BRPI0307086B1 - variante de uma fitase parental, métodos para melhorar o valor nutritivo de uma ração animal, e para tratar proteínas vegetais, composição, processo para reduzir os níveis de fitato em um esterco animal, e, uso da variante - Google Patents

Abstract

"variante de uma fitase parental, seqüência de ácido nucleico isolado, construção de ácido nucléico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir a variante, para melhorar o valor nutritivo de uma ração animal, e para tratar proteínas vegetais, planta transgênica, ou parte de planta, animal não humano transgênico, ou produtos, ou elementos dos mesmos, composição, processo para reduzir os níveis de fitato em um esterco animal, e, uso da variante". a presente invenção refere-se a variantes de fitase derivadas de uma fitase parental que é homóloga a uma fitase peniophora lycii e compreende pelo menos uma substituição em pelo menos uma dentre várias posições correspondendo a uma posição na fitase peniophora lycii. as variantes tem melhoradas propriedades, particularmente uma maior atividade específica e/ou mais termoestável do que a fitase parental, por exemplo de um tm de até 82 <198>c a ph 5,5, como determinado por dsc, e/ou de uma atividade específica duplicada. a invenção também refere-se a dna codificando as variantes de fitase, métodos para sua produção, assim com o uso das mesmas, por exemplo na ração animal e aditivos para ração animal.

Description

“VARIANTE DE UMA FITASE PARENTAL, MÉTODOS PARA MELHORAR O VALOR NUTRITIVO DE UMA RAÇÃO ANIMAL, E PARA TRATAR PROTEÍNAS VEGETAIS, COMPOSIÇÃO, PROCESSO PARA REDUZIR OS NÍVEIS DE FITATO EM UM ESTERCO ANIMAL, E, USO DA VARIANTE” Campo da Invenção A presente invenção refere-se a variantes de uma fitase parental, particularmente variantes de termoestabilidade e/ou atividade específica melhoradas. A invenção também refere-se a seqüências de DNA codificando estas variantes, sua produção em uma célula hospedeira recombinante, assim como métodos para usar as variantes, particularmente dentro do campo de ração animal. Uma fitase parental preferida é a fitase Peniophora compreendendo SEQID NO: 2.

Antecedentes da invenção EP 897010 intitulado "Modified fitases" descreve, inter alia, algumas variantes de uma fitase de Aspergillus fumigatus. EP 897985 intitulado "Fitase de consensos" descreve, inter alia, uma fitase de consenso fungai que pode ser projetada com base em, inter alia, um alinhamento múltiplo de várias fitases de ascomiceto. WO 99/48380 intitulado "Thermostable fitases in feed preparation and plant expression" refere-se a alguns aspectos de uso de fitases termoestáveis. Exemplos de fitases termoestáveis são as várias fitases de consenso ligadas na página 30 abaixo da linha de negrito. WO 00/43503 intitulado "Improved fitases" refere-se a, inter alia, algumas variantes de fitases com termoestabilidade, que podem ser projetadas por um processo similar ao descrito em EP 897985. Exemplos de fitases termoestáveis são mostrados na página 54-55 abaixo da linha em negrito. Estas fitases tem, todas, uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 abaixo de 75%. É um objeto da presente invenção prover novas e melhoradas variantes de fítase, particularmente com melhorada termoestabilidade e/ou atividade específica aumentada.

Arte antecedente Uma fitase derivada de Peniophora lycii é descrita em WO 98/28408, e algumas variantes da mesma em WO 99/49022 (ver, por exemplo, reivindicação 31 a p. 76-77), cujas variantes, no entanto, para os presentes fins não foram reivindicadas.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se a uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição de pelo menos uma posição de, pelo menos, uma região selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 26; 28-31; 37-48; 55-69; 73-83; 91-119; 123-126; 135-142; 152-163; 169-199; 204-222; 229-238; 248-266; 284-289; 300-308; 321-335; 343-350; 384-398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade de fitase, e (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%, e (d) com a condição que a variante não é uma variante de Peniophora lycii fitase CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: G26S; Y28N; D29S; F31Y; E42D,K,A; T45R; V46I; W59F; S620; A64K; R65Q,E,G,A; S66T; R67A,I,Q,K; Q68Y,V,I; K74R,A; A99N; D100S; L102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Q111E,N; T112A,S; M116F,I,L; A135S; D137Y; Q138D,S,G; D142A; ()154fH; S155N; G156P; E157Q,S; E169S; E170A,P; G171A; ()171aS; T174P,A; N177S; N178S/T; M179T,V,L; N182A,V; V184G; D185E; ()185eT; G186S,A; D187R,K,S; ()187aV,T; E188Q,S,A,V; S189E; V195L; N199A,P; L204N; A207D,H; S216T; D217E; L219Y,T; T220Y,N; L221F; M222L; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; S249Q,A; E251 D; Y254A,L,G; D255N; D257K; Y259F; T262H; P264A; G286R,H; Q287K,S; A288P; T321Q,S,G; M322I; V321I; P324A; A327S,F,I,L; F332Y; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D350S,V; G388A; V393R; Ε395Κ/Γ; e L396R. A presente invenção refere-se também a seqüências de ácido nucleico isoladas codificando a variante fitase e a construções de ácido nucleico, vetores e células hospedeiras compreendendo as seqüências de ácido nucleico assim como métodos para produzir e usar as variantes de fitase. Breve Descrição Das Figuras A Figura 1 provê as coordenadas para a estrutura 3D de uma fitase de Peniophora lycii que compreende a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2.

Descrição Detalhada Da Invenção Estrutura tri-dimensional de fitase Peniophora A estrutura da fitase de Peniophora lycii foi resolvida de acordo com os princípios para métodos cristalográficos de raios-X como dados, por exemplo, em X-ray Structure Determination, Stout, G.K. e Jensen, L.H. John Wiley & Sons, Inc. NY, 1989. As coordenadas estruturais para a estrutura de cristal a uma resolução de 2.2 Â usando o método de substituição isomorfa são dados na Figura 1, em formato PDB padrão. (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory, Brookhaven CT). O arquivo PDB de Figura 1 refere-se a uma parte apenas da seqüência para esta fitase, ou seja, a parte correspondendo aos resíduos 22-422 de SEQ ID NO: 2.

Dinâmica molecular (MD) As simulações de dinâmica molecular (MD) são indicativas da mobilidade de aminoácidos na estrutura da proteína (ver McCammon, JA e Harvey SC (1987) "Dynamics of proteins and nucleic acids". Cambridge University Press). Estas dinâmicas de proteína são com freqüência comparadas com os fatores B cristalográficos (Ver Stout, GH e Jensen, LH, (1989). "X-ray stracture determination", Wiley). Ao realizar uma estimulação MD, em por exemplo, temperaturas diferentes, a mobilidade relacionada com a temperatura é simulada. As regiões tendo a maior mobilidade ou flexibilidade (aqui flutuações isotrópicas) podem ser sugeridas para mutagenese aleatória. Entende-se aqui que a elevada mobilidade encontrada em algumas áreas da proteína podem ser termicamente melhoradas por substituição destes resíduos.

Usando o programa CHARMM (Molecular Simulations (MSI)), a estrutura de fitase Peniophora descrita acima foi submetida a MD a 300, 350, 400, 450, e 500K para 300 e 600ps e então minimizada usando 300 etapas de Steepest Oescent, 600 etapas de Conjugated Gradients, e 3000 etapas de ABNR com um grau de tolerância de 0,001 kcal/mole.

As seguintes regiões sugeridas para mutagenese resultam de simulações com MD: MD a 300 e 400K sem água: 37-48, 91-119, 232-238, 300-308, 325-335, 343-348; MD a 300 e 400K com água: 407-412; MD a 300K sem água: 229-236; MD em uma caixa de água cúbica com limites de períodos: 123-126, 154-157, 204-216, 284-289, 419-423.

As seguintes regiões sugeridas para mutagenese resultam de avaliações dos fatores B na estrutura X: 73-83,207-217.

As regiões acima podem ser combinadas como a seguir: 37-48; 73-83; 91-119; 123-126; 154- 157; 204-217; 229-238; 284-289; 300-308; 325-335; 343-348; 407-412; 419-423.

Outras regiões resultantes para simulações de MD são: 154-163; 204-218; 323-335; 342- 350.

Outras regiões resultantes da avaliação para fatores B são: 1-29, preferivelmente 1-29; 59-106; 169-171; 178-247; 339-344; 367-371; 417 e assim em diante. As regiões mais preferidas são: 1-24; 69-94; 182-188; 199-220; 229-241; 368-370; 420-423. Sítio ativo e envoltórios de ligação de substrato Programas conhecidos na arte, como INSIGHTII de Molecular Simulations MSI, San Diego, Califórnia podem ser usados para definir os envoltórios de sítio ativo compreendendo os resíduos de aminoácidos que estão em proximidade íntima com os resíduos catalíticos (H55, D319, R54). Os envoltórios de ligação de substrato também podem ser definidos, compreendendo os resíduos de aminoácidos que estão em proximidade íntima com o sítio de ligação do (H55, R54, RI39, N320) e que podem ser assim esperados como estando em contato com o substrato. A proximidade íntima pode ser definida como, por exemplo 0Â, 15 Â, 16 Â, ou 20 Â, dos resíduos relevantes. A informação sobre a ligação do substrato pode ser deduzida por atracamento do ácido fítico ou um derivado do mesmo como inositol-1, 4, 5-trifosfato (arquivo da base de dados Brookhaven ldjx. Inositol-1, 4, 5-trifosfatos) na chave do sítio ativo (os resíduos fazendo a superfície do sítio ativo).

Estratégia para preparar variantes Com base na estrutura 3D da Fig. 1 e SEQ ID NO: 2, e seguido o estudo de sítio ativo e envoltórios de ligação de substrato (16 Â, preferivelmente 15 Â, mais preferivelmente 10 Â ), assim como dinâmica molecular, as seguintes regiões foram sugeridas para mutagenese, principalmente tendo em vista melhorar a termoestabilidade e/ou aumentar a atividade específica: Aminoácidos 26-31; 55-69; 99-104; 135-142; 169-193; 253-266; ou aminoácidos 321-323 de SEQID NO: 2.

As seguintes posições das regiões acima de SEO ID NO: 2 são preferivelmente submetidas a mutagenese G26, P27, Y28, D29, P30, W59, P60, T61, S62, G63, A64, R65, S66, R67,068, V69,A99, D100,L 102,P 103 ,F 104, A13 5,G 136,D137,Q 138, V141,D142, E169, El70, N177, N178, M179, P181, N182, D189, T191, W192, L193, Y253, Y254, D257, K258, Y259, Y260, T262, G265, N266, T321, e/ou V323.

As seguintes.variantes são contempladas: G266S,A, P27X,M; Y28F,N,Q; D29S,T,A; F30X; W59X,F,Y; P60S; T61S; S62A; G63A,S; A64G,K,R,S; R65A; S66K,T; R67X,K,A,L,V,S; Q68E,D,N,M; V69X; A99X,D,S,E,N; D100X,S,E,N; L102V; P103X,E; F104X,L; A135S,D; G136X, 8,D; D137S; Q138X,D,N; V141X; D142X; E169A; E170X,A,T; N177D; N178A,G,L; M179V,T; P181X,T,V; N182X,A; D189X; T191X; W192X; L 193T,I; Y253N,G; Y254A,G; 02578; K258L; Y259X,F,P,W; Y260X,P,W; T262Y,V; G265X; N266Q; T321 Q,L,N; e/ou V32I.

Os resíduos de aminoácidos ou posições principalmente apontando para o substrato são as seguintes: P27, Y28, R65, R67, Q68, A99, 0100, L 102, A135, G136, D137, E169, N177, T191, W192, Y253, Y254, T262, e T321. As variantes sendo alteradas em uma ou mais destas posições são especificamente contempladas, por exemplo variantes compreendendo uma alteração em pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez destas posições. Em uma forma de realização particular, a variante compreende alterações em pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quatorze, pelo menos quinze, pelo menos dezesseis, pelo menos dezessete, pelo menos dezoito, ou em todas as dezenove posições. Exemplos destas variantes são as compreendendo pelo menos uma, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, ou pelo menos dez mutações selecionadas dentre as seguintes: P27X,M; Y28F,N,Q; R65A; R67X,K,A,L,V,S; Q68E,D,N,M; A99X,D, 8,E,N; D100X, 8,E,N; L102V; A135S,D; G136X,S,D; D1378; E169A; N177D; T191X; VY192X; Y253N,G; Y254A,G; T262Y,V; e/ou T3210,L,N. Em uma forma de realização particular, a variante compreende pelo menos onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, pelo menos dezoito, ou dezenove destas mutações.

Polipeptídeos tendo atividade de fitase No presente contexto, um polipeptídeo tendo atividade de fitase (uma fitase) é uma enzima que catalisada a hidrólise do fitato (mio-inositol hexaquisfosfato) em (1) mio-inositol e/ou (2) mono-, di-, tri-, tetra-e/ou penta-fosfatos dos mesmos e (3) fosfato inorgânico No presente contexto, o termo um substrato de fitase engloba, isto é ácido fitico e qualquer fitato, (sal de ácido fitico), assim como os fosfatos listados sob (2) acima. O site ΕΝΖΥΜΕ na internet (http://www.expasv.ch/enzvme/) é um repositório de informação com relação à nomenclatura de enzimas. Ele é primariamente baseado nas recomendações do Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (1UB-MB) e descreve cada tipo de enzima caracterizada para a qual um número EC (Enzyme Commission) foi dado (Bairoch A. The ΕΝΖΥΜΕ database, 2000, Nucleic Acids Res 28:304-305). Ver também o livro Enzyme Nomenclature da NC-IUBMB, 1992).

De acordo com o site ENZYME, dois diferentes tipos de fitases são conhecidos. Um assim chamado 3-fitase (mio-inositol hexafosfato 3-fosfohidrolase, EC 3.1.3.8) e um assim chamado 6-fitase (mio-inositol hexafosfato 6-fosfohidrolase, EC 3.1.3.26). Para os fins da presente invenção, ambos os tipos são incluídos na definição de fitase.

Para os fins da presente invenção, a atividade fitase é determinada na unidade de FYT, um FYT sendo a quantidade de enzima que libera 1 micromol de orto-fosfato inorgânico por exemplo minuto, sob as seguintes condições: pH 5, 5; temperatura 37°C; substrato: fitato de sódio (C6H6024P6Nai2) em uma concentração de 0,0050 mol/1. Os testes de fitase apropriados são os testes FYT e FTU descritos no Exemplo 1 de WO 00/20569. FTU é para determinar a atividade de fitase em ração e pré-mistura. O teste de FYT é também descrito no exemplo 2 do mesmo.

Fitase parental Uma fitase parental é uma fitase que é homóloga à fitase derivada de Peniophora lycii CBS 686.98. No presente contexto, homólogo significa tendo uma identidade de pelo menos 60% para SEQ ID NO: 2, aqui, correspondendo a aminoácidos 17-439 da seqüência de aminoácido completa, incluindo a parte de peptídeo de sinal, de uma fitase derivada de Peniophora lycii CBS 686.96 (SEQ ID NO: 2 de WO 98/28408). A homologia é determinada como geralmente descrito abaixo na seção intitulada Homologia de ácido. A fitase parental pode ser um polipeptídeo de tipo selvagem ou de ocorrência natural, ou uma variante alélica do mesmo, ou um fragmento do mesmo que tem atividade de fitase, particularmente uma parte madura da mesma. Também pode ser uma variante da mesma e/ou polipeptídeo geneticamente engenheirado ou sintético.

Em uma forma de realização particular, a fitase parental de tipo selvagem é uma fitase fungica como uma fitase fungica filamentosa, ou uma fitase de levedura. Um exemplo de uma fitase de levedura é a fitase Schwanniomyces occidentalis descrita emUS 5830732.

Em outra forma de realização particular, a fitase parental fungica de tipo selvagem é derivada de um fungo filamento50, por exemplo do filo Aseomyeota ou do filo Basidiomyeota (uma fitase ascomiceto, uma fitase basidiomiceto, respectivamente).

Exemplos fitases de ascomicetos são as derivadas de uma cepa de Aspergillus, por exemplo Aspergillus awamori PHYA (SWISSPROT P34753, Gene 133:55-62 (1993)), Aspergillus niger (ficuum) PHYA (SWISSPROT P34752, EP 420358, Gene 127:87-94 (1993)), Aspergillus awamori PHYB (SWISSPROT P34755, Gene 133:55-62 (1993)), Aspergillus niger PHYB (SWISSPROT P34754. Biochem. Biophys. Res. Commun. 195:5357(1993)); ou uma cepa de Emericella, por exemplo Emericella nidulans PHYB (SWISSPROT 000093, Biochim. Biophys. Acta 1353:217-223 (1997)); ou uma cepa de Thermomyces (Humicola), por exemplo a fitase Thermomyces lanuginosus fitase descrita em WO 97/35017. Outros exemplos de fitases ascomiceto são descritos em EP 684313 (por exemplo derivados de cepas Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, e Myceliphíhora thermophila); JP 11000164 (uma fitase derivada de uma cepa de Penicillium.); US 6139902 (uma fitase derivada de uma cepa de Aspergillus), e WO 98/13480 (fitase Monascus anka).

Exemplos de fitases basidiomiceto são as fitases derivadas de Paxillus ínvolutus, Trametes pubescens, Agroeybe pediades e Peniophora lyciii (ver WO 98/28409).

Uma fitase parental preferida é derivada da espécies de Peniophora, preferivelmente de uma cepa de Peniophora lycii, mais preferivelmente da cepa n Peniophora lycii CBS 686.96.

Será entendido que a definição das espécies acima mencionadas incluem tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo anamorfos, sem levar em conta o nome da espécie pela qual eles são conhecidos. Os versados na arte irão prontamente reconhecer a identidade de equivalentes apropriados.

As cepas destas espécies são prontamente acessíveis ao público em várias coleções de cultura, como a American Type Culture Collection (A TCC). Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Além disso, estes polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo solo, estrumes, água, etc), usando sondas apropriadas. As técnicas para isolar microorganismos de habitats naturais são bem conhecidas dos versados na arte. A seqüência de ácido nucleico pode ser então derivada similarmente por triagem de uma biblioteca genômica ou de cDNA de outro microorganismo. Uma vez que uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo foi detectada com a sonda (s), a seqüência pode ser isolada ou clonada por utilização de técnicas que são bem conhecidas dos versados na arte (ver por exemplo Sambrook et a/., 1989, supra).

