PL207852B1 - Bakteria z rodzaju Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu i sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny - Google Patents

Bakteria z rodzaju Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu i sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny

Info

Publication number
PL207852B1
PL207852B1 PL369471A PL36947102A PL207852B1 PL 207852 B1 PL207852 B1 PL 207852B1 PL 369471 A PL369471 A PL 369471A PL 36947102 A PL36947102 A PL 36947102A PL 207852 B1 PL207852 B1 PL 207852B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
phenylalanine
amino acid
bacterium
dna
protein
Prior art date
Application number
PL369471A
Other languages
English (en)
Other versions
PL369471A1 (pl
Inventor
Vitaliy Arkadyevich Livshits
Maria Viacheslavovna Vitushkina
Sergey Vladimirovich Mashko
Vera Georgievna Doroshenko
Irina Vladimirovna Biryukova
Zhanna Iosifovna Katashkina
Aleksandra Yurievna Skorokhodova
Alla Valentinovna Belareva
Original Assignee
Ajinomoto Co Inc
Ajinomoto Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26654105&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL207852(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from RU2001131571/13A external-priority patent/RU2001131571A/ru
Priority claimed from RU2002121670/13A external-priority patent/RU2222596C1/ru
Application filed by Ajinomoto Co Inc, Ajinomoto Kk filed Critical Ajinomoto Co Inc
Publication of PL369471A1 publication Critical patent/PL369471A1/pl
Publication of PL207852B1 publication Critical patent/PL207852B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/222—Phenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy dziedziny biotechnologii a przedmiotem wynalazku są bakteria z rodzaju
Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu i sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
Konwencjonalnie L-aminokwasy wytwarzano metodą fermentacji wykorzystując szczepy mikroorganizmów otrzymywane ze źródeł naturalnych lub mutantów tych samych szczepów, zwłaszcza ze zmodyfikowanych w celu podniesienia wydajności wytwarzania L-aminokwasów.
Ujawniono wiele technik podnoszenia wydajności wytwarzania L-aminokwasów, na przykład, przez transformację mikroorganizmu rekombinowanym DNA (na przykład, US 4,278,765). Techniki te opierają się na podwyższaniu aktywności enzymów biorących udział w biosyntezie aminokwasów i/lub pozbawianiu wrażliwości enzymów docelowych na hamowanie przez sprzężenie zwrotne powodowane przez wytwarzany L-aminokwas (na przykład JP 56-18596 (1981), WO 95/16042 lub US 5 661 012 i US 6 040 160).
Z drugiej strony, zwiększenie wydzielania aminokwasu może poprawiać produktywność szczepu wytwarzającego L-aminokwas. Ujawniono wytwarzający lizynę szczep bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium wykazujący podwyższoną ekspresję genu wydzielania L-lizyny (gen lysE) (WO 97 23597A2). Ponadto, ujawniono geny kodujące białka wspomagające sekrecję L-cysteiny, L-cystyny, N-acetyloseryny lub pochodnych tiazolidynowych (US 5 972 663).
Obecnie ujawniono kilka genów Escherichia coli kodujących domniemane białka błonowe wzmacniające wytwarzanie L-aminokwasów. Dodatkowe kopie genu rhtB czynią bakterię bardziej oporną na L-homoserynę i wzmacniają wytwarzanie L-homoseryny, L-treoniny, L-alaniny, L-waliny i L-izoleucyny (EP 994190A2). Dodatkowe kopie genu rhtC czynią bakterię bardziej oporną na L-homoserynę i L-treoninę i wzmacniają wytwarzanie L-homoseryny, L-treoniny i L-leucyny (EP 1013765A1). Dodatkowe kopie genów yahN, yeaS, yfiK i yggA wzmacniają wytwarzanie kwasu L-glutaminowego, L-lizyny, L-treoniny, L-alaniny, L-histydyny, L-proliny, L-argininy, L-waliny oraz L-izoleucyny (EP 1016710A2).
Twórcy wynalazku otrzymali wcześniej mutanta E.coli K-12, posiadającego mutację thrR (określanego jako rhtA23), która nadaje oporność na wysokie stężenia treoniny lub homoseryny w podłożu minimalnym (Astaurova, O.B. i in., Appl. Bioch. and Microbiol., 21, 611-616 (1985)). Mutacja powodowała poprawę wytwarzania L-treoniny (SU 974817), homoseryny i glutaminianu (Astaurova, O.B. i in., Appl. Bioch. and Microbiol., 27, 556-561, 1991) przez poszczególne szczepy E. coli.
Ponadto, twórcy wynalazku ujawnili, że gen rhtA znajduje się na 18 minucie chromosomu E.coli, w pobliżu operonu glnHPQ, który koduje składowe układu transportowego glutaminy oraz, że gen rhtA jest identyczny z otwartą ramką odczytu ybiF pomiędzy genami pexB i ompX. Jednostkę odpowiedzialną za ekspresję białka kodowanego przez otwartą ramkę odczytu oznaczono jako gen rhtA (rht: oporność na homoserynę i treoninę).
Poza tym, twórcy wynalazku stwierdzili, że amplifikacja genu rhtA nadaje również oporność na homoserynę i treoninę. Mutacja rhtA23 jest podstawieniem A w miejsce G w pozycji -1 w odniesieniu do kodonu start ATG (skróty 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology w połączeniu z Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology 1997, San Francisco, Kalifornia 24-29 sierpnia 1997, skrót nr 457). Wiadomo, że układ nukleotydów w regionie pomiędzy sekwencją SD i kodonem start, a szczególnie sekwencja znajdująca się bezpośrednio przed kodonem start, istotnie wpływa na zdolność translacji mRNA. Stwierdzono 20 zakresów poziomu ekspresji, w zależności od charakteru trzech nukleotydów poprzedzających kodon start (Gold i in., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui i in., EMBO J.,3, 623-629, 1984). Dlatego też można spodziewać się, że mutacja rhtA23 powoduje zwiększenie ekspresji genu rhtA.
Gen rhtA koduje białko, które składa się z 295 reszt aminokwasowych a jego wyliczona masa cząsteczkowa wynosi 31,3 kDa. Analiza sekwencji RhtA wykazała, że jest to wysoce hydrofobowe białko, zawierające 10 domniemanych elementów transbłonowych. Przeszukiwanie PSI-BLAST sekwencji nukleotydowej szczepu K-12 E.coli, należącego do rodzaju Escherichia (Science, 277, 14531474 (1997)) ujawniło co najmniej 10 białek homologicznych do RhtA. Wśród nich znajdowały się białka kodowane przez geny ydeD i yddG. Wykazano, że gen ydeD bierze udział w wypływie metabolitów szlaku cysteiny (Daeler i in.. Mol. Microbiol., 36, 1101-1112, 2000; US 5 972 663). Gen yddG jest znany jako domniemana sekwencja kodująca, która może kodować funkcjonalnie nieznane białko (numery 3687 do 4568 w sekwencji z GenBank o numerze dostępu AE000244 U00096).
PL 207 852 B1
Celem wynalazku jest zwiększenie produktywności szczepu wytwarzającego L-fenyloalaninę oraz opracowanie sposobu wytwarzania L-fenyloalaniny z wykorzystaniem tego szczepu a także zwiększenie produktywności szczepu wytwarzającego L-tryptofan oraz opracowanie sposobu wytwarzania L-tryptofanu z wykorzystaniem tego szczepu.
Kiedy allel genu typu dzikiego zamplifikowano na wektorze wysokokopijnym w mikroorganizmie, zidentyfikowano gen yddG kodujący białko błonowe, homolog RhtA, które nie jest zaangażowane w szlak biosyntezy docelowych L-aminokwasów a nadaje mikroorganizmowi oporność na fenyloalaninę i kilka analogów aminokwasowych. Poza tym, gen yddG może wzmacniać wytwarzanie L-fenyloalaniny, kiedy jego dodatkowe kopie wprowadzi się do komórek każdego wytwarzającego szczepu. Gen yddG może także wzmacniać wytwarzanie L-tryptofanu, jeśli zwiększy się jego ekspresję w komórkach każdego wytwarzającego szczepu.
W rozwiązaniu według wynalazku aminokwas jest w konfiguracji L, o ile nie stwierdzono inaczej.
Sposób wytwarzania L-aminokwasu obejmuje wytwarzanie L-fenyloalaniny z wykorzystaniem bakterii wytwarzającej L-fenyloalaninę, w której wzmocnione są aktywności białek według wynalazku, takich jak te zawierające sekwencję aminokwasową o numerze identyfikacyjnym: 2. Ponadto, sposób wytwarzania L-aminokwasu obejmuje wytwarzanie L-tryptofanu z wykorzystaniem bakterii wytwarzającej L-tryptofan, w której wzmocnione są aktywności białek według wynalazku, takich jak te zawierające sekwencję aminokwasową przedstawioną w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 2.
