BRPI0214330B1 - Bactéria produtora de l-aminoácido, e, métodos para a produção de um l-aminoácido e de alquil éster inferior de alfa-l-aspartil-l-fenilalanina - Google Patents
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Description
“BACTÉRIA PRODUTORA DE L-AMINOÁCIDO, E, MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE UM L-AMINOÁCIDO E DE ALQUIL ÉSTER INFERIOR DE ALFA-L-ASPARTIL-L-FENIL-ALANINA”.
Campo técnico A presente invenção refere-se à biotecnologia, especificamente a um método para a produção de aminoácidos, a saber de ácidos aromáticos, tais como L-fenil-alanina e L-triptofano, por fermentação, e mais especificamente a um gene derivado da bactéria Escherichia coli. O gene é útil para a melhoria da produtividade de L-fenil-alanina e de L-triptofano. Técnica anterior Convencionalmente os L-aminoácidos têm sido industrialmente produzidos pelo método de fermentação utilizando cepas de microorganismos obtidas de fontes naturais ou mutantes das mesmas especialmente modificadas para aumentarem a produtividade de L-aminoácido. Têm sido descritas muitas técnicas para aumentar a produtividade de L-aminoácido, por exemplo, pela transformação de microorganismo por DNA recombinante (veja, por exemplo, Patente US 4.278.765). Estas técnicas baseiam-se no aumento das atividades das enzimas envolvidas na biossíntese de aminoácido e/ou na dessensibilização das enzimas alvo à inibição de retroalimentação pelo L-aminoácido produzido (veja, por exemplo, Pedido Publicado Japonês 56-18596 (1981), WO 95/16042 ou Patentes US 5.661.012 e 6.040.160).
Por outro lado, a intensificação da atividade de excreção de aminoácido pode aumentar a produtividade da cepa produtora de L-aminoácido. Cepa produtora de lisina de uma bactéria pertencente ao gênero Corynebacterium possuindo expressão aumentada de gene de excreção de L-lisina (gene lysE) está descrita (WO 97235974A2). Em adição, genes codificadores de proteínas de efluxo adequadas para a secreção de L-cisteína, L-cistina, N-acetil-serina ou derivados de tiazolidina também estão descritos (Patente US 5.972.663).
Atualmente, vários genes de Escherichia coli codificadores de proteínas de membrana putativa intensificadores da produção de L-aminoácido estão descritos. Cópias adicionais de gene rhtB tomam uma bactéria mais resistente à L-homosserina e intensificam a produção de L-homosserina, L-triptofano, L-alanina, L-valina e de L-isoleucina (Pedido de Patente Européia EP994190A2). Cópias adicionais do gene rhtC tomam uma bactéria mais resistente à L-homosserina e à L-triptofano e intensificam a produção de L-homosserina, de L-triptofano e de L-leucina (Pedido de Patente Européia EP1013765A1). Cópias adicionais de genes yahN, yeaS, yfiK e yggA intensificam a produção de ácido L-glutâmico, L-lisina, L-triptofano, L-alanina, L-histidina, L-prolina, L-arginina, L-valina e de L-isoleucina (Pedido de Patente Européia EP1016710A2).
Anteriormente os presentes inventores obtiveram, com respeito a E. coli K-12, um mutante possuindo uma mutação, thrR (aqui referida como rhíA23) que está envolvida na resistência a altas concentrações de treonina ou de homosserina em um meio mínimo (Astaurova, O.B. et al., Appl. Biochem. Microbiol., 21, 611-616, 1985). A mutação melhorou a produção de L-triptofano (Patente SU 974817), de homosserina e de glutamato (Astaurova, O.B. et al., Appl. Biochem. Microbiol., 27, 556-561, 1991) pelas respectivas cepas de E. coli produtoras.
Em adição, os presentes inventores revelaram que o gene rhtA existe por 18 min no cromossomo de E. coli próximo ao operon glnHPQ que codifica os componentes do sistema de transporte de glutamina, e que o gene rhtA é idêntico à ybiF ORF entre os genes pexB e ompX. A unidade que expressa uma proteína codificada pela ORF tem sido chamada de gene rhtA (rht: resistência à homosserina e à treonina).
Além disso, os presentes inventores verificaram que a amplificação do gene rhtA também conferiu resistência à homosserina e à treonina. A mutação rhtA23 é uma substituição de G por A na posição 1 com respeito ao códon de iniciação ATG (ABSTRACS do 17* International Congress of Biochemistry and Molecular Biology conjuntamente com 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, Califórnia, 24-29 de Agosto de 1997, Abstract no. 457). É sabido que uma composição de nucleotídeo do espaçador entre a seqüência SD e o códon de iniciação e especialmente as seqüências imediatamente a montante do códon de iniciação afetam profundamente a traduzibilidade do mRNA. Uma faixa de 20 vezes nos níveis de expressão foi verificada, dependendo da natureza dos três nucleotídeos precedendo o códon de iniciação (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). Portanto, pode ser sugerido que a mutação rhtA23 aumenta a expressão do gene rhtA. O gene rhtA codifica uma proteína que consiste de 295 resíduos de aminoácido e possui peso molecular calculado de 31,3 kDa. A análise da seqüência de RhtA revelou que ela é uma proteína elevadamente hidrofóbica contendo 10 segmentos de transmembrana preditos. Uma pesquisa de PSI-BLAST da seqüência de nucleotídeos da cepa K-12 de E. coli pertencente ao gênero Escherichia (Science, 277, 1453-1474 (1997)) revelou pelo menos 10 proteínas homólogas a RhtA. Dentre elas há proteínas codificadas pelos genes ydeD e yddG. Foi mostrado que o gene ydeD está envolvido no efluxo dos metabólitos da rota de cisteína (Dapier et al., Mol. Microbiol., 36, 1101-1112, 2000; US 5.972.663). É sabido que o gene yddG é CDS putativo, que pode codificar proteína funcionalmente desconhecida (números 3687 a 4568 na seqüência de acesso do banco de genes AE000244 U00096).
