BRPI0210791B1 - Composição tendo atividade bacteristática e bactericida contra esporos bacterianos e células vegetativas e processo para tratamento de alimentos utilizando a mesma - Google Patents
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Description
COMPOSIÇÃO TENDO ATIVIDADE BACTERISTÁTICA E BACTERICIDA
CONTRA ESPOROS BACTERIANOS E CÉLULAS VEGETATIVAS E PROCESSO
PARA TRATAMENTO DE ALIMENTOS UTILIZANDO A MESMA
Fundamentos da Invenção Este pedido reivindica o benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) de pedido de patente provisório US copendente depositado anteriormente No. 60/305.114, depositado em 13 de julho de 2001, entitulado "Food-Treating Composition Having Bacteristatic and Bactericidal Activity and Process for Treating Food Therewith" , cujo teor é incorporado como referência. 1. Campo da Invenção A presente invenção se refere a uma composição tendo atividade bacteristática e bactericida contra bactéria indesejável presente no alimento, e a um processo para tratamento de alimento com uma tal composição a fim de produzir o alimento mais resistente a apodrecimento e segurança ao consumidor. 2 . Descrição da Técnica Relacionada Processos e composições para tratamento de produtos alimentícios que inibem ou previnem apodrecimento bacteriano e/ou o desenvolvimento de bactéria prejudicial são amplamente praticados. É uma prática comum na esterilização comercial de alimentos com baixo teor de ácidos (i.e., pH >4,5) para aplicar uma combinação de calor e pressão para alimentos enlatados ou embalados em bolsa suficiente para alcançar pelo menos uma redução 12 decimal (12D) de esporos de Clostridiuw botulinum, considerado o mais resistente ao calor de bactérias perigosas em alimentos derivando de sua capacidade de formar esporos altamente resistentes a calor que sobrevivem a processos menos importantes. Infelizmente, processos de esterilização 12D típicos podem alterar a aparência e sabor dos alimentos, tornando os mesmos menos desejáveis do que alimentos que são processados a temperaturas que são menos letais (subletal) a esporos de C. Botulinum.
Nos últimos anos, mais alimentos foram submetidos a tratamento com doses subletais de calor, pressão, irradiação, ultrassom, ou combinações dos mesmos, que podem decrescer níveis bacterianos de um produto alimentício enquanto também fornece um produto alimentício organolepticamente mais atrativo. Esses tratamentos de processamento subletais alteram produtos alimentícios menos dramaticamente do que tratamentos de calor 12D tradicionais usados para esterilizar produtos de alimentos, mas os alimentos mais processados desta forma devem depois ser refrigerados para proteger contra o possível crescimento de bactéria formadora de esporo.
Embora tratamentos de processamento subletal matem a maior parte de células bacterianas patogênicas e que causam apodrecimento vegetativas, elas tipicamente matam somente uma fração de esporos bacterianos potenciais, que têm elevada resistência ao calor, irradiação e outros tratamentos. Tais esporos podem sobreviver tratamentos de processamento subletais e subseqüentemente crescem no alimento processado, causando apodrecimento, doença e, nos piores casos, a morte. Para esta razão, os alimentos mais tratados desta forma são refrigerados a fim de retardar ou evitar o crescimento de tais esporos.
Produtos alimentícios infectados com essas bactérias formadoras de esporos são numerosos e incluem, mas não estão limitados a, refeições prontas para consumo e entradas, saladas "deli", alimentos de laticínios, temperos e condimentos, carnes curadas ou processadas, frango, assim como frutas e vegetais processados, produtos derivados de vegetais e frutas, grãos e produtos derivados de grãos, pastas, sopas, e alimentos embalados assepticamente. A vida de prateleira refrigerada por muito tempo de alimentos prontos para consumo, especialmente produtos de alimento enlatado, especialmente embalados a vácuo, embalados em atmosfera modificada (MAP), podem ser especialmente problemáticos na medida em que eles podem permitir que os esporos de alguma bactéria, tal como Clostridium botulinum, germinem e cresçam no alimento com a produção de toxinas letais. Tal risco pode ser maior em alimentos processados subletalmente porque processos subletais destroem as espécies vegetativas não patogênicas que diferentemente apodrecem ou competem com espécies formadoras de esporos.
Um risco adicional agravante nesta classe de alimento é o uso de vácuo ou processos de embalagem em atmosfera modificada, que produzem as condições anaeróbicas para o desenvolvimento e crescimento de esporos clostridianos.
Pesquisa extensiva também foi conduzida no campo de segurança de alimento para desenvolver composições de grau alimentar que podem funcionar como agentes antibacterianos. A técnica anterior relevante pode ser encontrada nas Patente US No. 5.096.718, e 5.260.061 e nas referências citadas nas mesmas. Essas patentes descrevem o uso de metabólitos de bactérias de ácido propiônico em certos alimentos para aumentar a vida de prateleira dos produtos resultantes. Esses metabólitos demonstram eficácia contra bactérias gram negativo mas não são tipicamente eficazes contra bactérias gram positivo ou seus esporos. JP 07-115950 descreve a combinação de bacteriocinas produzidas por bactéria de ácido lático do geno propionibactéria em combinação ou com ácidos orgânicos e seus sais, ésteres de ácido graxo de poliálcoois hídricos, amino ácidos, peptídeos antibacterianos e proteínas, polisacarídeos compreendendo açúcares, ácidos sacarídeos e amino açúcares e seus produtos de decomposição parcial, especiarias e seus óleos essenciais e componentes de planta, e álcoois.
Patente US No. 5.217.250 descreve o uso de composições de nisina como bactericidas. A nisina é um lantibiótico, mais especificamente, um polipeptídeo com propriedades antimicrobianas que é produzido por várias linhagens da bactéria Streptococcus lactis. A nisina é primariamente eficaz contra bactéria gram positiva. Esta patente descreve que a combinação de um agente quelante, tal como EDTA ou outros sais de acetato ou sais de citrato, com nisina pode resultar em uma ampla faixa de bactericida.
