ES2268687T3 - Polipeptidos con actividad fitasa. - Google Patents
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Abstract
Una secuencia de DNA que codifique un polipéptido que presenta una actividad fitasa termotolerante con un actividad máxima alrededor de un pH 5, 5, siendo una secuencia de DNA procedente de un hongo seleccionado del grupo formado por Aspergillus terreus, Myceliophthora thermophila, Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans y Talaromyces thermophilus; secuencia de DNA seleccionada a partir de las siguientes: (a1) La secuencia de DNA de la Figura 1 [ID. de SEC. Núm.: 1] o su cadena complementaria; (a2) La secuencia de DNA de la Figura 2 [ID. de SEC. Núm.: 3] o su cadena complementaria; (a3) Una secuencia de DNA que contiene una de las secuencias de DNA de las figuras 4 [ID. de SEC. Núm.: 5], 5 [ID. de SEC. Núm.: 7], 6 [ID. de SEC. Núm.: 9] o 10 [ID. de SEC. Núm.: 13] o [ID. de SEC. Núm.: 14] o su cadena complementaria; (b) Una secuencia de DNA que hibrida bajo condiciones estándar con las secuencias definidas en los puntos (a1 a a3); (c) Una secuencia de DNA que, debido a la degeneración del código genético, no hibrida con las secuencias definidas en los puntos (a1 a a3) o (b), pero que codifica polipéptidos con exactamente las mismas secuencias aminoacídicas que los polipéptidos codificados por estas secuencias de DNA; y (d) Una secuencia de DNA que es un fragmento de las secuencias de DNA especificadas en (a1 a a3), (b), o (c).
Description
Polipéptidos con actividad fitasa.
Las fitasas (mio-inositol hexakisfosfato
fosfohidrolasas, EC 3.1.3.8) son enzimas que hidrolizan fitato
(mio-inositol hexakisfosfato) a mio-inositol y fosfato
inorgánico y se sabe que son unos aditivos para pienso de gran
valor.
Se describió por primera vez una fitasa en fibra
de arroz en 1907 [Suzuki et al., Bull. Coll. Agr. Tokio Imp.
Univ. 7, 495 (1907)] y las fitasas en especies de
Aspergillus en 1911 [Dox and Golden, J. Biol. Chem. 10,
183-186 (1911)]. También se han encontrado fitasas
en fibra de trigo, semillas vegetales, intestinos animales y
microorganismos [Howsen and Davies, Enzyme Microb. Technol.
5, 337-382 (1983), Lambrechts et al.,
Biotech. Lett. 14, 61-66 (1992), Shieh and
Ware, Appl. Microbiol. 16, 1348-1351
(1968)].
La clonación y expresión de la fitasa obtenida
de Aspergillus niger (ficuum) están descritas por
VanHartingsveldt et al., en Gene 127,
87-94 (1993) y en la Solicitud de Patente Europea,
Núm. de Publicación 420 358 y las de la obtenida de Aspergillus
niger (var awamori) por Piddington et al. en Gene 133,
55-62 (1993).
Dado que las fitasas utilizadas hasta el momento
en la agricultura presentan ciertas desventajas, es objeto de la
presente invención proporcionar nuevas fitasas, en términos más
generales, polipéptidos con actividad fitasa frente a inositol
fosfatos, incluyendo fitasas ("actividad fitasa") en grandes
cantidades con propiedades mejoradas. Puesto que se sabe que las
fitasas utilizadas hasta el momento pierden actividad durante el
proceso de peletización del pienso debido al tratamiento térmico
empleado, una tolerancia mejorada a la temperatura sería una de
estas propiedades.
Aún no se han descrito fitasas en hongos
termotolerantes a excepción de Aspergillus fumigatus [Dox and
Golden et al., J. Biol. Chem. 10,
183-186 (1911)] y Rhizopus oryzae [Howson and
Davies, Enzyme Microb. Technol. 5, 377-382
(1993)]. Se han descrito fosfatasas termotolerantes, que también
presentan actividad relacionada con el ácido fítico, que provienen
de Aspergillus terreus Cepa 9A-1 [Yamada
et al., Agr. Biol. Chem. 32,
1275-1282 (1968) y Yamamoto et al., Agr.
Biol. Chem. Vol 36, Núm. 12, 2097-2103 (1972)] y de
Schwanniomyces castellii [óptimo de temperatura 77ºC; Segueilha
et al., Bioeng. 74, 7-11 (1992)]. La
enzima descrita en Yamada et al. y Yamamoto et al. es
un homohexámero con un peso molecular de 214 000 y una actividad
enzimática para el ácido fítico con un máximo de actividad
alrededor de pH 4,5. Sin embargo, estas fitasas deben estar
disponibles en grandes cantidades para su uso comercial en la
agricultura. Consecuentemente, un objeto de la presente invención
es proporcionar secuencias de DNA que codifiquen fitasas tolerantes
al calor. La tolerancia al calor mejorada de las fitasas
codificadas por estas secuencias de DNA se puede determinar mediante
ensayos conocidos en el campo, p. ej. mediante los procesos
utilizados para la peletización del pienso o ensayos que determinen
la dependencia respecto al calor de la propia actividad enzimática
como describe, p. ej., Yamada et al. (s.a).
Otro objeto de la presente invención es el
cribado de hongos que muestren un cierto grado de termotolerancia
para la producción de fitasa. Este cribado se puede realizar por
ejemplo como se describe en el Ejemplo 1. De este modo se han
identificado por primera vez cepas fúngicas termotolerantes,
incluidas en el Ejemplo 1, para producir una fitasa.
Entonces se pueden cultivar cepas
termotolerantes, véase p. ej. las incluidas en el Ejemplo 1, del
modo conocido en el campo, p. ej. como indica su proveedor, p. ej.
The American Tissue Type Culture Collection (ATTC), Deutsche
Sammlung von Mikroorgnismen und Zellkulturen GmbH (DSM),
Agricultural Research Service Culture Collection (NRRL) y la
Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS), a partir de los que se
puede disponer de estas cepas, o bien como se indica en el Ejemplo
2, por ejemplo.
Unas propiedades más mejoradas son, p. ej., una
especificidad mejorada del sustrato por lo que respecta al ácido
fítico [mio-inositol (1,2,3,4,5,6) hexakisfosfato],
que es una forma principal de almacenamiento de fósforo en plantas
y semillas. Se necesita una enzima con suficiente actividad frente
al ácido fítico y todas las demás moléculas de inositol fosfato
para la liberación completa de los seis grupos fosfato del ácido
fítico. La utilización, p. ej., de la fitasa de Aspergillus
niger requiere para esta liberación completa la adición de la
fosfatasa ácida de pH 2,5. Sería claramente ventajoso disponer de
una única enzima con la actividad necesaria. Por ejemplo, la
Publicación de Solicitud de Patente Internacional Núm. 94/03072
describe un sistema de expresión que permite la expresión de una
mezcla de enzimas degradadoras de fitato en proporciones deseadas.
Sin embargo, aún sería más deseable disponer de ambas actividades en
un único polipéptido. Por lo tanto, también es objeto de la
presente invención proporcionar secuencias de DNA que codifiquen
este tipo de polipéptidos. Las actividades de fitasa y fosfatasa se
pueden determinar mediante ensayos conocidos en el estado de la
técnica o descritos, p. ej., en el Ejemplo 9.
Otra propiedad mejorada es, p. ej., el
denominado perfil de pH mejorado. Esto significa, p. ej., dos
máximos de degradación de fitina: uno cerca de pH 2,5, que podría
ser el pH del estómago de ciertos animales, y otro cerca de pH 5,5,
que podría corresponder al pH posterior al estómago de ciertos
animales. Es posible determinar un perfil de pH de este tipo
mediante ensayos conocidos en el estado de la técnica o ensayos
descritos, p. ej., en el Ejemplo 9. En consecuencia, también es
objeto de la presente invención proporcionar secuencias de DNA que
codifiquen estos polipéptidos mejorados.
En términos generales, es objeto de la presente
invención proporcionar una secuencia de DNA que codifique un
polipéptido con actividad fitasa que presente un máximo de actividad
alrededor de pH 5,5, procediendo la secuencia de DNA de un hongo
seleccionado del grupo formado por Aspergillus terreus,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans,
Myceliophthora thermophila y Talaromyces thermophilus,
o proporcionar una secuencia de DNA que codifique un fragmento de
dicho polipéptido cuyo fragmento aún presente actividad fitasa; o
más específicamente una secuencia de DNA donde el hongo es
seleccionado del grupo formado por Aspergillus fumigatus,
Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Myceliophthora
thermophila y Talaromyces thermophilus; o más
específicamente una secuencia de DNA donde el hongo es seleccionado
del grupo formado por Aspergillus terreus, Myceliophthora
thermophila, Aspergillus fumigatus, Aspergillus
nidulans y Talaromyces thermophilus. Las secuencias de
DNA que codifican un fragmento de un polipéptido de la presente
invención pueden tener una longitud de, p. ej., entre 1350 y 900,
preferiblemente entre 900 y 450 y lo más preferible entre 450 y 150
nucleótidos, y se puede preparar basándose en la secuencia de DNA
del polipéptido completo mediante métodos de recombinación o
mediante síntesis química que es ampliamente conocida por el experto
en la materia.