Em ainda outra forma de realização particular, a fitase parental é uma fitase sintética. Uma fitase sintética é projetada pelo homem e, como esperado, não ocorre na natureza. EP 897985 e WO 00/43503 descrevem exemplos destas fitases fungicas sintéticas, geralmente designadas fitases de consenso. As fitases embaralhadas são outros exemplos de uma fitase parental sintética ou geneticamente engenheirada, que pode ser preparada como é geralmente conhecido na arte, por exemplo por mutagenese dirigida ao sítio, por PCR (usando um fragmento de PCR contendo a mutação desejada, como um dos iniciadores nas reações de PCR), ou por mutagenese aleatória. Também está incluído no conceito de uma fitase sintética qualquer híbrido ou fitase quimérica, isto é, uma fitase que compreende uma combinação de seqüências de aminoácidos parciais derivadas de, pelo menos, duas fitases. A fitase parental pode compreender a seqüência de aminoácido especificada, ou pode ser uma variante alélica da mesma, ou um fragmento da mesma que tem atividade de fitase. Em uma forma de realização, a fitase parental compreende a seqüência de aminoácidos especificada ou uma variante alélica da mesma; ou um fragmento da mesma que tem atividade fitase. Em outra forma de realização, a fitase parental consiste da seqüência de aminoácido especificada, ou uma variante alélica da mesma, ou um fragmento da mesma que tem atividade de fitase.

Um fragmento de uma seqüência de aminoácido especificada é um polipeptídeo tendo um ou mais aminoácidos deletados do término amino e/ou carboxila desta seqüência de aminoácido. Em uma forma de realização, um fragmento contém pelo menos 150, ou pelo menos 200, ou pelo menos 250, ou pelo menos 260, ou pelo menos 280, ou pelo menos 300, ou pelo menos 320, ou pelo menos 340, ou pelo menos 360, pelo menos 380, ou pelo menos 390, ar pelo menos 400, ou pelo menos 410, ou pelo menos 420, ou pelo menos 430, ou pelo menos 440, ou pelo menos 450 resíduos de aminoácidos.

Uma variante alélica denota qualquer duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo local cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As mutações de genes podem ser silentes (sem mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo seqüências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene. A fitase parental também pode ser uma parte madura de qualquer uma das seqüências de aminoácidos referidas acima. Uma parte madura significa uma seqüência de aminoácido madura e refere-se à parte de uma seqüência de aminoácidos que permanece após uma parte de peptídeo de sinal em potencial ter sido clivada.

Em ainda outra forma de realização, a fitase parental pode ser uma variante das fitases referidas acima compreendendo uma substituição, deleção e/ou inserção de um ou mais aminoácidos. A seqüência de aminoácido de fitase variante pode diferir da seqüência de aminoácido especificada por uma inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos e/ou a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por diferentes resíduos de aminoácidos. Preferivelmente, as mudanças de aminoácidos são de uma natureza menor, isto é, substituições de aminoácidos conservativas que não afetam de modo significante a duplicação e/ou atividade da proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos, extensões pequenas amino- ou carboxil-terminal, como um resíduo metionina amino-terminal; um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduos, ou uma extensão pequena que facilita a purificação por mudança da carga líquida ou outra função, como um trato poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

Os exemplos de substituições conservativas estão em um grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina, e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspartíco), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos ((leucina isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina alanina, serina, treonina e metionina). As substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são bem conhecidas dos versados na arte e descritas, por exemplo por H. Neurath e R.L. HilI, 1979, In, The Proteins, Academic Press, New York. As mudanças que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Nal, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, LeuNal, Ala/Glu, e Asp/Gly assim como as mesmas em forma reversa.

Taxonomia de microorganismos As questões com relação a taxonomia podem ser resolvidas por consulta a uma base de dados de taxonomia, como o NCBI Taxonomy Browser que se encontra disponível no seguinte site da internet: http: //www.ncbi .nlm.nih. go v/T axonomv/taxonomvhome .htmll/ e/ou por consulta a livros de Taxonomia. Para os presentes fins, um livro preferido com relação a taxonomia de fungos é o Dictionary of the Fungi, 9a. ed., editado por Kirk, P.M., P.F. Gannon, J.G. David & J.A. Stalpers, GAB Publishing, 2001.

Uma fitase sintética, como uma fitase de consen50, uma fitase embaralhada, ou uma fitase híbrida, podem compreender uma combinação de seqüências de aminoácidos parciais derivando de, pelo menos, duas fitases ascomiceto, pelo menos duas fitases basidiomiceto e de pelo menos uma fitase ascomiceto e pelo menos uma fitase basidiomiceto. Estas fitases ascomiceto e preferivelmente das quais uma seqüência de aminoácido parcial deriva podem, por exemplo, ser qualquer uma das fitases específicas referidas aqui.

No presente contexto, uma fitase sintética derivada de pelo menos um fungo é uma fitase fungica. Além dis50, uma fitase sintética derivada de fitases ascomiceto somente é uma fitase ascomiceto; e uma fitase sintética derivada de fitases basidiomiceto somente é uma fitase basidiomiceto. Qualquer fitase sintética derivada de pelo menos uma fitase ascomiceto, assim como pelo menos uma fitase basidiomiceto pode ser designada como uma fitase mista ascomiceto/ basidiomiceto. A designação de fitase Peniophora significa uma fitase de tipo selvagem derivada de uma espécie do gênero Peniophora, incluindo variantes alélicas, fragmentos ou variantes das mesmas, ou uma fitase sintética preparada com base em pelo menos uma, preferivelmente pelo menos duas, Peniophora fitase(s), mais preferivelmente com base apenas em Peniophora fitases. Exemplos de espécies de Peniophora incluem: Peniophora aurantiaca, P. cinerea, P. decorticans, P. duplex, P. ericsonii, P. incamate, P. lycii, P. meridionalis, P. nuda, P. piceae, P. pini, P. pfthya, P. polygonia, P. próxima, P. pseudo-pini, P. rufa, P. versicolor, e espécies simplesmente classificadas como Peniophora sp. Uma espécie preferida é Peniophora lycii. Uma cepa preferida é Peniophora lycii CBS 686.96.

Homologia de aminoácido A presente invenção refere-se a fitases tendo seqüência de aminoácidos que tem um certo grau de identidade para SEQ ID NO: 2 (a seguir "fitases homólogas") Para fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácidos, assim como o grau de identidade entre duas sequências de nucleotídeos, é determinado pelo programa "align" que é um alinhamento de Needleman-Wunsch (isto é, um alinhamento global). O programa é usado para alinhamento de polipeptídeo, assim como de seqüências de nucleotídeos. A matriz de escore do default BLOSUM50 é usada para alinhamentos de polipeptídeos e a matriz de identidade de default é usada para alinhamentos de nucleotídeos. A penalidade para o primeiro resíduo é um gap de -12 para polipeptídeos e -16 para nucleotídeos. As penalidades para outros resíduos de um gap são -2 para polipeptídeos e -4 para nucleotídeos. "Align" é parte da versão de programa FASTA v20u6 (ver W. R. Pearson e D. J.Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98). Os alinhamentos de proteína FASTA usam o algoritmo de Smith-Waterman sem limitação do tamanho do gap (ver "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith e M. S. Waterman (1981) J. Mol. Biol. 147:195-197).

Em formas de realização particulares, a fitase parental tem uma seqüência de aminoácidos que tem um grau de identidade para SEQ ID NO: de pelo menos cerca de 55%, ou de pelo menos cerca de 60%, ou de pelo menos cerca de 65%, ou de pelo menos cerca de 70%, ou de pelo menos cerca de 75% ou de pelo menos cerca de 80%, ou de pelo menos cerca de 85%, ou de pelo menos cerca de 90%, ou de pelo menos cerca de 91 %, ou de pelo menos cerca de 92%, ou de pelo menos cerca de 93%, ou de pelo menos cerca de 94%, ou de pelo menos cerca de 95%, ou de pelo menos cerca de 96%, ou de pelo menos cerca de 97%, ou de pelo menos cerca de 98%, ou de pelo menos cerca de 99%.

Em outra forma de realização particular, estas fitases parentais homólogas tem uma seqüência de aminoácidos que difere por trinta, vinte e cinco, vinte e dois, vinte, dezenove, dezoito, dezessete, dezesseis, quinze, quatorze, treze, doze, onze, dez, nove, oito, sete, seis, cinco, quatro, três, dois ou apenas um aminoácido (s) dentre o aminoácido especificado.

Também, a fitase parental resultante é homóloga a SEO 10 NO: 2. Em formas de realização particulares, a fitase variante compreende ou tem uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos cerca de 55%, ou de pelo menos cerca de 60%, ou de pelo menos cerca de 65%, ou de pelo menos cerca de 70%, ou de pelo menos cerca de 71 %, ou de pelo menos cerca de 72%, ou de pelo menos cerca de 73%, ou de pelo menos cerca de 74%. ou de pelo menos cerca de 75%, ou de pelo menos cerca de 76%, ou de pelo menos cerca de 77%, ou de pelo menos cerca de 78%, ou de pelo menos cerca de 79%, ou de pelo menos cerca de 80%, ou de pelo menos cerca de 82%. ou de pelo menos cerca de 85%, ou de pelo menos cerca de 87%, ou de pelo menos cerca de 90%, ou de pelo menos cerca de 92%, ou de pelo menos cerca de 95%, ou de pelo menos cerca de 97%.

Hibridização de ácido nucleico Na alternativa, as fitases parentais homólogas, assim como fitases variantes, podem ser definidas como sendo codificadas por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixa, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência média-alta, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas, e mais preferivelmente condições de estringência muito altas, com nucleotídeos 49-1320 de SEO 10 NO: 1, ou uma sub- seqüência ou filamento complementar da mesma (J Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor, New York). Uma sub- seqüência pode ter pelo menos 100 nucleotídeos ou pelo menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, ou pelo menos 300 nucleotídeos. Além disso, a sub-seqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que tem atividade de enzima relevante.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0, 3% SDS, 200 pg/ml DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e ou 25% formamida para estrigências muito baixas e baixas, 35% formamida para condições de estringência média e média alta, ou 50% formamida para estringências altas e muito altas, seguindo o procedimento de Southern blotting.

Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos de comprimento, o material de veículo é finalmente três vezes cada durante 15 minutos usando 2 x SSC, 0., 2% SDS preferivelmente pelo menos a 45°C (estringência muito baixa) mais preferivelmente pelo menos a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (estringência média), mais preferivelmente pelo menos 60 °C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65 °C (alta estringência e mais preferivelmente pelo menos a 70 °C (estringência muito alta).

Para sondas curtas que tem 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, as condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização, e lavagem pós-hibridização a 5 °C a 10 °C abaixo do Tm calculado, usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of íhe National Academy af Sciences USA 48:1390) em 0, 9 MNaCl, 0,09 M Tris-HCI pH 7, 6, 6 mM EDTA, 0, 5% NP- 40, IX solução de Derihardt, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato monobásico de sódio, 0,1 mM A TP, e 0, 2 mg de RNA de levedura por ml após procedimentos de Sothem blotting seguintes.

Para sondas curtas que tem cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos de comprimento, o material veículo é lavado uma vez em 6X 8CC mais 0,1 % 8D8 durante 15 minutos e duas vezes a cada 15 minutos usando 6X 88C a 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado.

Numeração da posição A nomenclatura usada aqui para definição de posições de aminoácidos é basicamente como descrito em WO 99/49022, isto é com referência à seqüência de aminoácidos de fitase derivada de Peniaphora lycii CB8 686.96, exceto que no presente contexto a numeração começa a 817 da seqüência de P- lycii mostrada em Fig. 1 de WO 99/49022. conseqüentemente, os números de posição usados aqui diferem dos números de posição de WO 99/49022 em 16 (ver pag. 14, linha 26, e Fig. 1 de WO 99/49022,). Assim, por exemplo, 81 aqui é equivalente a 817 de WO 99/49022, e F8 aqui é equivalente a F24 de WO 99/49022. A seqüência SEQID NO:2 compreende aminoácidos14-409 da seqüência mostrada em Fig. 6 de WO 99/49022, correspondendo a aminoácidos 16-439 da seqüência de P_lycii mostrada na Figura 1 do mesmos.

Conseqüentemente, no presente contexto, a base para as posições de numeração na 8EQ ID NO: 2 partindo com SI e terminando com E423. Uma fitase parental, assim como uma fitase variante, pode compreender extensões como comparado com SEQ ID NO: 2, isto é, as extremidades N-terminais e/ou as extremidades C-terminais da mesma. Os aminoácidos destas extensões, se presente, devem ser numerados como é comum na arte, isto é, para uma extensão C-terminal: 424, 425, 426 e assim em diante e para uma extensão Nterminal, -1, -2, -3 e assim em diante.

Alterações, como substituições, deleções e inserções No presente contexto, os seguintes são exemplos de vários modos em que uma variante de fitase - pelo menos em teoria, isto é, no papel - pode ser derivada de uma seqüência de aminoácido parental: Um aminoácido pode ser substituído com outro aminoácido; um aminoácido pode ser deletado; um aminoácido pode ser inserido; assim como qualquer combinação de várias destas alterações.

Para os presentes fins, o termo substituição se destina a incluir qualquer número de qualquer tipo destas alterações. Esta é uma definição razoável porque, por exemplo, uma deleção pode ser considerada como uma substituição de um aminoácido, AA, em uma dada posição, nn, sem nada, (). Esta substituição p ode ser designada AAnnO. Do mesmo modo, uma inserção de apenas um aminoácido,BS, a jusante de um aminoácido, AA, em uma dada posição, nn, pode ser designado: OnnaSS. E se dois aminoácidos, SS e CC, são inseridos a jusante do aminoácido AA na posição nn, esta substituição (combinação de duas substituições) pode ser designada: ()nnaBB+()nnbCC, os gaps assim criados entre aminoácidos nn e nn+1 na seqüência parental recebendo designação em letras de caixa baixa ou subscrito, a, b, c, etc, para o número de posição anterior, aqui nn. Uma vírgula (,) entre substituintes, como por exemplo na substituição A327S,F,I,L significa "ambos ou", isto é, que A327 é substituído com S, ou F, ou I, ou L. Um sinal mais (+) entre substituições, como por exemplo nas substituições 29S+12SD+324A significa "e", isto é, que estas três substituições únicas são combinadas em uma e na mesma variante de fitase. Esta nomenclatura definindo alterações de aminoácidos é também basicamente como descrito em WO 99/49022 (ver p. 16 do mesmo).

Na alternativa, em que o termo substituição é definido de modo diferente, a presente invenção refere-se a uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma alteração em, pelo menos, uma posição selecionada dentre os vários grupos de regiões aqui indicados, em que a alteração(ões) são independentemente uma inserção de pelo menos um aminoácido a jusante do aminoácido que ocupa a posição; uma deleção de aminoácido que ocupa a posição; e/ou uma substituição do aminoácido que ocupa a posição com um aminoácido diferente; em que a variante tem atividade fitase, e cada posição corresponde a uma posição da seqüência de aminoácido da enzima tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; e a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%, e com condição (ões) como aqui definidas.

No presente contexto, o termo "uma substituição" significa pelo menos uma substituição. Pelo menos um significa um ou mais, por exemplo um, ou dois, ou três, ou quatro, ou cinco, ou seis, ou sete, ou oito, ou nove, ou dez, ou doze, ou quatorze, ou quinze, ou dezesseis, ou dezoito, ou vinte, ou vinte e dois ou vinte e quatro ou vinte e cinco, ou vinte e oito, ou trinta, e assim em diante, de modo a incluir, em princípio, qualquer número de substituições. As variantes da invenção, no entanto, ainda tem de ser, por exemplo, pelo menos 75% idênticas a SEQ ID NO: 2, esta porcentagem sendo determinada pelo programa acima mencionado. As substituições podem ser aplicadas a qualquer posição englobada por qualquer região mencionada em reivindicação 1, e variantes compreendendo combinações de qualquer número e tipo destas substituições também são incluídas. O termo substituição, como usado aqui, também inclui deleções, assim como extensões, ou inserções, que podem aumentar o comprimento da seqüência correspondendo a SEQ ID NO: 2. Em uma forma de realização particular, o número de substituições é, no máximo, de 200, ou 175 ou 150, ou 125, ou 120, ou 110, ou 106, ou 105, ou 100, ou 90, ou 80, ou 70, ou 60,ou 50 ou 40, ou 30, ou 25.

Além disso, o termo "uma substituição" engloba uma substituição em qualquer um dos dezenove aminoácidos naturais, ou em outros aminoácidos, como aminoácidos não naturais. Por exemplo, uma substituição de aminoácido Q em posição 20 inclui cada uma das seguintes substituições: 20A, 20C, 20D, 20E, 20F, 20G, 20H, 201, 20K, 20L, 20M, 20N, 20P, 20R, 20S, 20T, 20V, 20W, ou 20Y. Isto é, assim, equivalente à designação 20X, em que X designa qualquer aminoácido. Estas substituições também pode ser designadas Q20A, Q20C, Q20X, etc. O mesmo se aplica por analogia a cada uma e determinada posição acima mencionada, para especificamente incluir aqui qualquer uma destas substituições.

Identificação de números de posição correspondentes.

Para a fitase parental de Peniophora lycii CBS 686.96, a numeração de posição refere-se à numeração de SEQ ID NO: 2. Para uma dada posição em outra fitase - seja uma parental ou uma fitase variante - uma posição correspondente em SEQ ID NO: 2 pode ser sempre encontrada. Ou -na alternativa - uma posição que corresponde a uma posição da seqüência de aminoácidos da fitase compreendendo (ou tendo) a seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 2, pode ser sempre encontrada. A seqüência de aminoácidos de uma fitase parental diferente da fitase de Peniophora lycii CBS 686.96, ou por sua vez, de uma seqüência de aminoácido de fitase variante, é designada SEQ ID NO: X. Uma posição correspondendo à posição N de SEQ ID NO: 2 é encontrada como a seguir: A seqüência de aminoácido de fitase parental ou variante SEQ-X é alinhada com SEQ ID NO: 2, como especificado acima, na seção Homologia de aminoácido. Para o alinhamento, a posição na seqüência SEQ-X correspondente à posição N de SEQ ID NO: 2 pode ser claramente e não ambiguamente derivada, usando os princípios descritos abaixo.