Patente US No. 5.458.876 descreve a combinação de um lantibiótico com lisozima como uma composição antimicrobiana. EP 0 466 244 descreve uma composição tendo propriedades antibacterianas aperfeiçoadas que é uma mistura de pelo menos um de cada dos seguintes grupos de compostos: (I) uma substância de lise na parede da célula ou um sal do mesmo, (II) um composto antibacteriano, e (III) um adjuvante selecionado de ácidos orgânicos aceitáveis para uso em produtos alimentícios, preparações para uso cosmético ou higiene pessoal, ou sais desses ácidos; fosfatos e fosfatos condensados ou seus ácidos correspondentes; e outros agentes sequestrantes.
Preferencialmente, (I) é lisozima, (II) pode ser uma bacteriocina (e.g. nisina ou pediocina) , e (III) pode ser ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido tartárico, ortofosfatos, hexametafosfatos, tripolifosfatos, outros polifosfatos, ou agentes sequestrantes contendo grupos amino substituídos ou não substituídos, e.g. EDTA. EP 0 453 860 descreve a combinação de nisina com um tampão de fosfato eficaz a um pH entre 5,5 e 6,5 para auxiliar bactéria gram eradicato de superfícies.
Patente US No. 5.989.612 descreve a combinação de um metabólito propionibacteriano, não somente ácido propiônico, com uma substância potente, que inclui agentes quelantes, óleos essenciais, ou ácidos orgânicos (diferentes de ácido propiônico, ácido acético, ácido lático, e seus respectivos sais).
Patente US No. 6.207.210 descreve a combinação de um metabólito propionibacteriano, não somente ácido propiônico, um lantibiótico, e um ou mais sais fosfato que agem como um agente quelante.
Seria ainda benéfico desenvolver uma composição antibacteriana eficaz contra bactéria gram negativo e gram positivo, assim como contra esporos gram positivo, especialmente em alimentos submetidos a um tratamento de processamento subletal (menos do que 12D).
Sumário da Invenção Verificou-se agora que, quase supreendentemente, uma composição de tratamento de alimento contendo pelo menos um metabólito propionibacteriano e pelo menos dois componentes adicionais selecionados do grupo consistindo em (a) lantibióticos, (b) enzimas líticas, e (c) ácidos orgânicos e/ou sais de ácidos orgânicos, demonstra excelente atividade bactericida e bacteristática contra bactéria vegetativa gram positivo e gram negativo, assim como bactéria formadora de esporo gram positivo tipicamente encontrada em alimentos. Esta composição é especialmente eficaz sendo bacteristática e bactericida a bactérias patogênicas contendo alimento potencialmente prejudicial quando usado em conjunto com um ou mais tratamentos de processamento subletais.
Em modalidades particularmente preferidas, lantibiótico (a) da composição aqui é nisina ou lacticina; enzima lítica (b) é lisozima ou quitinase; e ácido orgânico e/ou sal de ácido orgânico (c) é selecionado do grupo consistindo em ácido acético, um sal de ácido acético tal como acetato de sódio, diacetato de sódio, ou acetato de potássio, ácido lático um sal de ácido lático tal como lactato de sódio ou lactato de potássio, ácido propiônico, propionatos, incluindo mas não limitado a, propionato de sódio e propionato de potássio, ácido cítrico, sal de ácido cítrico tal como citrato de sódio ou citrato de potássio, ou misturas dos mesmos.
Ainda em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um processo para reduzir a contagem bacteriana global em ou sobre um alimento pela aplicação ao alimento de uma quantidade eficaz bactericida e eficaz bacteristática da composição anterior.
Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um produto de alimento tendo uma população bacteriana viva reduzida como resultado de ter aplicado na mesma uma quantidade eficaz bactericida e eficaz bacteriostática da composição anterior.
Na prática, a composição de acordo com a presente invenção pode ser aplicada a um alimento em combinação com um ou mais tratamentos de processamento subletal tal como tratamento de calor subletal.
Descrição Detalhada das Modalidades Preferidas A composição antibacteriana da presente invenção contém pelo menos um metabólito propionibacteriano e pelo menos dois componentes adicionais selecionados do grupo consistindo em (a) lantibióticos, (b) enzimas líticas e (c) ácidos orgânicos e/ou sais de ácido orgânico. A composição antibacteriana demonstra atividade bacteristática e bactericida contra bactéria vegetativa gram negativo e gram positivo indesejável assim como esporos gram positivo tipicamente encontrados sobre ou em alimentos.
Como aqui usado, "metabólito" se refere a uma substância orgânica, diferente de água ou dióxido de carbono, produzido por propionibactéria. "Bacteriostático" ou eficaz "bacteriostático" se refere a capacidade de uma substância ou composição para inibir o crescimento ou multiplicação de bactéria. "Bactericida" ou "bactericida eficaz" se refere à característica de uma substância ou composição de destruir, i.e., matar, a bactéria. As expressões "metabólito ativo" e "metabólito inibitório" se referem a um metabólito bacteriostático. "Enzima lítica" inclui qualquer substância capaz de degradar a parede celular bacteriana resultando na lise (e morte) da célula. A expressão "bactéria prejudicial" inclui todos os organismos bacterianos presentes em um alimento que causa, acelera, participa em, ou diferentemente assume o papel no apodrecimento de alimento e/ou que pode ser prejudicial a saúde, especialmente saúde humana, se a bactéria ou seus subprodutos (e.g., toxinas) são ingeridos. O termo "alimento" ou "produto alimentício" engloba todas as substâncias nutritivas comestíveis e composições, especialmente aquelas destinadas para consumo humano, e inclui por exemplo substâncias nutritivas e composições cozidas não processadas, assim como processadas. A expressão "presente no alimento" se refere a todas as superfícies externas e superfícies interiores e/ou porções de um alimento que são resistentes a bactérias prejudiciais.