Aún más, es objeto de la presente invención
proporcionar una secuencia de DNA que codifique un polipéptido con
actividad fitasa, siendo la secuencia de DNA seleccionada a partir
de las siguientes:
(a) la secuencia de DNA de la Figura 1 [ID. de
SEC. Núm.: 1] o su cadena complementaria;
(b) una secuencia de DNA que hibride bajo
condiciones estándar con secuencias definidas en (a) o,
preferiblemente, con la región codificante de estas secuencias o,
más preferiblemente, con una región situada entre las posiciones
491 y 1856 de estas secuencias de DNA o, aún más preferiblemente,
con una sonda genómica obtenida preferiblemente mediante cebado
aleatorio utilizando el DNA de Aspergillus terreus 9A1 como
se describe en el Ejemplo 12.
(c) una secuencia de DNA que, debido a la
degeneración del código genético, no hibrida con secuencias de (a)
o (b), pero que codifica polipéptidos que poseen exactamente las
mismas secuencias aminoacídicas que los polipéptidos codificados
por estas secuencias de DNA; y
(d) una secuencia de DNA que es un fragmento de
las secuencias de DNA especificadas en (a), (b) o (c).
Unas "condiciones estándar" para la
hibridación en este contexto significan las condiciones que
habitualmente utilizan los expertos en la materia para detectar
señales de hibridación específicas y que se describen, p. ej., en
Sambrook et al., "Molecular Cloning", segunda ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press 1989, New York; o preferiblemente
las denominadas condiciones de hibridación astringentes o de lavado
no astringentes; o bien más preferiblemente las denominadas
condiciones de hibridación astringentes o de lavado astringentes con
las que está familiarizado un experto en la materia y que se
describen en, p. ej., Sambrook et al. (s.a.); o incluso aún
más preferidas son las condiciones de hibridación astringentes o de
lavado astringentes o no astringentes, como aparecen en el Ejemplo
12. Un "fragmento de las secuencias de DNA" en este contexto se
refiere a un fragmento que codifica un polipéptido que aún tiene
actividad fitasa como se ha especificado anteriormente.
También es objeto de la presente invención
proporcionar una secuencia de DNA que codifique un polipéptido con
actividad fitasa, siendo la secuencia de DNA una seleccionada a
partir de las siguientes:
(a) la secuencia de DNA de la Figura 2 [ID. de
SEC. Núm.: 3] o su cadena complementaria;
(b) una secuencia de DNA que hibride bajo
condiciones estándar con secuencias definidas en (a) o,
preferiblemente, una región que abarca cerca del 80% de la región
codificante que contiene de forma opcional aproximadamente entre
100 y 150 nucleótidos del extremo 5' de la región no codificante de
dichas secuencias de DNA o, más preferiblemente, con una región
situada entre las posiciones 2068 y 3478 de estas secuencias de DNA
o, aún más preferiblemente, con una sonda genómica obtenida
preferiblemente mediante cebado aleatorio utilizando el DNA de
Myceliophthora thermophila como se describe en el Ejemplo
12.
(c) una secuencia de DNA que, debido a la
degeneración del código genético, no hibrida con secuencias de (a)
o (b), pero que codifica polipéptidos que poseen exactamente las
mismas secuencias aminoacídicas que los polipéptidos codificados
por estas secuencias de DNA; y
(d) una secuencia de DNA que es un fragmento de
las secuencias de DNA especificadas en (a), (b) o (c).
Los términos "fragmentos" y "condiciones
estándar" tienen el significado dado anteriormente.
También es objeto de la presente invención
proporcionar una secuencia de DNA que codifique un polipéptido con
actividad fitasa, siendo la secuencia de DNA seleccionada a partir
de las siguientes:
(a) una secuencia de DNA que contenga una de las
secuencias de DNA de las Figuras 4 [ID. de SEC. Núm.: 5], 5 [ID. de
SEC. Núm.: 7], 6 [ID. de SEC. Núm.: 9] o 10 ["aterr21", ID. de
SEC. Núm.: 13; "aterr58", ID. de SEC. Núm.: 14], o su cadena
complementaria;
(b) una secuencia de DNA que hibride bajo
condiciones estándar con secuencias definidas en (a) o,
preferiblemente, con aquellas secuencias que contengan la secuencia
de DNA de la Figura 4 [ID. de SEC. Núm.: 5] aislable de
Talaromyces thermophilus o de la Figura 5 [ID. de SEC. Núm.:
7] aislable de Aspergillus fumigatus o de la Figura 6 [ID.
de SEC. Núm.: 9] aislable de Aspergillus nidulans o de una o
las dos secuencias dadas en la Figura 10 ["aterr21", ID. de
SEC. Núm.: 13; "aterr58", ID. de SEC. Núm.: 14] aislable de
Aspergillus terreus (CBS 220.95) o, más preferiblemente, con
una región de estas secuencias de DNA que se extiende al menos
hasta el 80% de la región codificante o, aún más preferiblemente,
con una sonda genómica obtenida preferiblemente mediante cebado
aleatorio utilizando el DNA de Talaromyces thermophilus o
Aspergillus fumigatus o Aspergillus nidulans o
Aspergillus terreus (CBS 220.95) como se describe en el
Ejemplo 12.
(c) una secuencia de DNA que, debido a la
degeneración del código genético, no hibrida con secuencias de (a)
o (b), pero que codifica polipéptidos que poseen exactamente las
mismas secuencias aminoacídicas que los polipéptidos codificados
por estas secuencias de DNA; y
(d) una secuencia de DNA que es un fragmento de
las secuencias de DNA especificadas en (a), (b) o (c).
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar una secuencia de DNA que codifique un polipéptido con
actividad fitasa, siendo la secuencia de DNA seleccionada a partir
de una secuencia de DNA que contiene la secuencia de DNA de la
Figura 4 [ID. de SEC. Núm.: 5] aislable de Talaromyces thermophilus,
de la Figura 5 [ID. de SEC. Núm.: 7] aislable de Aspergillus
fumigatus,de la Figura 6 [ID. de SEC. Núm.: 9] aislable de
Aspergillus nidulans o de la Figura 10 ["aterr21", ID.
de SEC. Núm.: 13; "aterr58", ID. de SEC. Núm.: 14] aislable de
Aspergillus terreus (CBS 220.95) o siendo la secuencia de DNA
una variante degenerada o un equivalente de la misma.
Los términos "fragmentos" y "condiciones
estándar" tienen el significado dado anteriormente. Una
"variante de degeneración" en este contexto significa una
secuencia de DNA que, debido a la degeneración del código genético,
presenta una secuencia nucleotídica diferente a la que nos hemos
referido, pero codifica un polipéptido con la misma secuencia
aminoacídica. "Equivalente" se refiere en este contexto a una
secuencia de DNA que codifica polipéptidos con actividad fitasa y
con una secuencia aminoacídica que difiere, por deleción,
sustitución o adición de uno o más aminoácidos, preferiblemente
hasta 50, más preferiblemente hasta 20, aún más preferiblemente
hasta 10 y todavía más preferiblemente 5, 4, 3 o 2, respecto de la
secuencia aminoacídica del polipéptido codificado por la secuencia
de DNA a la que se refiere la secuencia equivalente. En el campo se
conocen bien sustituciones de aminoácidos que generalmente no
alteran la actividad específica y se describen en, p. ej., H.
Neurath y R.L. Hill en "The Proteins" (Academic Press, New
York, 1979, véase especialmente la Figura 6, pág. 14). Los
intercambios que se dan más a menudo son los siguientes: Ala/Ser,
Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val,
Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val,
Ala/Glu y Asp/Gly, además de estas mismas a la inversa (las
abreviaciones de tres letras se utilizan para los aminoácidos y son
estándar y ampliamente conocidas en el campo).
Estos equivalentes se pueden producir mediante
métodos conocidos en el estado de la técnica y descritos, p. ej.,
en Sambrook et al. (s.a). Es posible determinar si los
polipéptidos codificados por estas secuencias equivalentes aún
poseen una actividad fitasa mediante uno de los ensayos conocidos en
el campo o, p. ej., uno de los descritos en el Ejemplo 9.
También es objeto de la presente invención
proporcionar una de las antes mencionadas secuencias de DNA que
codifican un polipéptido que posee actividad fitasa, siendo la
secuencia de DNA procedente de un hongo o, de forma más específica,
de un hongo seleccionado de uno de los grupos de hongos específicos
antes mencionados.
Todavía es más objeto de la presente invención
proporcionar una secuencia de DNA que codifique un constructo
quimérico que posea actividad fitasa, conteniendo dicho constructo
quimérico un fragmento de una secuencia de DNA como la especificada
anteriormente o, preferiblemente, una secuencia de DNA en la que el
constructo quimérico contenga en su extremo
N-terminal un fragmento de la fitasa de
Aspergillus niger fusionada en su extremo
C-terminal con un fragmento de la fitasa de
Aspergillus terreus o, más preferiblemente, una secuencia de
DNA con la secuencia nucleotídica específica mostrada en la Figura 7
[ID. de SEC. Núm.: 11] y una variante de degeneración o equivalente
de la misma, donde "variante de degeneración" y
"equivalente" tienen los significados antes especificados.
El DNA genómico y el cDNA de cepas fúngicas se
pueden preparar del modo conocido en el campo [véase p. ej. Yelton
et al., Procd. Natl. Acad. Sci. USA,
1470-1474 (1984) o Sambrook et al., s.a., o
bien del modo que se describe de forma específica en el Ejemplo
2].