Descrição da invenção Um objetivo da presente invenção é aumentar a produtividade de cepas produtoras de L-fenil-alanina e proporcionar um método para a produção de L-fenil-alanina usando a cepa. Também um objetivo da presente invenção é aumentar a produtividade de cepa produtora de L-triptofano e proporcionar um método para a produção de L-triptofano utilizando a cepa.
Este objetivo foi alcançado pela identificação de que o gene yddG codificador de uma proteína de membrana, homóloga a RhtA, que não está envolvido na rota biossintética de um L-aminoácido alvo, conferiu a um microorganismo uma resistência a vários aminoácidos e análogos de aminoácido quando o alelo de tipo selvagem foi amplificado em um vetor de multicópias no microorganismo. Além disso, o gene yddG pode intensificar a produção de aminoácido quando suas cópias adicionais são introduzidas nas células da respectiva cepa produtora. E o gene yddG pode intensificar a produção de L-triptofano quando sua expressão nas células da respectiva cepa produtora é intensificada. Assim a presente invenção tem sido completada.
As presentes invenções são as seguintes: 1) Uma bactéria produtora de L-aminoácido pertencente ao gênero Escherichia, na qual a produção de L-aminoácido pela bactéria é aumentada pela intensificação de uma atividade de uma proteína como definida a seguir em (A) ou (B) em uma célula da bactéria: (A) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (B) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências, e que possui uma atividade de fazer com que a bactéria possua resistência aumentada à L-fenil-alanina e/ou a um análogo de aminoácido tal como p-fluoro-fenil-alanina e 5-fluoro-DL-triptofano ou semelhante; (daqui por diante, as proteínas como definidas acima em (A) ou (B) são referidas como "proteínas da presente invenção"). 2) A bactéria de acordo com a bactéria acima, na qual a atividade da proteína como definida em (A) ou (B) é aumentada pela transformação da bactéria com um DNA codificador de proteínas como definidas em (A) ou (B), ou pela alteração da seqüência de regulação de expressão de citado DNA no cromossomo da bactéria. 3) A bactéria de acordo com a bactéria acima, na qual a transformação é realizada com um vetor de multicópias contendo o DNA. 4) A bactéria de acordo com a bactéria acima, na qual o promotor nativo do citado DNA é substituído por promotor mais potente. 5) Um método para a produção de um L-aminoácido, que compreende as etapas de cultivar a bactéria de acordo com a bactéria acima em um meio de cultura e coletar do meio de cultura o L-aminoácido a ser produzido e acumulado no meio. 6) O método de acordo com o método acima, no qual o L-aminoácido a ser produzido é L-fenil-alanina. 7) O método de acordo com o método acima, no qual a bactéria tem expressão intensificada dos genes para a biossíntese de fenil-alanina. 8) O método de acordo com o método acima, no qual o L-aminoácido a ser produzido é L-triptofano. 9) O método de acordo com o método acima, no qual a bactéria tem expressão intensificada dos genes envolvidos na biossíntese de triptofano. 10) Um método para a produção de alquil éster inferior de a-L-aspartil-L-fenil-alanina, compreendendo as etapas de: cultivar a bactéria de acordo com a bactéria acima em um meio de cultura para produzir e acumular L-fenil-alanina no meio, a citada bactéria possuindo produtividade de L-fenil-alanina, e sintetizar alquil éster inferior de α-L-aspartil-L-fenil-alanina a partir de ácido aspártico ou de seu derivado e da L-fenil-alanina obtida. 11)0 método de acordo com o método acima, adicionalmente compreendendo as etapas de: esterificar a L-fenil-alanina para gerar um alquil éster inferior de L-fenil-alanina, condensar o alquil éster inferior da L-fenil-alanina com o derivado de ácido aspártico, no qual o derivado é anidrido N-acil-L-aspártico, separar o alquil éster inferior de N-acil-a-L-aspartil-L-fenil-alanina da mistura reacional, e hidrogenar o alquil éster inferior de N-acil-a-L-aspartil-L-fenil-alanina para gerar o alquil éster inferior de a-L-aspartil-L-fenil-alanina.
Na presente invenção, um aminoácido é de configuração L a não ser que seja indicado de outro modo. O método para a produção de L-aminoácido inclui a produção de L-fenil-alanina usando bactéria produtora de L-fenil-alanina na qual estão intensificadas as atividades das proteínas da presente invenção tal como aquela compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2. Também, o método para a produção de L-aminoácido inclui a produção de L-triptofano usando bactéria produtora de L-triptofano na qual estão intensificadas as atividades das proteínas da presente invenção tal como aquela compreendendo a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2. A presente invenção será explicada em detalhe abaixo. A bactéria da presente invenção é uma bactéria produtora de L-aminoácido pertencente ao gênero Escherichia, na qual a produção de L-aminoácido pela bactéria é aumentada pela intensificação de uma atividade das proteínas da presente invenção em uma célula da bactéria.
