BRPI0211809B1

BRPI0211809B1 - Método para o controle de ervas daninhas nas vizinhanças de uma planta de trigo ou triticale, método para modificar a tolerância de uma planta de trigo ou triticale a um herbicida de imidazolinona e método de produção de uma planta de trigo ou triticale transgênica tendo resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona

Info

Publication number: BRPI0211809B1
Application number: BRPI0211809-2A
Authority: BR
Inventors: Curtis J. Pozniak; Pierre Hucl
Original assignee: University Of Saskatchewan
Priority date: 2001-08-09
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2019-04-24
Also published as: AR036336A1; US9695438B2; EP1414975B1; CA2790951C; RU2337531C2; AU2008203779B2; EP1414975A1; US20120266330A1; US20120266331A1; RU2004106627A; US20160097057A1; US9499832B2; BR0211809A; WO2003014357A1; UA87261C2; US8110727B2; CA2456314A1; US20040237134A1; US20140011681A1; MXPA04001012A

Abstract

"plantas de trigo tendo resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona e método de produção da mesma". a presente invenção é direcionada a plantas de trigo tendo resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona. mais particularmente, a presente invenção inclui plantas de trigo contendo um ou mais ácidos nucléicos imi tal como um cultivar de imi de teal. os ácidos nucléicos estão preferivelmente localizados ou derivados de diferentes genomas. a presente invenção também inclui sementes produzidas por essas plantas de trigo e métodos de controle de ervas daninhas nas vizinhanças dessas plantas de trigo.

Description

[001] Esse pedido reivindica os prioridade do pedido provisório U.S,.

60/311.282 depositado em 9 de agosto de 2001.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção está relacionada em geral a plantas tendo uma resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona. Mais especificamente, a presente invenção está relacionada a plantas de trigo obtidas por mutagênese e reprodução cruzada e transformação que têm uma resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO [003] Ácido acetohidroxi sintase(AHAS; EC 4.1. 3.18) é a primeira enzima que catalisa a síntese bioquímica dos aminoácidos de cadeia ramificada valina, leucina e isoleucina (Singh B. K. , 1999 Biosynthesis of valine, leucine and isoleucine in: Singh B. K. (Ed) Plant aminoácidos. Marcel Dekker Inc. New York, New York. Pg 227247). AHAS é o sítio de ação de quarto famílias de herbicidas estruturalmente diversas incluindo as sulfoniluréias (LaRossa RA and Falco SC, 1984 Trends Biotechnol 2: 158-161), as imidazolinonas (Shaner e cols.,

1984 Plant Physiol 76: 545-546), as triazolopirimidinas

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2/72 (Subramanian and Gerwick, 1989 Inhibition of acetolactate sintase by triazolopirimidinas in (ed) Whitaker JR, Sonnet PEBiocatalysis in agricultural biotechnology. ACS Symposium Series, American Chemical Society. Washington, D. C. Pg 277-288), e as pirimidiloxibenzoatos (Subramanian e cols., 1990 Plant Physiol 94: 239-244.). Herbicidas de imidazolinona e sulfoniluréia são amplamente usados na agricultura moderna devido a sua eficácia em taxas de aplicação muito baixas e relativa não toxicidade em animais. Por inibição da atividade de AHAS, essas famílias de herbicidas evitam crescimento e desenvolvimento adicionais de plantas suscetíveis incluindo várias espécies de ervas daninhas. Vários exemplos de herbicidas de imidazolinona comercialmente disponíveis são PURSUIT® (imazetapir), SCEPTER® (imazaquin) e ARSENAL® (imazapir). Exemplos de herbicidas de sulfoniluréia são clorsulfuron, metsulfuron metil, sulfometuron metil, clorimuron etil, tifensulfuron metil, tribenuron metil, bensulfuron metil, nicosulfuron, etametsulfuron metil, rimsulfuron, triflusulfuron metil, triasulfuron, primisulfuron metil, cinosulfuron, amidosulfuron, fluzasulfuron, imazosulfuron, pirazosulfuron etil e halosulfuron.

[004] Devido a sua alta eficácia e baixa toxicidade, herbicidas de imidazolinona são preferidos para aplicação por pulverização sobre o topo de uma ampla área de vegetação. A capacidade de pulverizar um herbicida sobre o topo de uma ampla escala de vegetação diminui os custos associados com o estabelecimento e manutenção da plantação e diminui a necessidade por preparação do local antes do uso de tais substâncias químicas. Pulverização sobre o topo

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3/72 de uma espécie tolerante desejada também resulta na capacidade de atingir um potencial de rendimento máximo da espécie desejada devido à ausência de espécies competitivas. No entanto, a capacidade de usar tais tecnicas de pulverização-sobre é dependente da presença de espécies resistentes à imidazolinona da vegetação desejada na área de sobre-pulverização.

[005] Entre as principais safras agrícolas, algumas espécies leguminosas tal como soja são naturalmente resistentes a herbicidas de imidazolinona devido a sua capacidade de metabolizar rapidamente os compostos herbicidas (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33: 469471). Outras safras tal como milho (Newhouse e cols., 1992 Plant Physiol. 100: 882-886) e arroz (Barrette e cols., 1989 Crop Safeners for Herbicides, Academic Press New York, pp. 195-220) são algo suscetíveis a herbicidas de imidazolinona. A sensibilidade diferencial aos herbicidas de imidazolinona é dependente da natureza química do herbicida particular e metabolismo diferencial do composto de uma forma tóxica a uma forma não tóxica em cada planta (Shaner e cols., 1984 Plant Physiol. 76: 545-546; Brown e cols., 1987 Pestic. Biochm. Physiol. 27: 24-29). Outras diferenças fisiológicas das plantas tais como absorção e translocação também possuem um papel importante na sensibilidade (Shaner and Robinson, 1985 Weed Sci. 33: 469471).

[006] Cultivares de safra resistentes a imidazolinonas, sulfoniluréias e triazolopirimidinas foram produzidos de forma bem sucedida usando mutagênese de semente, microespório, pólen, e calo em Zea mays,

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Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glicinamax, e Nicotiana tabacum (Sebastian e cols., 1989 Crop Sci. 29: 1403-1408;

Swanson e cols., 1989 Theor. Appl. Genet. 78: 525-530; Newhouse e cols., 1991 Theor. Appl. Genet. 83: 65-70; Sathasivan e cols., 1991 Plant Physiol. 97: 1044-1050; Mourand e cols., 1993 J. Heredity 84: 91-96). Em todos os casos, um gene nuclear único, parcialmente dominante conferiu resistência. Quarto plantas de trigo resistentes à imidazolinona também foram previamente isoladas seguindo à mutagênese de semente de Triticum aestivum L. cv Fidel (Newhouse e cols., 1992 Plant Physiol. 100: 882-886). Estudos de hereditariedade confirmaram que um gene único, parcialmente dominante conferiu resistência. Baseado em estudos alélicos, os autores concluíram que as mutações nas quatro linhas identificadas estavam localizadas no mesmo lócus. Um dos genes de resistência de cultivar de Fidel foi desiganado FS-4 (Newhouse e cols., 1992 Plant Physiol. 100: 882-886).

[007] A modelagem baseada em computador da conformação tridimensional do complexo AHAS-inibidor prevê vários aminoácidos na bolsa de ligação de inibidor proposta como sítios onde mutação induzida confere provavelmente resistência seletiva a imidazolinonas (Ott e cols., 1996 J. Mol. Biol. 263: 359-368). Plantas de trigo produzidas com algumas dessas mutações racionalmente desenhadas no sítios de ligação propostos da enzima AHAS têm, de fato, exibido resistência específica a uma única classe de herbicidas (Ott e cols., 1996 J. Mol. Biol. 263: 359-368).

[008] A resistência da planta a herbicidas de

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5/72 imidazolinona tem sido relatada também em inúmeras patentes. Patentes U. S. Nos. 4.761.373, 5.331.107,

5.304.732, 6.211.438, 6.211.439 e 6.222.100 descrevem de forma geral p uso de um gene de AHAS alterado para elicitar resistência a herbicida em plantas, e especificamente revela certas linhas de milho resistentes à imidazolinona. Patente U.S. No. 5.013.659 revela plantas que exibem resistência a herbicida possuindo mutações em pelo menos um aminoácido em uma ou mais regiões conservadas. as mutações aqui descritas codificam resistência cruzada para imidazolinonas e sulfoniluréias ou resistência específica de sulfoniluréia, mas resistência específica a imidazolinona não é descrita. adicionalmente, a Patente U.S. No. 5.731.180 e Patente U.S. No. 5.767.361 discute um gene isolado tendo uma única substituição de aminoácido em uma seqüência de aminoácido de AHAS de monocotilédone de tipo selvagem que resulta em resistência específica a imidazolinona.

[009] Até hoje, a técnica anterior não descreveu plantas de trigo resistentes à imidazolinona contendo mais que um gene de AHAS alterado. A técnica anterior também não descreveu plantas de trigo resistentes à imidazolinona contendo mutações nos genomas outro que não o genoma do qual o gene FS-4 é derivado. Portanto, o que é necessário na técnica é a identificação de genes de resistência de imidazolinona de genomas adicionais. O que também são necessári9os na técnica são plantas de trigo tendo resistência aumentada a herbicidas tal como imidazolinona e contendo mais que um gene de AHAS alterado. Também necessários são métodos para controle de crescimento de

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6/72 erva daninha nas vizinhanças de tais plantas de trigo. Essas composições e métodos devem permitir o uso de técnicas de sobre-pulverização quando da aplicação de herbicidas a áreas contendo plantas de trigo.

SUMARIO DA INVENÇÃO [010] A presente invenção fornece plantas de trigo que compreende ácidos nucléicos IMI, onde a planta de trigo tem resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comprada a uma variedade de tipo selvagem da planta. As plantas de trigo podem conter um, dois, três ou mais ácidos nucléicos IMI. Em uma modalidade, a planta de trigo compreende múltiplos ácidos nucléicos IMI localizados em diferentes genomas. Preferivelmente, os ácidos nucléicos IMI codificam proteínas que compreendem uma mutação em uma seqüência de aminoácidos conservada selecionada do grupo que consiste em um domínio A, um domínio B, um domínio C, um domínio D e um domínio E. Mais preferivelmente, a mutação está em um domínio conservado E ou um domínio conservado C. Também são fornecidas partes de plantas e sementes de planta derivadas das plantas de trigo aqui descritas. Em uma outra modalidade, a planta de trigo compreende um ácido nucléico IMI que não é um ácido nucléico Imi1. o ácido nucléico IMI pode ser um ácido nucléico Imi2 ou Imi3, por exemplo.

[011] Os ácidos nucléicos IMI da presente invenção podem compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em: um polinucleotídeo de ID SEQ NO: 1; um polinucleotídeo de ID SEQ NO: 3; uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de ID SEQ NO: 2; uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um

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7/72 polipeptídeo de ID SEQ NO: 4, um polinucleotídeo que compreende pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados; e um polinucleotídeo complementar a qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados.

[012] As plantas da presente invenção podem ser transgênicas ou não transgênicas. Exemplos de plantas não transgênicas de trigo tendo resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona incluem uma planta de trigo tendo um Número de Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-3953 ou PTA-3955; ou a derivado mutante, recombinante, ou geneticamente construído, da planta com Número de Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-3953 ou PTA3955; ou de qualquer progênie da planta com Número de Designação de Depósito de Patente ATCC PTA-3953 ou PTA3955; ou a planta que é uma progênie de qualquer uma dessas plantas.

[013] Em adição às composições da presente invenção, vários métodos são fornecidos. Aqui descritos estão os métodos de modificação da tolerância de uma planta a um herbicida de imidazolinona que compreende a modificação da expressão de um ácido nucléico IMI na planta. Também são descritos métodos de produção de uma planta transgênica tendo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona que compreendem, transformação da célula de planta com um vetor de expressão que compreende um ou mais ácidos nucléicos IMI e geração da planta a partir da célula de planta. A invenção também inclui um método de controle de ervas daninhas na vizinhança de uma planta de trigo, que compreende a aplicação de um herbicida de imidazolinona às

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8/72 ervas daninhas e à planta de trigo, onde a planta de trigo tem resistência aumentada ao herbicida de imidazolinona quando comprada a uma variedade de tipo selvagem de uma planta de trigo e onde a planta compreende um ou mais ácidos nucléicos IMI. Em algumas modalidades preferidas desses métodos, as plantas compreendem múltiplos ácidos nucléicos IMI que estão localizados em diferentes genomas de trigo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [014] Figura 1 é uma tabela que mostra os resultados de avaliação única de planta de resistência de imazamox em populações F1 e parental resultantes de cruzamentos recíprocos entre linhas resistentes e CDC Teal. Os números apresentados representam o número de plantas pontuado em cada classe fenotípica. Linhas parentais são indicadas em negrito. O número de linhas parentais pontuado inclui aqueles pontuados com as populações F2.

[015] Figura 2 é uma tabela que mostra a reação a imazamox em populações F2 e BCF1 resultantes de cruzamentos entre linhas resistentes e CDC Teal e testes Qui-quadrado de modelos de lócus único e de dois lócus (15A x Teal) para controle de resistência. Os símbolos usados na Figura 2 indicam o seguinte: a) valor P de Qui-quadrado (1 df) representa a probabilidade de que desvios da proporção testada são devidos ao acaso apenas. Valores de P de Quiquadrado maiores que 0,05 indicam que os valores observados não eram significativamente diferentes dos valores esperados; b) valor P de qui-quadrado que representa a probabilidade de que desvios entre populações F2 resultantes de cruzamentos recíprocos entre CDC Teal e

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9/72 linhas resistentes são devidos ao acaso apenas. Valores de Qui-quadrado maiores que 0,05 indicam que as populações F2 recíprocas eram homogêneas, e os dados das duas populações recíprocas foram unidos; c) CDC Teal foi usado como o progenitor recorrente;

d) proporções testadas foram baseadas nos resultados da geração de F2; e e) -valor P de qui-quadrado (1 df) para proporção BCF1.

[016] Figura 3 é uma tabela que mostra os resultados de uma avaliação de resistência a imazamox em famílias de F2:3 resultantes de cruzamentos entre linhas resistentes e CDC Teal e testes de Qui-quadrado de modelos de lócus único e de dois lócus (15A x Teal) para controle de resistência. Os símbolos usados na Figura 3 indicam o seguinte: aproporções de segregação de família testadas foram baseadas nos resultados de das populações de F2 e BCF1; b- valor P de qui-quadrado (2 df) que representa a probabilidade de que desvios da proporção testada são devidos ao acaso apenas. Valores de P de qui-quadrado maiores que 0,05 indicam que valores observados não eram significativamente diferentes dos valores esperados.