La clonación de las secuencias de DNA de la
presente invención a partir de este DNA genómico se puede llevar a
cabo entonces mediante el uso, p. ej., del método ampliamente
conocido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los
principios de este método están resumidos, p. ej., por White et
al. (1989), mientras que métodos mejorados aparecen descritos
en, p. ej., Innis et al. [PCR Protocols: A guide to Methods
and Applications, Academic Press, Inc. (1990)]. La PCR es un método
in vitro para la producción de grandes cantidades de un DNA
específico de longitud y secuencia definidas, a partir de una mezcla
de diferentes secuencias de DNA. Por lo tanto, la PCR se basa en la
amplificación enzimática del fragmento específico de DNA de interés
que se encuentra flanqueado por dos cebadores oligonucleotídicos
que son específicos para esta secuencia y que hibridan con la
cadena complementaria de la secuencia diana. Los cebadores están
orientados con sus extremos 3' enfrentados. Los ciclos repetidos de
desnaturalización del molde por calor, hibridación de los cebadores
con sus secuencias complementarias y extensión de los cebadores
hibridados con una DNA polimerasa, dan lugar a la amplificación del
segmento situado entre los cebadores de la PCR. Dado que el producto
de la extensión de cada cebador puede servir como molde para el
otro, cada ciclo básicamente duplica la cantidad de fragmento de
DNA producido en el ciclo anterior. Mediante la utilización de la
Taq DNA polimerasa termoestable, aislada a partir de la bacteria
termofílica Thermus aquaticus, ha sido posible evitar la
desnaturalización de la polimerasa cuya adición se necesitaba
después de cada paso de desnaturalización por calor. Este desarrollo
ha llevado a la automatización de la PCR mediante una diversidad
de dispositivos simples de ciclado de temperatura. Además, la
especificidad de la reacción de amplificación se aumenta al permitir
la utilización de temperaturas más elevadas para la hibridación y
extensión de cebadores. La mayor especificidad mejora la producción
global de productos de amplificación al minimizar la competición de
fragmentos que no son diana por enzima y cebadores. De este modo,
la secuencia específica de interés se amplifica de forma elevada y
puede separarse fácilmente de las secuencias no específicas
mediante métodos conocidos en el campo, p. ej. mediante separación
sobre un gel de agarosa, y clonarse mediante métodos conocidos en
el campo utilizando vectores como describen, p. ej., Holten y
Graham en Nucleic Acid Res. 19, 1156 (1991), Kovalic et
al. en Nucleic Acid Res. 19, 4560 (1991), Marchuk et
al. en Nucleic Acid Res. 19, 1154 (1991) o Mead et
al. en Bio/Technology 9, 657-663
(1991).
Los cebadores oligonucleotídicos utilizados en
el procedimiento de PCR se pueden preparar como ya se conoce en el
campo y describen, p. ej., Sambrook et al. (1989 "Molecular
Cloning" 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor).
Los cebadores específicos utilizados en la
práctica de la presente invención se han diseñado como cebadores
degenerados sobre la base de la comparación de secuencias de DNA de
secuencias conocidas de la fitasa de Aspergillus niger, la
fosfatasa ácida de Aspergillus niger, la fosfatasa ácida de
Saccharomyces cerevisiae y la fosfatasa ácida de
Schizosaccharomyces pombe (para información de secuencias
véase p. ej. el Instituto Europeo de Bioinformática (Hinxton Hall,
Cambridge, GB). La degeneración de los cebadores se redujo
seleccionando algunos codones de acuerdo con una tabla de
utilización de codones para Aspergillus niger preparada sobre
la base de secuencias conocidas de Aspergillus niger.
Además, se ha encontrado que el aminoácido del extremo
C-terminal de las secuencias aminoacídicas
utilizadas para definir las sondas específicas debe ser un
aminoácido conservado en todas las fosfatasas ácidas incluidas
las
fitasas antes especificadas, pero el resto de aminoácidos deben ser más específicos para la fitasa que para la fosfatasa.
fitasas antes especificadas, pero el resto de aminoácidos deben ser más específicos para la fitasa que para la fosfatasa.
Estas secuencias de DNA amplificadas pueden
entonces utilizarse para el cribado de genotecas de DNA de, p. ej.,
origen fúngico mediante métodos conocidos en el campo (Sambrook
et al., s.a.) o del modo descrito específicamente en los
Ejemplos 5 a 7.
Una vez obtenidas, las secuencias de DNA
completas de la presente invención se pueden integrar en vectores
mediante métodos conocidos en el campo y descritos p. ej. en
Sambrook et al. (s.a.) para sobreexpresar el polipéptido
codificado en sistemas huésped apropiados. Sin embargo, un experto
en la materia sabe que también las propias secuencias de DNA pueden
utilizarse para transformar los sistemas huésped apropiados de la
invención para obtener sobreexpresión del polipéptido codificado.
Unos sistemas huésped adecuados son por ejemplo hongos como los
Aspergilli, p. ej. Aspergillus niger [ATCC 9142] o
Aspergillus ficuum [NRRL 3135], o como los Trichoderma, p.
ej., Trichoderma reesei, o bien levaduras como Saccharomyces,
p. ej. Saccharomyces cerevisiae, o Pichia como Pichia
pastoris; todos disponibles en ATCC. Algunas bacterias que se
pueden utilizar son, p. ej., E. coli, Bacilli como p. ej.
Bacillus subtilis o Streptomyces, p. ej., Streptomyces
lividans (véase p. ej. Anné y Mallaert en FEMS Microbiol.
Letters 114, 121 (1993). Las E. coli que se pueden
utilizar son las cepas K12 de E. coli, p. ej. M15 [descritas
como DZ 291 por Villarejo et al. en J. Bacteriol.
120, 466-474 (1974)], HB 101 [ATCC Núm.
33694] o E. coli SG13009 [Gottesman et al., J.
Bacteriol. 148, 265-273 (1981)].
Los vectores que se pueden utilizar para la
expresión en hongos son conocidos en el campo y están descritos en,
p. ej., PE 420 358, en Cullen et al. [Bio/Technology
5, 369-376 (1987)] o en Ward en Molecular
Industrial Micology, Systems and Applications for Filamentous
Fungi, Marcel Dekker, New York (1991), Upshall et al.
[Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)], Gwynne
et al. [Bio/Technology 5, 71-79
(1987)], Punt et al. [J. of Biotechnology 17,
19-34 (1991)] y, en el caso de levaduras, en
Sreekrishna et al. [J. Basic Microbiol. 28,
265-278 (1988), Biochem. 28,
4117-4125 (1989)], Hitzemann et al. [Nature
293, 717-722 (1981)] o en PE 183 070, PE 183 071, PE
248 227, PE 263 311. Los vectores adecuados que se pueden utilizar
para la expresión en E. coli son mencionados, p. ej., por
Sambrook et al. [s.a.] o Fiers et al. en "Procd. 8th
Int. Biotechnology Symposium" [Soc. Franc. Microbiol., Paris
(Durand et al., eds.), pp. 680-697 (1988)] o
por Bujard et al. en Methods in Enzymology, eds. Lefkovits
and Pernis, Academic Press, Inc., Vol. IV, 121-152
(1990). Los vectores que se pueden utilizar para la expresión en
Bacilli son conocidos en el campo y están descritos en, p.
ej., PE 405 370, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 81, 439 (1984)
por Yansura y Henner, Meth. Enzym. 185,
199-228 (1990) o PE 207 459.
O bien estos vectores ya llevan elementos
reguladores (p. ej. promotores), o bien las secuencias de DNA de la
presente invención pueden fabricarse de modo que contengan estos
elementos. Los elementos promotores adecuados que se pueden
utilizar son conocidos en el campo y p. ej. son: para Trichoderma
reesei, el promotor cbhl [Haarki et al., Biotechnology
7, 596-600 (1989)] o el pki1 [Schindler et
al., Gene 130, 271-275 (1993)]; para
Aspergillus oryzae, el promotor amy [Christensen et
al., Abstr. 19th Lunteren Lectures on Molecular Genetics F23
(1987); Christensen et al., Biotechnology 6,
1419-1422 (1988); Tada et al., Mol. Gen.
Genet. 229, 301 (1991)]; para Aspergillus niger, el
promotor glaA [Cullen et al., Bio/Technology 5,
369-376 (1987); Gwynne et al.,
Bio/Technology 5, 713-719 (1987); Ward en
Molecular Industrial Mycology, Systems and Applications for
Filamentous Fungi, Marcel Dekker, New York, 83-106
(1991)], el alcA [Gwynne et al., Bio/Technology 5,
713-719 (1987)], el suc1 [Boddy et al.,
Current Genetics 24, 60-66 (1993)], el aphA
[MacRae et al., Gene 71, 339-348
(1988); MacRae et al., Gene 132,
193-198 (1993)], el tpiA [McKnight et al.,
Cell 46, 143-147 (1986); Upshall et
al., Bio/Technology 5, 1301-1304 (1987)],
el gpdA [Punt et al., Gene 69, 49-57
(1988); Punt et al., J. of Biotechnology 17,
19-37 (1991)] y el pkiA [de Graaff et al.,
Curr. Genet. 22, 21-27 (1992)]. Los
elementos promotores adecuados que se pueden utilizar para la
expresión en levaduras son conocidos en el campo y p. ej. son: el
promotor pho5 [Vogel et al., Molecular and Cellular Biology,
2050-2057 (1989); Rudolf and Hinnen, Proc. Natl.
Acad. Sci. 84, 1340-1344 (1987)] o el
promotor gap para la expresión en Saccharomyces cerevisiae
y, para Pichia pastoris, p. ej. el promotor aoxl [Koutz et
al., Yeast 5, 167-177 (1989); Sreekrishna
et al., J. Basic Microbiol. 28,
265-278 (1988)].