Referência é feita, como um exemplo apenas, a Figura 1 de WO 99/49022, considerando que as seqüências A_pediades, A_fiimigatus ou T Januginosus são por exemplo fitases variantes que foram alinhadas na fitase P lycii, que os requerentes consideram como correspondendo a SEQ ID NO: 2 como descrito aqui (para os presentes fins, elas devem ser alinhadas para SEQ IDNO: 2).

Pergunta no. 1: qual posição em A_pediades corresponde a S17 de P lycii (referida posição sendo, para os presentes fins, designada Sl)? A resposta é: Al 5.

Pergunta no. 2: qual posição na fitase designada A fumigatus corresponde a 55b() de P lycii (referida posição sendo, para os presentes fins, designada 39b())? A resposta é: S63.

Pergunta no. 3: Qual posição em A_pediades corresponde a L31 de P lycii (referida posição sendo, para os presentes fins, designada LI5)? A resposta é ()30d.

Pergunta no. 4: qual substituição em P lycii corresponde a uma variante de fitase de T lanuginosa, imaginativa, tendo a substituição G3L? A resposta é ()-6L (referida substituição sendo, para os presentes fins, designada 0-22L). SEQ-X pode ser uma parte madura da fitase em questão, ou pode também incluir uma parte de peptídeo de sinal, ou pode ser um fragmento da fitase madura que tem atividade fitase, por exemplo um fragmento do mesmo comprimento que SEQID NO: 2, ou o fragmento que se estende de Sl a E423 quando alinhado com SEQ ID NO: 2, como aqui descrito.

Região e posição No presente contexto, o termo região significa pelo menos uma posição de uma seqüência de aminoácido de fitase parental, o termo posição designando um resíduo de aminoácido desta seqüência de aminoácido. Em uma forma de realização, região significa uma ou mais posições sucessivas da seqüência de aminoácido de fitase parental, por exemplo uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, etc., até o número de posições consecutivas da seqüência. conseqüentemente, uma re pode consistir de uma posição apenas, ou pode consistir de várias posições consecutivas, como por exemplo, posição no. 37, 38 e 39; ou posição no. 37, 38, 39, 40, e 41; ou posição no. 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 e 48. Para os presentes fins, as últimas três regiões são designadas 37-39, 37-41, e 37-48, respectivamente. Os limites destas regiões ou faixas são incluídos na região. SEQ ID NO: 2 é um exemplo de uma seqüência de aminoácido de fitase parental preferida.

Uma região engloba especificamente cada e determinada posição que ela engloba. Por exemplo, região 37-48 especificamente engloba cada uma das posições 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, e 48. O mesmo se aplica por analogia a outras regiões mencionadas aqui. T ermo estabilidade Para os presentes fins, o termo termoestável, como aplicado no contexto de um determinada polipeptídeo, refere-se à temperatura de fusão, Tm, deste polipeptídeo, como determinado usando calorimetria de varredura diferencial (DSC) a pH de 5, 5: Para um polipeptídeo termoestável, Tm é pelo menos 61 °C. Em formas de realização particulares, Tm é pelo menos 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77, 5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100°C.

Na alternativa, o termo termoestável refere-se a uma temperatura de fusão de pelo menos 49°C e, preferivelmente pelo menos 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77, 5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,ou 90 °C, como determinada usando DSC a pH de 7,0.

Em outra alternativa, o termo termoestável refere-se a uma temperatura de fusão de pelo menos 51°C, preferivelmente pelo menos 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77, 5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ou 90° C, como determinado usando DSC a um pH de 3,0.

Em ainda outra alternativa, o termo termoestável refere-se a uma temperatura de fusão de 37°C, preferivelmente pelo menos 38, 39, 40, 41,42, 43,44, 45, 46,47,48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 77, 5, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, ou 90 °C, como determinado usando DSC emumpH de 2,5.

Para a determinação de Tm, uma amostra do polipeptídeo com uma pureza de pelo menos 90% (ou 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ou 98%) como determinado por SDS-PAGE pode ser usada. Ainda mais a amostra de enzima pode ter uma concentração de entre 0,5 e 2,5 mg/ml de proteína (ou entre 0, 6 e 2,4, ou entre 0,7 e 2,2, ou entre 0,8 e 2,0 mg/ml proteína), como determinado de absorbância a 280 nm e com base em um coeficiente de extinção calculado a partir da seqüência de aminoácido da enzima em questão. O DSC ocorre no pH desejado (por exemplo pH 5,5, 7,0, 3,0 ou 2,5) e com uma taxa de aquecimento constante, por exemplo de 1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 °C/min. Os exemplos de tampões apropriados são mencionados na parte experimental. Os exemplos de taxas de aquecimento preferidas são 1,0, 1,5 ou 2,0 °C/ min quando usando o equipamento como descrito no exemplo 2 aqui. Para outros tipos de equipamento com menores volumes de amostra, uma estimativa confiável de Tm pode ser obtida usando uma taxa de aquecimento de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou mesmo 10 °C/min, por exemplo.

Em uma forma de realização particular, a variante de fitase da invenção é mais termoestável do que a fitase parental. Uma fitase parental preferida para este fim é a fitase Peniophora lycii CBS 686.96.

Atividade específica O termo atividade específica elevada, aumentada ou melhorada refere-se a uma atividade específica de pelo menos 105%, com relação à atividade específica da fitase parental como determinado pelo mesmo procedimento. Em formas de realização particulares, a atividade específica relativa é de pelo menos 110, 115, 120, 125, 130, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350 ou mesmo 400%, ainda com relação à atividade específica da fitase parental como determinado pelo mesmo procedimento.

Na alternativa, o termo alta atividade específica refere-se a uma atividade específica de pelo menos 200 FYT/mg proteína enzima (EP). Em formas de realização particulares, a atividade específica é pelo menos 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900 ou 3000 FYT/mg EP. A atividade específica é medida em amostras altamente purificadas (um gel SDS poli acrilamida deve mostrar a presença de apenas um componente). A concentração de enzima proteína pode ser determinada por análise de aminoácido e a atividade de fitase nas unidades de FYT. A atividade específica é uma característica da variante de fitase específica em questão, e é calculada como a atividade de fitase medida em unidades FYT por mg de enzima proteína variante de fitase.

Ver exemplo 3 para outros detalhes. A variante de fitase da invenção é termoestável e/ou de alta atividade específica. Em uma forma de realização particular, ela é termoestável. Em outra forma de realização particular é de alta atividade específica. Em uma terceira forma de realização particular, é termoestável, assim como de uma elevada atividade específica. Em ainda outras formas de realização particulares, é (a) mais termoestável do que a fitase parental, (b) tem maior atividade específica como comparado com a fitase parental; ou (c) mais termoestável do que a fitase parental e de maior atividade específica como comparado com a fitase parental.

Variantes de baixo teor alergênico Em uma forma de realização específica, as variantes de fitase da presente invenção são (também) variantes de baixo teor alergênico, projetadas para invocar uma resposta imunológica reduzida quando expostas a animais, incluindo o homem. O termo resposta imunológica deve ser entendido como qualquer reação pelo sistema imune de um animal exposto à variante de fitase. Um tipo de resposta imunológica é um resposta alérgica levando a níveis aumentados de IgE no animal exposto. Os variantes de baixo teor alergênico podem ser preparados usando técnicas bem conhecidas dos versados na arte. Por exemplo, a variante de fitase pode ser conjugada com porções de polímero abrigando porções ou epítopos da variante de fitase envolvida em uma resposta imunológica. A conjugação com polímeros pode envolver a copulação química in vitro de polímero para a variante de fitase, por exemplo como descrito em WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/ 35026, e/ou WO 99/00489. A conjugação pode, além disso ou altemativamente ao mesmo, envolver a copulação in vivo de polímeros para a variante de fitase. Esta conjugação pode ser obtida por engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificando a variante de fitase, inserindo seqüências de consenso codificando sítios de glicosilação adicionais na variante de fitase e expressando a variante de fitase em um hospedeiro capaz de glicosilar a variante de fitase, ver, por exemplo WO 00/26354. Outro modo de prover variantes de baixo teor alergênico é por engenharia genética da seqüência de nucleotídeos codificando a variante de fitase de modo a levar a variante de fitase a se auto-oligomerizar, considerando que estas monômeros de variante de fitase podem abrigar os epítopos de outros monômeros de variante de fitase e, assim, diminuindo a antigenicidade dos oligômeros. Estes produtos e sua preparação são descritos, por exemplo, em WO 96/16177. Os epítopos envolvidos em uma resposta imunológica podem ser identificados por vários métodos, como o método de mostra de fagos descrito em WO 00/26230 e WO 01/ 83559, ou na abordagem aleatória descrita em EP 561907. Uma vez que um epítopo foi identificado, sua seqüência de aminoácido pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas da variante de fitase por técnicas de manipulação de genes conhecidas como a mutagenese dirigida ao sítio (ver por exemplo WO 00/26230, WO 26354 e/ou WO 00/22103) e/ou conjugação de um polímero pode ser feita em proximidade suficiente do epítopo para o polímero abrigar o epítopo.

Construções e seqüências de ácido nucleico A presente invenção também refere-se a seqüências de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico que codifica uma variante de fitase da invenção. O termo "seqüência de ácido nucleico isolado" refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que é essencialmente livre de outras seqüências de ácido nucleico, por exemplo pelo menos cerca de 20% pura, preferivelmente pelo menos cerca de 40% pura, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% pura, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% pura, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% pura, como determinado por eletroforese de agarose. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico isolado pode ser obtida por procedimentos de clonagem padrões, usados em engenharia genética para recolocar a seqüência de ácido nucleico de seu local natural para um sítio diferente onde será reproduzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver a excisão e isolamento de um fragmento de ácido nucleico desejado compreendendo a seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor, e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira, onde cópias múltiplas ou clones da seqüência de ácido nucleico serão replicadas. A seqüência de ácido nucleico pode ser de genômico, cDNA, RNA, semi-sintético, origem sintética, ou quaisquer combinações dos mesmos.

As seqüências de ácido nucleico da invenção podem ser preparadas por introdução de pelo menos uma mutação na seqüência de codificação de fitase parental ou uma sub-seqüência da mesma, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica uma fitase variante. A introdução de uma mutação na seqüência de ácido nucleico para mudar um nucleotídeo por outro nucleotídeo pode ser obtida por mutagenese dirigida ao sítio usando qualquer um dos métodos bem conhecidos dos versados na arte, por exemplo por mutagenese dirigida ao sítio, por mutagenese aleatória, ou por mutagenese aleatória dopada, salpicada, ou localizada. A mutagenese aleatória é realizada de modo apropriado como uma mutagenese aleatória localizada ou específica para região em pelo menos três partes do gene traduzindo a seqüência de aminoácido mostrada em questão, ou dentro do gene completo. Quando a mutagenese é realizada pelo uso de um oligonucleotídeo, o oligonucleotídeo pode ser dopado ou salpicado com os três nucleotídeos não parentais durante a síntese de oligonucleotídeo nas posições que devem ser mudadas. A dopagem ou salpico pode ser realizado de modo que códons para aminoácidos indesejados são evitados. O oligonucleotídeo dopado ou salpicado pode ser incorporado no DNA codificando a enzima fitase por qualquer técnica, usando por exemplo PCR, LCR ou qualquer DNA polimerase e ligase como considerado apropriado.

Preferivelmente, a dopagem é realizada usando "dopagem aleatória constante", em que a porcentagem de tipo selvagem e mutação em cada posição é pré-definida. Além disso, a dopagem pode ser dirigida para Λ uma preferEncia para a introdução de alguns nucleotídeos, e assim uma preferência para a introdução de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos. A dopagem pode ser feita, por exemplo, de modo a permitir a introdução de 90% de tipo selvagem e 10% de mutações em cada posição. Uma consideração adicional é a escolha de um esquema de dopagem baseado em genética, assim como limitações estruturais da proteína. A mutagenese aleatória pode estar localizada com vantagem em uma parte da fitase parental em questão. Isto pode, por exemplo, ser vantajoso quando algumas regiões da enzima foram identificadas como sendo de importância particular para uma dada propriedade da enzima.

Os métodos alternativos de prover variantes da invenção incluem o embaralhamento de genes, por exemplo como descrito em WO 95/22625 ou em WO 96/00343, e o processo de derivação de consenso como descrito em EP 897985.

Construções de ácido nucleico Uma construção de ácido nucleico compreende uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção ligada de modo operativo a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a expressão da seqüência de codificação em uma célula hospedeira apropriada sob condições compatíveis com as seqüências de controle. A expressão será entendida para incluir qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo incluindo, mas não limitada a transcrição, modificação pós-transcripcional, tradução, modificação pós-tradução, e secreção.

Vetor de expressão Uma seqüência de ácido nucleico codificando uma variante de fitase da invenção pode ser expressa usando um vetor de expressão que tipicamente inclui seqüências de controle codificando um promotor, operador, sítio de ligação de ribossomo, sinal de iniciação de tradução e, opcionalmente, um gene repressor ou vários genes ativadores. O vetor de expressão recombinante transportando a seqüência de DNA codificando uma variante de glucoamilase da invenção pode ser qualquer vetor que pode convenientemente ser submetido a procedimentos de DNA recombinante, e a escolha do vetor irá depender, com ffeqüência, da célula hospedeira em que ela deve ser introduzida. O vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado. A variante de fitase também pode ser co-expressada junto com pelo menos uma outra enzima de interesse de ração animal, como xilanase, uma endoglucanase, uma endo-1, 3(4)- beta-glucanase, e/ou uma protease. As enzimas podem ser co-expressas de diferentes vetores, de um vetor, ou usando uma mistura de ambas as técnicas. Quando usando diferentes vetores, os vetores podem ter diferentes marcadores selecionáveis, e diferentes origens de replicação. Quando usando somente um vetor, os genes podem ser expressos de um ou mais promotores. Se clonados sob a regulação de um promotor (di- ou multi-cistrônico), a ordem em que os genes são clonados pode afetar os níveis de expressão das proteínas. A variante de fitase também pode ser expressa como uma proteína de fusão, isto é, que o gene codificando a variante de fitase foi fundido em quadro ao gene codificando outra proteína. Esta proteína pode ser outra enzima ou um domínio funcional de outra enzima. Células hospedeiras A presente invenção também refere-se a células hospedeiras recombinantes compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da invenção, que são usadas com vantagem na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira, de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra cromossômico de auto-replicação. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira irá depender, em uma grande extensão, do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte. A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo um procarioto, ou um microorganismo não unicelular, por exemplo uma célula eucariótica, como um animal, um mamífero, um inseto, uma planta ou uma célula fungica. As células de animais preferidas são células de animais não humanos.

Em uma forma de realização preferida, a célula hospedeira é uma célula fungica, uma célula de levedura, como Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia. A célula hospedeira fungica pode ser uma célula fungica filamentosa, como uma célula de uma espécie de, mas não limitada a Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma.

As células unicelulares utilizáveis são células bacterianas como bactérias gram positivas incluindo, mas não são limitadas a célula de Bacillus, ou uma célula de Streptomyces, ou células de bactérias de ácido láctico, ou bactérias gram negativas como E. coli e Pseudomonas sp. As bactérias de ácido láctico incluem, mas não são limitadas às espécies dos gêneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus e Eníerococcus. Métodos de produção A presente invenção também refere-se a métodos para produzir uma fitase da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira sob condições que conduzem à produção de variante de fitase, e (b) recuperação da variante de fitase.

Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente apropriado para produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos dos versados na arte. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, fermentação em escala pequena ou larga escala (incluindo fermentações contínua, em batelada, em batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizados em um meio apropriado e sob condições que permitem ao polipeptídeo ser expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as composições publicadas (por exemplo em catálogos do American Type Culture Collection). Se a fitase for secretada em meio nutriente, ela pode ser recuperada diretamente do meio. Se não for secretada, ela pode ser recuperada dos lisados de células. A fitase resultante pode ser recuperada por métodos conhecidos na arte. Por exemplo, pode ser recuperada de um meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não são limitados a centrifugação, filtragem, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.

As fitases da presente invenção podem ser purificadas por vários procedimentos conhecidos na arte incluindo, mas não são limitados a cromatografia (por exemplo troca de íons, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver por exemplo Protein Purification, J-C, Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, NY 1989).

Plantas A presente invenção também refere-se a uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta que foi transformada com uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo tendo atividade fitase da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte da planta. Altemativamente, a planta ou parte da planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo melhorando o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

Em uma forma de realização particular, o polipeptídeo é marcado para os vacúolos de armazenamento de endosperma nas sementes. Este pode ser obtido por síntese do mesmo como um precursor com um peptídeo de sinal apropriado, ver Horvath et al, em PNAS, 15 de fevereiro de 2000, vol. 97, no. 4, pag. 1914-1919. A planta transgênica pode ser uma dicotiledônea (uma dicot) ou uma monocotiledônea (uma monocot) ou variantes engenheiradas das mesmas. Os exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, como grama dos campos (azul, Poa), gramíneas para forragem como festuca, lólio, relva de zonas temperadas, como Agrostis, e cereais, por exemplo trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e milho.

Os exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes como tremoços, batata, beterraba de açúcar, ervilhas, feijões e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, semente de colza, e o organismo de modo mais intimamente relacionado Arabidopsis thaliana. As plantas de baixo teor de fitase como descritas em, por exemplo, patente US 5.689.054 e patente US 6.111.168, são exemplos de plantas engenheiradas. Os exemplos de partes de plantas são a haste, calo, folhas, raiz, frutos, sementes e tubérculos. Também tecidos de plantas específicos, como cloroplasto, apoplasto, mitocóndrias, vacúolos, peroxisomas, e citoplasma são considerados como sendo uma parte da planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, é considerada como uma parte a planta.

Também está incluído no escopo a presente invenção a progênie destas plantas, partes de plantas e células de plantas. A planta transgênica ou célula de planta expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com os métodos bem conhecidos dos versados na arte. Brevemente, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de uma ou mais construções de expressão codificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro da planta e propagando a planta modificada resultante ou célula de planta em uma planta transgênica ou célula de planta.