[017] Figura 4 é uma tabela que mostra os resultados onde uma única avaliação de planta de resistência a imazamox em populações F2 que resulta de entrecruzamentos entre linhas resistentes. Proporções de Qui-quadrado testadas foram baseadas nos resultados de F2 e resultados da família F2:3 obtidos de cruzamentos entre linhas resistentes e CDC Teal. A proporção de 15:1 testada é para modelos de dois lócus e a proporção de 63:1 testada é para o modelo de três lócus. O símbolo “a” usado na Figura 4 indica o seguinte: valor P de qui-quadrado (1 df) que

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10/72 representa a probabilidade de que desvios da proporção testada são devidos ao acaso apenas. Valores de P de quiquadrado maiores que 0,05 indicam que valores observados não eram significativamente diferentes dos valores esperados.

[018] Figura 5 é uma tabela que mostra os resultados de uma avaliação de resistência a imazamox em famílias F2:3 que resulta de entrecruzamentos de segregação entre linhas resistentes. Os símbolos usados na Figura 5 indicam o seguinte: a - proporções de segregação de família testadas foram baseadas nos resultados das populações F2 examinadas; b - valor P de Qui-quadrado (2 df) que representa a probabilidade os desvios da proporção testada são devidos ao acaso apenas. Valores de P de qui-quadrado maiores que 0,05 indicam que valores observados não eram significativamente diferentes dos valores esperados.

[019] Figura 6 é uma tabela que compara o percentual d atividade de AHAs in vitro não inibida em quarto linhas de trigo na presença de concentrações crescentes do herbicida de imidazolinona imazamox. Teal é uma linha de tipo selvagem com nenhuma tolerância a herbicidas de imidazolinona enquanto BW755 contém o gene mutante FS4.

[020] Figura 7 é uma tabela que compara lesão sustentada por três genótipos de trigo quando tratados com uma taxa de 10X ou 30X de imazamox. A taxa de 1X é 20x10-5 g/m2. BW755 contém o gene mutante FS4. 15A/1lA é um volume de selfed progênie do cruzamento de Teal 11 A e Teal 15A. A população ainda não era homozigótica em todos os três lócus não alélicos.

[021] Figura 8 mostra um alinhamento de seqüência de

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DNA de genes de trigo Als1 e Imil parciais amplificados a partir de DNA genômico: CDC Teal (fileira 2; ID SEQ NO: 15 e

ID SEQ NO: 16), BW755 (fileira 3; ID SEQ NO: 17 e ID SEQ

NO:18), Teal IMI 10A (fileira 4; ID SEQ NO: 19 e SEQID NO : 20), Teal IMI 11A (fileira 5; ID SEQ NO: 21 e ID SEQ NO: 22), e Teal IMI 15A (fileira 6; ID SEQ NO: 23 e ID SEQ NO: 24). Seqüências parciais foram alinhadas com uma seqüência de gene de arroz ALS completa (fileira 1; ID SEQ NO:13 e ID SEQ NO:14) derivadas de Genbank (No. de Acesso ABO49822) e traduzida para seqüências de proteína (apresentadas sobre as seqüências de DNA). Os cinco domínios de aminoácido altamente conservados conhecidos por abrigarem mutações que conferem resistência a inibidores de AHAS são indicados em

negrito. Note	as	substituições	de guanina	para adenina	em
BW755, Teal	IMI	10A,	e Teal	IMI 15A	resulta	em	uma
substituição	de	serina	para	asparagina	(serina	627	em
arroz) no	domínio	IPSGG	(Domínio	E) do	gene

Als1. Conseqüentemente, os genes de resistência presentes nas plantas BW755, Teal IMI 10A, e Teal IMI 15A foram designados como parte da classe Imi1. Esses genes de resistência de Teal são referidos aqui como Teal IMI1 10A e

Teal IMIl 15A.

[022] Figura 9 mostra um alinhamento de seqüência de DNA de genes de trigo parciais Als2 e Imi2 amplificados a partir de DNA genômico: CDC Teal (fileira 2; ID SEQ NO: 25 e ID SEQ NO: 26), BW755 (fileira 3; ID SEQ NO: 27 e ID SEQ NO: 28), Teal IMI 10A (fileira 4; ID SEQ NO: 29 e ID SEQ NO: 30), Teal IMI 11A (fileira 5; ID SEQ NO: 31 e ID SEQ NO: 32) e Teal IMI 15A (fileira 6; ID SEQ NO: 33 e ID SEQ

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NO: 34). Seqüências parciais de AHAS foram alinhadas com uma seqüência completa de arroz AHAS (fileira 1; ID SEQ NO: 13 e ID SEQ NO: 14) derivadas de GenBank (No. de Acesso AB049822) e traduzidas em seqüências de proteínas (apresentadas acima da seqüência de DNAs). Os cinco domínios altamente conservados conhecidos por abrigar mutações que conferem resistência a inibidores de AHAS estão indicados em negrito. Note a substituição guanina para adenina em Teal IMI 11A, que resulta em uma substituição de serina para asparagina (serina 627 em arroz) no domínio IPSGG do gene Als2. Conseqüentemente, o gene de resistência presente em planta TealM11A foi designado como parte da classe Imi2 de ácidos nucléicos. Esse gene de resistência de Teal é aqui referido como Teal

designado
Esse	gene
IMI2	11A.
	[023]
Teal	IMI1

[023] Figura 10 mostra a seqüência parcial de DNA de Teal IMI1 15A (ID SEQ NO:1) e a seqüência de aminoácidos deduzida da mesma (ID SEQ NO: 2).

[024] Figura 11 mostra a seqüência parcial de DNA de Teal IMI2 11A (ID SEQ NO: 3) e a seqüência de aminoácidos deduzida da mesma (ID SEQ NO: 4).

[025] Figura 12 mostra a seqüência de ácidos nucléicos de tipo selvagem de Teal ALS1 ORF (ID SEQ NO:5), a ORF de Teal ALS2 (ID SEQ NO: 6) a ORF de Teal ALS3 (ID SEQ NO: 7).

[026] Figura 13 é uma representação esquemática das seqüências de aminoácidos conservadas nos genes AHAS envolvidos na resistência a vários inibidores de AHAS. O sítio de aminoácido específico responsável por resistência é indicado por um sublinhado. (Modificado de Devine, M. D.

e Eberlein, C. V., 1997 Physiological, biochemical and

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13/72 molecular aspects of herbicide resistance based on altered target sites in Herbicide Atividade: Toxicity, Biochemistry, and Molecular Biology, IOS Press Amsterdam,

p. 159-185).

DESCRIÇÃO DETALHADA [027] A presente invenção é direcionada a plantas de trigo, partes de planta de trigo e célula de plantas de trigo tendo resistência aumentada to herbicidas de imidazolinona. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas de trigo aqui descritas e métodos para controle de ervas daninhas na vizinhança das plantas de trigo aqui descritas. Deve ser entendido que, como usado na especificação e nas reivindicações, um ou uns pode significar um ou mais, dependendo do contexto no qual ele é usado. Assim, por exemplo, referência a uma célula pode significar que pelo menos uma célula pode ser utilizada.

[028] Como aqui usado, o termo planta de trigo se refere a uma planta que é um membro do gênero Triticum. As plantas de trigo da presente invenção podem ser membros do gênero Triticum incluindo, mas não limitadas a, T. aestivum, T. turgidum, T. timopheevii, T. monococcum, T zhukovskyi e T. urartu e híbridos dessas. Exemplos de subespécies de T. aestivum incluídos na presente invenção são aestivum (trigo comum), compactum (trigo do tipo club), macha (trigo macha), vavilovi (trigo vavilovi), spelta e sphaecrococcum (trigo do tipo shot). Exemplos de subespécies de T. turgidum incluídos na presente invenção são turgidum, carthlicum, dicoccon, durum, paleocolchicuna, polonicum, turanicum e dicoccoides. Exemplos de subespécies de T.monococcum incluídos na presente invenção são

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14/72 monococcum e aegilopoides. Em uma modalidade da presente invenção, a planta de trigo é um membro da espécie Triticum aestivum, e mais particularmente, o cultivar CDC Teal.

[029] O termo “planta de trigo” pretende englobar plantas de trigo em qualquer estágio de maturidade ou desenvolvimento assim como quaisquer tecidos ou órgãos (partes de plantas) tomadas ou derivadas de qualquer planta a menos que claramente indicado de outra forma pelo contexto. Partes de plantas incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, flores, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, culturas de antera, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, protoplastos e semelhantes. A presente invenção também inclui sementes produzidas pelas plantas de trigo da presente invenção. Em uma modalidade, as sementes são de procriação verdadeira para uma resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando compradas a uma variedade de tipo selvagem da semente de planta de trigo.

[030] A presente invenção descreve uma planta de trigo que compreende um ou mais ácidos nucléicos IMI, onde a planta de trigo tem resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade de tipo selvagem da planta. Como aqui usado, o termo “ácido nucléico IMI” se refere a um ácido nucléico que mutado de um ácido nucléico em uma planta de trigo de tipo selvagem que confere resistência a imidazolinona aumentada a uma planta na qual ela é transcrita. Ácidos nucléicos de Teal AHAS de tipo selvagem são mostrados nas ID SEQ NO: 5 (Teal ALS1 ORF), ID SEQ NO: 6 (Teal ALS2 ORF) e ID SEQ NO: 7 (Teal ALS3 ORF). Em uma modalidade, a planta

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15/72 de trigo compreende múltiplos ácidos nucléicos IMI. Como usado quando da descrição dos ácidos nucléicos IMI, o termo múltiplo se refere a ácidos nucléicos IMI que têm diferentes seqüências de nucleotídeos e não se refere a um mero aumento no número do mesmo ácido nucléico IMI. Por exemplo, os ácidos nucléicos IMI podem ser diferentes devido ao fato de que eles são derivados ou localizados em diferentes genomas de trigo.

[031] É possível para as plantas de trigo da presente invenção ter múltiplos ácidos nucléicos IMI de diferentes genomas já que essas plantas podem conter mais que um genoma. Por exemplo, uma planta de trigo Triticum aestivum contém três genomas algumas vezes referidos como os genomas A, B e D. Porque o AHAS é uma enzima metabólica necessária, assume-se que cada genoma tem pelo menos um gene que codifica para a enzima de AHAS, comumente vista com outras enzimas metabólicas em trigo hexaplóide que foi mapeado. O ácido nucléico de AHAS em cada genoma pode, e usualmente pode, diferir em sua seqüência de nucleotídeos de um ácido nucléico de AHAS em um outro genoma. Uma pessoa experiente na técnica pode determinar o genoma de origem de cada ácido nucléico de AHAS através de cruzamento genético e/ou métodos de seqüenciamento ou métodos de digestão de exonuclease conhecidos por aqueles experientes na técnica e como tambe4m descrito no Exemplo 2 abaixo. Para os objetivos dessa invenção, ácidos nucléicos IMI derivados de um dos genomas A, B ou D são distintos e designados como ácidos nucléicos Imi1, Imi2 ou Imi3.

[032] Não é determinado aqui que qualquer classe de ácido nucléico IMI particular está correlacionada com

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16/72 qualquer genoma A, B ou D particular. Por exemplo, não é determinado aqui que os ácidos nucléicos Imi1 estão correlacionados a ácidos nucléicos de genoma A, que ácidos nucléicos Imi2 estão correlacionados a ácidos nucléicos de genoma B, etc. As designações Imi1, Imi2 e Imi3 indicam meramente que os ácidos nucléicos IMI em cada classe não segrega independentemente, enquanto dois ácidos nucléicos IMI de diferentes classes segregam independentemente e portanto podem ser derivadas de diferentes genomas de trigo. A classe Imi1 de ácidos nucléicos inclui o gene FS-4 como descrito por Newhouse e cols. (1992 Plant Physiol. 100: 882-886) e o gene Teal IMI1 15A descrito em maiores detalhes abaixo. A classe Imi2 de ácidos nucléicos inclui p gene Teal IMI2 11A descrito abaixo. Cada classe IMI pode incluir membros de diferentes espécies de trigo. Portanto, cada classe IMI inclui ácidos nucléicos IMI que diferem em sua seqüência de nucleotídeos mas que são todavia designadas como se originando de, ou sendo localizadas no, mesmo genoma de trigo usando estudos de hereditariedade como descrito nos Exemplos abaixo e conhecidos por aqueles de experiência comum na técnica.

[033] Conseqüentemente, a presente invenção inclui uma planta de trigo que compreende um ou mais ácidos nucléicos IMI, onde a planta de trigo tem resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade de tipo selvagem da planta e onde um ou mais ácidos nucléicos IMI são selecionados de um grupo que consiste em um ácido nucléico Imi1, Imi2 e Imi3. Em uma modalidade, a planta compreende um ácido nucléico Imi1 e um ácido nucléico Imi3. Em uma modalidade preferida, o ácido

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17/72 nucléico Imi1 compreende a seqüência de polinucleotídeos mostrada em ID SEQ NO: 1. Em uma outra modalidade, a planta compreende um ácido nucléico Imi2. Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico Imi2 compreende a seqüência de polinucleotídeos mostrada em ID SEQ NO: 3.

[034] Como aqui usado com relação a ácidos nucléicos, o termo de se refere a um ácido nucléico “localizado em” ou derivado de um genoma particular. O termo localizado em se refere a um ácido nucléico contido naquele genoma particular. Como também usado aqui em relação ao genoma, o termo derivado de se refere a um ácido nucléico que foi removido ou isolado daquele genoma. O termo isolado é definido em maiores detalhes abaixo.

[035] Em uma outra modalidade, a planta de trigo compreende um ácido nucléico IMI, onde o ácido nucléico é um ácido nucléico não-Imil. O termo não-Imil, se refere a um ácido nucléico IMI que não é um membro da classe Imi1 como descrito acima. Exemplos de ácidos nucléicos da classe Imi1 são mostrados nas fileiras 3, 4 e 5 da Figura 8. Um exemplo de ácido nucléico não-Imi1 é mostrado na fileira 5 da Figura 8. Conseqüentemente, em uma modalidade preferida, a planta de trigo compreende um ácido nucléico IMI que compreende a seqüência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de ID SEQ NO: 4. A seqüência de polinucleotídeos pode compreender a seqüência mostrada em ID SEQ NO: 3.

[036] A presente invenção inclui plantas de trigo que compreendem um, dois, três ou mais ácidos nucléicos IMI, onde a planta de trigo tem resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade

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18/72 de tipo selvagem da planta. Os ácidos nucléicos IMI podem compreender uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste em um polinucleotídeo de ID SEQ NO:1; um polinucleotídeo de ID SEQ NO: 3; uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de ID SEQ NO: 2; uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de ID SEQ NO: 4, um polinucleotídeo que compreende pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados; e um polinucleotídeo complementar a qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados.