En consecuencia, tanto los vectores que
contengan las secuencias de DNA de la presente invención,
preferiblemente para la expresión de dichas secuencias de DNA en
bacterias o en un hongo o levadura huésped, como dichas bacterias u
hongos o levaduras huésped transformados, son también objeto de la
presente invención.
Una vez se han expresado estas secuencias de DNA
en una célula huésped adecuada y en un medio adecuado, es posible
aislar la fitasa codificada tanto a partir del medio, en el caso de
que la fitasa sea secretada al medio, como a partir del organismo
huésped, en el caso de que dicha fitasa esté presente de forma
intracelular, mediante métodos conocidos en el campo de la
purificación de proteínas o los métodos descritos, p. ej., en la PE
420 358. Por consiguiente, también son objeto de la presente
invención tanto un proceso para la preparación de un polipéptido de
la presente invención caracterizado por que se cultivan bacterias
transformadas, o una célula huésped como las antes descritas, en
condiciones de cultivo adecuadas, y por que el polipéptido se
recupera de los mismos, como un polipéptido cuando se produce
mediante un proceso de este tipo o un polipéptido codificado por
una secuencia de DNA de la presente invención.
Una vez obtenidos, los polipéptidos de la
presente invención se pueden caracterizar, de acuerdo con su
actividad, mediante ensayos conocidos en el estado de la técnica o
como se describe, p. ej., en Engelen et al. [J. AOAC Intern.
77, 760-764 (1994)] o en el Ejemplo 9. Por lo
que respecta a las propiedades que confieren la utilidad en la
agricultura a los polipéptidos de la presente invención, se puede
utilizar cualquier ensayo conocido en el campo y descrito en, p.
ej., Simons et al. [British journal of Nutrition 64,
525-540 (1990)], Schöner et al. [J. Anim.
Physiol. a. Anim. Nutr. 66, 248-255 (1991)],
Vogt [Arch. Geflügelk. 56, 93-98 (1992)],
Jongbloed et al. [J. Anim. Sci. 70,
1159-1168 (1992)], Perney et al. [Poultry
Science 72, 2106-2114 (1993)], Farrell et
al. [J. Anim. Physiol. a. Anim. Nutr. 69,
278-283 (1993)], Broz et al. [British Poultry
Science 35, 273-280 (1994)] y Düngelhoef
et al. [Animal Feed Science and Technology 49,
1-10 (1994)]. En relación con su termotolerancia se
puede utilizar cualquier ensayo conocido en el campo y descrito en,
p. ej., Yamada et al. (s.a.); y en cuanto a sus perfiles de
pH y especificidad del sustrato también se puede utilizar cualquier
ensayo conocido en el campo y descrito, p. ej., en el Ejemplo 9 o
en Yamada et al. (s.a).
En general, los polipéptidos de la presente
invención se pueden utilizar sin limitarse a un campo específico de
la aplicación para la conversión de fitato a inositol y fosfato
inorgánico.
Además, los polipéptidos de la presente
invención se pueden utilizar para la preparación de alimentos
compuestos o piensos en los que los componentes de dicha
composición están mezclados con uno o más polipéptidos de la
presente invención. Por lo tanto, el alimento compuesto o los
piensos que contengan uno o más polipéptidos de la presente
invención también son objeto de la presente invención. Cualquier
experto en la materia estará familiarizado con su proceso de
preparación. Estos alimentos compuestos o piensos pueden también
contener aditivos o, componentes utilizados habitualmente con ese
fin y conocidos en el estado de la técnica.
También es objeto de la presente invención
proporcionar un proceso para la reducción de los niveles de fitato
en estiércol animal, caracterizado en que se alimenta un animal con
la composición de pienso en una cantidad efectiva para la
conversión del fitato contenido en el pienso a inositol y fosfato
inorgánico.
| Medio completo (Clutterbuck) | |
| Glucosa | 10 g/l |
| Solución de -CN | 10 ml/l |
| Nitrato sódico | 6 g/l |
| Bacto peptona (Difco Lab., Detroit, MI, USA) | 2 g/l |
| Extracto de levadura (Difco) | 1 g/l |
| Casaminoácidos (Difco) | 1,5 g/l |
| Solución modificada de elementos traza | 1 ml/l |
| Solución vitamínica | 1 ml/l |
| Medio M3 | |
| Glucosa | 10 g/l |
| Solución de -CN | 10 ml/l |
| Solución modificada de elementos traza | 1 ml/l |
| Nitrato amónico | 2 g/l |
Medio M3 - Fosfato
Medio M3 excepto por que -CN es substituido por
-CNP
Medio M3 - Fosfato
Medio M3 - Fosfato con la adición de 5 g/l de
Fitato de Na_{12} (Sigma #P-3168; Sigma, St.
Louis, MO, EE.UU.)
| Soluclón modificada de elementos traza | |
| CuSO_{4} | 0,04% |
| FeSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,08% |
| Na_{2}MoO_{4} \cdot 2H_{2}O | 0,08% |
| ZnSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 0,8% |
| B_{4}Na_{2}O_{7} \cdot 10H_{2}O | 0.004% |
| MnS_{4} \cdot H_{2}O | 0,08% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Solución vitamínica | |
| Riboflavina | 0,1% |
| Nicotinamida | 0,1% |
| Ácido p-amino benzóico | 0,01% |
| Piridoxina | 0,05% |
| Aneurina/HCl | 0,05% |
| Biotina | 0,001% |
\vskip1.000000\baselineskip
| Solución -CN | |
| KH_{2}PO_{4} | 140 g/l |
| K_{2}PO_{4} \cdot 3H_{2}O | 90 g/l |
| KCl | 10 g/l |
| NIgSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 10 g/l |
\vskip1.000000\baselineskip
| Solución -CNP | |
| HEPES | 47,6 g/200 ml |
| KCl | 2 g/200 ml |
| MgSO_{4} \cdot 7H_{2}O | 2 g/200 ml |
Ejemplo
1
Cribado de hongos para actividad fitasa
Se cribaron hongos en un sistema de tres placas
utilizando los medios de cultivo que se mencionan a
continuación:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\+ M3 \+ (un medio definido que contiene fosfato)\cr \+
M3-P \+ \hskip0,8cm (medio M3 sin
fosfato)\cr \+ M3 - P+Fitato \+
\hskip1.8cm (medio M3 sin fosfato pero que contiene
fitasa como única fuente de
fósforo)\cr}
Las placas se prepararon con agarosa para
disminuir el nivel de ruido de fondo de fosfato.
Se cultivaron hongos en el medio a la
temperatura recomendada por el proveedor. Se transfirieron tanto
esporas como micelio a las placas de ensayo y se incubaron a la
temperatura recomendada hasta que se observó crecimiento.
Se encontró que las siguientes cepas
termotolerantes presentaban dicho crecimiento:
Myceliophthora thermophila [ATCC 48
102]
Talaromyces thermophilus [ATCC 20
186]
Aspergillus fumigatus [ATCC 34 625]
\newpage
Ejemplo
2
Se cultivaron cepas de Myceliophthora
thermophila, Talaromyces thermophilus, Aspergillus fumigatus,
Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus 9A1 y Aspergillus terreus
CBS 220.95 en caldo de cultivo de
patata-dextrosa (Difco Lab., Detroit, MI, EE. UU.) o
en medio completo (Clutterbuck). Aspergillus terreus
9A-1 y Aspergillus nidulans se han depositado
con la finalidad de ser patentadas bajo el Tratado de Budapest en
el DSM en Braunschweig, RDA el 17 de marzo de 1994 con el número de
acceso DSM 9076 y el 17 de febrero de 1995 con el número de acceso
DSM 9743, respectivamente.
El DNA genómico se preparó del siguiente
modo:
Se inoculó medio con esporas a una elevada
densidad y se cultivó durante toda la noche en agitación. Esto
produjo un cultivo espeso de pequeñas esferas fúngicas. Se recuperó
el micelio mediante filtración, se secó en papel secante y se pesó.
Se utilizaron hasta 2,0 g por preparación. El micelio se molió hasta
conseguir un polvo fino en nitrógeno líquido e inmediatamente se
añadió a 10 ml de tampón de extracción (Tris/HCl 200 mM, NaCl 250
mM, EDTA 25 mM, SDS al 0,5%, pH 8,5) y se mezcló bien. A la
suspensión se le añadió fenol (7 ml), se mezcló y luego se añadió
también cloroformo (3 ml) y se mezcló bien. La mezcla se centrifugó
(20.000 g) y se recuperó la fase acuosa. Se añadió ribonucleasa A a
una concentración final de 250 \mug/ml y se incubó a 37ºC durante
15 min. A continuación se extrajo la mezcla con un volumen de
cloroformo y se centrifugó (10.000 g, 10 min). La fase acuosa se
recuperó y el DNA se precipitó con 0,54 volúmenes de isopropanol a
TA durante 1 hora a temperatura ambiente. El DNA se recuperó
mediante "spooling" y se resuspendió en agua.
