BRPI0312771B1

BRPI0312771B1 - Métodos para reduzir silenciamento de transgene e para detectar polinucleotídeo em plantas, molécula e construto de dna, bem como kit de detecção de dna

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Publication number: BRPI0312771B1
Authority: BR
Publication date: 2018-10-02

Description

(54) Título: MÉTODOS PARA REDUZIR SILENCIAMENTO DE TRANSGENE E PARA DETECTAR

POLINUCLEOTÍDEO EM PLANTAS, MOLÉCULA E CONSTRUTO DE DNA, BEM COMO KIT DE DETECÇÃO DE DNA (73) Titular: MONSANTO TECHNOLOGY LLC, Sociedade Norte-Americana. Endereço: 800 North Lindbergh Boulevard, St. Louis, MO 63167, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: STANISLAW FLASINSKI

Código de Controle: BB86314C31EB417B C5DCAD1E72219BF9

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 02/10/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 02/10/2018

Assinado digitalmente por:

Liane Elizabeth Caldeira Lage

Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS

PARA REDUZIR SILENCIAMENTO DE TRANSGENE E PARA DETECTAR

POLINUCLEOTÍDEO EM PLANTAS, MOLÉCULA E CONSTRUTO DE

DNA, BEM COMO KIT DE DETECÇÃO DE DNA.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao engendramento genético vegetal. Mais particularmente, a um método para construir um polinucleotídeo artificial e aos métodos de uso para reduzir o silenciamento de transgene em plantas. A invenção também se refere às células vegetais contendo o polinucleotídeo artificial em que uma célula vegetal é transformada para expressar o polinucleotídeo artificial e a planta regenerada a partir deste.

Descrição da Técnica Relacionada

Os genes heterólogos podem ser isolados a partir de uma fonte outra que não a planta na qual eles serão transformados ou eles podem ser modificados ou planejados para ter qualidades diferentes ou melhoradas. Particularmente traços ou qualidades desejadas de interesse para o engendramento genético vegetal podem incluir, mas não são limitadas à resistência aos insetos, doenças fúngicas e outras pragas e agentes causadores de doença, tolerâncias aos herbicidas, estabilidade realçada ou vida de prateleira, rendimento, tolerâncias ao estresse ambiental e realces nutricionais.

Os métodos biológicos moleculares tradicionais para gerar novos genes e proteínas no geral envolveram a mutagênese aleatória ou direcionada. Um exemplo de mutagênese aleatória é uma técnica de recombinação conhecida como embaralhamento de DNA como divulgado nas Patentes US 5.605.793, 5.811.238, 5.830.721, 5.837.458 e Pedidos Internacionais WO 98/31837, WO 99/65927, a totalidade de todas as quais é aqui incorporada por referência. Um método alternativo de evolução molecular envolve um processo de extensão escalonado (StEP) para a mutagênese e recombinação in vitro de sequências de molécula de ácido nucléico, como divulgado na Patente US 5.965.408, aqui incorporada por referência. Um

lo exemplo de mutagênese direcionada é a introdução de uma mutação pontual em um sítio específico em um polipeptídeo.

Um método alternativo, útil quando o gene heterólogo é de uma fonte não-vegetal, é planejar um gene inseticida artificial que use o códon mais freqüentemente usado na tabela de uso do códon na planta do milho (Koziel et al., 1993, Biotechnology 11, 194 a 200). Fischhoff e Perlak (Patente US N⁹ 5.500.365, aqui incorporada por referência) relatam a expressão mais alta de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis (Bt) comparada em plantas de safra quando a seqüência de polinucleotídeo foi modificada para reduzir a ocorrência de seqüências desestabilizadoras. Foi necessário modificar a seqüência de polinucleotídeo de Bt do tipo selvagem porque o polinucleotídeo de Bt de comprimento natural do tipo selvagem não expressou níveis suficientes de proteína inseticida em plantas para ser agronomicamente útil.

Os genes heterólogos são clonados em vetores adequados para a transformação de planta. As técnicas de transformação e regeneração úteis para incorporar genes heterólogos em um genoma da planta são bem conhecidos na técnica. O gene pode ser depois expressado na célula vegetal para exibir a característica ou traço adicionados. Entretanto, os genes heterólogos que normalmente expressam bem como transgenes podem experimentar o silenciamento de gene quando mais do que uma cópia dos mesmos genes é expressada na mesma planta. Isto pode ocorrer quando um primeiro gene heterólogo é muito similar a uma seqüência de DNA de gene endógeno na planta. Outros exemplos incluem quando uma planta transgênica é subseqüentemente cruzada com outras plantas transgênicas tendo os mesmos transgenes ou similares ou quando a planta transgênica é retransformada com um cassete de expressão vegetal que contém o mesmo gene ou similar. Similarmente, o silenciamento de gene pode ocorrer se a implantação de traços utilizam os mesmos elementos genéticos usados para direcionar a expressão do gene transgênico de interesse. De modo a implantar traços, linhagens transgênicas estáveis devem ser feitas com combinações diferentes de genes e elementos genéticos para evitar o silencia3 mento de gene.

A N-fosfonometilglicina, também conhecida como glifosato, é um herbicida bem conhecido que tem atividade em um amplo espectro de espécies vegetais. O glifosato é o ingrediente ativo do Roundup® (Monsanto Co.), um herbicida seguro tendo uma meia-vida desejavelmente curta no ambiente. Quando aplicado a uma superfície vegetal, o glifosato move-se sistemicamente através da planta. O glifosato é fitotóxico devido à sua inibição do caminho do ácido chiquímico, que fornece um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. O glifosato inibe a enzima 5-enolpiruvil-3fosfochiquimato sintase (EPSPS).

A tolerância ao glifosato também pode ser obtida pela expressão de variantes de EPSPS que têm afinidade mais baixa ao glifosato e portanto retêm a sua atividade catalítica na presença de glifosato (Patente U.S. N^p5.633.435, aqui incorporada por referência). As enzimas que degradam glifosato em tecidos vegetais (Patente U.S. N^s 5.463.175) também são capazes de conferir tolerância celular ao glifosato. Tais genes são usados para a produção de safras transgênicas que são tolerantes ao glifosato, permitindo deste modo que o glifosato seja usado para o controle eficaz de ervadaninha com preocupação mínima de dano de safra. Por exemplo, a tolerância ao glifosato foi geneticamente engendrada no milho (Patente U.S. N^e5.554.798), trigo (Pedido de Patente U.S. N^Q 20020062503), soja (Pedido de Patente U.S. N^e 20020157139) e canola (WO 9204449), todas as quais são incorporadas por referência. Os transgenes para a tolerância ao glifosato e os transgenes para a tolerância a outros herbicidas, por exemplo, o gene bar, (Toki et al. Plant Physiol., 100: 1503 a 1507, 1992; Thompson ef al. EMBO J. 6: 2519 a 2523, 1987, fosfinothricin acetyltransferase, BAR gene isolated from Streptomyces; DeBlock et al. EMBO J., 6:2513-2522, 1987, glufosinate herbicide) também são úteis como marcadores selecionáveis ou marcadores registráveis e podem fornecer um fenótipo útil para a seleção de plantas ligadas com outros traços agronomicamente úteis.

O que é necessário na técnica são métodos de planejar genes para a expressão em plantas para melhorar traços agronomicamente úteis «· ········

J-Λ que evitem o silenciamento de gene quando cópias múltiplas são inseridas e a recombinação com genes vegetais endógenos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Comparação acumulada das mudanças das sequências de polinucleotídeo de duas versões da EPSPS de arroz artificial (OsEPSPS_AT, OsEPSPS_ZM) e uma EPSPS de arroz nativa (OsEPSPS_Nat) o polipeptídeo de cada uma modificado para ser resistente ao glifosato.

Figura 2. Comparação acumulada das seqüências de polinucleotídeo de uma EPSPS de milho nativa (ZmEPSPS_Nat) e uma artificial (ZmEPSPS_ZM) o polipeptídeo de cada uma modificado para ser resistente ao glifosato.

Figura 3. Comparação acumulada das seqüências de polinucleotídeo de uma EPSPS de soja nativa (GmEPSPS_Nat) e uma versão artificial (GmEPSPS_GM) o polipeptídeo de cada uma modificado para ser resistente ao glifosato.

Figura 4. Comparação acumulada das seqüências de polinucleotídeo de um gene BAR nativo (BAR1_Nat) e duas versões artificiais com códon de eleição de Zea mays (BAR1_ZM) e Arabidopsis thaliana (BAR1_AT).

Figura 5. Comparação acumulada das seqüências de polinucleotídeo de CTP2 e CP4EPSPS nativas (CTP2CP4_Nat) e versões artificiais (CTP2CP4_AT, CTP2CP4_ZM e CTP2CP4_GM).

Figura 6. Mapa plasmídico de pMON54949.

Figura 7. Mapa plasmídico de pMON54950.

Figura 8. Mapa plasmídico de pMON30151.

Figura 9. Mapa plasmídico de pMON59302.

Figura 10. Mapa plasmídico de pMON59307.

Figura 11. Mapa plasmídico de pMON42411.

Figura 12. Mapa plasmídico de pMON58400.

Figura 13. Mapa plasmídico de pMON58401.

Figura 14. Mapa plasmídico de pMON54964.

1.3

Figura 15. Mapa plasmídico de pMON25455.

Figura 16. Mapa plasmídico de pMON30152.

Figura 17. Mapa plasmídico de pMON54992.

Figura 18. Mapa plasmídico de pMON54985.

Figura 19. Mapa plasmídico de pMON20999.

Figura 20. Mapa plasmídico de pMON45313.

Figura 21. Mapa plasmídico de pMON59308.

Figura 22. Mapa plasmídico de pMON59309.

Figura 23. Mapa plasmídico de pMON59313.

Figura 24. Mapa plasmídico de pMON59396.

Figura 25. Mapa plasmídico de pMON25496.

BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA SEQ ID NO: 1 OsEPSPS_TIPS Uma seqüência de proteína de

EPSPS de arroz modificada para ser resistente ao glifosato, com peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo de EPSPS nativa do arroz modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo de EPSPS de arroz artificial usando a tabela de uso do códon de Arabidopsis e os métodos da presente invenção e ainda modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

SEQIDNO: 2 OsEPSPS Nat

SEQ ID NO: 3 OsEPSPS AT ·· ·»·····*

SEQ ID NO: 4

OsEPSPS ZM

SEQ ID NO: 5

GmEPSPSJKS

SEQ ID NO: 6

GmEPSPS Nat

SEQ ID NO: 7

GmEPSPS_GM

SEQ ID NO: 8

ZmEPSPS_TIPS

SEQ ID NO: 9

ZmEPSPSJMat ··· »· ···· • · · · · 9 · · · · • · · · • · · · · ··· ·· ··

Seqüência de polinucleotideo de um polinucleotideo de EPSPS de arroz artificial usando a tabela de uso do códon de Zea mays e os métodos da presente invenção e ainda modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

Uma seqüência de proteína de EPSPS da soja modificada para ser resistente ao glifosato, com peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Seqüência de polinucleotideo de um polinucleotideo de EPSPS nativa da soja modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

Seqüência de polinucleotideo de um polinucleotideo de EPSPS da soja artificial usando a tabela de uso do códon de Glicina max e os métodos da presente invenção e ainda modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

Uma seqüência de proteína de EPSPS do milho modificada para ser resistente ao glifosato, com peptídeo de trânsito de cloroplasto.

Seqüência de polinucleotideo de um polinucleotideo de EPSPS nativa do milho modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

• · » · »·· ·

SEQ ID NO; 10

ZmEPSPS ZM

SEQ ID NO: 11

CTP2 ··· ·· ···· • · · · • · · · • · · « • · · · · • · · · · · ·

SEQ ID NO: 12

SEQ ID NO: 13

CTP2 Nat

CTP2 AT

SEQ ID NO: 14

CTP2 ZM

SEQ ID NO: 15

CP4EPSPS

SEQ ID NO: 16

CP4EPSPS_Nat

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo de EPSPS do milho artificial usando a tabela de uso do códon de Zea mays e os métodos da presente invenção e ainda modificado para codificar uma proteína resistente ao glifosato.

Seqüência de proteína do peptídeo de trânsito de cloroplasto 2 do gene de EPSPS de Arabidopsis.

Seqüência de polinucleotídeo do peptídeo de trânsito de cloroplasto de EPSPS de Arabidopsis. Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a CTP2 usando a tabela de uso do códon de Arabidopsis e os métodos da presente invenção.

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a CTP2 usando a tabela de uso do códon de Zea mays e os métodos da presente invenção.

A seqüência de proteína da proteína de EPSPS resistente ao glifosato da cepa CP4 de Agrobacterium.

Seqüência de polinucleotídeo do polinucleotídeo nativo que codifica a proteína CP4EPSPS (Patente U.S. N⁹ 5.633.435).

• · · · · ··

CP4EPSPS_AT • · ·· · · · · • · ····»···

SEQ ID NO: 17

SEQ ID NO: 18

SEQ ID NO: 19

SEQ ID NO: 20

SEQ ID NO: 21

CP4EPSPS_ZM

BAR1

BAR1 Nat

BAR1 AT

SEQ ID NO: 22

SEQ ID NO: 23

SEQ ID NO: 24

BAR1 ZM

CP4EPSPS_Syn

CP4EPSPS_AT_p1

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a proteína CP4EPSPS usando a tabela de uso do códon de Arabidopsis e os métodos da presente invenção.

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a proteína CP4EPSPS usando a tabela de uso do códon de Zea mays e os métodos da presente invenção.

A seqüência de proteína de uma fosfinotricina acetiltransferase. Seqüência de polinucleotídeo do polinucleotídeo nativo isolado de Streptomyces que codifica a fosfinotricina acetiltransferase. Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a fosfinotricina acetiltransferase usando a tabela de uso do códon de Arabidopsis e os métodos da presente invenção.

Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a fosfinotricina acetiltransferase usando a tabela de uso do códon de Zea mays e os métodos da presente invenção. Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial com códon de eleição de dicotiledônea.

Diagnóstico de molécula iniciadora de DNA para o polinucleotídeo CP4EPSPS_AT.

V

SEQ ID NO: 25

SEQ ID NO: 26

SEQ ID NO: 27

SEQ ID NO: 28

SEQ ID NO: 29

SEQ ID NO: 30

SEQ ID NO: 31

SEQ ID NO: 32

SEQ ID NO: 33

SEQ ID NO: 34

SEQ ID NO: 35

CP4EPSPS_AT_p2

CP4EPSPS_ZM_p1

CP4EPSPS_ZM_p2

CP4EPSPS_Nat_p1

CP4EPSPS_Nat_p2

CP4EPSPS_Syn_p

ZmAdhl iniciadorl

ZmAdhl iniciador2

GNAGIAMKS

CTPEPSPSCP4_G

M

Diagnóstico de molécula iniciadora de DNA para o polinucleotídeo CP4EPSPS_ZM.

Diagnóstico de molécula iniciadora de DNA para o polinucleotídeo CP4EPSPS_Nat.

Diagnóstico de molécula iniciadora de DNA para o polinucleotídeo CP4EPSPS_Syn.

Diagnóstico de iniciador de controle 1 para o gene Adh1 do milho endógeno.

Diagnóstico de iniciador de controle 2 para o gene Adh1 do milho endógeno.

Motivo que fornece resistência ao glifosato a uma EPSPS vegetal. Seqüência de polinucleotídeo de um polinucleotídeo artificial que codifica a proteína CP4EPSPS usando a tabela de uso do códon de Glicina max.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece métodos e composições para planejar uma seqüência de polinucleotídeo artificial que codifica uma proteína de interesse, em que o polinucleotídeo artificial é substancialmente diver·· ········

Jl^ gente de um polinucleotídeo que ocorre naturalmente em uma planta ou um polinucleotídeo que foi introduzido como um transgene em uma planta e o polinucleotídeo artificial e o polinucleotídeo codificam um polipeptídeo substancialmente idêntico.

Os polinucleotídeos artificiais da presente invenção que codificam proteínas que fornecem fenótipos agronomicamente úteis a uma planta transgênica contendo um constructo de DNA que compreende o polinucleotídeo artificial. Os fenótipos agronomicamente úteis incluem, mas não são limitados a: tolerância à seca, rendimento aumentado, tolerância ao frio, resistência às doenças, resistência a inseto e tolerância a herbicida.

Um outro aspecto da presente invenção são polinucleotídeos artificiais que codificam uma proteína de EPSPS resistente a herbicida, uma proteína de fosfinotricina acetiltransferase, uma proteína de peptídeo de trânsito de cloroplasto. Em modalidades preferidas da presente invenção, a molécula de polinucleotídeo artificial é selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 35.

A presente invenção fornece constructos de DNA que compreendem: uma molécula promotora que funciona em plantas, operavelmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo artificial da presente invenção, em que a molécula de polinucleotídeo artificial é selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 35, operavelmente ligada a uma região de término de transcrição.

A presente invenção ainda fornece constructos de DNA que compreendem: uma molécula promotora que funciona em plantas, operavelmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo artificial que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto, operavelmente ligada a uma EPSPS resistente ao glifosato heteróloga, operavelmente ligada a uma região de sinal de término de transcrição, em que o polinucleotídeo artificial é substancial•V ········ ··· ··· ·* >··· • · · * • · · · • · · · • « · · · • ·· ·· ·· íe mente divergente na seqüência de polinucleotídeo dos polinucleotídeos conhecidos que codificam um peptídeo de trânsito de cloroplasto idêntico.

A presente invenção fornece constructos de DNA que compreendem pelo menos dois cassetes de expressão, o primeiro cassete de expressão compreendendo uma molécula promotora que funciona em plantas, operavelmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo artificial da presente invenção, operavelmente ligada a uma região de sinal de término de transcrição e o segundo cassete de expressão que compreende uma molécula promotora que funciona em plantas, operavelmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que codifica um polipeptideo substancialmente idêntico como o dito polinucleotídeo artificial e é menos do que oito-cinco por cento similar na seqüência de polinucleotídeo ao dito polinucleotídeo artificial, operavelmente ligada a uma região de sinal de término de transcrição.

A presente invenção fornece células vegetais, plantas ou sua progênie que compreendem um constructo de DNA da presente invenção. De interesse particular são as plantas de sua progênie selecionadas do grupo que consiste em trigo, milho, arroz, soja, algodão, batata, canola, gramado, árvores de floresta, sorgo em grão, safras vegetais, plantas ornamentais, safras de forragem e safras de frutas.

Um método da presente invenção reduz o silenciamento de gene durante a geração das plantas transgênicas compreendendo as etapas de:

a) construir um polinucleotídeo artificial que é substancialmente divergente de polinucleotídeos conhecidos que codificam uma proteína substancialmente idêntica e

b) construir um constructo de DNA contendo a dita molécula de polinucleotídeo artificial; e

c) transformar o dito constructo de DNA em uma célula vegetal; e

d) regenerar a dita célula vegetal em uma planta transgênica; e

e) cruzar a dita planta transgênica com uma planta fértil, em que a dita planta fértil contém uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma proteína substancialmente idêntica a uma proteína codificada pela dita molé12

··· • * • ·	··· ·· • · · • · ·	• •	• ·· ·····»·· ·· · · · · • · * ·	··
···	• · · • · · ··· ··	• • · ··	• · · · • · · · ··· ···· · *	• ·

cuia de polinucleotídeo artificial e em que a dita molécula de polinucleotídeo artificial e a dita molécula de polinucleotídeo são substancialmente divergentes.

Um outro aspecto da invenção é uma célula vegetal transgênica que compreende dois polinucleotídeos, em que pelo menos um dos polinucleotídeos é um transgene e os dois polinucleotídeos codificam uma proteína substancialmente idêntica e são menos do que oito-cinco por cento similares na seqüência de polinucleotídeo.

Um outro aspecto da presente invenção em um método para reduzir o silenciamento de gene durante a produção de plantas transgênicas compreende as etapas de:

a) construir um polinucleotídeo artificial que seja substancialmente divergente de polinucleotídeos conhecidos que codificam uma proteína substancialmente idêntica e

b) construir um primeiro constructo de DNA contendo a dita molécula de polinucleotídeo artificial; e

c) transformar o dito constructo de DNA em uma célula vegetal; e

d) regenerar a dita célula vegetal em uma planta transgênica; e

e) retransformar uma célula a partir da dita planta transgênica com um segundo constructo de DNA que compreende uma molécula de polinucleotídeo que codifica uma proteína substancialmente idêntica ao dito polinucleotídeo artificial e o dito polinucleotídeo e o polinucleotídeo artificial são substancialmente divergentes na seqüência de polinucleotídeo; e

f) regenerar a dita célula da etapa d em uma planta transgênica que compreende tanto o dito polinucleotídeo artificial quanto o dito polinucleotídeo.

Ainda são fornecidos pela presente invenção métodos para a seleção de uma planta transformada com um constructo de DNA da invenção que compreende as etapas de:

a) transformar uma célula vegetal com um constructo de DNA da presente invenção; e •· ········ dl

···	···	··	····
• ·	•	•	•	•	4 ·
• ·	•	• ·	•
···	•	t ·	•
	•	•	•	• ·
	···	··	··	« ·

b) cultivar a dita célula vegetal em um meio seletivo contendo um herbicida selecionado do grupo que consiste em: glifosato e glifosinato, para matar seletivamente as células que não foram transformadas com os ditos constructos de DNA; e

c) regenerar a dita célula vegetal em uma planta fértil.

Um outro aspecto da invenção é um método de detectar um polinucleotídeo artificial em uma célula vegetal, planta ou sua progênie transgênica que compreende as etapas;

a) contatar uma amostra de DNA isolada da dita célula vegetal, planta ou sua progênie com uma molécula de DNA, em que a dita molécula de DNA compreende pelo menos uma molécula de DNA de um par de moléculas de DNA que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nuciéico produz um amplicon que é diagnóstico para a dita molécula de polinucleotídeo artificial selecionada do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 35.

(a) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, produzindo deste modo o amplicon; e (b) detectar o amplicon.

Os reagentes fornecidos para realizar o método de detecção acima incluem, mas não são limitados a: moléculas de DNA que especificamente hibridizam com uma molécula de polinucleotídeo artificial selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22; e moléculas de DNA isoladas selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.

A presente invenção fornece plantas e progênie que compreende uma molécula de DNA selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:

• · • · · »· · · <ÀL

21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.

A presente invenção fornece pares de moléculas de DNA selecionados do grupo que compreendem: uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA é a SEQ ID NO: 24 ou seu complemento e a segunda molécula de DNA é a SEQ ID NO: 25 ou seu complemento e o par de moléculas de DNA quando usado em um método de amplificação de DNA produz um amplicon e uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA é a SEQ ID NO: 26 ou seu complemento e a segunda molécula de DNA é a SEQ ID NO: 27 ou seu complemento e o par de moléculas de DNA quando usados em um método de amplificação de DNA produz um amplicon, em que o amplicon é diagnóstico para a presença de um polinucleotídeo artificial da presente invenção no genoma de uma planta transgênica.