Convenientemente, a construção de expressão é uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo da presente invenção ligado de modo operativo com seqüências regulatórias apropriadas requeridas para expressão da seqüência de ácido nucleico na planta ou parte de planta de escolha. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável utilizável para a identificação de células hospedeiras em que a construção de expressão foi integrada e seqüências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (a última depende do método de introdução de DNA a ser usado). A escolha de seqüências regulatórias, como seqüências de promotor e terminador, e opcionalmente seqüências de sinal ou trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como o polipeptídeo é desejado a ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo da processo pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica para o desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser marcado em um tecido específico ou parte de planta como sementes ou folhas. As seqüências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para expressão constitutiva, o promotor de 35S-CaMV pode ser usado (Franck et al.,l980,Cell 21: 285-294). Os promotores específicos para órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de imersão de armazenamento, como sementes, tubérculos de batata e frutos (Edwards &

Coruzzi, 1990, Ann.Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de imersão metabólica como os meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mli. Biol. 24: 863-878), um promotor específico para semente como glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al, 1998, Plant and Cell Physíology 39: 885889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al, 1998, Journal of Plant Physíology 152: 708-711), um promotor de proteína de corpo de óleo de semente (Chen et al, 1998, Plant and Cell Physíology 39: 935-941), o promotor napA de proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para semente conhecido na arte, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico para folha, como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al, 1993, Plant Physíology 102: 991-1000, o promotor do gene do vírus de cólera adenina metiltransferase (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor de gene aldP de arroz (Kagaya et al, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor indutível de ferida, como o promotor pin2 de batata (Xu et al, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573-588).

Um elemento intensificador de promotor também pode ser usado para obter maior expressão da enzima na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra descrevem o uso do primeiro íntron de gene 1 de actina de arroz para melhorar a expressão.

Ainda mais, o uso de códons pode ser otimizado para a espécie de planta em questão para melhorar a expressão (ver Horvath et al, referido acima). O gene de marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão pode ser escolhidos dentre os disponíveis na arte. A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com as técnicas convencionais bem conhecidas dos versados na arte, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et ah, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

Atualmente, a transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para um estudo ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38). No entanto, também pode ser usada par a transformar monocotiledôneas, apesar de outros métodos de transformação serem geralmente preferidos para estas plantas. Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeio de partículas (partículas de ouro ou tungstênio microscópicas revestidas com o DNA de transformação) de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Bio/technology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocotiledôneas é baseado na transformação de protoplastos como descrito por Omirulleh et al, 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.

Após transformação, os transformantes tendo incorporado nos mesmos a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas totais de acordo com os métodos bem conhecidos na arte. A presente invenção também refere-se a métodos para a produção de um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma planta transgênica ou célula de planta compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando uma variante de fitase da presente invenção sob condições que conduzem à produção de variante de fitase, e (b) recuperar a variante de fitase.

Animais como hospedeiros de expressão A presente invenção também refere-se a um animal não humano, transgênico, e produtos ou elementos dos mesmos, cujos exemplos são fluidos do corpo como leite e sangue, órgãos, came e células de animal. As técnicas para expressar proteínas, por exemplo em células de mamíferos, são conhecidas na arte, ver por exemplo Protein Expression: A Practical Approach, Higgins and Hames (eds), Oxford University Press (1999), e três outros livros nesta série com relação a transcrição de genes, processamento de RNA, e processamento pós-translacional. Em termos gerais, para preparar um animal transgênico, as células selecionadas de um animal selecionado são transformadas com uma seqüência de ácido nucleico codificando uma variante de fitase da presente invenção de modo a expressar e produzir a variante de fitase. A variante de fitase pode ser recuperada do animal, por exemplo do leite das fêmeas, ou pode ser expressada para o benefício do próprio animal, por exemplo para auxiliar na digestão do animal. Os exemplos de animais são mencionados abaixo na seção de título Ração animal e Aditivos para ração animal.

Para produzir um animal transgênico com vista na recuperação de variante de fitase do leite do animal, um gene codificando a variante de fitase pode ser inserido nos ovos fertilizados de um animal em questão, por exemplo por uso de um vetor de expressão transgene que compreende um promotor de proteína de leite apropriado, e o gene codificando a variante de fitase. O vetor de expressão de transgene é microinjetado nos ovos fertilizados, e preferivelmente permanentemente integrado no cromossomo. Uma vez que o ovo começa a crescer e a se dividir, o embrião em potencial é implantado em uma mãe de aluguel e os animais transportando o transgene são identificados. O animal resultante pode então ser multiplicado por criação convencional. A variante de fitase pode ser purificada do leite do animal, ver, por exemplo Meade H.M. et al (1999): Expression of recombinante proteins in the milk of transgenic animais. Gene expression systems: Using nature for the art of expression, J. M. Femandez e J.P. Hoeffler (ed.). Academic Press.

Na alternativa, a fim de produzir um animal não humano transgênico que transporta no genoma de suas células somáticas e/ou germinais uma seqüência de ácido nucleico incluindo uma construção de transgene heteróloga incluindo um transgene codificando a variante de fitase, o transgene pode ser ligado de modo operativo a uma primeira seqüência regulatória para expressão específica de glândula salivar da variante de fitase, como descrito em WO 2000064247.

Ração animal e aditivos para ração animal Para os presentes fins, o termo animal inclui todos os animais, incluindo seres humanos. Em uma forma de realização particular, as variantes de fitase e composições da invenção podem ser usadas como um aditivo para ração para animais não humanos. Os exemplos de animais não são ruminantes, e ruminantes, como vacas, ovelhas e cavalos. Em uma forma de realização particular, o animal é um animal não ruminante. Os animais não ruminantes incluem animais mono-gástricos, por exemplo porcos ou suínos (incluindo, mas não são limitados a leitões, porcos em crescimento e porcas), aves de criação como perus e galinhas (incluindo mas não limitados a frangos, poedeiras), bezerros jovens e peixes (incluindo mas não limitados a salmão. O termo ração ou composição de ração significa qualquer composto, preparação, mistura ou composição apropriado ou destinado para ingestão por um animal. A ração pode ser dada ao animal antes, após ou simultaneamente com a dieta. A última é preferida. A composição da invenção, quando destinada para adição à ração animal, pode ser projetada como um aditivo para ração animal. Este aditivo sempre compreende a variante de fitase em questão, preferivelmente na forma de líquido estabilizado ou composições em pó. O aditivo pode compreender outros componentes ou ingrediente de ração animal. As assim chamadas pré-misturas para ração animal são exemplos particulares destes aditivos de ração animal. As pré-misturas podem conter a(s) enzima(s) em questão, e além disso pelo menos uma vitamina e/ou pelo menos um mineral.

Conseqüentemente, em uma forma de realização particular, além dos polipeptídeos componentes, a composição da invenção pode compreender ou conter pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral de traço. Também, pelo menos, um macro mineral pode ser incluído.

Os exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo vitamina K3.

Os exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo, Ca-D-pantotenato.

Os exemplos de minerais de tração são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio e cobalto.

Os exemplos de macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

Além disso, ingredientes aditivos para ração, opcionais, são agentes colorantes, compostos de aroma, estabilizadores, enzimas adicionais, e peptídeos antimicrobianos.

Os componentes de enzima adicionais da composição da invenção incluem, pelo menos, um polipeptídeo tendo atividade xilanase, e/ou pelo menos um polipeptídeo tendo atividade endoglucanase, e/ou um polipeptídeo tendo atividade endo-1, 3(4)-beta-glucanase, e/ou pelo menos um polipeptídeo tendo atividade protease. A atividade xilanase pode ser medida usando qualquer teste, em que um substrato é empregado, que inclui endo-ligações de 1, 4-beta-D-xilosídicas em xilanos. Diferentes tipos de substratos são disponíveis para a determinação de atividade xilanase, por exemplo comprimidos de arabinoxilano reticulado com Xylazyme (de MegaZyme), ou dispersões em pó insolúveis e soluções de arabinoxilano azo-colorido.

Atividade endoglucanase pode ser determinada usando qualquer teste de endoglucanase conhecido na arte. Por exemplo, vários substratos contendo celulose ou beta-glucano podem ser aplicados. Um teste endoglucanase pode usar substrato de cevada AZCL- beta-glucano, ou preferivelmente (1) AZCL-HE-celulose ou (2) Azo-CM-celulose como um substrato. Em ambos os casos, a degradação do substrato é seguida espectrofotometricamente em OD595 (ver 0 método Megazyme para AZCL-polissacarídeos para o teste de endo-hidrolases em http://www. Megazyme. Com/booklets/AZCLPOL.pdf. A atividade endo-1, 3(4)-beta-glucanase pode ser determinada usando qualquer teste endo-1, 3(4- beta-glucanase conhecido na arte. Um substrato preferido para medidas da atividade endo-1, 3(4)- beta-glucanase é um substrato de cevada beta-glucano azo-colorido, reticulado, em que as medidas são baseadas em princípios de determinação espectrofotométricos. A atividade de protease pode ser medida usando qualquer teste, em que um substrato é empregado, que inclui ligações peptídeo relevantes para a especificidade da protease em questão. Os exemplos de substrato de protease são caseína, os substratos pNA, como Suc-AAPF-pNA (disponível por exemplo de Sigma S-7388). Outro exemplo é Protazyme AK ( caseína reticulada colorida com azurina preparada como comprimidos por Megazyme T-PRAK). exemplo 2 de WO 01/58276 descreve testes de protease apropriados. Um teste preferido é o teste de Protazyme do exemplo 2D (o pH e a temperatura devem ser ajustados para a protease em questão como geralmente descrito previamente).

Para testar atividade de xilanase, endoglucanase, beta-1, 3(4)-glucanase e protease, o pH do teste e a temperatura do teste devem ser adaptados para a enzima em questão (preferivelmente um pH próximo do pH ótimo, e uma temperatura próxima da ótima temperatura). Um pH de teste preferido de está na faixa de 2-10, preferivelmente 3-9, mais preferivelmente pH 3 ou 4 ou 5 ou 6 ou 7 ou 8, por exemplo pH 3 ou pH 7. Uma temperatura de teste preferido está na faixa de 20-80°C, preferivelmente 30-80°C, mais preferivelmente 40-75°C, ainda mais preferivelmente 40-60°C, preferivelmente 40 ou 45 ou 50°C. A atividade da enzima é definida por referência a teste cego de referência, como por exemplo um teste cego de tampão.

Exemplos de peptídeos antimicrobianos AMP's) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatin, Lactoferrina, Lactoferricina, e Ovispirina como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), e variantes ou fragmentos das mesmas para reter a atividade antimicrobiana. Outros exemplos são os polipeptídeos anti-fungos (AFP's), como os derivados de Aspergillus giganteus, e Aspergillus niger, assim como variantes e fragmentos dos mesmos que retém a atividade antifungica como descrito em WO 94/01459 e PCT/DK02/ 00289.

Em uma forma de realização particular, o aditivo de ração animal da invenção se destina a ser incluído (ou prescrito como precisando ser incluído) em dietas de animais ou ração em níveis de 0,10-12,%, ou 0,050-11,%, ou 0,0100-10,0%; mais particularmente 0,05-5,.0%; ou 0, 2-1,0% (% significando g de aditivo por 100 g de ração. Isto é assim particularmente para pré-misturas.

Conseqüentemente, as concentrações dos componentes individuais do aditivo para ração animal, por exemplo a pré-mistura, podem ser encontradas por multiplicação da concentração na ração final do mesmo componente por, respectivamente, 10-10000; 20-2000; ou 100-500 (com referência a três intervalos de inclusão percentuais).

As concentrações na ração finais de componentes importantes da ração podem refletir as exigências nutricionais do animal, que são geralmente conhecidas pelo nutricionista versado, e apresentada em publicações como as seguintes: NRC, Nutrient requirements in swine, nona ed. revisada 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, National Research Council. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; e NRC, Nutrient requirements of poultry, nona ed. revista 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, National Research Council, National Academy Press, Washington, D.C., 1994. A variante de fitase deve ser aplicada, como evidente, em ração animal em uma quantidade eficaz, isto é uma quantidade adequada para melhorar o valor nutricional da ração. Atualmente é contemplado que ela é administrada nas seguintes faixas de dosagem: 0,01-200; ou 0,01-100; ou 0,05-100; ou 0,05-50; ou 0,10-10 - todas estas faixas sendo expressas em proteína de enzima por kg de ração (ppm).

Para determinação de mg de proteína fitase por kg de ração ou aditivo de ração, a enzima é purificada da composição de ração ou do aditivo de ração, e a atividade específica da enzima purificada é determinada usando um teste relevante. A atividade fitase da composição de ração ou aditivo de ração é também determinada usando o mesmo teste, e com base nestas duas determinações, a dosagem em mg de proteína fitase por kg de ração é calculada.

Como evidente, se uma amostra for disponível da variante de fitase usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, a atividade específica é determinada desta amostra (não precisa purificar a enzima da composição de ração ou o aditivo). A composição da invenção pode ser preparada de acordo com métodos bem conhecidos na arte, por exemplo por misturação da variante de fitase com os ingredientes adicionais, se presentes.

As composições de ração animal ou dietas tem um teor relativamente elevado de proteína. Uma composição de ração animal de acordo com a invenção tem um teor de proteína bruto de 50-800, ou 75-700, ou 100-600, ou 110-500, ou 120-490 g/kg, e além disso compreende uma composição da invenção.

Além disso, ou na alternativa, (para o teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção tem um teor de energia metabolizável de 10-30, ou 11-28, ou 11-26, ou 12-25 MJ/kg; e/ou um teor de cálcio de 0,1-200, ou 0, 5-150, ou 1-100, ou 4-50 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200, ou 0, 5-150, ou 1-100, ou 1-50, ou 1-25 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100, ou 0, 5-75, ou 1-50, ou 1-30 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150, ou 0, 5-125, ou 1-80 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0, 5-50, ou 0, 5-40, ou 1-30 g/kg. A proteína bruta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator 6,25, isto é, proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25 como descrito em Animal Nutrition, 4a. ed., capítulo 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards e J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). O teor de ni pode ser determinado pelo método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Official Methods of Analysis 14a. ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC). Mas outros métodos também podem ser usados, como o assim chamado método Dumas em que a amostra é queimada em oxigênio e a quantidade de gases nitrosos formados é analisada e recalculada como nitrogênio.

Energia metabolizável pode ser calculada com base na publicação NRC Nutrient Requirements of Swine (1988) pp. 2-6, e European Table of Energy Values for Poultry Feed-Stuffs, Spelderholt Centre for poultry research and extension, 7361 DA Beekbergen, Holanda. Grafisch bedrijf Ponsen & looijenbv. Wageningen, ISBN 90-71463-12-5.

Em uma forma de realização particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína vegetal e uma fonte de proteína. Os exemplos de proteínas vegetais ou fontes de proteína são soja, ervilhas e semente de colza, de famílias de leguminosas e brassica, e cereais como cevada, milho (com), aveia, arroz, centeio, sorgo e trigo.

Em ainda outras formas de realização particulares, a composição de ração animal da invenção contém 0-80% milho, e/ou 0-80% sorgo, e/ou 0-70% trigo, e/ou 0-70% cevada, e/ou 0-30% aveias, e/ou 0-40% farinha de soja, e/ou 0-10% de farinha de peixe, e/ou 0-20% de soro de leite.

As dietas para animais podem ser, por exemplo, fabricadas como ração em massa (não pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, as rações moídas são misturadas e quantidades suficientes de vitaminas essenciais e minerais são adicionados de acordo com as especificações para a espécie em questão. A variante de fitase da invenção pode ser adicionada na forma de uma formulação de enzima sólida ou líquida, ou na forma de um aditivo para ração, como uma pré-mistura. Uma composição sólida é tipicamente adicionada antes ou durante a etapa de misturação, e uma composição líquida é tipicamente adicionada após a etapa de pelotização. A variante de fitase da invenção, quando adicionada à ração animal leva a um valor nutricional melhorado da ração, por exemplo a taxa de crescimento e/ou o ganho de peso e/ou a conversão de ração (isto é, o peso de ração ingerida com relação ao ganho de peso) do animal é / são melhorados. Estes resultados podem ser devido, por sua vez, a um ou mais dos seguintes efeitos: as porções fosfato de cátions divalentes e trivalentes de quelatos de ácido fítico como íons metal, inter alia, os íons nutricionalmente essenciais de cálcio, ferro, zinco e magnésio, assim como os minerais de traço, manganês, cobre e molibdênio. Além disso, o ácido fítico também em uma certa extensão se liga a proteínas por interação eletrostática. Em um pH abaixo do ponto isoelétrico, pi, da proteína, a proteína positivamente carregada se liga diretamente com fitase. Em um pH acima de pi, a proteína negativamente carregada se liga via íons metal a fitato. O ácido fítico e seus sais, fitatos, não são com freqüência metabolizados, porque eles não são absorvíveis do sistema gastro-intestinal, isto é, nem o fósforo do mesmo, nem os íons de metal quelatado, nem as proteínas ligadas são nutricionalmente disponíveis, conseqüentemente, porque fósforo é um elemento essencial para o crescimento de todos os organismos, alimentos e preparações de ração precisam ser suplementadas com fosfato inorgânico. Com bastante freqüência também, os íons nutricionalmente essenciais, como ferro e cálcio, devem ser suplementados. E, além disso, o valor nutricional de uma dada dieta diminui, devido à ligação de proteínas por ácido fítico.

Em formas de realização particulares, o ganho de peso é de, pelo menos, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ou pelo menos 110% do controle (sem adição de enzimas).

Em outras formas de realização particulares, a conversão da ração é, no máximo (ou não mais do que) 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91 ou no máximo 90%, como comparado com o controle (sem adição de enzima). A composição da invenção também pode ser usada in vitro, por exemplo para tratar proteínas vegetais. O termo proteínas vegetais como usado aqui refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui, pelo menos, uma proteína derivada de ou se originando de um vegetal, incluindo proteínas modificadas, e derivados de proteínas. Em formas de realização particulares, o teor de proteína das proteínas vegetais é de, pelo menos, 10, 20, 30,40, 50 ou 60% (peso/peso).

Os exemplos de proteínas vegetais ou fontes de proteínas são cereais, como cevada, trigo, centeio, aveia, milho (com), arroz e sorgo. Outros exemplos são farinha de soja, ervilhas e farinha de semente de colza de famílias leguminosas e brassica. A proteína vegetal ou fonte de proteínas é tipicamente colocada em suspensão em um solvente, por exemplo um solvente aquoso como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados devido com relação às características de variante de fitase e enzimas adicionais, se presentes. A reação enzimática é continuada até obter o resultado desejado, após o que pode ou não ser parado por inativação da enzima, por exemplo por etapa de tratamento térmico.