Na presente invenção, "bactéria produtora de L-aminoácido" significa uma bactéria que possui uma capacidade de produzir e de acumular o L-aminoácido em um meio, quando a bactéria for cultivada no meio. A capacidade de produção de L-aminoácido pode ser possuída pela bactéria como uma propriedade de uma cepa selvagem da bactéria ou pode ser conferida ou intensificada por procriação.
Modalidade preferida da bactéria da presente invenção é uma bactéria produtora de L-aminoácido pertencente ao gênero Escherichia que possui atividade intensificada das proteínas da presente invenção. Mais concretamente a bactéria da presente invenção hospeda o DNA possuindo o gene yddG superexpressado no cromossomo ou em plasmídeo da bactéria e possui atividade intensificada para produzir L-fenil-alanina. Outra modalidade preferida da bactéria da presente invenção é bactéria produtora de L-triptofano pertencente ao gênero Escherichia que possui atividade intensificada das proteínas da presente invenção. Mais concretamente, a bactéria da presente invenção hospeda o DNA possuindo o gene yddG superexpressado no cromossomo ou em um plasmídeo na bactéria e possui capacidade aumentada para produzir L-triptofano. A proteína da presente invenção inclui aquelas como definidas a seguir em (A) ou (B): (A) uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQID NO: 2 na Listagem de Seqüências; (B) uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos incluindo deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos na seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 na Listagem de Seqüências, e que possui uma atividade de fazer com que a bactéria possua resistência aumentada a um aminoácido tal como fenil-alanina e/ou a um análogo de aminoácido tal como p-fluoro-fenil-alanina, 5-fluoro-DL-triptofano ou semelhante. O número de "vários aminoácidos" difere dependendo da posição ou do tipo de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína. Pode ser 2 a 30, preferivelmente 2 a 15, e com maior preferência 2 a 5 para a proteína (A). "Resistência a L-fenil-alanina e/ou a um análogo de aminoácido" significa a capacidade da bactéria de crescer em um meio mínimo contendo L-fenil-alanina ou análogo de aminoácido em concentração sob a qual a cepa não modificada ou de tipo selvagem, ou parental da bactéria não pode crescer, ou a capacidade da bactéria de crescer mais rapidamente em um meio contendo L-fenil-alanina ou análogo de aminoácido do que a cepa não modificada ou de tipo selvagem, ou parental da bactéria. Os análogos de L-aminoácido são exemplificados por p-fluoro-fenil-alanina, 5-fluoro-DL-triptofano ou semelhantes. A concentração mencionada acima de L-aminoácido ou de análogo de aminoácido é em geral de 10 mg/mL a 25 mg/mL, preferivelmente de 15 mg/mL a 20 mg/mL no caso de L-fenil-alanina. A concentração mencionada acima de análogo de aminoácido é em geral de 0,1 mg/mL a 5 mg/mL, preferivelmente de 0,5 mg/mL a 2,0 mg/mL no caso de p-fluoro-fenil-alanina, e em geral é de 0,2 pg/mL a 20 pg/mL, preferivelmente de 2 pg/mL a 5 pg/mL no caso de 5-fluoro-DL-triptofano. A bactéria da presente invenção também inclui uma na qual a atividade da proteína da presente invenção é intensificada pela transformação da citada bactéria com DNA codificador da proteína como definida em (A) ou (B), ou pela alteração da seqüência de regulação da expressão de citado DNA no cromossomo da bactéria. O DNA, que é usado para modificação da bactéria da presente invenção pode codificar uma proteína possuindo atividade de excreção de L-aminoácido. Mais concretamente, o DNA é representado pelo gene yddG. O gene yddG pode ser obtido, por exemplo, por PCR usando iniciadores baseados na seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQID NO: 1. O DNA da presente invenção inclui um DNA codificador da proteína que inclui deleção, substituição, inserção ou adição de um ou vários aminoácidos em uma ou mais posições na proteína (A) desde que não eliminem a atividade da proteína. Embora o número de "vários" aminoácidos difira dependendo da posição e do tipo de resíduos de aminoácido na estrutura tridimensional da proteína, ele pode ser de 2 a 30, preferivelmente de 2 a 15, e com maior preferência de 2 a 5 para a proteína (A). O DNA codificador de substancialmente a mesma proteína que a proteína definida em (A) pode ser obtido, por exemplo, pela modificação da seqüência de nucleotídeos codificadora da proteína definida em (A) usando mutagênese sítio-direcionada de modo que um ou mais resíduos de aminoácido sejam deletados, substituídos, inseridos ou adicionados. Tal DNA modificado pode ser obtido por métodos convencionais usando tratamento com reagentes e condições geradoras de mutações. Tal tratamento inclui o tratamento do DNA codificador de proteínas da presente invenção com hidroxil-amina ou o tratamento da bactéria hospedando o DNA com irradiação de UV ou reagente tal como N-metil-N'-nitro-N-nitroso-guanidina ou ácido nitroso. O DNA da presente invenção inclui variantes que podem ser encontradas em diferentes cepas e variantes de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia de acordo com a diversidade natural. O DNA codificador de várias variantes pode ser obtido pelo isolamento do DNA, que hibridiza com o gene yddG ou com parte do gene sob condições rigorosas, e que codifica a proteína intensificadora da produção de L-fenil-alanina. O termo "condições rigorosas" é aqui referido como uma condição sob a qual é formado o denominado híbrido específico, e não é formado o híbrido não específico. Por exemplo, as condições rigorosas incluem uma condição sob a qual são hibridizados DNAs possuindo entre si homologia não menor do que 70%. Altemativamente, as condições rigorosas são exemplificadas pelas condições que compreendem a condição ordinária de lavagem em hibridização de Southern, por exemplo, 60°C, 1 x SSC, 0,1% SDS, preferivelmente 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Como uma sonda para DNA que codifica variantes e hibridiza com o gene yddG, também pode ser usada uma seqüência parcial da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. Uma tal sonda pode ser preparada por PCR usando oligonucleotídeos produzidos baseados na seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como iniciadores, e um fragmento de DNA contendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1 como um modelo. Quando um fragmento de DNA em um comprimento de cerca de 300 pb é usado como a sonda, as condições de lavagem para a hibridização consistem de, por exemplo, 50°C, 2 x SSC, e 0,1% SDS. A transformação da bactéria com um DNA codificador de uma proteína significa a introdução do DNA dentro da célula de bactéria por exemplo por métodos convencionais para aumentar a expressão do gene codificador da proteína da presente invenção e para intensificar a atividade da proteína na célula bacteriana.