El DNA resultante se purificó aún más de la
siguiente forma:
Una porción del DNA se digirió con proteinasa K
durante 2 h a 37ºC y entonces se extrajo de forma repetida (de dos
a tres veces) con un volumen igual de fenol/cloroformo y a
continuación se precipitó previamente a la resuspensión en agua a
una concentración de aproximadamente 1 \mug/\mul.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
La PCR se llevó a cabo básicamente siguiendo el
protocolo de Perkin Elmer Cetus [(PEC); Norwalk, CT, EE. UU.]. Los
siguientes dos cebadores se utilizaron (las bases indicadas entre
paréntesis son o una o la otra):
- Phyt 8: 5' ATG GA(CT) ATG TG(CT) TCN TT(CT) GA 3'[ID. de SEC. Núm.: 19]
- Degeneración = 32
- Tm elevada = 60ºC/Tm baja 52ºC
- Phyt 9: 5' TT(AG) CC(AG) GC(AG) CC(GA) TGN CC(GA) TA 3'[ID. de SEC. Núm.: 20]
- Tm elevada = 70ºC/Tm baja 58ºC
\vskip1.000000\baselineskip
Una reacción típica se realizó de la siguiente
manera:
| H_{2}O | 24,5 \mul | |
| 10 x tampón PEC GeneAmp | 5 \mul | |
| dNTP de GeneAmp (10 mM) | 8 \mul | |
| Cebador 1 (Phyt 8, 100 \muM) | 5 \mul | |
| Cebador 2 (Phyt 9, 100 \muM) | 5 \mul | |
| DNA (\sim 1 \mug/\mul) | 1 \mul | |
| Taq Polimerasa (PEC) | 0,5 \mul |
Todos los componentes, a excepción de la Taq
polimerasa, se incubaron a 95ºC durante 10 min, seguido de 50ºC
durante 10 min, y a continuación se dispuso la reacción en hielo.
Después se añadió la Taq polimerasa (Apmlitaq,
Hoffmann-La Roche, Basel, Suiza) y se realizaron 35
ciclos de PCR en un Triothermoblock (Biometra, Göttingen, Alemania)
de acuerdo con el siguiente perfil de ciclado:
\newpage
- 95ºC/60 s
- 50ºC/90 s
- 72ºC/120 s
Se analizó una alícuota de la reacción en gel de
agarosa al 1,5%.
Ejemplo
4
Los productos de PCR del tamaño esperado
(aproximadamente 146 pb predichas a partir de la secuencia del DNA
de Aspergillus niger) se extrajeron a partir de agarosa de
bajo punto de fusión y se purificaron en una columna
NACS-PREPAC (BRL Life Technologies Inc.,
Gaithersburg, MD, EE. UU.) básicamente según el protocolo del
fabricante. El fragmento se poliadeniló en 50 \mul de cacodilato
sódico 100 mM pH 6,6; Tris/HCl 12,5 mM pH 7,0; Ditiotreitol 0,1 mM;
125 \mug/ml de albúmina sérica bovina; CoCl2 1 mM; dATP 20 \muM
y 10 unidades de desoxitransferasa terminal (Boehriger Mannheim,
Mannheim, Alemania) durante 5 minutos a 37ºC y se clonó en el vector
p123T [Mitchell et al., PCR Meth. App. 2,
81-82 (1992)].
De manera alternativa, se purificaron y clonaron
fragmentos de PCR utilizando el equipo de ligación "Sure
Clone" (Pharmacia) siguiendo las instrucciones del
fabricante.
La secuenciación se llevó a cabo con DNA
bicatenario purificado en una columna Quiagen (Diagen GmbH, Hilden,
Alemania) siguiendo el método didesoxi y utilizando el equipo
Pharmacia T7 (Pharmacia, LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia) de
acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante.
Ejemplo
5
Los fragmentos provenientes de Aspergillus
terreus cepa 9A-1 y de Myceliophthora
thermophila se utilizaron como sondas para "southerns" de
BamHI y BgIII con el fin de determinar la enzima de restricción
adecuada para construir genotecas en el vector Lambda Fix II
(Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.). Lambda Fix II solo puede
aceptar insertos de 9 a 23 kb. Las transferencias Southern se
realizaron de acuerdo al siguiente protocolo que sigue. Se digirió
DNA genómico (10 \mug) en un volumen final de 200 \mul. Se
preparó la reacción sin enzima y se incubó en hielo durante 2
horas. Se añadió la enzima (50 unidades) y se incubó la reacción a
la temperatura apropiada durante 3 horas. A continuación se extrajo
la reacción con un volumen igual de fenol/cloroformo y se precipitó
con etanol. El DNA resuspendido en tampón de carga se calentó hasta
65ºC durante 15 min previamente a la separación sobre un gel de
agarosa al 0,7% (durante toda la noche, 30 V). El gel, antes de la
transferencia, se lavó dos veces en HCl 0,2 M durante 10 min a
temperatura ambiente (TA) y entonces dos veces en NaCl 1M/NaOH 0,4
M durante 15 min a TA. El DNA se transfirió en NaOH 0,4 M en una
transferencia por capilaridad durante 4 horas a una membrana de
nylon Nytran 13 N (Schlicher and Schuell AG, Feldbach, Zurich,
Suiza). Después de la transferencia, la membrana se expuso a
radiación UV [Auto cross-link, UV Stratalinker 2400,
Stratagene (La Jolla, CA, EE. UU.)].
La membrana se prehibridó en tampón de
hibridación [formamida al 50%, dodecilsulfato sódico (SDS) al 1%,
dextranosulfato al 10%, 4 x SSPE (NaCl 180 mM, NaH_{2}PO_{4} 10
mM, EDTA 1mM, pH 7,4)] durante 4 horas a 42ºC y, después de la
adición de la sonda desnaturalizada, durante toda la noche a 42ºC.
El blot se lavó:
- 1 x SSPE/SDS 0,5%/TA/30 minutos
- 0,1 x SSPE/SDS 0,1%/TA/30 minutos
- 0,1 x SSPE/SDS 0,1%/65ºC/30 minutos
Los resultados indican que el DNA genómico de
Aspergillus terreus cepa 9A-1 digerido con
BamHI y el DNA genómico de Myceliophthora thermophila
digerido con BgIII producen fragmentos adecuados para su clonación
en el vector Lambda Fix II.
La construcción de genotecas de Aspergillus
terreus cepa 9A-1 y Myceliophthora
thermophila en Lambda Fix II se realizó siguiendo los
protocolos del fabricante (Stratagene).
Las genotecas de Lambda se dispusieron en 10
placas de 137 mm para cada genoteca. Las calvas se colocaron sobre
filtros redondos Nytran 13 N y se trataron durante 1 minuto con NaOH
0,5 M/NaCl 1,5 M seguido de 15 minutos con Tris-HCl
0,5 M pH 8,0/NaCl 1,5 M. Después se trataron los filtros con 2 x SSC
durante 5 minutos y se secaron mediante aire. A continuación se
fijaron con radiación UV (1 min, UV Stratalinker 2400, Stratagene).
Los filtros se hibridaron y se lavaron de igual forma a la antes
descrita. Las calvas positivas putativas se recortaron y el fago
extraído en tampón SM (NaCl 180 mM, MgSO_{4}·7H_{2}O 8mM,
Tris/HCl 20 mM pH 7,5, gelatina al 0,01%). Esta reserva se diluyó y
se dispuso en placas de 137 mm. Los filtros duplicados se colocaron
sobre filtros y se trataron del mismo modo que en el paso anterior.
Se tomó una única calva positiva clara de cada placa y se diluyó en
tampón SM. Se tomaron tres calvas positivas: dos de Aspergillus
terreus cepa 9A-1 (9A1\lambda17 y
9A1\lambda22) y una de Myceliophthora thermophila
(MT\lambda27).
Ejemplo
6
El DNA Lambda se preparó a partir de las placas
positivas. Esto se realizó utilizando el sistema "Magic Lambda
Prep" (Promega Corp., Madison, WI, EE. UU.) de acuerdo con las
especificaciones del fabricante. Para confirmar la identidad de los
clones, el DNA Lambda se digirió con PstI y SaII y el blot
resultante se sondó con los productos de PCR. En todos los casos,
con esto se confirmó que los clones contenían secuencias
complementarias a la sonda.
Ejemplo
7
Se digirió DNA de 9A1\lambda17 con PstI y la
mezcla resultante de fragmentos se ligó en un pBluescript II SK+
(Stratagene) escindido con PstI y tratado con fosfatasa alcalina de
gamba (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH, EE. UU.). La
ligación duró toda la noche a 16ºC. La mezcla de ligación se
transformó dentro de células XL-1 Blue
Supercompetent (Stratagene) y se dispusieron en placas LB que
contenían
isopropil-\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) 0,5 mM, 40 \mug/ml de
5-bromo-4-cloro-3-idoil-\beta-D-galactopiranosido
(XgaI) y 50 \mug/ml de ampicilina.
Se digirió DNA de 9A\lambda17 con Bgl II y Xba
I y la mezcla resultante se ligó en un pBluescript II SK+ digerido
con BamHI/Xba I. La ligación, transformación y el cribado se
realizaron del modo descrito anteriormente.
Se digirió DNA de MT\lambda27 con SaII y la
mezcla resultante de fragmentos se ligó en un pBluescript II SK+
escindido con SaII y tratado con fosfatasa alcalina de gamba. La
ligación duró toda la noche a 16ºC. La mezcla de ligación se
transformó a células XL-1 Blue Supercompetent
(Stratagene) y estas se dispusieron en placas LB que contenían
XgaI/TPTG y ampicilina.