Para fins desta invenção, "tratamento subletal" é definido como qualquer operação que é suficiente para significativamente reduzir a população bacteriana de um alimento que é insuficiente para realizar uma redução de 12 decimal (12D) de esporos de C. Botulinum. Tratamentos subletais que são contemplados aqui incluem calor, irradiação, pressão, ultrassom, ozônio, nitrito, etc. Que, quando aplicado a um alimento, reduzirá significativamente sua contagem bacteriana mas será insuficiente para realizar um 12 decimal (12D) de esporos de C. Botulinum. 0 primeiro componente da composição de tratamento de alimento da presente invenção é uma quantidade eficaz bacteristática de pelo menos um metabólito propionibacteriano. Esses metabólitos são descritos na Patente US No. 5.096.718 e 5.260.061; cujo teor é incorporado por referência aqui. Esses metabólitos podem inibir crescimento ou multiplicação bacteriana, particularmente no caso de bactéria gram negativo. Este efeito pode ser alcançado sem resultar em um sabor indesejável, odor, ou aparência, ou mesmo em alimentos "flavorizados "delicadamente", que iriam diminuir sua aceitação. 0 metabólito pode ser obtido por crescimento propionibactéria, e.g. Propionibacterium shermanii, P.
Freudenreichii, P. pentosaceum, P. thoenii, P. arabinosum, P. "rub"rum, P. jensenii, P. peterssonii, e espécies relacionadas (como identificado em Malik et al. , Can. J.
Microbiol. 14: 1185, 1968). Linhagens Propionibacterium identificadas em números estão disponíveis junto a American Type Culture Collection (ATCC). Outras culturas são amplamente disponíveis ou podem ser obtidas junto a Oregon State University, Corvallis, Oregon, sem custo. Por exemplo, Propionibacterium freudenreichii subespécie shermanii, linhagem ATCC #9616, pode ser usada de acordo com a presente invenção.
Embora ácido propiônico possa ser utilizado na presente invenção, é geralmente conhecido na técnica para conferir um sabor forte aos alimentos. Enquanto tais sabores são desejáveis em alguns alimentos, tal como queijo suíço, em muitos alimentos eles são indesejáveis. Todas as composições fermentadas em fração contendo outros metabólitos propionibacterianos em uma mistura demonstram atividade antibacteriana sem os sabores fortes associados com ácido propiônico. Exemplos de tais composições contendo esses metabólitos incluem aqueles vendidos pela Rhodia Inc. sob a marca MICROGARD®.
Culturas de Propionibacterium podem ser usadas para produzir um ingrediente alimentício, incluindo um ou mais metabólitos, que podem inibir bactéria gram negativo no pH normal de muitos alimentos. Os metabólitos, que podem ser obtidos como subprodutos da fermentação de cultura propionibacteriana de leite desnatado ou outro meio de fermentação adequado, pode servir como adjuvantes de sabor e podem também ser inibitórios a vários microorganismos após a conclusão da fermentação. 0 grau de inibição alcançado para as misturas de metabólitos estudado é maior do que para ácido propiônico sozinho, favorecendo o uso de, e.g., composições MICROGARD®. A vida de prateleira de um produto alimentício é estendido pelo fornecimento em ou sobre o produto de um ou mais tais metabólitos ativos em combinação com outros componentes da composição da presente invenção. 0 meio de crescimento para espécies Propionibacterium pode ser formulado com leite, soro, ou dextrose, mais extratos de levedura, hidrosilatos de proteína, ou qualquer outra proteína contendo estimulantes. Vários tampões, sais, ácidos, e outros auxiliares de processamento podem ser incorporados para aumentar a produção de metabólito e aperfeiçoar a manipulação da composição final. 0 líquido de crescimento, após desenvolvimento da propionibactéria até cerca de 106 a cerca de IO10 células por ml, pode ser tratado com calor (pasteurizado) para matar a bactéria estranha e inoculada antes do uso do metabólito contendo meio de crescimento em uma forma líquida, condensada, seca, ou congelada.
Para facilitar armazenamento e expedição, uma mistura de crescimento de propionibactéria pode ser evaporada e congelada, ou concentrada e desidratada, e.g., por secagem por aspersão, ou secagem com congelamento, para formar um pó. Os metabólitos podem ser separados ou purificados ou usados como uma mistura. Metabólitos em pó ou naturais líquidos de propionibactérias podem ser incorporados em vários alimentos e alimenta para produzir os mesmos menos suscetíveis ao apodrecimento pelo crescimento e/ou atividade enzimática de bactéria gram negativo. A atividade antiapodrecimento e pode também ser obtida pela incorporação de propionibactéria viável diretamente no alimento.
Na maioria dos casos, aperfeiçoamento substancial em redução bacteriana pode ser obtido pela inclusão na composição antibacteriana de matéria da presente invenção de uma quantidade de um metabólito propionibacteriano suficientemente pequeno que não terá nenhum efeito prejudicial no sabor ou aroma do produto alimentício. Mais especificamente, o produto líquido, condensado, ou seco, que tipicamente compreende sólidos ou líquidos em cultura pasteurizados contendo os metabólitos propionibacterianos além de outros componentes da composição antibacteriana da matéria da presente invenção, que é geralmente adicionada ao produto alimentício de tal modo que as quantidades de metabólitos propionibacterianos variam de cerca de 0,01 a cerca de 2,0 porcento em peso do produto, preferencialmente de cerca de 0,05 a cerca de 1,0 porcento em peso do produto, e mais preferencialmente de cerca de 0,1 a cerca de 0,75 porcento em peso do produto. No caso onde a composição é adicionada a uma mistura seca a qual os ingredientes líquidos são adicionados e a seguir cozidos, tal como um bolo, a quantidade adicionada é em peso da mistura seca antes do cozimento.