A presente invenção fornece uma planta e sua progênie identificada por um método de amplificação de DNA para conter no seu genoma uma molécula de DNA selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.

A presente invenção fornece e considera kits de detecção de DNA que compreendem: pelo menos uma molécula de DNA de comprimento suficiente que seja especificamente homóloga ou complementar a um polinucleotídeo artificial selecionado do grupo que consiste na SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22, em que a dita molécula de DNA é útil como uma sonda de DNA ou iniciador de DNA; ou pelo menos uma molécula de DNA homóloga ou complementar a uma molécula iniciadora de DNA selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27.

» · · · · · I

A presente invenção ainda fornece um método de detectar a presença de um polinucleotídeo artificial que codifica uma EPSPS resistente ao glifosato em uma amostra de DNA, o método compreendendo:

(a) extrair uma amostra de DNA de uma planta; e (b) contatar a amostra de DNA com uma molécula de DNA rotulada de comprimento suficiente que seja especificamente homóloga ou complementar a um polinucleotídeo artificial selecionado do grupo que consiste na: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, em que a dita molécula de DNA rotulada é uma sonda de DNA; e (c) submeter a amostra e a sonda de DNA às condições de hibridização severa; e (d) detectar a sonda de DNA hibridizada à amostra de DNA.

A presente invenção fornece um polinucleotídeo isolado que codifica uma enzima de EPSPS, a enzima de EPSPS contém o motivo da SEQ ID NO: 34. A presente invenção fornece um constructo de DNA contendo um polinucleotídeo que codifica a enzima de EPSPS com o motivo da SEQ ID NO: 34. Uma célula vegetal, planta ou sua progênie que é tolerante ao glifosato como um resultado da expressão de uma enzima de EPSPS que contém o motivo da SEQ ID NO: 34 é um aspecto da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

As seguintes definições são fornecidas para melhor definir a presente invenção e para guiar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que de outro modo mencionado, os termos devem ser entendidos de acordo com o uso convencional por aqueles versados na técnica relevante. As definições de termos comuns na biologia molecular também podem ser encontradas em Rieger et al., Glossary of Genetics: Classical e Molecular, 5^a edição, Springer-Verlag: Nova Iorque, (1991); e Lewin, Genes V, Oxford University Press: Nova Iorque, (1994). A nomenclatura para as bases de DNA como apresentada em 37 CFR § 1.822 é usada. A nomenclatura de uma e três letras padrão para os resíduos de aminoácido é usada.

Substituições de aminoácido, variantes de aminoácido, são preferivelmente substituições de resíduo de aminoácido único para um outro resíduo de aminoácido em qualquer posição dentro da proteína. As substituições, supressões, inserções ou qualquer combinação destas podem ser combinadas para chegar em um constructo final.

Um polinucleotídeo artificial como usado na presente invenção é uma seqüência de DNA planejada de acordo com os métodos da presente invenção e criada como uma molécula de DNA isolada para o uso em um constructo de DNA que forneça a expressão de uma proteína em células hospedeiras e para os propósitos de clonagem em constructos apropriadas ou outros usos conhecidos por aqueles versados na técnica. Programas de computador estão disponíveis para estes propósitos, incluindo mas não limitados aos programas BestFit ou Gap do Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group (GCG), Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, Wl 53711. O polinucleotídeo artificial pode ser criado por um ou mais métodos conhecidos na técnica, que incluem, mas não são limitados à: PCR de sobreposição. Um polinucleotídeo artificial da presente invenção é substancialmente divergente de outros polinucleotídeos que codificam a proteína idêntica ou quase idêntica.

O termo quimérico refere-se a uma seqüência de ácido nucléico ou de proteína de fusão. Uma seqüência codificadora de ácido nucléico quimérica é compreendida de duas ou mais seqüências unidas na matriz que codificam uma proteína quimérica. Um gene quimérico refere-se aos elementos genéticos múltiplos derivados de fontes heterólogas que compreendem um gene.

As frases seqüência codificadora, matriz de leitura aberta e seqüência estrutural referem-se à região de tripletos de ácido nucléico seqüenciais contínuos que codificam uma proteína, polipeptídeo ou seqüência de peptídeo.

Códon refere-se a uma seqüência de três nucleotídeos que especificam um aminoácido particular.

Uso de códon ou códon de eleição referem-se à freqüência ··· ··· ·· ···· · ·· ········ ·· ··· · · · · · · · •·· · · · · · · · · • ······· · · • ··· ·· ·· ······· · · de uso de códons que codificam aminoácidos nas seqüências codificadoras de organismos.

Complementaridade e complemento quando se referem às seqüências de ácido nucléico, referem-se à ligação específica de adenina à timina (uracila no RNA) e citosina à guanina nos filamentos opostos de DNA ou RNA.

Constructo refere-se aos elementos genéticos heterólogos operavelmente ligados entre si compondo uma molécula de DNA recombinante e pode compreender elementos que fornecem a expressão de uma molécula de polinucleotídeo de DNA em uma célula hospedeira e elementos que fornecem a manutenção do constructo.

Região de terminal C refere-se à região de uma cadeia de peptídeo, polipeptídeo ou proteína do seu centro até a extremidade que carrega o aminoácido tendo um grupo carboxila livre.

O termo divergente, como aqui usado, refere-se à comparação das moléculas de polinucleotídeo que codificam a mesma ou quase a mesma proteína ou polipeptídeo. O código genético de quatro letras (A, G, C e T/U) compreende códons de três letras que direcionam as moléculas de tRNA para montar aminoácidos em um polipeptídeo a partir de um padrão de mRNA. Tendo mais do que um códon que pode codificar o mesmo aminoácido é aludido como degenerado. Os códons degenerados são usados para construir moléculas de polinucleotídeo substancialmente divergentes que codificam o mesmo polipeptídeo onde estas moléculas têm uma seqüência de nucleotídeos do seu comprimento completo em que eles são menos do que 85 % idênticos e não existe nenhum comprimento de seqüência de polinucleotídeo maior do que 23 nucleotídeos que sejam idênticos.

O termo que codifica DNA refere-se ao DNA cromossômico, DNA plasmídico, cDNA ou polinucleotídeo de DNA artificial que codifica qualquer uma das proteínas aqui discutidas.

O termo endógeno refere-se aos materiais que se originam de dentro de um organismo ou célula.

Endonuclease refere-se a uma enzima que hidrolisa DNA de <Χο

filamento duplo nos locais internos.

Exógeno refere-se a materiais que se originam de fora de um organismo ou célula. Isto tipicamente se aplica às moléculas de ácido nucléico usadas na produção de células hospedeiras e plantas transformadas ou transgênicas.

Éxon refere-se à porção de um gene que é realmente traduzida em proteína, isto é, uma seqüência codificadora.

O termo expressão refere-se à transcrição ou tradução de um polinucleotídeo para produzir um produto de gene correspondente, um RNA ou proteína.

Fragmentos. Um fragmento de um gene é uma porção de uma molécula de ácido polinucléico de comprimento total que é de pelo menos um comprimento mínimo capaz de transcrição em um RNA, tradução em um peptídeo ou útil como uma sonda ou iniciador em um método de detecção de DNA.

O termo gene refere-se ao DNA cromossômico, DNA plasmídico, cDNA, polinucleotídeo de DNA artificial ou outro DNA que codifica uma molécula de peptídeo, polipeptídeo, proteína ou RNA e os elementos genéticos que flanqueiam a seqüência codificadora que estão envolvidos na regulagem da expressão.

O termo genoma como se aplica aos vírus abrange todas as seqüências de ácido nucléico contidas dentro do capsídeo do vírus. O termo genoma como se aplica às bactérias abrange tanto o cromossoma quanto os plasmídeos dentro de uma célula hospedeira bacteriana. Os ácidos nucléicos codificadores da presente invenção introduzidos em células hospedeiras bacterianas podem ser portanto cromossomicamente integrados ou localizados no plasmídeo. O termo genoma como se aplica às células vegetais abrange não apenas o DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, mas à organela de DNA encontrada dentro dos componentes subcelulares da célula. Os ácidos nucléicos da presente invenção introduzidos nas células vegetais podem estar portanto cromossomicamente integrados ou localizados na organela.

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Glifosato refere-se à N-fosfonometilglicina e seus sais, o Glifosato é o ingrediente ativo do herbicida Roundup® (Monsanto Co.). Os tratamentos de plantas com glifosato referem-se aos tratamentos com as formulações de herbicida Roundup® ou Roundup Ultra®, a menos que de outro modo estabelecido. O Glifosato como N-fosfonometilglicina e seus sais (não formulado como o herbicida Roundup®) são componentes de meios de cultura sintéticos usados para a seleção de bactérias e tolerância da planta ao glifosato ou usados para determinar a resistência à enzima em ensaios bioquímicos in vitro.

Seqüência de DNA heterólogo refere-se a uma seqüência de polinucleotídeo que se origina de uma fonte ou espécies estranhas ou, se da mesma fonte, é modificada a partir da sua forma original.

DNA homólogo refere-se ao DNA da mesma fonte como aquela da célula receptora.

Hibridização refere-se à capacidade de um filamento de ácido nucléico para unir com um filamento complementar por intermédio do emparelhamento de base. A hibridização ocorre quando seqüências complementares nos dois filamentos de ácido nucléico se ligam entre si. As sondas e iniciadores de ácido nucléico da presente invenção hibridizam sob condições severas a uma seqüência de DNA alvo. Qualquer método de hibridização ou amplificação de ácido nucléico convencional pode ser usado para identificar a presença de DNA a partir de um evento transgênico em uma amostra. As moléculas de ácido nucléico ou seus fragmentos são capazes de hibridizar especificamente a outras moléculas de ácido nucléico sob certas circunstâncias. Como aqui usado, duas moléculas de ácido nucléico são ditas serem capazes de hibridizar especificamente entre si se as duas moléculas forem capazes de formar uma estrutura de ácido nucléico antiparalela, de filamento duplo. Uma molécula de ácido nucléico é dita ser o complemento de uma outra molécula de ácido nucléico se elas exibem complementaridade completa. Como aqui usado, as moléculas são ditas exibir complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma das moléculas é complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas são ditas serem minimamente

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complementar se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam recozidas entre si pelo menos sob condições de severidade baixa convencionais. Similarmente, as moléculas são ditas serem complementares” se elas podem hibridizar entre si com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçam recozidas entre si sob condições de alta severidade convencionais. As condições de severidade convencionais são descritas por Sambrook et al., 1989 e por Haymes et al., Em: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), aqui incorporada por referência em sua totalidade. Afastamentos da complementaridade completa são portanto permissíveis, contanto que tais afastamentos não impeçam completamente a capacidade das moléculas para formarem uma estrutura de filamento duplo. De modo que uma molécula de ácido nucléico sirva como um iniciador ou sonda ela necessita ser apenas suficientemente complementar em seqüência para ser capaz de formar uma estrutura de filamento duplo estável sob o solvente e concentrações salinas particulares utilizados.

Como aqui usado, uma seqüência substancialmente homóloga é uma seqüência de ácido nucléico que especificamente hibridizará com o complemento da seqüência de ácido nucléico ao qual ela está sendo comparada sob condições de alta severidade. O termo condições severas é funcionalmente definido com respeito à hibridização de uma sonda de ácido nucléico a um ácido nucléico alvo (isto é, a uma seqüência de ácido nucléico particular de interesse) pelo procedimento de hibridização específico debatido em Sambrook et al., 1989, em 9.52-9.55. Ver também, Sambrook et al., 1989 em 9.47-9.52, 9.56-9.58 aqui incorporada por referência em sua totalidade; Kanehisa, (Nucl. Acids Res. 12: 203 a 213, 1984, aqui incorporada por referência em sua totalidade); e Wetmur e Davidson, (J. Mol. Biol. 31: 349 a 370, 1988, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Conseqüentemente, as seqüências de nucleotídeo da invenção podem ser usadas quanto a sua capacidade para formar seletivamente moléculas duplex com trechos complementares de fragmentos de DNA. Dependendo da aplicação prevista, desejar-se-á utilizar condições variáveis de hibridização para se o/e>

obter graus variáveis de seletividade de sonda em relação à seqüência alvo. Para aplicações que requerem seletividade alta, desejar-se-á tipicamente utilizar condições relativamente severas para formar os híbridos, por exemplo, selecionar-se-á condições relativamente de sal baixo e/ou temperatura alta, tal como fornecidas por cerca de 0,02 M a cerca de 0,15 M de NaCl em temperaturas de cerca de 50° C a cerca de 70° C. Uma das condições severas, por exemplo, é lavar o filtro de hibridização pelo menos duas vezes com tampão de lavagem de alta severidade (0,2X SSC, 0,1 % de SDS, 65° C). As condições de severidade apropriadas que promovem a hibridização de DNA, por exemplo, 6,0 x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45° C, seguida por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50° C, são conhecidas por aqueles versados na técnica ou podem ser encontradas em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Por exemplo, a concentração salina na etapa de lavagem pode ser selecionada de uma severidade baixa de cerca de 2,0 x SSC a 50° C até uma severidade alta de cerca de 0,2 x SSC a 50° C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem pode ser aumentada de condições de severidade baixa na temperatura ambiente, cerca de 22° C, até condições de alta severidade a cerca de 65° C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados ou a temperatura ou a concentração de sal podem ser mantidos constantes enquanto a outra variável é mudada. Tais condições seletivas toleram pouco, se algum, desemparelhamento entre a sonda e o padrão ou filamento alvo. A detecção de seqüências de DNA por intermédio da hibridização é bem conhecida por aqueles versados na técnica e as divulgações das Patentes U.S. N³⁵4.965.188 e 5.176.995 são exemplares dos métodos de análises de hibridização.

Identidade refere-se ao grau de similaridade entre duas seqüências de ácido polinucléico ou proteína. Um alinhamento das duas seqüências é realizado por um programa de computador adequado. Um programa de computador amplamente usado e aceito para realizar alinhamentos de seqüência é o CLUSTALW v1.6 (Thompson, et al. Nucl. Acids Res., 22: 4673 a 4680, 1994). O número de bases ou aminoácidos emparelhados • ·· ········ »« · · · · • · · · • · · · • · · · ······· · · é dividido pelo número total de bases ou aminoácidos e multiplicado por 100 para se obter uma identidade percentual. Por exemplo, se duas seqüências de 580 pares de base tiveram 145 bases emparelhadas, elas podem ser 25 por cento idênticas. Se as duas seqüências comparadas são de comprimentos diferentes, o número de emparelhamentos é dividido pelo mais curto dos dois comprimentos. Por exemplo, se existem 100 aminoácidos emparelhados entre uma proteína de 200 e uma de 400 aminoácidos, elas são 50 por cento idênticas com respeito à seqüência mais curta. Se a seqüência mais curta é menor do que 150 bases ou 50 aminoácidos no comprimento, o número de emparelhamentos é dividido por 150 (para as bases de ácido nucléico) ou 50 (para os aminoácidos) e multiplicados por 100 para se obter uma identidade percentual.

Como aqui descrito uma proteína pode ser substancialmente idêntica às proteínas relacionadas. Estas proteínas com identidade substancial no geral compreendem pelo menos uma seqüência de polipeptideo que tem pelo menos noventa e oito de identidade de seqüência percentual comparada com a sua outra seqüência de polipeptideo relacionada. O programa Gap no WISCONSIN PACKAGE versão 10.0-UNIX da Genetics Computer Group, Inc. está fundamentado no método de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443 a 453, 1970) usando o conjunto de parâmetros de padrão para a comparação pelo modo de pares (para a comparação de seqüência de aminoácido: Penalidade de Criação de Intervalo = 8, Penalidade de Extensão de Intervalo = 20); ou usando o programa TBLASTN no conjunto de software BLAST 2.2.1 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389 a 3402), usando a matriz BLOSUM62 (Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89: 10915 a 10919, 1992) e o conjunto de parâmetros padrão para a comparação pelo modo de pares (valor de criação de intervalo = 11, valor para a extensão de intervalo = 1.). No BLAST, o valor E ou o valor de probabilidade, representa o número de alinhamentos diferentes com pontuações equivalentes ou melhores do que as pontuações de alinhamento bruto, S, que são esperadas ocorrer em uma pesquisa de banco de dados por acaso. Quanto mais baixo o valor E, mais significante o emparelhamen•» ··«·»··· • · · 9 • ·· ··· · · ···· t · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • ·«··· ··

Μ to. Porque o tamanho do banco de dados é um elemento nos cálculos do valor E, os valores E obtidos pela aplicação de BLAST contra banco de dados públicos, tais como o GenBank, tem no geral aumentado com o tempo para qualquer emparelhamento questão/entrada dado. A identidade percentual refere-se à porcentagem de resíduos de aminoácido identicamente emparelhados que existem ao longo do comprimento daquela porção das seqüências que é alinhada pelo algoritmo BLAST.

Intron refere-se a uma porção de um gene não traduzido em proteína, embora ela seja transcrita em RNA.

Uma seqüência de ácido nucléico isolada é substancialmente separada ou purificada de outras seqüências de ácido nucléico com as quais o ácido nucléico está normalmente associado na célula do organismo no qual o ácido nucléico naturalmente ocorre, isto é, outro DNA cromossômico ou extracromossômico. O termo abrange os ácido nucléicos que são bioquimicamente purificados de modo a remover substancialmente ácido nucléicos contaminantes e outros componentes celulares. O termo também abrange ácidos nucléicos recombinantes e ácido nucléicos quimicamente sintetizados.

Polipeptídeos Isolados, Purificados, Homogêneos. Um polipeptídeo é isolado se ele foi separado dos componentes celulares (ácido nucléicos, lipídeos, carboidratos e outros polipeptídeos) que naturalmente o acompanham ou que é quimicamente sintetizado ou recombinante. Um polipeptídeo monomérico é isolado quando pelo menos 60 % em peso de uma amostra é composta do polipeptideo, preferivelmente 90 % ou mais, mais preferivelmente 95 % ou mais e o mais preferivelmente mais do que 99 %. A pureza ou homogeneidade da proteína são indicadas, por exemplo, pela eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de proteína, seguido pela visualização de uma única faixa de polipeptideo no tingimento do gel de poliacrilamida; a cromatografia líquida de alta pressão; ou outros métodos convencionais. As proteínas podem ser purificadas por qualquer um dos meios conhecidos na técnica, por exemplo como descrito no Guide to Protein Purification, ed. Deutscher, Meth. Enzymol. 185. Academic Press, San

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Diego, 1990; e Scopes, Protein Purification: Principies e Practice, Springer Verlag, Nova Iorque, 1982.

Rotulação ou rotulado. Existe uma variedade de métodos e reagentes convencionais para a rotulação de polinucleotídeos e polipeptídeos e fragmentos destes. Os rótulos típicos incluem isótopos, ligandos ou receptores de ligando radioativos, fluoróforos, agentes e enzimas quimioluminescentes. Os métodos para a rotulação e orientação na escolha de rótulos apropriados para os vários propósitos são debatidos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989) e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing e Wiley-lnterscience, Nova Iorque, (1992).

Região codificadora de proteína madura, este termo refere-se à seqüência de um produto de proteína processado, isto é, uma EPSP sintase madura que permanece depois que o peptídeo de trânsito de cloroplasto foi removido.

Nativo, o termo nativo no geral refere-se a um ácido polinucléico ou polipeptideo que ocorrem naturalmente (tipo selvagem). Entretanto, no contexto da presente invenção, alguma modificação de um polinucleotídeo e polipeptideo isolados pode ter ocorrido para fornecer um polipeptídeo com um fenótipo particular, por exemplo, substituição de aminoácido na EPSPS sensível ao glifosato para fornecer uma EPSPS resistente ao glifosato. Para propósitos comparativos na presente invenção, o polinucleotídeo isolado que contém uns poucos nucleotideos substituídos para fornecer a modificação de aminoácido para a tolerância a herbicida é aludido como o polinucleotídeo nativo quando comparado com o polinucleotídeo substancialmente divergente criado pelos métodos da presente invenção. Entretanto, o polinucleotídeo nativo modificado desta maneira é não nativo com respeito aos elementos genéticos normalmente encontrados ligados a um polinucleotídeo não-modificado que ocorre naturalmente.

Região de terminal N refere-se a uma região de uma cadeia de peptídeo, polipeptideo ou proteína do aminoácido tendo um grupo amino livre no centro da cadeia.

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Ácido nucléico refere-se ao ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA).

Códigos de ácido nucléico: A = adenosina; C = citosina; G = guanosina; T = timidina. Códigos usados para a síntese de oligonucleotídeos: N = eqüimolar A, C, G e T; I = desoxiinosina; K = eqüimolar G e T; R = eqüimolar A e G; S = eqüimolar C e G; W = eqüimolar A e T; Y = eqüimolar CeT.

Um segmento de ácido nucléico ou uma segmento de molécula de ácido nucléico é uma molécula de ácido nucléico que foi isolada livre de DNA genômico total de uma espécie particular ou que foi sintetizado. Incluído com o termo segmento de ácido nucléico estão os segmentos de DNA, vetores recombinantes, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, fago, vírus, et cetera.

Variantes de Seqüência de Nucleotídeo, usando métodos bem conhecido, o versado na técnica pode facilmente produzir variantes de seqüência de nucleotídeo e aminoácido de genes e proteínas, respectivamente. Por exemplo, as moléculas de DNA variantes da presente invenção são moléculas de DNA contendo mudanças em uma seqüência de gene de EPSPS, isto é, mudanças que incluem um ou mais nucleotídeos da seqüência de gene de EPSPS sendo suprimido, adicionado e/ou substituído, tal que o gene de EPSPS variante codifique uma proteína que retenha a atividade de EPSPS. As moléculas de DNA variantes podem ser produzidas, por exemplo, pelas técnicas de mutagênese de DNA padrão ou sintetizando-se quimicamente a molécula de DNA variante ou uma porção desta. Os métodos para a síntese química de ácidos nucléicos são debatidos, por exemplo, em Beaucage et al., Tetra. Letts. 22: 1859 a 1862 (1981) e Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185- (1981). A síntese química de ácido nucléicos pode ser realizada, por exemplo, em sintetizadores de oligonucleotídeo automatizados. Tais variantes preferivelmente não mudam a matriz de leitura da região que codifica a proteína do ácido nucléico e preferivelmente codificam uma proteína não tendo nenhuma mudança ou apenas uma redução menor.

Matriz de leitura aberta (ORF) refere-se a uma região de DNA ou RNA que codifica um peptídeo, polipeptídeo ou proteína.

Operavelmente Ligada. Uma primeira seqüência de ácido nucléico está operavelmente ligada com uma segunda seqüência de ácido nucléico quando a primeira seqüência de ácido nucléico é colocada em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor está operavelmente ligado a uma seqüência codificadora de proteína se o promotor causa a transcrição ou expressão da seqüência codificadora. No geral, as seqüências de DNA operavelmente ligadas são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões codificadoras de proteína, na matriz de leitura.