Przedmiotem wynalazku jest bakteria z rodzaju Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, która charakteryzuje się tym, że wytwarzanie L-aminokwasu przez tę bakterię jest zwiększone w porównaniu do szczepu niezmodyfikowanego, poprzez zwiększoną aktywność białka zdefiniowanego w (A) lub (B) w komórce bakterii, poprzez transformację bakterii DNA kodującym białko zdefiniowane w (A) lub (B) poprzez wprowadzenie wielokrotnych kopii DNA kodującego białko zdefiniowane w (A) lub (B) do chromosomu bakteryjnego, lub wytwarzanie L-aminokwasu przez tę bakterię jest zwiększone przez umieszczenie tego DNA pod kontrolą promotora wybranego spośród PL promotora, lac promotora, trp promotora i trc promotora, przy czym:
(A) białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, (B) białko o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego do 30 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, i które wykazuje aktywność nadającą bakterii oporność na L-fenyloalaninę, p-fluorofenyloalaninę lub 5-fluoro-DL-tryptofan.
Transformację przeprowadza się wysokokopijnym wektorem zawierającym DNA.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu, który obejmuje etapy, w których hoduje się określoną bakterię w podłożu hodowlanym i z podłoża hodowlanego wyodrębnia się L-aminokwas, wytworzony i nagromadzony w tym podłożu.
Hoduje się tę bakterię, która ma zwiększoną ekspresję genów zaangażowanych w biosyntezę fenyloalaniny lub tryptofanu.
Innym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, który obejmuje etapy, w których hoduje się określoną bakterię w podłożu hodowlanym do wytworzenia i nagromadzenia L-fenyloalaniny w podłożu, przy czym bakteria wykazuje zdolność wytwarzania L-fenyloalaniny oraz syntezuje się niższy ester alkilowy α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z kwasu asparaginowego lub jego pochodnej i otrzymanej L-fenyloalaniny.
Sposób według wynalazku dodatkowo obejmuje etapy, w których estryfikuje się L-fenyloalaninę do utworzenia niższego estru alkilowego L-fenyloalaniny, kondensuje się niższy ester alkilowy L-fenyloalaniny z pochodną kwasu asparaginowego, przy czym pochodną jest bezwodnik N-acylo-L-asparaginowy, oddziela się niższy ester alkilowy N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z mieszaniny reakcyjnej, i przeprowadza się uwodornianie niższego estru alkilowego N-acyl-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny do utworzenia niższego estru alkilowego a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
Wynalazek wyjaśniono szczegółowo poniżej.
Bakterią według wynalazku jest wytwarzająca L-aminokwas bakteria należąca do rodzaju Escherichia, przy czym wytwarzanie L-aminokwasu przez bakterię jest zwiększone przez zwiększenie aktywności białka według wynalazku w komórce bakterii.
PL 207 852 B1
Bakteria wytwarzająca L-aminokwas oznacza bakterię, która posiada zdolność do wytwarzania i akumulacji L-aminokwasu w podłożu, kiedy bakterię hoduje się w podłożu. Bakteria może posiadać zdolność wytwarzania L-aminokwasu jako właściwość szczepu dzikiego bakterii lub może ją uzyskać lub może być ona wzmocniona w wyniku hodowli.
Korzystnym przykładem bakterii według wynalazku jest wytwarzająca L-fenyloalaninę bakteria należąca do rodzaju Escherichia, która wykazuje zwiększoną aktywność białek według wynalazku. Konkretnie, bakteria według wynalazku posiada na chromosomie lub na plazmidzie DNA z genem yddG ulegającym nadekspresji i wykazuje wzmocnioną zdolność do wytwarzania L-fenyloalaniny. Innym korzystnym przykładem bakterii według wynalazku jest wytwarzająca L-tryptofan bakteria należąca do rodzaju Escherichia, która wykazuje zwiększoną aktywność białek według wynalazku. Konkretnie, bakteria według wynalazku posiada na chromosomie lub na plazmidzie DNA z genem yddG ulegającym nadekspresji i wykazuje wzmocnioną zdolność do wytwarzania L-tryptofanu.
Białko według wynalazku obejmuje te zdefiniowane w poniższych punktach, (A) lub (B):
(A) białko, o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji;
(B) białko, o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercję lub addycją jednego lub kilku aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 w Liście Sekwencji i, które nadaje bakterii wzmocnioną oporność na aminokwas, taki jak fenyloalanina i/lub analog aminokwasowy, taki jak p-fluorofenyloalanina oraz 5-fluoro-DL-tryptofan, lub podobne.
Liczba „kilka aminokwasów zależy od pozycji lub rodzaju reszty aminokwasowej w trzeciorzędowej strukturze białka. Może to być od 2 do 30, korzystnie od 2 do 15, a najkorzystniej od 2 do 5 dla białka (A).
Oporność na L-fenyloalaninę i/lub analog aminokwasowy oznacza zdolność bakterii do wzrostu w podłożu minimalnym zawierającym L-fenyloalaninę lub analog aminokwasowy w stężeniu, w którym bakteria niezmodyfikowana lub typu dzikiego, b ą d ź szczep macierzysty bakterii nie moż e rosnąć, lub oznacza zdolność bakterii do szybszego wzrostu w podłożu zawierającym L-fenyloalaninę bądź analog aminokwasowy niż bakteria niezmodyfikowana lub typu dzikiego, bądź szczep macierzysty bakterii. Przykładami analogów L-aminokwasów są p-fluorofenyloalanina, 5-fluoro-DL-tryptofan lub podobne. Stężenie L-aminokwasu wynosi od 10 do 25 mg/ml, korzystnie od 15 do 20 mg/ml w przypadku L-fenyloalaniny. Stężenie analogu aminokwasowego wynosi od 0,1 do 5 mg/ml, korzystnie od
0,5 do 2,0 mg/ml w przypadku p-fluorofenyloalaniny a w przypadku 5-fluoro-DL-tryptofanu od 0,2 do μg/ml, korzystnie od 2 do 5 μg/ml.
Bakteria według wynalazku obejmuje również bakterię, dla której aktywność białka według wynalazku wzmacnia się przez transformację bakterii DNA kodującym białko, jak zdefiniowano w (A) lub (B), bądź przez zmianę sekwencji regulatorowej DNA w chromosomie bakterii.
DNA, który stosuje się do modyfikacji bakterii według wynalazku może kodować białko wykazujące aktywność wydzielania L-aminokwasu, Konkretnie, DNA stanowi gen yddG. Gen yddG można otrzymać, na przykład, metodą PCR z zastosowaniem starterów opartych na sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1.
DNA według wynalazku obejmuje DNA kodujący białko, które zawiera delecję, substytucję, insercję lub addycję jednego bądź kilku aminokwasów w jednej lub więcej pozycjach białka (A), dopóki nie utraci ono aktywności białka. Chociaż liczba „kilku aminokwasów różni się w zależności od pozycji lub rodzaju reszty aminokwasowej w trzeciorzędowej strukturze białka, może ona wynosić od 2 do 30, korzystnie od 2 do 15, a najkorzystniej od 2 do 5 dla białka (A). DNA kodujący zasadniczo takie samo białko jak białko zdefiniowane w (A) można otrzymać przez, na przykład, modyfikację sekwencji nukleotydowej kodującej białko zdefiniowane w (A) wykorzystując mutagenezę ukierunkowaną tak, że jedna lub więcej reszt aminokwasowych ulegnie delecji, substytucji, insercji lub addycji. Tak zmodyfikowany DNA można otrzymać konwencjonalnymi metodami, traktując mutagennymi odczynnikami i warunkami. Takie traktowanie obejmuje traktowanie DNA kodującego białko według wynalazku hydroksyloamina lub poddanie bakterii niosącej DNA działaniu promieniowania UV lub traktowaniu odczynnikiem, takim jak N-metylo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyna lub kwas azotowy III.
DNA według wynalazku obejmuje warianty, które mogą występować w różnych szczepach i odmianach bakterii należących do rodzaju Escherichia, zgodnie z naturalną różnorodnością biologiczną. DNA kodujący takie warianty można otrzymać przez izolację DNA, który hybrydyzuje z genem lub częścią genu yddG w ostrych warunkach i, który koduje białko zwiększające wytwarzanie L-fenyloalaniny. Terminem ostre warunki określa się w opisie warunki, w których powstaje tak zwany specyficzny produkt hybrydyzacji natomiast nie tworzą się niespecyficzne produkty hybrydyzacji. Na przyPL 207 852 B1 kład, ostre warunki obejmują warunki, w których hybrydyzują fragmenty DNA o wysokiej homologii, na przykład fragmenty DNA o homologii jeden do drugiego nie mniejszej niż 70%. Alternatywnie, przykładami surowych warunków są warunki zwykle stosowane przy przemywaniu w hybrydyzacji Southerna, np. 60°C, 1 x SSC, 0,1% SDS, korzystnie 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Można również zastosować część sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1 jako sondę dla DNA, który koduje warianty i hybrydyzuje z genem yddG. Taką sondę można przygotować metodą PCR, stosując jako startery oligonukleotydy utworzone na podstawie sekwencji nukleotydowej o numerze identyfikacyjnym: 1, a jako matrycę fragment DNA zawieraj ą cy sekwencję nukleotydową o numerze identyfikacyjnym: 1. Jeśli jako sondę stosuje się fragment DNA o długości około 300 bp, warunki przemywania przy hybrydyzacji obejmują, na przykład, 50°C, 2 X SSC i 0,1% SDS.