Materiais comercialmente disponíveis, mais especificamente, sólidos e líquidos pasteurizados em cultura incluindo metabólitos propionibacterianos, são vendidos junto a Rhodia Inc. sob a marca MICROGARD®. Esses produtos não são purificados por todos os fermentados em fração de leite ou meio similar. MICROGARD® MG100 é um leite desnatado em cultura que é padronizado com sólidos de leite desnatado e secos com aspersão. MICROGARD® MG200 é uma dextrose em cultura pasteurizada que foi padronizada com maltodextrina e seca com aspersão. MICROGARD® MG250 é uma versão condensada (congelada ou líquida) do produto de dextrose em cultura. A composição de tratamento de alimento da invenção pode também incluir uma quantidade eficaz bactericida de pelo menos um lantibiótico como um segundo componente. O termo "lantibiótico" foi atribuído por Schenell et al. (Nature 333: 276-278 (1988)) para descrever um grupo de substâncias bacterianas que contêm a lantionina de amino ácido e outros amino ácidos que não de proteína. As propriedades comuns desses bactericidas são revistos por Kellner et al. (Eur. J. Biochem 177:53-59 (1988)) em que eles observam que "antibióticos de polipeptídeo policíclico possuem um alto teor de amino ácidos insaturados (deidroalanina, deidrobutrina) e amino ácidos de tioéter (meso-lantionina, (2S, 3S, 6R)-3-metil antionina). Além do mais, lisinoalanina, ácido 3-hidróxi aspártico e S-(2- aminovinil)-D-ciste£na são encontrados em alguns membros".
Lantibióticos incluem nisina, subtilina, pep 5, epidermina, gallidermina, cinnamicina, Ro09-0198, duramicina e ancovenina. Esses antibióticos de peptídeos sintetizados ribossalmente contêm de 19 a 34 amino ácidos e são produzidos por vários micróbios incluindo espécies Staphylococcus, espécies Bacillus e espécies Streptomyces.
Além de sua única composição de amino ácidos que não de proteína, eles podem ser distintos a partir de outros antibióticos de polipetídeo com base de sua especificidade.
Bacteriocinas em geral, e os lantibióticos em particular, são caracterizados por um espectro muito estreito de ação.
Assim, somente poucas espécies são sensíveis a uma bacteriocina particular em concentrações práticas. Isto contrasta com outros antibióticos de polipetídeo de espectro amplo que são ativos contra a maioria das bactérias, e os "peptídeos líticos" discutidos por Jaynes et al., no pedido internacional publicado WO 89/00194, que são ativos contra a maioria das bactérias, leveduras, e mesmo células de mamíferos. A nisina, uma das bacteriocinas caracterizadas mais completamente, é um peptídeo codificado ribossomalmente que ocasionalmente ocorre como um dímero com um peso molecular de cerca de 7000. A nisina é o nome coletivo descrevendo várias substâncias intimamente relacionadas que apresentam composições de amino ácidos similares, e alguma faixa limitada de atividade antibiótica. Este fenômeno é discutido por E. Lipinska em "Antibiotics and Antibiosis in Agriculture" (M. Woodbine, Ed.) pp. 103-130. Isto contém vários amino ácidos não usuais incluindo beta-metil lantionina, deidroalanina, e lantionina reunindo um total de 34 aminoácidos. Existem cinco ligações tio-éter no peptídeo que contribuem para a sua estabilidade em soluções ácidas. A nisina divide homologia notável de estrutura e ação com outros lantibióticos, por exemplo subtilina e epidermina (Buchman et al. , J. Bio. Chem. 263 (31) : 16260- 16266 (1988). Revisões recentes de nisina, suas propriedades físicas e usos incluem "Bacteriocinas de bactéria de ácido lático", T. R. Klaenhammer, Biochimie 70: 337-349 (1988), "Nisin", A. Hurst, Avd., Appl. Microbiol. 27:85-121 (1981) e Patente US No. 4.740.593. 0 uso de nisina para combater L. Monocytogenes foi registrado por M. Doyle; "Effect of Enviromental and Processing Conditions on Listeria Monocytogenes", Food Technology, 42(4) :169-171 (1988) . Este artigo descreve a inibição inicial do crescimento do organismo (por cerca de 12 horas) e reporta que L. Monocytogenes pode crescer a um nível de pH tão baixo quanto 5,0 e é resistente a pH alcalino com a capacidade de crescer a pH 9,6.
Por ela mesma, a nisina não é eficaz como um antimicróbio em meio complexo tal como alimentos. Por exemplo, é sabido que a atividade da nisina contra C.
Botulinum tipicamente decresce em meio complexo tal como alimentos. (Rogers and Montville, J. Food Sei., 59 (3) :663- 668 (1994)) . A nisina está comercialmente disponível junto a Rhodia Inc. em uma preparação percentual em peso de 2,5 padronizada sob o nome comercial Novasin™. Onde a nisina é adicionada como um componente da composição antibacteriana da presente invenção, pode ser que esteja presente em quantidades variando de cerca de 0,5% a cerca de 10% em peso da composição antibacteriana.
Proteínas contendo lantibióticos podem também estar presentes como um subproduto de fermentação em baixo nível em certas variedades de cheddar ou queijo Americano e no produto de leite desnatado fermentado conhecido como MICROGARD® MG300. Onde um lantibiótico é adicionado à composição antibacteriana da presente invenção na forma de um produto de leite fermentado tal como MICROGARD® MG300, as quantidades de MICROGARD® MG300 utilizadas podem variar de cerca de 75% a cerca de 95% em peso da composição antibacteriana.