Os métodos de intensificação da expressão de gene incluem um aumento do número de cópias do gene. A introdução de um gene em um vetor que é capaz de funcionar em uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia aumenta o número de cópias do gene. Para tais propósitos vetores de multicópias podem ser preferivelmente empregados. O vetor de multicópias é exemplificado por PBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMWl 19, pET22b ou semelhantes.
Além disso, a intensificação da expressão de gene pode ser conseguida pela introdução de cópias múltiplas do gene dentro do cromossomo bacteriano, por exemplo, pelo método de recombinação homóloga ou semelhante.
No caso de a expressão de dois ou mais genes ser intensificada, os genes podem ser hospedados juntos no mesmo plasmídeo ou separados em plasmídeos diferentes. Também é aceitável que um dos genes seja hospedado em um cromossomo, e o outro gene seja hospedado em um plasmídeo.
Por outro lado, a intensificação da expressão de gene pode ser conseguida pela colocação do DNA da presente invenção sob o controle de um promotor potente em vez do promotor nativo. Força de promotor é definida pela freqüência de ações de iniciação da síntese de RNA. Métodos para a avaliação da força de promotor e exemplos de promotores potentes são descritos por Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. ("Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates altemate structures", EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Por exemplo, é sabido que promotor PL de fago lambda é promotor constitutivo potente. Outros promotores potentes conhecidos são promotor lac, promotor trp, promotor trc, e semelhantes. Uso de promotor potente pode se combinado com multiplicação de cópias de gene. Métodos para a preparação de DNA cromossômico, hibridização, PCR, preparação de DNA plasmídeo, digestão e ligação de DNA, transformação, seleção de um oligonucleotídeo como um iniciador e semelhantes podem ser métodos ordinários bem conhecidos por uma pessoa experiente na arte. Estes métodos são descritos em Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) e semelhantes. A bactéria da presente invenção pode ser obtida pela introdução dos DNAs acima mencionados na bactéria pertencente ao gênero Escherichia inerentemente possuindo a capacidade de produzir L-aminoácido. Altemativamente, a bactéria da presente invenção pode ser obtida pela conferência da capacidade de produzir L-aminoácido à bactéria pertencente ao gênero Escherichia já hospedando os DNAs.
Uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia não é particularmente limitada desde que tenha uma capacidade para produzir L-aminoácido ou possa adquirir a capacidade. Os exemplos de bactéria pertencente ao gênero Escherichia incluem Escherichia coli.
Como uma cepa parental que é para ser intensificada na atividade de proteína da presente invenção, podem ser usadas as cepas de bactéria produtora de fenil-alanina pertencente ao gênero Escherichia, tais como a cepa AJ12739 {tyrAwTnlO, tyrR) (VKPM B-8197); cepa HW1089 (ATCC Accession No. 55371) hospedando o gene pheA34 (US 5.354.672); cepa mutante MWEClOl-b (KR8903681); cepas NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (US 4.407.952) e semelhantes. Também como uma cepa parental que é para ser intensificada na atividade da proteína da presente invenção, podem ser utilizadas a bactéria pertencente ao gênero Escherichia produtora de fenil-alanina, a cepa K-12 de E. coli [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), a cepa K-12 de E. coli [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), a cepa K-12 de E. coli [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) e a cepa K-12 de E. coli [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] chamada de AJ 12604 (FERM BP-3579) (Patente européia EP488424B1).
Como uma cepa parental que é para ser intensificada na atividade de proteína da presente invenção, pode ser usada a bactéria produtora de triptofano pertencente ao gênero Escherichia tal como as cepas de E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DS10123) deficientes em triptofanil-RNA sintetase codificada pelo gene mutante trpS (Patente US 5.756.345); cepa de E. coli SV164 (pGH5) possuindo alelo ser A livre de inibição de retroalimentação por serina (Patente US 6.180.373); cepas de E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) e AGX6 (pGX50) aroP (NRRL B-12264) defiente na enzima triptofanase (Patente US 4.371.614); cepa de E. coli AGX17/pGX50, pACKG-4-pps na qual uma capacidade de produção de fosfoenolpiruvato está intensificada (WO97/08333, Patente US 6.319.696) e semelhante. O método da presente invenção inclui o método para a produção de um L-aminoácido, compreendendo as etapas de: cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura, para permitir que o L-aminoácido seja produzido e acumulado no meio de cultura, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura. Também, o método da presente invenção inclui o método para a produção de L-fenil-alanina, compreendendo as etapas de: cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura, para permitir que L-fenil-alanina seja produzida e acumulada no meio de cultura, e coletar a L-fenil-alanina do meio de cultura. Também, o método da presente invenção inclui o método para a produção de L-triptofano, compreendendo as etapas de: cultivar a bactéria da presente invenção em um meio de cultura, para permitir que L-triptofano seja produzida e acumulada no meio de cultura, e coletar a L-triptofano do meio de cultura.
