). Se reforzaron tres veces i.p. con 25 \mug de \alpha1\beta1 emulsionado con adyuvante incompleto de Freund (LifeTechnologies). El ratón con el título anti-dominio \alpha1-I mayor se reforzó i.p. con 100 \mug de \alpha1\beta1 tres días antes de la fusión, y por vía intravenosa con 50 \mug de \alpha1\beta1 un día antes de la fusión. Las células esplénicas se fusionaron con células de mieloma FL653 a una proporción 1:6 y se sembraron a 100.000 y 33.000 por pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos.

Se evaluaron los sobrenadantes para su unión a la integrina \alpha1\beta1 por FACS de un único color. Antes del análisis FACS, los sobrenadantes se incubaron con células K562 sin transfectar para eliminar la IgG que se unía solamente a la subunidad \beta. Posteriormente, se incubaron 3-5 x 10^{4} células K562 transfectadas con la subunidad de integrina \alpha1 (K562-\alpha1) suspendidas en tampón FACS (suero de ternera fetal (FCS) al 1% en PBS que contenía NaN_{3} al 0,5%) con sobrenadante durante 45 minutos a 4ºC, se lavaron y se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con ficoeritrina. Después de lavar dos veces con tampón FACS, las células se analizaron en un citómetro de flujo Becton Dickinson.

Los sobrenadantes de los hibridomas resultantes se exploraron para la unión al dominio \alpha1-I. En resumen, se recubrieron 50 \mul de fusión dominio \alpha1-I humano-GST a 30 \mug/ml en PBS sobre pocillos de una placa de 96 pocillos (Nunc) durante una noche a 4ºC. Las placas se lavaron con PBS, se bloquearon con BSA al 1% en PBS y el sobrenadante de hibridoma se incubó con el dominio I a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavado extensivo con PBS que contenía Tween 20 al 0,03%, se añadió IgG anti-ratón unido a fosfatasa alcalina (Jackson ImmunoResearch) durante una hora adicional. Después de un lavado final, se añadió 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato (pNPP) en glicina 0,1 M, ZnCl_{2} 1 mM, y MgCl_{2} 1 mM durante 30 minutos a temperatura ambiente, y las placas se leyeron a O.D. 405.

Los sobrenadantes seleccionados se ensayaron para su capacidad de inhibir la adhesión dependiente de K562-\alpha1 a colágeno IV. Las células K562-\alpha1 se marcaron con pentaacetoximetiléster de 2',7'-(bis-2-carboxietil-5 y 6) carboxifluoresceína (BCECF; Molecular Probes) 2 mM en DMEM que contenía BSA al 0,25% a 37ºC durante 30 minutos. Las células marcadas se lavaron con tampón de unión (Hepes 10 mM, pH 7,4; NaCl al 0,9%; y glucosa al 2%) y se resuspendieron en tampón de unión más MgCl_{2} 5 mM a una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml. Se incubaron 50 \mul de sobrenadante con un volumen igual de 2 x 10^{5} células K562-\alpha1 en pocillos de una placa de 96 pocillos. La placa después se centrifugó y se retiraron los sobrenadantes. Las células se resuspendieron en tampón de unión y se transfirieron a pocillos de una placa recubierta con colágeno y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, las células no adherentes se retiraron lavando tres veces con tampón de unión. Las células unidas se analizaron en un Cytofluor (Millipore).

Se identificaron inicialmente 19 hibridomas, cuyos sobrenadantes se unieron a células K562 de leucemia humana que expresaban la integrina \alpha1\beta1 (K562-\alpha1) y al dominio \alpha1-I. Las inmunoglobulinas se purificaron de cada uno de estos hibridomas y se ensayaron para la capacidad de bloquear la unión de K562-\alpha1 o el dominio \alpha1-I a colágeno IV. Los mAb están en dos clases: aquellos que bloquean y aquellos que no bloquean la función \alpha1\beta1. Por ejemplo, mientras que los mAb producidos por los clones AEF3, BGC5, AQC2 y AJH10 se unen al dominio \alpha1-I (Fig. 13A, datos no mostrados para BGC5), solamente los mAb AJH10 y AQC2 inhiben la adhesión dependiente del dominio \alpha1-I (Fig. 13B; Fig. 16B) o K562-\alpha1 (Fig. 13C; Fig. 16C) a colágeno IV.

Secuenciación de las Regiones Determinantes de Complementariedad. Para establecer el origen clonal de este panel de mAb, se amplificaron por PCR y secuenciaron las CDR de 12 de los 19 anticuerpos (datos no mostrados).

Se transcribieron de forma inversa (kit Ready-To-Go You Prime First Strand, Pharmacia Biotech) 2 \mug del ARNm aislado de 10^{7} hibridomas (kit de aislamiento de ARNm FastTrack, Invitrogen), usando 25 pM de cada uno de los siguientes cebadores: cadena pesada, VHIFOR-2 (Michishita et al., 1993, Cell 72:857-867); cadena ligera, VK4FOR, que define cuatro oligos diferentes (Kern et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:22811-22816). Para cada hibridoma, se amplificaron las cadenas pesada y ligera en cuatro reacciones de PCR diferentes usando diversas combinaciones de los siguientes oligos: 1) cadena pesada: VHIFR1K (Kamata et al., 1995, J. of Biol. Chem. 270:12531-12535), VH1BACK, VH1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), V_{H}fr1a, V_{H}fr1b, V_{H}fr1e, V_{H}fr1f, V_{H}fr1g (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 709-720), o VH1FOR-2 (Michishita, M., Videm, V., y Arnaout, M. A. (1993) Cell 72, 85 7-867); 2) cadena ligera: VK1BACK (Baldwin et al. (1998) Structure 6, 923-935), oligos VK4FOR, VK2BACK (Kern et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 22811-22816), o V_{K}fr1a, V_{H}fr1c, V_{H}fr1e, V_{H}fr1f (Ignatius et al. (1990) J. Cell Biol. 111, 709-720). Los productos se amplificaron (5 min. a 95ºC, 50 ciclos de 1 min. a 94ºC, 2 min. a 55ºC, 2 min. a 72ºC, y un ciclo final de 10 min. a 72ºC), se purificaron en gel (QIAquick, Qiagen), y se secuenciaron directamente usando diversos de los oligos enumerados en un secuenciador ABI 377.

Las secuencias de los clones productores de mAb de bloqueo de función eran casi idénticas a lo largo de todas las regiones determinantes de complementariedad (CDR) y las regiones flanqueantes intermedias, lo que sugiere que estos hibridomas están clonalmente relacionados.

Ejemplo 16

Inmunotransferencia y Análisis FACS. Las secuencias de las regiones variables de los anticuerpos no bloqueantes eran marcadamente diferentes de la familia clonalmente relacionada de secuencias encontradas para los anticuerpos bloqueantes. Como parece que los anticuerpos bloqueantes se originan a partir de un único clon, se eligieron dos (AJH10 y AQC2) para caracterizarlos adicionalmente.

Inmunotransferencia. Se diseccionó la capa celular de músculo liso de aorta de oveja, y se extrajeron células K562-\alpha1 con Triton X-100 al 1% en Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 10 mM, 20 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina, ácido etilendiaminatetraacético (EDTA) 10 mM. Las muestras se sometieron a un gradiente del 4-20% de SDS-PAGE, y se electrotransfirieron sobre membranas de nitrocelulosa. Las transferencias se bloquearon con leche en polvo al 5% en TBS; se lavaron en TBS que contenía Tween-20 al 0,03%, y se incubaron con anticuerpos en tampón de bloqueo que contenía NaN_{3} al 0,05% durante 2 horas. Las transferencias después se lavaron como anteriormente, se incubaron con IgG anti-ratón conjugada con peroxidasa de rábano rusticano durante una hora, se lavaron de nuevo y después se trataron con reactivo ECL (Amersham). Las transferencias después se expusieron a una película (Kodak) durante 30 a 60 segundos, y se revelaron.

La inmunotransferencia y el análisis FACS (Fig. 14) demuestran que AJH10 reacciona con integrina \alpha1\beta1 humana, de conejo, y oveja, pero no de rata, o que sugiere que los mAb de bloqueo se unen a un epítopo lineal evolutivamente conservado. Los mAb no bloqueantes no eran eficaces en inmunotransferencia ni reaccionaban con especies diferentes al ser humano.

Ejemplo 17 La unión del dominio \alpha1-I al colágeno es dependiente de catión divalente A. Purificación de los dominios \alpha1-I

Los dominios \alpha1-I se expresaron en E. coli como proteínas de unión a GST (glutatión-S-transferasa) que contenían un sitio de escisión de trombina en la unión de las secuencias. El sobrenadante aclarado de células lisadas en PBS se cargó en una columna de glutatión Sepharose 4B (Pharmacia) que se lavó extensivamente con PBS. La proteína de fusión del dominio \alpha1-I-GST se eluyó con Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, glutatión (reducido) 5 mM. Para estudios de desnaturalización, el dominio I se escindió con trombina en Tris 50 mM, pH 7,5, y se purificó del compañero de fusión GST. Se añadió DTT a 2 mM y la muestra se cargó en una columna de glutatión Sepharose 4B. Se combinaron las fracciones de flujo continuo y lavado y recargaron en una columna Q Sepharose FF (Pharmacia). El dominio \alpha1-I se eluyó con Tris HCl 50 mM, pH 7,5, 2-mercaptoetanol 10 mM, NaCl 75 mM. El dominio I purificado presentaba su masa predicha (Lee et al. (1995) Structure 3, 1333-1340, 871 Da) por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-MS), migraba como una única banda por SDS-PAGE, y la proteína eluía como un único pico de tamaño apropiado por cromatografía por exclusión de tamaño en una columna Superose 6 FPLC (Pharmacia).

B. Análisis Funcional

Se recubrieron placas de 96 pocillos durante una noche a 4ºC con 1 \mug/ml de colágeno IV (Sigma) o colágeno tipo I (Collaborative Biomedical), se lavaron con tampón Triton (Triton X-100 al 0,1%; MnCl_{2} 1 mM; Tris-HCl 25 mM; NaCl 150 mM), y se bloquearon con albúmina sérica bovina (BSA) al 3% en Tris-HCl 25 mM; NaCl 150 mM (TBS). Se incubaron diluciones en serie de la proteína de fusión de dominio \alpha1-I-GST en TBS que contenía MnCl_{2} 1 mM y BSA al 3% en las placas recubiertas a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavaron en tampón Triton. Se detectó el dominio \alpha1-I unido con adiciones en serie de 10 \mug/ml de anticuerpo policlonal biotinilado anti-GST (Pharmacia); ExtrAvidina-peroxidasa de rábano rusticano (Sigma) diluido 1:3000 en TBS que contenía MnCl_{2} 1 mM y BSA al 3%, y ABTS de 1 etapa (sulfonato de 2,2'-azina-di[3-etilbenztiazolina]; Pierce). Las placas se leyeron a O.D. 405 en un lector de microplaca (Molecular Devices).