Na prática, onde um lantibiótico é usado como um componente da composição antibacteriana da presente invenção, o lantibiótico é adicionado ao produto alimentício de tal modo que ele está presente em quantidades que variam de cerca de 1 a cerca de 100 ppm (em peso do produto alimentício) de ingrediente ativo (e.g., nisina), com níveis preferidos variando de cerca de 1 a cerca de 12,5 ppm, baseado na segurança e capacidade de adequação de uso em diferentes alimentos.
Como alternativas aos lantibióticos descritos acima, um metabólito bacteriano Pediococcus, especificamente pediocina, pode produzir resultados eficazes na composição da presente invenção. Além disso, a nova classe de bacteriocinas estreptococais chamadas lacticinas, especialmente lacticina 3147 como descrito em WO 96/32482, deveria produzir atividade similar contra bactéria gram positivo. Tanto pediocinas quanto lacticinas têm primariamente atividade bacteristática contra uma faixa limitada de bactéria gram positivo.
Em uma modalidade preferida, a nisina ou lactinina é usada como o lantibiótico na composição da presente invenção.
Um outro componente da composição antibacteriana da presente invenção pode ser uma substância de lise de parede celular tal como enzima lítica. Essas enzimas podem ser usadas para controlar ou evitar o crescimento de microorganismos alvo. Para uma enzima lítica ser útil na indústria de alimento como um componente antibacteriano ou agente, deve ser capaz de degradar um espectro amplo de bactéria, particularmente aqueles que causam apodrecimento de alimento e/ou são patógenos.
Em uma modalidade preferida, uma lisozima é usada como a enzima lática. Lisozimas (muramidase; mucopeptídeo N-acetil mucamoil hidrolase; 1,4-beta-N acetil hexosaminodase, E. C. 3.2.1.17) são enzimas líticas bem conhecidas que foram isoladas a partir de várias fontes e são enzimas bem caracterizadas. As lisozimas são as mais comumente derivadas a partir de albumina de ovo em um processo de extração de grau alimentar, mas são também disponíveis a partir de conchas de vieira árticas, leite humano, lágrimas, e outras fontes naturais. Primeiro foi descoberto por W. Fleming em 1922, lisozima branca de ovo que estava entre as primeiras proteínas seqüenciadas, a primeira para a qual uma estrutura dimensional foi sugerida usando cristalografia, e a primeira para a qual um mecanismo detalhado de ação foi proposto. Sua atividade antimicrobiana contra bactéria gram positivo é bem documentado, por exemplo por V. N. Procter et al. Em CRC
Crit. Reviews in Food Science and Nutrition, 26(4) :359-395 (1988) . O peso molecular da lisozima branca do ovo é aproximadamente 14.300 a 14.600, o ponto isoelétrico é pH 10,5-10,7. É composto de 129 amino ácidos que são interconectados por quatro pontes de dissulfito. Enzimas similares foram isoladas e caracterizadas a partir de fontes naturais incluindo tais produtores diversos como Escherichia. coli e lágrimas humanas. Apesar das diferenças ligeiras (por exemplo, a lisozima humana tem 130 amino ácidos) a capacidade para hidrólise de polímeros de acetil hexosamina permanece essencialmente a mesma. Desse modo, para fins desta invenção, o termo lisozima é destinado a incluir aquela parede celular ou enzimas degradantes de peptidoglicano que têm a capacidade de hidrolisar acetil hexosamina polímeros relacionados. A lisozima é conhecida por matar ou inibir o crescimento de bactéria e fungos, e é usada na Europa para controlar o crescimento do organismo apodrecido Clostridium tyrobutyricum em uma ampla variedade de queijos. Foi também proposto para uso em uma variedade de outras aplicações de preservação de alimento e foi reportado por inibir o crescimento de (e em alguns casos matar) Listeria monocytogenes (Hughey et al. , Appl. Environ. Microbiol 53:2165-2179 (1987)). Lisozima derivada de albumina de ovo com uma atividade de cerca de 20.000 unidades de Shugvar/mg está comercialmente disponível junto a Rhodia sob a marca NovaGARD™.
Quando a lisozima é usada como um antimicrobiano em alimento, ela é adicionada ao produto alimentício em quantidades variando de cerca de 20 a cerca de 500 ppm em peso da solução usada para tratamento, mais preferencialmente entre cerca de 50 e cerca de 200 ppm, primariamente para inibir Clostridum tyrobutyricum em queijos envelhecidos. A lisozima não é bactericida nesses níveis contra bactérias diferentes de gram positivo, mas ela foi usada a níveis mais altos (maior do que 1000 ppm, tipicamente 2000 ppm ou mais) para remover a parede celular a partir de uma faixa ampla de bactéria gram positivo.
Quando a lisozima é adicionada como um componente da composição antibacteriana da presente invenção, ela pode estar presente em quantidades variando de cerca de 0,25% a cerca de 10% em peso da composição antibacteriana.
Preferencialmente, onde lisozima é usada como um componente da composição antimicrobiana da presente invenção, ela está presente em quantidades variando de cerca de 50 ppm a cerca de 150 ppm em peso de um produto de alimento tratado com a composição da presente invenção.
Uma outra enzima lítica preferida que pode ser usada na composição de acordo com a presente descrição é quitinase. A composição antibacteriana de matéria pode também conter ácidos orgânicos aceitáveis para uso em produtos alimentícios desses ácidos. A composição antibacteriana pode conter ácidos individuais ou sais, ou misturas dos mesmos. Ácidos orgânicos preferidos ou sais para uso na composição incluem ácido acético, acetato de sódio, diacetato de sódio, acetato de potássio, ácido lático, lactato de sódio, lactato de potássio, ácido propiônico, propionatos, incluindo, mas não limitado a, propionato de sódio e propionato de potássio, ácido cítrico ou seus sais tal como citrato de sódio ou citrato de potássio, ou misturas dos mesmos. Em uma modalidade preferida, diacetato de sódio é usado em quantidades variando de cerca de 1% a cerca de 25% em peso da composição antibacteriana.