[037] O herbicida de imidazolinona pode ser selecionado de, mas não é limitado a, PURSUIT® (imazethapyr), CADRE® (imazapic), RAPTOR® (imazamox),

SCEPTER® (imazaquin), ASSERT® (imazethabenz), ARSENAL® (imazapyr), um derivado de qualquer um dos herbicidas anteriormente mencionados, ou uma mistura de dois ou mais dos herbicidas anteriormente mencionados, por exemplo, imazapyr/imazamox (ODYSSEY®). Mais especificamente, o herbicida de imidazolinona pode ser selecionado de, mas não limitado a, ácido (4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidiazolin2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil)-4-metil-5-oxo-2imidazolin-2-il)-3-quinolina-carboxílico, ácido 5-etil-2(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5(metoximetil)-nicotínico, ácido 2-(4-isopropil-4-metil-5oxo-2-imidazolin-2-il)-5-metil-nicotínico, e uma mistura de metil 6-(4-isopropil-4- metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-mtoluato e metil 2-(4-isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin2-il)-p-toluato. O uso de ácido 5-etil-2-(4-isopropil-4Petição 870180062833, de 20/07/2018, pág. 43/117

19/72 metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-nicotínico e ácido 2-(4isopropil-4-metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)nicotínico é preferido. O uso de ácido 2-(4-isopropil-4metil-5-oxo-2-imidazolin-2-il)-5-(metoximetil)-nicotínico é particularmente preferido.

[038] Em uma modalidade, a planta de trigo compreende dois ácidos nucléicos IMI, onde os ácidos nucléicos são derivados de ou localizados em diferentes genomas de trigo. Preferivelmente, um dos dois ácidos nucléicos é um ácido nucléico Imi1, e mais preferivelmente compreende a seqüência de polinucleotídeos de ID SEQ NO: 1. Em uma outra modalidade, a planta de trigo compreende um ácido nucléico IMI, onde o ácido nucléico compreende a seqüência de polinucleotídeos de ID SEQ NO:1 ou ID SEQ NO: 3. Ainda em uma outra modalidade, a planta de trigo compreende três ou mais ácidos nucléicos IMI onde cada ácido nucléico é de um diferente genoma. Preferivelmente, pelo menos um dos três ácidos nucléicos IMI compreende uma seqüência de polinucleotídeos selecionada do grupo que consiste em ID SEQ NO: 1 e ID SEQ NO: 3.

[039] Em uma modalidade preferida da presente invenção, um ou mais ácidos nucléicos IMI contidos na planta codificam uma seqüência de aminoácidos que compreende uma mutação em um domínio que é conservado entre várias proteínas AHAS. Esses domínios conservados são aqui referidos como Domínio A, Domínio B, Domínio C, Domínio D e Domínio E. Figura 13 mostra a localização geral de cada domínio em uma proteína AHAS. Como aqui usado, Domínio A contém a seqüência de aminoácidos AITGQVPRRMIGT (ID SEQ NO:8); Domínio B contém a seqüência de aminoácidos QWED (ID

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SEQ NO: 9); Domínio C contém a seqüência de aminoácidos VFAYPGG ASMEIHQALTRS (ID SEQ NO: 10); Domínio D contém a seqüência de aminoácidos AFQETP (ID SEQ NO: 11); Domínio E contém a seqüência de aminoácidos IPSGG (ID SEQ NO: 12). A presente invenção também contempla que pode haver leves variações nos domínios conservados, por exemplo, em ervas cizônias, o resíduo de serina no Domínio E é substituído por um resíduo de alanina.

[040] Conseqüentemente, a presente invenção inclui uma planta de trigo que compreende um ácido nucléico IMI que codifica uma seqüência de aminoácidos tendo uma mutação em um domínio conservado selecionado do grupo que consiste em um domínio A, um domínio B, um Domínio C, um domínio D e um domínio E. Em uma modalidade, a planta de trigo compreende um ácido nucléico IMI que codifica uma seqüência de aminoácidos tendo uma mutação em um domínio E. Em uma modalidade preferida adicional, as mutações nos domínios conservados ocorrem nas localizações indicadas pelo seguinte sublinhado: GG/GqGPrrGIGT (ID SEQ NO: 8); OWED (ID

SEQ NO: 9);	VFAYPGGASMEIHQALTRS	(ID SEQ NO: 10); AFQETP	(ID
SEQ NO: 11)	e IPSGG (ID SEQ	NO: 12). Uma substituição
preferida é 12).	asparagina por serina no Domínio E (ID SEQ	NO:
[041] As plantas de trigo	aqui descritas podem	ser
plantas de	trigo transgênicas	ou plantas de trigo	não
transgênicas	. Como aqui usado,	o termo transgênica	se
refere a qualquer planta, célula	de planta, calo, tecido	de

planta ou parte de planta, que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em vários casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante é

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21/72 adequadamente integrado em um cromossomo ou elemento estável extracromossômico, de forma que ele seja passado a gerações sucessivas. Para os objetivos da invenção, o termo polinucleotídeo recombinante” se refere a um polinucleotídeo que foi alterado, rearranjado ou modificado por engenharia genética. Exemplos incluem qualquer polinucleotídeo, ou polinucleotídeos clonados, que são unidos ou ligados a seqüências heterólogas. O termo recombinante” não se refere a alterações de polinucleotídeos que resultam de eventos de ocorrência natural, tal como mutações espontâneas, ou de mutagênese não espontânea seguido por reprodução seletiva. Plantas contendo mutações que surgem devido a mutagênese não espontânea e reprodução seletiva são preferidas são aqui referidas como plantas não transgênicas e estão incluídas na presente invenção. Em modalidades onde a planta de trigo é transgênica e compreende múltiplos ácidos nucléicos IMI, os ácidos nucléicos podem ser derivados de diferentes genomas ou do mesmo genoma. Alternativamente, em modalidades onde a planta de trigo é não transgênica e compreende múltiplos ácidos nucléicos IMI, os ácidos nucléicos estão localizados em diferentes genomas.

[042] Um exemplo de um cultivar de planta de trigo não transgênica que compreende um ácido nucléico IMI é o cultivar de planta depositado com o ATCC sob o Número de Designação de Depósito de Patente PTA-3953 e designada aqui como o cultivar de trigo Teal IMI 11A. O cultivar de trigo Teal IMI 11A contém um ácido nucléico Imi2. As seqüências de nucleotídeos parciais e seqüências de aminoácidos deduzidas que correspondem ao gene de Teal

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IMI2 11A são mostradas em ID SEQ NO: 3 e ID SEQ NO: 4, respectivamente. A única porção das seqüências não incluídas em ID SEQ NO: 3 e ID SEQ NO: 4 são aquelas seqüências que codificam e que correspondem a uma seqüência sinalizadora que é clivada da proteína madura de Teal IMI2 11A. Conseqüentemente, ID SEQ NO: 4 representa a seqüência deduzida completa da proteína madura de Teal IMI2 11A.

[043] Um exemplo de um cultivar de planta de trigo que compreende dois ácidos nucléicos IMI em diferentes genomas é o cultivar de planta depositado com o ATCC sob o Número de Designação de Depósito de Patente PTA-3955 e e designada aqui como o cultivar de trigo Teal IMI 15A. O cultivar de trigo Teal IMI 15A contém ácidos nucléicos Imi1 e Imi3. O ácido nucléico Imi1 compreende uma mutação que resulta em uma mudança de serina para asparagina proteína IMI codificada com essa. Os genes AHAS mutados são designados aqui como Teal IMI1 15A e Teal IMI3 15A. As seqüências de nucleotídeos parciais e seqüências de aminoácidos deduzidas que correspondem ao gene de Teal IMIl 15A são mostradas nas ID SEQ NO: 1 e ID SEQ NO: 2, respectivamente. A unia porção das seqüências não incluída em ID SEQ NO: 1 e ID SEQ NO: 2 são aquelas seqüências que codificam e que correspondem a aproximadamente 100-150 pares de base na extremidade 5' e aproximadamente 5 pares de base na extremidade 31 da região codificadora.

[044] Depósitos separados de 2500 sementes dos cultivares de trigo Teal IMI 11A e Teal IMI 15A foram feitos com a “American Type Culture Collection”, Manassas,

Virginia em 3 de janeiro de 2002. Esses depósitos foram feitos de acordo com os termos e disposições do Tratado de

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Budapeste relacionado ao depósito de microorganismos. Os depósitos foram feitos por um termo de pelo menos trinta anos e pelo menos cinco anos depois que o mais recente requerimento para o fornecimento de uma amostra do depósito é recebido pelo ATCC. As sementes depositadas foram concedidas com os Números de Designação de Depósito de Patente

PTA-3953 (Teal IMI 11A) e PTA-3955 (Teal IMI 15A).

[045] A presente invenção inclui a planta de trigo tendo um a Número de Designação de Depósito de Patente PTA3953 ou PTA-3955; um derivado da planta mutante, recombinante, ou geneticamente construído com Número de Designação de Depósito de Patente PTA3953 ou PTA-3955; qualquer progênie da planta com Número de Designação de Depósito de Patente PTA-3953 ou PTA-3955; e a planta que é a progênie de qualquer dessas plantas. Em uma modalidade preferida, a planta de trigo da presente invenção adicionalmente tem as características de resistência a herbicida da planta com Número de Designação de Depósito de

Patente PTA-3953 ou PTA-3955.

[046] Também incluídos na presente invenção estão híbridos dos cultivares de trigo Teal IMI 11A e Teal IMI 15A aqui descritos. Exemplo 5 demonstra híbridos de Teal IMI llA/Teal IMI 15A tendo resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona. A presente invenção também inclui híbridos dos cultivares de trigo Teal IMI 11A ou Teal IMI 15A e um outro cultivar de trigo. O outro cultivar de trigo inclui, mas não é limitado a, T. aestivum L. cv Fidel e qualquer cultivar de trigo que ancora um gene mutante FS-1, FS-2, FS-3 ou FS-4. (veja Patente U.S. No.

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6.339.184 e Pedido de Patente U. S. No. 08/474.832). Em uma modalidade preferida, a planta de trigo é um híbrido entre um cultivar de Teal IMI 11A e um cultivar de Fidel

FS-4. Os híbridos de Teal IMI 11A/FS-4 compreendem um ácido nucléico Imi1 e um ácido nucléico Imi2. Um híbrido de cultivar de Teal IMI11A e a Fidel que ancora o gene FS-4 está incluído na presente invenção e foi depositado com a “American Type Culture Collection, Manassas, Virginia em 3 de janeiro de 2002. Esse depósito foi feito de acordo com os termos e disposições do Tratado de Budapeste em relação ao depósito de microorganismos. O depósito foi feito por um termo de pelo menos trinta anos e pelo menos cinco anos depois que o mais recente requerimento para o fornecimento de uma amostra do depósito é recebido pelo ATCC. As sementes depositadas foram concedidas com o Número de Designação de Depósito de Patente PTA-3954.

[047] Os termos “cultivar” e “variedade” se referem ao grupo de plantas em uma espécie definida por partilhar um conjunto comum de características ou traços aceitos por aqueles experientes na técnica como suficientes para distinguir um cultivar ou variedade de um outro cultivar ou variedade. Não há qualquer implicação em cada um dos termos de que todas as plantas de qualquer cultivar dado ou variedade serão geneticamente idênticos no gene completo ou nível molecular ou que qualquer planta dada será homozigótica em todos os lócus. Um cultivar ou variedade é considerado de “reprodução verdadeira” para um traço particular se, quando o cultivar ou variedade de reprodução verdadeira é auto-polinizado, toda a progênie contém o traço. Na presente invenção, o traço surge de uma mutação

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25/72 em um gene AHAS da planta de trigo ou semente.

[048] Deve ser entendido que a planta de trigo da presente invenção pode compreender um gene AHAS de tipo selvagem ou não-mutado em adição a um gene IMI. Como descrito no Exemplo 4, deve ser contemplado que cultivar de trigo Teal IMI 11A contém uma mutação em apenas uma das múltiplas isoenzimas de AHAS e que o cultivar de trigo Teal IMI 15A contém uma mutação em apenas duas das múltiplas isoenzimas de AHAS. Portanto, a presente invenção inclui uma planta de trigo que compreende um ou mais ácidos nucléicos IMI em adição a um ou mais ácidos nucléicos de AHAS de tipos selvagem ou não mutado.

[049] Em adição a plantas de trigo, a presente invenção engloba proteínas e ácidos nucléicos IMI isolados. Os ácidos nucléicos compreendem um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em um polinucleotídeo de ID SEQ NO:1; um polinucleotídeo de ID SEQ NO: 3; uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de ID SEQ NO: 2; uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de ID SEQ NO: 4, um polinucleotídeo que compreende pelo menos 60 nucleotídeos consecutivos de qualquer um dos polinucleotídeos acima mencionados; e um polinucleotídeo complementar a qualquer um dos acima mencionados polinucleotídeos. Em uma modalidade preferida, o ácido nucléico IMI compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo de ID SEQ NO: 2 ou ID SEQ NO: 4. Em uma modalidade preferida adicional, o ácido nucléico IMI compreende uma seqüência de polinucleotídeos de ID SEQ NO:1 ou ID SEQ NO:

3.

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26/72 [050] O termo “proteína AHAS” se refere a uma proteína acetohidroxi-ácido sintase e o termo “proteína IMI” se refere a qualquer proteína AHAS que é mutada a partir de um tipo selvagem proteína AHAS e que confere resistência a imidazolinona aumentada a uma planta, célula de planta, parte de planta, semente de planta ou tecido de planta quando ela é expressa nessa. Em uma modalidade preferida, a proteína IMI compreende um polipeptídeo de ID SEQ NO: 2 ou ID SEQ NO: 4. Como também usado aqui, os termos “ácido nucléico” e “polinucleotídeo” se referem a RNA ou DNA que é linear ou ramificado, de filamento único ou duplo, ou um híbrido desses. O termo também engloba híbridos de RNA/DNA. Esses termos também englobam seqüência não traduzida localizada nas extremidades 3' e 5' da região codificadora do gene: pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos de seqüência acima da extremidade 5' da região codificadora e pelo menos cerca de 200 nucleotídeos da seqüência abaixo da extremidade 3' da região codificadora do gene. Bases menos comuns, tais como inosina, 5-metilcitosina, 6metiladenina, hipoxantina e outras também podem ser usadas para dsRNA anti-senso e pareamento de ribozima. Por exemplo, polinucleotídeos que contêm análogos de propina C5 de uridina e citidina mostraram ligar RNA com alta afinidade e serem potentes inibidores anti-senso de expressão de gene. Outras modificações, tal como modificação à estrutura de fosfodiéster, ou o 2'hidroxi no grupo e açúcar ribose do RNA também podem ser feitas. Os polinucleotídeos e ribozimas anti-senso podem consistir inteiramente em ribonucleotídeos, ou podem conter ribonucleotídeos misturados e desoxirribonucleotídeos. Os

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27/72 polinucleotídeos da invenção podem ser produzidos por vários meios, incluindo preparações genômicas, preparações de cDNA, síntese in vitro, RT-PCR e transcrição in vitro ou in vivo.

que codificam outros um ácido nucléico nucléico polipeptídeos) “isolado” é [051] Uma molécula de ácido nucléico “isolada” é uma que é substancialmente separada de outra molécula de ácido nucléicos, que estão presentes na fonte natural do ácido ou seja, seqüências

Preferivelmente, livre de algumas das seqüências que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (ou seja, seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucléico) em seu réplicon de ocorrência natural. Por exemplo, um ácido nucléico clonado é considerado isolado. Em várias modalidades, a molécula de ácido nucléico IMI isolada pode conter menos que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb ou 0,1 kb de seqüências de nucleotídeos que naturalmente flanqueiam a molécula de ácido nucléico em DNA genômico da célula da qual o ácido nucléico é derivado (por exemplo, uma célula de Triticum aestivuma). Um ácido nucléico também é considerado isolado se ele foi alterado por intervenção humana, ou colocado em um lócus ou localização que não é seu sítio natural, ou se ele é introduzido em uma célula por agroinfecção ou biolística. Além disso, uma molécula de ácido nucléico “isolada”, tal como uma molécula de cDNA, pode ser livre de alguns dos outros materiais celulares com os quais ela é naturalmente associada, ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou precursores químicos ou outras substâncias químicas quando quimicamente sintetizada.