Resultados

Los dominios \alpha1-I humano y de rata (95% de identidad con el humano) se expresaron en E. coli como proteína de fusión a GST y se purificaron sobre glutatión sepharose. Ambas proteínas se examinaron para la unión a colágeno I y IV usando una variación de un ensayo basado en ELISA descrito previamente (Qu, A., y Leahy, D. J. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 10277-10281). El dominio \alpha1-I humano se une a colágeno IV con mejor eficacia que a colágeno I (Fig. 15A). Un anticuerpo específico contra el dominio \alpha1-I, pero no un anticuerpo específico contra el dominio \alpha2-I (Fig. 15B) anulaba la unión a ambos ligandos (los datos para colágeno I no se muestran). Tanto Mn^{2+} como Mg^{2+} estimulaban la unión, y EDTA reducía la unión hasta niveles de fondo (Fig. 15C). No se detectaron diferencias medibles en la unión al ligando entre los dominio \alpha1-I humano y de rata, lo que sugiere que las diferencias de secuencia entre especies no son funcionalmente relevantes (datos no mostrados). Por tanto, el dominio \alpha1-I, específicamente, requiere cationes para su eficaz unión al ligando.

Ejemplo 18

Un Epítopo Dependiente de Cationes Reside cerca del motivo MIDAS. Se explotó la observación de que AJH10 reconoce las secuencias de dominio \alpha1-I humano, pero no de rata para mapear el epítopo para los mAb de bloqueo de función de \alpha1\beta1. Las secuencias humana y de rata difieren en solamente 12 aminoácidos, 4 de los cuales descansan en un trecho de 6 aminoácidos (aa 91-96, Fig. 11A) adyacente a la treonina crítica (Fig. 11A, aa 98) dentro del motivo MIDAS. Para ensayar la hipótesis de que los 6 restos aminoacídicos, Val-Gln-Arg-Gly-Gly-Arg (restos 91-96 de la Fig. 12), comprenden el epítopo para los mAb bloqueantes, se construyó un dominio I quimérico (R\DeltaH), intercambiando los restos de rata G91, R92, Q93, y L96 por los restos humano correspondientes, V, Q, R, y R, respectivamente. AJH10, junto con todos los mAb de bloqueo de función, reconoce el dominio I quimérico (R\DeltaH; Fig. 11B).

Para orientar estos restos con respecto al dominio MIDAS en la estructura terciaria del dominio \alpha1-I, se modeló el dominio \alpha1-I usando las coordenadas de la estructura cristalina del dominio \alpha2 I.

Se construyó un modelo de homología del dominio \alpha1 I humano usando la estructura cristalina de rayo X del dominio \alpha2 I humano (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546). El modelo se construyó usando el módulo de modelado por homología de Insight II (versión 2.3.5; Biosym Technologies). Se usó el programa CHARMM (Clackson et al. (1991) Nature 352, 624-628) con la serie de parámetros todos hidrógeno 22 con una constante dieléctrica dependiente distante de dos veces la distancia de separación de los átomos. Primero se hicieron 1000 etapas de minimización del descenso más escalonado con restricciones posicionales armónicas de masa ponderada de 1 kcal/(mol \ring{A}^{2}) en todos los átomos del dominio \alpha1-I. Esta minimización estuvo seguida de otras 1000 etapas de descenso más escalonado y 5000 etapas del Adopted-Bases Newton Raphson con restricciones de 0,1 kcal/(mol \ring{A}^{2}) en los átomos C-\alpha del dominio \alpha1-I para evitar desviaciones significativas de la estructura cristalina de rayos X del dominio \alpha2-I.

Las secuencias de integrina \alpha1\beta1 y \alpha2\beta1 muestran un 51% de identidad con ausencia de inserciones o deleciones, los que sugiere que la estructura global de los dos dominios I será similar. Se predice que el sitio de coordinación de metales es igual en el dominio \alpha1-I que en el dominio \alpha2-I, y los restos que comprenden el epítopo para los mAb bloqueantes descansan en un bucle entre la hélice \alpha3 y la hélice \alpha4 que contiene la treonina dentro del motivo MIDAS crítico para la unión de cationes. El modelo del dominio \alpha1-I predice que el nitrógeno de amida de Q92 (Fig. 11A) se une por hidrógeno con el grupo carbonilo de I33, el resto adyacente a S32. Por tanto, el bucle que contiene el epítopo puede desempeñar un papel funcional en la estabilización de la región MIDAS.

Ejemplo 19

El anticuerpo monoclonal AQC2 (es decir, mAQC2; "m" para murino) (Ejemplo 15, supra) es un anticuerpo kappa IgG_{1}. Para identificar las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera de este anticuerpo, se obtuvo el ARN celular total de las células de hibridoma murino AQC2 usando un midi kit QIAGEN RNEASY de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después se clonaron los ADNc que codificaban las regiones variables de las cadenas pesada y ligera por RT-PCR a partir del ARN celular total usando un sistema de preamplificación GIBCO BRL SUPERSCMIPT para la síntesis de la primera cadena de ADNc siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se usaron hexámeros aleatorios para el cebado.

Se amplificó el dominio variable de cadena pesada de mAQC2 por PCR a partir de la primer cadena de ADNc con los cebadores: 5' TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGC CCT TGG CCC C 3' (SEC ID Nº 11) y 5' AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G 3' (S=C/G, M=A/C, R=A/G, y W=A/T) (SEC ID Nº 12). La PCR se sometió a 30 ciclos usando la Taq polimerasa Advantage de Clontech: desnaturalización 30 segundos a 94ºC, hibridación 1 min. a 50ºC, y elongación 1,5 min. a 68ºC. La cadena ligera de mAQC2 con su secuencia señal se amplificó por PCR usando los cebadores: 5' ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA GGT GCA GAT TWT CAG CTT C 3' (W=A/T) (SEC ID Nº 13) y 5' ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA 3' (SEC ID Nº 14). La PCR se sometió a 30 ciclos usando la Pfu polimerasa clonada de Stratagene: desnaturalización 1 min. a 94ºC, hibridación 1 min. a 50ºC, y elongación 2 min. a 72ºC. Los productos de PCR para las cadenas pesada y ligera se purificaron en gel usando un kit de extracción de gel QIAGEN QIAQUICK siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

El producto de cadena pesada purificado se subclonó en el vector pCR2.1-TOPO TA de Invitrogen usando su kit de clonación TOPO TA. La cadena ligera purificada se subclonó en el vector pCRbluntIITOPO de Invitrogen usando su kit de clonación Zero blunt TOPO siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Se secuenciaron insertos de múltiples subclones independientes. Con la excepción de las posiciones degeneradas dentro de los cebadores de PCR, las secuencias de los insertos de los subclones independientes eran idénticas.

Las secuencias polipeptídicas de mAQC2 se dedujeron a partir de sus secuencias codificantes. La secuencia de aminoácidos N-terminal para la cadena ligera madura predicha por la secuencia de ADNc a partir del producto de PCR amplificado con una secuencia señal coincidía exactamente con la secuencia N-terminal de la cadena ligera de mAQC2 purificada obtenida de la degradación de Edman (DVKVVESGG; SEC ID Nº 15). Los análisis BLAST de las secuencias del dominio variable confirmaron su identidad de inmunoglobulina.

\newpage

La secuencia polipeptídica del dominio variable de cadena ligera de mAQC2 se muestra a continuación:

1002

Las CDR se muestran en negrita. Las CDR se definen de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edición, The United States Department of Health and Human Services, The United States Government Printing Office, 1991. Usando el sistema de numeración de Kabat, la SEC ID Nº 1 se representa del siguiente modo, donde un guión indica la ausencia de un aminoácido:

1003

La secuencia polipeptídica del dominio variable de cadena pesada de mAQC2 es:

1004

Las CDR se muestran en negrita. Usando el sistema de numeración de Kabat, la SEC ID Nº 2 se representa del siguiente modo, donde los números de las posiciones son cifras consecutivas salvo que se indique otra cosa:

1005

Como se usa en este documento, los números de las posiciones de los restos de dominios variables sen designan de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat salvo se indique otra cosa.

Ejemplo 20

Este ejemplo describe la generación de un anticuerpo quimérico murino-humano, chAQC2.

Los ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de mAQC2 se usaron para construir vectores de expresión de chAQC2, en los que las regiones variables de mAQC2 estaban unidas a las regiones constantes de IgG_{1} humana y kappa.

La quimera de cadena pesada se construyó del siguiente modo. Se subclonó un fragmento PstI-BstEII de 0,33 kb a partir del plásmido pAND083 de cadena pesada de mAQC2 en el fragmento de vector PstI-BstEII de 2,82 kb fosfatado a partir del plásmido pLCB7 de cadena pesada 5a8, para añadir una secuencia codificante señal de la cadena pesada y un sitio donante de corte y empalme murino para el ADNc de la región variable de cadena pesada de mAQC2. 5a8 es un mAb específico de CD4 molecularmente clonado (véase, por ejemplo, Boon et al., 2002, Toxicology 172:191-203). En la cadena pesada madura codificada por el plásmido resultante (pAND092), el extremo N-terminal difería en cinco restos del extremo N-terminal (DVKVVE; SEC ID Nº 16) de la cadena pesada de mAQC2 afín.

Para corregir el extremo N-terminal de cadena pesada, pAND092 se sometió a mutagénesis de eliminación de sitio único (USE) usando un kit de mutagénesis USE (Amersham Pharmacia Biotech) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. Las sustituciones Q1D, Q3K, L4V, Q5V, Q6E estaban codificadas por el cebador mutagénico 5' GCA CCA GGT GCC CAC TCC GAC GTC AAG GTG GTG GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTG 3' (SEC ID Nº 17). Los clones plasmídicos mutados se identificaron por sus nuevos sitios AatII y HinfI y el sitio PstI eliminado. La secuencia codificante de cadena pesada después se confirmó por secuenciación de ADN. El plásmido correctamente mutado se llamó pAND094. El fragmento NotI-HindIII de 0,43 kb de pAND094 y el fragmento HindIII-NotI de 1,21 kb del plásmido pEAG964 (que contenía una secuencia codificante para una región constante de IgG_{1} humana) se subclonaron en el sitio NotI de pCH269, un plásmido derivado del vector de expresión pCEP4 EBV (Invitrogen). El plásmido resultante se llamó pAND099.