Se escogieron colonias de las transformaciones
anteriores y se distribuyeron de forma uniforme aproximadamente 75
en una placa. Tras toda la noche de incubación a 37ºC las colonias
se elevaron a un filtro de nylon ("Hybond-N",
Amersham Corp., Arlington Heights, IL, USA) y los filtros se
trataron con NaOH 0,5 M durante 3 minutos, Tris/HCl 1 M pH 7,5 dos
veces durante 1 minuto, luego Tris/HCl 0,5 M pH 7,5/NaCl 1,5 M
durante 5 minutos. Los filtros se secaron al aire y luego se
fijaron con radiación UV (2 minutos, UV Stratalinker 2400,
Stratagene). Los filtros se hibridaron con los productos de PCR del
Ejemplo 5. Se seleccionaron colonias positivas y se preparó DNA.
Los subclones se secuenciaron del modo descrito previamente en el
Ejemplo 4. Las secuencias determinadas se muestran en la Figura 1
(Fig. 1) en el caso de la fitasa proveniente de la cepa 9A1 de
Aspergillus terreus y su secuencia de DNA codificante, en la
Figura 2 en el caso de la fitasa procedente de Myceliophthora
thermophila y su secuencia de DNA codificante. La Figura 3A
muestra un mapa de restricción para el DNA de Aspergillus terreus
(donde la flecha indica la región codificante y las rayas las
regiones secuenciadas además de la región codificante) y la 3B
muestra uno para M. thermophila. En la Figura 4 se muestran
las secuencias determinadas en el caso de parte de la fitasa de
Talaromyces thermophilus y su secuencia de DNA codificante,
en la figura 5 las correspondientes a parte de la fitasa de
Aspergillus fumigatus y su secuencia de DNA codificante y en la
Figura 6 las correspondientes a parte de la fitasa de Aspergillus
nidulans y su secuencia de DNA codificante. Las secuencias para
las partes de las fitasas y sus secuencias de DNA codificante
correspondientes a Talaromyces thermophilus, Aspergillus
fumigatus y Aspergillus nidulans se obtuvieron del mismo
modo en que se ha descrito para los casos de la cepa 9A1 de
Aspergillus terreus y Myceliophthora thermophila en
los Ejemplos 2-7. Se presentan bases para ambas
cadenas en minúsculas mediante las abreviaciones del código
normalmente utilizado de una letra. Las secuencias aminoacídicas de
la fitasa derivadas se proporcionan en letras mayúsculas, siguiendo
el código de una letra normalmente utilizado, bajo la secuencia de
DNA correspondiente.
Ejemplo
8
Todas las construcciones se realizaron
utilizando procedimientos estándar de biología molecular como los
descritos por Sambrook et al., (1989) (Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY).
Los primeros 46 aminoácidos (aa) de la fitasa de
Aspergillus niger, como se describe en la PE 420 358, se
fusionaron con el aminoácido 320 del extremo C terminal del gen de
Aspergillus terreus 9A1. Cuando se clonó el gen de la fitasa
de A. niger mediante PCR, se introdujo un sitio NcoI en el
codón de inicio ATG. El intrón hallado en la fitasa de A.
niger se eliminó mediante mutagénesis dirigida
(Bio-Rad kit, Núm. de Cat.
170-3581; Bio-Rad, Richmond, CA, EE.
UU.) utilizando el siguiente cebador (en el que la raya vertical
indica que la secuencia a su izquierda hibrida con el extremo 3' del
primer exón y a su derecha con el extremo 5' del segundo exón):
\newpage
| 5'-AGTCCGGAGGTGACT \hskip0.3cm | \hskip0.3cm CCAGCTAGGAGATAC-3' | [ID. de SEC. Núm.: 21]. |
Para fabricar el constructo quimérico de las
fitasas de A. niger y A. terreus se introdujo un sitio
Eco 47III en la secuencia codificante de A. niger para
facilitar la clonación. Se utilizó una PCR con un cebador
mutagénico (5' CGA TTC GTA GCG CTG GTA G 3') junto con el cebador T3
para producir un fragmento de DNA que se escindió con Bam HI y Eco
47III. El fragmento Bam HI/Eco 47III se insertó en el p9A1Pst
cortado con Bam HI/Eco 47III (Ejemplo 7). La Figura 7 muestra la
secuencia aminoacídica del constructo de fusión y su secuencia de
DNA codificante.
Ejemplo
9
Para la expresión del constructo de fusión en
A. niger, se escogió un casete de expresión en el que el gen
de fusión se encontraba bajo el control del promotor inducible de la
glucoamilasa de A. niger (glaA).
Se crearon casetes de expresión con el promotor
constitutivo de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpdA) de A. nidulans para el gen
completo de A. terreus 9A1.
Todos los genes utilizados para la expresión en
A. niger llevaban su propia secuencia de señales para la
secreción.
El promotor de la glucoamilasa de A.
niger (glaA) se aisló como un fragmento XhoI/ClaI de 1960
pb a partir del plásmido pDH33 [Smith et al. (1990), Gene
88: 259-262] y se clonó en un vector pBluescriptSK+
(pBS) [Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.] que contenía el fragmento
BamHI/XbaI de 710 pb del terminador trpC de A.
nidulans. Al plásmido con el casete se le denominó pGLAC. El gen
de fusión, como se describe en el Ejemplo 8, se colocó bajo el
control del promotor de glaA de A. niger mediante la ligación
del fragmento NcoI/EcoRI de extremo romo con el sitio ClaI de
extremo romo y el sitio EcoRV del plásmido pGLAC. Se verificó la
orientación correcta mediante productos de digestión de enzimas de
restricción. Se transfirió el casete completo como un fragmento
KpnI/XbaI a pUC19 (New England Biolabs, Gmbh, Schwalbach, BRD), que
llevaba el gen pyr4 de Neurospora crassa
(pUC19-pyr4), un marcador de selección en Aspergilli
auxotróficos para uridina, dando lugar al vector pFPAN1 (véase la
figura 8 con los sitios de restricción y las regiones codificantes
como se ha indicado; los sitios de restricción tachados indican
sitios con ligación de extremos romos).
El promotor de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (gpdA) de A. nidulans se aisló en forma
de un fragmento EcoRI/NcoI de \sim2,3 kb a partir del plásmido
pAN52-1 [Punt et al. (1987), Gene 56:
117-124], se clonó en pUC19-NcoI
(pUC19 que presentaba un sitio SmaI sustituido por uno para NcoI),
se reaisló como un fragmento EcoRI/BamHI y se clonó en pBS con el
terminador trpC como se ha descrito anteriormente. El casete
obtenido se denominó pGPDN. El gen de A. terreus se aisló en
forma de fragmento NcoI/EcoRI, en el que el sitio EcoRI se rellenó
para crear extremos romos. El plásmido pGPDN se escindió con BamHI y
NcoI. El sitio BamHI se rellenó para crear extremos romos. El
fragmento (romo) NcoI/EcoRI del gen de A. terreus se clonó
entre el promotor gpdA y el terminador trpC. El casete
de expresión se aisló en forma de fragmento KpnI/XbaI y se clonó en
pUC19-pyr4 dando lugar al plásmido pPAT1 (véase la Figura 9;
para una explicación de las abreviaciones véase la leyenda de la
Figura 8).
Se utilizó el plásmido pFPAN1 para transformar
A. niger utilizando el protocolo de transformación que
describe Ballance et al. [(1983), Biochem. Biophys. Res.
Commun. 112, 284-289] con algunas
modificaciones:
- Se inoculó medio YPD (extracto de levadura al
1%, peptona al 2%, dextrosa al 2%) con 10^{6} esporas por ml y se
cultivaron las esporas durante 24 horas a 30ºC y 250 rpm.
- Se recogieron células utilizando tejido N
Wero-Lene (Núm. 8011.0600 Wernli AG
Verbandstoffabrik, 4852 Rothrist, Suiza) y se lavaron una vez con
tampón (KCl 0,8 M y CaCl_{2} 0,05 M en tampón succinato 0,01 M; pH
5,5).
- Para la preparación de protoplastos solamente
se utilizaron enzimas de lisis (SIGMA L-2265, St.
Louis, MO, EE. UU.).
- Las células se incubaron durante 90 min a 30ºC
y 100 rpm, y los protoplastos se separaron mediante filtración
(tejido N Wero-Lene).
\newpage
- Los protoplastos se lavaron una vez con STC
(sorbitol 1 M, CaCl_{2} 0,05 M, Tris/HCl 0,01 M pH 7,5) y se
resuspendieron en el mismo tampón.
- Se mezclaron suavemente 150 \mul de
protoplastos (~10^{8}/ml) con 10-15 \mug de DNA
plasmídico y se incubó la mezcla a temperatura ambiente (TA)
durante 25 min.
- Se añadió polietilenglicol (PEG 4000 al 60%,
CaCl_{2} 50 mM, Tris/HCl 10 mM pH 7,5) en tres pasos: 150
\mul, 200 \mul y 900 \mul, y se continuó incubando la muestra
a temperatura ambiente (TA) durante 25 min.
- Se añadieron 5 ml de STC, se centrifugó y los
protoplastos se resuspendieron en 2,5 ml de YGS (extracto de
levadura al 0,5%, glucosa al 2%, sorbitol 1,2 M).
- La muestra se incubó durante 2 horas a 30ºC
(100 rpm), se centrifugó y se resuspendieron los protoplastos en 1
ml de sorbitol 1,2 M.
- Los protoplastos transformados se mezclaron
con 20 ml de medio de regeneración mínima (bases nitrogenadas sin
aminoácidos de levaduras al 0,7%, glucosa al 2 5, sorbitol 1 M, agar
al 1,5%, Tris/HCl 20 mM pH 7,5 complementado con 0,2 g de arginina
y 10 mg de nicotinamida por litro).
- Las placas se incubaron a 30ºC durante
3-5 días.