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28/72 [052] Especificamente excluídos da definição de “ácidos nucléicos isolados” estão: cromossomos de ocorrência natural (tal como difusão de cromossomo), bibliotecas de cromossomo artificial, bibliotecas genômica, e bibliotecas de cDNA que existem como uma preparação in vitro de ácido nucléico ou como uma preparação de célula hospedeira transfectada/transformada, onde as células hospedeiras são uma preparação heterogênea in vitro ou plaqueadas como uma população heterogênea de colônias únicas. Também especificamente excluídas são as bibliotecas acima onde um ácido nucléico especificado constrói menos que 5% do número de inserções de ácido nucléico nas moléculas de vetor. Também especificamente excluído é o DNA genômico de célula inteiras ou preparações de RNA de célula inteira (incluindo preparações de célula inteira que são mecanicamente removidas ou enzimaticamente digeridas). Ainda especificamente excluídas são as preparações de célula inteira encontradas como uma preparação in vitro ou como uma mistura heterogênea separada por eletroforese onde o ácido nucléico da invenção não foi adicionalmente separado dos ácidos nucléicos heterólogos no meio de eletroforese (por exemplo, separação adicional por excisão de uma única banda de uma população de banda heterogênea em um gel de agarose ou mancha de nylon).

[053] Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção, por exemplo, uma molécula de ácido nucléico contendo uma seqüência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 1, ID SEQ NO: 3 ou uma porção dessas, pode ser isolada usando técnicas padrão de biologia molecular e uma informação de seqüência aqui fornecida. Por exemplo, um cDNA de IMI de T.

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29/72 aestivum pode ser isolado de uma biblioteca de T.aestivum usando toda ou uma porção da seqüência de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3. Além disso, uma molécula de ácido nucléico que engloba toda ou uma porção de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 pode ser isolada da reação de cadeia de polimerase usando iniciadores de oligonucleotídeo desenhados baseado nessa seqüência. Por exemplo, mRNA pode ser isolado de célula de plantas (por exemplo, pelo procedimento de extração de guanidino-tiocianato de Chirgwin e cols., 1979 Biochemistry 18 : 52945299) e cDNA pode ser preparado usando transcriptase reversa (por exemplo, transcriptase reversa Moloney MLV, disponível por Gibco/BRL, Bethesda, MD; ou transcriptase reversa AMV, disponível por Seikagaku America,Inc., St. Petersburg, FL). Iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos para amplificação de reação de cadeia de polimerase podem ser desenhados baseado na seqüência de nucleotídeos mostrada em ID SEQ NO:1 ou ID SEQ NO: 3. Uma molécula de ácido nucléico da invenção pode ser amplificada usando cDNA ou, alternativamente, DNA genômico, como um modelo e iniciadores de oligonucleotídeo adequados de acordo com técnicas padrão de amplificação de PCR . A molécula de ácido nucléico assim amplificada pode ser clonada em um vetor adequado e caracterizada por análise de seqüência de DNA. Além disso, oligonucleotídeos que correspondem a uma seqüência de nucleotídeos de IMI podem ser preparados por técnicas sintéticas padrão, por exemplo, usando um sintetizador de DNA automatizado.

[054] Os ácidos nucléicos IMI da presente invenção podem compreender seqüências que codificam uma proteína IMI (ou seja, “regiões codificadoras”), assim como seqüências

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5' não traduzidas e seqüências 3' não traduzidas: alternativamente, a molécula de ácido nucléicos da presente invenção pode compreender apenas as regiões codificadoras de um gene IMI, ou podem conter fragmentos genômicos inteiros isolados de DNA genômico. A região codificadora dessas seqüências é indicada como uma “posição de ORF”. Além disso, a molécula de ácido nucléico da invenção pode compreender uma porção da região codificadora de um gene IMI, por exemplo, um fragmento que pode ser usado como um marcador ou iniciador. As seqüências de nucleotídeos determinadas da clonagem dos genes IMI de T. aestivum permitem a geração de marcadores e iniciadores desenhados para uso na identificação e/ou clonagem de homólogos de IMI em outros tipos de célula e organismos, assim como homólogos de IMI de outras plantas de trigo e espécies relacionadas. A porção da região codificadora também pode codificar um fragmento biologicamente ativo de uma proteína

IMI.

[055] Como aqui usado, o termo “porção biologicamente ativa de” uma proteína IMI pretende incluir uma porção, por exemplo, um domínio/motivo, de uma proteína IMI que, quando produzida em uma planta aumenta a resistência da planta a um herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade de tipo selvagem da planta. Métodos para quantificação da resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona são fornecidos nos Exemplos fornecidos abaixo. Porções biologicamente ativas de uma proteína IMI incluem peptídeos codificados pelas seqüências de polinucleotídeos que compreendem ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 que incluem menos aminoácidos que uma proteína IMI de

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31/72 comprimento total e transmitem resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona sob expressão em uma planta. Tipicamente, porções biologicamente ativas (por exemplo, peptídeos que têm, por exemplo, 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 ou mais aminoácidos em comprimento) compreendem um domínio ou motivo com pelo menos uma atividade de uma proteína IMI. Além disso, outras porções biologicamente ativas nas quais outras regiões do polipeptídeo são deletadas, podem ser preparadas por técnicas recombinantes e avaliadas para uma ou mais das atividades aqui descritas. Preferivelmente, as porções biologicamente ativas de uma proteína IMI incluem um ou mais domínios conservados selecionados do grupo que consiste em um domínio A, um Domínio B, um domínio C, um domínio D e um domínio E, onde o domínio conservado contém uma mutação.

[056] A invenção também fornece polipeptídeos quimérico ou de fusão de IMI. Como aqui usado, um polipeptídeo quimérico ou polipeptídeo de fusão” de IMI compreende uma polipeptídeo IMI operacionalmente ligado a um polipeptídeo não-IMI. Um polipeptídeo não-IMI se refere a um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos que não é substancialmente idêntica a um polipeptídeo IMI, por exemplo, um polipeptídeo que não é uma isoenzima IMI, cujo peptídeo realiza uma função diferente que um polipeptídeo IMI. No polipeptídeo de fusão, o termo operacionalmente ligado pretende indicar que o polipeptídeo IMI e é o polipeptídeo não-IMI são fundidos um ao outro de forma que ambas as seqüências realizem a função proposta atribuída à seqüência usada. O polipeptídeo nãoPetição 870180062833, de 20/07/2018, pág. 56/117

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IMI pode ser fundido ao terminal-N ou terminal-C do polipeptídeo IMI. Por exemplo, em uma modalidade, o polipeptídeo de fusão é um polipeptídeo de fusão GST-IMI no qual a seqüência de IMI é fundida ao terminal-C da seqüência de GST. Tais polipeptídeos de fusão pode facilitar a purificação de polipeptídeos IMI recombinantes. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo de fusão é um polipeptídeo IMI contendo uma seqüência sinalizadora heteróloga em seu terminal-N. Em certas células hospedeiras (por exemplo, células hospedeiras de mamíferos), a expressão e/ou secreção de um polipeptídeo IMI pode ser aumentada através do uso de uma seqüência sinalizadora heteróloga.

[057] Uma molécula de ácido nucléico isolada que codifica e um polipeptídeo IMI tendo identidade de seqüência a um polipeptídeo codificado por uma seqüência de polinucleotídeos de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 pode ser criada por introdução de uma ou mais substituições de nucleotídeo, adições ou deleções em uma seqüência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 de forma que uma ou mais substituições de aminoácido, adições ou deleções são introduzidas no polipeptídeo codificado. Mutações podem ser introduzidas em uma seqüência de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 por técnicas padrão, tal como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR. Preferivelmente, substituições de aminoácido conservadoras são feitas em um ou mais resíduos de aminoácido não essenciais previstos.

[058] Uma “substituição de aminoácido conservadora” é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um

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resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral	similar.
Famílias de resíduo de aminoácidos tendo cadeias	laterais
similares foram definidas na técnica. Essas	famílias

incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,

cisteína), cadeias laterais não polares (por	exemplo,
alanina, valina, leucina, isoleucina,	prolina,
fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias	laterais
beta-ramificadas (por exemplo, treonina,	valina,
isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por	exemplo,

tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Portanto, um resíduo de aminoácido não essencial previsto em um polipeptídeo IMI é preferivelmente substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral. Alternativamente, em uma outra modalidade, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma seqüência codificadora de IMI, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem

ser classificados para uma atividade de IMI aqui	descrita
para identificar mutantes que retêm atividade	de IMI.
Seguindo a mutagênese da seqüência de ID SEQ NO:	1 ou ID

SEQ NO: 3, o polipeptídeo codificado pode ser expresso de forma recombinante e a atividade do polipeptídeo pode ser determinada por análise da resistência a imidazolinona da planta que expressa o polipeptídeo como descrito nos Exemplos abaixo.

[059] Para determinar o percentual de identidade de

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34/72 seqüência das duas seqüências de aminoácidos (por exemplo, ID SEQ NO: 2 ou ID SEQ NO: 4 e uma forma mutante dessa), as seqüências são alinhadas para objetivos de comparação ótima (por exemplo, intervalos podem ser introduzidos em uma seqüência de um polipeptídeo para alinhamento ótimo com o outro polipeptídeo). Os resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácido correspondentes são então comparados. Quando uma posição em uma seqüência (por exemplo, ID SEQ NO: 2 ou ID SEQ NO: 4) é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido como a posição correspondente na outra seqüência (por exemplo, uma forma mutante de ID SEQ NO: 2 ou ID SEQ NO: 4), então as moléculas são idênticas naquela posição. O mesmo tipo de comparação pode ser feito entre duas seqüências de ácido nucléico. O percentual de identidade de seqüência entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas partilhadas pelas seqüências (ou seja, percentual de identidade de seqüência = números de posições idênticas/números totais de posições x 100). Para os objetivos da invenção, o percentual de identidade de seqüência entre duas seqüências de ácido nucléico ou polipeptídeo é determinado usando o pacote de programa de computador Vetor NTI 6.0 (PC) (InforMax, 7600 Wisconsin Ave., Bethesda, MD 20814). Uma função de tratamento máximo da abertura dos intervalos de 15 uma função de tratamento máximo para a extensão dos intervalos 6,66 são usadas para determinar o percentual de identidade de dois ácidos nucléicos. Uma função de tratamento máximo da abertura dos intervalos de 10 uma função de tratamento máximo para a extensão dos intervalos 0,1 são usadas para determinar o percentual de identidade de dois

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35/72 polipeptídeos. Todos os outros parâmetros são ajustados na configuração padrão. Deve ser entendido que para os objetivos de determinação da identidade de seqüência, quando da comparação de uma seqüência de DNA a uma seqüência de RNA, um nucleotídeo de timidina é equivalente a um nucleotídeo de uracil. Preferivelmente, os polipeptídeos IMI isolados incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% ou 90-95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticos a uma seqüência de aminoácidos inteira codificada por uma seqüência de polinucleotídeos mostrada em ID SEQ NO:1 ou ID SEQ NO: 3. Em uma outra modalidade, os polipeptídeos IMI isolados incluídos na presente invenção são pelo menos cerca de 50-60%, preferivelmente pelo menos cerca de 60-70%, e more preferivelmente pelo menos cerca de 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90% ou 90-95%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idênticos a uma seqüência de aminoácidos inteira mostrada em ID SEQ NO: 2 ou ID SEQ NO: 4.

[060] Adicionalmente, ácidos nucléicos IMI otimizados podem ser criados. Preferivelmente, um ácido nucléico IMI otimizado codifica um polipeptídeo IMI que modula a tolerância da planta aos herbicidas de imidazolinona, e mais preferivelmente aumenta a tolerância da planta a um herbicida de imidazolinona sob sua sobre-expressão na planta. Como aqui usado, otimizado se refere a um ácido nucléico que é geneticamente construído para aumentar sua expressão em uma dada planta ou animal. Para fornecer

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36/72 ácidos nucléicos IMI otimizados de planta, a seqüência de DNA do gene pode ser modificada para 1) compreender códons preferidos por genes de planta altamente expressos; 2) compreender um conteúdo A+T na composição de base de nucleotídeo para aquela substancialmente encontrada em plantas; 3) formar uma seqüência de iniciação de planta, 4) eliminar seqüências que causam desestabilização, poliadenilação inadequada, degradação e terminação de RNA, ou que formam grampos de estruturas secundárias ou sítios de junção de RNA. Expressão de ácidos nucléicos IMI aumentada em plantas pode ser atingida por utilização da freqüência de distribuição de uso de códon em plantas em uma planta geral ou particular. Métodos para otimizar a expressão de ácido nucléico em plantas podem ser encontrados em EPA 0359472; EPA0385962; Aplicação PCT No. WO 91/16432; Patente U.S. No. 5.380.831; Patente U.S. No. 5.436.391; Perlack e cols., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324-3328; e Murray e cols., 1989 Nucleic Acids Res. 17: 477-498.