Em outra forma de realização particular de um processo de tratamento da invenção, as ações da enzima são sustentadas significando, por exemplo, que a composição de enzima é adicionada às proteínas vegetais ou fontes de proteína, mas a atividade de enzima é, em termos gerais, não comutada até depois quando desejado, uma vez que as condições de reação apropriadas são estabelecidas, ou uma vez que quaisquer inibidores de enzima são inativados, ou se outros meios que foram aplicados para atrasar a ação das enzimas. Método para gerar variantes de fitase Em outro aspecto, a invenção refere-se a um método para gerar uma variante de uma fitase parental, em que a variante é mais termoestável e/ou tem uma maior atividade específica do que a fitase parental, o método compreendendo: (d) submeter uma seqüência de DNA codificando a fitase parental para mutagenese aleatória, (e) expressar a seqüência de DNA mudada obtida na etapa (d) em uma célula hospedeira, e (f) triar as células hospedeiras expressando uma variante de fitase que é mais termoestável e/ou tem maior atividade específica do que a fitase parental. A etapa (d) do método acima da invenção é preferivelmente realizada usando iniciadores dopados, como descrito na parte experimental.

Em uma forma de realização preferida, o método acima inclui as seguintes etapas adicionais precedentes acima das etapas (d)-(f): (a) estabelecer uma estrutura 3D de uma fitase parental, (b) submeter a estrutura de 3D de (a) a simulações de MD em aumentadas temperaturas, (c) identificar regiões da seqüência de aminoácidos da fitase parental de elevada mobilidade (flutuações isotrópicas) e sugerindo as mesmas para mutagenese aleatória, em que pelo menos uma das regiões identificadas na etapa (c) é marcada na etapa (d). A estrutura (a) pode ser estabelecida por modelagem de homologia. Um modelo preferido é a estrutura da Figura 1.

Exemplos de temperaturas aumentadas são uma ou mais das seguintes temperaturas: 300K, 350K, 400K, 450K, 500K, e 550K.

Para este aspecto da presente invenção, a fitase parental pode ser uma fitase parental de tipo selvagem, ou variantes alélicas da mesma, ou fragmentos da mesma que tem atividade fitase, ou partes maduras da mesma, ou variantes da mesma, ou polipeptídeos geneticamente engenheirados ou sintéticos projetados com base nas mesmas. Os seguintes são exemplos de fitases parentais de tipo selvagem preferidas: fitases fungicas como fitases fungicas filamentosas, ou fitases de levedura. Um exemplo de uma fitase de levedura é Schwanniomyces occidentalis descrita em US 5830732. Os exemplos fitases fungicas filamentosas são as fitases derivadas do filo Ascomycota ou o filo Basidiomycota (uma fitase ascomicetos, ou uma fitase de basidiomicetos, respectivamente). Os exemplos de fitases ascomicetos são as derivadas de uma cepa de Aspergillus, por exemplo Aspergillus awamori PHYA (SWISSPROT P34753, Gene 133:55-62 (1993)), Aspergillus niger (ficuum) PHYA (SWISSPROT P34752, EP 420358, Gene 127:87-94 (1993)), Aspergillus awamori PHYB (SWISSPROT P34755,Gene 133:55-62 (1993)), Aspergillus niger PHYB (SWISSPROT P34754, Bioehem. Biophys.Res. Commun. 195:53-57(1993)); ou uma cepa de Emericella, por exemplo Emericella nidulans PHYB (SWISSPROT 000093, Bioehim. Biophys. Acta 1353:217-223 (1997)); ou uma cepa de Thermomyces (Humicola), por exemplo Thermomyces lanuginosus fitase descrita em W097/35017. Outros exemplos de fitases ascomicetos são descritos em EP 684313 (por exemplo derivado de cepas de Aspergillus fumigatus, Aspergillus terreus, e Myceliophthora thermophila); JP 11000164 (uma fitase derivada de uma cepa de Peniicillium.); US 6139902 (uma fitase derivada de uma cepa Aspergillus), e WO 98/13480 (fitase de Monascus anka). Exemplos de fitases de basidiomicetos são as fitases derivadas de Paxillus involutus, Trametes pubescens, Agrocybe pediades e Peniophora lycii (ver WO 98/28409).

Ainda para os fins deste aspecto da presente invenção, as fitases basidiomicetos são mais preferidas, e uma fitase parental altamente preferida é a fitase derivada de Peniophora lycii CBS 686.96 (assim como variantes alélicos, fragmentos dos mesmos, como geralmente descrito acima, assim como fitases homólogas).

Ainda para fins deste aspecto da presente invenção, as seguintes fitases e seqüências de fitases de WO 00/43503 são exemplos fitases parentais sintéticas preferidas: SEQ ID NO: 22 (consenso de basídio), SEQ ID NO: 24 (para matura de fitase de consenso-10); SEQ ID NO: 26 (fitase de consenso-10); SEQ ID NO: 27 (fitase de consenso-11), SEQ ID NO: 31 (fitase de consenso-10-termo(3)-Q50T-K91 A), SEQ ID NO: 36 (fitase de consenso-12), SEQ ID NO: 91 (fitase de consenso-3-termo(ll)-Q50T), SEQ ID NO: 93 (fitase de consenso-3-termo(l 1)-Q50T-K91A), SEQ ID NO: 95 (fitase de consenso- 10-termo(5)-Q50T); e SEQ ID NO: 97 (fitase de consenso-10-termo(5)-Q50T-K91 A), fitase de consenso-10-termo(3), fitase de consenso- 10-termo(3)-Q50T, fitase de consenso-10-termo(3)-K91 A, aminoácidos 27-467 de fitase de consenso- 10-termo(3), aminoácidos 27-467 de fitase de consenso-10-termo(3)-Q50T, aminoácidos 27-467 de fitase de consenso-10-termo(3)-K91 A.

Outros exemplos de fitases parentais preferidas são: As variantes de uma fitasse de Aspergillus fumigatus descrita em EP 897010, a fitase fungica de consenso e suas variantes descritas em EP 897985, as variantes de fitases de Aspergillus fumigatus e a fitase designada fitase de consenso-7, assim como variantes de fitase de consenso-1 descritas em WO 00/43503.

Um método de triagem preferido para variantes de fitases termoestáveis é a triagem primária descrita no exemplo 1: cultivar as colônias candidatas (por exemplo uma biblioteca de levedura) em um meio sólido apropriado (por exemplo placas de SC-glicose), durante um tempo apropriado (por exemplo durante 3 dias a 30 °C), replicar as placas em novas placas com filtros de nitrato, incubar durante um tempo apropriado (por exemplo a 30 °C durante 1 dias), transferir os filtros para placas de Na-fitato pré-aquecidas em um pH apropriado (por exemplo pH 5, 5 e 53 °C), incubar em uma temperatura elevada durante um tempo apropriado (por exemplo a 53 °C durante a noite), remover os filtros, e despejar em uma solução contendo íons Ca (por exemplo 0,5 M CaCl2 solução), elegendo as colônias com maiores zonas de depuração do que a fitase parental.

Outro método de triagem preferido é a triagem secundária descrita no exemplo 1 (cultivo submerso, estabelecendo uma atividade de fitase versus perfil de temperatura nos sobrenadantes, selecionando candidatos realizando melhor do que a fitase parental ( maior atividade maior temperatura, o que é melhor). Para ambos os testes, temperaturas alternativas são as indicadas acima na seção de termoestabilidade. Os dois métodos podem ser usados em combinação / sucessão como descrito no exemplo 1.

Os métodos de mutagenese aleatória preferidos são dopagem e oligo embaralhamento salpicado.

Em uma forma de realização ainda mais preferida do método acima para gerar variantes de fitase, o método é tomado iterativo, significando que, em uma primeira etapa, a fitase parental é uma das fitases acima mencionadas, por exemplo a fitase Peniophora, em uma segunda etapa a fitase parental é a variante X mais termoestável da mesma, em uma terceira etapa a fitase parental é outra variante Y de ainda maior termoestabilidade do que X e assim em diante.

Um método de triagem preferido para melhorar atividade específica é o método de triagem primário referido no exemplo 1. Outro método de triagem preferido para melhorada atividade específica é o método de triagem secundário referido no exemplo 1. A invenção também refere-se a um método para produzir uma variante de fitase obtenível ou obtida pelo método de geração de variantes de fitase descrito acima, compreendendo (a) cultivar a célula hospedeira para produzir um sobrenadante compreendendo a variante e (b) recuperar a variante. A presente invenção é ainda descrita no seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitando o escopo da invenção.

Formas de realização particulares Um aspecto da presente invenção é a transferência de mutações selecionadas (positivas, ou seja, por exemplo, melhorada termoestabilidade e/ou atividade específica) na estrutura dorsal de fitase Peniophora via um alinhamento de homologia para outras estruturas, preferivelmente estruturas homólogas. Este conceito foi descrito como a seguir: em cada uma das reivindicações e formas de realização particulares adicionais como as listadas abaixo, substituindo "fitase parental" por "fitase derivada de Peniophora lycii CBS 686.96", e adicionando a seguinte reivindicação: uma variante de uma fitase que é homóloga à fitase derivada de Peniophora lycii CBS 686.96, a variante compreendendo uma substituição em, pelo menos, uma posição correspondendo à reivindicada e listada nas formas de realização adicionais, a posição correspondente sendo deduzida por alinhamento da fitase homóloga para SEQ ID NO: 2, como descrito acima. Várias formas de realização particulares da variante de fitase da invenção são reivindicadas, e formas de realização particulares adicionais são especificadas abaixo. A invenção também refere-se aos seguintes aspectos das formas de realização abaixo: seqüências de ácido nucleico isoladas, construções de ácido nucleico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras recombinantes; métodos para produção; plantas transgênicas, ou partes de plantas, animais não humanos transgênicos, ou produtos, ou elementos dos mesmos, composições como aditivos para ração, e ração animal, métodos e processos de uso, e usos (como aqui reivindicado). Uma composição compreendendo pelo menos uma variante de fitase de qualquer uma das reivindicações ou qualquer uma das formas de realização acima é específica aqui incluída. A ração animal preferivelmente compreende pelo menos uma proteína vegetal ou fonte de proteína.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 26; 28; 29; 30; 31; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 55; 56; 57; 58; 59; 60; 61; 62; 63; 64; 65; 66; 67; 68; 69; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; 110; 111; 112; 113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 123; 124; 125; 126; 135; 136; 137; 138; 139; 140; 141; 142; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 169; 170; 171; 172; 173; 174; 175; 176; 177; 178; 179; 180; 181; 182; 183; 184; 185; 186; 187; 188; 189; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 196; 197; 198; 199; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211, 212; 213; 214; 215; 216; 217; 218; 219; 220; 221; 222; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 248; 249; 250; 251; 252; 253; 254; 255; 256; 257; 258; 259; 260; 261; 262; 263; 264; 265; 266; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 321; 322; 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 332; 333;. 334; 335; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350; 384; 385; 386; 387; 388; 389; 390; 391; 392; 393; 394; 395; 396; 397; 398; 407; 408; 409; 410; 411; 412; 419; 420; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição que a variante não é uma variante da fitase Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: G268; Y28N; D29S; F31Y; E42D,K,A; T45R; V46I; W59F; S62D; A64K; R65Q,E,G,A; S66T; R67A,I,Q,K; Q68Y,V,I; K74R,A; A99N; D100S; L102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Q111E,N; T112A, 8; M116F,I,L; A135S; D137Y; Q1380, S,G; D142A; ()154fH; S155N; G156P; E157Q, 8; E169S; E170A,P; G171A; ()171aS; T174P,A; N177S; N178S,T; M179T,V,L; N182A,V; V184G; D185E; ()185eT; G1868,A; D187R,K, S; ()187aV,T; E188Q,S,A,V; S189E; V195L; N199A,P; L204N; A207D,H; S216T; D217E; L219Y,T; T220Y,N; L221F; M222L; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; S249Q,A; E251D; Y254A,L,G; D255N; D257K; Y259F; T262H; P264A; G286R,H; Q287K,S; A288P; T321Q,S,G; M322I; V321I; P324A; A327S,F,I,L; F332Y; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D3508,V; G388A; V393R; E395K,T; e L396R.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 26; 28-31; 37-48; 55-69; 73-83; 91-119; 123-126; 135-142; 152-163; 169-199; 204-222; 229-238; 248-266; 284289; -300-308; 321-335; 343-350; 384-398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e em que a variante na posição 26; 28; 29; 31; 42; 45; 46; 59; 62; 64; 65; 66; 67; 68; 74; 99; 100; 102; 103; 104; 107; 109; 110; 111; 112; 116; 135; 137; 138; 142; 154f; 155; 156; 157; 169; 170; 171; 171a; 174; 177; 178; 179; 182; 184; 185; 185e; 186; 187; 187a; 188; 189; 195; 199; 204; 207; 216; 217; 219; 220; 221; 222; 230; 235e; 248; 249; 251; 254; 255; 257; 259; 262; 264; 286; 287; 288; 321 322; 323; 324; 327; 332; 333; 344; 346; 348; 349; 350; 388; 393; 395; e 396 é selecionada dentre o grupo consistindo de: 26A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q5R,T,V,W,Y; 28A,C,D, E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W; 29A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y; 31 A,C,D, E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W; 42C,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R, S,T,V,W,V; 45A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q, 8,V,W,V; 46A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W, Y; 59A,C,D, E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T ,V ,Y; 62A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y; 64C,D, E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T, V, W, Y; 65C,D, F,H,I,K,L,M,N,P,S,T,V,W,Y; 66A,C,D, E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W,Y; 67C,D, E,F,G,H,L,M,N,P,S,T,V,W,Y; 68A,C,D, E,F,G,H,K,L,M,N,P,R,S,T,W; 74C,D5E,F,G,H,I,L5M,N,P,Q,S,T,V, W,V;

99C5D5E,F,G,H,I5K,L,M,P,Q5R,S, T, V, W, Y 100A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V, W, Y; 102A,C,D,E,F,G,H5I,K,M,N,P,Q,R,S5T,W,Y; 103A,C,D,F,G,H> Ι,Κ,Ε,Μ,Ν,0,^8,Τ,ν,Ψ,Υ; 104A,C,D,E,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V, W, Y; 107 A,C,D,E,F3G,H,I,K,L,M,P,R,S,V, W, Y; 109A5C,D,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W, Y; II OA,C5D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, W,Y; III A3C,D,F3G,H,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W,Y; 11 2C,D3E3F3G3H3I3K3L3M3N3P3Q3R3 V, W, Y; 116A3C3D,E3G3H3K3N3P3Q3R3S3T3V, W,Y; 135C3D, E,F ,G3H3I3K3L3M,N ,P3Q3R3T3 V, W, Y; 137A3C3E3F3G3H3I3K3L3M3N3P3Q,R,S3T3V3W; 1 38A3C3E3F3H3I3K3L3M3N3P,R3T3V3W3 Y; 142C3E3F3G3H3I3K3L3M3N3P3Q3R3S3T3V3W, Y; 154fA3C3D3E3F3G3I,K3L,M3N3P3Q3R3S3T3V3W3 Y; 155A3C3D3E,F3G3H3I3K3L3M3P3Q3R,T3V3W3 Y; 156A,C3D3E3F3H3I3K3L3M3N3Q3R3S3T3V3W3 Y; 157 A3C3D3F,G3H3 I3K3L3M3N3P,R3T3 V3 W,V; 169A3C3D, F3G3H3I3K3L3M3N3P3Q3R,T,V3 W, Y; 170C,D3 F3G,H3I3K3L3M3N3Q3R3S3T3V3W3Y ; 171 C,D, E3F3H3I3K3L3M3N3P,Q3R3S3T3 V, W, Y; 171 aA,C,D3 E3F3G,H3I3K3L3M3N3P3Q3R3T3V3W3Y; 174C3D, E3F,G3H3I3K3L3M3N3Q3R3S3V,W3Y; 177A,C,O, E3F3G3H3I3K3L3M3P3Q3R3T, V, W, Y; 178A,C,D3 E3F3G3H3I3K3L,M3P3Q3R3V3 W, Y; 179A3C3D, E3F3G,H3I3K,N3P3Q3R3S3W3Y; 182C3D3 E3F3G3H3I3K3L3M,P3Q3R3S3T3 W,Y; 184A3C,D3E, F3H3I3K3L3M3N,P3Q3R,S3T3 W3Y; 185A3C3F3G3H3I3K3L,M3N3P3Q3R3S3T3V3W3Y; 185eA,C3D3E, F3G3H3I3K3L3M3N3P3Q3R3S3V,W3Y; 186C,D3E, F3H3I3K3L3M3N3P3Q3R3T,V3W,Y; 187 A3C3E3F,G3H3I; t3M3N,P,Q3T3V3W3Y; 187aA3C3D3E3F3G,H3I3K3L3M3N3P3Q3R3S3 W,Y; 188C3D3F3G3H3I3K,L3M3N3P,R3T3 W3V; 1 89A3C,D3F3G3H3I3K3L3M3N3P3Q3R3T3V,W3Y; 195 A3C3D,E, F3G,H3I3K3M3N3P3Q,R3S3T3W3Y; 199C,D3E3F3G3H3I3K3L3M3Q3R3S3T3V3W,Y; 204A3C3D3E3F,G3H3I3K3M3P3Q3R3S3T3V3W3Y; 207G3E,F3G3I3K,L3M3N3P3Q3R3S3T3V3W3V; 216A5C,D,E,F,G,H)I5K5L,M,N,P,Q,R,V, W, Y; 217A,C,F,G,H, I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W,Y; 219A,C,D, EvF,G,FIJ,K,M,N,P,Q,R,S, V, W; 220A,C,D, E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,V,W; 221 A,C,D, E,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 222A,C,D, E,F ,G,FI,I,K,N,P,Q,R5S,T,V, W,V; 230A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W,V; 235eA,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,V,W, Y; 248A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 249C,D, E,F,G,H,I,K,L,M,N,P5R,T,V, W,V; 251 A,C,F,G,HJ3K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; 254CJD, E,F,H,I,K,M,N,P,Q,"R,S,T,V, W; 255A,C,E,F,G,H,J,K,L,M,P,Q,R,S,T,V, W,V; 257A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 259A,C,D, E,G,HJ,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W; 262A,C,D, E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y; 264C,D, E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y; 286A,C,D,E,F/,K,L,M,N,P,Q,S, T,V,W,V; 287 A,C,D,E,F,G,H,',L,M,N,P,R, T,V,W, Y; 288C,D,E,F,G,H,I,K,L5M,N,Q3R,S,T,V,W,Y; 321A,C,D, E,F,H,I,K,L,M,N,P,R,V,W,V; 322A,C,D, E,F,G,H,K,L,N,P,Q,R,S J,V,W, Y; 323A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T, W, Y; 324C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,V; 327C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y; 332A,C,0,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W; 333A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,V; 344A,C,0,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,V; 346A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,S,T, V,W,V; 348A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, Y; 349C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,T,W,V; 350A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,W,V; 388C,D, E,F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, Y; 393A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 395A,C,D,F.,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y; and 3 96A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,S,T, V, W, Y;