Na presente invenção, a cultura, a coleta e a purificação de L-aminoácido, tal como L-fenil-alanina e L-triptofano, do meio e semelhante podem ser realizadas em uma maneira semelhante ao método de fermentação convencional no qual um aminoácido é produzido usando um microorganismo. Um meio utilizado para a cultura pode ser quer um meio sintético quer um meio natural, desde que o meio inclua uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio e minerais e, se necessárias, quantidades apropriadas de nutrientes que o microorganismo requer para crescer. A fonte de carbono pode incluir vários carboidratos tais como glicose e sacarose, e vários ácidos orgânicos. Dependendo do modo de assimilação do microorganismo usado, álcool incluindo etanol e glicerol podem ser utilizado. Como a fonte de nitrogênio, são empregados vários sais de amônio tais como amônia e sulfato de amônio, ou outros compostos de nitrogênio tais como aminas, uma fonte de nitrogênio natural tal como peptona, hidrolisado de feijão-soja e microorganismo fermentativo digerido. Como minerais, monofosfato de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, cloreto de cálcio, e semelhantes são usados. Algum nutriente adicional pode ser adicionado no meio se necessário. Por exemplo, se o microorganismo requerer tirosina para crescimento (auxotrofia de tirosina) a quantidade suficiente de tirosina poderá ser adicionada no meio para cultura. A cultura é realizada preferivelmente sob condições aeróbicas tais como uma cultura vascolejada, e cultura agitada com aeração, em uma temperatura de 20°C a 42°C, preferivelmente de 37°C a 40°C. O pH da cultura está normalmente entre 5 e 9, preferivelmente entre 6,5 e 7,2. O pH da cultura pode ser ajustado com amônia, carbonato de cálcio, vários ácidos, várias bases, e soluções-tampão. Normalmente, um cultivo de 1-5 dias acarreta o acúmulo de L-aminoácido alvo no meio líquido.
Após o cultivo, sólidos tais como células podem ser removidos do meio líquido por centrifiigação ou filtração por membrana, e depois o L-aminoácido alvo pode ser coletado e purificado por método convencional tal como métodos de troca iônica, de concentração e de cristalização.
Fenil-alanina produzida pelo método da presente invenção pode ser usada, por exemplo, para a produção de alquil éster inferior de ct-L-aspartil-L-fenil-alanina (também referida como "aspartame"). Isto é, o método da presente invenção inclui o método para a produção de alquil éster inferior de α-L-aspartil-L-fenil-alanina pelo uso de L-fenil-alanina como uma matéria-prima. O método compreendendo a síntese de alquil éster inferior de α-L-aspartil-L-fenil-alanina a partir de L-fenil-alanina produzida pelo método da presente invenção como descrito acima e de ácido aspártico ou seu derivado. Como alquil éster inferior, metil-éster, etil-éster e propil-éster, ou semelhantes podem ser mencionados.
No método da presente invenção, um processo para a síntese de alquil éster inferior de α-L-aspartil-L-fenil-alanina a partir de L-fenil-alanina e de ácido aspártico ou de seu derivado não é particularmente limitado e qualquer método convencional pode ser aplicado desde que L-fenil-alanina ou seu derivado possa ser usada para a síntese de alquil éster inferior de a-L- aspartil-L-fenil-alanina. Concretamente, por exemplo, alquil éster inferior de a-L-aspartil-L-fenil-alanina pode ser produzido pelo seguinte processo (Patente US 3.786.039). L-fenil-alanina é esterificada para a obtenção de alquil éster inferior de L-fenil-alanina. O alquil éster de L-fenil-alanina é reagido com derivado de ácido L-aspártico cujos grupos amino e β-carboxila estão protegidos e o grupo α-carboxila é esterificado para ativação. O derivado inclui anidrido N-acil-L-aspártico tal como anidrido N-formil-, N-carbobenzóxi-, ou N-p-metóxi-carbobenzóxi-L-aspártico. Pela reação de condensação, mistura de N-acil-a-L-aspartil-L-fenil-alanina e N-acil-p-L-aspartil-L-fenil-alanina é obtida. Se a reação de condensação for realizada sob a presença de um ácido orgânico cuja constante de dissociação de ácido a 37°C é 10*4 ou menor, a razão da forma ot para a forma β na mistura será aumentada (Publicação Publicada de Patente Japonesa 51-113841). Depois a N-acil-a-L-aspartil-L-fenil-alanina é separada da mistura, seguida por hidrogenação para a obtenção de a-aspartil-L-fenil-alanina.
Breve descrição do desenho A Figura 1 mostra a estrutura da região de cromossomo construída a montante do geneyddG.
Melhor modo de realização da invenção A presente invenção será mais concretamente explicada abaixo com referência aos Exemplos.
Exemplo 1: Clonaeem de gene vddG de E. coli A seqüência de nucleotídeos inteira da cepa K-12 de E. coli já foi determinada {Science, 277, 1453-1474, 1997). Uma pesquisa de PSI-BLAST revelou que pelo menos 10 paralogos rhtA incluindo o gene yddG estão presentes no genoma de E. coli K-12. O gene yddG codifica a subunidade de transmembrana putativa cuja função é desconhecida.