Transformacja bakterii DNA kodującym białko oznacza wprowadzenie konwencjonalnymi metodami DNA do komórki bakterii w celu podwyższenia ekspresji genu kodującego białko według wynalazku i wzmocnienia aktywności białka w komórce bakteryjnej.
Sposoby wzmacniania ekspresji genu obejmują zwiększenie liczby kopii genu. Wprowadzenie genu do wektora, który jest zdolny do funkcjonowania w bakterii należącej do rodzaju Escherichia zwiększa liczbę kopii genu. W tym celu korzystne jest stosowanie wektorów wysokokopijnych. Przykładami wektorów są pBR322, pUC19, pBluescript KS+, pACYC177, pACYC184, pAYC32, pMW119, pET22b lub podobne.
Poza tym, zwiększenie ekspresji genu można osiągnąć przez wprowadzenie wielu kopii genu do chromosomu bakteryjnego, na przykład, metodą rekombinacji homologicznej lub podobnymi.
W przypadku zwię kszenia ekspresji dwóch lub więcej genów, geny mogą znajdować się razem na tym samym plazmidzie lub oddzielnie na różnych plazmidach. Dopuszczalne jest również, aby jeden gen znajdował się na chromosomie a drugi na plazmidzie.
Z drugiej strony, zwiększenie ekspresji genu można osiągnąć przez umieszczenie DNA według wynalazku pod kontrolą silniejszego promotora zamiast promotora natywnego.
Siłę promotora definiuje się przez częstość zdarzeń inicjacji syntezy RNA. Metody oceny siły promotora i przykłady silnych promotorów opisali Deuschle, U., Kammerer, W., Gentz, R., Bujard, H. (Promoters in Escherichia coli: a hierarchy of in vivo strength indicates alternate structures. EMBO J. 1986, 5, 2987-2994). Na przykład, promotor PL faga lambda jest znany jako silny konstytutywny promotor. Innymi znanymi silnymi promotorami są promotor lac, promotor trp, promotor trc i podobne. Stosowanie silnego promotora można łączyć ze zwielokrotnianiem kopii genu.
Metody przygotowywania chromosalnego DNA, hybrydyzacji, PCR, przygotowywania plazmidowego DNA, trawienia i ligacji DNA, transformacji, wyboru oligonukleotydu jako startera i podobne mogą być zwyczajnymi metodami znanymi specjalistom w tej dziedzinie. Metody te opisano w Sambrook, J. i Russell D., Molecular Cloning A Laboratory Manual, wydanie trzecie, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) i podobnych.
Bakterię według wynalazku można otrzymać przez wprowadzenie DNA do bakterii należącej do rodzaju Escherichia, posiadającej wrodzoną zdolność do wytwarzania L-aminokwasów. Alternatywnie, bakterię według wynalazku można otrzymać przez nadanie zdolności do wytwarzania L-aminokwasu bakterii należącej do rodzaju Escherichia posiadającej już DNA.
Bakteria należąca do rodzaju Escherichia nie jest szczególnie ograniczona tak długo, jak wykazuje zdolność do wytwarzania L-aminokwasu lub można jej tę zdolność nadać. Przykłady bakterii należącej do rodzaju Escherichia obejmują Escherichia coli.
Jako szczep macierzysty, który wzmacnia się pod względem aktywności białka według wynalazku można stosować wytwarzającą fenyloalaninę bakterię należącą do rodzaju Escherichia, taką jak szczep AJ12739 E. coli (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), szczep HW1089 (numer dostępu ATCC 55371) zawierający gen pheA34 (US 5 354 672), szczep mutanta MWEC101-b (KR8903681), szczepy NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 i NRRL B-12147 (US 4 407 952) i podobne. Również jako szczep macierzysty, który wzmacnia się pod względem aktywności białka według wynalazku można stosować wytwarzającą fenyloalaninę bakterię należącą do rodzaju Escherichia, taką jak szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) i szczep K-12 E. coli [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB] nazwany AJ 12604 (FERM BP-3579) i podobne (EP 488424B1).
Jako szczep macierzysty, który wzmacnia się pod względem aktywności białka według wynalazku można stosować wytwarzającą tryptofan bakterię należącą do rodzaju Escherichia, taką jak
PL 207 852 B1 szczepy JP4735/pMU3028 (DSM10122) i JP6015/pMU91 (DSM10123) E. coli pozbawione syntetazy tryptofanylo-tRNA kodowanej przez zmutowany gen trpS (EP 5 756 345); szczep SV164 E. coli (pGH5) posiadający allel serA uwolniony od hamowania zwrotnego przez serynę (EP 6 180 373), szczepy AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) i AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) E. coli pozbawione enzymu tryptofanazy (US 4 371 614), szczep AGX17/pGX50, pACKG4-pps E. coli, w którym wzmocniono zdolność wytwarzania fosfoenolopirogronianu (WO 97/08333, US 6 319 696) i podobne.
Sposób według wynalazku obejmuje sposób wytwarzania L-aminokwasu, obejmujący etapy hodowania bakterii według wynalazku w podłożu hodowlanym, umożliwienia wytwarzania i akumulacji L-aminokwasu w podłożu hodowlanym oraz zbierania L-aminokwasu z podłoża hodowlanego. Sposób według wynalazku obejmuje również sposób wytwarzania L-fenyloalaniny, obejmujący etapy hodowania bakterii według wynalazku w podłożu hodowlanym, umożliwienia wytwarzania i akumulacji L-fenyloalaniny w podłożu hodowlanym oraz zbierania L-fenyloalaniny z podłoża hodowlanego. Sposób według wynalazku obejmuje również sposób wytwarzania L-tryptofanu, obejmujący etapy hodowania bakterii według wynalazku w podłożu hodowlanym, umożliwienia wytwarzania i akumulacji L-tryptofanu w podłożu hodowlanym oraz zbierania L-tryptofanu z podłoża hodowlanego.
W wynalazku, hodowla, zbieranie i oczyszczanie L-aminokwasów, takich jak L-fenyloalanina i L-tryptofan, z podłoż a i podobne czynności można przeprowadzać podobnie do konwencjonalnych metod fermentacji, w których aminokwas wytwarza się przy wykorzystaniu mikroorganizmu. Podłoże stosowane do hodowli może być albo podłożem syntetycznym albo naturalnym, o ile podłoże zawiera źródło węgla i źródło azotu oraz soli mineralnych, jeśli to konieczne, odpowiednie ilości składników odżywczych, których mikroorganizm wymaga do wzrostu. Źródło węgla mogą stanowić różne węglowodany, takie jak glukoza i sacharoza oraz różne kwasy organiczne. W zależności od sposobu asymilacji stosowanego mikroorganizmu, można wykorzystywać alkohol, obejmujący etanol i glicerol. Jako źródło azotu stosuje się różne sole amonowe, takie jak amoniak i siarczan amonowy, inne związki azotowe, takie jak aminy, naturalne źródła azotu, takie jak pepton, hydrolizat sojowy i trawione mikroorganizmy fermentacyjne. Jako sole mineralne stosuje się monofosforan potasowy, siarczan magnezowy, chlorek sodowy, siarczan żelaza, siarczan manganowy, chlorek wapniowy i podobne. Jeśli jest to konieczne do podłoża można dodawać pewne dodatkowe składniki odżywcze. Na przykład, jeśli mikroorganizm wymaga do wzrostu tyrozyny (auksotroficzny pod względem tyrozyny) do podłoża hodowlanego można dodać odpowiednią ilość tyrozyny.
Hodowlę przeprowadza się korzystnie w warunkach tlenowych, tak jak w hodowli z wytrząsaniem i hodowli z mieszaniem i napowietrzaniem, w temperaturze od 20 do 42°C, korzystnie od 37 do 40°C. pH hodowli pozostaje zazwyczaj w zakresie pomiędzy 5 a 9, korzystnie pomiędzy 6,5 a 7,2. pH hodowli można ustalić stosując amoniak, węglan wapnia, różne kwasy, różne zasady i bufory. Zazwyczaj, hodowla 1-5-dniowa prowadzi do akumulacji docelowego L-aminokwasu w podłożu płynnym.