La quimera de cadena ligera se generó del siguiente modo. Se subclonó un fragmento EcoRI de 0,46 kb a partir del plásmido pAND081 del dominio variable de cadena ligera de mAQC2 en el fragmento de vector de 2,7 kb fosfatado del vector de clonación pNN09 derivado de pUC, para añadir un sitio NotI 5'. El plásmido resultante, pAND091, se sometió a mutagénesis usando el kit Amersham USE (supra) para introducir un sitio BglII en el extremo 3' de la secuencia codificante. El cebador mutagénico tenía la secuencia 5' GGA GGC ACC AAG CTG GAG ATC TAA CGG GCT GAT GCT GC 3' (SEC ID Nº 18). El plásmido correctamente mutado se identificó por sus cambios de sitio BglII y BstYI. La secuencia codificante de cadena ligera en el plásmido resultante pAND093 se confirmó por secuenciación de ADN. Después, se subclonaron el fragmento NotI-BglII de 0,44 kb del dominio variable de cadena ligera a partir de pAND093 y el fragmento BclI-NotI de 0,68 kb a partir del plásmido pEAG963 (que contenía una secuencia codificante para un dominio constante de cadena ligera kappa humana) en el sitio NotI de pCH269 (supra), produciendo el plásmido pAND102. Para crear una cadena ligera kappa sin bloquear (Q1E), pAND093 se sometió a mutagénesis USE con el cebador mutagénico 5' CAT AAT GTC CAG GGG AGA AAT TGT TCT CAC CCA G 3' (SEC ID Nº 19), para introducir un sitio XmnI. El plásmido mutado se identificó detectando un cambio en el sitio XmnI. La secuencia de cadena ligera en el plásmido resultante pAND097 se confirmó por secuenciación de ADN. Se subclonaron el fragmento NotI-BglII de 0,44 kb de dominio variable de cadena ligera a partir de pAND097 y el fragmento BclI-NotI de 0,68 kb a partir del plásmido pEAG963 (que contenía un dominio constante de cadena ligera kappa humana) en el sitio NotI de pCH269, produciendo el plásmido pAND098.

Para generar anticuerpos chAQC2, se introdujeron por co-transfección los vectores de expresión (vector pAND099 de cadena pesada de chAQC2 + vector pAND102 de cadena ligera de chAQC2, y vector pAND099 de cadena pesada de chAQC2 + vector pAND098 de cadena ligera no bloqueada de chAQC2) en células 293-EBNA. Los transfectantes se ensayaron para la secreción y especificidad de anticuerpo. Los controles eran células transfectadas con los vectores correspondientes sin un inserto o con construcciones de ADN que codifican ch5c8 (un mAb específico de CD154 molecularmente clonado descrito en, por ejemplo, Elster et al., 2001, Transplantation 72:1473-1478) o chCBE11 (un mAb específico de LT\betaR molecularmente clonado descrito en, por ejemplo, Browning et al., 1996, J. Biol. Chem. 271:24934-24938).

Después se lisaron los transfectantes con la secreción de anticuerpo deseado, y se realizó la inmunoprecipitacón con proteína A sobre los lisados y medio condicionado. El análisis de transferencia de Western de los precipitados realizado con anticuerpos anti-cadena pesada y ligera humanas indicó que las células transfectadas con chAQC2 sintetizaban y secretaban de forma eficaz las cadenas pesada y ligera a niveles similares a las células transfectadas con ch5c8 y transfectadas con chCBE11. Además, se tiñeron células K562\alpha1 que expresaban huVLA-1 con el medio condicionado de las células transfectadas, y se realizó análisis FACS sobre las células teñidas. Los resultados indicaron que el anticuerpo chAQC2 producía patrones de tinción similares a los de mAQC2, mientras que los medios condicionados de células con transfección simulada y transfectadas con ch5c8 no lograban teñir las células K562\alpha1. Se purificó AQC2 quimérico producido a partir de una transfección transitoria aumentada en escala y demostró que se unía a VLA-1 por titulación FACS. AQC2 quimérico con una cadena ligera de tipo silvestre o una genéticamente no bloqueada se unía a VLA-1. Véanse también las Fig. 16A-D (analizadas a continuación).

Ejemplo 21

Este ejemplo describe un método para humanizar el anticuerpo monoclonal mAQC2.

Análisis de los dominios variables de mAQC2. Los dominios variables en las cadenas ligera y pesada de mAQC2 se compararon con las secuencias consenso para subgrupos de ratón y ser humano (Kabat et al, supra) usando el programa de software FASTA. Se descubrió que el dominio variable de cadena ligera era un miembro del subgrupo VI de ratón con un 89% de identidad en un solapamiento de 109 aminoácidos. Este dominio también correspondía al subgrupo I de ser humano con un 72% de identidad en un solapamiento de 113 aminoácidos. Se descubrió que el dominio variable de cadena pesada era un miembro del subgrupo IIId de ratón con un 86% de identidad en un solapamiento de 129 aminoácidos. Este dominio variable de cadena pesada también correspondía al subgrupo III de ser humano con un 79% de identidad en un solapamiento de 130 aminoácidos.

Las CDR se categorizaron en clases canónicas de acuerdo con Chotia et al., Nature 342, pág. 877-883 (1989). Los restos clave que definen cada clase canónica determinen en gran medida la conformación estructural del bucle de CDR, y por tanto deben retenerse en el anticuerpo reconformado. El bucle L1 de mAQC2 está en la clase canónica 1 (bucle de 10 restos), L2 en la clase 1 (bucle de 7 restos) y L3 en la clase 1 (bucle de 9 restos). El bucle H1 está en la clase 1 (bucle de 5 restos) y el bucle H2 en la clase 1 (bucle de 16 restos). El bucle H3 no parecía pertenecer a ninguna clase canónica. Los restos canónicos importantes para estas clases estaban todos incluidos en los anticuerpos humanizados.

Se determinaron restos flanqueantes inusuales en mAQC2 analizando todas las secuencias de cadena variable de ratón y humanas en la versión de septiembre de 1999 de la base de datos de Kabat. Se creía que las diferencias específicas de mAQC2 podrían indicar mutaciones somáticas que potencian la afinidad de unión si estas diferencias estaban cerca del sitio de unión. Se retiraron los restos de mAQC2 inusuales más lejanas del sitio de unión y los restos flanqueantes humanos inusuales en caso de que no crearan epítopos inmunogénicos en el anticuerpo humanizado. Los restos flanqueantes inusuales encontrados en mAQC2 eran 7 (F), 10(L), y 41(K) en la cadena ligera; y 4(V), 21 (A), y 40(I) en la cadena pesada. Ninguno de estos restos flanqueantes de ratón inusuales estaba retenido en los anticuerpos humanizados.

Modelado de la estructura de las regiones variables. Las cadenas ligera y pesada de mAQC2 se alinearon frente a una base de datos no redundante para determinar qué tramos estructurales usar para construir modelos tridimensionales de las cadenas ligera y pesada de mAQC2. Usando FASTA, se descubrió que la cadena ligera tenía un 82% de identidad de secuencia con el anticuerpo murino monoclonal ab57 (1CLOL), mientras que se descubrió que la cadena pesada tenía un 76% de identidad de secuencia con el fragmento Fab de 6d9 murino (1HYY). Usando el paquete de software de modelado molecular SYBYL (Tripos Inc.), se construyeron las estructuras tridimensionales aproximadas de las cadenas ligera y pesada de mAQC2 usando la cadena ligera de ab57 y la cadena pesada de 6d9, respectivamente. La integridad estructural de los modelos se evaluó en la consola y se descubrió que era razonable.

Diseño de regiones variables reconformadas. Se usaron dos enfoques para elegir las regiones flanqueantes aceptoras humanas para "aceptar" las CDR de mAQC2. El primer enfoque fue por coincidencia de homología y el otro usando secuencias consenso de Ig humana. En el enfoque de homología, se exploraron la base de datos de Kabat, la base de datos no redundante de NCBI, ENTREZ (The National Institutes of Health), y la base de datos Incyte usando los programas de software FASTA y BLAST. La elección de las regiones flanqueantes aceptoras humanas se hizo en base a la identidad de secuencia entre as regiones flanqueantes de mAQC2 y las regiones flanqueantes humanas (excluyendo las regiones flanqueantes de anticuerpos previamente humanizados) y la fuente del anticuerpo.

Finalmente se eligieron las regiones flanqueantes de un gen de región variable de inmunoglobulina que tiene un número de acceso a GENBANK de gi: 587330 (subgrupo I de kappa humana Vk-1c147) para la cadena ligera del anticuerpo humanizado (Welschof et al., J. Immunol. Meth. 179:203-14 (1995)). Se eligieron las regiones flanqueantes de Amulc11 (Kabat ID 044469; subgrupo III humano) para la cadena pesada del anticuerpo humanizado (Huang et al., J. Immunol. 151:5290-300 (1993)).

Mutaciones inversas de las regiones flanqueantes humanas. Las estrategias para determinar qué mutaciones
inversas hacer están disponibles en los sitios web Humanization bY Design en los urls reflejados: http://
mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan y http://www.cryst.bbk.ac.uk/\simubcg07s. Los experimentos previos han demostrado que es importante retener ciertos restos canónicos, restos de empaquetado de superficie de contacto y restos murinos inusual que están cerca del sitio de unión. Además, deben considerarse los restos en la "Zona Vernier", que forma una plataforma sobre la que descansan las CDR (Foote et al., J. Mol. Biol. 224, p. 487 (1992)) y aquellos cerca del CDR H3.

Se diseñaron cuatro versiones reconformadas para cada una de las cadenas ligera y pesada variables, como se muestra en la Tabla 1. Dos de las cuatro versiones para cada cadena se diseñaron por coincidencia de homología (denominadas huAQC2-h1 y -h2) y las otras dos versiones por coincidencia consenso (huAQC2-c1 y -c2). Debe apreciarse que las secuencias para la cadena pesada huAQC-h1 y la cadena pesada huAQC-c1 son idénticas.

TABLA 1 Secuencias de mAQC2, huAQC2, y regiones flanqueantes humanas

1006

1007

Algunas de las mutaciones inversas se analizan a continuación.

\global\parskip0.900000\baselineskip

(1) cadena ligera:

1 D->Q

Esta mutación se hizo en todas las versiones ya que experimentos previos de reconformación (por ejemplo, Kolbinger et al., Protein Eng. 6, p. 971 (1993)) sugirieron su importancia para la unión a antígeno.

4 M->L

Éste es un resto de vernier y se retuvo en todas las versiones.

46 L->P

Este resto es un resto tanto de superficie de contacto como vernier y se retuvo solamente en h1 y c1.

47 L->W

Éste es un resto vernier y se retuvo solamente en h1 y c1.

71 F->Y

Este resto está en una posición canónica importante y se retuvo en todas las versiones.

(2) cadena pesada:

1 E->D

Esta mutación inversa se hizo en h1 (es decir, c1) solamente.

12 I->V

El resto I es inusual en ser humano y se retuvo en h2 solamente.

28 T->S

Éste es un resto vernier y se retuvo en h1 solamente.

29 V->F

Éste es un resto canónico y se retuvo en todas las versiones.