Baseando-se na seqüência de nucleotídeos relatada foram sintetizados os iniciadores mostrados na SEQ ID NO: 3 (iniciador 1) e na SEQ ID NO: 4 (iniciador 2). O iniciador 1 é uma seqüência complementar a uma seqüência de 91 a 114 pb à jusante do códon de terminação do gene yddG com um sítio de reconhecimento BamHI de enzima de restrição introduzido em sua extremidade 5. O iniciador 2 é uma seqüência complementar a uma seqüência de 224 a 200 pb a montante do códon de iniciação com um sítio de reconhecimento Sali de enzima de restrição introduzido em sua extremidade 5 . O DNA cromossômico da cepa TG1 de E. coli foi preparado por um método ordinário. PCR foi realizada em "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" sob as seguintes condições: 40 s a 95°C, 40 s a 47°C, 40 s a 72°C, 30 ciclos por meio de Taq polimerase (Fermentas). O fragmento de PCR obtido contendo o gene yddG com seu próprio promotor foi tratado com restritases Bam HI e Sali e inserido em vetores de multicópias pUC19 e pAYCTER3 previamente tratados com as mesmas enzimas. Assim, os plasmídeos pYDDGl e pYDDG2, respectivamente, foram obtidos. O vetor pAYCTER3 é um derivado de um pAYC32, um vetor muito estável e de número de cópias moderado construído baseando-se no plasmídeo RSF1010 (Christoserdov A. Y., Tsygankov Y., D., "Broad-host range vectors derived ffom a RSF1010 Tnl plasmid", Plasmid, 1986, v. 16, pp. 161-167). O vetor pAYCTER3 foi obtido pela introdução do polylinker do plasmídeo pUC19 e de terminador forte rrnB no plasmídeo pAYC32 em vez de seu promotor como segue. Primeiro, o polylinker de plasmídeo pUC19 foi obtido por PCR usando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NO: 5 e 6. O produto de PCR obtido foi tratado com restritases ücoRI e Bdlii. O terminador rrnB também foi obtido por PCR utilizando os iniciadores mostrados nas SEQ ID NO: 7 e 8. O produto de PCR obtido foi tratado com restritases Bglil e Bell. Depois, estes dois fragmentos de DNA foram ligados no plasmídeo pAYC32 previamente tratado com restritases EcoBl e Bdlii. Assim o plasmídeo pAYCTER3 foi obtido.
Exemplo 2: O efeito da amplificação do gene vddG sobre a resistência da cepa TG1 de E. coli aos aminoácidos e aos análogos de aminoácido Os plasmídeos pYDDGl e pYDDG2 e os vetores pUC19 e pAYCTER3 foram introduzidos em cepa TG1 de E. coli. Assim foram obtidas as cepas TG1 (pYDDGl), TG1 (pYDDG2), TG1 (pUC19) e TG1 (pAYCTER3).
Então a capacidade destas cepas de crescerem na presença de aminoácidos e de análogos de aminoácido para cada cepa foi determinada em placas de ágar mínimo de glicose M9 contendo concentrações graduadas de inibidor. As placas foram inoculadas com 10 a 10 células de uma cultura noturna crescida em um meio mínimo (suplementado com 100 μg/mL de ampicilina para cepas de plasmídeo). O crescimento foi estimado após 44 h de incubação a 37°C. Os resultados são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 * +: crescimento bom; ±: crescimento insatisfatório; sem crescimento; n.d. -não determinado. ** Os mesmos resultados foram obtidos para a cepa TG1 hospedando o plasmídeo pAYCTER3.
Exemplo 3: Efeito da amplificação do gene vddG sobre a produção de fenil-alanina A cepa AJ12739 de E. coli produtora de fenil-alanina foi usada como uma cepa parental para a transformação com plasmídeos hospedando o gene yddG. A cepa AJ12739 está depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rússia, 113545 Moscou, lst Doroznhy proezd, 1), desde 6 de novembro de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8197. A cepa AJ12739 produtora de fenil-alanina foi transformada com o plasmídeo ou com o plasmídeo pTDDG2 ou com o vetor pAYCTER3 para a obtenção das cepas AJ12739/pYDDG2 e de AJ12739/pAYCTER3. Estas cepas foram cada uma cultivadas a 37°C por 18 horas em um caldo de nutrientes com 100 mg/L de ampicilina, e 0,3 mL da cultura obtida foi inoculado em 3 mL de um meio de fermentação contendo 100 mg/L de ampicilina, em um tubo de ensaio de 20 mm x 200 mm, e cultivadas a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo. Após o cultivo, uma quantidade acumulada de fenil-alanina no meio foi determinada por TLC. Placas de TLC de 10 cm x 15 cm revestidas com camadas de 0,11 mm de sílica-gel Sorbfil sem indicador fluorescente (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rússia) foram utilizadas. Placas Sorbfil foram desenvolvidas com uma fase móvel: propan-2-ol: acetato de etila: amônia aquosa 25%: água = 40: 40: 7: 16 (v/v). Uma solução (2%) de ninhidrina em acetona foi usada como um reagente de visualização. A composição do meio de fermentação (g/L): Glicose 40,0 (NH4)2S04 16,0 K2HP04 1,0 MgS04.7H20 1,0 FeS04.7H20 0,01 MnS04.5H20 0,01 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedura 2,0 Tirosina 0,125 CaC03 20,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente. CaC03 seco por calor é esterilizado a 180°C por 2 h. O pH é ajustado para 7,0. Antibiótico é introduzido no meio após a esterilização. Os resultados são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 Pode ser visto da Tabela 2 que a amplificação do gene yddG melhorou a produtividade de fenil-alanina da cepa AJ12739.