Po hodowli elementy w stanie stałym, takie jak komórki można usuwać z podłoża płynnego przez wirowanie lub sączenie membranowe a następnie docelowy L-aminokwas można zbierać i oczyszczać konwencjonalnymi metodami, takimi jak metody z wykorzystaniem wymiany jonowej, zatężania i krystalizacji,
Fenyloalaninę wytwarzaną sposobem według wynalazku można stosować, na przykład, do wytwarzania estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny (określanej również jako „aspartam). To jest, sposób według wynalazku obejmuje sposób wytwarzania estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z wykorzystaniem L-fenyloalaniny jako surowca. Sposób obejmuje syntetyzowanie estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z L-fenyloalaniny wytwarzanej sposobem według wynalazku, jak opisano powyżej, oraz kwasu asparaginowego lub jego pochodnej. Jako ester niższego alkilu można wymienić ester metylowy, ester etylowy i ester propylowy lub podobne.
W sposobie według wynalazku, sposób syntetyzowania estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, z L-fenyloalaniny oraz kwasu asparaginowego lub jego pochodnej, nie jest szczególnie ograniczony i można stosować wszelkie konwencjonalne metody dopóki do syntezy estru niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny można stosować L-fenyloalaninę lub jej pochodną. Konkretnie, na przykład, ester niższego alkilu i α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny można wytwarzać poniższym sposobem (US 3 786 039). L-fenyloalaninę estryfikuje się w celu otrzymania estru niższego alkilu i L-fenyloalaniny. Ester alkilowy L-fenyloalaniny poddaje się reakcji z pochodną kwasu L-asparaginowego, w której blokuje się grupę aminową i grupę β-karboksylową a grupę α-karboksylową estryfikuje się w celu aktywacji. Pochodna obejmuje bezwodnik N-acylo-L-asparaginowy, taki jak bezwodnik N-formylo-, N-karbobenzoksy- lub N-p-metoksykarbobenzoksy-L-asparaginowy. W reakcji kondenPL 207 852 B1 sacji otrzymuje się mieszaninę N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny i N-acyl-e-L-aspartylo-L-fenyloalaniny. Jeśli reakcję kondensacji przeprowadza się w obecności kwasu organicznego, którego stała dysocjacji kwasowej w temperaturze 37°C wynosi 10-4 lub mniej, to stosunek postaci α do postaci β w mieszaninie jest podwyższony (JP 51-113841). Następnie N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaninę wyodrębnia się z mieszaniny, po czym poddaje uwodornieniu w celu otrzymania a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
Krótki opis rysunku
Fig. 1 przedstawia strukturę skonstruowanego regionu chromosomu położonego przed genem yddG.
Wynalazek zostanie dokładnie przedstawiony w przykładach.
P r z y k ł a d 1:
Klonowanie genu yddG z E. coli
Cała sekwencja nukleotydową szczepu K-12 E. coli jest już określona (Science, 277, 14531474, 1997). Przeszukiwanie PSI-BLAST ujawniło, że w genomie K-12 E. coli znajduje się co najmniej 10 paralogów rthA obejmujących gen yddG. Gen yddG koduje białko transbłonowe, którego funkcja jest nieznana.
Opierając się na znanej sekwencji nukleotydowej zsyntetyzowano startery przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 3 (starter 1) i sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 4 (starter 2). Starter 1 jest sekwencją komplementarną do sekwencji od 91 do 114 bp za kodonem terminacji genu yddG, z miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny BamHl wprowadzonym w jej końcu 5'. Starter 2 jest sekwencją komplementarną do sekwencji od 224 do 200 bp przed kodonem start genu yddG, z miejscem rozpoznawanym przez enzym restrykcyjny Sall wprowadzonym w jej końcu 5'.
Chromosomalny DNA szczepu TG1 E. coli przygotowywano zwykłą metodą. PCR przeprowadzano, stosując Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400, w następujących warunkach: 40 sekund w temperaturze 95°C, 40 sekund w temperaturze 47°C, 40 sekund w temperaturze 72°C, 30 cykli z wykorzystaniem polimerazy Tag (Fermentas). Otrzymany fragment PCR zawierający gen yddG z jego własnym promotorem traktowano BamHl i SalI i wstawiono do wysokokopijnych wektorów pUC19 i pAYCTER3, uprzednio traktowanych tymi samymi enzymami. Tak otrzymano plazmidy, odpowiednio, pYDDG1 i pYDDG2. Wektor pAYCTER3 jest pochodną pAYC32, wektorem o średniej ilości kopii i bardzo stabilnym, skonstruowanym na podstawie plazmidu RSF1010 (Christoserdov A. Y., Tsygankov Y. D, Broadhost range vectors derived from a RSF 1010 Tnl plasmid, Plasmid, 1986, tom 16, str. 161-167). Wektor pAYCTER3 otrzymano przez wprowadzenie polilinkera z plazmidu pUC19 i silnego terminatora rrnB do plazmidu pAYC32 w miejsce jego promotora, w sposób przedstawiony poniżej. Najpierw, polilinker z plazmidu pUC19 otrzymano metodą PCR, stosując startery przedstawione w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 5 i w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 6. Otrzymany produkt PCR traktowano restryktazami EcoRl i Bglll. Terminator rrnB otrzymano również metodą PCR, stosując startery przedstawione w sekwencjach o numerach identyfikacyjnych 7 i 8. Otrzymany produkt PCR traktowano restryktazami Bglll i Bell. Następnie, te dwa fragmenty DNA zligowano z plazmidem pAYC32, uprzednio traktowanym restryktazami EcoRl i Bell. W ten sposób otrzymano plazmid PAYCTER3.
P r z y k ł a d 2:
Wpływ amplifikacji genu yddG na oporność szczepu TG1 E. coli na aminokwasy i analogi aminokwasów
Plazmidy pYDDGl i pYDDG2 oraz wektory pUC19 i pAYCTER3 wprowadzono do szczepu TGl E. coli. Tak otrzymano szczepy TGl (pYDDGl), TGl (pYDDG2), TGl (pUC19) i TG1 (pAYCTER3).
Następnie, dla każdego szczepu, określano zdolność do wzrostu w obecności aminokwasów i analogów aminokwasowych, stosując płytki z minimalnym podłożem agarowym z glukozą M9 zawierające gradient stężeń inhibitora. Na płytki wysiewano od 106 do 107 komórek z całonocnej hodowli w podłożu minimalnym (uzupełnionym 100 μg/ml ampicyliny dla szczepów niosących plazmidy). Wzrost oceniano po 44 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C.
Wyniki przedstawiono w Tablicy 1.
PL 207 852 B1
T a b l i c a 1
Substrat Stężenie mg/ml Wzrost po 44 h*
TG1 (pUC19)** TG1 (pYDDG1) TG1 (pYDDG2)
- - + + +
L-fenyloalanina 20,0 - + ±
p-fluoro-DL-fenyloalanina 1,0 - + +
p-fluoro-DL-fenyloalanina 2,0 - + -
5-fluoro-DL-tryptofan 0,0005 - + n.o.
+: wzrost dobry ±: wzrost słaby -: brak wzrostu
n.o. - nie oceniano.
**Takie same wyniki otrzymano dla szczepu TG1 niosącego plazmid pAYCTER3.
P r z y k ł a d 3
Wpływ amplifikacji genu yddG na wytwarzanie fenyloalaniny
Jako szczep macierzysty do transformacji plazmidami zawierającymi gen yddG stosowano wytwarzający fenyloalaninę szczep AJ12739 E.coli. Szczep AJ12739 zdeponowano w Rosjan National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Rosja, 113545 Moskwa, 1st Dorozhny proezd, 1) 6 listopada 2001 z numerem dostę pu VKPM B-8197.
Wytwarzający fenyloalaninę szczep AJ12739 transformowano plazmidem pYDDG2 lub wektorem pAYCTER3 w celu uzyskania szczepów, odpowiednio, AJ12739/pYDDG2 i AJ12739/pAYCTER3. Szczepy te hodowano w temperaturze 37°C w ciągu 18 godzin w bulionie odżywczym z 100 mg/l ampicyliny i stosując 0,3 ml otrzymanej hodowli zaszczepiano 3 ml podłoża fermentacyjnego zawierającego 100 mg/l ampicyliny, w probówkach o wymiarach 20 x 200 mm, i hodowano w temperaturze 37°C w ciągu 48 godzin na wstrząsarce obrotowej. Po zakończeniu hodowli określano ilość zakumulowanej w podłożu fenyloalaniny stosując TLC. Stosowano płytki do TLC o wymiarach 10 x 15 cm powleczone warstwą 0,11 mm żelu krzemionkowego Sorbfil bez wskaźnika fluorescencyjnego (Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, Rosja). Płytki z Sorbfilem rozwijano w fazie ruchomej: propan-2-ol : octan etylu : 25% wodny roztwór amoniaku : woda = 40 : 40 : 7 : 16 (v/v). Jako odczynnik do wizualizacji stosowano roztwór (2%) ninhydryny w acetonie.