[061] Como aqui usado, freqüência de uso de códon preferido se refere à preferência exibida por uma célula hospedeira específica em uso de códons de nucleotídeos para especificar um dado aminoácido. Para determinar a freqüência de uso de um particular códon em um gene, o número de ocorrências daquele códon no gene é dividido pelo número total de ocorrências de todos os códons especificando o mesmo aminoácido no gene. De modo similar, a freqüência de uso de códon preferido exibida pela célula hospedeira pode ser calculada pela freqüência média de uso de códon preferido em um grande número de genes expressos

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37/72 pela célula hospedeira. É preferível que essa análise seja limitada a genes que são altamente expressos pela célula hospedeira. O desvio percentual da freqüência de uso de códon preferido par um gene sintético daquele empregado pela célula hospedeira é calculado primeiro por determinação do desvio percentual da freqüência de uso de um único códon daquele da célula hospedeira seguido por obtenção do desvio médio sobre todos os códons. Como aqui definido, esse cálculo inclui códons únicos (ou seja, ATG e TGG). Em termos gerais, o desvio médio total do uso de códon de um gene otimizado daquele da célula hospedeira é calculado usando a equação 1A = n = 1 Z Xn - Yn Xn vezes 100 Z onde Xn = freqüência de uso para códon n em uma célula hospedeira; Yn = freqüência de uso para códon n no gene sintético, n representa um códon individual que especifica um aminoácido e o número total de códons é Z. O desvio total da freqüência de uso de códon, A, para todos aminoácidos deve preferivelmente ser de menos que cerca de 25%, e mais preferivelmente menos que cerca de 10%.

[062] Portanto, um ácido nucléico IMI pode ser otimizado de forma que sua freqüência de distribuição de uso de códon desvia, preferivelmente, não mais que 25% daquela de genes de planta altamente expressos e, mais preferivelmente, não mais que cerca de 10%. Em adição, é dada consideração ao conteúdo percentual de G+C da terceira base degenerada (monocotilédones parecem favorecer G+C nessa posição, enquanto dicotilédones não favorecem). É reconhecido que o nucleotídeo XCG (onde X é A, T, C, ou G) é o códon menos preferido em dicotilédones enquanto o códon XTA é evitado em ambos monocotilédones e dicotilédones.

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Ácidos nucléicos IMI otimizados dessa invenção também têm preferivelmente CG e TA índice de evitação de duplicidade intimamente se aproximando daquele da planta hospedeira escolhida (ou seja, Triticum aestivum). Mais preferivelmente esses índices desviam daqueles do hospedeiro em não mais que cerca de 10-15%.

[063] Em adição às moléculas de ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos IMI descritos acima, um outro aspecto da invenção pertence a moléculas de ácidos nucléicos isoladas que são anti-senso e elas. Polinucleotídeos anti-senso são tidos como inibidores da expressão de gene de um polinucleotídeo objetivado por ligação específica ao polinucleotídeo de alvo e interferência com a transcrição, junção, transporte, tradução e/ou estabilidade do polinucleotídeo de alvo. Métodos são descritos na técnica anterior para objetivar o polinucleotídeo anti-sendo ao DNA cromossômico, para uma transcrição de RNA primário ou para um mRNA processado. Preferivelmente, as regiões de alvo incluem sítios de junção, códons de iniciação de tradução, códons de terminação de tradução, e outras seqüências na estrutura de leitura aberta.

[064] O termo anti-senso, para os objetivos da invenção, se refere a um ácido nucléico que compreende um polinucleotídeo que é suficientemente complementar a toda ou uma porção de um gene, transcrição primária ou mRNA processado, de forma a interferir com expressão do gene endógeno. Polinucleotídeos complementares são aqueles que são capazes de parear bases de acordo com as regras padrão de complementaridade de Watson-Crick. Especificamente,

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39/72 purinas farão pares de base com pirimidinas para formar uma combinação de guanina pareada com citosina (G:C) e adenina pareada com timina (A:T) no caso de DNA, ou adenina pareada com uracil (A:U) no caso de RNA. Deve ser entendido que dois polinucleotídeos podem hibridizar um ao outro mesmo se eles não são completamente complementares um ao outro, desde que cada um tenha pelo menos uma região que é substancialmente complementar uma a outra. O termo “ácido nucléico anti-senso” inclui cassetes de expressão de RNA de filamento único assim como de DNA de duplo filamento que podem ser transcritos para produzir um RNA anti-senso. Ácidos nucléicos anti-senso “ativos” são moléculas de RNA anti-senso que são capazes de hibridizar seletivamente com uma transcrição primária ou mRNA que codifica um polipeptídeo tendo pelo menos 80% de identidade de seqüência com o polipeptídeo codificado pela seqüência de polinucleotídeos de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3.

[065] Em adição aos ácidos nucléicos IMI e polipeptídeos descritos acima, a presente invenção engloba esses ácidos nucléicos e polipeptídeos anexados a uma porção. Essas porções incluem, mas não são limitadas a, porções de detecção, porções de hibridização, porções de purificação, porções de liberação, porções de reação, porções de reação, e semelhantes. Um grupo típico de ácidos nucléicos tendo porções anexadas são marcadores e iniciadores. Marcadores e iniciadores tipicamente compreendem um oligonucleotídeo substancialmente isolado. O oligonucleotídeo tipicamente compreende uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições restritas a pelo menos cerca de 12, preferivelmente cerca

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40/72 de 25, mais preferivelmente cerca de 40, 50 ou 75 nucleotídeos consecutivos de um filamento senso da seqüência apresentada em ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3, uma seqüência anti-senso da seqüência apresentada em ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3, ou mutantes de ocorrência natural dessas. Iniciadores baseados em uma seqüência de nucleotídeos de ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 podem ser usados nas reações de PCR para clonar homólogos de IMI. Marcadores baseados nas seqüências de nucleotídeos de IMI podem ser usados para detectar transcrições ou seqüências genômica que codificam os mesmos polipeptídeos homólogos. Em modalidades preferidas, o marcador também compreende um grupo de rótulo anexado a ele, por exemplo grupo de rótulo pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator de enzima. Tais marcadores podem ser usados como uma parte de um kit de teste de marcador genômico para identificação de células que expressam um polipeptídeo IMI, tal como por medição do nível de um ácido nucléico que codifica IMI, em uma amostra de células, por exemplo, detectar níveis de mRNA de IMI ou determinar se um gene IMI genômico foi mutado ou deletado.

[066] A invenção também fornece um vetor de expressão recombinante isolado que compreende um ácido nucléico IMI como descrito acima, onde a expressão do veto na célula hospedeira resulta em resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comprado a uma variedade de tipo selvagem da célula hospedeira. Como aqui usado, o termo “vetor” se refere a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual ele foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça

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41/72 de Dna de filamento duplo circular no qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, onde segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores epissomais de mamífero). Outros vetores (por exemplo, vetores nãoepissomais de mamífero) são integrados no genoma da célula hospedeira após introdução na célula hospedeira, e dessa forma são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são operacionalmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como “vetores de expressão”. Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, “plasmídeo” e “vetor” podem ser usados de forma intercambiável já que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção pretende incluir tais outras formas de vetores de expressão, tal como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, adenovírus e vírus adenoassociados), que servem a funções equivalentes.

[067] Os vetores de expressão recombinantes da invenção compreendem um ácido nucléico da invenção em uma forma adequada para expressão do ácido nucléico na célula hospedeira, o que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nas células hospedeiras para serem usadas para expressão, que é operacionalmente ligada à

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42/72 seqüência de ácido nucléico a ser expressa. Em um vetor de expressão recombinante, operacionalmente ligado” pretende significar que a seqüência de nucleotídeos de interesse é ligada à seqüência(s) reguladora em uma maneira que permite a expressão da seqüência de nucleotídeos (por exemplo, em um sistema de transcrição/tradução in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor é introduzido na célula hospedeira). O termo seqüência reguladora” pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) ou veja: Gruber e Crosby, in: Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick e Thompson, capítulo 7,89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, incluindo as referências dessas. Seqüências reguladoras incluem aquelas que direcionam expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em vários tipos de células hospedeiras e aquelas que direcionam a expressão de uma seqüência de nucleotídeos penas em certas células hospedeiras ou sob certas condições. Deve ser avaliado por aqueles experientes na técnica que o desenho do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, do nível de expressão de polipeptídeo desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidas em células hospedeiras para dessa forma produzir polipeptídeos ou peptídeos, incluindo polipeptídeos de fusão ou peptídeos, codificados por ácidos nucléicos como aqui descrito (por exemplo, polipeptídeos

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IMI, polipeptídeos de fusão,etc.).

[068] Em uma modalidade preferida da presente invenção, os polipeptídeos IMI são expressos em plantas e células de plantas tal como célula de plantas unicelulares (tal como algas) (veja Falciatore e cols., 1999 Marine Biotechnology 1 (3): 239-251 e referências dessa) e célula de plantas de plantas superiores (por exemplo, os espermatófitos, tal como plantas de safra). Um polinucleotídeo IMI pode ser introduzido em uma célula de planta por qualquer meio, incluindo transfecção, transformação ou tradução, eletroporação, bombardeamento de partícula, biolística, agroinfecção e semelhantes. Um método de transformação conhecido por aqueles experientes na técnica é a imersão de uma planta e floração em uma solução de Agrobactéria, onde a Agrobactéria contém o ácido nucléico IMI, seguido por reprodução dos gametas transformados.

[069] Outros métodos adequados para transformação ou transfecção de células hospedeiras incluindo célula de plantas pode ser encontrado em Sambrook, e cols. (Molecular Cloning: ALaboratory Manual. 2a, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) e outros manuais laboratoriais tal como Methodsin Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland e Davey, Human Press, Totowa, New Jersey. Já que a resistência aumentada a herbicidas de imidazolinona é um traço geral desejado para ser herdado em uma ampla variedade de plantas como milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, colza e canola, mandioca, pimentão,

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44/72 girassol e tagetes, plantas solonáceas como batata, tabaco, berinjela, e tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfalfa, plantas frondosas (café, cacau, chá), espécies Salix, arvores (oil palm, coco), gramas perenes e grãos de forragem, essas plantas de safra são também são plantas de alvo preferidas para engenharia genética como uma modalidade adicional da presente invenção. Grãos de forragem incluem, mas não são limitadas a, capim de trigo (wheatgrass), alpiste (canarygrass), espécie de capim do gênero Bromus (Bromegrass), espécie de capim do gênero Elymus (Wildrye Grass), espécie de capim do gênero Poa (Bluegrass), Capim-panasco (Orchardgrass), Alfafa, “Salfoin”, Cornichão (Birdsfoot Trefoil), Feno de Trevo (Alsike Clover), Trevo Vermelho (Red Clover) e Meliloto (Sweet Clover).Em uma modalidade da presente invenção, transfecção de uma polinucleotídeo IMI em uma planta é realizada por transferência de

Agrobacterium. Transformação de

Agrobacterium pode ser realizada usando por exemplo a cepa GV3101 (pMP90)(Koncz e Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) ou LBA4404 (Clontech) de Agrobacterium tumefaciens. Transformação pode ser realizada por técnica padrão de transformação e regeneração (Deblaere e cols., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777-4788; Gelvin, Stanton B. e Schilperoort, Robert A,Plant Molecular Biology Manual, 2nd Ed. -Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. -in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R. e Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S. , ISBN 0-8493-5164-2). Por exemplo, colza pode gene mediada planta mediada por por

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45/72 ser transformada via transformação de cotilédone ou hipocotil (Moloney e cols., 1989 Plant cell Report 8: 238242; De Block e cols., 1989 Plant Physiol. 91: 694-701). O uso de antibióticos para seleção de Agrobacterium e planta depende do vetor binário e da cepa de Agrobacterium usada para transformação. Seleção de colza é normalmente realizada usando kanamicina como marcador selecionável de planta. Transferência de gene mediada por Agrobacterium para flax pode ser realizada usando, por exemplo, a técnica descrita por Mlynarova e cols., 1994 Plant Cell Report 13: 282285. Adicionalmente, transformação de soja pode ser realizada usando, por exemplo, a técnica descrita em Patente Européia No. 0424 047, Patente U.S. No. 5.322.783, Patente Européia No. 0397687, Patente U.S. No. 5.376.543 ou Patente U.S. No. 5.169.770. Transformação de milho pode ser atingida por bombardeamento de partícula, retenção de Dna mediada por polietileno glicol ou via técnica de fibra de silicone carbide. (veja, por exemplo, Freeling e Walbot “The maize handbook” Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Um exemplo específico de transformação de milho é encontrado na Patente U.S. No. 5.990.387 e um exemplo específico de transformação de trigo pode ser encontrado na Aplicação PCT No. WO 93/07256.

[070] De acordo com a presente invenção, o polinucleotídeo IMI introduzido pode ser mantido na célula de planta de forma estável se ele é incorporado em um réplicon autônomo não cromossômico ou integrado nos cromossomos de planta. Alternativamente, o polinucleotídeo IMI introduzido pode estar presente em um vetor extracromossômico de não-replicação e ser transitoriamente

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46/72 expresso ou transitoriamente ativo. Em uma modalidade, um microorganismo recombinante homólogo pode ser criado onde o polinucleotídeo IMI é integrado no cromossomo, um vetor é preparado que contém pelo menos uma porção do gene AHAS no qual uma deleção, adição ou substituição foi introduzida para dessa forma alterar, por exemplo, funcionalmente romper, o gene AHAS endógeno e para criar um gene IMI. Para criar uma mutação em ponto via recombinação homóloga, híbridos DNA-RNUm podem ser usados na técnica conhecida como quimeraplastia (Cole-Strauss e cols., 1999 Nucleic Acids Research 27 (5): 1323-1330 e Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist 87 (3): 240-247). Ouros procedimentos de recombinação homóloga em espécies de Triticum são bem conhecidas na técnica e são contempladas para uso nessa.

[071] No vetor de recombinação homóloga, o gene IMI pode ser flanqueado em suas extremidades 5' e 3' por uma molécula adicional de ácido nucléico do gene AHAS para permitir recombinação homóloga de ocorrer entre o gene IMI hexógeno realizada pelo vetor e um gene AHAS endógeno em um microorganismo ou planta. A molécula de ácido nucléico de AHAS adicional é de comprimento suficiente para recombinação homóloga bem sucedida com o gene endógeno. Tipicamente, várias centenas de pares de base até kilobases de DNA de flanqueamento (ambos nas extremidades 5' e 3') são incluídas no vetor (veja, por exemplo, Thomas, K. R., e Capecchi, M. R., 1987 Cell51: 503 para uma descrição de vetores de recombinação homóloga ou Strepp e cols., 1998 PNAS, 95 (8): 4368-4373 para recombinação baseada em cDNA em Physcomitrella patens). No entanto, já que o gene IMI normalmente difere do gene AHAS em muito poucos

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47/72 aminoácidos, uma seqüência de flanqueamento não é sempre necessária. O vetor de recombinação homóloga é introduzido no microorganismo ou célula de planta (por exemplo, via DNA mediado por polietileno glicol), e células nas quais o gene IMI introduzido foi recombinado de forma homóloga com o gene AHAS endógeno são selecionadas usando técnicas conhecidas na técnica.