Superexpressão refere-se à expressão de um RNA ou polipeptídeo ou proteína codificados por um DNA introduzido em uma célula hospedeira, em que o RNA ou polipeptídeo ou proteína não estão normalmente presentes na célula hospedeira ou em que o RNA ou polipeptídeo ou proteína estão presentes na dita célula hospedeira em um nível mais alto do que aquele normalmente expressado a partir do gene endógeno que codifica o RNA ou polipeptídeo ou proteína.

O termo planta abrange qualquer planta superior e sua progênie, incluindo monocotiledôneas (por exemplo, milho, arroz, trigo, cevada, etc.), dicotiledôneas (por exemplo, soja, algodão, canola, tomate, batata, Arabidopsis, tabaco, etc.), gimnospermas (pinheiros, abetos, cedros, etc.) e inclui partes de plantas, incluindo unidades reprodutivas de uma planta (por exemplo, sementes, bulbos, tubérculos, frutas, flores, etc.) ou outras partes ou tecidos daquela planta podem ser reproduzidos.

Cassete de expressão vegetal refere-se a segmentos de DNA quimérico que compreendem os elementos reguladores que são operavelmente ligados para fornecer a expressão de um produto de transgene em plantas.

Plasmídeo refere-se a um pedaço circular, extracromossômico, auto-replicativo de DNA.

Sinal de poliadenilação ou sinal poliA refere-se a uma se• · • · qüência de ácido nucléico localizada a 3' em relação a uma região codificadora que cause a adição de nucleotídeos de adenilato à extremidade 3’ do mRNA transcrito a partir da região codificadora.

Reação de cadeia da polimerase (PCR)” refere-se a um método de amplificação de DNA que usa uma técnica enzimática para criar cópias múltiplas de uma seqüência de ácido nucléico (amplicon). As cópias de uma molécula de DNA são preparadas transportando-se um DNA polimerase entre dois amplímeros. A base deste método de amplificação são ciclos múltiplos de mudanças de temperatura para desnaturar, depois recozer os amplímeros (moléculas preparadoras de DNA), seguido pela extensão para sintetizar novos filamentos de DNA na região localizada entre os amplímeros flanqueadores. A amplificação de ácido nucléico pode ser realizada por qualquer uma dos vários métodos de amplificação de ácido nucléico conhecido na técnica, incluindo a reação de cadeia da polimerase (PCR). Uma variedade de métodos de amplificação são conhecidos na técnica e são descritos, inter alia, nas Patentes U.S. N⁸⁵ 4.683.195 e 4.683.202 e no PCR Protocols: A Guide to Method e Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. Os métodos de amplificação pela PCR foram desenvolvidos para amplificar até 22 kb de DNA genômico e até 42 kb de DNA de bacteriófago (Cheng et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 5695 a 5699, 1994). Estes métodos assim como outros métodos conhecidos na técnica de amplificação de DNA podem ser usados na prática da presente invenção.

Polinucleotídeo refere-se a uma extensão de moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA) e ácido ribonucléico (RNA) maiores do que dois, que são conectados para formar uma molécula maior.

Fragmentos de polipeptídeo. A presente invenção também abrange fragmentos de uma proteína que carece de pelo menos um resíduo de uma proteína de comprimento natural nativa, mas que substancialmente mantém a atividade da proteína.

O termo promotor ou região promotora refere-se a uma molécula de ácido polinucléico que funciona como um elemento regulador, usualmente encontrado a montante (5') em relação a uma seqüência codificado-

ra, que controla a expressão da seqüência codificadora controlando-se a produção de RNA mensageiro (mRNA) pelo qual fornece o sítio de reconhecimento para a RNA polimerase e/ou outros fatores necessários para o início da transcrição no sítio correto. Como aqui considerado, um promotor ou região promotora inclui variações de promotores derivados por meio de ligação a várias seqüências reguladoras, mutagênese aleatória ou controlada e a adição ou duplicação de seqüências realçadoras. A região promotora aqui divulgada e seus equivalentes biologicamente funcionais, são responsáveis por conduzir a transcrição de seqüências codificadoras sob o seu controle quando introduzido em um hospedeiro como parte de um vetor recombinante adequado, como demonstrado pela sua capacidade para produzir mRNA.

Recombinante. Um ácido nucléico recombinante é feito por uma combinação de dois segmentos de outro modo separados de seqüência, por exemplo, pela síntese química ou pela manipulação de segmentos isolados de ácidos nucléicos pelas técnicas de engendramento genético.

O termo constructo de DNA recombinante” ou vetor recombinante refere-se a qualquer agente tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, seqüência que replica autonomamente, fago ou seqüência de nucleotídeo de DNA ou RNA de filamento único ou de filamento duplo linear ou circular, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de DNA que uma ou mais seqüências de DNA foram ligadas em uma maneira funcionalmente operativa. Tais constructos de DNA recombinantes ou vetores são capazes de introduzir uma seqüência reguladora 5' ou região promotora e uma seqüência de DNA para um produto de gene selecionado em uma célula em uma maneira tal que a seqüência de DNA é transcrita em um mRNA funcional que é traduzido e portanto expressado. Os constructos de DNA recombinantes ou vetores recombinantes podem ser construídos para serem capazes de expressar RNAs de anti-sentido, de modo a inibir a tradução de um RNA específico de interesse.

Regeneração refere-se ao processo de cultivar uma planta a partir de uma célula vegetal (por exemplo, protoplasto vegetal ou explante).

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Repórter refere-se a um gene e produto de gene correspondente que quando expressados em organismos transgênicos produzem um produto detectável pelos métodos químicos ou moleculares ou produzem um fenótipo observável.

Resistência refere-se a uma enzima que é capaz de funcionar na presença de uma toxina, por exemplo, EPSP sintases de classe II resistentes ao glifosato. Uma enzima que tem resistência a uma toxina pode ter a função de destoxificar a toxina, por exemplo, a fosfinotricina acetiltransferase, a glifosato oxidorreductase ou pode ser uma enzima mutante tendo atividade catalítica que não é afetada por um herbicida que rompe a mesma atividade na enzima do tipo selvagem, por exemplo, a acetolactato sintase, EPSP sintases de classe I mutantes.

Enzima de restrição refere-se a uma enzima que reconhece uma seqüência palindrômica específica de nucleotídeos no DNA de filamento duplo e cliva ambos os filamentos; também chamada de uma endonuclease de restrição. A divagem tipicamente ocorre dentro do sítio de restrição.

Marcador selecionáve! refere-se a uma molécula de ácido polinucléico que codifica uma proteína, que confere um fenótipo que facilita a identificação de células contendo a molécula de ácido polinucléico. Marcadores selecionáveis incluem aqueles genes que conferem resistência aos antibióticos (por exemplo, ampicilina, canamicina), complementam uma deficiência nutricional (por exemplo, uracila, histidina, leucina) ou comunica uma característica que se distinga visualmente (por exemplo, mudanças de cor ou fluorescência). Os genes selecionável marcadores dominantes úteis incluem genes que codificam os genes de resistência a antibiótico (por exemplo, a neomicina fosfotransferase, aad); e os genes de resistência a herbicida (por exemplo, a fosfinotricina acetiltransferase, EPSP sintase de classe II, EPSP sintase de classe I modificada). Uma estratégia útil para a seleção de transformantes para a resistência a herbicida é descrita, por exemplo, em Vasil, Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I-III, Laboratory Procedures e Their Applications Academic Press, Nova Iorque (1984).

O termo específica para (uma seqüência alvo) indica que uma sonda de DNA ou iniciador de DNA hibridizam sob condições de hibridização dadas apenas com a seqüência alvo em um amostra que compreende a seqüência alvo.

O termo substancialmente purificado, como aqui usado, referese a uma molécula separada de outras moléculas normalmente associadas com ela no seu estado nativo. Mais preferivelmente, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente em uma preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode ser maior do que 60 % livre, preferivelmente 75 % livre, mais preferivelmente 90 % livre das outras moléculas (exclusivo de solvente) presentes na mistura natural. O termo substancialmente purificado não é intencionado a abranger moléculas presentes no seu estado nativo.

Tolerante ou tolerância refere-se a um efeito reduzido de um agente biótico ou abiótico sobre o cultivo e desenvolvimento de organismos e plantas, por exemplo, uma praga ou um herbicida.

Transcrição refere-se ao processo de produzir uma cópia de RNA a partir de um DNA padrão.

Transformação refere-se a um processo de introduzir uma molécula de ácido polinucléico exógeno (por exemplo, um constructo de DNA, uma molécula de ácido polinucléico recombinante) em uma célula ou protoplasto e que a molécula de ácido polinucléico exógena seja incorporada em um cromossoma ou seja capaz de replicação autônoma.

Transformado ou transgênico referem-se a uma célula, tecido, órgão ou organismo nos quais um ácido polinucléico estranho, tal como um vetor de DNA ou molécula de ácido polinucléico recombinante. Uma célula ou organismo transgênicos ou transformados também incluem a progênie da célula ou organismo e a progênie produzida a partir de um programa de procriação que utiliza uma tal planta transgênica como um precursor em um cruzamento e que exibe um fenótipo aumentado resultante da presença da molécula de ácido polinucléico estranha.

O termo transgene refere-se a qualquer molécula de ácido po-

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linucléico não nativa para uma célula ou organismo transformados na célula ou organismo. Transgene também abrange as partes componentes de um gene vegetal nativo modificado pela inserção de uma molécula de ácido polinucléico não nativa pela recombinação direcionada ou mutação específica ao sítio.

Moléculas de peptídeo de trânsito ou peptídeo alvejador, estes termos no geral referem-se às moléculas de peptídeo que quando ligadas a uma proteína de interesse direcionam a proteína a um tecido, célula, localização subcelular ou organela celular particulares. Os exemplos incluem, mas não são limitados a, peptídeos de trânsito de cloroplasto, sinais de alvejamento nuclear e sinais vacuolares. O peptídeo de trânsito de cloroplasto é de utilidade particular na presente invenção para direcionar a expressão da enzima de EPSPS ao cloroplasto.

O termo tradução refere-se à produção do produto de gene correspondente, isto é, um peptídeo, polipeptídeo ou proteína a partir de um mRNA.

Vetor refere-se a um plasmídeo, cosmídeo, bacteriofago ou vírus que carrega DNA estranho em um organismo hospedeiro. Polinucleotídeos

Os métodos da presente invenção incluem planejar genes que conferem um traço de interesse à planta na qual eles são introduzidos. Os transgenes de interesse agronômico que fornecem traços agronômicos benéficos para as plantas de safra, por exemplo, incluindo, mas não limitadas aos elementos genéticos que compreendem resistência à herbicida (Patente US N⁹ 5.633.435; Patente US N⁹ 5.463.175), rendimento aumentado (Patente US N⁹ 5.716.837), controle de inseto (Patente US N^s 6.063.597; Patente US N⁹ 6.063.756; Patente US N⁹ 6.093.695; Patente US N⁹ 5.942.664; Patente US N^s 6.110.464), resistência fúngica às doenças (Patente US N⁹5.516.671; Patente US N⁹ 5.773.696; Patente US N⁹ 6.121.436; e Patente US N⁹ 6.316.407 e Patente US N⁹ 6.506.962), resistência a vírus (Patente US N⁹ 5.304.730 e Patente US N⁹ 6.013.864), resistência à nematóide (Patente US N⁹ 6.228.992), resistência bacteriana às doenças (Patente US N⁹ • · · •

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5.516.671), produção de amido (Patente US N⁹ 5.750.876 e Patente US N⁹6.476.295), produção de óleo modificado (Patente US N° 6.444.876), produção de óleo alta (Patente US N^a 5.608.149 e Patente US N^s 6.476.295), teor de ácido graxo modificado (Patente US N⁹ 6.537.750), produção de proteína alta (Patente US N⁹ 6.380.466), maturação de fruta (Patente US N⁹5.512.466), nutrição animal e humana realçada (Patente US N^s 5.985.605 e Patente US N⁹ 6.171.640), biopolímeros (Patente US N⁹ 5.958.745 e Pedido de Patente US N⁹ US20030028917), resistência ao estresse ambiental (Patente US N⁹ 6.072.103), peptídeos farmacêuticos (Patente US N⁹ 6.080.560), traços de processamento melhorados (Patente US N⁹ 6.476.295), digestibilidade melhorada (Patente US N⁹ 6.531.648) rafinose baixa (Patente US N⁹6.166.292), produção de enzima industrial (Patente US N⁹ 5.543.576), sabor melhorado (Patente US N⁹ 6.011.199), fixação de nitrogênio (Patente US N⁹5.229.114), produção de semente híbrida (Patente US N⁹ 5.689.041) e produção de biocombustível (Patente US N⁹ 5.998.700), os elementos genéticos e transgenes descritos nas patentes listadas acima são aqui incorporados por referência.

Os herbicidas para os quais a tolerância da planta transgênica foi demonstrada e o método da presente invenção pode ser aplicado, incluem mas não são limitados aos: herbicidas de glifosato, glifosinato, sulfoniluréias, imidazolinonas, bromoxinila, delapon, cicloezanodiona, inibidores da protoporfiriongênio oxidase e isoxasflutol. As moléculas de polinucleotídeo que codificam proteínas envolvidas na tolerância a herbicida são conhecidas na técnica e incluem, mas não são limitadas a uma molécula de polinucleotídeo que codifica a 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintase (EPSPS, descrita nas Patentes U.S. N— 5.627.061, 5.633.435. 6.040.497; Padgette et al. Herbicide Resistant Crops, Lewis Publishers, 53 a 85, 1996; e PenalozaVazquez, et al. Plant Cell Reports 14: 482 a 487, 1995; e aroA (Patente U.S. N⁹ 5.094.945) para a tolerância a glifosato; bromoxinil nitrilase (Bxn) para a tolerância a Bromoxinil (Patente U.S. N⁹ 4.810.648); fitoeno dessaturase (crtl, Misawa et al, (1993) Plant J. 4; 833 a 840 e (1994) Plant J. 6; 481 a 489); para a tolerância ao norflurazon, acetoidroxiácido sintase (AHAS, aka

ALS, Sathasiivan et al. Nucl. Acids Res. 18: 2188 a 2193. 1990); e o gene bar para a tolerância ao glufosinato e bialafos (DeBlock, et al. EMBO J. 6: 2513 a 2519, 1987).

A tolerância a herbicida é um fenótipo desejável para plantas de safra. N-fosfonometilglicina, também conhecido como glifosato, é um herbicida bem conhecido que tem atividade em um amplo espectro de espécies vegetais. O glifosato é o ingrediente ativo de Roundup® (Monsanto Co.), um herbicida seguro tendo uma meia vida desejavelmente curta no ambiente. Quando aplicado a uma superfície da planta, o glifosato move-se sistemicamente através da planta. O glifosato é tóxico às plantas pela inibição do caminho do ácido chiquímico, que fornece um precursor para a síntese de aminoácidos aromáticos. Especificamente, o glifosato afeta a conversão de fosfoenolpiruvato e ácido 3-fosfochiquímico em ácido 5-enolpiruvil-3fosfochiquímico pela inibição da enzima 5-enolpiruvil-3-fosfochiquimato sintase (daqui em diante aludido como EPSP sintase ou EPSPS). Para os propósitos da presente invenção, o termo glifosato deve ser considerado incluir qualquer forma herbicidamente eficaz de N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal desta) e outras formas que resultam na produção do ânion glifosato na planta.

Através dos métodos de engendramento genético vegetal, é possível produzir plantas tolerantes ao glifosato inserindo-se no genoma da planta uma molécula de DNA que cause a produção de níveis mais altos de EPSPS do tipo selvagem (Shah et al., Science 233: 478 a 481, 1986). A tolerância ao glifosato também pode ser obtida pela expressão de variantes de EPSPS que tenham afinidade mais baixa ao glifosato e portanto retêm a sua atividade catalítica na presença de glifosato (Patente U.S. N- 5.633.435). As enzimas que degradam glifosato nos tecidos da planta (Patente U.S. N^Q5.463.175) também são capazes de conferir tolerância celular ao glifosato. Tais genes, portanto, permitem a produção de safras transgênicas que são tolerantes ao glifosato, permitindo deste modo que o glifosato seja usado para o controle eficaz de ervas daninhas com preocupações mínimas de dano à safra. Por exemplo, a tolerância a glifosato foi geneticamente engen• · · « · ·· · • « • « • · · drada no milho (Patente U.S. N^Q 5.554.798, 6.040.497), trigo (Zhou et al. Plant Cell Rep. 15: 159 a 163, 1995), soja (WO 9200377) e canola (WO 9204449).

As variantes da enzima de EPSPS do tipo selvagem foram isoladas que são resistentes ao glifosato como um resultado de alterações na seqüência codificadora de aminoácido EPSPS (Kishore et al., Annu. Rev. Biochem. 57: 627 a 663, 1988; Schulz etal., Arch. Microbiol. 137: 121 a 123. 1984; Sost et al., FEBS Lett. 173: 238 a 241, 1984; Kishore et al., Em Biotechnology for Crop Protections ACS Symposium Series N° 379. eds. Hedlin et al., 37 a 48, 1988). Estas variantes tipicamente têm um Ki mais alto para o glifosato do que a enzima de EPSPS do tipo selvagem que confere o fenótipo tolerante a glifosato, mas estas variantes também são caracterizadas por um alto K_m para PEP que torna a enzima cineticamente menos eficiente. Por exemplo, a K_m aparente para PEP e o K, aparente para glifosato para a EPSPS nativa da E. coli são 10 μΜ e 0,5 μΜ enquanto para um isolado resistente ao glifosato tendo uma única substituição de aminoácido de uma alanina no lugar da glicina na posição 96 estes valores são 220 μΜ e 4,0 mM, respectivamente. A Patente US N^e 6.040.497 relata que a mutação conhecida como a mutação TIPS (uma substituição de isoleucina no lugar da treonina na posição de aminoácido 102 e uma substituição de serina no lugar de prolina na posição de aminoácido 106) compreende duas mutações que quando introduzidas na seqüência de polipeptídeo da EPSPS de Zea mays confere a resistência ao glifosato à enzima. As plantas transgênicas contendo esta enzima mutante são tolerantes ao glifosato. As mutações idênticas podem ser feitas nas enzimas EPSPS sensíveis ao glifosato de outras fontes para criar enzimas resistente ao glifosato.

Uma variedade de enzimas de EPSPS nativas e variantes foi expressada em plantas transgênicas de modo a conferir a tolerância a glifosato (Singh, et al., Em Biosynthesis e Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, Amer Soc Plant Phys. Pubs., 1992). Os exemplos de algumas destas EPSPSs incluem aqueles descritos e/ou isolados de acordo com a Patente U.S. N⁵ 4.940.835. Patente U.S. N^Q 4.971.908, Patente U.S. N° • · · · · · »······«

Md

5.145.783, Patente U.S. N^s 5.188.642, Patente U.S. N⁹ 5.310.667 e Patente U.S. N⁹ 5.312.910. Elas também podem ser derivadas de uma classe estruturalmente distinta de genes de EPSPS não homólogos, tais como os genes de EPSPS de classe II isolado de Agrobacterium sp. cepa CP4 como descrito na Patente U.S. N⁹ 5.633.435 e Patente U.S. N⁹ 5.627.061.

Peptídeos de trânsito de cloroplasto (CTPs) são engendrados para serem fundidos ao término N da EPSPS bacteriana para direcionar as enzimas resistentes ao glifosato no cloroplasto da planta. Na EPSPS vegetal nativa, as regiões de peptídeo de trânsito de cloroplasto estão contidas na seqüência codificadora nativa (por exemplo, CTP2, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210: 47 a 442, 1987, aqui incorporada por referência em sua totalidade). O CTP nativo pode ser substituído com um CTP heterólogo durante a construção de um cassete de expressão vegetal de transgene. Muitas proteínas localizadas no cloroplasto, incluindo a EPSPS, são expressadas a partir de genes nucleares como precursores e são alvejadas ao cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) que é removido durante as etapas de importação. Os exemplos de outras de tais proteínas de cloroplasto incluem a subunidade pequena (SSU) de Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase, Ferredoxina, Ferredoxina oxidorreductase, a proteína I e a proteína II do complexo de colheita de luz e Tiorredoxina F. Foi demonstrado in vivo e in vitro que as proteínas que não de cloroplasto podem ser alvejados ao cloroplasto pelo uso de fusões de proteína com um CTP e que a seqüência de CTP é suficiente para alvejar uma proteína ao cloroplasto. A incorporação de um peptídeo de trânsito de cloroplasto adequado, tal como, o CTP de EPSPS da Arabidopsis thaliana (Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210: 437 a 442 (1987) e a CTP de EPSPS da Petunia hybrida (della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 6873 a 6877 (1986) foi mostrada alvejar as seqüências de proteína de EPSPS heterólogas aos cloroplastos nas plantas transgênicas. A produção de plantas tolerantes ao glifosato pela expressão de uma proteína de fusão que compreende um CTP de terminal amino com uma enzima de EPSPS resistente ao glifosato é bem conhecida por aqueles versados na técnica, (Patente U.S. N⁹ 5.627.061, Patente U.S. N^s 5.633.435.

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Patente U.S. N^Q 5.312.910, EP 0218571, EP 189707, EP 508909 e EP 924299). Aqueles versados na técnica reconhecerão que vários constructos quiméricos podem ser feitas que utilizam a funcionalidade de um CTP particular para importar enzimas de EPSPS resistentes ao glifosato no cloroplasto de célula vegetal.

Modificação e mudanças podem ser feitas na estrutura dos polinucleotídeos da invenção e ainda obter-se uma molécula que codifique uma proteína ou peptídeo funcionais com características desejáveis. O seguinte é um método com base na substituição do(s) códon(s) de um primeiro polinucleotídeo para criar um polinucleotídeo artificial equivalente ou ainda um melhorado, de geração secundária, onde este novo polinucleotídeo artificial é útil nos métodos de implantação de gene transgênico e expressão realçada. É considerado que as substituições de códon no polinucleotídeo de geração secundária pode em certos casos resultar em pelo menos um aminoácido diferente daquele do primeiro polinucleotídeo. A substituição de aminoácido pode fornecer uma característica melhorada à proteína, por exemplo, uma EPSP sintase resistente ao glifosato ou ela pode ser uma mudança conservada que não afeta substancialmente as características da proteína. O método fornece um polinucleotídeo artificial criado pela retro tradução de uma seqüência de polipeptídeo em um polinucleotídeo usando uma tabela do uso de códon, seguido pelas etapas de realçar as características do polipeptídeo artificial que o torna particularmente útil em plantas transgênicas.

Em formas de modalidades particulares da invenção, os polipeptídeos modificados que codificam proteínas resistentes a herbicida são considerados serem úteis para pelo menos um dos seguintes: conferir tolerância a herbicida em uma planta transformada ou transgênica, para melhorar a expressão de genes de resistência a herbicida em plantas, para o uso como marcadores selecionáveis para a introdução de outros traços de interesse em uma planta e para impedir a recombinação com um gene vegetal endógeno similar ou transgene existente permitindo ainda a implantação de gene sem o silenciamento de gene.