49 S->A

Éste es un resto vernier y se retuvo en todas las versiones.

93 A->T

Éste es un resto vernier y de superficie de contacto y se retuvo en todas las versiones.

94 S->R

Éste es un resto canónico y se retuvo en ambas versiones.

\global\parskip0.800000\baselineskip

Las regiones variables de huAQC2 se crearon por mutagénesis USE como se ha descrito anteriormente, usando los plásmidos del dominio variable de chAQC2 como moldes de partida. Las secuencias de ADNc de las regiones flanqueantes ("FR") aceptoras humanas fueron Kabat nº Z37334 para la cadena ligera y Kabat nº U00490 para la cadena pesada. Para facilitar la identificación de plásmidos mutados, se introdujeron butacones silenciosas para cambiar los sitios de restricción. Los plásmidos mutados se identificaron por los cambios en los sitios de restricción. Las secuencias de ADNc de la región variable en los plásmidos resultantes se confirmaron por secuenciación de ADN.

Las versiones h1 y c1 de cadena pesada (que son idénticas) se crearon by usando el plásmido pAND094 como molde. Los cebadores mutagénicos fueron: cebador FR1 5'GGT GCC CAC TCC GAC GTC CAG CTG GTC GAG TCA GGG GGA GGC TTA GTC CAG CCT GGA GGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC 3' (SEC ID Nº 20), que introducía los sitios TaqI y PvuII, y eliminaba un sitio DdeI; cebador FR2 5' ATG TCT TGG GTT CGC CAG GCT CCG GGG AAG GGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC 3' (SEC ID Nº 21), que introducía un sitio NciI, y eliminaba los sitios BspEI y EarI; cebador FR3 5' TTC ACC ATC TCC AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACC CTG TAC CTG CAG ATG AAC AGT CTG AGG GCC GAG GAC ACA GCC GTG TAT TAC TGT ACA AGA 3' (SEC ID Nº 22), que introducía los sitios PstI y DdeI; y cebador FR4 5' TGG GGC CAA GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GGT GAG 3' (SEC ID Nº 23), que introducía los sitios KpnI y Eco0109I. El plásmido de cadena pesada h1 resultante (es decir, c1) se denominó pAND104.

La versión c2 de cadena pesada se creó usando pAND104 como molde con los siguientes cebadores mutagénicos: cebador FR1 5' TCC TGT GCA GCC TCT GGA TTC ACC TTC AGT AGG TAT ACT ATG TCT TGG GTT 3' (SEC ID Nº 24), que introducía un sitio AccI; y cebador FR1 5' GCA CCA GGT GCG CAC TCC GAG GTC CAG CTG GTC GAG TCA 3' (SEC ID Nº 25), que introducía un sitio FspI y eliminaba un sitio AatII. El plásmido de cadena pesada c2 resultante se denominó pAND115.

La versión h2 de cadena pesada se creó usando pAND115 como molde con el siguiente cebador: cebador FR1 5' GAG TCA GGG GGA GGC TTA ATC CAG CCT GGA GGG TCC CTG 3' (SEC ID Nº 26), que eliminaba un sitio DdeI. El plásmido de cadena pesada h2 resultante se denominó pAND113.

Para generar vectores de expresión para las cadenas pesadas de huAQC2, se subclonó el fragmento NotI-HindIII de 0,43 kb de dominio variable de cadena pesada a partir de pAND104, pAND115, o pAND113, y el fragmento HindIII-NotI de 1,21 kb a partir de pEAG964 (supra) en el sitio NotI de pCH269 (supra). Los plásmidos de expresión de cadena pesada resultantes se denominaron pAND114 (h1), pAND121 (c2), y pAND124 (h2), respectivamente.

La versión h1 de cadena ligera se creó usando el plásmido pAND093 como molde. Los cebadores mutagénicos fueron: cebador FR1 5' CAA ATT GTT CTC ACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGG GAC AGA GTC ACC ATC ACA TGC AGT GCC AGC TCA 3' (SEC ID Nº 27), que eliminaba los sitios BstEII y PstI; cebador FR2 5' TTC TGG TAT CAG CAG AAG CCC GGG AAA GCC CCC AAA CCC TGG ATT 3' (SEC ID Nº 28), que introducía un sitio NciI; cebador FR3 5' GCT TCT GGA GTC CCT TCA CGC TTC AGT GGC AGT GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACA ATC AGC AGC CTG CAA CCT GAA GAT TTT GCC ACT TAT TAC TGC CAG 3' (SEC ID Nº 29), que introducía un sitio DdeI y eliminaba los sitios Eco0109I y AvaII; y cebador FR4 5' GGT GGA GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEC ID Nº 30), que introducía los sitios DdeI y StyI. El plásmido de cadena ligera h1 resultante se denominó pAND103.

La versión h2 de cadena ligera se creó usando pAND103 como molde con el siguiente cebador: cebador FR2 5' CCC GGG AAA GCG CCC AAA CTC CTG ATT TAT CTC ACA TCC 3' (SEC ID Nº 31), que introducía los sitios HhaI y HaeII. El plásmido de cadena ligera h2 resultante se denominó pAND116.

La versión c1 de cadena ligera usó el plásmido pAND103 como molde con los siguientes cebadores: cebador FR1 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEC ID Nº 32), que introducía los sitios SmaI, NciI, y HpaII; cebador FR4 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEC ID Nº 33), que introducía un sitio Bsp1286I. El plásmido de cadena ligera c1 resultante se denominó pAND118.

La versión c2 de cadena ligera se creó usando el plásmido pAND116 como molde con los siguientes cebadores: cebador FR1 5' GCC TCA GTC ATA ATG TCC CGG GGA CAA ATT CAG CTC ACC CAG TCT CCA TCC 3' (SEC ID Nº 34), que introducía los sitios SmaI, NciI, y HpaII; cebador FR4 5' GGT AAC CCG TGG ACG TTC GGT CAG GGC ACT AAG GTG GAG ATC TAA CGG GCT 3' (SEC ID Nº 35), que introducía un sitio Bsp1286I. El plásmido de cadena ligera c2 resultante se denominó pAND119.

Para generar vectores de expresión para las cadenas ligeras de huAQC2, se subclonaron el fragmento NotI-BglII de 0,44 kb de dominio variable de cadena ligera a partir de pAND103, pAND116, pAND118, o pAND119, y el fragmento BclI-NotI de 0,68 kb a partir de pEAG963 (supra) en el sitio NotI de pCH269 (supra). Los vectores de expresión de cadena ligera se denominaron pAND117 (h1), pAND120 (h2), pAND122 (c1), y pAND123 (c2), respectivamente.

Los vectores de expresión se introdujeron por co-transfección en células 293-EBNA, y las células transfectadas se ensayaron para la secreción y especificidad de anticuerpo. Las células transfectadas con un vector vacío sirvieron como control negativo. Los lisados de células completas y el medio condicionado se inmunoprecipitaron con proteína A. El análisis de transferencia de Western de los precipitados (revelado con anticuerpos anti-cadena pesada y ligera humanas) indicó que las células transfectadas con huAQC2 sintetizaban y secretaban de forma eficaz las cadenas pesada y ligera a niveles similares a las células transfectadas con chAQC2.

Después se realizó el análisis FACS de células K562\alpha1 que expresaban VLA-1 teñidas con medio condicionado de las células transfectadas. Para hacer esto, las células K562\alpha1 se incubaron con el medio condicionado en hielo durante 120 min. Las células después se lavaron tres veces con un tampón FACS (PBS con FBS al 5% y azida sódica al 0,05%). Las células lavadas se resuspendieron en el tampón y se incubaron con anticuerpo anti-IgG humana (H + l) conjugado con PE (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) en hielo durante 30 min. en hielo. Después de la incubación, las células se lavaron tres veces con el tampón FACS, y se resuspendieron en el tampón FACS para el análisis. Los datos se muestran en la Tabla 2, en la que HuAQC2-h1 se refiere a un mAb que consta de la versión h1 de la cadena pesada de huAQC2 (HC) y la versión h1 de la cadena ligera de huAQC2 (LC) (véase la Tabla 1). Asimismo, huAQC-h2 es un mAb que consta de las versiones h2 de las cadenas pesada y ligera, las versiones c1 de huAQC2-c1, y las versiones c2 de huAQC2-c2. En la tabla, el MFI relativo se refiere al MFI medio normalizado al observado para chAQC2 bloqueado. Los datos mostrados representan el promedio de dos transfecciones independientes. Estos datos indicaron que los mAb huAQC2-h2 y -c2 se unían peor que huAQC2-h1 y -c1 con relación a chAQC2.

TABLA 2 Tinción FACS de células K562\alpha1 por chAQC2 y huAQC2

1008

Las co-transfecciones de células 293-EBNA con chAQC2 y huAQC2-h1, - h2, -c1 y -c2 se aumentaron en escala. Se purificaron los anticuerpos en los medios condicionados con Proteína A-Sepharose. Los mAb purificados se ensayaron por FACS para su actividad. El protocolo fue el siguiente.

1. Contar las células de matraz que se dividió 1:4 en el día previo al ensayo.

2. Sedimentar las células y resuspenderlas a 2,5e5 células/ml en tampón FACS (FBS al 5% en PBS con Nacida al 0,02%).

3. Pipetear 100 \mul de células en los pocillos de una placa de fondo en V de 96 pocillos.

4. Preparar diluciones en serie 1:3 de AQC2 partiendo a 3 \mug/ml en tampón FACS.

5. Sedimentar las células durante 5 minutos a 800 X g y golpear la placa para retirar el tampón.

6. Resuspender las células en 100 \mul de las series de anticuerpos diluidos.

7. Incubar durante 2 horas en hielo.

8. Lavar la placa. Sedimentar las células durante 3 minutos a 800 x g y golpear la placa para retirar el tampón.

9. Resuspender las células en 100 \mul de anticuerpo secundario (diluido 1:100 en tampón FACS).

10. Incubar durante 30 minutos en hielo.

11. Lavar la placa (véase anteriormente).

12. Resuspender las células en 25 \mul de tampón FACS.

13. Centrifugar los tubos FACS brevemente para asegurar que los 50 \mul están en la parte inferior de los tubos.

14. Agitar con vórtice cada tubo vigorosamente y recoger 5000 acontecimientos.

Los datos se muestran en la Fig. 17. Estos datos confirmaron que huAQC2-h2 y -c2 se unía peor que huAQC2-h1 y -c1 con relación a chAQC2.

Se estudiaron adicionalmente las versiones consenso de huAQC2 porque serían menos inmunogénicas cuando se usaran para tratar pacientes con indicaciones crónicas. Se realizaron co-transfecciones de mezcla-y-coincidencia para identificar si una única cadena era responsable de la disminución aparente en la unión observada con huAQC2-c2. Las co-transfecciones sugirieron que la reducción podía atribuirse a la cadena ligera c2 (codificada por pAND123), que difería de la cadena ligera c1 (codificada por pAND122) en solamente dos restos en la región FR2: P46L y W47L.