Preferencialmente, o produto de alimento resultante tratado com a composição antimicrobiana da presente invenção terá de cerca de 500 ppm a cerca de 1500 ppm de diacetato de sódio.
Outros aditivos que podem estar presentes na composição da invenção incluem, mas não estão limitados aos seguintes materiais: agentes quelantes e/ou antibacterianos adicionais, temperos naturais ou sintéticos e/ou flavorizantes e/ou colorantes, vitaminas, minerais, nutrientes, enzimas, e agentes aglutinantes tais como goma guar, goma xantano, e similares. A adição desses materiais não é considerada crítica para o sucesso da presente invenção e seria considerado dentro do conhecimento do técnico.
Em uma modalidade particularmente preferida, a composição antimicrobiana de matéria inclui um metabólito propionibacteriano misturado com uma variedade de ácidos orgânicos, ou seus sais, incluindo diacetato de sódio, em combinação com bacteriocina lantibiótica, tal como nisina ou lacticina, e uma enzima lítica, tal como lisozima, para controlar o crescimento de uma ampla faixa de bactéria formadora de esporo e/ou que provoca apodrecimento gram negativo e gram positivo em produtos alimentícios. A composição antimicrobiana da presente invenção pode ser usada com relação a qualquer produto alimentício que é suscetível ao crescimento bacteriano ou degradação. Esses incluem, mas não estão limitados a, alimentos de laticínios, frutas e vegetais, frutas e produtos derivados de vegetais, grãos e produtos derivados de grãos, carnes, frangos e frutos do mar. Uma modalidade preferida inclui o tratamento de produtos alimentícios processados subletalmente incluindo refeições prontas para consumo, entradas, e carnes, saladas "deli", temperos (incluindo temperos de salada), molhos e condimentos, pastas, sopas, e alimentos embalados assepticamente, assim como misturas dos anteriores. A composição antimicrobiana de acordo com a presente invenção é mais prontamente usada pela mistura com e/ou aplicação de um produto alimentício misturável, mas podería ser também eficaz para tratar a superfície de produtos alimentícios sólidos por imersão, rinsagem, ou aspersão ou pela aplicação ao interior de tais produtos, e.g. por injeção. Em outras modalidades, a composição antibacteriana pode ser aplicada como um marinado, pão, tempero "rub", geléia, mistura colorante, e similares, ou como um ingrediente a ser misturado com e incorporado no produto alimentício, o critério chave sendo aquele que a composição antimicrobiana está disponível à superfície (incluindo superfícies internas) submetida a crescimento bacteriano e/ou degradação. Ainda em outras modalidades, a composição antimicrobiana pode ser indiretamente colocada em contato com a superfície do alimento pela aplicação da composição a materiais de embalagem de alimentos e a seguir aplicação da embalagem à superfície do alimento de tal modo que a composição bacteriana entre em contato com a superfície alimentícia externa. A quantidade ótima a ser usada dependerá da composição antibacteriana do produto alimentar particular a ser tratado e o método usado para aplicar a composição antibacteriana à superfície do alimento, mas pode ser determinado por simples experimento.
As composições antimicrobianas de acordo com a presente invenção são eficazes contra bactérias gram positivo incluindo, mas não limitado a, bactéria formadora de esporo anaeróbico incluindo espécies clostridiais tal como Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clsotridium sporogenes, Clostridium ttyrobutyricum, e Clostridium putrefasciens, bactéria formadora de esporo aeróbico incluindo espécies de bacilos tal como Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, e Bacillus coagulans; patógenos vegetativos gram positivo incluindo espécies estafilococus tal como Staphylococcus aureus; espécies listeriais tal como Listeria monocytogenes/ e, finalmente, bactéria vegetativa produtora de Micrococcus, Streptococcus e grupos ácido lático incluindo, mas não limitado a, espécies Lactobacillus e Leuconostoc.
As composições antimicrobianas da presente invenção são também eficazes contra bactéria gram negativo incluindo, mas não limitado a, bactéria Escherichia tal como E. Coli H7:0157; bactéria Campylobacter tal como Campylobacter jejuni; bactéria Vibrio tal como Vibrio parahaemolytica; Pectobacteria tal como Pectobacterium carotovorum; bactéria Pseudomonas tal como Pseudomona fluorescens; e espécies Salmonella.
Verificou-se adicionalmente que a composição de acordo com a presente descrição é eficaz também na redução do teor de bactéria viva de produtos sanguíneos contendo mais do que cerca de 1% de gordura, ou materiais solúveis em óleo, assim como produtos alimentícios que são emulsões graxas. Quando o produto alimentício é uma gordura em emulsão em água, é particularmente vantajoso incorporar a composição na fase aquosa do produto alimentício a fim de minimizar a partição na fase de lipídio onde a composição não estaria disponível para proteção antibacteriana do produto alimentício.
Produtos alimentícios tratados com a composição de acordo com a presente descrição podem também ser tratados com tratamentos de processamento subletal tal como calor, irradiação, pressão, ultrassom, congelamento, campo elétrico com pulso, ozônio, nitrito, etc. Verificou-se que a composição em combinação com um tratamento de processamento subletal é mais eficaz na redução do teor de bactéria viva dos produtos alimentícios do que tratamento sozinho. Esses produtos alimentícios permanecem estáveis a temperaturas ambiente por cerca de 3 dias ou mais. As temperaturas de refrigeração desses produtos alimentícios permanecem por cerca de 7 dias ou mais.
Os seguintes exemplos não limitantes são ilustrativos da ampla faixa de composições antimicrobianas que podem ser usadas para preservar produtos alimentícios de acordo com a presente descrição.