Skład podłoża fermentacyjnego (g/l):
Glukoza 40,0
(NH4)2SO4 16,0
K2HPO4 0,1
MgSO4 • 7H2O 1,0
FeSO4 • 7H2O 0,01
MnSO4 • 5H2O 0,01
Tiamina-HCl 0,0002
ekstrakt drożdżowy 2,0
Tyrozyna 0,125
CaCO3 20,0
Glukozę i siarczan magnezu sterylizuje się oddzielnie. CaCO3 sterylizuje się gorącym suchym
powietrzem w temperaturze 180°C w ciągu 2 godzin. pH doprowadza się do 7,0. Antybiotyk wprowadza się do podłoża po sterylizacji. Wyniki przedstawiono w Tablicy 2.
T a b l i c a 2
Szczep E. coli OD600 Ilość fenyloalaniny. g/l
AJ12739 (pAYCTER3) 7,0 1,5
AJ12739 (pYDDG2) 7,8 1,9
Na podstawie Tablicy 2 można zauważyć, że amplifikacja genu yddG poprawia wydajność wytwarzania fenyloalaniny szczepu AJ12739.
PL 207 852 B1
P r z y k ł a d 4
Podstawienie natywnego regionu przed genem yddG hybrydowym elementem regulatorowym zawierającym promotor PL i SDlacz w chromosomie E. coli
W celu zwiększenia ekspresji genu yddG, region wczesnego promotora PL faga λ (Giladi i in., J.Mol.Biol., 260, 484-491, 1996) połączony z sekwencją Shine-Dalgarno (sekwencja SD) genu lacZ z E. coli zintegrowano przed regionem kodującym yddG w chromosomie szczepu BW25113 E. coli w miejsce regionu natywnego, stosują c metodę opisaną przez Datsenko K.A. i Wanner B.L. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, 2000), zwaną również jako „integracja Red-driven. Dodatkowo, wprowadzono fragment sztucznego DNA zawierający gen oporności na chloramfenikol (CmR) (Fig. 1). Sekwencję nukleotydową podstawionego natywnego regionu położoną przed genem yddG przedstawiono w Liście Sekwencji (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 9).
Konstrukcję fragmentu sztucznego DNA zintegrowanego w odpowiadającym regionie chromosomu bakteryjnego przeprowadzono w kilku etapach. W pierwszym etapie, fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne BglII w regionie przed promotorem, promotor PL i sekwencję SD genu lacZ z E. coli połączoną bezpoś rednio ze znajdują cym się za nim kodonem inicjacji ATG genu yddG otrzymano metodą PCR. DNA faga λ (#SD0011, Fermentas, Litwa) stosowano w PCR jako matrycę. PCR przeprowadzano stosując startery P1 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 10) i P2 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 11). Starter P1 zawiera miejsce restrykcyjne Bglll. Satrter P2 zawiera sekwencję DNA faga lambda, miejsce restrykcyjne Xbal, sekwencję SD genu lacZ z E. coli i 36 nukleotydów z ramki odczytu yddG. Sekwencję z genu yddG wprowadzono do startera P2 w celu dalszej integracji „Red-driven fragmentu do chromosomu bakteryjnego.
We wszystkich przypadkach PCR przeprowadzano stosując do amplifikacji Perkin-Elmer 2400
GeneAmp PCR System. Mieszanina reakcyjna o całkowitej objętości 100 μΐ składała się z: 10 μΐ 10-krotnie stężonego buforu do PCR (Fermentas, Litwa) z dodatkiem MgCl2 w ilości do uzyskania końcowego stężenia 2 mM w mieszaninie reakcyjnej, 200 μΜ każdego z dNTP, 400 nM każdego z wybranych starterów 1 oraz 2u polimerazy Taq (Fermentas, Litwa). Matrycę DNA do dalszej amplifikacji w reakcji PCR dodawano do mieszaniny reakcyjnej w ilości przeliczanej na 0,2 ng docelowego fragmentu DNA. Warunki temperaturowe PCR były następujące: początkowa denaturacja DNA w ciągu 5 minut w temperaturze 95°C, po której następuje 30 cykli denaturacji w temperaturze +95°C w ciągu 30 sekund, przyłączanie starterów w temperaturze +50°C w ciągu 30 sekund, elongacja w temperaturze +72°C w ciągu 30 sekund i końcowa polimeryzacja w ciągu 5 minut w temperaturze +72°C.
Równolegle przeprowadzano drugi etap konstruowania fragmentu DNA. Gen CmR zamplifikowano metodą PCR stosując komercyjnie dostępny plazmid pACYC184 (GenBank/EMBL numer dostępu X06403, Fermentas, Litwa) jako matrycę i startery P3 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 12) oraz P4 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13). Starter P3 zawiera miejsce restrykcyjne BgIll wykorzystywane do późniejszego łączenia z wcześniej otrzymanym fragmentem DNA zawierającym promotor PL. Promotor P4 zawiera 36 nukleotydów położonych przed genem yddG z E. coli koniecznych do dalszej integracji „Red-driven fragmentu do chromosomu bakteryjnego.
Obydwa otrzymane fragmenty traktowano endonukleazą restrykcyjną Bglll, po czym następowała reakcja ligacji z zastosowaniem ligazy DNA T4 (Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, wyd. 3, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001).
Zligowany produkt amplifikowano w reakcji PCR stosując startery P2 i P4. PCR przeprowadzano jak opisano powyżej z następującymi wyjątkami: mieszanina reakcyjna zawierała 2 ng zligowanych produktów i czas elongacji przedłużono do 2 minut. Strukturę skonstruowanego regionu DNA przed genem yddG przedstawiono na Fig. 1. Sekwencję nukleotydową skonstruowanego regionu DNA przedstawiono w sekwencji o numerze identyfikacyjnym: 14.
Otrzymany fragment DNA oczyszczony przez wytrącanie etanolem stosowano do elektroporacji i integracji „Red-driven do chromosomu bakteryjnego szczepu BW25113 E. coli. Zrekombinowany plazmid pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, 2000) z termowrażliwym replikonem stosowano jako donor genów pochodzących z faga λ odpowiedzialnych za układ rekombinacji „Red-driven.
Komórki BW25113 (pKD46) namnażano przez noc w temperaturze +30°C w płynnym podłożu LB z dodatkiem ampicyliny (100 μg/ml), następnie rozcieńczono 1:100 podłożem SOC (ekstrakt drożdżowy, 5 g/l, NaCl, 0,5 g/l, Trypton, 20 g/l, KCl, 2,5 mM, MgCl2, 10 mM) z dodatkiem ampicyliny (100 μg/ml) i L-arabinozy (10 mM) (arabinozę stosuje się do indukcji plazmidu kodującego geny układu „Red-driven) i hodowano w temperaturze +30°C do osiągnięcia optymalnej gęstości
PL 207 852 B1 hodowli bakteryjnej, wynoszącej OD600 = 0,4-0,7. Namnożone komórki z 10 ml hodowli bakteryjnej przemyto 3 razy schłodzoną lodem wodą dejonizowaną a następnie zawieszono w 100 μΐ wody. 10 μΐ fragmentu DNA (10 ng) rozpuszczonego w wodzie dejonizowanej dodano do zawiesiny bakteryjnej. Elektoporację przeprowadzano, stosując elektoporator Bio-Rad (USA) (Nr 165-2098, wersja 2-89), zgodnie z instrukcjami producenta. Poddane wstrząsowi komórki dodano do 1 ml SOC, inkubowano w ciągu 2 godzin w temperaturze 37°C a następnie rozprowadzono na płytki z podłożem agarowym L zawierającym 25 μg/ml chloramfenikolu. Kolonie wyhodowane w ciągu 24 godzin testowano pod kątem obecności makera CmR znajdującego się przed genem yddG stosując metodę PCR z zastosowaniem starterów P4 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 13) i P5 (sekwencja o numerze identyfikacyjnym: 15). W tym celu, świeżo wyizolowane kolonie zawieszano w 20 μl wody a następnie 1 μl stosowano do metody PCR. Warunki PCR były następujące: początkowa denaturacja DNA w ciągu 10 minut w temperaturze 95°C, następnie 30 cykli denaturacji w temperaturze +95°C w ciągu 30 sekund, przyłączania starterów w temperaturze +50°C w ciągu 30 sekund i elongacji w temperaturze +72°C w ciągu 50 sekund a ostateczna polimeryzacja w ciągu 5 minut w temperaturze +72°C. Kilka testowanych kolonii CmR zawierało konieczny fragment DNA o wielkości 2172 nukleotydów.
P r z y k ł a d 5
Wpływ zwiększonej ekspresji genu yddG na wytwarzanie tryptofanu
Jako szczep macierzysty do oceny wpływu zwiększonej ekspresji genu yddG na wytwarzanie tryptofanu stosowano wytwarzający tryptofan szczep SV164 E.coli (pGH5).