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 28-31; 37-48; 55-69; 91-119; 123-126; 152-163; 169-199; 204-222; 229-238; 248-266; 284-289; 321-335; 343-350; 384-398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de V28N; D29S; F31Y; E42D,K,A; T45R; V46I; W59F; S62D; A64K; R65Q,E,G,A; S66T; R67A,I,Q,K; Q68Y,V,I; A99N; D100S; L 102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Q111E,N; T112A,S; M116F,I,L; ()154fH; S155N; G156P; E157Q,S; E169S; E170A,P; G171A; ()171aS; T174P,A; N177S; N178S,T; M179T,V,L; N182A,V; V184G; D185E; ()185eT; G186S,A; D187R,K,S; ()187aV,T; E188Q,S,A,V; S189E; V195L; N199A,P; L204N; A2070,H; S216T; D217E; L219Y,T; T220Y,N; L221 F; M222L; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; S249Q,A; E251 D; Y254A,L,G; D255N; 0257K; Y259F; T262H; P264A; G286R,H; Q287K,S; A288P; T321Q,S,G; M322I; V321I; P324A; A327S,F,I,L; F332V; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D350S,V; G388A; V393R; E395K,T; e L396R.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 45; 63; 69; 92; 93; 95; 97; 98; 99; 102; 110; 114; 118; 125; 152; 156; 157; 160; 163; 183; 185; 187; 190; 191; 194; 199; 205; 210; 218; 222; 234; 248; 286; 321; 323; 324; 328; 330; 334; 343; 344; 345; 347; 349; 350; 384; 395; 398; 409; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; T45R; A99N; L 102V; H110S,V; G156P; E157Q,S; D185E; ()185eT; D187R,K,S; ()187aV,T; N199A,P; M222L; V248R,I; G286R,H; T321 Q,S,G; V321I; P324A; E344R; V349L,A,S; D350S,V; e Ε395Κ/Γ.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 45; 63; 69; 92; 93; 95; 97; 98; 99; 102; 110; 114; 118; 125; 152; 156; 157; 160; 163; 183; 185; 187; 190; 191; 194; 199; 205; 210; 218; 222; 234; 248; 286; 321; 323; 324; 328; 330; 334; 343; 344; 345; 347; 349; 350; 384; 395; 398; 409; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) em que uma variante na posição 29; 45; 99; 102; 110; 156; 157; 185; 185e; 187; 187a; 199; 222; 248; 286; 321; 323; 324; 344; 349; 350; e 395 é selecionada dentre o grupo consistindo de: 29A,C,E,F,G,FI,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,V; 45A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,V,W, Y; 99C,D,E,F,G,H, I,K,L,M,P,Q,R, S,T,V,W,Y; 1 02A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W, Y; 110A,C,O,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, W,Y; 156A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T, V, W, Y; 157 A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,W,V; 185 A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W, Y; 185eA,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R, 8,V,W,Y; 187 A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,T,V,W, Y; 187aA,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R, 8,W, Y; 199C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V, W, Y; 222A,C,D, E,F,G,H, I,K,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; 248A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,V; 286A,C,D,E,F,I,K,L,M,N,P,Q, S,T,V,W,V; 321A,C5D, E,F,H,I,K,L,M,N,P,R, V, W, Y; 323A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R, S,T,W, Y; 324CsD,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,V; 344A,C,0,F,G,H, I,K,L5M5N,P,Q,S,T,V,W, Y; 349C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,T,W,V; 3 5 OA,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, W,V; e 395A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R, S,V,W, Y. A variante das reivindicações ou de qualquer uma das formas de realização acima, que compreende pelo menos uma das substituições selecionadas dentre o grupo consistindo de: 20R; 29N,C,T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931; 95R,H,M,N,S,T; 97V; 98G; 990; 1021; 110Y,R,W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C,R; 157K; 160R; 163P; 183K,A,W,G; 185A,H,N,P,K; 187G; 1905,K; 191L,R, 8; 194R; 1998; 2058; 210G; 218T; 2221; 234K, 8; 248A,C,D,E,G,H, S,T; 2868; 321 A; 323A; 324S,L; 328T; 330R; 334E,D,G; 343N; 344A,V,S; 345D,H; 347Q,P; 349M,K; 0350T,M,I,L; 384S,A; 395G; 398T; 4098; 421 R,S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291; e 430M. A variante das reivindicações ou qualquer uma das formas de realização acima e abaixo, em que a fitase parental i) tem uma seqüência de aminoácido que tem um grau de identidade para a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 de pelo menos cerca de 60%, preferivelmente pelo menos 60%; ii) é codificada por uma seqüência de ácido nucleico que hibridiza sob condições de baixa estringência com nucleotídeos 49-1320 de SEQ ID NO: 1 ou o filamento complementar do mesmo; iii) é uma fitase fungica, preferivelmente uma fitase de basidiomicetos ou uma fitase mista de ascomiceto/ basidiomiceto, como fitase Peniophora, por exemplo uma fitase derivada de Peniophora lycii, por exemplo Peniophora lycii CBS 686.96. A variante de fitase das reivindicações ou qualquer uma das formas de realização acima e abaixo, que é termoestável e/ou tem uma alta atividade específica, preferivelmente mais termoestável e/ou de uma maior atividade específica, como comparada com a fitase parental.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de 20; 29; 37-48; 63; 69; 73-83; 91-119; 123-126; 154-157; 163; 183; 187; 194; 199; 204-218; 229-238; 248; 284-289; 300-308; 323-335; 343-350; 384; 395; 398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; e (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; E42D,K,A; T45R; V46I; K74R,A; A99N; D100S; L 102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Qll 1 E,N; T112A,S; M116F,I,L; S155N; Q154ÍR; G156P; E157Q,S; D187R,K,S; ()187aV,T; N199A,P; L204N; A207D,H; S216T; D217E; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; G286R,H; Q287K,S; A288P; V321I; P324A; A327S,F,I,L; F332Y; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D350K,A; e E395K,T.

Uma variante de uma fitase parental compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 63; 69; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; 110; 111; 112; 113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 123; 124; 125; 126; 154; 155; 156; 157; 163; 183; 187; 194; 199; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211,.212; 213; 214; 215; 216; 217; 218; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 248; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350; 384; 395; 398; 407; 408; 409; 410; 411; 412; 419; 420; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430;

em que (a) a variante tem atividade fitase; e (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; E42D,K,A; T45R; V46I; K74R,A; A99N; D1005; L102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Q111E,N; T112A,S; M116F,I,L; S155N; ()154fH; G156P; E157Q,S; D187R,K,S; ()187aV,T; N199A,P; L204N; A207D,H; S216T; D217E; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; G286R,H; Q287K,S; A288P; V321I; P324A; A327S,F,I,L; F332Y; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D350K,A; e E395K,T.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 29; 37-48; 63; 69; 73-83; 91-119; 123-126; 154-157; 163; 183; 187; 194; 199; 204-218; 229-238; 248; 284-289; 300-308; 323-335; 343-350; 384; 395; 398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; e (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e em que a variante na posição 29, 42, 45, 46, 74, 99, 100, 102, 103, 104, 107, 109, 110, 111, 112, 116, 155, 154, 156, 157, 187, 187a, 199, 204, 207, 216, 217, 230, 235e, 248, 286, 287, 288, 323, 324, 327, 332, 333, 344, 346, 348, 349, 350, 395 é selecionada dentre o grupo consistindo de: 29A,C,E,F,G,H, I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y; 42C,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; 45A,C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,V, W,V; 46A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,V; 74C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,V; 99C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W, Y; 100A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, V, W, V; 1 02A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W, Y; 103A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,V; 1 04A,C,D,E,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V;. 107A, C,0,E,F,G,H, I,K,L,M,P,R,S,V,W,V; 1 09A,C,O,E,F,G,H,I,K,L,N,P,Q,R,T,V,W, Y; 110A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, W, Y; 111 A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W,Y; 112C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,V, W,Y; 116A,C,0,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T, V,W,Y; 155C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W, Y; 154fA,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, Y; 156A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,V; 157 A,C,0,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V5W,V; 187A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,T,V,W,Y; 187aA,C,0,E,F',G5H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,V; 199C,D,E,F,G,H,I^L,M,Q,R,S,T,V,W,Y; 204A,C,O,E,F,G,H,I,K,M,P,Q,R,S,T,V,W,V; 207C,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; 216A,C,03E,F,G,H,I5K,L,M,N,P,Q,R, V, W, V; 217A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W, Y; 230A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W,V; 235eA, C,0,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,S,T,Y,W,Y; 248A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 286A,C,D,E,F, I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,V; 287 A,C,0,E,F,G,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W, Y; 288C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, Y; 323A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y; 324C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,V; 327C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y; 332A; ê,D,E,G,H,! ,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W; 333A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W, Y; 344A,C,D,F,G,H, I,K,L,M,N,P5Q,S,T,V5W, Y; 346Α50,Ο,Ε5Ρ5αΗ,Ι,Κ,Ε,Μ,Ν5Ρ58,Τ,ν,Ψ,Υ; 348A,C,0,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,Y; 349C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,T,W,V; 350C,E,F,G,H, I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; and 395A,C,D,F,G,H}I,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,V.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 45; 63; 69; 95; 97; 98; 99; 102; 114; 118; 125; 163; 183; 187; 194; 199; 205; 218; 234; 248; 323; 324; 328; 330; 334; 343; 344;

345; 347; 349; 350; 384; 395; 398; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; T45R; A99N; L102V; D187R,K,S; ()187aV,T; N199A,P; V248RJ; V321I; P324A; E344R; V349L,A,S; D350K,A; e Ε395Κ/Γ.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 29; 37-48; 63; 69; 73-83; 91-119; 123-126; 154-157; 163; 183; 187; 194; 199; 204-218; 229-238; 248; 284-289; 300-308; 323-335; 343-350; 384; 395; 398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e em que a variante na posição 29,45, 99,102, 187, 187a, 199, 248, 323, 324, 344, 349, 350, e 395 é selecionada dentre o grupo consistindo de: 29A,C,E, F,G,H,I,K,1,M,N,P,Q,R,T,V,W,V; 45A,C,D,E,F,G,H,I,K,1,M,N,P,Q,S,V, W,Y; 99C,D,E,F,G,H, I,K,1,M,P,Q,R,S,T,V,W,V; 1 02A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W,V; 187 A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,T,V,W,Y; 187aA,C,D,E,F,G,H,I,K,l,M,N,P,Q,R,S,W,Y; 199C,D,E,F,G,H,I,K,1,M,Q,R,S,T,V, W ,V; 248A,C,D,E,F,G,H,K,1,M,N,P,Q,S,T,W,Y; 323A,C, D,E,F,G,H,K,1,M,N,P ,Q,R,S,T, W, V; 324C,0,E,F,G,H,I,K,1,M,N,Q,R,S,T,V,W, Y; 344A,C,D,F,G,H, I,K,1,M,N,P,Q,S,T,V, W,V; 349C,D,E,F,G,H, I,K,M,N,P,Q,R,T,W,V; 350C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; e 395A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y. A variante de qualquer uma das formas de realização acima que compreende pelo menos uma das substituições selecionada dentre o grupo consistindo de: 20R; 29N,C,T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931; 95R; 97V; 98G; 990; 1021; 110Y; 114A; 118A; 1250; 163P; 183K; 187G; 194R; 1995; 205S; 218T; 234K,S; 248A; 323A; 324S,1; 328T; 330R; 334E,0,G; 343N; 344A,V,S; 3450,H; 347Q,P; V349M; 0350V,T; 384S,A; 395G; 398T; 409S; 421R,S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291; e 430M. A variante de qualquer uma das formas de realização acima cuja variante compreende uma substituição ou uma combinação de substituições selecionada dentre o seguinte grupo de substituições e combinações de substituições: 20R+95R+97V+98G; 29N+1021; 29N+118A; 29N+234S; 29N+324S; 29N+163P+324S; 29N+163P+324S+395G; 29S; 29S + 205S; 29S+1250+324A; 29S+324A+350V; 29S+1250+324A+3 5 0V; 29S+125D+324A+234K+330R; 29S+125D+32 4A+330R+395G; 29S+99D+125D+324A+334E+350V; 29S+1250+324A+218T+344S+35OV; 29S+1250+324A+234K+330R+395G; 29S+324A+125D+350V+63N+218T+334E+183K+421S; 29S+324A+1250+350V+45A+69A+99D+110Y+334E+344S; 29T+3241;

45A+350V+421 R+422R+423N+424S+425L +426E+427G+428R+429I+430M; 69A+334E; 99D+398T; 114A+18 7G+194R+324S; 114A+187G+194R+324S; 218T+334G; 323A+324S; 324S; 324S+328T; 324S+395G; 324S+345D+347Q; 330R; 334E+344A; 3340+343N+344V; 345H+347P+350V; e 350V.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 29; 37-40; 45; 47- 48; 63; 69; 73-83; 91-98; 99; 102; 103; 110; 113-119; 123-125; 154-157; 163; 183; 187; 194; 199; 204-218; 229-238; 248; 284-289; 300-308; 323-324; 328-335; 343-347; 349; 350; 384; 395; 398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; T45R; K74R,A; A99N; L 102V; P103E; HllOS.V; M116F,I,L; S155N; ()154fH; G156P; E157Q,S; D187R,K,S; ()187aV,T; N199A,P; L204N; A2070,H; S216T; D217E; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; G286R,H; Q287K,S; A288P; V321I; P324A; F332Y; N333P; E344R; R346P; V349L,A,S; D350K,A; e E395K,T.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 29; 37-48; 63; 69; 7383; 91-119; 123-126; 152-163; 183-199; 204-218; 229-238; 248; 284-289; 300-308; 323335; 343-350; 384; 395; 398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; E42D,K,A; T45R; V46I; K74R,A; A99N; D1005; L102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Q111E,N; T112A,S; M116F,I,L; ()154fH; S155N; G156P; E157Q,S; V184G; D185E; ()185eT; G186S,A; D187R,K,S; ()187aY,T; E188Q,S,A,V; S189E; V195L; N199A,P; L204N; A2070,H; S216T; D217E; L230V; 0235eE.Q; V248R,I; G286R,H; Q287K,S; A288P; V321I; P324A; A327S},I,L; F332Y; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D350S,V; e E395K,T.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 37; 38; 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45; 46; 47; 48; 63; 69; 73; 74; 75; 76; 77; 78; 79; 80; 81; 82; 83; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99; 100; 101; 102; 103; 104; 105; 106; 107; 108; 109; 110; 111; 112; 113; 114; 115; 116; 117; 118; 119; 123; 124; 125; 126; 152; 153; 154; 155; 156; 157; 158; 159; 160; 161; 162; 163; 183; 184; 185; 186; 187; 188; 189; 190; 191; 192; 193; 194; 195; 196; 197; 198; 199; 204; 205; 206; 207; 208; 209; 210; 211, 212; 213; 214; 215; 216; 217; 218; 229; 230; 231; 232; 233; 234; 235; 236; 237; 238; 248; 284; 285; 286; 287; 288; 289; 300; 301; 302; 303; 304; 305; 306; 307; 308; 323; 324; 325; 326; 327; 328; 329; 330; 331; 332; 333; 334; 335; 343; 344; 345; 346; 347; 348; 349; 350; 384; 395; 398; 407; 408; 409; 410; 411; 412; 419; 420; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; E42D,K,A; T 45R; V46I; K74R,A; A99N; D1005; L102V; P103E; F104L; N107T,Q; S109M; H110S,V; Q111E,N; T112A,S; M116F,I,L; ()154fH; S155N; G156P; E157Q,S; V184G; D185E; ()185eT; G186S,A; D187R,K,S; ()187aV,T; E188QSAV; S189E; V195L; N199A,P; L204N; A207D,H; S216T; D217E; L230V; ()235eE,Q; V248R,I; G286R,H; Q287K,S; A288P; V321I; P324A; A327S,F,I,L; F332Y; N333P; E344R; R346P; W348F; V349L,A,S; D350S,V; e E395K,T.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição de pelo menos uma região selecionada dentre o grupo de regiões consistindo de: 20; 29; 37-48; 63; 69; 7383; 91-119; 123-126; 152-163; 183-199; 204-218; 229-238; 248; 284-289; 300-308; 323335; 343-350; 384; 395; 398; 407-412; e 419-430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e em que a variante na posição 29, 42, 45, 46, 74, 99, 100, 102, 103, 104, 107, 109, 110, 111, 112,116,154,155,156,157,184,185, 185e, 186, 187, 187a, 188, 189, 195, 199, 204, 207, 216, 217, 230, 235e, 248, 286, 287, 288, 323, 324, 327, 332, 333, 344, 346, 348, 349, 350, 395 é selecionada dentre o grupo consistindo de: 29A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,V; 42C,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,V; 45 A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,V, W ,V; 46A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y; 74C,D,E,F,G,H, I,K,L,M,N,P,a,S,T,V,W,V; 99C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T, V, W ,V; 100A,C,E, F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V, W,V; 1 02A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W, Y; 103 A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, W,V; 1 04A,C,D,E,G,FI,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, Y; t07A,C,O,E,F,G,H,I:K,L,M,P,R,S,V,W,V; 1 09A,C,D,E,F,G,FI,I,K,L,N,P,Q,R,T,V, W, V; 110A,C,O,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,\V,Y; 111 A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,P,R,S,T,V,W,Y; 112C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,V,W,Y; 11 6A,C,D,E,G,H,K,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 154fA,C,0,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 155A,C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,T,V,W,V; 156A,C,0,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,V; 157 A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,W,V; 184A,C,D,E, F,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,V; 185A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, Y; 185eA,C,0,E, F,G,F1,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y; 186C,0,E, F,FI,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, V, W, Y; 187A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,T,V,W,Y; 187aA,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,W,V; 188C,D, F,G,H. I,K,L,M,N,P,R,T,W, Y; 189A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,V; 195 A,C,D,E, F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y; 199C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y; 204A,C,D,E, F,G,F1,I,K,M,P,Q,R,S,T,V,W,Y; 207C,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V ,W,Y; 216A,C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R, V, w,Y; 217 A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V,W, Y; 230A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y; 235eA,C,0,F,G,H, I,K,L,M,N,P,R,S,T,V, W,Y; 248A,C,0,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,V; 286A,C,0,E,F,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y; 287A,C,0,E,F,G,H,I,L,M,N,P,R,T,V,W,V; 288C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W, Y; 323A,C,0,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y; 324C,0,E,F,G,H, I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V, W,Y; 327C,D,E,G,H,K,M,N,P,Q,R,T,V,W,Y; 332A,C,0,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,V, W; 333A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,V; 344A,C,D,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V, W,Y; 346A,C,0,E,F,G,FI,I,K,L,M,N,Q,S,T,V,W,V; 348A,C,D,E,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T, V,Y; 349C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,T,W,V; 350A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,W,Y; e 395A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,V.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 45; 63; 69; 92; 93; 95; 97; 98; 99; 102; 110; 114; 118; 125; 152; 156; 157; 160; 163; 183; 185; 187; 194; 199; 205; 218; 234; 248; 286; 323; 324; 328; 330; 334; 343; 344; 345; 347; 349; 350; 384; 395; 398; 409; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQ ID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ Π) NO: 2 de pelo menos 75%; e (d) com a condição de que a variante não é uma variante de Peniophora lycii CBS 686.96 selecionada dentre o grupo consistindo de: D29S; T 45R; A99N; L 1 02V; H 11 OS, V; G 156P; E157Q,S; D185E; ()185eT; D187R,K,S; ()187aV,T; N199A,P; V248R,I; G286R,H; V321I; P324A; E344R; V349L,A,S; D350S,V; e E395K,T.