Exemplos Os seguintes exemplos comparam a eficácia de uma composição antimicrobiana, referida como CB-1, um leite seco não graxo (NFDM) com Nisina (Novasin™) como um controle. CB-1 continha Novasin™, MICROGARD® MG200, diacetato de sódio, e lisozima. Os componentes dessas composições são descritos abaixo na Tabela 1.
Tabela 1 Composições Antibacterianas Exemplo 1 Inibição de composição antibacteriana contra bacillus cereus em leite desnatado e integral a 30EC
Leite desnatado e integral foi esterilizado, cloreto de 2,3,5-triferil tetrazolium (TTC) foi adicionado (para indicação de crescimento por variação de cor), e a mistura resultante foi inoculada com esporos de Bacillus cereus (um formador de esporo aeróbico) a cerca de 4-5 log células/ml. A composição antibacteriana (CB-1) e um controle Novasin™ (controle) foi adicionada como soluções de armazenamento 10% (o controle continha 4 vezes a quantidade de nisina como CB-1). A inibição foi indicada pela concentração mínima para nenhum crescimento durante um dado tempo e é descrita abaixo na Tabela 2.
Tabela 2 Eficácia de Composições *MIC = concentração de inibição mínima A contagem de placa de B. Cereus para essas composições foi depois obtida em placas de agar TSA, incubada a 30EC por 24 horas, e os resultados são indicados na Tabela 3 abaixo.
Tabela 3 Contagens de placa Inibição contra B. Cereus em leite integral Exemplo 2 Inibição de composição antibacteriana contra L.
Monocytogenes em leite integral e leite desnatado a 25EC
Leite integral e desnatado foi esterelizado, cloreto de 2,3,5-triferil tetrazolium (TTC) foi adicionado (para indicação de crescimento por variação de cor), e a mistura resultante foi inoculada com L. Monocytogenes ATCC 19115 (um vegetativo, patógeno gram positivo) a cerca de 4-5 log células/ml. A composição antibacteriana (CB-1) e controle Novasin™ (controle) foram adicionados como soluções de armazenamento 10% (o controle continha 4 vezes a quantidade de nisina como CB-1). A inibição foi indicada pela concentração mínima para nenhum crescimento durante um dado tempo e é descrita abaixo na Tabela 4.
Tabela 4 Eficácia de Composições *MIC = concentração de inibição mínima A contagem de placa de L. Monocytogenes para essas composições foi depois obtida em placas agar TSA, incubadas a 30EC por 24 horas e os resultados são indicados na Tabela 5 abaixo.
Tabela 5 Contagens de placa *2% CB-1 contém alguma concentração de nisina como controle a 0,5% **CFU = unidades de formação de colônia (# de células) Exemplo 3 Inibição de composição antibacteriana contra C.
Sporogenes, em leite integral a 30EC
Leite integral foi esterelizado, cloreto de 2,3,5- triferil tetrazolio (TTC) foi adicionado (por indicação de crescimento por variação de cor) , e a mistura resultante foi inoculada com C. Sporogenes (um formador de esporo não patogênico, anaeróbico) a cerca de 4-5 log de células/ml. A composição antibacteriana (CB-1) e um controle Novasin™ (controle) foram adicionados como soluções de armazenamento 10% (o controle continha 4 vezes a quantidade de nisina como CB-1) de contagem de placa de C. Sporogenes para essas composições foi depois obtida em placas de agar TSA, incubadas a 30EC por 24 horas e os resultados estão indicados na Tabela 6 abaixo.
Tabela 6 Exemplo 4 Eficácia de composição antibacteriana para retardar a produção de toxina em produtos alimentícios Dez misturas de linhagem de esporos C. Botulinum proteolítico (patógenos formadores de esporos anaeróbicos), tendo cerca de 100 esporos/grama, foram armazenados ao calor a 88 °C por 100 minutos com alimentos. Alguns dos alimentos tinham um teor de gordura alto, e incluía um molho Alfredo, uma refeição pronta consumo (peito de galinha cozida em molho), uma sopa pronto para consumo, e uma pasta fresca. As amostras de alimento inoculadas foram incubadas a 15°C ou 27°C. A composição antibacteriana (CB- 1) , Novasin™, e em um caso CB-1 sem lisozima, foram adicionados como soluções de armazenamento 10% (o tratamento Novasin™ continha a mesma quantidade de nisina como CB-1 e CB-1 sem lisozima) . Amostras de alimentos não tratados foram usados como um controle (controle). Amostras triplicatas foram submetidas a ensaio no tempo 0 e cada intervalo de amostragem, que variou dependendo do alimento particular a ser tratado, seu pH, sua temperatura, etc.
Ensaios em camundongos padrão foram usados para testar a presença de toxina botulinal, que foi confirmada por antitoxina botulinal trivalente ABE. A eficácia dessas composições antibacterianas no retardamento de produção de toxina nesses produtos alimentícios é descrita abaixo nas Tabelas 7-10.
Tabela 7 Eficácia de composição antibacteriana no retardamento de produção de toxina em molho Alfredo a pH 5,2, 27°C
Tabela 8 Eficácia de composição antibacteriana no retardamento de produção de toxina em refeição pronta para consumo a pH
5,6, 27 ° C * A amostra tratada com Novasin tinha a mesma quantidade de nisina como a amostra tratada com CB-1 Tabela 9 Eficácia de composição antibacteriana no retardamento de produção de toxina em sopa pronta para consumo a pH 6,5, 15 °C ** A amostra tratada com Novasin tinha a mesma quantidade de nisina como a amostra tratada com CB-1 e amostra tratada com lisozima sem CB-1 Tabela 10 Eficácia de composição antibacteriana no retardamento de produção de toxina em pasta fresca a pH 6,0, 27°C
Será agora entendido que várias modificações podem ser feitas para as modalidades descritas aqui.