Para examinar las contribuciones individuales de cada uno de estos dos cambios, se construyeron nuevos vectores de expresión de cadena ligera c2. El plásmido pAND125, la variante L47W de la cadena ligera c2 se creó usando pAND119 como molde con el siguiente cebador mutagénico: cebador FR2 5' GGG AAA GCA CCC AAA CTC TGG ATC TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEC ID Nº 36), que introducía los sitios HhaI y HaeII. El plásmido pAND126, la variante L46P de la cadena ligera c2, se creó usando pAND119 como molde con el siguiente cebador mutagénico: cebador FR2 5' AAG CCC GGG AAG GCG CCC AAA CCC CTG ATT TAT CTC ACA TCC AAC 3' (SEC ID Nº 37), que introducía sitios BsaHI, BanI, y NarI. Los vectores de expresión para estas nuevas cadenas ligeras de huAQC2 se crearon subclonando el fragmento NotI-BglII de 0,44 kb del dominio variable de cadena ligera a partir de pAND125 o pAND126, y el fragmento BclI-NotI de 0,68 kb a partir de pEAG963 (supra) en el sitio NotI de pCH269 (supra). Los plásmidos resultantes se denominaron pAND132 (c2 con L47W; SEC ID Nº 47), y pAND133 (c2 con L46P; SEC ID Nº 70), respectivamente.

Se realizaron co-transfecciones de los nuevos plásmidos de cadena ligera con cada uno de los plásmidos de cadena pesada de huAQC2. Se examinó la unión a VLA-1 por FACS. Los datos demuestran que la mutación inversa L47W no lograba mejorar la unión. La mutación L46P mejoraba el pico de la curva de unión, pero la EC50 aún estaba desplazada hacia la derecha con relación al comportamiento de la versión 1 de huAQC2 (Tabla 2, supra). Estos resultados sugerían que ambas mutaciones inversas eran necesarias para la completa actividad de unión.

También se creó una cadena ligera c1 genéticamente no bloqueada, ya que la variante Q1D sería un resto más "humanizada". El mutante Q1D, denominado pAND148, se creó con el molde pAND118 con el siguiente cebador mutagénico: cebador FR1 5' GTC ATA ATG TCC CGG GGA GAT ATC CAG CTC ACC CAG TCT 3' (SEC ID Nº 38), que introducía un nuevo sitio EcoRI y eliminaba un sitio ApoI. Se creó un vector de expresión para esta última variante de la cadena ligera de huAQC2 subclonando el fragmento NotI-BglII de 0,44 kb del dominio variable de cadena ligera a partir de pAND148 y el fragmento BclI-NotI de 0,68 kb a partir de pEAG963 en el sitio NotI de pCH269, produciendo el vector de expresión de cadena ligera pAND150 (c1 con Q1D N-terminal no bloqueado). La co-expresión de la cadena ligera genéticamente no bloqueada con la cadena pesada c2 (es decir, "huAQC2 LC c1 no bloqueado/HC c2"; denominado huAQC2-c4) era equivalente a la de "huAQC2 LC c1/HC c2" (denominada huAQC2-c3). La unión a VLA-1 se confirmó por FACS en células K562\alpha1 que expresan VLA1 (Tabla 2).

Co-transfecciones de células 293-EBNA con chAQC2 y huAQC2-h1, -h2, -c1, -c2, -c3, y -c4. Se purificaron los anticuerpos en los medios condicionados en Proteína A-Sepharose. Los mAb purificados se ensayaron para su actividad (Fig. 17 y 18). Se eligió huAQC2-c3 como fármaco candidato, ya que sus propiedades eran más similares a chAQC2. Después se diseñaron los vectores para la expresión estable de huAQC2-c3 en células CHO. Lo vectores contenían un ADNc para huAQC2 c1 LC o c2 HC, con las UTR 5' y 3' eliminadas y la lisina C-terminal de cadena pesada genéticamente delecionada para asegurar la homogeneidad del producto. Los vectores finales fueron pAND162 (cadena ligera), pAND160 (cadena pesada). Como se usa en este documento, huAQC2-c3 también se llama hAQC2.

Las secuencias polipeptídicas completas de hAQC2 son las siguientes.

Cadena Ligera (Plásmido: pAND162)

1009

Cadena Pesada (Plásmido: pAND160)

1010

1011

A continuación se muestran otras secuencias polipeptídicas y de nucleótidos de cadena pesada y ligera.

\global\parskip1.000000\baselineskip

A. cadena pesada de chAQC2 (pAND099) (SEC ID Nº 39 y 40. El primer Nº se refiere a la secuencia de nucleótidos y el último a la secuencia polipeptídica. Se usa el mismo orden en la siguiente numeración).

1012

1013

1014

1015

1016

1017

1018

1019

1020

1021

1022

1023

\hskip1,3cm1024

\newpage

Ejemplo 22

Este ejemplo describe la caracterización de diversos anticuerpos AQC2 de la invención.

Ensayo en fase sólida para la unión al dominio \alpha1 I. Se añadieron cincuenta \mul de proteína de fusión de dominio \alpha1 I-GST a 10 mg/ml a una placa de poliestireno de 96 pocillos CORNING COSTAR EASY WASH (Gotwals et al., Biochemistry, 38, 8280-8 (1999)). Después de incubación a 4ºC durante 16 h, la placa se lavó cuatro veces con 350 \mul de Tween-20 al 0,1% en PBS en un lavador de placa. La placa se bloqueó por la adición de 180 \mul de BSA al 3% en TBS a 25ºC durante 60 min., y después se lavó como anteriormente. Se prepararon diluciones de los anticuerpos (50 \mul/pocillo) en TBS que contenía 1 mg/ml de BSA (tampón de ensayo) en una placa de fondo redondo de 96 pocillos, se transfirieron a la placa recubierta con el dominio \alpha1 I, y se incubaron durante 60 min. a 25ºC. Después de un lavado final, se añadieron 100 \mul/pocillo de reactivo TMB (Pierce). Después de 10 min., se añadieron 100 \mul de ácido sulfúrico 1 M, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un espectrómetro de 96 pocillos UV-Vis.

Ensayos de electroquimioluminescencia para la unión de integrina \alpha1\beta1 o el dominio \alpha1 I a colágeno. Se recubrieron DYNABEADS M-280 tosil-activadas (Dynal, Inc.) con 100 \mug/ml de colágeno tipo IV (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los lisados celulares de células K562 transfectadas con \alpha1 se prepararon del siguiente modo. Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron a 10^{8} células/ml en un tampón de lisis que contenía Tris 25 mM, pH 7,4, NP-40 al 1%, CaCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 1 mM, BSA al 2%, y PMSF1 mM, y se incubaron a 4ºC durante 60 min. Se retiraron los desechos celulares por centrifugación a 12.000 rpm durante 30 min. y se usó el sobrenadante resultante en los posteriores experimentos. Se marcaron el anticuerpo de activación anti-\beta1 TS2/16 y el anticuerpo policlonal anti-GST (Pharmacia) con TAG-NHS éster (IGEN International, Inc., Gaithersburg, MD) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos marcados se purificaron por cromatografía de filtración en gel en SEPHADEX G25M (Pharmacia).

Para realizar el ensayo de unión, se bloquearon perlas recubiertas con colágeno (1 mg/ml) durante 5 min. con plasma de rata Lewis al 8% en un tampón de ensayo que contenía HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, y Triton X-100 al 0,1%. Para el ensayo de unión a \alpha1\beta1, se incubaron diluciones en serie de los anticuerpos con 10 \mug de perlas, lisado celular preparado a partir de 10^{5} células K562 transfectadas con \alpha1 (supra), y 0,1 \mug/ml de TAG-TS2/16 en un tampón de ensayo que contenía MnCl_{2} 1 mM. Para el ensayo de unión al dominio \alpha1 I, los anticuerpos se incubaron con 10 \mug de perlas, 0,1 \mug/ml de la proteína de fusión de dominio \alpha1 I y GST, y 1 \mug/ml de TAG-anti-GST en un tampón de ensayo que contenía MnCl_{2} 1 mM. Después de una a dos horas de agitación a temperatura ambiente, se añadieron 200 \mul del tampón de ensayo y las muestras se leyeron en un detector de electroquimioluminescencia ORIGEN 1.5 (IGEN). Los diagramas de presentan con unidades de electroquimioluminescencia arbitrarias (ECL) en el eje de ordenadas.

Ensayo de competición de mAQC2 biotinilado. Se recubrió una placa de 96 pocillos con 50 \mul de proteína de fusión de dominio \alpha1 I y GST a 5 \mug/ml y se bloqueó con BSA al 3% en TBS como se ha descrito anteriormente. Se prepararon diluciones de los anticuerpos (60 \mul/pocillo) en el tampón de ensayo en una placa de fondo redondo de 96 pocillos, y se añadieron 60 \mul de AQC2 murino biotinilado a 0,1 \mug/ml en el tampón de ensayo. Se transfirieron cincuenta microlitros de cada pocillo a la placa recubierta y se incubaron durante 3 h a 25ºC. La placa después se lavó como anteriormente, se añadieron 50 \mul de EXTRAVIDINA conjugada con peroxidada (Sigma) a 1 \mug/ml, y la placa se incubó otras 2 h a 25ºC. Después de un avado final, se añadieron 100 \mul/pocillo de reactivo TMB (Pierce). Después de 10 min., se añadieron 100 \mul de ácido sulfúrico 1 M, y se leyó la absorbancia a 450 nm en un espectrómetro de 96 de pocillos UV-Vis.

Resultados experimentales. Los resultados experimentales se muestran en las Fig. 16A-D y la Tabla 3. Se determinó la capacidad de mAQC2, chAQC2, hAQC2, y hAQC2' (es decir, huAQC2-c4; que difiere de hAQC2 solamente en que el resto 1 de la cadena ligera de hAQC2' era D en lugar de Q) para (1) unirse a células K562 transfectadas con \alpha1 human (por FACS); (2) unirse al dominio \alpha1-I inmovilizado (por ELISA); (3) competir con mAQC2 por la unión al dominio \alpha1-I (ELISA); (4) bloquear la unión del dominio \alpha1-I a colágeno (ensayo de electroquimioluminescencia); o (5) bloquear a unión de integrina \alpha1\beta1 a colágeno (ensayo de electroquimioluminescencia). Los resultados se muestran en las Fig. 16A-D, y los valores de IC50 (para inhibición) o EC50 (para unión) calculados se dan en la Tabla 3. En cada ensayo, cada una de las formas de AQC2 humanizado mostraron una capacidad similar para unirse a VLA1 (o el dominio \alpha1) o bloquear la unión a colágeno (obsérvese que en el panel C, la diferencia observada en la intensidad entre mAQC2 y las formas humanizadas deriva del uso de un anticuerpo secundario anti-IgG murina, en lugar de un anticuerpo anti-IgG humana).