Uma variante de uma fitase parental, compreendendo uma substituição em pelo menos uma posição selecionada dentre o grupo consistindo de: 20; 29; 45; 63; 69; 92; 93; 95; 97; 98; 99; 102; 110; 114; 118; 125; 152; 156; 157; 160; 163; 183; 185; 187; 194; 199; 205; 218; 234; 248; 286; 323; 324; 328; 330; 334; 343; 344; 345; 347; 349; 350; 384; 395; 398; 409; 421; 422; 423; 424; 425; 426; 427; 428; 429; 430; em que (a) a variante tem atividade fitase; (b) cada posição corresponde a uma posição de SEQID NO: 2; e (c) a variante tem uma porcentagem de identidade para SEQ ID NO: 2 de pelo menos 75%; e em que a variante na posição 29, 45, 99,102, 110; 156; 157; 185; 185e; 187, 187a, 199, 248, 286; 323, 324, 344, 349, 350, e 395 é selecionada dentre o grupo consistindo de: 29A,C,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,V,W,V; 45A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,S,V,W, Y; 99C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,P,Q,R,S,T,V,W,V; 1 02A,C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,S,T,W,V; 110A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,R,T, W, Y; 156A,C,D,E,F,H,I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y; 157 A,C,0,F,G,H,I,K,L,M,N,P,R,T,V,W,V; 185 A,C,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,T, V, W, Y; 185eA,C,0,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S,V,W, Y, 187A,C,E,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,T,V,W,Y; 187aA,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,S, W, Y; 199C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,Q,R,S,T,V,W,Y; 248A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,S,T,W,V; 286A,C,D,E,F,G,I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,Y; 323A,C,D,E,F,G,H,K,L,M,N,P,Q,R,S,T,W,Y; 324C,D,E,F,G,H, I,K,L,M,N,Q,R,S,T,V,W,Y; 344A,C,D,F,G,H, I,K,L,M,N,P,Q,S,T,V,W,V; 349C,D,E,F,G,H,I,K,M,N,P,Q,R,T,W, Y; 350A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,P,Q,R,T,W,Y; e 395A,C,D,F,G,H,I,L,M,N,P,Q,R,S,V,W,Y. A variante de qualquer uma das formas de realização acima, que compreende pelo menos uma das substituições selecionadas dentre o grupo consistindo de: 20R; 29N,C,T; 45A; 63N; 69A; 92L; 931; 95R,H,M,N,S,T; 97V; 98G; 99D; 1021; 110Y,R,W; 114A; 118A; 125D; 152A; 156C,R; 160R; 163P; 183K,A,W,G; 185A,H,N,P; 187G; 191L; 194R; 1995; 205S; 218T; 234K,S; 248A,C,D,E,G,H,S; 286S; 323A; 324S,L; 328T; 330R; 334E,D,G; 343N; 344A,V,S; 345D,H; 347Q,P; V349M; D350T; 384S,A; 395G; 398T; 409S; 421 R,S; 422R; 423N; 424S; 425L; 426E; 427G; 428R; 4291; e 430M. A variante de qualquer uma das formas de realização acima, que compreende uma substituição ou uma combinação de substituições selecionadas dentre o grupo consistindo de substituições e combinações de substituições: 20R+95R+97V+98G; 29N+1021; 29N+118 A;

29N+163P+324S; 29N+163P+324S+395G; 29N+234S; 29N+324S; 29S; 29S+45A+69A+99D+110Y+125D+324A+3 34E+344S+350V; 29S+63N +125D+183K+218T +324A+334E+350V+421 S; 29S+95H+11 OW+183W+324A+350V; 29S+95M+11 OW+183 W+324A+350V; 29S+95N+11 OR+183 W+324A+350V; 29S+95R+11 OW+183 W+324A+350V; 29S+95S+110R+183W+324A+350V; 29S+95S+110 W+183 W+324A+3 5 0V; 29S+95T+110R+183W+324A+350V; 29S+95T+110 Y+125D+183 W+286S+324A+350V; 29S+95T +11 OY+152A+156C+157Q+160R+183 W+324A+350V; 29S+95T +11 OY+156R+157Q+183W+324A+350V; 29S+95T+110Υ+183 W+185 A+248A+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+185A+248C+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+185 A+248E+324A+350V; 29S+95T+11Ο Y+183 W+185 A+248H+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+185H+248G+324A+350V; 29S+95T +110Y+183W+185P+248G+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+185P+248S+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+191L+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+248D+324A+350V; 29S+95T+110Y+183W+324A; 29S+95T+110Y+183W+324A+350V; 29S+99D+125D+324A+334E+350V; 29S+110Y+183 W+185N+324A+350V; 29S+125D+218T+324A+344S+3 50V; 29S+125D+234K+324A+330R; 29S+125D+234K+324A+330R+395G; 29S+125D+324A; 29S+125D+324A+330R+395G; 29S+125D+324A+350V; 29S+183A+324A+350V; 29S+183G+324A+33 4E+344S+350V; 29S+183W+324A+350V; 29S+205S; 29S+324A+350V; 29T+324L;

45 A+350V+421 R+422R+423N+424S+425L +426E+427G+428R+429I+430M; 69A+334E; 99D+398T;; 114A+187G+194R+324S; 218T+334G; 323A+324S; 324S; 324S+328T 324S+345D+347Q; 324S+395G; 330R; 334D+343N+344V; 334E+344A; 345H+347P+350V; e 350V.

Exemplos Os produtos químicos são produtos comerciais de tipo pelo menos reagente.

Exemplo 1 - Preparação de variantes PE, triagem e isolamento de variantes de melhorada termoestabilidade e/ou atividade específica Princípios gerais Usando a fitase de Peniophora lycii CBS 686.96 como uma fitase parental, e com base em regiões de interesse aqui descritas, várias bibliotecas de variante de fitase foram construídas e expressadas em levedura (bibliotecas de dopagem, e bibliotecas de embaralhamento de oligo salpicado, cujos exemplos são descritos abaixo).

Triagem para melhorada termoestabilidade: as bibliotecas de leveduras foram submetidas a uma triagem primária como descrito abaixo (replica, filtro único), para selecionar tais colônias que mostram atividade a 53 °C.

As colônias mostrando atividade a 53 °C foram transferidas para uma triagem secundária como também descrito abaixo (cultivo em placas de 24 reservatórios) para estabelecer um perfil de temperatura (atividade a 37°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C, 70°C, 72°C etc., como aplicável) para cada colônia.

Para colônias com melhor desempenho do que a fitase de peniophora parental de tipo selvagem, os plasmídeos foram isolados e re-transformados em levedura, e a experiência de perfil de temperatura foi repetida. A partir das experiências de perfil de temperatura, as seguintes Figuras são calculadas: "Atividade relativa a 60°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 62°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 65°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 68°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 70°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 72°C/37°C," e assim em diante. Nestas relações, a temperatura primeiro mencionada pode ser designada a "temperatura elevada de escolha". Estes termos são definidos como a relação de atividade fitase na temperatura elevada (por exemplo 60 ou 62°C), relativo à atividade de fitase em menor temperatura (37°C), com base nos valores de atividade de fitase obtidos para os sobrenadantes no método de triagem secundário (medidas do perfil de temperatura). As colônias em que uma ou mais destas atividades relativas são melhoradas em comparação com a fitase parental foram selecionadas, o plasmídeo em questão foi seqüenciado, e a variante correspondente identificada como uma variante de fitase melhorada da invenção.

Em um segundo ciclo de tiragem, uma variante de fitase termoestável foi selecionada como uma fitase parental nova (estrutura dorsal) e o acima foi repetido (temperaturas ajustadas como apropriado com base no desempenho desta nova estrutura dorsal).

Além disso, variantes de combinação foram construídas, e alguns pontos quentes em potencial randomizados e as variantes testadas.

Em um terceiro ciclo de triagem, uma outra variante de fitase termoestável nova melhorada foi selecionada como uma nova estrutura dorsal, e o acima foi repetido (temperaturas novamente ajustadas em uma direção ascendente, por exemplo a primeira temperatura do ciclo de triagem foi agora aumentada a 63 °C. Além disso, ainda algumas novas variantes de combinação foram construídas, e outros sítios aparentemente interessantes para encontrar um par ótimo de substituições.

Outras variantes foram preparadas como geralmente descrito acima. A triagem para atividade específica melhorada: na triagem primária, a biblioteca de levedura foi espalhada em placa de SC-glicose contendo Ca-fitato, e cultivada durante 3 dias a 30 °C. Os clones com maiores halos foram selecionados e cultivados em placas de 24 reservatórios contendo meio YPD. Na triagem secundária, a atividade dos sobrenadantes nos reservatórios foi verificada relativamente e os clones com maior atividade foram selecionados. Os clones selecionados foram verificados para atividade restante em placas após incubação a 80 °C, pH 4 durante 30 min para des-selecionar as variantes com menor termoestabilidade. Os clones com alta termoestabilidade foram selecionados e cultivados novamente em placas de 24 reservatórios para semi-purificação. A semi-purificação foi conduzida por ligação de fitase a conA-sepharose (Concanavalin A em matriz de gel Sepharose 4B Gel de Amersham Bioscience, Cat. No. 17-0440-01) e eluindo com 0, M metil-alfa-D-mannopiranosídeo em PBS + 0,1 % tween20 (PBS é 8g/l NaCl, 0,2 g/1, KCI, 2,68 g/1 Na2HP04-7H20, 0,24 g/1 KH2P04 (pH 7,4), e Tween 20 é comercialmente disponíveis de Bio-Rad, cat. No. 170-6531). Os sobrenadantes semi-purificados foram então empregados em análise de imuno- eletroforese após terem ajustados a atividade para 30FYT/ml. Para a imuno-eletroforese de "foguete", um anticorpo policlonal criado em coelhos contra fitase Peniophora purificada foi usado. Os clones com menores sinais foram selecionados como variantes com maior atividade específica (a área sob o foguete sendo proporcional à concentração do antígeno (a fitase), isto é quanto menor a área, menos proteína fitase, e maior a atividade específica).

Os exemplos de variantes melhoradas são mostrados nas tabelas 1-5 abaixo. Estas variantes demonstram uma maior atividade específica e/ou são mais termoestáveis do que a fitase parental de Peniophora. Particularmente, com relação a termoestabilidade, as variantes demonstram maiores valores para "atividade Relativa a 60°C / 37°C," e/ou "Atividade relativa 62°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 65°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 68°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 70°C/37°C," e/ou "Atividade relativa 72°C/37°C," e/ou "atividade relativa a 74°C 137°C," etc. (ver os resultados mostrados nas tabelas 6-1 e 6-2). As variantes selecionadas resultantes do método de triagem de atividade específica são mostrados na tabela 6-3 abaixo. Todas estas variantes tem, como esperado, uma atividade específica ainda maior do que a variante designada "N" na tabela 8.

As variantes selecionadas foram expressadas em Aspergillus oryzae IFO 4177 que é descrito em WO 97/35956, e as células transformadas foram cultivadas no meio MDU 2Bp a 25 °C a 220 rpm. As variantes de fitase foram purificadas do caldo de fermentação e ainda caracterizadas com relação a termoestabilidade e/ou atividade específica como descrito no exemplo 2 e mostrado nas tabelas 7-8.

Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Tabela 6-1 <Ν •ό J5 •s Η « I

Tabela 6-3 Cepas e plasmídeos E. coli DH12S (disponível da Gibco BRL) é usado para o resgate de plasmídeo de levedura. pTMPP2ver2 é um vetor de transporte de S. cerevisiae e E.coli sob o controle de promotor TPI, construído de pJC039 descrito WO 00/10038. Ele é usado para construção da biblioteca, expressão de leveduras, triagem e sequenciamento.

Saccharomyces cerevisiae YNG318: MATa Dpep4[cir+] ura3-52, Ieu2-D2, his 4-539 é usado para a construção de biblioteca de levedura e a expressão de variantes de fitase. É descrito em J. Biol. Chem. 272 (15), 9720-9727, 1997).

Meios e substratos: Solução IPX basal 66,8 g/1 base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos (DIFCO) 100 g/1 succinato 60 g/1 NaOH SC-glicose 100 ml/1 20% glicose (isto é uma concentração final de 2%= 2 g/100 ml)) 4 ml/1 5% treonina 10 ml/1 1 % triptofano 25ml/l 20% casamino ácidos 100 ml/1 solução 10X basal A solução acima é esterilizada usando um filtro de tamanho de poro de 0,20 pm. Agar e H20 (aproximadamente 761 ml) é autoclavado junto e a solução de SC-glicose esterilizada separadamente é adicionada à solução de agar.

YPD 20 g/1 Bacto pepton 10 g/1 extrato de levedura 100 ml/1 20% glicose (esterilizada separadamente) Placa de Na-fítato 100 ml/1 1M tampão Na acetato (pH 5,5) 5 g/1 Na fitato 30 g/1 ágar solução PEG/LiAc 50 ml 40% PEG4000 (esterilizado por autoclavagem) 1 ml 5M acetato de lítio (esterilizado por autoclavagem) solução de metal de traco FeS04 x 7H20 13,90 g/1 MnS04 x 5 H20 13,60 g/1 ZnCl2 6,80 g/1 CuS04 x 5 H20 2,50 g/1 NiCl2 x 6 H20 0,24 g/1 ácido cítrico x H20 3,00 g/1 MDU-2Bp Maltose x H20 45 g/1 Extrato de levedura 7 g/1 MgS04 x 7H20 1 g/1 NaCl 1 g/1 K2S04 2 g/1 KH2P04 12 g/1 Solução de metal de traço 0,5 ml/1 Métodos Atividade de fitase. método de triagem primária Espalhar a biblioteca de levedura sobre placas de SC-glicose e incubar durante 3 dias a 30 °C. Replicar em novas placas de SC-glicose com filtros de nitrato por uso de pano de veludo. Incubar as placas a 30 °C durante 1 dia (ou 20 °C durante o final de semana). Transferir os filtros para placas de Na-fitato a 0,5% pré-aquecidas (pH 5,5). Incubar as placas na temperatura prescrita, por exemplo 53 °C, durante a noite (O/N). Remover os filtros e despejar 0,5 M solução CaCl2. Encontrar os clones de levedura com zonas limpas. Isolar os clones candidatos da placa mestre e inocular em nova placa de SC-glicose e 1 mL de meio YPD em placas de 24 reservatórios. Método de triagem secundária Cultivar meio YPD em placas de 24 reservatórios a 25 °C durante 3 dias a 180 rpm. Centrifugar a placa ou apenas deixar as mesmas ainda durante uma hora. Aplicar 5 μΐ e 10 μΐ de sobrenadantes de placas de fitato de Na. Incubar as placas a 37 °C e 53 °C durante a noite. Verificar o diâmetro de zonas limpas. Verificar o perfil de temperatura do sobrenadante para os clones que retém atividade a 53 °C, usando o teste de fitase descrito no exemplo 2 abaixo (temperatura de teste como prescrito). Método para construção de biblioteca de levedura Misturar 0,5 μΐ de vetor (digerido com EcoRI-Notl) e 1 μΐ de fragmentos de PCR. Descongelar células competentes YNG318 em gelo. Misturar 100 μΐ de células, a mistura de DNA e 10 μΐ de DNA veículo (Clontech) em tubos de polipropileno de 12 ml (Falcon 2059). Adicionar 0,6 ml solução PEG/LiAc e misturar suavemente. Incubar durante 30 min a 30 °C, e 200 rpm. Incubar durante 30 min a 42 °C (choque térmico). Transferir para um tubo eppendorf e centrifugar durante 5 s. Remover o sobrenadante e resolver em 3 mL de YPD. Incubar a suspensão de células durante 45 min a 200 rpm a 30 °C. Despejar a suspensão em placas de SC-glicose para dar aproximadamente 300 clones/placa.

Construção da biblioteca As bibliotecas de dopagem são construídas por método SOE (Splicing by Overlap Extension, ver "PCR: A practical approach", p. 207-209, Oxford University press, eds. McPherson, Quirke, Taylor), seguido por recombinação de levedura.