Conseqüentemente, a descrição acima não deve ser construída como limitante, mas meramente como exemplificações de modalidades preferidas. Por exemplo, várias combinações dos componentes da composição antibacteriana descrita aqui, e seu uso em vários produtos alimentícios, serão evidentes a partir de ou razoavelmente sugeridas pela descrição anterior da presente invenção. Aqueles técnicos no assunto entenderão que outras modificações estarão dentro do escopo e espírito das reivindicações em anexo.
Claims (26)
1. Composição de tratamento de alimento tendo uma atividade bactericida e bacteriostática para bactéria prejudicial ao alimento, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um metabólito propionibacteriano em combinação com: a) um lantibiótico; b) uma enzima lítica; e, c) um ácido orgânico ou seu sal.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o dito lantibiótico é selecionado do grupo consistindo essencialmente em nisina e lacticina.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima litica é selecionada do grupo consistindo essencialmente em lisozima e quitinase.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido orgânico ou seu sal é selecionado do grupo consistindo essencialmente em ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido propiônico, diacetato de sódio, acetato de sódio, acetato de potássio, lactato de sódio, lactato de potássio, citrato de sódio, citrato de potássio, propionato de sódio, propionato de potássio, e misturas dos mesmos.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o ácido orgânico ou seu sal é diacetato de sódio.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda um ou mais componentes selecionados do grupo consistindo em agentes antibacterianos adicionais, agentes quelantes, temperos naturais, temperos sintéticos, flavorizantes, corantes, colorantes, vitaminas, minerais, nutrientes, enzimas, e agentes aglutinantes .
7. Processo para inibir o crescimento e matar bactérias em um produto alimentício, caracterizado pelo fato de ser através da aplicação a uma ou mais superfícies do produto alimentício de uma quantidade eficaz bactericida e para inibição de crescimento de bactéria, de uma composição que demonstra eficácia bactericida e inibitória de crescimento contra bactérias gram positiva e gram negativa compreendendo metabólito propionibacteriano em combinação com: a) um lantibiótico; b) uma enzima lítica; e, c) um ácido orgânico ou seu sal.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição reduz a quantidade de bactéria gram positiva no produto alimentício.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a bactéria gram positiva é selecionada a partir do gênero consistindo em Bacillus, Clostridia, Staphyloccus, Listeria, Micrococcus, Streptococcus, Lactobacillus e Leuconostoc.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a bactéria é selecionada do grupo consistindo em Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus coagulans, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium putrefasciens, Staphylococcus aureus, e Listeria monocytogenes.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição reduz a quantidade de bactéria gram negativa no produto alimentício.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a bactéria gram negativa é selecionada do gênero consistindo em Escherichia, Campylobacter, Vibrio, Pectobactéria, Pseudomonas e Salmonella.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as bactérias são selecionadas a partir do grupo consistindo em E.Coli H7:0157, Campylobacter jejuni, Vibrio parahaemolytica, Pectobacterium carotovorum e Pseudomonas fluorescens.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é selecionado do grupo consistindo em laticínios, frutas, vegetais, produtos derivados de frutas, produtos derivados de vegetais, grãos, produtos derivados de grãos, carnes, frangos, frutos do mar, refeições prontas para consumo, saladas "deli", temperos de saladas, condimentos, pastas, sopas, alimentos embalados assepticamente, e misturas dos mesmos.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício contém mais do que cerca de 1% de gordura, lipídio, ou materiais solúveis em óleo.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício compreende uma emulsão graxa.
17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a composição é incorporada na fase aquosa da emulsão graxa.
18. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada tanto a uma superfície do produto alimentício quanto a um material de embalagem de alimento que é consequentemente trazida em contato com a superfície do produto alimentício.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada ao produto alimentício por imersão, rinsagem, injeção, aspersão, ou mistura.
20. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada ao produto alimentício como um componente de um marinado, pão, tempero "rub", geleia, ou mistura colorante.
21. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a composição é usada em combinação com um tratamento de processamento subletal do produto alimentício.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o tratamento de processamento subletal é selecionado do grupo consistindo em calor, irradiação gama, pressão alta, ultrassom, ozônio, nitrito e combinações dos mesmos.
23. Produto alimentício, caracterizado pelo fato de que contém uma população de bactérias vivas reduzida como um resultado da aplicação a uma ou mais de suas superfícies uma composição de tratamento de alimento definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, que demonstra eficiência contra bactéria gram positiva e gram negativa.
24 . Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo em laticínios, frutas, vegetais, produtos derivados de frutas, produtos derivados de vegetais, grãos, produtos derivados de grão, carne, frango, frutos do mar, refeições prontas para consume, saladas "deli", temperos de salada, condimentos, pastas, sopas, alimentos embalados assepticamente, e misturas dos mesmos.
25. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a composição é usada em combinação com um tratamento de processamento subletal do produto alimentício.
26. Produto alimentício, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o tratamento de processamento subletal é selecionado do grupo consistindo essencialmente em calor, irradiação gama, pressão alta, ultrassom, ozônio, nitrito e combinações dos mesmos. COMPOSIÇÃO TENDO ATIVIDADE BACTERISTÁTICA E BACTERICIDA CONTRA ESPOROS BACTERIANOS E CÉLULAS VEGETATIVAS E PROCESSO PARA TRATAMENTO DE ALIMENTOS UTILIZANDO A MESMA A presente invenção se refere a composições antibacterianas eficazes contra bactérias vegetativas gram negativo e gram positivo mais bactéria formadora de poro gram positivo prejudicial incluem metabólitos propionibacterianos em combinação com dois ou mais dos seguintes: um lantibiótico; uma enzima lítica; e um ácido orgânico ou seu sal. Métodos de uso são fornecidos, assim como produtos alimentícios tratados com essas composições antibacterianas.
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