[072] Em uma outra modalidade, podem ser produzidos microorganismos recombinantes que contêm sistemas selecionados para permitir expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão de um gene IMI em um vetor colocando-o sob controle do óperon lac permite expressão do gene IMI apenas na presença de IPTG. Tais sistemas reguladores são bem conhecidos na técnica.

[073] Se presente em um vetor de não replicação extracromôssico ou um vetor que é integrado no cromossomo, o polinucleotídeo IMI preferivelmente reside no cassete de expressão da planta. O cassete de expressão da planta preferivelmente contém seqüências reguladoras capazes de dirigir a expressão de gene nas células de plantas que são operacionalmente ligadas de forma que cada seqüência pode preencher essa função, por exemplo, terminação de transcrição por sinais de poliadenilação. Sinais de poliadenilação preferidos são aqueles que se originam de tDNA de Agrobacterium tumefaciens tal como o gene 3 conhecido como octopina sintase do Ti-plasmídeo pTiACH5 (Gielen e cols., 1984 EMBO J. 3: 835) ou equivalentes funcionais desses, mas também todos os outros terminadores funcionalmente ativos em plantas são adequados. Já que a expressão de gene de planta é muito freqüentemente não

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48/72 limitada em níveis de transcrição, o cassete de expressão da planta preferivelmente contém outras seqüências operacionalmente ligadas como intensificadores de tradução tal como a seqüência contendo a seqüência líder não traduzida 5' do vírus mosaico de tabaco acentuando a proporção de polipeptídeo por RNA (Gallie e cols., 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711). Exemplos de vetores de expressão de planta incluem aqueles detalhados em: Becker, D. e cols., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721; e Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, S.

15-38.

[074] Expressão de gene de planta deve ser operacionalmente ligada a um promotor adequado que confere expressão de gene em uma maneira oportuna, específica a célula ou tecido. Promotores úteis nos cassetes de expressão da invenção incluem qualquer promotor que é capaz de iniciar transcrição em uma célula de planta. Tais promotores incluem, mas não são limitadas a aqueles que podem ser obtidos de plantas, vírus de planta e bactérias que contêm genes que são expressos em plantas, tal como Agrobacterium e Rhizobium.

[075] O promotor pode ser constitutivo, indutível, preferido de estágio de desenvolvimento, preferido de tipo de célula, preferido de tecido ou preferido de órgão.

Promotores constitutivos são ativos sob a maioria das

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49/72 condições. Exemplos de promotores constitutivos incluem os promotores de CaMV 19S e 35 S (Odell e cols. 1985 Nature 313:810-812), o promotor sXCaMV 35S (Kay e cols. 1987 Science 236: 1299-1302) o promotor Sepl, o promotor de actina de arroz (McElroy e cols. 1990 Plant Cell2: 163171), o promotor de actina de Arabidopsis, o promotor de ubiquitan (Christensen e cols. 1989 Plant Molec Biol. 18: 675-689); pEmu (Last e cols. 1991 Theor Appl Genet. 81:581588), o promotor de vírus mosaico de figwort 35S, o promotor Smas (Velten e cols. 1984 EMBO J. 3: 2723-2730), o promotor GRP1-8, o promotor cinamil álcool desidrogenase (Patente U.S. No. 5.683.439), promotor do T-DNA de Agrobacterium, tal como manopina sintase, nopalina sintase, e octopina sintase, o promotor de subunidade pequena de ribulose bifosfato carboxilase (ssuRUBISCO), e semelhantes.

[076] Promotores indutíveis são ativos sob certas condições ambientais, tal como a presença ou ausência de um nutriente ou metabólito, calor ou frio, luz, ataque de patógeno, condições anaeróbicas, e semelhantes. Por exemplo, o promotor hsp80 de Brassica é induzido por choque de calor, o promotor PPDK é induzido por luz, o promotor PR-1 de tabaco, Arabidopsis e milho são indutíveis por infecção com um patógeno, e o promotor Adh1 é induzido por hipoxia e estresse de frio. Expressão de gene de planta também pode ser facilitada via um promotor indutível (para revisão veja Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 :89-108). Promotores quimicamente indutíveis são especialmente adequados se a expressão de gene é desejada por ocorrer em uma maneira de tempo específico. Exemplos de tais promotores são promotor indutível de ácido

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50/72 salicílico (Aplicação PCT No. WO 95/19443), um promotor indutível de tetraciclina (Gatz e cols., 1992 Plant J. 2: 397-404) e um promotor indutível de etanol (Aplicação PCT No. WO 93/21334).

[077] Promotores preferidos de estágio de desenvolvimento são preferivelmente expressos em certos estágios de desenvolvimento. Promotores preferido de tecido e órgão incluem aqueles que são preferencialmente expressos em certos tecidos ou órgãos, tal como folhas, raízes, sementes, ou xilema. Exemplos de promotores preferido de tecido e órgão incluem, mas não são limitadas a promotor preferido de fruto, preferido de óvulo, preferido de tecido masculino, preferido de semente, preferido de tegumento, preferido de tubérculo, preferido de caule, preferido de pericarpo, e preferido de folha, preferido de estigma, preferido de pólen, preferido de antera, preferido de pétala, preferido de sépala, preferido de pedicelo, preferido de silique, preferido de ramo, preferido de raiz e semelhantes. Promotores preferidos de semente são preferencialmente expressos durante o desenvolvimento e/ou germinação da semente. Por exemplo, promotores preferidos de semente podem ser preferidos de embrião, preferidos de endosperma e preferidos de semente coberta. Veja Thompson e cols. 1989 BioEssays 10: 108. Exemplos de promotores preferidos de semente incluem, mas não são limitados a celulose sintase (celA), Cim1, gamma-zein, globulina-1, milho 19 kD zein (cZ19Bl) e semelhantes.

[078] Outros promotores adequados preferidos de tecido ou órgão incluem o promotor e gene de napina de colza (Patente U.S. No. 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba

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51/72 (Baeumlein e cols., 1991 Mol Gen Genet. 225 (3): 459-67), o promotor sw oleosina de Arabidopsis (Aplicação PCT No. WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (Patente U.S. No. 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (Aplicação PCT No. WO 91/13980) ou o promotor de leguminosa B4 (LeB4;Baeumlein e cols., 1992 Plant Journal, 2 (2): 2339) assim como promotores que conferem expressão específica a semente em plantas monocotilédones como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados de nota são o promotor de gene lpt2 ou lpt1 de cevada (Aplicação PCT No. WO95/15389 e Aplicação PCT No. WO 95/23230) ou aqueles descritos na Aplicação PCT No. WO 99/16890 (promotores do gene hordeína de cevada, gene glutelina de arroz, gene orizina de arroz, gene prolamina de arroz, gene gliadina de trigo, gene glutelina de trigo, gene glutelina

de aveia,	gene	Kasirina de	Sorgo,	gene	secalina	de
centeio).
[079]	Outros	promotores	úteis	nos	cassetes	de
expressão	da invenção incluem,	mas não	são	limitadas	ao,
promotor principal	de proteína	de ligação a/b	de clorofila,

os promotores de histona, o promotor Ap3, o promotor de conglicina, o promotor de napina, o promotor de lectina de soja, o promotor de milho zein 15kD, o promotor de zein 22kD, o promotor de zein 27kD, o promotor de g-zein, os o promotores cerosos, contraídos 1, contraídos 2 e promotores de bronze, o promotor Zml3 (Patente U.S. No. 5.086.169), os promotores poligalacturonase de milho (PG) (Patentes U. S. Nos. 5.412.085 e 5.545.546) e o promotor SGB6 (Patente U.S. No. 5.470.359), assim como promotores sintéticos ou outros naturais.

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52/72 [080] Flexibilidade adicional no controle de expressão de gene heteróloga em plantas pode ser obtida por uso de domínios de ligação de DNA e elementos de resposta de fontes heterólogas (ou seja, domínios de ligação de DNA de fontes não vegetais). Um exemplo de tal domínios de ligação de DNA heterólogo é o domínios de ligação de DNA LexA (Brent e Ptashne, Célula 43: 729-736 (1985)).

[081] Um outro aspecto da invenção pertence a células hospedeiras nas quais um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos “célula hospedeira” e “célula hospedeira recombinante” são usados de foram intercambiável aqui. Deve ser entendido que tais termos se referem não apenas à célula individual particular mas eles também se aplicam à progênie ou progênie potencial de tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a mutação ou influencias ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula mãe, mas ainda estão incluídas no escopo do termo como aqui usado. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polinucleotídeo IMI pode ser expresso em células bacterianas tal como C. glutamicum, células de insetos, células fúngicas ou células de mamíferos (tal como células de ovário de hamster da China (CHO) ou células COS), algas, ciliados, célula de plantas, fungos ou outros microorganismos como C. glutamicum. Outras hospedeiras adequadas são conhecidas por experientes na técnica.

[082] A célula hospedeira da invenção, tal como uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica em cultura, células aqueles

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53/72 pode ser usada para produzir (ou seja, expressar) um polinucleotídeo IMI. Conseqüentemente, a invenção também fornece métodos para produção de polipeptídeos IMI usando as células hospedeiras da invenção. Em uma modalidade, o método compreende cultura da célula hospedeira da invenção (na qual um vetor de expressão recombinante que codifica um polipeptídeo IMI foi introduzido, ou em cujo genoma foi introduzido um gene que codifica um tipo selvagem ou polipeptídeo IMI) em um meio adequado até que polipeptídeo IMI é produzido. Em uma outra modalidade, o método também compreende isolação de polipeptídeos IMI do meio ou da célula hospedeira. Um outro aspecto da invenção pertence a polipeptídeos IMI isolados, e porções biologicamente ativas desses. Um polipeptídeo isolado ou purificado ou porção biologicamente ativa desse é livre de algum do material celular quando produzido por técnicas de DNA recombinante, ou precursores químicos ou outras substâncias químicas quando quimicamente sintetizados. A linguagem substancialmente livre de material celular inclui preparações de polipeptídeo IMI nas quais o polipeptídeo é separado de alguns componentes celulares das células nas quais ele é naturalmente ou de forma recombinante produzido. Em uma modalidade, a linguagem substancialmente livre de material celular inclui preparações de um polipeptídeo IMI tendo menos que cerca de 30% em peso também referido como um mais preferivelmente menos seco) de material não-IMI polipeptídeo contaminante) que cerca de 20% de material não-IMI, ainda mais preferivelmente menos que cerca de 10% de material não-IMI, e mais preferivelmente menos que cerca de 5% de material

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54/72 não-IMI.

[083] Quando o polipeptídeo IMI, ou porção biologicamente ativa desse, é de forma recombinante produzido, ele também é preferivelmente substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, o meio de cultura representa menos que cerca de 20%, mais preferivelmente menos que cerca de 10%, e mais preferivelmente menos que cerca de 5% do volume da preparação de polipeptídeo. A linguagem substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos” inclui preparações de polipeptídeo IMI nas quais o polipeptídeo é separado de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese do polipeptídeo. Em uma modalidade, a linguagem substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos” inclui preparações de um polipeptídeo IMI tendo menos que cerca de 30% (em peso seco) de precursores químicos ou outros produtos químicos não-IMI, mais preferivelmente menos que cerca de 20% de precursores químicos ou produtos químicos não-IMI, ainda mais preferivelmente menos que cerca de 10% de precursores químicos ou produtos químicos não-IMI, e mais preferivelmente menos que cerca de 5% de precursores químicos ou produtos químicos não-IMI preferidas, polipeptídeos isolados, biologicamente ativas desses, são polipeptídeos contaminantes do mesmo organismo do qual o polipeptídeo IMI é derivado. Tipicamente, tais polipeptídeos são produzidos por expressão recombinante de, por exemplo, um polipeptídeo IMI de Triticum aestivum em plantas outras que não Triticum aestivum ou microorganismos

Em modalidades ou porções desprovidos de

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55/72 tal como C. glutamicum, ciliados, algas ou fungos.

[084] O polinucleotídeo IMI e seqüências de polipeptídeos da invenção possuem uma variedade de uses. O ácido nucléico e seqüências de aminoácidos da presente invenção podem ser usados para transformar plantas, dessa forma modular a resistência a herbicidas de imidazolinona da planta. Conseqüentemente, a invenção fornece um método de produção de uma planta transgênica tendo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona que compreende, (a) transformação a célula de planta com um ou mais vetores de expressão que compreendem um ou mais ácidos nucléicos IMI, e (b) geração a partir da célula de planta de uma planta transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade de tipo selvagem da planta. Em uma modalidade, os múltiplos ácidos nucléicos IMI são derivados de diferente genomas. Também incluídos na presente invenção estão métodos de produção de uma planta transgênica tendo tolerância aumentada a um herbicida de imidazolinona que compreende, (a) transformação da célula de planta com um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico IMI, onde o ácido nucléico é um ácido nucléico Imi1 e (b) geração a partir da célula de planta de uma planta transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comprada a uma variedade de tipo selvagem da planta.

[085] A presente invenção inclui métodos de modificação da tolerância da planta a um herbicida de imidazolinona que compreende modificação da expressão de um ou mais ácidos nucléicos IMI. Preferivelmente, os ácidos nucléicos estão localizados ou são derivados de diferente

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56/72 genomas. A resistência ao herbicida de imidazolinona da planta pode ser aumentada ou diminuída como realizada por aumento ou diminuição da expressão de um polinucleotídeo IMI, respectivamente. Preferivelmente, a resistência ao herbicida de imidazolinona da planta é aumentada por aumento da expressão de um polinucleotídeo IMI. Expressão de um polinucleotídeo IMI pode ser modificada por qualquer método conhecidos por aqueles experientes na técnica. Os métodos de aumento da expressão de polinucleotídeos IMI podem ser usados quando a planta é transgênica ou não transgênica. Nos casos quando a planta é transgênica, a planta pode ser transformada com um vetor contendo qualquer um dos ácidos nucléicos que codificam IMI acima descritos, ou a planta pode ser transformada com um promotor que direciona expressão de polinucleotídeos IMI endógenos na planta, por exemplo. A invenção afiram que tal promotor pode ser específico a tecido ou regulado por desenvolvimento. Alternativamente, planta não transgênicas podem ter expressão de polinucleotídeo IMI endógena modificada por indução de um promotor nativo. A expressão de polinucleotídeos que compreende ID SEQ NO: 1 ou ID SEQ NO: 3 em plantas de alvo pode ser realizada por, mas não limitado a, um dos seguintes exemplos: (a) promotor constitutivo, (b) promotor induzido por produtos químicos, e (c) sobre-expressão de promotor construída com por exemplo fator de transcrição derivado de dedo de zinco (Greisman e Pabo, 1997 Science 275: 657). Em uma modalidade preferida, a transcrição do polinucleotídeo IMI é modulada usando fatores de transcrição derivados de dedo de zinco (ZFPs) como descrito em Greisman e Pabo, 1997 Science 275:

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657 e fabricado por Sangamo Biosciences, Inc. Esses ZFPs compreendem um domínio de reconhecimento de DNA e um domínio funcional que causa ativação ou repressão de um ácido nucléico alvo tal como um ácido nucléico IMI. Portanto, podem ser criadas ativação e repressão de ZFPs que reconhecem especificamente os promotores de polinucleotídeo IMI descritos acima e usados para aumentar ou diminuir a expressão de polinucleotídeo IMI em uma planta, dessa forma modulando a resistência a herbicida da planta.