Szczep SV164 (pGH5) opisano szczegółowo w US 6 180 373 oraz EP 0662143.
W celu sprawdzenia wpływu zwiększenia ekspresji genu yddG zachodzącej pod kontrolą silnego konstytutywnego promotora PL na wytwarzanie tryptofanu, fragment DNA z chromosomu szczepu BW25113 E.coli przeniesiono do wytwarzającego tryptofan szczepu SV164 E.coli (pGH5) przez transdukcję P1 (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY), otrzymując SV164 PL-yddG (pGH5).
Oba szczepy, SV164 (pGH5) i SV164 PL-yddG (pGH5), hodowano z wytrząsaniem w temperaturze 37°C w ciągu 18 godzin w 3 ml bulionu odżywczego uzupełnionego 20 μg/ml tetracykliny (marker plazmidu pGH5). 0,3 ml otrzymanej hodowli zastosowano do zaszczepienia 3 ml podłoża fermentacyjnego zawierającego tetracyklinę (20 μg/ml) w probówkach o wymiarach 20 x 200 mm i hodowano w temperaturze 37°C w ciągu 48 godzin na wstrząsarce obrotowej przy 250 obrotach na minutę.
Skład podłoża fermentacyjnego przedstawiono w Tablicy 3.
T a b l i c a 3
Część Składnik Stężenie końcowe, g/l
1 2 3
A KH2PO4 1,5
NaCl 0,5
(NH4)2SO4 1,5
L-metionina 0,05
L-fenyloalanina 0,1
L-tyrozyna 0,1
Mameno (całkowity N) 0,07
B Glukoza 40,0
MgSO4·7H2O 0,3
C CaCl2 0,011
D FeSO4 x 7H2O 0,075
cytrynian sodowy 1,0
E Na2MoO4 · 2H2O 0,00015
H3BO3 0,0025
CoCl2 · 6H2O 0,00007
PL 207 852 B1 cd. tablicy 3
1 2 3
CUSO4 • SH2O 0,00025
MnCl2 • 4H2O 0,0016
ZnS04•7 H2O 0,0003
F tiamina-HCl 0,005
G CaCO3 30,0
H Pirydoksyna 0,03
Część A miała pH 7,1 doprowadzone NH4OH, Każdą część sterylizowano oddzielnie.
Po hodowli, ilość tryptofanu zakumulowanego w podłożu określano przez TLC, jak opisano w Przykładzie 3. Otrzymane wyniki przedstawiono w Tablicy 4.
T a b l i c a 4
Szczep E. coli OD600* Ilość tryptofanu, g/l*
SV164 (pGH5) 7,0 3,72 ± 0,13
SV164 PL-yddG (pGH5) 7,0 4,17 ± 0,35
*Prezentowane wyniki pochodzą co najmniej z sześciu niezależnych doświadczeń przeprowadzonych dla każdego szczepu.
Na podstawie Tablicy 4 można zauważyć, że zwiększenie ekspresji genu yddG poprawiło wydajność wytwarzania tryptofanu przez szczep SV164 (pGH5).
PL 207 852 B1
Lista sekwencji <110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> SPOSÓB WYTWARZANIA L-AMINOKWASÓW Z WYKORZYSTANIEM BAKTERII NALEŻĄCYCH DO RODZAJU ESCHERICHIA <130> B890SMOP1411 <140>
<141> 2002-11-21 <150> RU 2001131571 <151> 2001-11-23 <150> RU 2002121670 <151> 2002-08-14 <160> 15 <170> Patentln wersja 2.1 <210> 1 <211> 882 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1
atgacacgac aaaaagcaac gctcataggg ctgatagcga tcgtcctgtg gagcacgatg 60
gtaggattga ttcgcggtgt cagtgagggg ctcggcccgg tcggcggcgc agctgctatc 120
tattcattaa gcgggctgct gttaatcttc acggttggat ttccgcgtat tcggcaaatc 180
ccgaaaggct atttactcgc cgggagtctg ttattcgtca gctatgaaat ctgtctggcg 240
ctttccttag ggtatgcggc gacccatcat caggcgattg aagtgggtat ggtgaactat 300
ctgtggccca gcctgacaat tctctttgcc attctgttta atggtcagaa aaccaactgg 360
ttgattgtac ctggattatt attagccctc gtcggcgtct gttgggtgtt aggcggtgac 420
aatgggttac attatgatga aatcatcaat aatatcacca ccagcccatt gagttatttc 480
ctggcgttca ttggtgcgtt tatctgggca gcctattgca cagtaacgaa taaatacgca 540
cgcggattta atggaattac cgtttttgtc ctgctaacgg gagcaagtct gtgggtttac 600
tattttctta cgccacaacc agaaatgata tttagcacgc ccgtcatgat taaactcatc 660
tctgcggcat ttaccttagg atttgcttat gctgcatgga atgtcggtat attgcatggc 720
aatgtcacca ttatggcggt aggttcgtat tttacgcctg tactttcctc agcgcttgca 780
gccgtgctgc tcagcgcccc gctgtcgttc tcgttctggc aaggcgcgct gatggtctgc 840
ggcggttccc tgctctgctg gctggcgaca cgtcgtggtt aa 882
<210> 2 <211> 293
PL 207 852 B1 <212> białko <213> Escherichia coli <400> 2
Met Thr Arg Gin Lys Ala Thr Leu Ile Gly 15 10
Trp Ser Thr Met Val Gly Leu Ile Arg Gly 20 25
Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Ile Tyr Ser 35 40
Ile Phe Thr Val Gly Phe Pro Arg Ile Arg 50 55
Leu Leu Ala Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser 65 70
Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Ala Thr His His 85 90
Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Thr 100 105
Phe Asn Gly Gin Lys Thr Asn Trp Leu Ile
Leu Ile Ala Ile Val Leu
Val Ser Glu Gly Leu Gly 30
Leu Ser Gly Leu Leu Leu 45
Gin Ile Pro Lys Gly Tyr 60
Tyr Glu Ile Cys Leu Ala 75 80
Gin Ala Ile Glu Val Gly 95
Ile Leu Phe Ala Ile Leu
110
Val Pro Gly Leu Leu Leu
115 120 125
Ala Leu Val Gly Val Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Asn
130 135 140
Tyr Asp Glu Ile Ile Asn Asn Ile Thr Thr Ser Pro Leu 145 150 155
Leu Ala Phe Ile Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys
165 170
Asn Lys Tyr Ala Arg Gly Phe Asn Gly Ile Thr Val Phe 180 185
Thr Gly Ala Ser Leu Trp Val Tyr Tyr Phe Leu Thr Pro 195 200 205
Met Ile Phe Ser Thr Pro Val Met Ile Lys Leu Ile Ser
210 215 220
Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile 225 230 235
Asn Val Thr Ile Met Ala Val Gly Ser Tyr Phe Thr Pro
245 250
Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro Leu Ser 260 265
Trp Gin Gly Ala Leu Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu
Gly
Ser
Thr
Val
190
Gin
Ala
Leu
Val
Phe
270
Cys
Leu
Tyr
Val
175
Leu
Pro
Ala
His
Leu
255
Ser
Trp
His
Phe
160
Thr
Leu
Glu
Phe
Gly
240
Ser
Phe
Leu
PL 207 852 B1
<210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 3 tgatcggatc cgaaatgaga tataa <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 4 ctgcggtcga cgtccattgc tttc <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 5 gaccatagat ctgaattcga gctcggtac <210> 6 <211> 29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 6 acggccagat ctaagcttgc atgcctgca
PL 207 852 B1 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 7 aacagtgatc atttgcctgg cggcagtagc gcgg 34 <210> 8 <211> 41 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 8 ataaaaagct tagatctcaa aaagagtttg tagaaacgca a 41 <210> 9 <211> 160 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagaaaaa cgcaccactg cctgacaggc 60 cagttaaaaa aatgctataa aattcagctt aatttttaac ggcaagagag acaaaacagc 120 gagcatgaca cgacaaaaag caacgctcat agggctgata 160 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 10 aaatcagatc ttcagaattc tcacctacc 29 <210> 11 <211> 69
PL 207 852 B1 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 11 tatcagccct atgagcgttg ctttttgtcg tgtcatagct gtttccttct agacggccaa 60 tgcttcgta 69 <210 12 <211> 34 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 12 tagcgaagat ctctgatgtc cggcggtgct tttg 34 <210 13 <211> 57 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 13 cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagattac gccccgccct gccactc 57 <210> 14 <211> 1362 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220 <223> Opis sztucznej sekwencji: gen oporności Cm, promotor PL i sekwencja SD z genu lacZ <400> 14 cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagattac gccccgccct gccactcatc 60 gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 120 atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 180
PL 207 852 B1
ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 240
actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 300
ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 360
atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 420
gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 480
ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 540
cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 600
ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 660
atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 720
tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 780
acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 840
atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta 900
ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt 960
tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg 1020
gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagag atcttcacct accaaacaat 1080
gcccccctgc aaaaaataaa ttcatataaa aaacatacag ataaccatct gcggtgataa 1140
attatctctg gcggtgttga cataaatacc actggcggtg atactgagca catcagcagg 1200
acgcactgac caccatgaag gtgacgctct taaaaattaa gccctgaaga agggcagcat 1260
tcaaagcaga aggctttggg gtgtgtgata cgaaacgaag cattggccgt ctagaaggaa 1320
acagctatga cacgacaaaa agcaacgctc atagggctga ta 1362
<210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>
<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 15 ttaaccacga cgtgtcg 17

Claims (7)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Bakteria z rodzaju Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, znamienna tym, że wytwarzanie L-aminokwasu przez tę bakterię jest zwiększone w porównaniu do szczepu niezmodyfikowanego, poprzez zwiększoną aktywność białka zdefiniowanego w (A) lub (B) w komórce bakterii, poprzez transformację bakterii DNA kodującym białko zdefiniowane w (A) lub (B) poprzez wprowadzenie wielokrotnych kopii DNA kodującego białko zdefiniowane w (A) lub (B) do chromosomu bakteryjnego, lub wytwarzanie L-aminokwasu przez tę bakterię jest zwiększone przez umieszczenie tego DNA pod kontrolą promotora wybranego spośród PL promotora, lac promotora, trp promotora i trc promotora, przy czym:
    (A) białko o sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, (B) białko o sekwencji aminokwasowej z delecją, substytucją, insercją lub addycją jednego do 30 aminokwasów w sekwencji aminokwasowej o numerze identyfikacyjnym: 2 z Listy Sekwencji, i które wykazuje aktywność nadającą bakterii oporność na L-fenyloalaninę, p-fluorofenylo-alaninę lub 5-fluoro-DL-tryptofan.