TABLA 3 Resumen de los resultados de ensayo (todos los valores en nM)

1025

A continuación se ensayó si cambios en ciertos restos conservativos en las CDR podrían evitar la actividad de unión a VLA-1 de hAQC2. Se produjeron construcciones de ADN que codificaban variantes de hAQC2 con las siguientes mutaciones por mutagénesis dirigida al sitio: (1) G55S en la CDR2 de cadena pesada; (2) S24N en la CDR1 de cadena ligera (que introduce un sitio de glucosilación N-unido ocupado); (3) G92S en la CDR3 de cadena ligera; (4) una combinación de (1) y (2); y (5) una combinación de (1) y (3). Las construcciones de ADN que codificaban tanto la cadena pesada como la ligera después se introdujeron por co-transfección en células 293-EBNA, y se ensayo el medio condicionado de los transfectantes para la expresión del anticuerpo por transferencia de Western y ELISA. Los resultados indicaron que las variantes de hAQC2 se expresaban de forma tan eficaz como el hAQC2 afín. El análisis FACS usando células K562 que expresan VLA-1 mostró adicionalmente que las actividades de unión a VLA-1 de estas variantes eran similares al propio hAQC2. En resumen, las sustituciones de aminoácidos no alteraban la actividad de unión a VLA-1 de hAQC2. De hecho, la estructura cristalina por rayos V del complejo R\DeltaH/Fab de hAQC2 (infra) muestra que S24 y G92 de la cadena ligera y G55 de la cadena pesada no están en el bolsillo de unión que está en contacto con el dominio \alpha1-I.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 23

Las funciones efectoras de una inmunoglobulina asocian la actividad de unión a antígeno de la inmunoglobulina con las ramas inflamatoria, citotóxica y estimuladora del sistema inmune. Las funciones efectoras pueden alterar la seguridad y eficacia de un producto terapéutico de inmunoglobulina. Para reducir las funciones efectoras potenciales de hAQC2, se hicieron las mutaciones de L234A y L235A en su cadena pesada para generar hsAQC2. Por la misma razón, se hizo una única mutación de N297Q en la cadena pesada de hAQC2 para generar una forma aglucosilada de hAQC2, llamada haAQC2. Pueden hacerse estudios para comparar su eficacia, función efectora residual, estabilidad e inmunogenicidad con el hAQC2 afín. Salvo que se indique otra cosa, los números de las posiciones de los restos en las regiones constantes usados en este documento se denominan de acuerdo con la convención de numeración EU.

\newpage

La secuencia polipeptídica de cadena pesada de haAQC2 es del siguiente modo (Plásmido: pAND161):

1026

\newpage

La secuencia polipeptídica de cadena pesada de hsAQC2 es del siguiente modo (Plásmido: pAND171):

1028

Ejemplo 24

Este ejemplo describe un método para determinar la estructura cristalina del complejo de un dominio \alpha1-I quimérico de rata/humano de la integrina \alpha1\beta1 y el fragmento Fab de hAQC2.

Preparación del complejo proteico

El fragmento Fab de hAQC2 se preparó a partir del anticuerpo hAQC2 usando una variación del procedimiento del kit de preparación de Fab IMMUNOPURE® (nº Cat 44885, Pierce, Rockford, IL). El anticuerpo hAQC2 intacto se concentró a 12 mg/ml en un tampón que contenía fosfato 20 mM, EDTA 10 mM y cisteína 25 mM (pH 7,0). Se añadió papaína inmovilizada a una proporción de enzima a sustrato de 1:50, y se permitió que sucediera la digestión durante una noche a 37ºC. Se retiró la papaína inmovilizada y el producto de digestión en bruto se dializó frente a tampón acetato sódico 20 mM (pH 4,5). El fragmento Fab se separó del anticuerpo intacto residual, el fragmento Fab dimérico, y el fragmento Fc por cromatografía de intercambio catiónico usando una columna S (Poros HS/M, PERSEPTIVE Biosytems nº PO42M26) con un gradiente salino superficial. El fragmento Fab después se intercambió en tampón Hepes 0,1 M (pH 8,0).

El dominio \alpha1-I quimérico usado en la presente invención es una construcción de dominio I quimérico de rata/humano (mutante R\DeltaM) que contenía los restos Thr145-Phe336 de la cadena de integrina \alpha1 de rata, donde los restos Gly217, Arg218, Gln219 y Leu222 (numeración cristalina) se han sustituido con restos humanos equivalentes Val, Gln, Arg y Arg, respectivamente, para restaurar la unión al anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos de los dominios \alpha1-I R\DeltaH quimérico, de rata, y humano se dan a continuación en las SEC ID Nº 59, 60 y 61, respectivamente. Se expresó el dominio \alpha1-I recombinante en E. coli como una proteína de fusión a GST. El dominio \alpha1-I R\DeltaH se escindió con trombina y se purificó de un clon de Pichia pastoris como se ha descrito previamente (Gotwals et al., 1999, Biochemistry 38:8280-8288).

1029

1030

1031

El fragmento Fab de hAQC2 se mezcló con un exceso de dominio \alpha1-I quimérico y se incubó a 37ºC durante 15 minutos. Los complejos \alpha1/Fab saturados se separaron del dominio \alpha1-I no complejado por cromatografía de exclusión de tamaño usando una columna S200 Sephacryl (Pharmacia, Gibco). El complejo se concentró adicionalmente a 11 mg/ml en Tris 20 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM, MnCl_{2} 1 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM.

Preparación de cristales

Las condiciones de cristalización se encontraron usando los kits CRYSTAL SCREEN^{TM} de Hampton Research (Laguna Niguel, CA). Los cristales del complejo descrito anteriormente se desarrollaron a 20ºC por difusión por vapor usando una cantidad igual de solución de complejo proteico y una solución de reserva de PEG 1500 al 20-30%. Típicamente, se añadieron 2 \mul de complejo proteico a 2 \mul de solución de pocillo para producir gotas de 4 \mul. Los cristales se desarrollaron en dos a siete días en forma de varas hexagonales con dimensiones de 0,8 x 0,05 x 0,05 mm^{3}. La presencia del dominio \alpha1-I y el fragmento Fab de hAQC2 se confirmó por análisis de SDS-PAGE de los cristales disueltos. Para reducir el daño por la radiación inherente durante la recogida de datos, los datos de difracción de rayos X se recogieron a aproximadamente -173,15ºC (100 K). Para preparar los cristales para la recogida de datos a esta baja temperatura, los cristales se equilibraron gradualmente en una solución crioprotectora que contenía PEG 400 al 25% y PEG 1500 al 30%, y se enfriaron rápidamente en nitrógeno líquido.

Determinación de la estructura

Se recogieron los datos de difracción de rayos X nativa a resolución de 2,8 \ring{A} de un único cristal a aproximadamente 173,15ºC (100 K) usando un dispositivo detector cargado-acoplado ADSC Quantum 4 a X4A de línea del haz del Brookhaven National Laboratory (BNL) National Synchrotron Light Source (NSLS). Los datos se procesaron usando los programas de software DENZO y SCALEPACK (Otwinowski & Minor, 1997, Methods in Enzymol. 276:307-326). Los cristales pertenecían al grupo espacial P6_{1} o su enantiomorfo P6_{5}, con dimensiones de celda unitaria a = b = 255,09 \ring{A}, c=38,64 \ring{A}. La serie de datos era un 96,6% completa y tenía un R-de fusión del 8,3%. El coeficiente de Matthews (Matthews, 1968, J. Mol. Biol. 33:491-497) era de 2,59 \ring{A}^{3} Da^{-1} con un contenido de disolvente del 52,1%, que indicaba que eran dos complejos en una unidad asimétrica. Los dos complejos en la unidad asimétrica estaban relacionados por la simetría de orden 2 no cristalográfica. La estadística de los datos se muestra en la Tabla 4.

Se hicieron exploraciones de remplazo molecular con el programa AMoRe (Navaza, 1994, Acta Cryst. A50:157-163) del paquete de programas CCP4 (Collaborative Computational Project Nº 4. The CCP4 Suite: programs for protein crystallography. 1994, Acta Cryst. D50:760-763), y se hicieron manipulaciones gráficas moleculares con el programa QUANTA. Se usó un único dominio \alpha1-I de la estructure del dominio \alpha1-I de rata de la integrina \alpha1\beta1 (Protein Data Bank (PDB) número de acceso lck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385) como modelo o sonda para las búsquedas de rotación y traslación. La exploración de la función de traslación indicó que el 1^{er} y 9º picos más altos de la función de rotación correspondían a las soluciones correctas para los dos dominios \alpha1-I en la unidad asimétrica (coeficiente de correlación (cc) = 21,1%, R = 53,1%) y que el grupo espacial era P6_{5}. Posteriormente, se hicieron exploraciones para el fragmento Fab de hAQC2, manteniendo las soluciones del dominio I fijas y usando un modelo del dominio Fv del Fab de hAQC2 como sonda de búsqueda. Se halló una solución clara para uno de los dos dominios Fv (cc = 22,1%, R = 52,6%), pero el segundo Fv no pudo localizarse. La posición del segundo Fv se obtuvo usando la simetría de orden 2 no cristalográfica. El refinamiento de cuerpo rígido de los dos dominios I y dos dominios Fv redujo el factor R al 43,6% (R-libre = 42,7%). Un mapa de densidad electrónica 2Fo-Fe mostró una densidad electrónica clara para el dominio constante (Fconst) del primer fragmento Fab, pero ausencia de densidad para el dominio Fconst del segundo fragmento Fab. Se ajustó manualmente un modelo del dominio Fconst del primer Fab en la densidad electrónica observada. Después del refinamiento de cuerpo rígido con el programa de software CNX (Accelrys Inc., San Diego, CA ©2000; Brunger, 1998, Acta Cryst. D54:905-921), usando los datos en el intervalo de resolución de 500-2,8 \ring{A}, se optimizó la posición de todos los dominios, reduciendo el factor R al 39,7% (R-libre = 38,9%).

Todas las posteriores etapas de refinamiento se realizaron con el programa CNX. Para reducir la desviación del modelo, se usaron modelos parciales para el cálculo del mapa 2Fo-Fc y el refinamiento del modelo. El modelo parcial inicial, se sometió a hibridación simulada y refinamiento de factor B agrupado con restricciones de simetría no cristalográfica. Los factores R-de trabajo y R-libre bajaron hasta el 28,3% y el 32,9%, respectivamente. Siguieron varios ciclos que constaban de la construcción iterativa de modelos, refinamiento posicional de probabilidad máxima y refinamiento de factor B. se aceptaron solamente los ajustes del modelo que provocaron una bajada en el factor R-libre. Se empleó una corrección del disolvente masivo después de que se construyera el modelo completo. Los factores R-de trabajo y R-libre del modelo final son del 21,3% y el 27,2%, respectivamente para los datos (F > 2\sigma) en el intervalo de resolución de 500-2,8 \ring{A}.