Outros métodos A transformação de E. coli para bibliotecas de construção e subclonagem é realizada por eletroporação (BIO-RAD Gene Pulser). Os plasmídeos de DNA são preparados por método alcalino (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor) ou com kit Qiagen r) plasmid Kit. Os fragmentos são recuperados de gel agarose por kit de extração de gel Qiagen. PCR é realizado pelo PTC-200 DNA Engine. O analisador genético ASI PRISM ™ 310 é usado para a determinação de todas as seqüências de DNA A transformação de levedura é realizada por método acetato de lítio. O DNA total da levedura é extraído pelo método de Robzyk and Kassir's descrito em Nucleic acids research, vol. 20, no 14 (1992) 3790.

Iniciadores gerais para amplificação e seauenciamento Os iniciadores abaixo são usados para fazer os fragmentos de DNA contendo quaisquer fragmentos mudados pelo método SOE, ou apenas para amplificar um gene de fitase completo. SEOIDNO: 3: 620AM34 GAGTACTATCTTGCATTTGTACTAGGAGTTTAGTGAACTTGC SEP ID NO: 4: 680AM35 ATGGTTATGGATTTCGGGGATTCTTCGAGCGTCCCAAAACC SEP ID NO: 5: AM34 AGGAGTTTAGTGAACTTGC SEP ID NO: 6: AM35 TCGAGCGTCCCAAAACC SEP ID NO: 7: 620 GTACTATCTTGCATTTGTAC SEP ID NO: 8: 680 GGTTATGGATTTCGGGGAT

Exemplos de iniciadores para a construção de bibliotecas de dopagem Região 229-236 De acordo com a prática estabelecida, as seqüências de nucleotídeos especificadas abaixo, códigos especiais para nucleotídeos são usados, estes são evidentes a partir de, por exemplo, http://www.cs.pitt.edu/~vanathi/na.html). Por exemplo, K designa G ou T; Y designa C ou T; R designa A ou G; e N designa A ou C ou G ou T. T229 VNN nucleotídeos L230INMKR aminoácidos 5231 TVN aminoácidos 5232 VNN nucleotídeos G233 VNN nucleotídeos N234 VNN nucleotídeos A235 VNN nucleotídeos S236 AMK aminoácidos ou apenas A (difícil de obter MeK) Distribuição de nucleotídeos para L230INMKR: Nucleotídeo Base 1 Base 2 Base 3 G 0,0 3,0 46,6 A 12,5 6,5 7,7 T 0,0 90,4 45,7 C 87,5 0,0 0,0 Os iniciadores abaixo são marcados na região T229-S236: SEP ID NO: 9: Dopagem 1 (62meros): GAT ATG TGC CCG TTC GAC 12K (11)(12)(13) (14)(15)T 42K 33K 115 32K 5CC CCC TTC TGT GAC CTA TTT AC SEP ID NO: 10: Dopagem 1 R(18meros): GTCGAACGGGCACATATC 1: A91 G3 T3 C3 2: C91 G3 A3 T3 3: G91 C3 A3 T3 4: T91 G3 A3 C3 5: T95 G5 11: C88 A 12 12: T90 G3 A7 13: G47 A8 T45 14: G9 A91 15: G83 A4 T9 C4 Iniciadores para a construção de bibliotecas de oligo- embaralhamento salpicado SEP ID NO: 11: L 102Ή (43meros): AGTTCGGCGTCGCCGATCTGAYCCCGTTCGGGGCTAACCAATC SEP ID NO: 12: VE248+25IX (53meros): TATTTACCGCGGAGGAGTATVNNTCGTACVNNTACTACTATGACCTC

GACAAG SEOIDNO: 13: V271 AI (45meros): CCGGGAACGCTCTCGGTCCTRYCCAGGGCGTCGGATACGTCAATG SEP ID NO: 14: G286X (42meros):. ATGAGCTGCTTGCACGCTTGACCVNNCAAGCCGTTCGAGACG Construção de variantes de fitase por dopagem A primeira reação PCR foi realizada com 2 pares de iniciadores, 620AM34 e DopelR, e Dopel com misturas de nucleotídeos descritas acima de 680AM35 usando o seguinte sistema de reação PCR e condições: Sistema de reação PCR Condições_________________ 38,9 μΐ H20 1 98 °C TÕs 5 μΐ 10 X tampão reação 2 68 °C 90 s 1 μΐ Klen Taq LA (Clontech) 1-2 30 ciclos 4 μΐ lOmMdNTPs 3 68 °C 10 min 0,3 μΐ X 2 100 pmol/μΐ iniciadores 0,5 μΐ pTMPP2 ver 2 Os fragmentos resultantes foram purificados com gel e usados para o gabarito para a segunda reação PCR. O segundo PCR foi realizado com 620 e 680 como iniciadores usando as seguintes condições e reações de PCR: Sistema de reação PCR Condições 38,4 μΐ H20 1 98 °C 10 s 5 μΐ 10 X tampão reação 2 66 °C 90 s 1 μΐ Klen Taq LA (Clontech) 1-2 30 ciclos 4 μΐ lOmMdNTPs 3 66 °C 10min 0,3 μΐ X 2 100 pmol/μΐ iniciadores 0,5 μΐ X2 fragmentos PCR

Biblioteca de embaralhamento oligo salpicado As bibliotecas salpicadas foram construídas como a seguir: reação PCR para preparar um fragmento de gene da variante foi realizada com oolimerase Klen Taa e AM34 e AM35 como iniciadores como descrito acima, Λ. i e o fragmento foi purificado com gel. Cerca de 10 pg DNA / 250 μΐ foram incubados com 0,8 μΐ Dnase (Gibco BRL 18068-015) e 30 μΐ 10X de tampão a 25 °C durante 7- 10 min. EDTA foi adicionado a uma concentração final de 10 mM que parou a reação. Os fragmento de DNA de tamanho correto (50-150 bp) foram purificados por filtro de vidro Whatman. então, os fragmentos tratados com Dnase foram remontados usando o seguinte sistema de reação PCR e condições: Sistema de reação PCR____________________Condições_______________________ 0,2, 0,5 e 1 pmol gabarito tratado com 1 94°C 2 min.

Dnase 2 94°C 30 sec. 3,6,12x excesso molar de cada oligo 3 45°C 30 sec. mutagênico 4 72°C 1 min. 1 contas Ready to go 2-4 30 ciclos 0,1 μΐ Pwo polimerase 5 72°c 5 min. volume final 25 μΐ Usando a mistura de PCR acima, como um gabarito, uma segunda reação PCR foi realizada usando as seguintes condições e sistema de reação PCR:« copiar página 59, tabela Sistema de reação PCR____________________Condições_______________________ 0,2,0,5 1 e 2 μΐ la. reação PCR 1 94°C 2 min. 2 contas Ready-to-go 2 94°C 30 sec. 0,3 μΐ 100 pmol iniciador 1 (AM34) 3 55°C 30 sec. 0,3 μΐ 100 pmol iniciador 2 (AM35) 4 72°C 90 sec. 0,1 μΐ Pwo polimerase 2-4 25 ciclos 5 72°C 10 min.

Exemplo 2 - Purificação e caracterização de variantes de fitase Purificação de variantes de fitase O caldo de cultura de fermentações de Aspergillus oryzae expressando várias variantes selecionadas dentre as tabelas 1-5 acima (designadas em letras em caixa alta A-M) foi filtrado usando uma primeira série de filtros GF de Millipore e então um filtro HA de 0,45 pm (Millipore). Sulfato de amônio (AMS) foi então adicionado ao filtrado a uma concentração de 1,35 M e pH ajustado a pH 6. A amostra foi filtrada novamente (0,45 μηι filtro HA como acima) e carregada em uma coluna de Phenyl Sepharose de 70 ml (volume dependente da carga) (XK26, Pharmacia), equilibrada em 1,35M AMS, 20 MM succinato, pH 6. A coluna foi lavada com 1,35 M AMS, 20 mM succinato, pH 6, antes de eluir a fitase em um gradiente linear de 1,35 - 0 M AMS em 20 mM succinato, pH 6 sobre volumes de 10 colunas. O fluxo foi fixado a 6 ml/min e frações de 10 ml coletadas. As frações contendo atividade e de pureza suficiente (como avaliado por SDS-PAGE) foram reunidas e dialisadas pela noite contra acetato de sódio 50 mM, pH 5,5. A poça contendo a fitase foi então adicionada a 20 mM ácido tris-acético, pH 7,5, e submetida a cromatografia de troca de ânions ou em uma coluna 8 ml MonoQ ou uma Q-Sepharose maior (Pharmacia) equilibrada em 20 mM ácido tris-acético, pH 7,5. A fitase foi eluída em um gradiente linear de 0-0,5 M NaCl em 20 mM ácido tris-acético, pH 7,5 sobre 10 volumes de coluna. As taxas de fluxo e tamanhos de frações foram ajustados de acordo com a escala da coluna. As frações contendo atividade fitase e de pureza suficiente foram reunidas e concentradas em membranas Amicon YM10 antes de diálise contra 50 mM acetato de sódio, pH 5,5.

SDS-PAGE SDS-PAGE foi conduzido usando Novex 4-20 Tris-glicina de acordo com as instruções dos fabricantes. As variantes de fitase, como purificadas de A. oryzae, tinham um peso molecular MW, em tomo de 65 kDa, correspondendo a em tomo de 25% carboidrato.

Teste de atividade fitase. perfis de temperatura e pH, teste de estabilidade em temperatura Amostras de enzima diluídas de 10 μΐ (diluídas em 0,1 M acetato de sódio, 0,01% Tween20, pH 5,5) foram adicionadas em 250 μΐ 5 mM fitato de sódio (Sigma) em 0,1 M acetato de sódio, 0,01% Tween 20, pH 5,5 (pH ajustado após dissolver o fitato de sódio; o substrato foi pré-aquecido) Α ιμλπΙ^π/Ιλ ΐνη»Λ ta ΤΛ Λ ΊΤ °Γ Α ν©ηΛηΛ Λ\< μλι·λ/^λ ν*λ·*· γ» ocn ..1 u iiiwuüaux/ uuaantv _>v iijllii a .j / v^. n. íCayau ιυι paiaua pui auiyau u.i> (ài 10% TCA e o fosfato livre foi medido por adição de 500 μΐ 7,3 g FeS04 em lOOml reagente molibdato (2,5 g (NH4)6Mo7024.4H20 em 8 ml H2S04, diluído a 250 ml). A absorbância a 750 nm foi medida em amostras de 200 μΐ em placas de microtitulação de 96 reservatórios. Os controles em branco de substrato e enzima foram incluídos. Uma curva padrão de fosfato foi também incluída (0-2 mM fosfato). 1 FYT é igual à quantidade de enzima que libera 1 μηιοί de fosfato/min nas dadas condições.

Os perfis de pH foram obtidos realizando o teste acima em vários valores de pH em 50 mM tampões pH 3 (glicina HCI), pH 4-5,5 (acetato de sódio), pH 6 (MES), pH 7-8 (Tris-HCI).

Os perfis de temperatura foram obtidos realizando o teste nas várias temperaturas (pré-aquecimento do substrato). A estabilidade da temperatura foi investigada por pré-incubação das fitases em 0,1 M fosfato de sódio, pH 5,5 em várias temperaturas antes de medir a atividade residual.

As variantes purificadas demonstram perfis de pH similares como a fitase parental P. lycii (todas tendo um pH ótimo em tomo de pH 4-5). Calorimetria de varredura diferencial (DSC) DSC foi realizada em vários valores de pH usando VP-DSC de Micro Cal. As varreduras foram realizadas em uma taxa constante de 1,5 °C/min de 20-90 °C. Antes de realizar DSC, as fitases foram dessalinizadas usando colunas NAP-5 (Pharmacia), equilibradas nos tampões apropriados (por exemplo 0,1 M glicina-HCI, pH 2,5 ou 3,0; 0,1 M acetato de sódio, pH 5,5; 0,1M Tris-HCI, pH 7,0). A manipulação dos dados foi realizada usando software MicroCal Origin.

A temperaturas de fusão resultante, Tm, são mostradas na tabela 7 abaixo. A termoestabilidade das variantes é melhorada de modo significante em comparação com a fitase parental Peniophora. A termoesíabilidade é vista como sendo dependente de pH.

Tabela 7 Exemplo 3 - Atividade específica A atividade específica de variantes selecionadas das tabelas 1-5 (aqui designadas N, O e P) foi determinada em amostras altamente purificadas dialisadas contra 20 mM acetato de sódio, pH 5,5. A pureza foi verificada antes em um gel poliacrilamida SDS mostrando a presença de apenas um componente. A concentração de proteína foi determinada por análise de aminoácido como a seguir: uma alíquota de amostra foi hidrolisada em 6N HCI, 0,1% fenol durante 16 h a 110 °C em um tubo de vidro evacuado. Os aminoácidos resultantes foram quantificados usando um sistema de análise de aminoácido Applied Biosystems 420A, operado de acordo com as instruções dos fabricantes. A partir das quantidades de aminoácidos, a massa total - e assim também a concentração - de proteína na alíquota hidroüsada podem ser calculadas. A atividade de fitase foi determinada nas unidades de FYT, e a atividade específica foi calculada como a atividade de fitase medida em unidades FYT por mg de proteína de enzima variante de fitase.

Os resultados são mostrados na tabela 8 abaixo. Os números de atividade específica são relativos à atividade específica de fitase parental de Peniophora que foi fixada em 100%.

Tabela 8 Exemplo 4 - Ração animal e aditivos para ração animal compreendendo uma variante de fitase Aditivo para ração animal 10 g de variante de fitase no. 1938 (calculada como a proteína de enzima fitase) são adicionados à seguinte pré-mistura (por quilo de pré-mistura): 5000000 IE vitamina A 1000000 IE vitamina D3 13333 mg vitamina E 1000 mg vitamina K3 750 mg vitamina BI 2500 mg vitamina B2 1500 mg vitamina B6 7666 mg vitamina B12 12333 mg niacina 33333 mcg biotina 300 mg acido fólico 3000 mg Ca=D=pantctenato 1666 mg Cu 16666 mg Fe 16666 mg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se 5,8 % Cálcio 25 % „ Sódio Racão animal Este é um exemplo de uma ração animal compreendendo 0,03 g/kg (30 ppm) de variante de fitase E (calculada como a proteína de enzima fitase) 74,0% trigo 20,7% de bolo de soja torrado 5,0% óleo de soja 0,3% da pré-mistura acima Os ingredientes são misturados, e a ração é pelotizada na temperatura desejada, por exemplo 65, 75, 80 ou mesmo 85 °C. A invenção descrita e reivindicada aqui não deve ser limitada no escopo pelas formas de realização específicas aqui descritas, porque estas formas de realização se destinam como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer formas de realização equivalentes se destinam a estar no escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas aqui se tomarão evidentes para os versados na arte a partir da descrição acima. Estas modificações também se destinam a estar no escopo das reivindicações anexas. No caso de disputa, a presente descrição, incluindo definições, serão a base de controle. Várias referências são aqui citadas, cujas descrições são todas aqui incorporadas por referência em suas totalidades.

Claims (9)

1. Variante de uma fita se parental de termoestabilidade e/ou atividade específica melhorada(s) em comparação à fitase de Peniophora iycii CBS 686.96, caracterizada pelo fato de compreender uma substituição ou grupo de substituições selecionado dentre o grupo consistindo em: D29C; D29N; D29T; D29N+L1Ü2I; D29N+T118 A; D29N+L163P+P324S; D29N+L1Ó3P+P324S+E395G; D29N+P234S; D29N+P324S; D29N+L163P+D187C+G194R+P324S; D29S+E125D+P324A+A334E+E344S+P421S; D29S+P324A+D350V+E183 W+K9ST+H11OY+D185K+V248T+V349L+ D350I; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H11 OY+D 185P+V248G; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H11 OY+D 185K+V248G+V349K+D 350L; D29S+P324A+D350V+E183W+H110Y+D185N; D29S+P324A+E125D+D350V+A99D+A334E; D29S+P324A+E125D+D350T; D29S+P324A+E125D+D350V+N345H+L347P; D29S+K95R+D350V; D29S+K95T+H110Y+E157K+E183W+D185H+D187R+T190S+T191R+V2 48G+P324A+D350V; D29S+P324A+E125D+D350V+E344S+A218T; D29S+P324A+D350V; D29S+P324A+D350V+Ε183 W+K95T+H110 Υ+Τ191L; D29S+P324A+D350V+E183W; D29S+P324A+E183W+K95T+H1 ΙΟΥ; D29S+P324Α+Ε125D+D350V+G63N+Α218Τ+Α334Ε+Ε183Κ+Ρ421S; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185P+V248S; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+E125D+G286S; D29S+P324A+E125D+D350V; D29S+P324A+D350V+E183G+A334E+E344S; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110R; D29S+K95T+H110Y+E183W+D185H+V248G+T321A+V323A+P324A+D3 50V; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185H+V248G; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+G152A+G156C+E157Q+L1 60R; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248A; D29S+P324A+D350V+E183W+K95H+H110W; D29S+P324A+D350V+E183A; D29S+P324A+D350V+E183W+K95N+H110R; D29S+K95T+H110Y+E183W+D185K+V248T+ P324A+D350V; D29S+P324A+D350V+E183W+K95S+H110W; D29S+P324A+D350V+E183W+K95T+H110Y+D185A+V248E; e D29T+P324L; em que (a) a variante tem atividade fitase; e (b) cada posição corresponde a uma posição da SEQID NO: 2.

2. Composição, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma variante de fitase como definida na reivindicação 1, e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral traço.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de ainda compreender pelo menos uma enzima selecionada dentre o seguinte grupo de enzimas: xilanases, endoglucanases, endo-l,3(4)-beta-glucanases, e proteases.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 3, caracterizada pelo fato de ser um aditivo de ração animal.

5. Composição de ração animal, caracterizada pelo fato de ter um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e compreender a variante como definida na reivindicação 1 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4.

6. Método para melhorar o valor nutritivo de uma ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende adicionar a variante como definida na reivindicação 1 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4 à ração.

7. Processo para reduzir os níveis de fitato em um esterco animal, caracterizado pelo fato de compreender a alimentação de um animal com uma quantidade eficaz da ração como definida na reivindicação 5.

8. Método para tratar proteínas vegetais, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de adicionar a variante como definida na reivindicação 1 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4 a pelo menos uma proteína vegetal ou fonte de proteína.

9. Uso da variante como definida na reivindicação 1 ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 2 a 4 em ração animal, caracterizado pelo fato de ser na preparação de ração animal; para melhorar o valor nutritivo da ração animal; para reduzir os níveis de fitato em esterco animal; para o tratamento de proteínas vegetais; ou para liberar fósforo de um substrato de fitase.