É conhecido que o código genético é degenerado. Os aminoáci37

dos e seus códon(s) de RNA são listados abaixo na Tabela 1. TABELA 1. Aminoácidos e os códons de RNA que os codificam. Aminoácido Códons

Histidina; His; H Isoleucina; Ile; I

Nome completo; código de 3 letras; código de 1 letra Alanina; Ala; A GCA GCC GCG GCU Cisteína; Cys ; C UGC UGU Ácido aspártico; Asp; D GAC GAU Ácido glutâmico; Glu; E GAA GAG Fenilalanina; Phe; FUUC UUU Glicina; Gly; G GGA GGC GGG GGU CAC CAU AUA AUC AUU

Lisina; Lys; KAAA AAG

Leucina ; Leu ; L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina; Met; M AUG

Asparagina; Asn; N AAC AAU

Prolina; Pro; P CCA CCC CCG CCU

Glutamina; Gin; Q CAA CAG

AGA AGG CGA CGC CGG CGU AGC AGU UCA UCC UCG UCU ACA ACC ACG ACU GUA GUCGUGGUU

Arginina; Arg; R Serina; Ser; S Treonina; Thr; T Valina; Vai; V

Triptofano; Trp; W UGG

Tirosina; Tyr; Y UAC UAU

Os códons são descritos em termos de bases de RNA, por exemplo, adenina, uracila, guanina e citosina, é o mRNA que é diretamente traduzido em polipeptídeos. É entendido que quando do planejamento de um polinucleotídeo de DNA para o uso em um constructo, as bases de DNA podem ser substituídas, por exemplo, timína ao invés de uracila.

É desejável fornecer plantas transgênicas que tenham fenótipos agronomicamente melhorados múltiplos. Freqüentemente a tolerância a herbicida é usada como um marcador selecionável para ajudar na produção de

plantas transgênicas que podem possuir genes adicionais de importância agronômica. A implantação dos transgenes pelos métodos de cruzamento tradicionais ou pela retransformação de uma primeira planta transgênica com um cassete de expressão vegetal adicional pode incluir a introdução de genes ou elementos genéticos que têm seqüência de polinucleotídeo idêntica ou quase idêntica. A progênie contendo estes genes implantados pode ser suscetível à perda da expressão de gene devido ao silenciamento de gene. O método da presente invenção fornece uma molécula de polinucleotídeo modificada que codifica uma proteína resistente a herbicida. As moléculas de polinucleotídeo são planejadas para serem suficientemente divergentes em seqüência de polinucleotídeo de outras moléculas de polinucleotídeo que codificam a mesma proteína de resistência a herbicida. Estas moléculas podem então coexistir na mesma célula vegetal sem a preocupação do silenciamento de gene.

A seqüência de polinucleotídeo divergente é criada usando-se uma tabela de uso de códon construída a partir de seqüências codificadoras conhecidas de várias espécies vegetais. Por exemplo, as tabelas de uso de códon para Arabidopsis thaliana, Zea mays e Glicina max podem ser usadas no método para planejar os polinucleotídeos da presente invenção. Outras tabelas de uso de códon de outras plantas também podem ser usadas por aqueles versados na técnica.

A primeira etapa no método para planejar uma nova molécula de polinucleotídeo artificial que codifica uma proteína de tolerância a herbicida é o uso de uma tabela de uso de códon para determinar o uso de códon percentual em uma espécie vegetal para cada aminoácido da proteína de tolerância a herbicida, seguida pela substituição de pelo menos um de cada oito códons contíguos com um códon diferente selecionado da tabela de uso de códon e ajustando o uso de códon percentual para cada aminoácido codificado pelo polinucleotídeo até substancialmente o mesmo uso de códon percentual encontrado na tabela de uso de códon. As etapas adicionais podem incluir a introdução de um códon de parada translacional na segunda e terceira matriz de leitura aberta da nova seqüência de polinucleotídeo; elimi-

nando alguns códons de partida translacionais na segunda e na terceira matrizes de leitura aberta; ajustando a relação GC:AT local para cerca de 2:1 em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos; rompendo sinais de poliadenilação potenciais ou sítios de junção de intron potenciais; removendo pelo me5 nos um sítio de enzima de restrição de seis nucleotídeos contíguos ou mais; e comparando a identidade de seqüência do novo polinucleotídeo artificial com um polinucleotídeo existente que codifica a mesma ou proteína similar de modo que a identidade de seqüência entre os dois polinucleotídeos não seja mais do que 85 por cento.

Uma retrotradução de uma seqüência de proteína para uma seqüência de nucleotídeo pode ser realizada usando uma tabela de uso de códon, tal como aquela encontrada no Genetics Computer Group (GCG) SeqLab ou outros programas de análise de DNA conhecidos por aqueles versados na técnica de análise de DNA ou como fornecido nas Tabelas 2, 3 e 4 da presente invenção. A tabela de uso de códon para Arabidopsis thaliana (Tabela 2), Zea mays (Tabela 3) e Glicina max (Tabela 4) são exemplos de tabelas que podem ser construídas para espécies vegetais, as tabelas de uso de códon também podem ser construídas que representam o uso de códon de monocotiledônea ou dicotiledônea.

Tabela 2. Tabela de uso de códon de Arabidopsis thaliana.

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Gly	GGG	188335,00	10,18	0,16
Gly	GGA	443469,00	23,98	0,37
Gly	GGT	409478,00	22,14	0,34
Gly	GGC	167099,00	9,03	0,14

Glu	GAG	596506,00	32,25	0,48
Glu	GAA	639579,00	34,58	0,52
Asp	GAT	683652,00	36,96	0,68
Asp	GAC	318211,00	17,20	0,32

Vai	GTG	320636,00	17,34	0,26

········

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Vai	GTA	185889,00	10,05	0,15
Vai	GTT	505487,00	27,33	0,41
Vai	GTC	235004,00	12,71	0,19

Ala	GCG	162272,00	8,77	0,14
Ala	GCA	323871,00	17,51	0,27
Ala	GCT	521181,00	28,18	0,44
Ala	GCC	189049,00	10,22	0,16

Arg	AGG	202204,00	10,93	0,20
Arg	AGA	348508,00	18,84	0,35
Ser	AGT	260896,00	14,11	0,16
Ser	AGC	206774,00	11,18	0,13

Lys	AAG	605882,00	32,76	0,51
Lys	AAA	573121,00	30,99	0,49
Asn	AAT	418805,00	22,64	0,52
Asn	AAC	385650,00	20,85	0,48

Met	ATG	452482,00	24,46	1,00
Ile	ATA	235528,00	12,73	0,24
Ile	ATT	404070,00	21,85	0,41
Ile	ATC	341584,00	18,47	0,35

Thr	ACG	140880,00	7,62	0,15
Thr	ACA	291436,00	15,76	0,31
Thr	ACT	326366,00	17,65	0,34
Thr	ACC	190135,00	10,28	0,20

Trp	TGG	231618,00	12,52	1,00
End	TGA	19037,00	1,03	0,43
Cys	TGT	196601,00	10,63	0,60
Cys	TGC	131390,00	7,10	0,40

··· • ·	• · · · · • · · • · ·	999 9 9 9	« ·_# 99999·99 99 9 9 9 9 * * * .	9 9
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Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração


End	TAG	9034,00	0,49	0,20
End	TAA	16317,00	0,88	0,37
Tyr	TAT	276714,00	14,96	0,52
Tyr	TAC	254890,00	13,78	0,48

Leu	TTG	389368,00	21,05	0,22
Leu	TTA	237547,00	12,84	0,14
Phe	TTT	410976,00	22,22	0,52
Phe	TTC	380505,00	20,57	0,48

Ser	TCG	167804,00	9,07	0,10
Ser	TCA	334881,00	18,11	0,20
Ser	TCT	461774,00	24,97	0,28
Ser	TCC	203174,00	10,99	0,12

Arg	CGG	88712,00	4,80	0,09
Arg	CGA	115857,00	6,26	0,12
Arg	CGT	165276,00	8,94	0,17
Arg	CGC	69006,00	3,73	0,07

Gin	CAG	280077,00	15,14	0,44
Gin	CAA	359922,00	19,46	0,56
His	CAT	256758,00	13,88	0,62
His	CAC	160485,00	8,68	0,38

Leu	CTG	183128,00	9,90	0,11
Leu	CTA	184587,00	9,98	0,11
Leu	CTT	447606,00	24,20	0,26
Leu	CTC	294275,00	15,91	0,17

Pro	CCG	155222,00	8,39	0,17
Pro	CCA	298880,00	16,16	0,33

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Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Pro	CCT	342406,00	18,51	0,38
Pro	CCC	97639,00	5,28	0,11

Tabela 3. Tabela de uso do códon de Zea mays

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Gly	GGG	8069,00	15,19	0,21
Gly	GGA	7100,00	13,37	0,18
Gly	GGT	7871,00	14,82	0,20
Gly	GGC	15904,00	29,94	0,41

Glu	GAG	22129,00	41,67	0,68
Glu	GAA	10298,00	19,39	0,32
Asp	GAT	11996,00	22,59	0,41
Asp	GAC	17045,00	32,09	0,59

Vai	GTG	13873,00	26,12	0,38
Vai	GTA	3230,00	6,08	0,09
Vai	GTT	8261,00	15,55	0,23
Vai	GTC	11330,00	21,33	0,31

Ala	GCG	11778,00	22,18	0,24
Ala	GCA	8640,00	16,27	0,18
Ala	GCT	11940,00	22,48	0,24
Ala	GCC	16768,00	31,57	0,34

Arg	AGG	7937,00	14,94	0,27
Arg	AGA	4356,00	8,20	0,15
Ser	AGT	3877,00	7,30	0,10
Ser	AGC	8653,00	16,29	0,23

Lys	AAG	22367,00	42,11	0,74
Lys	AAA	7708,00	14,51	0,26
Asn	AAT	6997,00	13,17	0,36

:··«	··« •	·♦ • ·	··· · •	• ·· ········ ·· · · · ·	··
• ·	•	• ·	•	• · · ·
···	• •	• · • ·	• • ·	• · · · • · · ·
	···	• ·	··	······· · ·	• ·

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Asn	AAC	12236,00	23,04	0,64

Met	ATG	12841,00	24,18	1,00
Ile	ATA	3997,00	7,53	0,16
Ile	ATT	7457,00	14,04	0,31
Ile	ATC	12925,00	24,34	0,53

Thr	ACG	5665,00	10,67	0,22
Thr	ACA	5408,00	10,18	0,21
Thr	ACT	5774,00	10,87	0,22
Thr	ACC	9256,00	17,43	0,35

Trp	TGG	6695,00	12,61	1,00
End	TGA	591,00	1,11	0,45
Cys	TGT	2762,00	5,20	0,30
Cys	TGC	6378,00	12,01	0,70

End	TAG	411,00	0,77	0,32
End	TAA	299,00	0,56	0,23
Tyr	TAT	4822,00	9,08	0,31
Tyr	TAC	10546,00	19,86	0,69

Leu	TTG	6677,00	12,57	0,14
Leu	TTA	2784,00	5,24	0,06
Phe	TTT	6316,00	11,89	0,32
Phe	TTC	13362,00	25,16	0,68

Ser	TCG	5556,00	10,46	0,14
Ser	TCA	5569,00	10,49	0,15
Ser	TCT	6149,00	11,58	0,16
Ser	TCC	8589,00	16,17	0,22

Arg	CGG	4746,00	8,94	0,16

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Arg	CGA	2195,00	4,13	0,07
Arg	CGT	3113,00	5,86	0,10
Arg	CGC	7374,00	13,88	0,25

Gin	CAG	13284,00	25,01	0,64
Gin	CAA	7632,00	14,37	0,36
His	CAT	5003,00	9,42	0,39
His	CAC	7669,00	14,44	0,61

Leu	CTG	13327,00	25,09	0,28
Leu	CTA	3785,00	7,13	0,08
Leu	CTT	8238,00	15,51	0,17
Leu	CTC	12942,00	24,37	0,27

Pro	CCG	8274,00	15,58	0,27
Pro	CCA	7845,00	14,77	0,26
Pro	CCT	7129,00	13,42	0,23
Pro	CCC	7364,00	13,87	0,24

Tabela 4. Tabela de uso do códon de Glicina max

Aminoácido Codon Número /1000 Fração

Gly	GGG	3097,00	12,82	0,18
Gly	GGA	5434,00	22,49	0,32
Gly	GGT	5248,00	21,72	0,31
Gly	GGC	3339,00	13,82	0,20

Glu	GAG	8296,00	34,33	0,50
Glu	GAA	8194,00	33,91	0,50
Asp	GAT	7955,00	32,92	0,62
Asp	GAC	4931,00	20,40	0,38

Vai	GTG	5342,00	22,11	0,32
Vai	GTA	1768,00	7,32	0,11

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Vai	GTT	6455,00	26,71	0,39
Vai	GTC	2971,00	12,29	0,18

Ala	GCG	1470,00	6,08	0,08
Ala	GCA	5421,00	22,43	0,31
Ala	GCT	6796,00	28,12	0,38
Ala	GCC	4042,00	16,73	0,23

Arg	AGG	3218,00	13,32	0,28
Arg	AGA	3459,00	14,31	0,30
Ser	AGT	2935,00	12,15	0,17
Ser	AGC	2640,00	10,92	0,15

Lys	AAG	9052,00	37,46	0,59
Lys	AAA	6370,00	26,36	0,41
Asn	AAT	5132,00	21,24	0,48
Asn	AAC	5524,00	22,86	0,52

Met	ATG	5404,00	22,36	1,00
Ile	ATA	3086,00	12,77	0,23
Ile	ATT	6275,00	25,97	0,47
Ile	ATC	3981,00	16,47	0,30

Thr	ACG	1006,00	4,16	0,08
Thr	ACA	3601,00	14,90	0,29
Thr	ACT	4231,00	17,51	0,34
Thr	ACC	3562,00	14,74	0,29

Trp	TGG	2866,00	11,86	1,00
End	TGA	221,00	0,91	0,36
Cys	TGT	1748,00	7,23	0,49
Cys	TGC	1821,00	7,54	0,51

ϋΜ

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

End	TAG	143,00	0,59	0,23
End	TAA	256,00	1,06	0,41
Tyr	TAT	3808,00	15,76	0,51
Tyr	TAC	3667,00	15,17	0,49

Leu	TTG	5343,00	22,11	0,24
Leu	TTA	2030,00	8,40	0,09
Phe	TTT	4964,00	20,54	0,49
Phe	TTC	5067,00	20,97	0,51

Ser	TCG	1107,00	4,58	0,06
Ser	TCA	3590,00	14,86	0,21
Ser	TCT	4238,00	17,54	0,24
Ser	TCC	2949,00	12,20	0,17

Arg	CGG	683,00	2,83	0,06
Arg	CGA	964,00	3,99	0,08
Arg	CGT	1697,00	7,02	0,15
Arg	CGC	1538,00	6,36	0,13

Gin	CAG	4147,00	17,16	0,46
Gin	CAA	4964,00	20,54	0,54
His	CAT	3254,00	13,47	0,55
His	CAC	2630,00	10,88	0,45

Leu	CTG	2900,00	12,00	0,13
Leu	CTA	1962,00	8,12	0,09
Leu	CTT	5676,00	23,49	0,26
Leu	CTC	4053,00	16,77	0,18

Pro	CCG	1022,00	4,23	0,08
Pro	CCA	4875,00	20,17	0,37
Pro	CCT	4794,00	19,84	0,36

• · · · · • · ·

Aminoácido	Codon	Número	/1000	Fração

Pro	CCC	2445,00	10,12	0,19

As tabelas de uso de códon são bem conhecidas na técnica e podem ser encontradas nos bancos de dados de gene por exemplo, banco de dados do Genbank. O Banco de Dados do Uso de Códon é uma versão WWW extendida de CUTG (Uso de Códon Tabulado do Genbank). A fre5 qüência de uso de códon em cada organismo é feito pesquisável através deste local da World Wide Web (Nakamura et al. Nucleic Acids Res. 28: 292, 2000).

Em várias formas de realização da invenção, as etapas podem ser realizadas em qualquer ordem ou simultaneamente. Qualquer ou todas as etapas podem ser realizadas no planejamento de um polinucleotídeo artificial da invenção. Cada etapa é descrita em detalhes abaixo.

Os códons diferentes para um aminoácido particular deve ser distribuído por todo o polinucleotídeo com base no uso de códon percentual aproximado para espécies particulares a partir de uma tabela de uso de có15 don. Cachos locais de códons idênticos devem ser evitados. Pelo menos um códon é substituído para cada oito códons contíguos para fornecer divergência suficiente de seqüências de polinucleotídeo que codificam proteínas idênticas ou similares. Exceto onde especificamente desejado, por exemplo, para fornecer uma enzima tolerante a herbicida, a proteína codificada per20 manece inalterada pela substituição de um códon no lugar de um outro códon que é traduzido ao mesmo aminoácido como listado na Tabela 1.

Em formas de realização da presente invenção, correções são feitas para a relação GC:AT local de um polinucleotídeo ajustando-se a relação GC:AT local para ser aproximadamente a mesma relação como o poli25 nucleotídeo de tamanho natural, mas não maior do que 2X em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos contíguos da molécula de polinucleotídeo. A faixa de relações GC:AT de um polinucleotídeo usando as tabelas de uso de códon de plantas dicotiledôneas deve ser de cerca de 0,9 a cerca de 1,3 e para as plantas monocotiledôneas de cerca de 1,2 a cerca de 1,7. A relação

GC:AT local pode ser importante na manutenção da estrutura secundária apropriada de RNA. As regiões que compreendem muitas bases A+T ou bases G+C consecutivas são prognosticadas ter uma probabilidade maior para formar estruturas de grampo de cabelo devido à autocomplementaridade. Portanto, a substituição com um códon diferente pode reduzir a probabilidade de formação de estrutura secundária autocomplementar, que é conhecida reduzir a transcrição e/ou tradução em alguns organismos. Na maioria dos casos, os efeitos adversos podem ser minimizados usando-se moléculas de polinucleotídeo que não contenham mais do que cinco A+T ou G+C consecutivos. O comprimento máximo da trilha GC local (sem qualquer nucleotídeo AT) não deve ser maior do que 10 nucleotídeos. Portanto os códons que codificam proteínas ricas em Gly, Ala, Arg, Ser e Pro podem ser substituídos para impedir cachos longos de nucleotídeos GC. Os códons ricos em GC listados podem ser usados em combinação com os códons ricos em AT para os aminoácidos Lys, Asn, Ile, Tyr, Leu, Phe e vice versa para corrigir a relação GC:AT local.

Uma checagem da identidade de seqüência usando ferramentas de alinhamento de seqüência de nucleotídeo tais como o programa GAP (GCG, Madison, Wl) pode ser feita imediatamente depois da retrotradução para garantir que a seqüência gerada tenha grau apropriado de diversidade de seqüência. A seqüência de polinucleotídeo contígua maior do que 23 nucleotídeos que têm cem por cento de identidade de seqüência deve ser eliminado realizando-se substituições de códon nestes comprimentos de seqüência.

Os códons de partida translacionais (ATG do DNA, AUG no mRNA) presentes na segunda matriz de leitura (matriz b), a terceira matriz de leitura (matriz ”c”) e as matrizes de leitura reversa (matriz d, e, f). O segundo e terceiro códons de início de matriz podem iniciar a tradução, entretanto muito menos eficientemente do que o primeiro. Portanto, se um ou dois AUG são encontrados próximos à extremidade 5' de uma molécula de mRNA reside na matriz b ou c pode ser benéfico eliminá-los em uma região de polinucleotídeo que contenha pelo menos os primeiros três códons y

Met na matriz a. Também, se a seqüência de proteína não tem mais do que um Met na matriz a, então eliminar tanto quanto possível das matrizes avançadas b ou c. Para realizar isto, por exemplo, os códons para aminoácidos, Asp, Asn, Tyr, His na proteína de interesse seguido por qualquer um dos aminoácidos: Gly, Glu, Asp, Vai ou Ala, pode ser substituído para eliminar um códon de partida na segunda matriz. A seqüência GATGGG codifica os aminoácidos Asp-Gly e forma um ATG na matriz de leitura b. Quando a seqüência é modificada para GACGGG, o início ATG é eliminado e a seqüência ainda codifica Asp-Gly. Uma estratégia similar é usada para eliminar códons de partida na matriz de leitura c. A combinação de um aminoácido selecionado do grupo de Gly, Glu, Vai, Ala, Arg, Lys, Ile, Thr, Cys, Tyr, Leu, Ser, His ou Pro seguido por Trp pode resultar na formação no ATG na terceira matriz de leitura do gene. Nesta situação, o primeiro códon pode ser mudado para ter um nucleotídeo outro que não A na terceira posição.

A eliminação do códon de ATG no filamento de DNA complementar do gene nas matrizes alternadas (d, e, e/ou f) sem mudar a seqüência de aminoácido da proteína pode ser realizada em uma maneira similar. Esta modificação reduz a probabilidade de tradução mesmo se o transgene é integrado em um genoma vegetal em uma orientação que permite a transcrição do mRNA de complemento reverso de um promotor vegetal nativo. A tradução de qualquer matriz de leitura reversa pode ser minimizada pela introdução de um códon de parada em todas as três matrizes de leitura reversa como descrito abaixo.

A criação de códons de parada para todas as três matrizes do DNA complementar pode ser realizada como segue. Os códons Leu (TTA e CTA) e Ser (TCA) produzem três códons de parada diferentes no filamento de complemento reverso. Se aqueles aminoácidos podem ser encontrados no término C da proteína de interesse, seus códons podem ser usados para gerar paradas no filamento complementar na matriz de leitura d. Para gerar um códon de parada na matriz de leitura e de filamento complementar, encontrar os aminoácidos Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gly, His, Ile, Leu Phe, Pro,

Ser, Thr, Tyr ou Vai seguidos pelos aminoácidos Gin, His ou Tyr da proteína de interesse. Por exemplo, a seqüência de polinucleotídeo de GCCCAC que codifica os aminoácidos Ala-His pode ser modificada para GCTCAC. A seqüência complementar, GTGAGC, terá agora o códon de parada TGA mostrado em itálicos. Quando a proteína de interesse tem um Ala, Ile, Leu, Phe, Pro, Ser, Thr ou Vai seguido por um Arg, Asn, Ile, Lys, Met ou Ser a matriz de leitura no filamento complementar pode ser modificada para ter um códon de parada na matriz de leitura ”f' do filamento complementar. A seqüência de polinucleotídeo ATATCT para Ile e Ser pode ser modificada para ATCAGT para gerar códon de parada no filamento complementar como mostrado em itálicos, ACTGAT. A combinação de códons para Phe seguido por qualquer um dos códons para os aminoácidos Asn, Ile, Lys, Met ou Thr sempre gerará códon de parada na matriz do filamento complementar e ou llflt

Para criar um códon de parada na matriz de leitura avançada b, a matriz de leitura a deve terminar nos nucleotídeos TA ou TG. A pesquisa da proteína de interesse quanto aos aminoácidos Ile, Leu, Met ou Vai em combinação com qualquer um dos seguintes aminoácidos: Ala, Arg, Asn Asp, Glu, Gly, Ile, Lys, Met, Ser, Thr ou Vai. Por exemplo, se a seqüência de polinucleotídeo que codifica os aminoácidos Met-Ser é ATGTCT, ela pode ser modificada para ATGAGT para produzir um códon de parada TGA na segunda matriz de leitura.