El mapa de densidad electrónica 2Fo-Fc final es de buena calidad para la mayor parte del complejo con la excepción de los restos aminoacídicos 288-295 de un fragmento del dominio I (molécula A en la Fig. 19) que estaban asociados con débil densidad electrónica y no se habían incluido en el modelo. Además, el dominio constante complejo de un fragmento Fab no tenía densidad electrónica visible, lo que indica que está desordenado. Esto parece ser consecuencia de la ausencia de contactos cristalinos para el dominio constante del fragmento Fab debido a su posición dentro de una gran canal de disolvente. Este dominio tampoco se incluyó en el modelo final que constaba de 1030 restos aminoacídicos, que constituían 6 cadenas polipeptídicas, y 2 iones de manganeso. La desviación posicional r.m.s. entre restos equivalentes de los dos complejos en la unidad asimétrica es pequeña (0,37 \ring{A} para 1660 átomos de cadena principal equivalentes). La estadística de estereoquímica se calculó con los programas de software PROCHECK (Laskowski et al., 1993, J. Appl. Cryst. 26:283-291; Morris et al., 1992, Proteins 12:345-364) y CNX. Los enlaces de hidrógeno (< 3,6 \ring{A}) se encontraron con el programa CONTACT (Tadeusz Skarzynski, Imperial College, London, 1.12.88; Collaborative Computational Project Nº 4. The CCP4 Suite: programs for protein crystallography. 1994, Acta Cryst. D50, 760-763). Todos los restos no de glicina (excepto el resto Thr50 de la cadena L que se analizará a continuación) están en las regiones permitidas del diagrama de Ramachandran y el 86% de los restos está en las regiones más favorecidas. El factor B promedio de los átomos de cadena principal s 38,5 \ring{A}^{2}. Los datos del análisis cristalográfico están en la Tabla 4.

TABLA 4 Resumen de la Estadística de Datos y el Análisis Cristalográfico

1032

Ejemplo 25

Este ejemplo describe la estructura cristalina del complejo de un dominio \alpha1-I quimérico de rata/humano de la integrina \alpha1\beta1 y el fragmento Fab de hAQC2.

Arquitectura de la Estructura Cristalina

La estructura cristalina del complejo del dominio a1-I quimérico de rata/humano de la integrina \alpha1\beta1 y el fragmento Fab de hAQC2 tiene una forma alargada (Fig. 20). Las dimensiones del complejo son 100 \ring{A} x 50 \ring{A} x 35 \ring{A}.

El fragmento Fab muestra el plegamiento típico de inmunoglobulina. La cadena ligera y la cadena pesada del fragmento Fab forman cada una dos láminas anchas de cadenas \beta antiparalelas que se empaquetan estrechamente entre sí para formar una estructura para los bucles de la región determinante de complementariedad (CDR) que se extienden desde las láminas empaquetadas. Tanto la cadena ligera como la cadena pesada contienen tres bucles CDR. Los bucles de cadena ligera se llaman L1, L2 y L3, mientras que los bucles de cadena pesada se mencionan como H1, H2 y H3. Los bucles de la región determinante de complementariedad (CDR) corresponden a la estructura canónica 1 para los bules de cadena ligera L1, L2 y L3 y para los bucles de cadena pesada H1 y H2 (Chotia et al., 1989, Nature 342:877-883). El bucle de cadena pesada H3 tiene una estrecha conformación tipo horquilla \beta que está estabilizada por enlaces de hidrógeno internos así como dos restos aromáticos (Tyr104 y Phe105) que están empaquetados contra la cadena ligera. El resto Thr50 de L2 adopta ángulos diedros de cadena principal que caen en las regiones no permitidas del diagrama de Ramachandran. Se ha hecho la misma observación para el resto correspondiente para otros anticuerpos (Muller et al., 1998, Structure 6, pág. 1153-11567) que indica que es una característica natural de los bucles L2.

El dominio \alpha1-I de la presente invención tiene una estructura muy similar al dominio \alpha1-I no complejado (número de acceso a PDB lck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385; código de acceso a PDB 1qc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:24906-24913). La estructura del dominio I muestra una "unión dinucleotídica" o plegamiento de "Rossman" (Rao & Rossman, 1973, J. Mol. Biol. 76:241-256) en la que una lámina central de cinco cadenas \beta paralelas y una pequeña cadena antiparalela está rodeada en ambos lados por un total de siete hélices \alpha. Las seis cadenas \beta de la estructura de esta invención se mencionarán como \betaA, \betaB, \betaC, \betaD, \betaE, y \betaF y las siete hélices \alpha se llaman \alpha1, \alpha2, \alpha3, \alpha4, \alpha5, \alpha6 y \alpha7.

Existen tres rasgos estructurales característicos para los dominios I. El primer rasgo característico es la presencia de una pequeña hélice insertada en el bucle \betaE-\alpha6, llamada hélice C. La mayor parte del bucle de hélice C de la molécula A (Fig. 19) de la presente invención está asociada con débil densidad electrónica, los que sugiere desorden. Esto parece ser una consecuencia de la ausencia de contactos cristalinos o contactos con el Fab que habría estabilizado el bucle. Sin embargo, el mismo bucle en la molécula B (Fig. 19) de la presente invención tiene una densidad electrónica bien definida y se ha incluido en el modelo. El segundo rasgo característico de los dominios \alpha1-I es el MIDAS o Sitio de Adhesión Dependiente de Iones Metálicos donde se implican iones y ligandos metálicos para unirse al dominio I. Cinco restos clave que forman parte del MIDAS se mencionan como el motivo "DxSxS-T-D". Estos restos, que están completamente conservados entre los dominios I, coordinan el ión metálico (Gotwals et al., 1999, Biochentistry 38:8280-8288). Los cristales de la presente invención se desarrollaron en presencia de manganeso y se observó que el sitio MIDAS del dominio I en esta estructura contiene un ión metálico Mn^{+2}. El ión está directamente coordinado por las cadenas laterales de los restos Ser156, Ser158 y Thr224. El mapa de densidad electrónica 2Fo-Fc muestra ausencia de evidencias de que los restos de MIDAS Asp154 y Asp257 hagan una coordinación indirecta mediada por agua del ión metálico (Fig. 20). Sin embargo, la ausencia aparente de moléculas de agua podría ser una consecuencia de la resolución limitada (2,8 \ring{A}) del mapa de densidad electrónica. El tercer rasgo de los dominios I es que todas las estructuras determinadas de los dominios I pertenecen a una de dos conformaciones llamadas "abierta" y "cerrada". Las diferencias entre la conformación abierta y cerrada incluyen un modo diferente de coordinación de iones metálicos y un desplazamiento posicional significativo (aproximadamente 10 \ring{A}) de la hélice C-terminal del dominio I. El dominio I en el complejo de la presente invención está en la conformación cerrada.

En la estructura del complejo de la presente invención, el fragmento Fab se une a su epítopo sobre la superficie superior frontal del dominio I con una planta de 35 \ring{A} por 30 \ring{A}. El área superficial internado total en la superficie de contacto anticuerpo-antígeno es de 1534 \ring{A}^{2} que es típico de otros complejos anticuerpo-antígeno (Davies et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7-12; Jones & Thornton, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:13-20). La superficie es de carácter hidrófobo al 25% e hidrófilo al 75%. La cadena pesada contribuye en un 65% del área superficial internada para el complejo, mientras que el 35% restante está aportado por la cadena ligera. El epítopo del anticuerpo consta de restos localizados en cuatro bucles del dominio I (Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56). Tres de los bucles forman el sitio MIDAS: bucle 1 (\betaA-\alpha1) que contiene la secuencia DXSXS conservada, bucle 2 (\alpha3-\alpha4) que contiene la Thr224 de MIDAS y bucle 3 (\betaD-\alpha5) que contiene el resto Asp257 de MIDAS. El cuatro bucle es el bucle de hélice C y está implicado solamente en los contactos minoritarios.

El rasgo central de la interacción antígeno-anticuerpo es la coordinación del ión metálico en el sitio MIDAS por Asp101 del CDR H3 del anticuerpo (Fig. 20). La distancia entre el ión y O\delta1 de Asp101 es de 2,4 \ring{A}. Además, el átomo O\delta2 de Asp101 está interaccionando con His261 del dominio I. De forma interesante, el CDR H3 contiene varios restos de glicina adyacentes a Asp101 (secuencia GFGDGGY) (SEC ID Nº 62), supuestamente para permitir suficiente flexibilidad al bucle de la CDR para permitir la apropiada coordinación del ión metálico. La secuencia CDR H3 es esencialmente invariable en anticuerpos monoclonales que se crearon contra el mismo antígeno y que se halló que pertenecían a la misma clase. La mayoría de los restos del anticuerpo que están implicados en los contactos anticuerpo-antígeno están localizados en los bucles de CDR L3, H1, H2 y H3. Parece que unos pocos restos de los bucles L1 (Asn30) y L2 (Tyr48) forman contactos de Van der Waals minoritarios. L3 contribuye principalmente a los contactos a través de dos grandes restos hidrófobos, Trp90 y Trp95. Además, Asn93 de L3 forma enlaces de hidrógeno con Gln223 del dominio I. Las cadenas laterales de His56 y Tyr58 del bucle H2 forman enlaces de hidrógeno con los átomos de cadena principal del bucle 2 del dominio I. La Arg31 de H1 está en contacto con Arg291 del bucle 4 del dominio I. La Arg222 del bucle 2 del dominio I está intercalada entre varios restos de anticuerpo incluyendo Tyr58, Trp95 y Asn93. Éste es el único restos de los cuatro mutados en el dominio I R\DeltaH, que está implicado en los contactos con el Fab. Por lo tanto es probable que sea el único resto responsable del restablecimiento de la unión del anticuerpo después de la mutagénesis.