[086] Como descrito em mais detalhes acima, as plantas produzidas pelos métodos da presente invenção podem ser monocotilédones ou dicotilédones. As plantas podem ser selecionadas de milho, trigo, centeio, aveia, triticale, arroz, cevada, soja, amendoim, algodão, colza, canola, mandioca, pimentão, girassol, tagetes, plantas solanáceas, batata, tabaco, berinjela, tomate, espécies de Vicia, ervilha, alfalfa, café, cacau, chá, espécies Salix, árvores (oil palm, coco), grama perene e grãos de forragem, por exemplo. Safas de forragem incluem, mas não são limitadas a, capim de trigo (wheatgrass), alpiste (canarygrass), espécie de capim do gênero Bromus (Bromegrass), espécie de capim do gênero Elymus (Wildrye Grass), espécie de capim do gênero Poa (Bluegrass), Capim-panasco (Orchardgrass), Alfafa, Salfoin, Cornichão (Birdsfoot Trefoil), Feno de Trevo (Alsike Clover), Trevo Vermelho (Red Clover) e Meliloto (Sweet Clover). Em uma modalidade preferida, a planta é uma planta de trigo. Em cada um dos métodos acima descritos, a célula de planta inclui, mas não está limitado a, um protoplasto, célula produtora de gameta, e uma célula

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58/72 que se regenera em uma planta completa. Como aqui usado, o termo transgênica se refere a qualquer planta, célula de planta, calo, tecido de planta ou parte de planta, que contém todo ou parte de pelo menos um polinucleotídeo recombinante. Em vários casos, todo ou parte do polinucleotídeo recombinante é integrado de forma estável em um cromossomo ou elemento estável extracromossômico, de forma que ele é passado a gerações sucessivas.

[087] Como acima descrito, a presente invenção ensina composições e métodos para aumentar a resistência a imidazolinona de uma planta de trigo ou semente quando comparada a uma variedade de tipo selvagem da planta ou semente. Em uma modalidade preferida, a resistência a imidazolinona de uma planta de trigo ou semente é aumentada de forma que a planta ou semente pode resistir a uma aplicação de herbicida de imidazolinona preferivelmente de aproximadamente 10-400x10-5 g/m2 mais preferivelmente 20-160 x10-5 g/m2 e mais preferivelmente 40-80x10-5 g/m2. Como aqui usado, resistir a uma aplicação de herbicida de imidazolinona significa que a planta não é morta ou danificada por tal aplicação.

[088] Adicionalmente é fornecido aqui um método de controle de ervas daninhas na vizinhança de uma planta de trigo, que compreende aplicação de um herbicida de imidazolinona às ervas daninhas e à planta de trigo, onde a planta de trigo tem resistência aumentada ao herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade de tipo selvagem de uma planta de trigo, e onde a planta compreende um ou mais ácidos nucléicos IMI. Em uma modalidade, a planta compreende múltiplos ácidos nucléicos IMI

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59/72 localizados ou derivados de diferente genomas. Em uma outra modalidade, a planta compreende um ácido nucléico não-IMI. Ao fornecer plantas de trigo tendo resistência aumentada a imidazolinona, uma ampla variedade de formulações pode ser empregada para proteção das plantas de trigo de ervas daninhas, de forma a aumentar o crescimento da planta e reduzir a competição por nutrientes. Um herbicida de imidazolinona pode ser utilizado por si para controle de ervas daninhas pré-florescimento, pósflorescimento, pré-plantação e na plantação em áreas que circundam as plantas de trigo aqui descritas ou uma formulação de herbicida de imidazolinona pode ser usada contendo outros aditivos. O herbicida de imidazolinona também pode ser usado como um tratamento para semente. Aditivos encontrados em uma formulação de herbicida de imidazolinona incluem outros herbicidas, detergentes, adjuvantes, agentes de propagação, agentes de adesão, agentes estabilizantes, ou semelhantes. A formulação de herbicida de imidazolinona pode ser uma preparação úmida ou seca e pode incluir, mas não está limitada a, pós com capacidade de escorrimento, concentrados com capacidade de emulsificação e concentrados líquidos. O herbicida de imidazolinona e formulações de herbicida pode ser aplicado de acordo com métodos convencionais, por exemplo, por pulverização, irrigação, salpicamento, ou semelhantes.

[089] Através dessa aplicação, várias publicações são referidas. As revelações de todas essas publicações e aquelas referências citadas nessas publicações estão aqui incorporadas por referência em suas totalidades nessa aplicação a fim de descrever mais completamente o estado da

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60/72 técnica à qual essa invenção pertence.

[090] Deve ser também entendido que o antecedente está relacionado a modalidades preferidas da presente invenção e que numerosas mudanças podem ser feitas nessa sem fugir ao escopo da invenção. A invenção também é ilustrada pelos exemplos a seguir, que não devem ser interpretados de qualquer modo como impondo limitações ao escopo dessa. Ao contrário, deve ser claramente entendido que se pode utilizar de várias outras modalidades, modificações, e equivalentes dessas, que, após leitura da descrição aqui presente, podem se sugerir àqueles experientes na técnica sem fugir do espírito da presente invenção e/ou do escopo das reivindicações em apêndice.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Mutagênese e seleção de linhas resistentes de trigo [091] Aproximadamente 40.000 sementes de Triticum aestivum L. cv CDC Teal (Hughes e Hucl, 1993 Can. J. Plant Sci. 73: 193-197) sofreram mutagênese usando procedimentos modificados descritos por Washington e Sears (1970). Sementes foram pré-encharcadas em água destilada por quarto horas, seguido por tratamento com 0,3% EMS for seis horas. As sementes foram enxaguadas continuamente com água morna por sete horas e deixadas para secar por aproximadamente quatro horas antes de serem plantadas no campo. As plantas Ml foram selfed e a semente foi colhida em massa. Aproximadamente 2 x 106 de plantas M2 cresceram no campo no ano seguinte e foram pulverizadas no estágio de duas folhas com imazamox em uma taxa de 40x10-5 g/m2 em um volume de spray de 100x10-5 L/m2. Adjuvante mesclado 0,05% (v/v) foi

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61/72 adicionado a solução de spray. Seis linhas resistentes a imazamox foram selecionadas e designadas como linhas 1A, 9A, 10A, 11A, 15A, e 16A. As gerações M3 e M4 cresceram em uma câmara de crescimento walk-in e as plantas resistentes a imazamox foram selecionadas usando taxas de

20x10-5 g/m2. Plantas resistentes foram selecionadas na geração M5 depois da aplicação de 40x10-5 g/m2 no campo. Semente de M5 era homozigótica para o traço, já que o teste de progênie detectou nenhuma segregação para resistência a imazamox.

EXEMPLO 2

Métodos usados para determinar hereditariedade e alelismo de genes IMI [092] Para determinar o controle genético de resistência cruzamentos imazamox nas seis recíprocos entre as linhas de trigo, seis linhas M6 homozigóticas resistentes M6 e CDC Teal (suscetível a aleatoriamente imazamox) foram feitos.

F1

Plantas selecionadas de cada um dos cruzamentos foram retrocruzadas com CDC Teal para formar populações de retrocruzamento (BC)F1. para investigar alelismo, todos os possíveis entrecruzamentos entre os seis mutantes e SWP965001 (Grandin/3*Fidel--FS-4) foram feitos. SWP965001 é uma linha de trigo da primavera que é homozigótica para o alelo FS-4. Genótipos parentais cresceram em um câmara de crescimento walk-in com um foto-período de 16 horas e um regime de temperatura de 24°C de dia e 16°C a noite. Estacas que emergiram em 3/4 do boot eram cortadas e então polinizadas 2-3 dias após a data de corte. Plantas F2 aleatoriamente selecionadas de todos os cruzamentos de

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62/72 segregação foram selfed para produzir famílias F2:3. Plantas parentes, Fl, BCF1, F2 e famílias F2:3 foram testadas para reação a imazamox. Todos os experimentos foram conduzidos em uma câmara de crescimento walk-in com um foto-período de 16 horas e um regime de temperatura de 23°C de dia e 16°C a noite. Um desenho completamente aleatório foi usado para todos os experimentos. Nos experimentos que envolvem famílias F2:3, foi feito esforço para randomizar tanto dentro das famílias como entre as famílias. As populações F1 e F2 foram classificadas no mesmo experimento junto com genótipos parentais e CDC Teal como controles. As populações BCF1 e F2:3 foram classificadas em dois experimentos separados junto com genótipos parentais adequados como controles.

[093] Aplicaram-se tratamentos herbicidas nas plantas que crescem na faixa de 8 x 16 células lisas, no estágio de folha dupla, utilizando-se de pulverizador corrediço calibrado para pulverizar 100x10-5 L/m2. Imazamox foi aplicado a plantas em uma taxa de 20x10-5 g/m2 usando um bocal 8001 EVS em uma pressão de 275 kPa. Tensoativo mesclado (0,05% v/v) foi adicionado à solução de herbicida antes da aplicação. Quinze dias após aplicação do herbicida, as plantas foram pontuadas com base em reações de parentesco e foram consideradas como resistentes, intermediárias, ou susceptíveis. Plantas resistentes não foram afetadas fenotipicamente após tratamento de herbicida, enquanto que plantas intermediárias foram caracterizadas por crescimento suspenso das duas primeiras folhas, escurecimento (pigmentação verde escura) das folhas, e a emergência de queda do coleóptilo. Plantas

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63/72 susceptíveis foram caracterizadas por falência em desenvolver novas folhas, clorose extensa da folha, e eventualmente, morte da planta. Para análise Mendeliana das populações segregantes, as plantas foram pontuadas em categorias resistentes e susceptíveis e testadas quanto à integridade de ajuste para vários modelos de gene 1, gene 2 e gene 3 usando análise de qui-quadrado. Para dados de planta F2 e BCF1, reações intermediárias incluíram a categoria de reação resistente. Correção de Yates para continuidade foi usada para ajustar o valor de qui-quadrado quando somente um grau único de liberdade foi usado na análise de qui-quadrado (Steele e Torrie 1980 Principles and procedures of statistics. McGraw-Hill, New York, New York. pp 633).

EXEMPLO 3

Resultados em Relação à Hereditariedade de genes IMI [094] Todos os parentes resistentes produziram um fenótipo similar quando pulverizados com 20x10-5 g/m2 de imazamox (Figura 1). Cruzamentos recíprocos entre as linhas resistentes e o parente susceptível (CDC Teal) resultaram em plantas F1 que sobreviveram à aplicação de imazamox (Figura 1), indicando que resistência a imazamox é um traço nuclear e não citoplasmático. Com a exceção de cruzamento 15A x Teal, as plantas F1 que resultam de cada uma das linhas resistentes cruzadas com CDC Teal exibiriam uma reação intermediária (Figura 1). Uma vez que as plantas F1 eram fenotipicamente intermediárias entre os dois parentes, concluiu-se que resistência a imazamox nessas linhas era um traço parcialmente dominante (Figura 1). Análise genética de resistência a imidazolinonas e sulfoniluréias em

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Arabidopsis thaliana (Haughn e Somerville, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 430-434), Zea mays (Newhouse e cols., 1991 Theor. Appl. Genet. 83: 6570), Brassica napus (Swanson e cols., 1989 Theor. Appl. Gen. 78: 525-530), e Glicina max (Sebastian e cols., 1989 Crop Sci. 29: 1403-1408) também indicou a presença de um gene nuclear único, parcialmente dominante.

[095] Quatorze plantas F1 que resultam do cruzamento 15A x Teal foram pontuadas como resistente (Figura 1). A avaliação de populações F2 desse cruzamento indicou que dois lócus independentemente segregantes estavam envolvidos na conferência de resistência nesse genótipo (Figura 2). Uma vez que F1 carregaria dois lócus heterozigotos resistentes, esperar-se-ia que seria observada uma reação resistente. Se cada um desses lócus isoladamente conferisse dominância parcial, aditivamente, dois lócus heterozigotos produziriam uma reação resistente. Swanson e cols. (1989) combinaram dois alelos semidominantes de resistência a imidazolinona de Brassica napus, representando dois genes não-ligados, para produzir um híbrido F1 híbrido que era superior em resistência a imidazolinona do que qualquer uma das linhas heterozigóticas isoladamente. Os autores concluíram que mecanismos de resistência são aditivos, e um alto nível de resistência é observado em linhas que carregam mais do que um alelo de resistência.

[096] Uma análise de herança citoplasmática foi conduzida na geração F2 pelo teste de homogeneidade de desvios de proporções de segregação entre as duas populações F2 recíprocas. Análise de qui-quadrado não

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65/72 revelou quaisquer desvios significativos entre populações recíprocas, confirmando a ausência de herança citoplasmática (Figura 2). Uma vez que herança citoplasmática estava ausente, os dados das duas populações recíprocas foram combinados e um qui-quadrado total nos dados reunidos em pool de F2 foi calculado (Figura 2).

[097] Com a exceção de Teal x 15A, todas as populações F2 que resultam de cruzamentos resistentes x susceptíveis deram um bom ajuste para uma proporção de resistentes:susceptíveis de 3:1 indicando segregação de um gene principal único para resistência a imazamox (Figura 2). Quando plantas F1 foram cruzadas com o parente susceptível, populações BCF1 resultantes geraram um bom ajuste para uma proporção de resistentes:susceptíveis de 1:1, confirmando a hipótese de lócus único (Figura 2). Os dados da população F2 do cruzamento 5A x Teal se ajustam a uma proporção de resistentes:susceptíveis de 15:1 (P=0,08), indicando segregação dois genes independentes, complementares (Figura 2). A população BCF1 gerou um bom ajuste para uma proporção de resistentes:susceptíveis de 3:1 com um valor P de qui-quadrado de 0,35, confirmando os resultados da F2 (Figura 2).