Se aislaron transformantes individuales, se
purificaron y se probaron para la sobreproducción de la proteína de
fusión. Se inocularon 100 ml de medio M25 [70 g de maltodextrina
(Glucidex 17D, Sugro Basel, Suiza), 12,5 g de extracto de levadura,
25 g de hidrolizado de caseína , 2 g de KH_{2}PO_{4}, 2 g de
K_{2}SO_{4}, 0,5 g de MgSO_{4}·7H_{2}O, 0,03 g de
ZnCl_{2}, 0,02 g de CaCl_{2}, 0,05 g de MnSO_{4}·4H_{2}O,
0,05 g de FeSO_{4} por litro pH 5,6] con 106 esporas por ml de los
transformantes FPAN1#11, #13, #16, #E25, #E30 y #E31,
respectivamente, y se incubaron durante 5 días a 30ºC y 270 rpm. Se
recogió el sobrenadante y se determinó la actividad. La proteína de
fusión mostró la actividad más elevada con ácido fítico como
sustrato a pH 2,5, mientras que con
4-nitrofenilfosfato como sustrato mostró dos óptimos
de actividad a pH 2,5 y 5,0 (Tabla 1).
Una reacción enzimática de 1 ml contenía 0,5 ml
de sobrenadante dializado (diluido en caso necesario) y ácido
fítico 5,4 mM (SIGMA P-3168). Las reacciones
enzimáticas se realizaron en tampón de acetato sódico 0,2 M pH 5,0
y en tampón de glicina 0,2 M pH 2,5; respectivamente. Las muestras
se incubaron durante 15 min a 37ºC. Las reacciones se
interrumpieron añadiendo 1 ml de TCA (ácido tricloroacético) al
15%.
Para la reacción de color, se diluyeron 0,1 ml
de la muestra previamente interrumpida con 0,9 ml de agua destilada
mezclada con 1 ml de solución de reactivo (3 volúmenes de
H_{2}SO_{4} 1 M, 1 volumen de
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}, 1 volumen de ácido
ascórbico al 10%). Las muestras se incubaron durante 20 min a 50ºC y
se midió el color azul por espectrofotometría a 820 nm. Dado que el
ensayo está basado en la liberación de fosfato, se utilizó una
curva estándar de fosfato, 11-45 nmol por ml, para
determinar la actividad de las muestras.
Una reacción enzimática de 1 ml contenía 100
\mul de sobrenadante dializado (diluido en caso necesario) y
4-nitrofenilfosfato 1,7 mM (Merck, 6850, Darmstad,
BRD). Las reacciones enzimáticas se realizaron en tampón de acetato
sódico 0,2 M pH 5,0 y en tampón de glicina 0,2 M pH 2,5;
respectivamente. Las muestras se incubaron durante 15 min a 37ºC.
Las reacciones se interrumpieron añadiendo 1 ml de TCA al 15%.
Para la determinación de la actividad enzimática
se utilizó el protocolo anteriormente descrito.
Se transformó A. niger NW205 con el
plásmido pPAT1 de la manera descrita anteriormente. Se aislaron
transformantes individuales, se purificaron y se cribaron en busca
de sobreproducción de la proteína de A. terreus. Se
inocularon 50 ml de medio YPD con 106 esporas por ml a partir de los
transformantes PAT1 #3, #10, #11, #13 y #16 y se incubaron durante
3 días a 30ºC y 270 rpm. Se recogió el sobrenadante y se determinó
la actividad de la manera antes descrita con la excepción de que
los pH de las reacciones enzimáticas fueron diferentes. La enzima
mostró su actividad principal a pH 5,5 con ácido fítico como
sustrato y a pH 3,5 con 4-nitrofenilfosfato como
sustrato
(Tabla 2).
(Tabla 2).
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Ejemplo
10
Se inoculó medio de precultivo [30 g de
maltodextrina (Glicidex 17D), 5 g de extracto de levadura, 10 g de
hidrolizado de caseína, 1 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de
MgSO_{4}·7H_{2}O, 3 g de Tween 80 por litro; pH 5,5] con
10^{6} esporas por ml en un frasco de agitación y se incubó
durante 24 horas a 34ºC y 250 rpm.
Se inoculó un fermentador de 10 l con el
precultivo a una dilución final del precultivo de 1:100. La
fermentación discontinua se llevó a cabo a 30ºC con una
concentración de oxígeno disuelto controlada de forma automática de
un mínimo del 25% (pO_{2} \geq 25%). El pH se mantuvo a 3,0
mediante titulación automática con NaOH 5 M.
El medio utilizado para la fermentación
consistía en: 35 g de maltodextrina, 9,4 g de extracto de levadura,
18,7 g de hidrolizado de caseína, 2 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de
MgSO_{4}·7H_{2}O, 2 g de K_{2}SO4, 0,03 g de ZnCl_{2},
0,02 g de CaCl_{2}, 0,05 g de MnSO_{4}·4H_{2}O, 0,05 g de
FeSO_{4} por litro; pH 5,6.
Después de tres días bajo estas condiciones las
actividades enzimáticas alcanzadas fueron de 35 unidades/ml y 16
unidades/ml a pH 2,5 y 5,0, respectivamente, con ácido fítico como
sustrato y de 295 unidades/ml y 90 unidades/ml a pH 2,5 y 5,0,
respectivamente, con 4-nitrofenilfosfato como
sustrato.
El precultivo, la inoculación del fermentador y
el medio de fermentación eran iguales que los descritos en el punto
anterior, excepto por el hecho de que el pH se mantuvo a 4,5
mediante titulación automática con NaOH 5 M.
Las actividades enzimáticas alcanzadas tras 4
días bajo estas condiciones fueron de 17,5 unidades/ml a pH 5,5 con
ácido fítico como sustrato y de 2 unidades/ml a pH 3,5 con
4-nitrofenilfosfato como sustrato.
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Ejemplo
11
Se utilizaron dos pares diferentes de cebadores
para la amplificación por PCR de fragmentos utilizando DNA de
Aspergillus terreus [CBS 220.95]. Los cebadores utilizados se
muestran en la tabla que aparece a continuación.
Las secuencias de DNA en negrita muestran el
cebador directo y las que están en cursiva el cebador antisentido.
Los cebadores corresponden a la parte indicada de la secuencia
codificadora del gen de Aspergillus niger. Las combinaciones
utilizadas son los cebadores 8 y 9 y los 10 y 11. Se utilizó el
equipo de anticuerpo Taq-Start de Clontech (Palo
alto, CA, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las
concentraciones de cebador para 8 y 9 fueron de 0,2 mM y para los
10 y 11 uno mM. Para la amplificación se utilizó la técnica de PCR
denominada "Touchdown" [Don, R. H. et al. (1991),
Nucleic Acids Res. 19, 4008]. En primer lugar se desnaturalizó el
DNA durante 3 min a 95ºC. A continuación se realizaron dos ciclos a
cada una de las temperaturas de hibridación: 60ºC, 59ºC, 58ºC,
57ºC, 56ºC, 55ºC, 54ºC, 53ºC, 52ºC y 51ºC, con un tiempo de
hibridación de un minuto cada una. Previamente a la hibridación, la
incubación se calentó hasta 95ºC durante un minuto y, tras la
hibridación, se llevó a cabo la elongación durante 30 s a 72ºC. Los
ciclos 21 y 35 se realizaron de la siguiente forma:
desnaturalización un min a 95ºC, hibridación un min a 50ºC y
elongación durante 30 s a 72ºC.
Se obtuvieron dos fragmentos de PCR diferentes.
Las secuencias de DNA obtenidas y su comparación con partes
relevantes del gen de la fitasa de Aspergillus terreus 9A1 se
muestran en la Figura 10 [partes relevantes del gen de la fitasa de
Aspergillus terreus 9A1 "9A1" (líneas superiores) (1) y
los fragmentos de PCR de Aspergillus terreus CBS 220.95
"aterr21" (líneas inferiores). Panel A: Fragmento obtenido con
el par de cebadores 8 y 9 (aterr21). Panel B: Fragmento obtenido
con el par de cebadores 10 y 11 (aterr58). Las secuencias de DNA de
Aspergillus terreus CBS 220.95 (líneas superiores) se
comparan con aquellas de Aspergillus terreus 9A1 (1) (líneas
inferiores). Panel A: cabe la posibilidad que la secuencia gc en
negrita (bases 16 y 17) del fragmento aterr21 sea cg (incertidumbre
de la secuenciación de DNA). Panel B: la x en posición 26 del
fragmento de PCR aterr58 podría representar cualquiera de los cuatro
nucleótidos].