Para ser capaz de criar um códon de parada para a matriz de leitura c, a matriz de leitura a deve ter o nucleotídeo T na terceira posição e o códon seguinte deve começar de AA, AG ou GA. Para encontrar códons adequados para modificar, procurar a proteína de interesse para qualquer um dos aminoácidos: Ala, Asn, Asp, Arg, Cys, Gly, His, Ile, Leu Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr ou Vai seguidos por qualquer um dos seguintes aminoácidos: Arg, Asn, Asp, Glu, Lys ou Ser. Por exemplo, se a seqüência de nucleotídeo para os aminoácidos Gly-Glu é GGAGAG, a seqüência pode ser modificada to GGTGAG para criar um códon de parada TGA na terceira matriz de leitura.

Uma outra modificação útil nos métodos de planejamento de polinucleotídeo artificial da presente invenção é eliminar sítios de restrição não desejados e outros padrões de seqüência específicos. Os sítios de restrição podem interferir com a clonagem e as manipulações de gene futuras. Por exemplo, alguns sítios de restrição habitualmente usados na clonagem de gene incluem, mas não são limitados, às enzimas de restrição do Tipo il com 6 ou mais bases que não de N listadas na Tabela 5 abaixo que é um excerto do banco de dados de endonuclease de restrição da New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA, USA). A procura quanto aos sítios de reconhecimento de enzima de restrição pode ser feita usando a aplicação da função Map encontrada no GCG SeqLab ou uma aplicação similar contida em outros programas de análise de DNA conhecidos por aqueles versados na técnica de análise de DNA. As enzimas de restrição também podem ser adicionadas à seqüência para facilitar a clonagem. Por exemplo, o sítio de restrição Clal é colocado em CP4EPSPS versão AT (SEQ ID NO: 17) e ZM (SEQ ID NO: 18) para gerar seqüências recombinantes pela mudança de fragmento e para facilitar a síntese de gene usando fragmentos de nucleotídeo que podem ser montados no gene inteiro. A seqüência de polinucleotídeo CTP2 de peptídeo de trânsito (SEQ ID NO: 12) é conectado com CP4EPSPS pelo sítio de restrição Sphl para facilitar a substituição de CTP2 com versões de nucleotídeo diferentes de CTP2 (SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14) ou polinucleotídeos que codificam peptídeos de trânsito de cloroplasto diferentes. Por exemplo, na EPSPS de arroz, o sítio de restrição NgaMIV é preservado em tomo da posição de nucleotídeo 205 em todas as versões artificiais para facilitar a mudança da região codificadora do peptídeo de trânsito de cloroplasto. Também, para a EPSPS da soja a seqüência de polinucleotídeo para o peptídeo de trânsito de cloroplasto é separada do peptídeo maduro pelo sítio de restrição para Sacll endonuclease.

É entendido que a modificação dos sítios de endonuclease de restrição não é requerida, mas é útil para outras manipulações das moléculas de DNA. A Tabela 5 fornece uma lista de endonucleases de restrição, aquelas de interesse particular para a presente invenção são marcadas com

um asterisco. Outros sítios de endonuclease de restrição desejáveis para a eliminação ou adição a um polinucleotídeo artificial da presente invenção estarão evidentes àqueles versados na técnica e não são limitadas por aquelas listadas na Tabela 5.

Tabela 5. Seqüências de reconhecimento de enzimas de restrição

Enzimas	Seqüência de reconhet
Aatll	G_ACGT^AC
*Accl	GT^AMK_AC
Acc65l	G^AGTAC_C
Acell	G_CTAG^AC-
Acll	AA^ACG_TT
Acyl	GR^ACG_YC
Afel	AGC^AGCT
Aflll	C^ATTAA_G
‘Afllll	A^ACRYG_T
Agel	A^ACCGG_T
Ahalll	TTT^AAAA
Apal	G_GGCC^AC
ApaLI	G^ATGCA_C
Apol	R^AAATT_Y
Ascl	GG^ACGCG_CC
Asei	AT^ATA_AT
AsiSI	GCG_AT^ACGC
Asull	TT^ACG_AA
Aval	C^AYCGR_G
Avalll	ATGCAT
Avrll	C^ACTAG_G
Bali	TGG^ACCA
‘BamHI	G^AGATC_C
Bani	G^AGYRC_C
Banll	G_RGCY^AC
*Bbel	G_GCGC^AC
BbvCI	CC^ATCA_GC
‘Bell	T^AGATC_A
Betl	W^ACCGG_W
BfrBI	ATG^ACAT

Enzimas *Bglll

BloHII

Blpi

Bme1580l

Bmgl

BpulOI

Bsal

BsaAI

BsaHI

BsaWI

Bsbl

BsePI

BseSI

Bsil

BsiEI

BsiWI

Bsml

Bsp1286l

Bsp1407l

BspEI

BspGI

BspHI

BspLU11l

BspMII

BsrBI

BsrDI

BsrFI

BsrGI

BssHII

BssSI

BstAPI

BstBI

BstEII

BstXI

BstYI

Seqüência de reconhecimento A^AGATC_T CTGCA^AG GC^ATNA_GC G_KGCM^AC

GKGCCC

CC^ATNA_GC

GGTCTCN^ANNNN_

YAC^AGTR

GR^ACG_YC

W^ACCGG_W

CAACAC

G^ACGCG_C

G_KGCM^AC

C^AACGA_G

CG_RY^ACG

C^AGTAC_G

GAATG_CN^A

G_DGCH^AC

T^AGTAC_A

T^ACCGG_A

CTGGAC

T^ACATG_A

A^ACATG_T

T^ACCGG_A

CCG^ACTC

GCAATG_NN^A

R^ACCGG_Y

T^AGTAC_A

G^ACGCG_C

C^AACGA_G

GCAN_NNN^ANTGC

TT^ACG_AA

G^AGTNAC_C

CCAN_NNNN^ANTGG

R^AGATC_Y

Enzimas

BstZ17l

Bsu36l

Btgl Btrl Btsl Cfrl CfrlOI *Clal Dral Drall Drdll Dsal Eael Eagl Ecl136ll Eco47lll Eco NI EcoO109l ‘EcoRI ‘EcoRV Espl *Fsel *Fspl FspAI Gdill Hael Haell HgiAI HgiCI HgiJII *Hincll Hindll ‘Hindlll *Hpal Kasl

Seqüência de reconhecimento GTA^ATAC

CC^ATNA_GG

C^ACRYG_G

CAC^AGTC

GCAGTG_NN^A

Y^AGGCC_R

R^ACCGG_Y

AT^ACG_AT

TTT^AAAA

RG^AGNC_CY

GAACCA

C^ACRYG_G

Y^AGGCC_R

C^AGGCC_G

GAG^ACTC

AGC^AGCT

CCTNN^AN_NNAGG

RG^AGNC_CY

G^AAATT_C

GAT^AATC

GC^ATNA_GC

GG_CCGG^ACC

TGC^AGCA

RTGC^AGCAY

C^AGGCC_R

WGG^ACCW

R_GCGC^AY

G_WGCW^AC

G^AGYRC_C

G_RGCY^AC

GTY^ARAC

A^AAGCT_T

GTT^AAAC

G^AGCGC_C

<2>3

Enzimas	Seqüência de reconhecimento
*Kpnl	G_GTAC^AC
Lpnl	RGC^AGCY
Mcrl	CG_RY^ACG
Mfel	C^AAATT_G
*Mlul	A^ACGCG_T
Mscl	TGG^ACCA
MspA11	CMG^ACKG
Mstl	TGC^AGCA
Nael	GCC^AGGC
Narl	GG^ACG_CC
*Ncol	C^ACATG_G
*Ndel	CA^ATA_TG
*NgoMIV	G^ACCGG_C
*Nhel	G^ACTAG_C
NIÍ3877I	C_YCGR^AG
*Notl	GC^AGGCC_GC
*Nrul	TCG^ACGA
*Nsil	A_TGCA^AT
Nspl	R_CATG^AY
NspBII	CMG^ACKG
*Pacl	TTA_AT^ATAA
*Pcil	A^ACATG_T
Pfl11081	TCGTAG
‘PfIMI	CCAN_NNN^ANTGG
PmaCI	CAC^AGTG
Pmel	GTTT^AAAAC
Pmll	CAC^AGTG
PpulOI	A^ATGCA_T
*PpuMI	RG^AGWC_CY
PshAI	GACNN^ANNGTC
Psil	TTA^ATAA
‘PspOMI	G^AGGCC_C
Pssl	RG_GNC^ACY
‘Pstl	C_TGCA^AG
*Pvul	CG_AT^ACG

Enzimas *Pvull

Rsrll *Sacl *Sacll *Sall

SanDI

Sapl

Saul

Sbfl *Scal

Scil

Sdul

SexAI

Sfcl

Sfel

Sfil

Sfol

Sgfl

SgrAI *Smal

Smll

Snal *SnaBI *Spel *Sphl

Spll

Srfl

Sse232l

Sse8387l

Sse8647l *Sspl *Stul *Styl *Swal

Tatl

Seqüência de reconhecimento CAG^ACTG

CG^AGWC_CG

G_AGCT^AC

CC_GC^AGG

G^ATCGA_C

GG^AGWC_CC

GCTCTTCN^ANNN_

CC^ATNA_GG

CC_TGCA^AGG

AGT^AACT

CTC^AGAG

G_DGCH^AC

A^ACCWGG_T

C^ATRYA_G

GGCCN_NNN^ANGGCC

GGC^AGCC

GCG_AT^ACGC

CR^ACCGG_YG

CCC^AGGG

C^ATYRA_G

GTATAC

TAC^AGTA

A^ACTAG_T

G_CATG^AC

C^AGTAC_G

GCCC^AGGGC

CG^ACCGG_CG

CC_TGCA^AGG

AG^AGWC_CT

AAT^AATT

AGG^ACCT

C^ACWWG_G

ATTT^AAAAT

W^AGTAC_W

• · ······»· • · · · • · · · · • · * φ · · · · » (ÓA>

Enzimas	Seqüência de reconhí
UbaMI	TCCNGGA
UbaPI	CGAACG
*Vspl	AT^ATA_AT
*Xbal	T^ACTAG_A
*Xhol	C^ATCGA_G
Xholl	R^AGATC_Y
*Xmal	C^ACCGG_G
Xmalll	C^AGGCC_G
Xmnl	GAANN^ANNTTC
Zral	GAC^AGTC

Uma pesquisa padrão pode ser realizada para encontrar seqüências desestabilizadoras e sítios de poliadenilação potenciais e depois romper ou eliminá-las como descrito na Patente US N^? 5.500.365. Certos trechos longos de regiões ricas em AT, por exemplo, o motivo de seqüência ATTTA (ou AUUUA, como aparece no RNA) foi implicado como uma seqüência desestabilizadora em mRNA de célula de mamífero (Shaw e Kamen, Cell 46: 659 a 667, 1986). Muitos mRNAs de vida curta têm regiões não traduzidas 3' ricas em A+T e estas regiões freqüentemente têm a seqüência ATTTA, algumas vezes presente em cópias múltiplas ou como multímeros (por exemplo, ATTTATTTA . . .). Shaw e Kamen mostraram que a transferência da extremidade 3' de um mRNA instável para um RNA estável (globina ou VA1) diminuiu a meia vida do RNA estável dramaticamente. Eles mostraram ainda que um pentâmero de Al l IA teve um efeito desestabilizador profundo em uma mensagem estável e que este sinal pode exercer o seu efeito se ele estiver localizado na extremidade 3' ou dentro da seqüência codificadora. Entretanto, o número de seqüências Al I IA e/ou o contexto de seqüência em que elas ocorrem também parece ser importante na determinação se elas funcionam como seqüências desestabilizadoras. Eles também mostraram que um trímero de Al l lA teve muito menos efeito do que um pentâmero sobre a estabilidade de mRNA e um dímero ou um monômero não teve nenhum efeito sobre a estabilidade. Note que os multímeros de ATTTA tais como um pentâmero automaticamente cria uma região rica em

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A+T. Em outros mRNAs instáveis, a seqüência ATTTA pode estar presente em apenas uma única cópia, mas está freqüentemente contida em uma região rica em A+T. Uma repetição de 11 pentâmeros de AUUUA mostraram alvejar transcritos repórter para a degradação rápida em plantas (OhmeTakagi et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 90, 11811 a 11815, 1993). A seqüência ATTTA pode ser formada pela combinação de códons para o aminoácido Ile (ATT) e Tyr (TAT) como mostrado A11 /AT. Um outro exemplo pode ser os códons que terminam em AT como em Asn, Asp, His ou Tyr, seguido pelo códon TTA para Leu (por exemplo, AATTTA). Também o códon para Phe (UUU) quando colocado entre os códons que termina em A e começa em A formará o motivo ATTTA. Para eliminar este motivo usualmente a mudança de nucleotídeo único é suficiente como no exemplo mostrado: GCA7TTAGC muda para GCATTCAGC ou GCCTTTAGC. Todos os três polinucleotídeos mostrados codificam Ala-Phe-Arg.

Mais seqüências que atuam em cis que alvejam o transcrito para a rotação rápida em plantas e em outro sistema foram identificadas (Abler e Green, Plant Mol. Biol. 32: 63 a 78, 1997). Estas incluem o elemento DST que consiste em três subdomínios altamente conservados separados pelas duas regiões variáveis encontradas a jusante do códon de parada dos transcritos SAUR (Newmaan etal., Vegetal Cell 5: 701 a 714, 1993). A seqüência conservada de DST consiste em GGAG(N5)CArAGAn'G(N₇)CATTTTG7'A7', onde os resíduos altamente conservados são mostrados em tipo itálico. O segundo e terceiro subdomínios de elementos DST contêm resíduos que são invariáveis entre os elementos DST e são chamados de ATAGAT e GTA, respectivamente. Ambos destes subdomínios são necessários para a função DST. Novas seqüências de polinucleotídeo artificiais são tríadas quanto a presença de motivos conservados de elementos DST GGAG, ATAGATT, CATTT e CAI I I IGTAT. Estas seqüências são eliminadas pelas substituições de base de códons que preservam a seqüência de proteína codificada pelo polinucleotídeo. Os motivos de seqüência DST GGAG, ATAGAT, CATTT e GTAT que apareceram em cachos ou padrões similares à seqüência de DST conservada também são eliminados pelas substituições γ

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de base.

As seqüências de polinucleotídeo que possivelmente podem funcionar como sítios de poliadenilação são eliminados no novo planejamento de polinucleotídeo (Patente U.S. N° 5.500.365). Estes sinais de poliadenilação podem não atuar como sítios poliA apropriados, mas ao invés funcionam como sítios aberrantes que dão origem aos mRNAs instáveis.

A adição de um cordão poliadenilado à extremidade 3' de um mRNA é comum à maior parte dos mRNAs eucarióticos. Contidos dentro estes transcritos de mRNA são sinais para a poliadenilação e a formação da extremidade 3' apropriada. Este processamento na extremidade 3' envolve a divagem do mRNA e a adição de poliA à extremidade 3' madura. Pesquisando-se quanto as seqüências de consenso próximas ao trato poliA nos mRNAs tanto vegetal quanto animal, foi possível identificar seqüências de consenso que aparentemente estão envolvidas na adição de poliA e na divagem da extremidade 3'. As mesmas seqüências de consenso parecem ser importantes a ambos destes processos. Estes sinais são tipicamente uma variação na seqüência AATAAA. Em células de animal, algumas variantes desta seqüência que são funcionais foram identificadas; em células vegetais parece haver uma faixa ampliada de seqüências funcionais (Dean et al., Nucl Acid Res., 14: 2229 a 2240, 1986; Hunt, Annu Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 45: 47 a 60, 1994; Rothine, Plant Mol. Biol. 32: 43 a 61, 1996). Todas estas seqüências de consenso são variações em AATAAA, portanto, todas elas são seqüências ricas em A+T.

Tipicamente, para se obter expressão suficiente de transgenes modificados em plantas, a seqüência codificadora de polinucleotídeo estrutural existente (gene estrutural) que codifica a proteína de interesse é modificada pela remoção das seqüências Al l IA e dos sinais de poliadenilação putativos pela mutagênese direcionada a sítio do DNA que compreende o gene estrutural. Substancialmente todos os sinais de poliadenilação conhecidos e as seqüências ATTTA são removidos no polinucleotídeo modificado, embora os níveis de expressão realçados são freqüentemente observados apenas com a remoção de algumas das seqüências de sinal de poliadenila60

6# ção identificadas acima. Alternativamente, se um polinucleotideo artificial é preparado codificando a proteína objeto, os códons são selecionados para se evitar a seqüência ATTTA e os sinais de poliadenilação putativos. Para os propósitos da presente invenção os sinais de poliadenilação putativos incluem, mas não são necessariamente limitados a, AATAAA, AATAAT, AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA e CATAAA.

A seqüência de DNA selecionada é escaneada para identificar regiões com mais do que quatro nucleotídeos de adenina (A) ou timina (T) consecutivos. As regiões A+T são escaneadas quanto aos sinais de poliadenilação vegetal potenciais. Embora a ausência de cinco ou mais nucleotídeos A ou T consecutivos elimina a maior parte dos sinais de poliadenilação vegetal, se existe mais do que um dos sinais de poliadenilação menores identificados dentro de dez nucleotídeos entre si, então a seqüência de nucleotídeo desta região é alterada para remover estes sinais enquanto mantém a seqüência de aminoácido codificada original.

A etapa seguinte é considerar os cerca de 15 a cerca de 30 ou mais resíduos de nucleotídeo que circundam a região rica em A+T. Se o teor de A+T da região circundante for menor do que 80 %, a região deve ser examinada quanto a sinais de poliadenilação. A alteração da região com base em sinais de poliadenilação é dependente (1) do número de sinais de poliadenilação presentes e (2) da presença de um sinal de poliadenilação vegetal maior. Os sinais de poliadenilação são removidos pela substituição de base da seqüência de DNA no contexto da substituição de códon.

Dois padrões adicionais não identificados na Patente US N° 5.500.365. são procurados e eliminados nas formas de realização da presente invenção. As seqüências AGGTAA e GCAGGT são seqüências de consenso para os sítios de junção 5' e 3’ de intron, respectivamente, em plantas monocotiledôneas e plantas dicotiledôneas. Apenas GT do sítio de junção 5' e o AG no sítio de junção 3' são requeridos para ser um empareIhamento exato. Entretanto, quando da condução de uma pesquisa quanto a estas seqüências de consenso, nenhum desemparelhamento é permitido

Ó5 para cada base.

Depois de cada etapa o mapeamento de seqüência é feito usando o programa MAP da GCG para determinar a localização das matrizes de leitura aberta e identificar padrões de seqüência que ainda precisam ser modificados. A etapa final seria realizar a análise da identidade de seqüência usando por exemplo o programa GAP do pacote da GCG para determinar o grau de divergência de seqüência e a identidade percentual.

Polipeptídeos

No geral, a proteína traduzida do polinucleotídeo artificial terá a mesma seqüência de aminoácido como a proteína traduzida da região codificadora não-modificada. Entretanto, a substituição de códons que codificam aminoácidos que fornecem um homólogo funcional da proteína é um aspecto da invenção. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos no lugar de outros aminoácidos em uma estrutura de proteína sem perda apreciável da capacidade de ligação interativa com as estruturas tais como, por exemplo, regiões de ligação de antígeno de anticorpos ou sítios de ligação nas moléculas do substrato. Visto que é a capacidade e a natureza interativas de uma proteína que define essa atividade funcional biológica da proteína, certas substituições de seqüência de aminoácido podem ser feitas em uma seqüência de proteína, e, naturalmente, a sua seqüência codificadora de DNA subjacente, e não obstante obter uma proteína com propriedades semelhantes. É assim considerado pelos inventores que várias mudanças podem ser feitas nas seqüências de peptídeo das composições divulgadas realizando-se mudanças nas seqüências de DNA correspondentes que codificam os peptídeos em que os peptídeos não mostraram nenhuma perda apreciável de sua utilidade ou atividade biológicas.

Um outro aspecto da invenção compreende homólogos funcionais, que diferem em um ou mais aminoácidos daqueles de um polipeptídeo aqui fornecido como o resultado de uma ou mais substituições de aminoácido conservativas. É bem conhecido na técnica que um ou mais aminoácidos em uma seqüência nativa podem ser substituídos com pelo menos um outro aminoácido, a carga e a polaridade do qual são similares àquelas do amino62

Ύ) ácido nativo, resultando em uma mudança silenciosa. Por exemplo, valina é um substituto conservativo para alanina e treonina é um substituto conservativo para serina. As substituições conservativas para um aminoácido dentro da seqüência de polipeptideo nativa podem ser selecionadas a partir de outros membros da classe a qual o aminoácido que ocorre naturalmente pertence. Os aminoácidos podem ser divididos nos seguintes quatro grupos: (1) aminoácidos ácidos, (2) aminoácidos básicos, (3) aminoácidos polares neutros e (4) aminoácidos não-polares neutros. Os aminoácidos representativos dentro destes vários grupos incluem, mas não são limitados a: (1) aminoácidos ácidos (negativamente carregados) tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; (2) aminoácidos básicos (positivamente carregados) tais como arginina, histidina e lisina; (3) aminoácidos polares neutros tais como glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina; e (4) aminoácidos não-polares neutros (hidrofóbicos) tais como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os substitutos conservados para um aminoácido dentro de uma seqüência de aminoácido nativa pode ser selecionada de outros membros do grupo ao qual o aminoácido que ocorre naturalmente pertence. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais hidroxílicas alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos naturalmente conservativos são: valina-leucina, valina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, ácido aspártico-ácido glutâmico e asparagina-glutamina. Contructos de DNA

O Material genético exógeno pode ser transferido em uma planta pelo uso de um constructo de DNA projetada para tal propósito pelos métodos que utilizam Agrobacterium, bombardeamento de partícula ou outros

• · · · · · · >1 métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. O projeto de tal constructo de DNA está em geral dentro do conhecimento da técnica (Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nova Iorque (1997). Os exemplos de tais plantas nas quais o material genético exógeno pode ser transferido, incluem, sem limitação, alfalfa, Arabidopsis, cevada, Brassica, brócoli, repolho, Citrus, algodão, alho, aveia, colza, cebola, canola, linho, milho, uma planta anual ornamental e perene ornamental, ervilha, amendoim, pimentão, batata, arroz, centeio, sorgo, soja, morango, cana de açúcar, beterraba, tomate, trigo, álamo, pinheiro, abeto, eucalipto, maçã, alface, lentilhas, uva, banana, chá, gramas, girassol, dendezeiro, Phaseolus, árvores, arbustos, videiras, etc. É bem conhecido que as plantas agronomicamente importantes compreendem genótipos, variedades e cultivares e que os métodos e composições da presente invenção podem ser testados nestas plantas por aqueles versados comumente na técnica da biologia molecular vegetal e do cruzamento vegetal.