Comparación de la estructura cristalina del complejo de un dominio \alpha1-I quimérico de rata/humano y el fragmento Fab de hAQC2 con otras estructuras de dominio I

El dominio \alpha1-I R\DeltaH quimérico tiene cuatro diferencias de secuencia con el dominio \alpha1-I de rata (restos de rata: 217G, 218R, 219Q y 222L), ocho diferencias de secuencia con el dominio \alpha1-I humano (restos humanos: 163D, 166T, 214K, 264H, 268K, 288S, 322I y 380T), y diez diferencias de secuencia con el clon usado en los estudios de estructura cristalina del dominio \alpha1-I humano (restos del clon: 163D, 166T, 174E, 214K, 230I, 264H, 268K, 288S, 322I y 380T). En la estructura cristalina del dominio \alpha1-I de \alpha1\beta1 de rata no ligando (código de acceso a PDB 1ck4; Nolte et al., 1999, FEBS Lett. 452:379-385), el dominio \alpha1-I no contiene iones metálicos unidos y adopta la conformación " cerrada". En la estructura cristalina del dominio \alpha1-I humano no ligado (código de acceso lqc5; Rich et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:24906-24913), el dominio \alpha1-I contiene Mg^{+2} unido y adopta de forma similar la conformación cerrada. La superposición de estas dos estructuras con el dominio \alpha1-I quimérico complejado indica que hay cambios conformacionales solamente minoritarios después de la unión del anticuerpo hAQC2. La desviación posicional r.m.s. entre el dominio \alpha1-I de rata y quimérico es de 1,04 \ring{A} para los 768 átomos de cadena principal. La desviación posicional r.m.s. entre el dominio \alpha1-I humano y quimérico es de 0,69 \ring{A} para los 764 átomos de cadena principal. Las mayores diferencias (par dominio \alpha1-I humano y quimérico) se observan en el bucle 1 (desviaciones r.m.s. de 1,24 \ring{A} para los átomos de cadena principal de los restos 154-161) y el bucle 4 (bucle de hélice C) del dominio \alpha1-I (desviaciones r.m.s. de 1,55 \ring{A} para los átomos de cadena principal de los restos 288-296). Sin embargo, estas diferencias pueden describirse de forma más precisa como desplazamientos de los elementos de estructura secundaria global en lugar de cambios conformacionales del complejo. Estos probablemente tienen que estar dentro del intervalo normal de flexibilidad conformacional de las proteínas. La desviación posicional r.m.s. entre el dominio \alpha1-I humano y quimérico para los átomos estructurales de los restos aminoacídicos Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, y Gly221 (numeración cristalina) es de 0,33 \ring{A}. La desviación posicional r.m.s. entre el dominio \alpha1-I de rata y quimérico para los átomos estructurales de los restos aminoacídicos Asp154, Ser156, Asn157, Ser158, Tyr160, Glu192, Gln218, Arg219, Gly220, Gly221, Arg222, Gln223, Thr224, Asp257, His261, Asn263, Arg291, y Leu294 (numeración cristalina) es de 0,97 \ring{A}.

El dominio I mantiene la conformación del domino I "cerrada" que se ha observado solamente para los dominios I no ligados cristalizados en ausencia de ligandos o pseudo-ligandos unidos al sitio MIDAS. La desviación posicional r.m.s. de las hélices C-terminales de los dominios I humano y quimérico (calculada para los átomos de cadena principal de los restos 321-335) es de 0,64 \ring{A}. Un mapa omitido de hibridación simulada calculado para el modelo refinado final confirma unívocamente que la posición de la hélice C-terminal y los elementos estructurales adyacentes son coherentes con la conformación cerrada.

Para investigar los efectos de la unión de ligando en los modos de coordinación de iones metálicos, se superpuso la estructura de la presente invención con las estructuras del dominio \alpha2-I no ligado (código de acceso a PDB Iao; Emsley et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:28512-28517) y el dominio \alpha2-1 en complejo con un péptido de colágeno (código de acceso a PDB 1dzi; Emsley et al., 2000, Cell 101:47-56). La coordinación del ión metálico por Asp101 del anticuerpo es remarcadamente similar a la coordinación del ión metálico del dominio \alpha2-I por un ácido glutámico del péptido de colágeno. Otro rasgo que está conservado es la interacción simultánea del grupo ácido con His261 (His258 en el dominio \alpha2-I). Todos los restos del MIDAS del complejo dominio I-Fab excepto la Ser156 y Ser158 adoptan conformaciones muy similares a las observadas en el dominio I no ligado. En contraste, las cadenas laterales de la Ser156 y Ser158, así como el metal, adoptan conformaciones similares a las del dominio I ligado. Está claro que la coordinación del ión metálico por Asp101 no permite que el ión mantenga la posición y las distancias de coordinación que se observan en el estado no ligado. Por tanto, el ión metálico no se coordina directamente por Asp257, un hecho que permite que el ión mantenga elevada electrofilicidad.

Implicaciones Biológicas

En la presente invención, no existe coordinación directa del metal por Asp257, lo que puede permitir una unión de elevada afinidad disminuyendo la barrera energética entre una conformación cerrada (sin ligando unido) y abierta (ligando unido). Sin embargo, la coordinación del metal por un ácido aspártico del anticuerpo no es suficiente para inducir la conformación abierta en el dominio I de la presente invención. La estructura del complejo de dominio I-Fab indica que es posible tener una fuerte unión al dominio I que adopte la conformación cerrada y que la coordinación del ión metálico por un resto ácido del ligando puede ser necesaria pero no suficiente para inducir un cambio conformacional al estado abierto. Se espera que la unión del anticuerpo estabilice el estado de baja afinidad de la integrina y evite la señalización desde el exterior que habría acompañado a la unión de la integrina al colágeno.

Aunque la anterior invención se ha descrito en algún detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será evidente para los especialistas en la técnica que se pondrán en práctica ciertos cambios y modificaciones. Por lo tanto, la descripción y los ejemplos no deben entenderse como limitantes del alcance de la invención.

Claims (19)

1. Un anticuerpo anti-VLA-1 o fragmento de unión a antígeno del mismo cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: V12, F29, A49, T93 y R94.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo al menos uno de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4 e Y71.

4. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo:

(a) una secuencia de dominio variable de cadena ligera de la SEC ID Nº 1 y una secuencia de dominio variable de cadena pesada de la SEC ID Nº 2; o

(b) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC22 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

5. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, siendo el anticuerpo o fragmento un anticuerpo humanizado.

6. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, comprendiendo el anticuerpo o fragmento:

(a) al menos uno de los siguientes restos en su cadena ligera: Q1, L4, P46, W47 e Y71; o al menos uno de los siguientes restos en su cadena pesada: D1, V12, S28, F29, A49, T93, R94 (convención de numeración de Kabat);
o

(b) una secuencia de dominio variable de cadena ligera definida por los restos aminoacídicos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3, y una secuencia de dominio variable de cadena pesada definida por los restos aminoacídicos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; o

(c) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275); o

(d) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356); o

(e) las mismas secuencias polipeptídicas de cadena pesada y ligera que un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274).

7. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, en el que la cadena pesada está mutada en uno o más de los restos aminoacídicos seleccionados entre el grupo compuesto por los restos 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 (sistema de numeración EU), causando de este modo una alteración en una función efectora reteniendo al mismo tiempo la unión a VLA-1 en comparación con un anticuerpo no modificado.

8. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7, comprendiendo el anticuerpo o fragmento las mutaciones L234A y L235A (sistema de numeración EU) en su cadena pesada en comparación con un anticuerpo no modificado.

9. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 5, estando el anticuerpo o fragmento mutado en un resto aminoacídico que es un sitio de glucosilación, eliminando de este modo el sitio de glucosila-
ción.

10. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 9, comprendiendo el anticuerpo o fragmento la mutación N297Q en su cadena pesada (sistema de numeración EU).

11. Una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

12. Secuencia de ácido nucleico aislada que comprende ADN que se selecciona entre el grupo compuesto por:

(a) una secuencia codificante para la SEC ID Nº 1 y una secuencia codificante para la SEC ID Nº 2;

(b) una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273) y una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por el hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273);

(c) una secuencia codificante para la cadena ligera de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275) y una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275);

(d) una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274);

(e) una secuencia codificante para la cadena pesada de un anticuerpo producido por la línea celular hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356);

(f) una secuencia codificante para los restos 1 a 106 de la SEC ID Nº 3 y una secuencia codificante para los restos 1 a 118 de la SEC ID Nº 4; y

(g) secuencias codificantes para un anticuerpo anti-VLA-1, o fragmento de unión a antígeno del mismo, cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera están definidas por los restos aminoacídicos 24 a 33, 49 a 55, y 88 a 96 de la SEC ID Nº 1, y cuyas regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada están definidas por los restos aminoacídicos 31 a 35, 50 a 65, y 98 a 107 de la SEC ID Nº 2.

13. Uso de la composición de la reivindicación 11 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un trastorno inmunológico.

14. Un método in vitro para determinar el nivel de VLA-1 en un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con el anticuerpo de la reivindicación 1, y detectar la unión del anticuerpo al tejido, determinando de este modo el nivel de VLA-1 en el tejido.

15. Uso de la composición de la reivindicación 11 para la preparación de una composición para la determinación del nivel de VLA-1 en un tejido para su uso en el diagnóstico de un trastorno inmunológico.

16. Una célula de la línea celular hAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3275), haAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3274), hsAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3356) o del hibridoma mAQC2 (número de acceso a la ATCC PTA3273).

17. Un método para identificar un inhibidor de un dominio I de una integrina que comprende las etapas:

(a) usar las coordenadas estructurales de los aminoácidos de hAQC2 que comprenden los restos de cadena ligera Asn30, Tyr48, Trp90, Asn93 y Trp95, y los restos de cadena pesada Arg31, His56, Tyr58, Gly100 y Asp101, de acuerdo con la Fig. 19 o \pm una desviación del cuadrado medio de la raíz a partir de los átomos estructurales de dichos aminoácidos de hAQC2 de no más de 1,10 \ring{A}, para generar una estructura tridimensional de un sitio de unión;

(b) emplear dicha estructura tridimensional para diseñar o seleccionar un antagonista potencial;

(c) sintetizar dicho antagonista potencial; y

(d) poner en contacto dicho antagonista potencial con hAQC2 para determinar la capacidad de dicho antagonista potencial de interaccionar con hAQC2, donde la capacidad de dicho antagonista potencial de interaccionar con hAQC2 indica que el antagonista potencial es un inhibidor del dominio I.

18. El uso de la reivindicación 13 ó 15, en el que el trastorno inmunológico se selecciona entre el grupo compuesto por un trastorno gastrointestinal, una enfermedad autoinmune, una fibrosis, un trastorno cutáneo, una enfermedad vascular, rinitis alérgica, síndrome de distrés respiratorio, asma, bronquitis, tendinitis, bursitis, una cefalea en migrañas, periarteritis nodosa, tiroiditis, anemia aplásica, enfermedad de Hodgkin, fiebre reumática, osteoartritis, sarcoidosis, síndrome nefrótico, fallo renal, síndrome de Bechet, polimiositis, gingivitis, hipersensibilidad, rechazo de injertos o trasplantes, enfermedad de injerto contra hospedador, conjuntivitis, hinchamiento después de lesión, isquemia miocárdica, y síndrome de choque por endotoxinas.

19. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, seleccionándose el fragmento de unión a antígeno entre el grupo compuesto por un Fab, un F(ab')2 y un Fv de cadena sencilla.