Exemplo 4: Substituição da região nativa do gene vddG a montante pelo elemento reeulatório híbrido transportando o promotor PT e SPi^7 em cromossomo de E. coli Para intensificar a expressão do gene yddG, a região de promotor PL precoce de fago λ (Gilado et al., J. Mol. Biol., 260, 484-491, 1996) ligada à seqüência de Shine-Dalgamo (seqüência SD) do gene lacZ de E. coli foi integrada na região codicadora yddG a montante no cromossomo da cepa BW25113 de E. coli em vez de a região nativa pelo método descrito por Datsenko K. A., e Wanner B. L. {Proc. Natl. Acad. Sei USAm 97, 6640-6645, 2000) também chamado de "integração Red-conduzida". Em adição, o fragmento de DNA artificial transportava o gene de resistência a cloranfenicol (CmR) (Fig. 1). A seqüência de nucleotídeos da região nativa substituída a montante do gene yddG está presente na Listagem de Seqüências (SEQ ID NO: 9). A construção do fragmento de DNA artificial integrado na região correspondente do cromossomo bacteriano foi realizada em várias etapas. Na primeira etapa, foi obtido por PCR o fragmento de DNA transportando o sítio de restrição - BglII na região "a montante", o promotor PLea seqüência SD do gene lacZ de E. coli diretamente ligado no códon de iniciação - ATG do gene yddG na região "a jusante". λϋΝΑ (#SD0011, "Fermentas", Lituânia" foi usado para a PCR como um modelo. PCR foi proporcionada usando iniciadores 1 (SEQ ID NO: 10) e P2 (SEQ ID NO: 11). Iniciador 1 contém sítio de restrição Bglll. Iniciador 2 contém a seqüência lambda DNA, sítio de restrição Xbal, seqüência SD do gene lacZ de E. coli e 36 nucleotídeos da matriz de leitura yddG. A seqüência de gene yddG foi introduzida no iniciador P2 para integração i?eí/-adicional do fragmento no cromossomo bacteriano.
Em todos os casos a PCR foi proporcionada usando o "Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System" amplificatório. A mistura reacional com o volume total de 100 pL consiste de: 10 μι de solução-tampão lOx PCR ("Fermentas", Lituânia) com a adição de MgCl2 até a concentração de 2 mM na mistura reacional, 200 μΜ cada de dNTP, 400 nM cada de iniciadores explorados e 2 μ Taq-polimerase ("Fermentas", Lituânia). A quantidade de DNA modelo para aplifícação adicional conduzida por PCR tem sido adicionada na mistura reacional no cálculo de 0,2 ng do fragmento de DNA alvo. A condição de PCR de temperatura foi a seguinte: desnaturação de DNA inicial por 5 min a 95°C seguida por 30 ciclos de desnaturação a +95°C por 30 s, recozimento a +50°C por 30 s, alongamento a +72°C por 30 s e polimerização final por 5 min a +72°C.
Em paralelo, o segundo estágio da construção de fragmento de DNA de interesse em sido proporcionado. Gene CmR foi amplificado por PCR utilizando o plasmídeo comercialmente disponível pACYC184 (Banco de Genes /número de acesso EMBL X06403, "Fermentas", Lituânia) como o modelo e os iniciadores P3 (SEQ ID NO: 12) e P4 (SEQ ID NO: 13). Iniciador P3 contém o sítio de restrição BglII usado para junção posterior com o fragmento de DNA inicialmente obtido transportando o promotor PL. O promotor P4 contém 36 nucleotídeos localizados a montante do gene yddG de E. coli necessário para integração Red-conduzida adicional do fragmento no cromossomo bacteriano.
Os dois fragmentos de DNA obtidos foram tratados com endonuclease de restrição Bglil seguido pelo procedimento de ligação usando T4 DNA polimerase (Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001). O produto ligado foi amplificado por PCR usando iniciadores P2 e P4. PCR foi proporcionada como descrito acima com as seguintes exceções: a mistura reacional continha 2 ng de produtos ligados e o tempo de alongamento foi aumentado para até 2 min. A estrutura da região de DNA construída a montante do gene yddG é mostrada na Figura 1. Seqüência de nucleotídeos da região de DNA construída é apresentada na SEQ ID NO: 14. O fragmento de DNA obtido purificado por precipitação com etanol foi usado para eletroporação e integração Red-conduzida no cromossomo bacteriano da cepa BW25113 de E. coli. O plasmídeo recombinante pKD46 (Datsenko, K. A., Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 97, 6640-6645, 2000) com o replicon termossensível foi empregado como o doador dos genes derivados de fago λ responsáveis pelo sistema de recombinação Red-conduzido.