Um grande número de moléculas promotoras de DNA isoladas que são ativas como um elemento genético de um transgene em células vegetais foi descrito. Estas incluem o promotor da nopalina sintase (P-nos) (Ebert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 5745 a 5749, 1987), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), o promotor da octopina sintase (P-ocs), que são transportadas em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens, os promotores de caulimovirus, tais como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., Plant Mol. Biol. 9: 315 a 324, 1987), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) e o promotor 35S de CaMV (Odell et al., Nature 313: 810 a 812, 1985), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), o promotor 35S do vírus mosaico de escrofulária (Patente U.S. N^s 6.018.100, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), o promotor indutível por luz da subunidade pequena de ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), o promotor Adh (Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 84: 6624 a 6628, 1987), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), o promotor da sacarose sintase (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87: 4144 a • · · · · ·

4148, 1990), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), o promotor do complexo do gene R (Chandler et al., Plant Cell 1: 1175 a 1183, 1989, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) e o promotor do gene da proteína de ligação de clorofila a/b, etc.

Uma variedade de promotores especifica mente ativos em tecidos vegetativos, tais como folhas, hastes, raízes e tubérculos, podem ser usados para expressar as moléculas de ácido nucléico da presente invenção. Os exemplos de promotores específicos de tubérculos incluem, mas não são limitados aos promotores de patatina classe I e II (Bevan et al., EMBO J. 8: 1899 a 1906, 1986); Koster-Topfer et al., Mol Gen Genet. 219; 390 a 396, 1989); Mignery et al., Gene 62: 27 a 44, 1988); Jefferson et al., Plant Mol. Biol. 14: 995 a 1006, 1990), aqui incorporada por referência nas suas totalidades), o promotor para os genes ADPGPP do tubérculos, tanto a subunidade grande quanto a pequena; o promotor da sacarose sintase (Salanoubat e Belliard, Gene 60: 47 a 56, 1987), Salanoubat e Belliard, Gene 84: 181 a 185, 1989), aqui incorporada por referência em sua totalidade); e o promotor para as proteínas de tubérculos principais incluindo os complexos de proteína de 22 kd e inibidores da proteinase (Hannapel, Plant Physiol. 10T. 703 a 704, 1993), aqui incorporada por referência em sua totalidade). Os exemplos de promotores específicos de folha incluem mas não são limitados aos promotores da ribulose bifosfato carboxilase (RbcS ou RuBISCO) (ver, por exemplo, Matsuoka et al., Plant J. 6; 311 a 319, 1994), aqui incorporada por referência em sua totalidade); o promotor do gene da proteína de ligação da clorofila de coleta de luz a/b (ver, por exemplo, Shiina et al., Plant Physiol. 115: 477 a 483. 1997; Casal etal., Plant Physiol. 116: 1533 a 1538, 1998, aqui incorporada por referência em suas totalidades); e o promotor do gene relacionado com myb da Arabidopsis thaliana (Atmyb5) (Li et al., FEBS Lett. 379: 117 a 121, 1996, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Os exemplos de promotor específico de raiz incluem mas não são limitados ao promotor para o gene da quitinase ácida (Samac et al., Plant Mol. Biol. 25; 587 a 596, 1994), aqui incorporada por referência em sua totalidade); os subdomínios específicos de raiz do promotor CaMV35S que foram

identificados (Lam et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 86: 7890 a 7894. 1989, aqui incorporada por referência em sua totalidade); o promotor da ORF13 de Agrobacterium rhizogenes que exibe alta atividade nas raízes (Hansen etal., Mol. Gen. Genet. 254: 337 a 343. 1997), aqui incorporada por referência em sua totalidade); o promotor para o gene específico da raiz do tabaco RB7 (Patente US 5.750.386; Yamamoto et al., Plant Cell 3: 371 a 382, 1991, aqui incorporada por referência em sua totalidade); e os promotores específicos da célula de raiz reportado por Conkling et al. (Conkling et al., Plant Physiol. 93: 1203 a 1211, 1990, aqui incorporada por referência em sua totalidade) e o promotor de POX1 (Pox1, pox1) (Hertig, et al. Plant Mol. Biol. 16: 171, 1991).

Uma outra classe de promotores específicos de tecido vegetativo útil são os promotores meristemáticos (ponta de raiz e ápice de broto). Por exemplo, os promotores SHOOTMERISTEMLESS e SCARECROW, que são ativos no desenvolvimento de meristemas apicais de broto ou raiz (Di Laurenzio et al., Cell 86: 423 a 433, 1996; Long, Nature 379: 66 a 69, 1996); aqui incorporada por referência em suas totalidades), podem ser usados. Um outro exemplo de um promotor útil é aquele que controla a expressão do gene da 3-hidróxi-3- metilglutaril coenzima A reduetase HMG2, cuja expressão é restrita aos tecidos meristemáticos e florais (zona secretora do estigma, grãos de pólen maduros, tecido vascular de gineceu e óvulos fertilizados) (ver, por exemplo, Enjuto et al., Plant Cell, 7: 517 a 527, 1995, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Também um outro exemplo de um promotor útil é aquele que controla a expressão de genes relacionados com knl de milho e outras espécies que apresentam a expressão específica de meristema (ver, por exemplo, Granger etal., Plant Mol. Biol. 31: 373 a 378, 1996; Kerstetter et al., Plant Cell 6: 1877 a 1887, 1994; Hake et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 350: 45 a 51, 1995, aqui incorporada por referência em suas totalidades). Um outro exemplo de um promotor meristemático é o promotor KNAT1 Arabidopsis thaliana. No ápice de broto, o transcrito KNAT1 está localizado primariamente no meristema apical de broto; a expressão de KNAT1 no meristema de broto diminui durante a tran66 ···

sição floral e é restrita ao córtex da haste de inflorescência (ver, por exemplo, Lincoln et al., Plant Cell 6: 1859 a 1876, 1994, aqui incorporada por referência em sua totalidade).

Os promotores específicos de semente e realçados de semente adequados podem ser derivados dos seguintes genes: MAC1 do milho (Sheridan et al., Genetics 142: 1009 a 1020, 1996, aqui incorporada por referência em sua totalidade); Cat3 do milho (Genbank N^s L05934. Abler et al., Plant Mol. Biol. 22: 10131 a 1038, 1993. aqui incorporada por referência em sua totalidade); vivparous-1 de Arabidopsis (Genbank N² U93215); Atimycl de Arabidopsis (Urao et al., Plant Mol. Biol. 32: 571-57, 1996; Conceicao et al., Plant 5: 493 a 505, 1994, aqui incorporada por referência em suas totalidades); napA de Brassica napus (Genbank N² J02798); a família do gene napin de Brassica napus (Sjodahl et al., Planta 197: 264 a 271, 1995, aqui incorporada por referência em sua totalidade).

O promotor específico de óvulo para o gene BEL1 (Reiser et al. Cell 83: 735 a 742, 1995, Genbank N² U39944; Ray et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5761 a 5765, 1994, todas as quais são aqui incorporada por referência em suas totalidades) também podem ser usados. Os promotores MEA (FIS1) e FIS2 específicos de ovo e célula central também são promotores específicos de tecido reprodutivo úteis (Luo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 10637 a 10642, 2000; Vielle-Calzada, et al., Genes Dev. 13: 2971 a 2982,1999; aqui incorporada por referência em suas totalidades).

Um promotor específico de pólen do milho foi identificado no milho (Guerrero et aí, Mol. Gen. Genet. 224: 161 a 168, 1990, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Outros genes especificamente expressados no pólen foram descritos (ver, por exemplo, Wakeley et aí, Plant Mol. Biol. 37: 187 a 192, 1998; Ficker et al., Mol. Gen. Genet 257: 132 a 142, 1998; Kulikauskas et al., Plant Mol. Biol. 34: 809 a 814, 1997; Treacy et al., Plant Mol. Biol. 34: 603 a 611, 1997; todas as quais são aqui incorporadas por referência em suas totalidades).

Os promotores derivados de genes que codificam proteínas de armazenagem embriônica, que inclui o gene que codifica a proteínas de ar67

mazenagem 2S de Brassica napus (Dasgupta et al, Gene 133: 301 a 302, 1993, aqui incorporada por referência em sua totalidade); a família de gene de proteínas de armazenagem em semente 2s de Arabidopsis-, o gene que codifica a oleosina 20kD de Brassica napus (GenBank N^s M63985); os genes que codificam a oleosina A (Genbank N⁹ U09118) e a oleosina B (GenBank N⁹ U09119) da soja; o gene que codifica a oleosina de Arabidopsis (GenBank N⁹ Z17657); o gene que codifica a oleosina 18kD do milho (GenBank N⁹ J05212, Lee, Plant Mol. Biol. 26: 1981 a 1987, 1994), aqui incorporada por referência em sua totalidade); e o gene que codifica a proteína rica em enxofre de peso molecular baixo da soja (Choi et ai., Mol. Gen. Genet. 246: 266 a 268, 1995, aqui incorporada por referência em sua totalidade), também podem ser usados.

Os promotores derivados de zeína que codifica genes (incluindo os genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD, 27 kD e gama; Pedersen et al., Cell 29: 1015 a 1026, 1982, aqui incorporada por referência em sua totalidade) também podem ser usados. As zeínas são um grupo de proteínas de armazenagem encontradas no endosperma do milho.

Outros promotores conhecidos funcionar, por exemplo, no milho, incluem os promotores para os seguintes genes: waxy, Brittle, Shrunken 2, Enzimas de ramificação I e II, amido sintases, enzimas de desramificação, oleosinas, glutelinas e sacarose sintases. Um promotor particularmente preferido para a expressão do endosperma do milho é o promotor para o gene da glutelina do arroz, mais particularmente o promotor Osgt-1 (Zheng et al., Mol. Cell Biol. 13: 5829 a 5842, 1993, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Os exemplos de promotores adequados para a expressão no trigo incluem aqueles promotores para as subunidades de ADPglicose pirofosforilase (ADPGPP), a ligação de grânulo e outras amido sintases, as enzimas de ramificação e desramificação, as proteínas abundantes em embriogênese, as giiadinas e as gluteninas. Os exemplos de tais promotores no arroz incluem aqueles promotores para as subunidades de ADPGPP, a ligação de grânulo e outras amido sintases, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, as sacarose sintases e as glutelinas. Um promotor

particularmente preferido é o promotor para a glutelina do arroz, Osgt-1. Os exemplos de tais promotores para a cevada incluem aqueles para as subunidades de ADPGPP, a ligação de grânulo e outras amido sintases, as enzimas de ramificação, as enzimas de desramificação, as sacarose sintases, as hordeínas, as globulinas de embrião e as proteínas específicas de aleurona.

Um promotor do tomate ativo durante o amadurecimento da fruta, senescência e abscisão das folhas e, em um grau menor, das flores pode ser usado (Blume et aí, Plant J. 12: 731 a 746, 1997, aqui incorporada por referência em sua totalidade). Outros promotores exemplares incluem o promotor específico do gene SK2 de pistol na batata (Sotanum tuberosum L.), que codifica uma endoquitinase básica específica de pistilo (Ficker et aí, Plant Mol. Biol. 35: 425 a 431, 1997, aqui incorporada por referência em sua totalidade); o gene Blec4 da ervilha (Pisum sativum cv. Alaska), ativo no tecido epidérmico de ápices de broto vegetativo e floral de alfalfa transgênica. Isto o torna uma ferramenta útil para alvejar a expressão de genes estranhos à camada epidérmica de brotos que crescem ativamente. O promotor E8 específico de tecido do tomate também é útil para direcionar a expressão de gene em frutas (Deikman, et aí, Plant Physiology 100: 2013 a 2017, 1992).

É ainda reconhecido que, visto que na maioria dos casos os limites exatos de seqüências reguladoras não foram completamente definidos, fragmentos de DNA de comprimentos diferentes podem ter atividade promotora idêntica.

Os promotores que são conhecidos ou são descoberto causar a transcrição de DNA em células vegetais podem ser usados na presente invenção. Tais promotores podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes tais como plantas e vírus de planta. Além dos promotores que são conhecidos por causar a transcrição de DNA em células vegetais, outras moléculas promotoras podem ser identificadas para o uso na corrente invenção triando-se uma biblioteca de cDNA vegetal para os genes que são seletiva ou preferivelmente expressados nos tecidos ou células alvo e isolando a região genômica 5' dos cDNAs identificados.

Os constructos ou vetores também podem incluir com a região codificadora de interesse um ácido polinucléico que atua, no todo ou em parte, para terminar a transcrição daquela região. Por exemplo, tais seqüências foram isoladas incluindo a seqüência Tr7 3' e a seqüência nos 3' (Ingelbrecht et al., The Plant Cell 1: 671 a 680, 1989, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência; Bevan et al., Nucleic Acids Res. 11: 369 a 385, 1983, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

Um vetor ou constructo também podem incluir elementos reguladores. Os exemplos de tais incluem o intron Adh 1 (Callis et al., Genes e Develop. 1; 1183 a 1200, 1987, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), o intron da sacarose sintase (Vasil et al., Plant Physiol. 91: 1575 a 1579, 1989, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) e o elemento TMV ômega (Gallie et al., Plant Cell 1: 301 a 311, 1989, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência). Estes e outros elementos reguladores podem ser incluídos quando apropriado.

Um vetor ou constructo também podem incluir um marcador selecionável. Os marcadores selecionáveis também podem ser usados para selecionar plantas ou células vegetais que contêm o material genético exógeno. Os exemplos de tais incluem, mas não são limitados a, um gene neo (Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199: 183 a 188, 1985, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) que codifica a resistência à canamicina e pode ser selecionada para usar a canamicina, G418, etc.; um gene bar que fornece a resistência ao bialafos; um gene da EPSP sintase mutante (Hinchee et al., Bio/Technology 6: 915 a 922 (1988), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) que fornece a resistência ao glifosato; um gene da nitrilase que fornece resistência à bromoxiniia (Stalker et al., J. Biol. Chem. 263: 6310 a 6314 (1988), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); um gene da acetolactato sintase mutante (ALS) que confere imidazolinona ou sulfoniluréia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato (Thillet et aí, J. Biol. Chem. 263; 12500 a 12508, 1988, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

Um vetor ou constructo também pode incluir um marcador triá•· ········

vel. Os marcadores triáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Os marcadores triáveis exemplares incluem um gene da β-glicuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson, Plant Mol. Biol, Rep. 5: 387 a 405 (1987), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência; Jefferson et al., EMBO J. 6: 3901 a 3907 (1987), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); um gene do local R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais (Dellaporta et al., Stadler Symposium 11: 263 a 282 (1988), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); um gene da β-lactamase (Sutcliffe et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 75: 3737 a 3741 (1978), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), um gene que codifica uma enzima para as qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow et al., Science 234: 856 a 859 (1986), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); um gene xylE (Zukowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 80: 1101 a 1105 (1983), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos; um gene da α-amilase (Ikatu et al., Bio/Technol. 8: 241 a 242, 1990, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); um gene da tirosinase (Katz etal., J. Gen. Microbiol. 129: 2703 a 2714,1983, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) que codifica uma enzima capaz de oxidar a tirosina a DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa até melanina; e uma a-galactosidase.

Introdução de Polinucleotídeos em Plantas

Existem muitos métodos para introduzir moléculas de ácido nucléico transformadoras em células vegetais. Acredita-se que os métodos adequados incluam virtualmente qualquer método pelo qual as moléculas de ácido nucléico possam ser introduzidas em uma célula, tal como pela infecção com Agrobacterium ou liberação direta de moléculas de ácido nucléico tais como, por exemplo, pela transformação mediada por PEG, pela eletroporação ou pela aceleração de partículas revestidas com DNA, etc. (Po• · ·······*

» · · · · · · trykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205 a 225 (1991), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência; Vasil, Plant Mol. Biol. 25: 925 a 937 (1994), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência). Por exemplo, a eletroporação foi usada para transformar protoplastos de Zea mays (Fromm et al., Nature 312: 791 a 793, 1986, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

Outros sistemas de vetor adequados para introduzir DNA transformador em uma célula hospedeira vegetal incluem mas não são limitados aos vetores de cromossoma artificial binário (BIBAC) (Hamilton et al., Gene 200: 107 a 116, 1997, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) e a transfecção com vetores de RNA viral (Della-Cioppa et al., Ann. Ν. Y. Acad. Sei. (1996), 792 pp Engineering Plants for Commercial Products e Applications, pp 57 a 61, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência.

A tecnologia para a introdução de DNA em células é bem conhecida por aqueles versados na técnica. Quatro métodos gerais para a liberação de um gene em células foram descritos: (1) métodos químicos (Graham e van der Eb, Virology 54: 536 a 539, 1973, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); (2) métodos físicos tais como microinjeção (Capecchi, Cell 22: 479 a 488 (1980), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência), eletroporação (Wong e Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107: 584 a 587 (1982); Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (U.S.A.) 82: 5824 a 5828 (1985); Patente U.S. N^s 5.384.253, todas as quais são aqui incorporadas em sua totalidade); e a pistola de gene (Johnston e Tang, Methods Cell Biol. 43; 353 a 365 (1994), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência); (3) vetores virais (Clapp, Clin. Perinatol. 20: 155 a 168, 1993; Lu et al., J. Exp. Med. 178: 2089 a 2096, 1993; Eglitis e Anderson, Biotechniques 6: 608 a 614, 1988, todas as quais são aqui incorporadas em sua totalidade); e (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel et al., Hum. Gen. Ther. 3: 147 a 154, 1992, Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 6099 a 6103, 1992, todas as quais são incorporadas por referência em sua totalidade).

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Os métodos de aceleração que podem ser usados incluem, por exemplo, o bombardeamento de microprojétil e outros. Um exemplo de um método para a liberação de moléculas de ácido nucléico transformadoras às células vegetais é o bombardeamento de microprojétil. Este método foi revisado por Yang e Christou, eds., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, Inglaterra (1994), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência. As partículas não-biológicas (microprojéteis) que podem ser revestidas com ácidos nucléicos e liberados nas células por uma força de propulsão. As partículas exemplares incluem aquelas compreendidas de tungstênio, ouro, platina e outros.

A transferência mediada por Agrobacterium é um sistema amplamente aplicável para introduzir genes em células vegetais porque o DNA pode ser introduzido nos tecidos vegetais integrais, desviando deste modo a necessidade para a regeneração de uma planta intacta a partir de um protoplasto. O uso de vetores de integração vegetal medidados por Agrobacterium para introduzir DNA em células vegetais é bem conhecido na técnica. Ver, por exemplo os métodos descritos por Fraley et al., Bio/Technology 3: 629 a 635 (1985) e Rogers et al., Methods Enzymol. 153: 253 a 277 (1987), ambas as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Além disso, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso que resulta em poucos rearranjos. A região de DNA a ser transferida é definida pelas seqüências da extremidade e o DNA interventor é usualmente inserido no genoma da planta como descrito (Spielmann et al., Mol. Gen. Genet. 205: 34 (1986), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

Uma planta transgênica que resulta de métodos de transformação com Agrobacterium freqüentemente contém um único gene em um cromossoma. Tais plantas transgênicas podem ser aludidas como sendo homozigotas em relação ao gene adicionado. Mais preferido é uma planta transgênica que seja homozigota em relação ao gene estrutural adicionado; isto é, uma planta transgênica que contenha dois genes adicionados, um gene no mesmo local em cada cromossoma de um par de cromossomas. Uma •fr ········ • · · · · • · · • ···· planta transgênica homozigota pode ser obtida acasalando-se sexualmente (autopolinização) uma planta transgênica segregante independente que contenha um único gene adicionado, germinando algumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes produzidas para o gene de interesse.

Também deve ser entendido que duas plantas transgênicas diferentes também podem ser acasaladas para produzir progênie que contenha dois genes exógeno independentemente segregados adicionados. A autopolinização de progênie apropriada pode produzir plantas que sejam homozigotas em relação a ambos os genes exógenos adicionados que codificam um polipeptideo de interesse. O retro-cruzamento com uma planta precursora e o cruzamento com uma planta não -transgênica também são considerados, como o é a propagação vegetativa.

A regeneração, desenvolvimento e cultivo de plantas a partir de um único transformante de protoplasto vegetal ou a partir de vários explantes transformados são bem conhecidos na técnica (Weissbach e Weissbach, Em: Methods for Plant Molecular Biology, (eds.), Academic Press, Inc. San Diego, CA, (1988), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência). Este processo de regeneração e cultivo tipicamente inclui as etapas de seleção de células transformadas, cultivando-se estas células individualizadas através dos estágios usuais de desenvolvimento embriônico até o estágio de muda enraizada. Os embriões e as sementes transgênicas são similarmente regenerados. Os brotos enraizados transgênicos resultantes são depois disso plantados em um meio de cultivo de planta apropriado tal como o solo.

O desenvolvimento ou regeneração de plantas contendo o gene estranho, exógeno que codifica uma proteína de interesse é bem conhecido na técnica. Preferivelmente, as plantas regeneradas são autopolinizadas para fornecer plantas transgênicas homozigotas. De outro modo, o pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas desenvolvidas com semente de linhagens agronomicamente importantes. Ao contrário, o pólen de plantas destas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente invenção conten74

do um polipeptídeo desejado é cultivada usando métodos bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

A presente invenção também fornece partes das plantas da presente invenção. As partes de planta, sem limitação, incluem semente, endosperma, óvulo e pólen. Em uma forma de realização particularmente preferida da presente invenção, a parte de planta é uma semente.

Os métodos para transformar dicotiledôneas, primariamente pelo uso de Agrobacterium tumefaciens e a obtenção de plantas transgênicas foi publicado, por exemplo, algodão (Patente U.S. N^e 5.004.863. Patente U.S. N^s 5.159.135. Patente U.S. N^Q 5.518.908, todas as quais são aqui incorporada por referência em sua totalidade), soja (Patente U.S. Ν^Ω 5.569.834. a totalidade da qual é aqui incorporada por referência) e Brassica (Patente U.S. N^e 5.463.174. a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

A transformação de monocotiledôneas usando a eletroporação, bombardeamento de partícula e Agrobacterium também foi relatada. Por exemplo, a transformação e a regeneração de planta foi obtida no aspargo, cevada, Zea mays (Fromm et al., Bio/Technology 8: 833 (1990), Armstrong et al., Crop Science 35: 550 a 557 (1995), todas as quais são aqui incorporada por referência em sua totalidade): aveia; arroz, centeio, cana de açúcar; festuca alta e trigo (Patente U.S. N^Q 5.631.152, a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

Além dos procedimentos debatidos acima, os técnicos estão familiarizados com os materiais de recurso padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolação de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc.), a geração de organismos recombinantes e a triagem e isolação de clones, (ver por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência; Birren et al., Genome Analisis: Detecting Genes, 1, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (1998), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência; Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 2, Cold

Í3

Spring Harbor, Nova Iorque (1998), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência; Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, eds. Clark, Springer, Nova Iorque (1997), a totalidade da qual é aqui incorporada por referência).