Ejemplo
12
Se incubaron 5 \mug de DNA genómico de cada
cepa incluida en la Tabla 3 con 4 unidades de HindIII o
PstI, respectivamente, por \mug de DNA a 37ºC durante 4
horas. Después de la digestión, las mezclas se extrajeron con fenol
y los DNA se hicieron precipitaron con etanol. Las muestras se
analizaron sobre geles de agarosa al 0,8%. Los DNA se transfirieron
a membranas Nytran (Schleicher & Shuell, Keene, NH, EE. UU.)
utilizando NaOH 0,4 M que contenía NaCl 1M como solución de
transferencia. Las hibridaciones se realizaron durante 18 horas a
42ºC. La solución de hibridación contenía formamida al 50%, SDS al
1%, dextrán sulfato al 10%, 4 x SSPE (1 x SSPE = NaCl 0,18 M, EDTA
1mM, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, pH 7,4), blotto 0,5% (leche en polvo
disuelta en agua) y 0,5 mg de DNA de esperma de salmón por ml. Las
membranas se lavaron bajo condiciones no astringentes utilizando a
modo de condición de lavado última y más astringente una incubación
durante 30 min a temperatura ambiente en 0,1 x SSPE que contenía
SDS al 0,1%. Las sondas utilizadas (marcadas a una actividad
específica de cerca de 10^{9} dpm/\mug de DNA) fueron los
fragmentos de PCR generados con los cebadores 8 y 9 (véase el
Ejemplo 11) utilizando DNA genómico de Myceliophtora
thermophila, Mycelio. thermo.; Aspergillus
nidulans, Asperg. nidul.; Aspergillus fumigatus,
Asperg. fumig.; Aspergillus terreus 9A1, Asperg.
terreus9A1; Talaromyces thermophilus, Talarom.
thermo. La sonda genómica MT2 se obtuvo mediante cebado
aleatorio (según el protocolo proporcionado por Pharmacia, Uppsala,
Suecia) y abarca 1410 pb, desde el sitio BspEI en dirección 5'
respecto del extremo N-terminal del gen de la fitasa
de Mycelio. thermo. hasta el sitio PvuII en el extremo
C-terminal (posiciones 2068 a 3478). La sonda
genómica AT2 se obtuvo mediante cebado aleatorio y abarca 1365 pb,
desde el sitio ApaI hasta el sitio NdeI del gen de la fitasa de
Asperg. terreus9A1 (posiciones 491 a 1856). La sonda de DNA
AN2 se obtuvo mediante cebado aleatorio y abarca la secuencia
codificadora completa (1404 pb) del gen de Asperg. niger (PE
420 358). Los resultados aparecen en la Tabla 3.
[^{"\text{*}"} excepto señal débil correspondiente a un
fragmento inespecífico de 20 kb; en el caso de la señal de
hibridación cruzada muy débil en 20 kb encontrada con DNA de
Aspergillus niger utilizando el fragmento de PCR de
Talaromyces thermophilus, esta señal es inespecífica puesto
que difiere de forma significativa del fragmento esperado de
HindIII de 10 kb, que contiene el gen de la fitasa;
^{"\text{**}"} señal debida a una digestión solamente
parcial de
DNA].
DNA].
En el caso de las hibridaciones cruzadas en
condiciones de lavado astringentes las membranas se lavaron también
durante 30 min a 65ºC en 0,1 x SSPE que contenía SDS al 0,1%. Los
resultados se muestran en la Tabla 4 [(1) se detecta todavía
solamente el fragmento HindIII de 10,5 kb; el fragmento
HindIII de 6,5 kb ha desparecido (véase la tabla 3)].
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(Tabla pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Grenzacherstrasse 124
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Basle
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: BS
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Suiza
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): CH-4002
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 061 - 688 25 05
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 061 - 688 13 95
\vskip0.800000\baselineskip
- (I)
- TELEX: 962292/965542 hir ch
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptidos con actividad fitasa
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 21
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: Apple Macintosh
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: System 7.1 (Macintosh)
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Word 5.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS PREVIOS A LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PE 94810228.0
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO: 25 de abril de 1994
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2327 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: join (374..420, 469..1819)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 466 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3995 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: join (2208..2263, 2321..3725)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2)INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 487 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 2..100
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Leu Ala Arg Asn His Thr Asp Thr Leu Ser
Pro Phe Cys Ala Leu}
\sac{Ser Thr Gin Glu Trp Glin Ala Tyr Asp Tyr
Gin Ser Leu Gly}
\sac{Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 106 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 2..106
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Ala Arg Thr Ser Asp Ala Ser Gln Leu
Ser Pro Phe Cys Gln}
\sac{Leu Phe Thr His Asn Glu Trp Lys Lys Tyr
Asn Tyr Leu Gln Ser Leu}
\sac{Gly Lys Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 109 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 2..109
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Met Ala Arg Thr Ala Thr Arg Asn Arg Ser
Leu Ser Pro Phe Cys}
\sac{Ala Ile Phe Thr Glu Lys Glu Trp Leu Gln
Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser}
\sac{Leu Ser Lys Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1912 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..1396
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE / CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- SITUACIÓN: 1..1398
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 466 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 112 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 91 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGAYATGT GYTCNTTYGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ÚNICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTRCCRGCR CRTGNCCRTA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAYGCNGAYT TYTCNCAYGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGRTCRTTNA CNAGNACNC
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATGGAYATGT GYTCNTTYGA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTRCCRGCRC CRTGNCCRTA
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA EL ID. DE SEC. NÚM.:
21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 30 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID. DE SEC. NÚM.: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTCCGGAGG TGACTCCAGC TAGGAGATAC
\hfill30
Claims (15)
1. Una secuencia de DNA que codifique un
polipéptido que presenta una actividad fitasa termotolerante con un
actividad máxima alrededor de un pH 5,5, siendo una secuencia de DNA
procedente de un hongo seleccionado del grupo formado por
Aspergillus terreus, Myceliophthora thermophila,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus nidulans y Talaromyces
thermophilus; secuencia de DNA seleccionada a partir de las
siguientes:
(a1) La secuencia de DNA de la Figura 1 [ID. de
SEC. Núm.: 1] o su cadena complementaria;
(a2) La secuencia de DNA de la Figura 2 [ID. de
SEC. Núm.: 3] o su cadena complementaria;
(a3) Una secuencia de DNA que contiene una de
las secuencias de DNA de las figuras 4 [ID. de SEC. Núm.: 5], 5 [ID.
de SEC. Núm.: 7], 6 [ID. de SEC. Núm.: 9] o 10 [ID. de SEC. Núm.:
13] o [ID. de SEC. Núm.: 14] o su cadena complementaria;
\vskip1.000000\baselineskip
(b) Una secuencia de DNA que hibrida bajo
condiciones estándar con las secuencias definidas en los
puntos
(a1 a a3);
(a1 a a3);
(c) Una secuencia de DNA que, debido a la
degeneración del código genético, no hibrida con las secuencias
definidas en los puntos (a1 a a3) o (b), pero que codifica
polipéptidos con exactamente las mismas secuencias aminoacídicas que
los polipéptidos codificados por estas secuencias de DNA; y
(d) Una secuencia de DNA que es un fragmento de
las secuencias de DNA especificadas en (a1 a a3), (b),
o (c).
o (c).
2. Una secuencia de DNA de acuerdo con la
reivindicación 1 que es seleccionada de una secuencia de DNA que
contiene la secuencia de DNA de la Figura 4 [ID. de SEC. Núm.: 5]
aislable a partir de Talaromyces thermophilus, de la Figura 5
[ID. de SEC. Núm.: 7] aislable a partir de Aspergillus
fumigatus, de la Figura 6 [ID. de SEC. Núm.: 9] aislable a
partir de Aspergillus nidulans o de la Figura 10 [ID. de SEC.
Núm.: 13] o [ID. de SEC. Núm.: 14] aislable a partir de
Aspergillus terreus (CBS 220.95) o cuya secuencia de DNA es
una variante degenerada o una equivalente de la misma.
3. Una secuencia de DNA que codifica un
constructo quimérico que presenta actividad fitasa y que contiene un
fragmento de una secuencia de DNA según cualquiera de las
reivindicaciones 1 o 2.
4. Una secuencia de DNA que codifica un
constructo quimérico como el definido en la reivindicación 3 que
contiene en su extremo N-terminal un fragmento de la
fitasa de Aspergillus niger fusionado en su extremo
C-terminal con un fragmento de la fitasa de
Aspergillus terreus.
5. Una secuencia de DNA según la
reivindicación 4, que contiene la secuencia nucleotídica específica
como la mostrada en la Figura 7 [ID. de SEC. Núm.: 11], y una
variante degenerada o una equivalente de la misma.
6. Un polipéptido codificado por una
secuencia de DNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un vector que comprende una secuencia de
DNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un vector según la reivindicación 7
adecuado para la expresión de dicha secuencia de DNA en bacterias o
en una levadura u hongo huésped.
9. Bacterias, o una levadura u hongo huésped,
transformados por una secuencia de DNA según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 o un vector según la reivindicación 7 u
8.
10. Un alimento compuesto destinado a la
alimentación humana o animal que contiene uno o más polipéptidos
según la reivindicación 6.
11. Un proceso para la preparación de un
polipéptido según la reivindicación 6 caracterizado en que la
bacteria o célula huésped transformada según la reivindicación 9 se
cultiva bajo condiciones adecuadas y a partir del cual se recupera
el polipéptido.
12. Un polipéptido, cuando es producido
mediante un proceso según la reivindicación 11.
13. Un proceso para la preparación de un
alimento compuesto destinado a la alimentación humana o animal en
el que los componentes de la composición están mezclados con uno o
más polipéptidos según la reivindica-
ción 6.
ción 6.
\newpage
14. Un proceso para la reducción de los niveles
de fitato en estiércol animal, caracterizado en que se
alimenta un animal con la composición de pienso definida en la
reivindicación 10 en una cantidad efectiva para la conversión del
fitato contenido en el pienso a inositol y fosfato inorgánico.
15. La utilización de un polipéptido según la
reivindicación 6 para la conversión de fitato a inositol fosfatos,
inositol y fosfato inorgánico.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94810228 | 1994-04-25 | ||
| EP94810228 | 1994-04-25 |
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|---|---|
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ID=8218243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95105693T Expired - Lifetime ES2268687T3 (es) | 1994-04-25 | 1995-04-15 | Polipeptidos con actividad fitasa. |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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