  2. 2. Bakteria według zastrz. 1, znamienna tym, że transformację przeprowadza się wysokokopijnym wektorem zawierającym DNA.
  3. 3. Sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których hoduje się bakterię określoną w zastrz. 1 albo 2 w podłożu hodowlanym i z podłoża hodowlanego wyodrębnia się L-aminokwas, wytworzony i nagromadzony w tym podłożu.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hoduje się bakterię, która ma zwiększoną ekspresję genów zaangażowanych w biosyntezę fenyloalaniny.
  5. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że hoduje się bakterię, która ma zwiększoną ekspresję genów zaangażowanych w biosyntezę tryptofanu.
  6. 6. Sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których hoduje się bakterię określoną w zastrz. 1 do 3 w podłożu hodowlanym do wytworzenia i nagromadzenia L-fenyloalaniny w podłożu, przy czym bakteria wykazuje zdolność wytwarzania L-fenyloalaniny oraz syntezuje się niższy ester alkilowy a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z kwasu asparaginowego lub jego pochodnej i otrzymanej L-fenyloalaniny.
  7. 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etapy, w których estryfikuje się L-fenyloalaninę do utworzenia niższego estru alkilowego L-fenyloalaniny, kondensuje się niższy ester alkilowy L-fenyloalaniny z pochodną kwasu asparaginowego, przy czym pochodną jest bezwodnik N-acylo-L-asparaginowy, oddziela się niższy ester alkilowy N-acylo-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny z mieszaniny reakcyjnej, i przeprowadza się uwodornianie niższego estru alkilowego N-acyl-a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny do utworzenia niższego estru alkilowego a-L-aspartylo-L-fenyloalaniny.
PL369471A 2001-11-23 2002-11-21 Bakteria z rodzaju Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu i sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny PL207852B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001131571/13A RU2001131571A (ru) 2001-11-23 Способ получения L-аминокислот с использованием бактерий, принадлежащих к роду Escherichia
RU2002121670/13A RU2222596C1 (ru) 2002-08-14 2002-08-14 Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL369471A1 PL369471A1 (pl) 2005-04-18
PL207852B1 true PL207852B1 (pl) 2011-02-28

Family

ID=26654105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL369471A PL207852B1 (pl) 2001-11-23 2002-11-21 Bakteria z rodzaju Escherichia wytwarzająca L-aminokwas, sposób wytwarzania L-fenyloalaniny lub L-tryptofanu i sposób wytwarzania niższych estrów alkilowych α-L-aspartylo-L-fenyloalaniny

Country Status (14)

Country Link
US (2) US7666655B2 (pl)
EP (1) EP1449918B1 (pl)
JP (1) JP4305184B2 (pl)
KR (1) KR101023925B1 (pl)
CN (2) CN101838628B (pl)
AR (1) AR037415A1 (pl)
AT (1) ATE470711T1 (pl)
AU (1) AU2002355022B2 (pl)
BR (1) BRPI0214330B1 (pl)
CA (1) CA2468179C (pl)
DE (1) DE60236684D1 (pl)
MX (1) MXPA04004874A (pl)
PL (1) PL207852B1 (pl)
WO (1) WO2003044192A1 (pl)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
RU2268300C2 (ru) * 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
BRPI0506369B1 (pt) * 2004-01-30 2020-11-03 Ajinomoto Co., Inc microorganismo transgênico, e, método para produzir um l-aminoácido
US20050181488A1 (en) * 2004-02-12 2005-08-18 Akhverdian Valery Z. Method for producing L-threonine using bacteria belonging to the genus Escherichia
US20050191684A1 (en) * 2004-02-25 2005-09-01 Zimenkov Danila V. Method for producing L-amino acids
RU2004105179A (ru) * 2004-02-25 2005-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) 6-фосфоглюконолактоназа из escherichia coli, фрагмент днк, бактерия, принадлежащая к роду escherichia, -продуцент l-аминокислоты, и способ получения l-аминокислоты
WO2005080583A2 (en) * 2004-02-25 2005-09-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids
DE102005018835A1 (de) 2005-04-22 2006-11-02 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
DE102005019040A1 (de) 2005-04-23 2006-10-26 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung verbesserter Stämme der Familie Enterobacteriaceae
EP1899452B1 (en) * 2005-06-17 2010-10-20 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with enhanced expression of the fucpikur operon
RU2333950C2 (ru) * 2005-12-27 2008-09-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПРОДУКЦИИ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Methylophilus
EP1979486B1 (en) 2006-01-30 2013-04-17 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid producing bacterium and method of producing l-amino acid
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2004803A2 (en) 2006-03-23 2008-12-24 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using bacterium of theenterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small rna
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
WO2007136133A1 (en) 2006-05-23 2007-11-29 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family
RU2006129690A (ru) 2006-08-16 2008-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
RU2355763C2 (ru) 2006-09-13 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная ацетолактатсинтаза и способ продукции разветвленных l-аминокислот
JP2010017082A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
KR100838037B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) ｅｎｔＣ 유전자가 불활성화된 Ｌ-트립토판 생산 미생물 및이를 이용한 Ｌ-트립토판 제조방법
KR100838036B1 (ko) * 2006-12-29 2008-06-12 씨제이제일제당 (주) ｙｊｅＯ 유전자가 결손된 Ｌ-트립토판 생산 미생물 및이를 이용한 Ｌ-트립토판 제조방법
JP5540504B2 (ja) 2007-01-22 2014-07-02 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
WO2009031565A1 (ja) 2007-09-04 2009-03-12 Ajinomoto Co., Inc. アミノ酸生産微生物及びアミノ酸の製造法
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
WO2009093703A1 (ja) 2008-01-23 2009-07-30 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ-アミノ酸の製造法
JP5217780B2 (ja) * 2008-02-08 2013-06-19 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
DE102008040352A1 (de) 2008-07-11 2010-01-14 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2336347B1 (en) 2008-09-08 2017-03-15 Ajinomoto Co., Inc. An l-amino acid-producing microorganism and a method for producing an l-amino acid
BRPI1007069A2 (pt) 2009-01-23 2015-08-25 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido.