Tendo agora no geral descrito a invenção, a mesma será mais facilmente entendida através da referência aos seguintes exemplos, que são fornecidos por via de ilustração e não são intencionados a serem limitantes da presente invenção, a menos que especificado.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Quando um polinucleotideo vegetal nativo isolado que compreende uma seqüência codificadora é reconstruído como um transgene, depois introduzido na planta pelos métodos de transformação vegetal existe um risco de que a expressão do gene vegetal homólogo endógeno interagirá negativamente com o transgene. Para evitar estas interações negativas pode ser necessário fornecer um polinucleotideo de transgene substancialmente divergente em seqüência do gene vegetal nativo. Uma molécula de polinucleotídeo artificial pode ser produzida pelo método da presente invenção e usada para reduzir a ocorrência de silenciamento de transgene.

Este exemplo serve para ilustrar os métodos da presente invenção que resultam na produção de um polinucleotideo que codifica uma EPSP sintase vegetal modificada. A enzima de EPSPS e o peptídeo de trânsito de cloroplasto do arroz nativo (Oryzae sativa) são usados para construir uma molécula de polinucleotideo artificial que também inclui códons que codificam aminoácidos substituídos que não ocorrem naturalmente na enzima de EPSPS do arroz. Estes aminoácidos substituídos fornecem uma enzima de EPSPS do arroz resistente ao glifosato (OsEPSPS_TIPS, SEQ ID NO: 1).

As etapas descritas na Tabela 6 são usadas para construir uma tal seqüência de polinucleotideo artificial (OsEPSPS_AT, SEQ ID NO: 3) usando uma tabela de uso do códon de Arabidopsis e os parâmetros para a construção de uma molécula de polinucleotideo substancialmente divergente, que quando expressada em plantas codifica uma enzima de EPSPS do

arroz modificada resistente ao herbicida de glifosato. A comparação da seqüência de gene de EPSPS do arroz nativo aludida como OsEPSPS_Nat (SEQ ID NO: 2) que foi previamente modificada para codificar uma enzima resistente ao glifosato com a molécula de polinucleotídeo modificada quanto ao uso de códon de Arabidopsis, OsEP3PS_AT (SEQ ID NO: 3) e com a seqüência modificada quanto ao uso de códon de Zea mays, OsEPSPS_ZM (SEQ ID NO: 4) por este método é mostrada na Figura 1. A Figura 1 mostra bases de nucleotídeo mudadas nos polinucleotídeos modificados comparados à OsEPSPS_Nat, SEQ ID NO: 2.

Tabela 6. Planejamento de polinucleotídeo para uma EPSP sintase de arroz modificada (OsEPSPS_AT)

1. Substituir os aminoácidos nas posições 173 e 177 para fornecer uma enzima de EPSPS do arroz modificada resistente ao herbicida de glifosato mostrada na SEQ ID NO: 1.

2. Retro traduzir a SEQ ID NO: 1 para gerar uma seqüência de polinucleotídeo artificial usando a tabela de uso de códon de Arabidopsis thaliana (Tabela 2).

3. Realizar o alinhamento de seqüência com a seqüência de polinucleotídeo OsEPSPS nativa (SEQ ID NO: 2) e a seqüência de polinucleotídeo artificial para determinar o grau de identidade de seqüência, mapear as matrizes de leitura aberta, selecionar padrões para procurar e identificar seqüências de reconhecimento de enzimas de restrição.

4. Fazer correções nos códons usados na seqüência de polinucleotídeo artificial para se obter a porcentagem desejada de identidade de seqüência e evitar a formação de cacho de códons idênticos. Isto é especialmente importante para os aminoácidos que ocorrem em alta freqüência, isto é, alanina, glicina, histidina, leucina, serina e valina. Distribuição aproximada de uso de códon na seqüência de polinucleotídeo de acordo com o uso de códon de Arabidopsis, Tabela 2.

5. A seqüência de polinucleotídeo é inspecionada quanto a regiões locais que tenham uma relação GC:AT mais alta do que cerca de 2 em uma faixa de cerca de 50 nucleotideos contíguos. A seqüência de polinucleotídeo

é ajustada como necessário, substituindo-se os códons nestas regiões tal que a relação GC:AT local seja menor do que cerca de 2 e a composição de polinucleotídeo inteira esteja na faixa de 0,9 a 1,3.

6. Introduzir códons de parada às matrizes de tradução b, c, d, e e T. Os códons de parada de tradução são criados nas matrizes de tradução b, c, d, e e f substituindo-se um ou mais códons dentro de cerca de 130 pares de bases (pares de base) das extremidades do polinucleotídeo artificial que cria um códon de parada sem mudar a seqüência codificadora de aminoácido da matriz um.

7. Eliminar os códons de ATG das matrizes de leitura aberta avançada (matrizes b e c) e reversa (matrizes d, e, T). As matrizes de leitura avançada e reversa são inspecionadas quanto a presença de códons ATG. Qualquer códon ATG nas matrizes b e c encontrado na seqüência de polinucleotídeo antes do terceiro Met na matriz a do polinucleotídeo é eliminado pela substituição de um ou mais códons que envolve o ATG mudando um dos nucleotídeos sem mudar a seqüência codificadora de aminoácido da matriz a”. Nas matrizes reversas, a substituição de ATG ou a introdução do códon de parada podem ser feitos para interromper matrizes de leitura potenciais.

8. Eliminar os padrões de reconhecimento das enzimas de restrição não desejadas e outros padrões específicos (poliadenilação, junção de RNA, padrões de instabilidade de seqüência). A seqüência de polinucleotídeo é inspecionada quanto a presença de qualquer padrão de polinucleotídeo não desejado e os padrões são rompidos pela substituição de códons nestas regiões.

9. Checar a identidade de seqüência entre um primeiro polinucleotídeo e o polinucleotídeo artificial criado pelo método da presente invenção. Eliminar a identidade de seqüência em um polinucleotídeo contíguo que seja maior do que 23 pares de base. É desejável eliminar a identidade de seqüência maior do que cerca de 15 pares de base. É útil selecionar a partir de aminoácidos tais como, serina, arginina e leucina que têm 6 códons ou a partir de aminoácidos com 4 códons para eliminar a identidade de seqüên-

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cia.

10. Revisar a seqüência de polinucleotídeo artificial que resulta de qualquer uma das etapas de 1 a 9 quanto a qualquer uma das características de seqüência identificadas nas etapas de 4 a 9 e se a seqüência não estiver de acordo com as condições realizar substituições de códon adicionais à seqüência até que as condições das etapas de 4 a 9 sejam atingidas.

11. Construir a molécula de polinucleotídeo artificial pelos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando PCR com uma mistura de iniciadores envolvidos. Os iniciadores nas extremidades do gene podem conter sítios de restrição convenientes para permitir a clonagem fácil do gene no vetor selecionado. Na extremidade 5' usualmente Alflll, BspHI, Ncol, Ndel, Pcil ou Sphl são mais convenientes visto que a sua seqüência contém um códon de partida ATG, entretanto outras enzimas também podem ser usadas se um polinucleotídeo modificado é planejado para criar uma fusão com um outro segmento de polinucleotídeo, por exemplo, peptídeo de trânsito de cloroplasto e seqüência codificadora de EPSPS.

12. Realizar uma análise de seqüência de DNA do polinucleotídeo artificial para confirmar a construção sintética resultante na molécula de polinucleotídeo desejada. Se erros são encontrados, então eliminar os mesmos pela mutagênese direcionada ao sítio para a qual muitos métodos são conhecidos por aqueles versados na técnica da mutagênese de DNA.

Uma versão do uso de códon de Zea mays (Zea mays, Tabela 3) da seqüência de enzima de EPSPS do arroz resistente ao glifosato (enzima de EPSPS do Oryzae sativa com mutações TIPS, SEQ ID NO: 1) é fabricada. O polinucleotídeo que codifica esta enzima inclui códons que codificam aminoácidos substituídos que não ocorrem naturalmente na enzima de EPSPS do arroz nativa. Estes aminoácidos substituídos fornecem uma enzima de EPSPS do arroz resistente ao glifosato. As etapas descritas na Tabela 7 são usadas para construir uma seqüência de polinucleotídeo artificial modificada (OsEPSPS_ZM, SEQ ID NO: 4) com base em uma tabela de uso do códon de Zea mays que codifica uma enzima de EPSPS do arroz modificada resistente ao herbicida de glifosato. A comparação da seqüência de • · · · · · ·

SY polinucleotídeo OsEPSPS_Nat (SEQ ID NO: 2) com a seqüência de polinucleotídeo artificial OsEPSPS_ZM (SEQ ID NO: 4) usando o uso de códon de Zea mays é mostrada na Figura 2.

Tabela 7. Construção de polinucleotídeo para a EPSP sintase de arroz modificada (OsEPSPS_ZM)

1. Retro traduzir a SEQ ID NO: 1 para gerar uma seqüência de polinucleotídeo artificial usando a tabela de uso do códon de Zea mays (Tabela 3).

2. Realizar o alinhamento de seqüência com a seqüência de polinucleotídeo OsEPSPS nativa (SEQ ID NO: 2) e a seqüência de polinucleotídeo artificial para determinar o grau de identidade de seqüência, mapear as matrizes de leitura aberta, selecionar padrões para procurar e identificar seqüências de reconhecimento de enzimas de restrição.

3. Fazer correções nos códons usados na seqüência de polinucleotídeo artificial para se obter a porcentagem desejada de identidade de seqüência e evitar a formação de cachos de códons idênticos. Isto é especialmente importante para os aminoácidos que ocorrem em alta freqüência, isto é, alanina, glicina, histidina, leucina, serina e valina. Distribuição aproximada de uso de códon na seqüência de polinucleotídeo de acordo com o uso de códon de Zea mays, Tabela 3.

4. A seqüência de polinucleotídeo é inspecionada quanto às regiões locais que têm uma relação GC:AT maior do que cerca de 2 em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos contíguos. A seqüência de polinucleotídeo é ajustada como necessário, pela substituição de códons nestas regiões tal que a relação GC:AT local seja menor do que cerca de 2 e a composição de polinucleotídeo inteira esteja na faixa de 1,2 a 1,7.

5. Seguir as etapas de 6 a 12 da Tabela 6.

• · · ·····

Tabela 8. Identidade de seqüência percentual entre polinucleotídeos OsEPSPS.

	OsEPSPS ZM	OsEPSPS AT	OsEPSPS Nat
OsEPSPS ZM	100,00	73,51	71,58
OsEPSPS AT		100,00	74,03
OsEPSPS Nat			100,00

Tabela 9. A composição de nucleotídeo e a relação GC:AT das seqüências de polinucleotídeo modificadas para a seqüência de gene de EPSPS do arroz.

		A	C	G	T	GC.AT
OsEPSPS.	_AT	377	336	444	391	1.02
OsEPSPS.	ZM	365	381	470	332	1.22

As duas seqüências de polinucleotídeo artificial de EPSPS do arroz (SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4) são modificadas tal que a identidade percentual esteja abaixo de 75 por cento comparada com a SEQ ID NO: 2 ou em relação uma com a outra (Tabela 8). A composição de nucleotídeo e a relação GC:AT das seqüências de polinucleotídeo para a seqüência de gene de EPSPS do arroz são mostradas na Tabela 9. Estes polinucleotídeos podem ser selecionados para o uso em constructos de expressão vegetal junto com elementos reguladores diferentes ou eles podem ser combinados em uma única planta pela retransformação com um constructo de DNA ou pelos métodos de cruzamento vegetal. Problemas com o silenciamento e a recombinação de gene são reduzidos quando os constructos de DNA têm níveis reduzidos de DNA homólogo.

EXEMPLO 2

O Milho (Zea mays) foi geneticamente modificado para ter resistência ao herbicida de glifosato (Patente US N^Q 6.040.497). Estas plantas de milho contêm um transgene com uma EPSP sintase do milho modificado quanto a tolerância ao glifosato. Os métodos da presente invenção podem ser usados para construir um novo polinucleotídeo artificial que codifica uma EPSP sintase do milho que é substancialmente diferente na identidade percentual ao gene da EPSP sintase do milho endógeno. O polinucleotídeo arti• · · $3 ficial da EPSP sintase do milho recém construído pode ser usado como um marcador selecionável durante a seleção de linhagens de planta transgênica que podem conter traços agronômicos transgênicos adicionais. Durante a produção de semente de milho híbrido, é útil ter ambos os precursores tolerantes ao glifosato usando transgenes que não interfiram.

Tabela 10. Constructo de polinucleotídeo para a EPSP sintase do milho modificada (ZmEPSPS_ZM, SEQ ID NO: 10)

1. Retro traduzir a SEQ ID NO: 8 para gerar uma seqüência de polinucleotídeo usando a tabela de uso do códon de Zea mays (Tabela 3).

2. Realizar o alinhamento de seqüência com a seqüência de polinucleotídeo ZmEPSPS_Nat (SEQ ID NO: 9) e a seqüência de polinucleotídeo artificial para determinar o grau de identidade de seqüência, mapear as matrizes de leitura aberta, selecionar padrões para procurar e identificar seqüências de reconhecimento de enzima de restrição.

3. Fazer correções nos códons usados na seqüência de polinucleotídeo artificial para se obter a porcentagem desejada de identidade de seqüência e para evitar a formação de cachos de códons idênticos. Isto é especialmente importante para os aminoácidos que ocorrem em alta freqüência, isto é, alanina, glicina, histidina, leucina, serina e valina. Distribuição aproximada de uso de códon na seqüência de polinucleotídeo de acordo com o uso de códon de Zea mays, Tabela 3.

4. A seqüência de polinucleotídeo artificial é inspecionada quanto às regiões locais que têm uma relação GC:AT maior do que cerca de 2 em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos contíguos. A seqüência de polinucleotídeo é ajustada como necessário, pela substituição de códons nestas regiões tal que a relação GC:AT local seja menor do que cerca de 2 e a composição de polinucleotídeo inteira esteja na faixa de 1,2 a 1,7.

5. Seguir as etapas de 6 a 12 da Tabela 6.

• · · • ·

I · » · · ·

Tabela 11. Identidade de seqüência percentual entre polinucleotídeos ZmEPSPS.

	ZmEPSPS ZM	ZmEPSPS Nat
ZmEPSPS ZM	100.00	74.81
ZmEPSPS Nat		100.00

A seqüência de nucleotídeo do gene de EPSPS do milho também é modificada para reduzir identidade entre o gene sintético e nativo e manter a relação GC:AT global típica para as monocotiledôneas. A relação GC:AT para a seqüência de ZmEPSPS_ZM é de 1,38. A identidade de seqüência é reduzida a cerca de 75 % entre a nativa (ZmEPSPS_Nat, SEQ ID NO: 9) e a sintética (ZmEPSPS_ZM, SEQ ID NO: 10).

A comparação de polinucleotídeos nativos que codificam a EPSPS indica que o peptídeo de trânsito de cloroplasto é o fragmento mais divergente do gene. A similaridade na seqüência de nucleotídeo de peptídeos maduros é maior do que 88 % para as enzimas do milho e do arroz e algumas regiões conservadas têm identidade de seqüência tão longas quanto 50 pares de base. O silenciamento de gene pós-transcricional foi observado para seqüências tão pequenas quanto 60 polinucleotídeos (Sijen et al., Plant Cell, 8: 2277 a 2294. 1996; Mains, Plant Mol. Biol. 43: 261 a 273, 2000).

EXEMPLO 3

A soja (Glicina max) foi geneticamente modificada para ser tolerante ao glifosato pela expressão de uma EPSPS de classe II isolada de Agrobacterium (Padgette et al. Crop Sci. 35: 1451 a 1461, 1995). Uma seqüência de gene de EPSPS da soja nativa foi identificada e uma seqüência de polinucleotídeo artificial planejada usando o método da presente invenção. O polinucleotídeo artificial codifica uma seqüência de proteína que é modificada para produzir uma enzima de EPSPS resistente ao glifosato (GmEPSPSJKS, SEQ ID NO: 5) pela substituição dos aminoácidos T para I, R para K e P para S dentro do motivo GNAGTAMRP, resultando em uma enzima de EPSPS de soja modificada com o motivo GNAGIAMKS (SEQ ID NO: 34), também aludido como o mutante IKS. A expressão de uma enzima

de EPSPS modificada nas células de uma planta pela transformação com um cassete de expressão vegetal transgênico, que contém um polinucleotídeo que codifica a EPSPS modificada com o motivo GNAGIAMKS conferirá a tolerância ao glifosato às plantas. As substituições de aminoácido adicionais para a arginina (R) no motivo também pode incluir asparagina (N). Tabela 12. Constructo de polinucleotídeo para o gene da EPSP sintase de soja modificado (GmEPSPS_GM, SEQ ID NO: 7).

1. Retro traduzir a SEQ ID NO: 5 para gerar uma seqüência de polinucleotídeo artificial usando a tabela de uso do códon de Glicina max (Tabela 4).

2. Realizar o alinhamento de seqüência com a seqüência de polinucleotídeo GmEPSPS_Nat (SEQ ID NO: 6) e a seqüência de polinucleotídeo artificial para determinar o grau de identidade de seqüência, mapear as matrizes de leitura aberta, selecionar os padrões para procurar e identificar as seqüências de reconhecimento de enzima de restrição.

3. Fazer as correções para os códons usados na seqüência de polinucleotídeo artificial para se obter a porcentagem desejada de identidade de seqüência e para evitar a formação de cachos de códons idênticos. Isto é especialmente importante para os aminoácidos que ocorrem em alta freqüência, isto é, alanina, glicina, histidina, leucina, serina e valina. Distribuição aproximada de uso de códon na seqüência de polinucleotídeo de acordo com o uso de códon de Glicina max, Tabela 4.

4. A seqüência de polinucleotídeo é inspecionada quanto às regiões locais que têm uma relação GC:AT maior do que cerca de 2 em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos contíguos. A seqüência de polinucleotídeo é ajustada como necessário, pela substituição de códons nestas regiões tal que a relação GC:AT local seja menor do que cerca de 2 e a composição de polinucleotídeo inteira esteja na faixa de 0,9 a 1,3.

5. Seguir as etapas de 6 a 12 da Tabela 6.

» · « • · · • · · »··· · ·

Tabela 13. Comparação da identidade de seqüência percentual do GmEPSPS modificado ao nível da seqüência de polinucleotídeo.

	GmEPSPS GM	GmEPSPS Nat
GmEPSPS GM	100,00	72,43
GmEPSPS Nat		100,00

O gene EPSPS da soja nativa é modificado usando uma tabela de códon de soja (Tabela 4) e as condições do método da presente invenção. A relação relativa de GC:AT não é mudada no gene modificado, entretanto a identidade de seqüência entre as duas é reduzida em 72 %. EXEMPLO 4

O gene do polinucleotídeo aroA nativo isolado de Agrobacterium cepa CP4 (Patente U.S. N^s 5.633.435, aqui incorporada por referência em sua totalidade) que codifica uma EPSP sintase resistente ao glifosato (SEQ ID NO; 15) pode ser modificada pelo método da presente invenção para fornecer um polinucleotídeo que tenha o uso de códon de Arabidopsis, Zea mays ou Glicina max. Para a expressão apropriada de CP4EPSPS para conferir a tolerância ao glifosato em plantas, um peptídeo de trânsito de cloroplasto é necessariamente fundido à seqüência codificadora de CP4EPSPS para alvejar o acúmulo da enzima nos cloroplastos. O peptídeo de trânsito de cloroplasto CTP2 é habitualmente usado para a expressão deste gene em plantas transgênicas (Nida et al., J. Agric. Food Chem. 44: 1960 a 1966, 1996). A seqüência de CP4EPSPS junta com o polinucleotídeo CTP2 (SEQ ID NO: 11) foram modificados pelo método da presente invenção. Outros peptídeos de trânsito de cloroplasto conhecidos na técnica podem ser fundidos a CP4EPSPS para direcionar a enzima aos cloroplastos.

Tabela 14. Construção de polinucleotídeo para a seqüência codificadora da EPSP sintase de aroA:CP4 (CP4EPSPS_AT, CP4EPSPS_ZM ou CP4EPSPS_GM)

1. Colocar a seqüência de peptídeo de trânsito de CTP2 (SEQ ID

NO: 11) em frente de CP4EPSPS (SEQ ID NO: 15) como um polipeptídeo de fusão. Retro traduzir o polipeptídeo de fusão para produzir uma seqüência de polinucleotídeo artificial usando a tabela de uso de códon de Arabidopsis thaliana (Tabela 2), ou a tabela de uso do códon de Zea mays (Tabela 3) ou a tabela de uso do códon de Glicina max (Tabela 4).

2. Realizar o alinhamento de seqüência com as seqüências de polinucleotídeo CTP2 nativo (SEQ ID NO: 12) e CP4EPSPS nativo (SEQ ID NO: 16) e a seqüência de polinucleotídeo artificial para determinar grau de identidade de seqüência, mapear as matrizes de leitura aberta, selecionar padrões para procurar e identificar seqüências de reconhecimento de enzima de restrição.

3. Fazer correções nos códons usados na seqüência de polinucleotídeo artificial para se obter a porcentagem desejada de identidade de seqüência e para evitar a formação de cachos de códons idênticos. Isto é especialmente importante para os aminoácidos que ocorrem em alta freqüência, isto é, alanina, glicina, histidina, leucina, serina e valina. Distribuição aproximada do uso de códon na seqüência de polinucleotídeo de acordo com o uso de códon de Arabidopsis thaliana, Tabela 2 ou a tabela de uso do códon de Zea mays (Tabela 3) dependendo da tabela em uso.

4. A seqüência de polinucleotídeo artificial é inspecionada quanto às regiões locais que têm uma relação GC:AT maior do que cerca de 2 em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos contíguos. A seqüência de polinucleotídeo é ajustada como necessário, pela substituição de códons nestas regiões tal que a relação GC:AT local seja menor do que cerca de 2 e a composição de polinucleotídeo inteira estando na faixa de 0,9 a 1,3 é a Tabela 2 que é usada e de 1,2 a 1,7 se a Tabela 3 é usada.

5. Seguir as etapas de 6 a 12 da Tabela 6.

Tabela 15. Comparação da identidade de seqüência percentual dos polinucleotídeos CP4EPSPS artificiais.

	CTP2CP GM	CTP2CP4 _AT	CTP2CP4 _ZM	CTP2CP4 _Syn	CTP2CP4 _NAT
CTP2CP4 GM	100,00	75,66	74,12	75,15	74,37
CTP2CP4 AT		100,00	76,13	74,56*	72,93
CTP2CP4 ZM			100,00	77,76*	82,58
CTP2CP4 Syn				100,00	82,70
CTP2CP4 NAT					100,00

*Α porcentagem de identidade diz respeito à CP4EPSPS e não incluem o peptídeo de trânsito.