As células de BW25113 (pKD46) foram crescidas durante a noite a +30°C no meio LB líquido com a adição de ampicilina (100 pg/mL), depois diluídas 1:100 pelo meio SOC (extrato de levedura, 5 g/L; NaCl, 0,5 g/L; Triptona, 20 g/L; KC1, 2,5 mM, MgCl2, 10 mM) com a adição de ampicilina (100 pg/mL) e L-arabinose (10 mM) (arabinose é usada para induzir os genes codificadores do plasmídeo do sistema Red-conduzido) e crescidas a +30°C para cada densidade óptica de cultura bacteriana OD60o = 0,4-0,7. As células crescidas dos 10 mL da cultura bacteriana foram lavadas 3 vezes por água deionizada gelada seguido pela suspensão em 100 pL de água. 10 pL de fragmento de DNA (10 ng) solubilizados em água deionizada foram adicionados na suspensão celular. A eletroporação foi realizada pelo eletroporador "Bio-Rad" (USA) (No. 165-2098, versão 2-89) de acordo com as instruções do fabricante. Células chocadas foram adicionadas em 1 mL SOC, incubadas 2 h a 37°C, e depois foram espalhadas sobre L-ágar contendo 25 μg/nlL de cloranfenicol. Colônias crescidas dentro de 24 h foram testadas para a presença de marcador CmR a montante do gene yddG poe PCR usando iniciadores P4 (SEQ ID NO: 13) e P5 (SEQ ID NO: 15). Para este propósito, uma colônia recém-isolada foi suspensa em 20 pL de água e depois 1 pL foi usado na PCR. As condições de PCR foram as seguintes: desnaturação inicial de DNA por 10 min a 95°C; depois 30 ciclos de desnaturação a +95°C por 30 s; recozimento a +50°C por 30 s e alongamento a +72°C por 50 s; a polimerização final por 5 min a +72°C. Umas poucas colônias CmR testadas continham o fragmento de DNA de 2172 nt necessário.
Exemplo 5: Efeito da expressão intensificada do gene vddG sobre a produção de triptofano A cepa SV164 (pGH5) de E. coli produtora de triptofano foi utilizada como uma cepa parental para a avaliação do efeito da expressão intensificada do gene yddG sobre a produção de triptofano. A cepa SV164 (pGH5) é descrita em detalhe na Patente US 6.180.373 ou na Patente Européia 0662143.
Para testar um efeito da intensificação da expressão do gene yddG sob o controle de promotor constitutivo forte PL sobre a produção de triptofano, o fragmento de DNA acima mencionado do cromossomo da cepa BW25113 de E. coli foi transferido para a cepa SV164 (pGH5) de E. coli produtora de triptofano por transdução PI (Miller, J. H., (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, ΝΎ) para a obtenção de SV164 PL-yddG (pGH5).
Tanto a cepa SV164 (pGH5) quanto a cepa SV164 PL-yddG (pGH5) foram cultivadas com agitação a 37°C porl8 horas em 3 mL de caldo de nutriente suplementado com 20 pg/mL de tetraciclina (marcador do plasmídeo pGH5). 0,3 mL das culturas obtidas foi inoculado em 3 mL de um meio de fermentação contendo tetraciclina (20 pg/mL) em tubos de ensaio 20 mm x 200 mm, e cultivado a 37°C por 48 horas com um agitador rotativo a 250 rpm. A composição do meio de fermentação é apresentada na Tabela 3.
Tabela 3 Seção A teve pH 7,1 ajustado por NH4OH. Cada seção foi esterilizada em separado.
Após o cultivo, a quantidade de triptofano acumulada no meio foi determinada por TLC como descrito no Exemplo 3. Os dados obtidos são apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 *Foram apresentados resultados de pelo menos seis experimentos independentes para cada cepa.
Pode ser visto da Tabela 4 que a intensificação da expressão do gene yddG aumentou a produtividade de triptofano da cepa SV164 (pGH5).
Aplicabilidade industrial De acordo com a presente invenção, é proporcionada uma bactéria pertencente ao gênero Escherichia possuindo produtividade aumentada de aminoácido, por exemplo, de L-fenil-alanina e de L-triptofano, e é proporcionado um método para a produção de L-amino-ácido usando a bactéria.
Claims (7)
1. Bactéria produtora de L-aminoácido pertencente ao gênero Escherkhia, caracterizada pelo fato de que a produção de L-aminoácido pela cilada bactéria é aumentada pela intensificação da atividade de uma proteína como definida a seguir em (A) em uma célula da citada bactéria pela transformação da citada bactéria com um vetor de múltiplas cópias contendo um DNA codificando a proteína como definida em (A), ou pela substituição do promotor nativo do citado DNA no cromossoma da bactéria por um promotor mais potente: (A) uma proteína que é codificada pelo gene yddG compreendendo a sequência de nucleotídeos mostrada em SEQ ID NO: 1 na listagem de sequências; em que o L-aminoácido é L-fenil-alanina ou L-triptofano.
2. Bactéria de acordo com a reivindicação I. caracterizada pelo fato de que a bactéria pertencente ao gênero Escherichia é Escheríchia coli.
3. Método para a produção de um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria como definida na reivindicação 1 ou 2, em um meio de cultura e coletar do meio de cultura o L-aminoácido a ser produzido e acumulado no meio, em que o L-aminoácido é L-fenil-alanina ou L-triptofano,
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-fenil-alanina.
5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é L-triptofano.
6. Método para a produção de alquil cstcr inferior dc a-L-aspartil-L-fenil-alanína, caracterizado pelo fato de compreender cultivar a bactéria como definida na reivindicação 1 ou 2 em um meio de cultura para produzir e acumular L-fenil-alanina no meio, a citada bactéria possuindo produtividade de L-fenil-alanina, e sintetizar alquil éster inferior de α-L-aspartil-L-fenil-alanina a partir de ácido aspártico ou de seu derivado e da L-fenil-alanina obtida.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender as etapas de: esterificar a L-fenil-alanina para gerar um alquil éster inferior de L-fenil-alanina, condensar o alquil éster inferior da L-fenil-alanina com o derivado de ácido aspártico, no qual o derivado é anidrido N-acil-L-aspártico, separar o alquil éster inferior de N-acil-oc-L-aspartil-L-fenil-alanina da mistura reacional, e hidrogenar o alquil éster inferior de N-acil-a-L-aspartil-L-fenil-alanina para gerar o alquil éster inferior de a-L-aspartil-L-fenil-alanina.
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