BRPI1014661B1 (pt) 2009-07-29 2020-12-15 Ajinomoto Co., Inc. Método para produzir um l-aminoácido
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
RU2530171C2 (ru) * 2012-02-29 2014-10-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") МУТАНТНЫЙ БЕЛОК, КОДИРУЕМЫЙ ГЕНОМ yddG, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia
CN102604882B (zh) * 2012-03-31 2013-05-22 福建省麦丹生物集团有限公司 生产l-苯丙氨酸的工程菌及其应用
US10047382B2 (en) 2012-07-03 2018-08-14 Kao Corporation Useful microorganism and method for producing substance of interest
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
JP5958653B2 (ja) 2013-10-02 2016-08-02 味の素株式会社 アンモニア制御装置およびアンモニア制御方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
EP2886651B1 (en) 2013-10-21 2018-08-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015114955A (ru) 2015-04-22 2016-11-10 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-изолейцина с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой сверхэкспрессирован ген cycA
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
CN105316371B (zh) * 2015-10-23 2018-08-14 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 一种用于提高色氨酸发酵产量的方法
CN108463555A (zh) 2016-01-12 2018-08-28 味之素株式会社 生产苯甲醛的方法
WO2017146195A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
CN108504613B (zh) * 2017-02-27 2021-03-30 四川利尔生物科技有限公司 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
KR101968317B1 (ko) * 2018-02-23 2019-04-11 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
EP3797167B1 (en) 2018-05-23 2024-09-18 Ajinomoto Co., Inc. A method of producing the tripeptide gamma-glu-val-gly using enterobacteriaceae
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
EP3904521A4 (en) 2018-12-26 2022-03-23 Daesang Corporation L-AMINO ACID-PRODUCING VARIANT STRAIN OF E. COLI OR CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM, AND METHODS OF PREPARATION OF L-AMINO ACIDS USING THE SAME
BR112021014194A2 (pt) 2019-02-22 2021-12-28 Ajinomoto Kk Método para a produção de um l-aminoácido
KR102205717B1 (ko) * 2019-04-05 2021-01-22 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-트립토판 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-트립토판을 생산하는 방법
BR112021017870A2 (pt) 2019-04-05 2021-12-07 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
JP7655312B2 (ja) 2019-09-25 2025-04-02 味の素株式会社 細菌の発酵によるｌ－アミノ酸の製造方法
JP7735863B2 (ja) 2019-10-28 2025-09-09 味の素株式会社 ベンズアルデヒドの製造方法
CN113122562A (zh) * 2020-01-16 2021-07-16 南京理工大学 膜蛋白YddG的表达载体及其表达纯化方法
KR102278000B1 (ko) * 2020-03-17 2021-07-15 씨제이제일제당 주식회사 프리페네이트 디하이드라타아제 활성 강화를 통한 l-트립토판을 생산하는 방법
KR102647745B1 (ko) * 2020-05-27 2024-03-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 l-타이로신 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 l-타이로신을 생산하는 방법
CN119012914A (zh) 2022-04-04 2024-11-22 味之素株式会社 防治寄生植物的方法
CN117510598B (zh) * 2023-11-07 2024-06-21 苏州华赛生物工程技术有限公司 转运蛋白YahN在L-肌肽生产中的应用
KR20250075805A (ko) 2023-11-21 2025-05-29 대상 주식회사 L-아미노산 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산의 생산 방법
WO2025226556A1 (en) * 2024-04-26 2025-10-30 Merck Sharp & Dohme Llc Process for preparing amino phenyl compounds
CN121022710B (zh) * 2025-10-29 2026-02-24 天津科技大学 过表达ydeD基因的基因工程菌及其生产L-苯丙氨酸的方法
CN121271814B (zh) * 2025-12-10 2026-02-13 内蒙古伊品生物科技有限公司 D-3-磷酸甘油酸脱氢酶突变体及其在提高l-色氨酸中的应用

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3786039A (en) * 1969-04-30 1974-01-15 Ajinomoto Kk Method of producing alpha-l-aspartyl-l-phenylalanine lower alkyl esters
SU875663A1 (ru) 1978-06-30 1982-09-15 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штаммы е.coLI ВНИИГенетика VL 334 @ N6 и ВНИИГенетика VL 334 @ N7-продуценты L-треонина и способ их получени
JPS561890A (en) 1979-06-15 1981-01-10 Ajinomoto Co Inc Preparation of l-phenylalanine by fermentation
JPS5618596A (en) 1979-07-23 1981-02-21 Ajinomoto Co Inc Production of l-lysine through fermentation process
US4371614A (en) 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
SU974817A1 (ru) 1981-06-16 1990-08-23 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Способ получени L-треонина
US4783403A (en) 1984-02-08 1988-11-08 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing l-phenylalanine
KR890003681B1 (ko) 1987-03-26 1989-09-30 주식회사 미원 미생물에 의한 l-페닐 알라닌의 제조방법
SU1694643A1 (ru) 1987-11-26 1991-11-30 Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент L-треонина
DE69124939T2 (de) 1990-11-30 1997-10-02 Ajinomoto Kk Rekombinante DNS-Sequenzen kodierend für Enzyme frei von Feedback Inhibition, Plasmide diese Sequenzen enthaltend, transformierte Mikroorganismen nützlich für Produktion von aromatischen Aminosäuren, und deren Verfahren zur Herstellung durch Fermentation
DE4232468A1 (de) 1992-09-28 1994-03-31 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung
CZ285453B6 (cs) 1992-11-10 1999-08-11 Ajinomoto Co.,Inc. DNA, která obsahuje gen kódující aspartokinézu III, mikroorganizmus Escherichia coli a způsob výroby L-threoninu fermentací
US5354672A (en) 1992-11-24 1994-10-11 Ian Fotheringham Materials and methods for hypersecretion of amino acids
JPH07155184A (ja) 1993-12-08 1995-06-20 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−リジンの製造法
JP4032441B2 (ja) 1995-08-30 2008-01-16 味の素株式会社 Ｌ−アミノ酸の製造方法
GB2304718B (en) 1995-09-05 2000-01-19 Degussa The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli
DE19548222A1 (de) 1995-12-22 1997-06-26 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern
DE19644566A1 (de) * 1996-10-26 1998-04-30 Forschungszentrum Juelich Gmbh Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / I
DE19726083A1 (de) 1997-06-19 1998-12-24 Consortium Elektrochem Ind Mikroorganismen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Cystein, L-Cystin, N-Acetyl-Serin oder Thiazolidinderivaten
RU2144564C1 (ru) * 1998-10-13 2000-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" ФРАГМЕНТ ДНК rhtB, КОДИРУЮЩИЙ СИНТЕЗ БЕЛКА RhtB, ПРИДАЮЩЕГО УСТОЙЧИВОСТЬ К L-ГОМОСЕРИНУ БАКТЕРИЯМ ESCHERICHIA COLI, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ
RU2148642C1 (ru) 1998-12-23 2000-05-10 ЗАО "Научно-исследовательский институт АДЖИНОМОТО-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты
RU2175351C2 (ru) 1998-12-30 2001-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Фрагмент днк из escherichia coli, определяющий повышенную продукцию l-аминокислот (варианты), и способ получения l-аминокислот
AU2002306849A1 (en) * 2001-03-21 2002-10-08 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
RU2229513C2 (ru) * 2001-11-23 2004-05-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
US7256003B2 (en) * 2004-07-13 2007-08-14 The Research Foundation For Mental Hygiene, Inc. Method for differentiation of Alzheimer's Disease into subgroups

Also Published As

Publication number Publication date
US20030157667A1 (en) 2003-08-21
US7666655B2 (en) 2010-02-23
CN1615359B (zh) 2010-04-28
ATE470711T1 (de) 2010-06-15
US20100099153A1 (en) 2010-04-22
CA2468179C (en) 2013-05-21
EP1449918A1 (en) 2004-08-25
EP1449918A4 (en) 2005-05-18
PL369471A1 (pl) 2005-04-18
KR20050044860A (ko) 2005-05-13
JP4305184B2 (ja) 2009-07-29
AR037415A1 (es) 2004-11-10
WO2003044192A1 (fr) 2003-05-30
JPWO2003044192A1 (ja) 2005-03-24
CA2468179A1 (en) 2003-05-30
DE60236684D1 (de) 2010-07-22
BR0214330A (pt) 2004-11-03
BRPI0214330B1 (pt) 2015-06-16
MXPA04004874A (es) 2004-09-03
CN101838628B (zh) 2012-06-20
KR101023925B1 (ko) 2011-03-22
AU2002355022B2 (en) 2007-09-20
CN101838628A (zh) 2010-09-22
EP1449918B1 (en) 2010-06-09
CN1615359A (zh) 2005-05-11
US7935506B2 (en) 2011-05-03
AU2002355022A1 (en) 2003-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2468179C (en) Method for producing l-amino acids using bacteria belonging to the genus escherichia
RU2229513C2 (ru) Способ получения l-аминокислот, штамм escherichia coli - продуцент l-аминокислоты (варианты)
EP2460873B1 (en) A method for producing an aromatic L-amino acid using a bacterium of the genus Eshcerichia with attenuated expression of any of the cynT, cynS, cynX or cynR genes or a combination thereof
JP5217780B2 (ja) Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
EP2049676A1 (en) A method for producing an l-amino acid using a bacterium of the enterobacteriaceae family with attenuated expression of the ydin gene or the ydib gene or combination thereof
RU2408723C2 (ru) Способ получения ароматических аминокислот с использованием бактерии, экспрессирующей ген aro1 из дрожжей
RU2530171C2 (ru) МУТАНТНЫЙ БЕЛОК, КОДИРУЕМЫЙ ГЕНОМ yddG, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ РОДА Escherichia
WO2011055710A1 (ja) Ｌ－アミノ酸の製造法