[098] Visto que se especula a partir dos dados de F2 que resistência nas linhas 1A, 9A,10A, 11A, e 16A é controlada por um gene principal único, famílias F2:3 devem segregar e se ajustar a uma proporção de família de resistência homozigótica:segregante:homozigótica de 1:2:1. A avaliação das famílias F2:3 indicou que cruzamentos Teal x 1A, Teal x 9A, Teal x 10A, Teal x 11A, e Teal x 16A todos se ajustam a uma proporção de família F2:3

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66/72 resistente:segregante: susceptível de 1: 2: 1 com valores

P de qui-quadrado de 0,64, 0,66, 0,52, 0,40, e 0,94, respectivamente (Figura 3). Esses resultados confirmam os resultados dos dados de F2 e BCF1 de que resistência em linhas 1A, 10A, 9A,11A, e resistência em 16A são controladas por um gene principal único. Esse padrão de herança é consistente com outros achados que relataram o controle genético de resistência a herbicidas de inibidor de AHAS. Até o momento, praticamente todas as mutações de planta que conferem resistência a imidazolinonas mostram que um gene único, parcialmente dominante controla o traço de resistência. Em Triticum aestivum, Zea mays, Glicina max, Arabidopsis thaliana, e Nicotiana tabacum, resistência a inibidores de AHAS é herdada como um gene nuclear único, parcialmente dominante (Newhouse e cols. 1991; Newhouse e cols. 1992; Chaleff e Ray, 1984 Science 223: 1148-1151;

Sathasivan e cols. , 1991 Plant Physiol. 97: 1044-1050).

Resistência de planta a herbicidas de inibidor de AHAS ocorre principalmente por causa de uma única mutação em ponto para o gene que codifica a enzima AHAS (Harms e cols. 1992, Mol. Gen. Genet. 233: 427-435; Winder e Spalding,

1988 Mol. Gen. Genet. 238: 394-399).

[099] Os dados de F2 que resultam do cruzamento

Teal x 15A fornecem um bom ajuste para uma proporção resistente:susceptível de 15:1, sugerindo segregação de dois lócus, independentemente segregantes (Figura 2). Se isso for o caso, famílias F2:3 devem segregar e se ajustar a uma proporção de família F2:3 resistente:segregante: susceptível de 7:8:1. Famílias F2:3 do cruzamento 15A x Teal se ajustaram à proporção esperada 7:8:1 (Figura 3),

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67/72 confirmando os resultados das populações F2 e BCF1 de que resistência em 15A é conferida por dois lócus independentes. Até onde vai o conhecimento do inventor, é o primeiro caso relatado onde dos alelos independentemente segregantes resistentes a imidazolinona foram identificados em uma linha única após mutagênese de semente.

EXEMPLO 4

Resultados em Relação Ao Alelismo de genes IMI [100] Para determinar os relacionamentos alélicos de gene de resistências, todos os intercruzamentos possíveis entre linhas resistentes foram avaliados. Nenhuma planta susceptível foi observada nas populações F2 que resultam dos intercruzamentos entre linhas SWP965001, 1A, 9A, 10A, 15A, e 16A (Figura 4). Uma vez que essas populações não eram segregantes, os genes de resistências nessas linhas são tanto alelos no lócus FS-4, quanto estão unidos muito intimamente. Uma vez que essas populações não eram segregantes na geração F2, famílias F2:3 desses cruzamentos não foram avaliadas.

[101] Todos os intercruzamentos envolvendo a linha 11A não segregavam na geração F2, indicando a presença de um gene único de resistência em 11A (Figura 4). Se dois genes de resistências independentemente segregantes estão presentes como o resultado do cruzamento de duas linhas, cada uma carregando um gene único de resistência, seria de se esperar uma proporção resistente:susceptível de 15:1 na geração F2. Na geração F2, cruzamentos SWP965001 x 11A, 1A x 11A, 10A x 11A, e 16A x 11A se ajustam à proporção esperada resistente:susceptível de 15:1sugerindo segregação independente de dois genes principais de resistência

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68/72 (Figura 4). Proporções da família F2:3 desses cruzamentos também deram um bom ajuste para uma proporção resistente: segregante:susceptível de 7:8:1, confirmando os resultados obtidos na geração F2 (Figura 5). Cruzamento 11A x 9A realmente produziu uma população F2 segregante, mas a proporção não se ajustou a uma proporção de segregação 15:1 devido a um excesso de segregantes susceptíveis. Várias outras hipóteses de dois genes foram testadas, mas verificou-se que todas eram altamente significativas (Dados não mostrados). A avaliação de famílias F2:3 desse cruzamento, no entanto, realmente se ajustou para uma proporção de segregação de 7:8:1, indicando segregação de dois genes independentes (Figura 5). Esses resultados confirmam que o gene de resistência em 11A é exclusivo em relação àqueles em linhas SWP96001, 1A, 9A, 10A, e 16A.

[102] Cruzamento 11A x 15A realmente produz uma população F2 segregante. Já que 15A carrega dois genes de resistência, um alélico para FS-4, uma população F2 segregante no cruzamento 11A x 15A deve indicar a presença de três genes segregantes. Gerações segregantes resultantes de cruzamento 15A x 11A foram testadas para segregação de três lócus independentes. Plantas F2 se adequaram a proporção esperada de 63:1 resistente:suscetível, indicando a segregação de três lócus independentes (Figura 4). Esses resultados sugerem que a segunda mutação em 15A não é alélica ao gene de resistência em 11A. Famílias F2:3 não foram classificadas como sobre 330 plantas em cada família deveriam ser classificadas a fim de assegurar adequado poder de teste (Hanson, 1959 Agron. J. 51: 711-716).

[103] Três lócus independentes de resistência foram

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69/72 identificados, Ada um com um alelo que confere resistência to imazamox. Regras recomendadas para símbolos de lócus de gene e alelo foram publicadas (McIntosh e cols., 1998 Catalogue of Gene Symbols. Volume 5, Proceedings of the 9th International wheat Genetics Symposium. Saskatoon, Saskatchewan). Lócus de genes não alélicos de uma enzima que catalisa a mesma reação devem receber o mesmo símbolo, que corresponde ao nome trivial da enzima. O nome trivial para AHAS é ALS. Dados ausentes para determinar os lócus para cromossomos e genomas específicos, devem ser designados em série seqüencial. A designação do fenótipo observado quando mudanças ocorrem no gene resultando em um novo alelo devem refletir aquele fenótipo. Portanto, é proposto que o alelo de resistência a imidazolinona FS-4 seja designado como Imi1 e o lócus onde ele está é designado como Als1. Imi responde por resistência a imidazolinona. Essa designação indica que o gene é um traço dominante e que é o primeiro alelo identificado. Dados de população segregante F2 e F2:3 sugerem que 15A e 11A carregam dois novos alelos independentes de resistência em diferentes lócus (Figuras 2 e 3). As designações para esses alelos são Imi2 para a mutação 11A no lócus Als2 e Imi3 para a segunda mutação 15A no lócus Als3.

[104] São aqui identificados três alelos de independentemente segregantes que conferem resistência a imazamox, denominados Imi1 (lA, 9A, 10A, 15A e 16A), Imi2 (11A), e Imi3 (15A). É proposto que cada um dos três alelos identificados esteja associado com um diferente gene estrutural que codifica para formas insensíveis a herbicida de AHAS. Já que o trigo é um hexaplóide, múltiplos lócus

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AHAS são esperados. Descobriu-se que outras espécies poliplóides têm mais que uma cópia de AHAS. Em Nicotiana tabacum, um alotetraplóide, dois genes AHAS foram identificados e caracterizados (Mazur e cols. 1987). Chaleff e Ray (1984) identificaram dois alelos de resistência a sulfoniluréia independentemente segregantes em Nicotiana tabacum, cada um codificando para uma forma alterada de AHAS. Zea mays possui dois genes AHAS idênticos constitutivamente expressos (Fang e cols., 1992 Plant Mol. Biol. 18: 1185-1187). Em Brassica napus e Gossypium hirsutum alotetraplóides, uma família de multi-gene AHAS que consiste em cinco e seis membros, respectivamente, está presente (Rutledge e cols., 1991 Mol Gen. Genet. 229: 3140; Grula e cols., 1995 Plant Mol. Biol. 28: 837-846). Níveis maiores de resistência a herbicidas foram observados em espécies poliplóides quando alelos múltiplos de resistência estão presentes. Swanson e cols. (1989 Theor. Appl. Gen. 78: 525-530) combinaram dois alelos únicos de resistência a imidazolinona de duas linhas homozigóticas de Brassica napus resultando em uma progênie com um maior nível de resistência que a linha homozigótica isolada. Creason e Chaleff (1988 Theor. Appl. Genet. 76: 177-182) identificaram plantas Nicotiana tabacum homozigóticas para duas mutações que conferiram resistência a sulfoniluréias. Plantas homozigóticas para ambas mutações eram cinco vezes mais resistentes a aplicações foliáceas de clorsulfuron que as plantas homozigóticas para cada mutação única. A presente invenção propõe a produção de níveis aumentados de resistência a um herbicida de imidazolinona em trigo por combinação de quaisquer dois ou três alelos resistência.

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EXEMPLO 5

Tolerância a herbicidas de imidazolinona em TealllA, Teal15A e híbrido Teal11A/15A [105] A tolerância aumentada exibida por TealllA e Teal 15A a 20 gramas por 105m2 de imazamox foi exemplificada nos exemplos prévios por uma capacidade de distinguir parente tolerante de suscetível e plantas segregantes em estudos de hereditariedade. Teal11A mostrou conferir níveis similares de tolerância a herbicidas de imidazolinona àqueles conferidos pela mutação FS4 em Fidel em várias estufas e comparações de campo. A similaridade na tolerância também é refletida na comparação da atividade in vitro de AHAS extraído de plantas tolerantes. Isso é possível porque a tolerância em Teal1lA, Teal 15A, e FS4 é devida a uma mutação na enzima AHAS transformando-a em resistente à inibição por herbicidas de imidazolinona. A Figura 6 indica que a atividade da enzima AHAS extraída de Teal11A e BW755, uma linha contendo FS4, muda de modo similar que a taxa de aumentos de imazamox, e ambos têm uma maior percentagem de enzima ativa (resistente) na mais alta concentração de imazamox que o controle de tipo selvagem, Teal.

[106] A presença de dois ácidos nucléicos IMI em Teal 15A fornece tolerância aumentada a herbicidas de imidazolinona comparada a uma linha tal como BW755 que carrega apenas um ácido nucléico IMI. Essa tolerância aumentada é refletida em menos danos em maiores taxas de herbicida, e também em ter mais atividade enzima AHAS não inibida. A Figura 7 ilustra que uma taxa de l0x de imazamox (200x10-5 g/m2), plantas de um gene todas tratadas foram

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72/72 danificadas, enquanto nenhuma planta de dois genes foi danificada. Em todas as concentrações de imazamox em um ensaio in vitro de atividade AHAS (Figura 6), mas particularmente nas concentrações mais altas, Teal 15A tinha uma maior percentagem de enzima ativa (resistente) que tinha as linhas de gene único, Teal 11A e BW755.

[107] A combinação de três genes não-alélicos cada um conferindo tolerância a herbicidas de imidazolinona resulta em maior tolerância que com apenas dois genes não alélicos (Figura 7). Em uma taxa de 30X, ou 600x10-5 g/m2 de imazamox, mais que a metade das plantas sustentaram nenhum dano em uma população selfed ainda segregante de Teal 15A cruzada com Teal11A, enquanto todas as plantas da população homozigótica de Teal15A sustentou dano.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para o controle de ervas daninhas nas vizinhanças de uma planta de trigo ou triticale, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) crescer uma planta de trigo ou triticale, em que a referida planta de trigo ou triticale compreende múltiplos ácidos nucleicos IMI, em que pelo menos dois dos múltiplos ácidos nucléicos IMI são selecionados a partir do grupo consistindo de:

a) um polinucleotídeo Imi3 da SEQ ID NO: 1 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 2;

b) um polinucleotídeo Imi2 da SEQ ID NO: 3 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 4;

c) um polinucleotídeo Imi1 da SEQ ID NO: 19 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 20;

e em que a planta de trigo ou triticale possui resistência aumentada ao herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade do tipo selvagem da planta de trigo ou triticale; e (ii) aplicar um herbicida de imidazolinona às ervas daninhas e à planta de trigo ou triticale do item (i).
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois dos múltiplos ácidos nucléicos IMI são selecionados do grupo consistindo de:

a) o polinucleotídeo Imi3 da SEQ ID NO: 1;

b) o polinucleotídeo Imi2 da SEQ ID NO: 3; e

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c) o polinucleotídeo Imi1 da SEQ ID NO: 19.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é selecionado do grupo consistindo de imazethapyr, imazapic, imazamox, imazaquin, imazethabenz ou imazapyr.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é imazethapyr.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é imazamox.
6. Método para modificar a tolerância de uma planta de trigo ou triticale a um herbicida de imidazolinona, caracterizado pelo fato de que compreende a modificação da expressão de múltiplos ácidos nucleicos IMI, em que pelo menos dois dos múltiplos ácidos nucleicos IMI são selecionados do grupo consistindo de:

a) um polinucleotídeo Imi3 da SEQ ID NO: 1 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 2;

b) um polinucleotídeo Imi2 da SEQ ID NO: 3 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 4;

c) um polinucleotídeo Imi1 da SEQ ID NO: 19 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 20.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os pelo menos dois dos múltiplos ácidos nucléicos IMI são selecionados do grupo consistindo de:

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a) o polinucleotídeo Imi3 da SEQ ID NO: 1; b) o polinucleotídeo Imi2 da SEQ ID NO: 3; e c) o polinucleotídeo Imi1 da SEQ ID NO: 19. 8. Método, de acordo com a reivindicação

caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é selecionado do grupo consistindo de imazethapyr, imazapic, imazamox, imazaquin, imazethabenz ou imazapyr.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é imazethapyr.
10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é imazamox.
11. Método de produção de uma planta de trigo ou triticale transgênica tendo resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona, caracterizado pelo fato de que compreende:

(i) transformar uma célula de planta com um ou mais múltiplos ácidos nucleicos IMI compreendidos em um ou mais vetores de expressão, em que pelo menos dois dos múltiplos ácidos nucleicos IMI são selecionados do grupo consistindo de:

a) um polinucleotídeo Imi3 da SEQ ID NO: 1 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 2; b) um polinucleotídeo Imi2 da SEQ ID NO: 3 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo polipeptídeo da SEQ ID NO: 4; c) um polinucleotídeo Imi1 da SEQ ID NO: 19 e suas sequências degeneradas que codificam o mesmo

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4/4 polipeptídeo da SEQ ID NO: 20; e ii) gerar, a partir da célula de planta, uma planta transgênica com uma resistência aumentada a um herbicida de imidazolinona quando comparada a uma variedade do tipo selvagem da planta.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois dos múltiplos ácidos nucléicos IMI são selecionados do grupo consistindo de:

a) o polinucleotídeo Imi3 da SEQ ID NO: 1; b) o polinucleotídeo Imi2 da SEQ ID NO: 3; e c) o polinucleotídeo Imi1 da SEQ ID NO: 19. 13 . Método, de acordo com a reivindicação

caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é selecionado do grupo consistindo de imazethapyr, imazapic, imazamox, imazaquin, imazethabenz ou imazapyr.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é imazethapyr.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o herbicida de imidazolinona é imazamox.