Tabela 16. A composição de nucleotídeo e a relação GC:AT das seqüências de polinucleotideo artificiais para a seqüência de gene de CP4EPSPS.

	A	C	G	T	GC:AT
CTP2CP4_GM	382	375	442	397	1.05
CTP2CP4_AT	369	408	469	350	1.22
CTP2CP4 ZM	312	487	577	290	1.65

A seqüência de polinucleotideo CTP2_Nat (SEQ ID NO: 12) mais CP4EPSPS_Nat (SEQ ID NO: 16) designada como CTP2CP4_Nat é comparada na Tabela 15 com as seqüências de polinucleotideo artificiais designadas como CTP2CP4_AT (CTP2_AT, SEQ ID NO: 13 fundida a CP4EPSPS_AT, SEQ ID NO: 17) e CTP2CP4_ZM (CTP2_AT, SEQ ID NO:

14 fundida a CP4EPSPS_ZM, SEQ ID NO: 18) produzidas pelo método da presente invenção. A seqüência de polinucleotideo que é a mais divergente das seqüências nativas CTP2CP4_NAT e CTP2CP4EPSPS_Syn é a CTP2CP4_AT tendo cerca de 73 % e 75 % de identidade de seqüência, respectivamente. A seqüência de polinucleotideo CTP2CP4_ZM comparada com a CTP2CP4_Nat e CP4EPSPS_Syn tem cerca de 83 % e 78 % de identidade com estas duas seqüências, respectivamente.

Um critério primário para a seleção de transgenes para combinar em uma planta é a identidade percentual. A Tabela 15 pode ser usada para selecionar uma molécula de polinucleotideo de CP4EPSPS para a constru20 ção do cassete de expressão vegetal quando é conhecido que a planta receptora conterá mais do que um polinucleotideo CP4EPSPS. A relação GC:AT na CP4EPSPS nativa é de cerca de 1,7. A versão artificial com o códon de eleição de Zea mays é produzida para ter uma relação GC:AT muito similar. Na versão do códon de Arabidopsis, a relação GC:AT é diminuída em cerca de 1,2.

A expressão de gene também é um critério para a seleção de transgenes a serem expressados. A expressão de um transgene pode variar em plantas de safra diferentes, portanto ter várias seqüências codificadoras ·· ♦·······

safra e um as87 de polinucleotídeo artificiais disponíveis para testar em plantas de genótipos, variedades ou cultivares diferentes é uma vantagem e pecto da invenção.

EXEMPLO 5

A seqüência de polinucleotídeo bar (SEQ ID NO: 20) que codifica uma proteína de fosfinotricina acetil transferase (SEQ ID NO: 19) foi usada para modificar geneticamente plantas quanto a resistência ao herbicida de glufosinato. Duas seqüências de polinucleotídeo bar novas foram planejadas usando o método da presente invenção. O alinhamento de BAR1_Nat com os dois polinucleotídeos BAR1 novos artificiais é mostrado na Figura 4. Tabela 17. Construção de gene de polinucleotídeo para BAR1_AT (SEQ ID NO: 21) e BAR1_ZM (SEQ ID NO: 22)

1. Retro traduzir a SEQ ID NO: 19 para gerar uma seqüência de polinucleotídeo usando a tabela de uso de códon de Arabidopsis thaliana (Tabela 2) ou a tabela de uso do códon de Zea mays (Tabela 3)

2. Realizar o alinhamento de seqüência com a seqüência de polinucleotídeo BAR1_Nat nativo (SEQ ID NO: 20) e a seqüência de polinucleotídeo artificial para determinar o grau de identidade de seqüência, mapear as estruturas de leitura aberta, selecionar os padrões para procurar e identificar as seqüências de reconhecimento de enzima de restrição.

3. Fazer correções para os códons usados na seqüência de polinucleotídeo artificial para se obter a porcentagem desejada de identidade de seqüência e para evitar a formação de cachos de códons idênticos. Isto é especialmente importante para os aminoácidos que ocorrem em alta freqüência, isto é, alanina, glicina, histidina, leucina, serina e valina. Distribuição aproximada de uso de códon na seqüência de polinucleotídeo de acordo com o uso de códon de Arabidopsis thaliana, Tabela 2 ou a tabela de uso do códon de Zea mays (Tabela 3) dependendo da tabela em uso.

4. A seqüência de polinucleotídeo artificial é inspecionada quanto às regiões locais que têm uma relação GC:AT maior do que cerca de 2 em uma faixa de cerca de 50 nucleotídeos contíguos. A seqüência de polinucleotídeo é ajustada como necessário, pela substituição de códons nestas regi• · ·····♦·· ··· ··· ·· • · · · · « · · · · ··· · · · • · · · ões tal que a relação GC.AT local seja menor do que cerca de 2 e a composição de polinucleotídeo inteira esteja na faixa de 0,9 a 1,3 se a Tabela 2 é usada e 1,2 a 1,7 se a Tabela 3 é usada.

5. Seguir as etapas de 6 a 12 da Tabela 6.

A identidade de seqüência de polinucleotídeos BAR artificiais está na faixa de 73 a 77 % (Tabela 18). O polinucleotídeo nativo é altamente rico em GC. A versão artificial (BAR1_ZM) com o códon de eleição de Zea mays reduziu a relação GC:AT a cerca de 1,3 e a versão artificial (BAR1_AT) com códon de eleição de Arabidopsis a relação é de cerca de 1,0 (Tabela 19).

Tabela 18. Identidade de seqüência percentual entre os genes bar ao nível de seqüência de polinucleotídeo.

	BAR1 ZM	BAR1 AT	BAR1 Nat
BAR1 ZM	100.00	77.35	76.99
BAR1 AT		100.00	73.73
BAR1 Nat			100.00

Tabela 19. Composição de nucleotídeo e a relação GC:AT das seqüências de polinucleotídeo artificiais para a seqüência de gene bar.

BAR_AT	139	130	144	139	1.01
BAR ZM	122	156	154	120	1.28

EXEMPLO 6

Este exemplo serve para ilustrar os constructos de DNA para a expressão dos polinucleotídeos artificiais da presente invenção em plantas. Um cassete de expressão vegetal de DNA transgênico compreende elementos reguladores que controlam a transcrição de um mRNA do cassete. Um cassete de expressão vegetal é construído para incluir um promotor que funciona em plantas que é operavelmente ligado a uma região líder 5' que é operavelmente ligada a uma seqüência de DNA de interesse operavelmente ligada a uma região de término 3'. Estes cassetes são construídos em vetores plasmídicos, que podem ser depois transferidos em plantas pelos métodos de transformação mediados por Agrobacterium ou outros métodos conhecidos por aqueles versados na técnica da transformação de planta. Os »······· γ

seguintes constructos de vetor plasmídico são ilustradas para fornecer exemplos de plasmídeos contendo cassetes de expressão vegetal que compreendem as moléculas de polinucleotídeo artificiais da presente invenção e não são limitadas a estes exemplos.

As moléculas de polinucleotídeo artificiais da presente invenção, por exemplo, CP4EPSPS_AT e CP4EPSPS_ZM são sintetizadas usando iniciadores envolvidos. O produto de tamanho natural é depois amplificado com iniciadores específicos de gene contendo projeções com Sphl (iniciador avançado) e EcoRI (iniciador reverso). Os genes são clonados no vetor pCRIl-TOPO (Invitrogen, CA). Os plasmídeos pMON54949 (CP4EPSPS_AT, Figura 6) e pMON54950 (CP4EPSPS_ZM, Figura 7) resultantes contêm o polinucleotídeo artificial e estes polinucleotídeos são seqüenciados usando métodos de seqüenciamento de DNA para confirmar que as modificações projetadas pelo método da presente invenção estão contidas nos polinucleotídeos artificiais. Na etapa seguinte, o polinucleotídeo artificial que codifica o peptídeo de trânsito de cloroplasto CTP2 é ligado à extremidade 5' dos polinucleotídeos CP4EPSPS. O promotor CaMV 35S com um realçador duplicado (P-CaMVe35S) e um intron de actina 1 de arroz (l-OsAct1) derivado de pMON30151 (Figura 8) pela digestão com Sphl e Hindlll ligados aos polinucleotídeos CTP2CP4EPSPS para criar os plasmídeos pMON59302 (CTP2CP4EPSPS_AT, Figura 9) e pMON59307 (CTP2CP4EPSPS_ZM, Figura 10).

Para a expressão dos novos polinucleotídeos artificiais em plantas monocotiledôneas, os genes são colocados nos cassetes de expressão vegetal contendo na extremidade 5* do polinucleotídeo, um promotor e um intron, uma região não-traduzida 5' e na extremidade 3' do polinucleotídeo um sinal de término de transcrição. Para este propósito, pMON42411 (Figura 11) contendo P-CaMV35S:en, I-HSP70, CTP2CP4_Nat e NOS 3' são digeridos com enzimas de restrição Ncol e EcoRI. O pMON59302 (Figura 9) e pMON59307 (Figura 10) são digeridos com as mesmas enzimas de restrição. Os fragmentos são purificados em gel usando o kit de purificação em gel da Qiagen e ligados para formar pMON58400 (CP4EPSPS_AT, Figura • ·· ···« • · · · • · · · · » ·« · · ···<

12) e pMON58401 (CP4EPSPS_ZM, Figura 13). O vetor pMON54964 adicional (Figura 14), contendo P-OsAct1/ l-OsAct1 é fabricado pela substituição de P-e35S/l-Hsp70 a partir de pMON58400 (Figura 12) usando o fragmento Hindlll /Ncol de pMON25455 (Figura 15). Para criar um vetor de expressão de monocotiledônea contendo o promotor P-FMV, pMON30152 (Figura 16) é digerido com Nhel, as extremidades são feitas abruptas com T4DNA polimerase na presença de 4 dNTP-s (200 μΜ) e Ncol. Os fragmentos de DNA CPT2CP4_AT ou CTP2CP4_ZM são isolados de pMON59302 (Figura 9) ou pMON59307 (Figura 10), respectivamente digerindo-se com EcoRI, fazendose abrupto com T4 DNA polimerase e digestão com Ncol. Os fragmentos de DNA purificados em gel são ligados e novos plasmídeos pMON54992 (CTP2CP4_AT, Figura 17) e pMON54985 (CTP2CP4_ZM, Figura 18) são criados. Em cada caso a construção plasmídica bem sucedida é confirmada pela digestão com endonuclease de restrição, usando entre outras Clal (introduzida em ambos os polinucleotídeos artificiais) e Pst I (introduzida no CP4EPSPS_ZM). O CP4EPSPS_Nat presente nos vetores precursores tem tanto Clal quanto dois sítios de restrição Pstl na região codificadora em localização diferente daquela nos polinucleotídeos artificiais.

Para a expressão de polinucleotídeos CP4EPSPS artificiais em plantas dicotiledôneas, dois vetores precursores são usados: pMON20999 (P-FMV/CTP2CP4_Syn/3'E-9, Figura 19) e pMON45313 (Pe35S/CTP2CP4_Syn/3'E9, Figura 20). Em cada plasmídeo, um fragmento de DNA contendo o polinucleotídeo CTP2CP4_Syn é substituído com CTP2CP4_AT ou CTP2CP4_ZM. Para criar pMON59308 (PCaMVe35S/CTP2CP4_AT, Figura 21) ou pMON59309 (PCaMVe35S/CTP2CP4_ZM, Figura 22), pMON45313 é digerido com Ncol e EcoRI e os fragmentos de restrição de DNA derivados de digestões com Ncol/EcoRI de pMON59302 (CTP2CP4_AT, Figura 9) ou pMON59307 (CTP2CP4_ZM, Figura 10) são ligados, respectivamente. Para criar pMON59313 (P-FMV/CTP2CP4_AT/3’E9, Figura 23) e pMON59396 (PFMV/CTP2CP4_ZM/3'E9, Figura 24) o plasmídeo precursor pMON20999 é digerido com Ncol e BamHI para remover CTP2CP4_Syn e os fragmentos

··· • · • · ···	··· ·· • · · • · · • · · • · ·	···· • • • • ·	• ·· ········ ·· · · · · • · · · • · · · • · · ·	··
	··· ··	··	······· · ·	•

de restrição Ncol/BamHI derivados de pMON59308 (CTP2CP4_AT, Figura 21) ou pMON59309 (CTP2CP4_ZM, Figura 22) são ligados, respectivamente.

EXEMPLO 7

Os polinucleotídeos artificiais são testados para determinar a eficácia para conferir tolerância ao glifosato às plantas transgênicas. Cinco cassetes de expressão diferentes (Tabela 20) com os novos polinucleotídeos CP4EPSPS artificiais são transformados no milho e as plantas de milho transgênico resultante comparadas com o padrão comercial (Roundup Ready® Corn 603, Monsanto Co.). O plasmídeo pMON25496 (Figura 25) contido no padrão comercial tem duas cópias do polinucleotídeo CP4EPSPS_Nat, a expressão dirigida pelos promotores P-CaMVe35S (P-CaMVe35S) e POsActl, respectivamente. Os plasmídeos contendo os novos polinucleotídeos de CP4EPSPS artificiais contêm apenas uma única cópia do polinucleotídeo a ser testado. A expressão destes polinucleotídeos são dirigidas pelo promotor P-CaMVe35S com o intron da proteína de choque térmico l-Hsp70 ou o promotor P-FMV com um intron da sacarose sintase do arroz (1-OsSS). O plasmídeo pMON54964 contém o promotor da actina 1 do arroz com o primeiro intron nativo (Patente U.S. N^Q 5.641.876, aqui incorporada por referência em sua totalidade).

Estes plasmídeos são transformados em células de milho por um método mediado por Agrobacterium e as linhagens de milho transgênico regeneradas em seleção com glifosato. As plantas de milho transgênico podem ser produzidas por um método de transformação mediado por Agrobacterium. Uma Agrobacterium cepa C58 desarmada (ABI) que abriga um constructo binário da presente invenção é usada. Esta é transferida em Agrobacterium por um método de acasalamento triparental (Ditta etal., Proc. Natl. Acad. Sei. 77: 7347 a 7351). Culturas líquidas de Agrobacterium são iniciadas a partir de estoques de glicerol ou a partir de uma placa recém riscada e cultivada durante a noite entre 26° C e 28° C com agitação (aproximadamente 150 rpm) até a fase de cultivo de hemi-log em meio LB líquido, pH 7,0 contendo os antibióticos apropriados. As células de Agrobacterium

são ressuspensos no meio de inoculação (CM4C líquido) e a densidade é ajustada até OD₆6o de 1. Os embriões de milho HillxLH198 e Hill Tipo li imaturos recém isolados são inoculados com um constructo contendo Agrobacterium e co-cultivados vários dias no escuro a 23° C. Os embriões são depois transferidos para meio de demora e incubados a 28° C durante vários ou mais dias. Todas as culturas subseqüentes são mantidas nesta temperatura. Os embriões são transferidos para um primeiro meio de seleção contendo carbenicilina 500/0,5 mM de glifosato). Duas semanas mais tarde, o tecido sobrevivente é transferido a um segundo meio de seleção contendo carbenicilina 500/1,0 mM de glifosato). Subcultivar o calo sobrevivente a cada 2 semanas até que os eventos possam ser identificados. Isto pode levar cerca de 3 subculturas em glifosato 1,0 mM. Uma vez que os eventos são identificados, avolumar o tecido a regenerar. As mudas são transferidas ao meio MSOD em vaso de cultura e mantido durante duas semanas. Depois as plantas com raízes são transferidas para o solo. Aqueles versados na técnica de transformação de milho podem modificar este método para fornecer plantas de milho transgênico substancialmente idênticas contendo as composições de DNA da presente invenção.

Cerca de 30 linhagens de milho transgênico para cada constructo de plasmídeo são testadas e a eficiência de transformação e os níveis de expressão da enzima CP4EPSPS são mostradas na Tabela 20. As linhagens de milho transgênico são tratadas com glifosato em uma taxa de 64 oz/acre (1,8 kg/acre) como plantas jovens, as plantas sobreviventes são ensaiadas pelo CP4EPSPS ELISA (Padgette et al. Crop Sei. 35: 1451 a 1461, 1995) para determinar os níveis de expressão de proteína de EPSPS CP4 (% exp CP4) mostrada na Tabela 20 e o nível de expressão é comparado com a planta do milho tolerante ao glifosato padrão comercialmente disponíveis (Roundup Ready® Com 603, Monsanto Co., St. Louis, MO) como uma porcentagem da quantidade de expressão de proteína determinada no padrão comercial. No geral, mais do que 50 % das linhagens de milho sobrevivem a pulverização com 1,8 kg/acre (64 oz/acre) de glifosato. As plantas sobreviventes são mostradas ter alto nível de expressão de CP4EPSPS que

variam de cerca de 75 a 86 % de padrão comercial 603.

Tabela 20. Eficiência de transformação (TE), expressão de CP4 (% média) derivada da transformação de constructos CP4-alt diferentes.

pMON	Promotor/lntron #	TE (%)	CP4 exp (%)*
58400 (CP4 AT)	P-CaMVe35S/IHsp70	5.4	75.5
58401 (CP4 ZM)	P-CaMVe35S/IHsp70	7.2	84.7
54964 (CP4 AT)	P-OsAct1	8.2	78.1
54985 (CP4 ZM)	P-FMV/IOsSS	11.5	85.7
54992 (CP4 AT)	P-FMV/IOsSS	11.5	78.2
nk603 (control)	P-OsAct1/P-e35S:	-	100

* A expressão de CP4EPSPS é calculada como a porcentagem de controle (603) feita em plantas que sobreviveram à pulverização com glifosato (1,8 kg/acre (64 oz/acre)).

EXEMPLO 8

Três constructos plasmídicos são avaliados em plantas de algodão transgênico (Tabela 21). O constructo de controle (pMON20999) contém

P-FMV/CP4EPSPS_Syn este cassete de expressão está contido na linhagem 1445 de algodão tolerante ao glifosato comercialmente disponível (Roundup Ready® cotton, Monsanto Co., St. Louis, MO). Os constructos plasmídicos, pMON59313 e pMON59396 contendo os polinucleotídeos CP4EPSPS_AT e CP4EPSPS_ZM, respectivamente, são ensaiados quanto a eficiência de transformação e os níveis de enzima CP4EPSPS em relação ao cassete de expressão tolerante ao glifosato comercial. Cerca de cinqüenta linhagens de algodão transgênico são avaliadas para cada constructo. O polinucleotídeo CP4EPSPS_AT artificial dirigido pelo promotor PFMV dá uma porcentagem mais alta de plantas com um único inserto e um aumento no nível de expressão da enzima CP4EPSPS em relação ao cassete de expressão de pMON20999 como medido pelo ELISA.

Tabela 21. Eficiência de transformação (TE), expressão de CP4EPSPS média em linhagens de algodão RO derivada da transformação de constructos de CP4EPSPS diferentes.

pMON	Promotor	TE (%)	CP4 Exp (%)
20999 (CP4EPSPS Syn)	P-FMV	15,0	100,0
59313 (CP4EPSPS AT)	P-FMV	15,0	116,4
59396 (CP4EPSPS ZM)	P-FMV	16,1	52,0

EXEMPLO 9

Os constructos contendo os polinucleotídeos CP4EPSPS artificiais, CP4EPSPS_AT e CP4EPSPS_ZM são avaliados na soja (Tabela 22). Os constructos plasmídicas contêm todas o promotor P-FMV para direcionar a expressão dos novos polinucleotídeos CP4EPSPS e são comparadas ao P-FMV/CP4EPSPS_Syn contido em pMON20999. Cerca de 25 a 30 plantas de soja transgênica são produzidas para cada construção. A eficiência de transformação e os níveis de enzima CP4EPSPS são medidos. Um nível de expressão surpreendentemente alto de proteína CP4EPSPS é medido em plantas de soja contendo a seqüência codificadora de CP4EPSPS_ZM (Tabela 22).

Tabela 22. Eficiência de transformação (TE), expressão CP4 média derivada da transformação de constructos de CP4EPSPS diferentes.

pMON	Promotor	TE (%)	CP4Exp(%)
20999 (CP4 Syn)	P-FMV	0,55	100,0
59313 (CP4 AT)	P-FMV	0,40	66,6
54996 (CP4 ZM)	P-FMV	0,29	242,5

EXEMPLO 10

As células de tabaco são transformadas com três constructos plasmídicos contendo seqüências de polinucleotídeo de CP4EPSPS dife20 rentes e regeneradas em plantas. Cerca de vinte linhagens transgênicas são avaliadas de cada constructo. A expressão de cada um dos polinucleotídeos CP4EPSPS é direcionada pelo promotor realçador duplicado P-CaMVe35S (Tabela 23). A eficiência de transformação e o nível de expressão da enzima CP4EPSPS é medido. Os constructos de polinucleotídeo de CP4EPSPS

diferentes são mostradas realizar aproximadamente a mesma em tabaco transgênico quanto a eficiência de transformação e expressão.

Tabela 23. Eficiência de transformação (TE), expressão de CP4 média em linhagens de tabaco RO derivadas da transformação de constructos de

EPSPS de CP4 diferentes.

pMON	Promotor	TE (%)	CP4 exp. (%)
59308 CP4EPSPS AT	P-CaMVe35S	35	100.0
59309 CP4EPSPS ZM	P-CaMVe35S	35	91.0
54313 CP4EPSPS_Syn	P-CaMVe35S	35	100.0

EXEMPLO 11

A Arabidopsis thaliana é transformada com quatro constructos plasmídicos pela infiltração a vácuo (Bechtold N, et al., CR Acad Sei Paris Sciences di Ia vie/life Sciences 316: 1194 a 1199, (1993) e a progênie V1 avaliada para comparar a eficácia das seqüências de polinucleotídeo CP4EPSPS diferentes e promotores diferentes para o uso na seleção de plantas em glifosato (Tabela 24). Cerca de 30 plantas V1 transgênicas (+) são produzidas para cada constructo. Os constructos direcionadas pelo PCaMVe35S com o realçador duplicado (pMON45313, pMON59308 e pMON59309) não mostram nenhuma diferença substancial no nível de expressão em folhas como determinado pelo ELISA. As plantas são transformadas com pMON26140 que contém CP4EPSPS_Syn dirigido pelo promotor P-FMV, estas plantas mostram o nível de expressão mais alto, os níveis de expressão detectados a partir das plantas dos constructos de teste são comparados a pMON26140.

Tabela 24. Avaliação de cassetes de expressão CP4 diferentes em Arabidopsis

pMON	Promotor/	Plantas produzidas	CP4 exp.(%)
45313(CPEPSPS4 Syn)	P-CaMVe35S	+	82,1
59308(CP4EPSPS AT)	P-CaMVe35S	+	79,3
59309(CP4EPSPS ZM)	P-CaMVe35S	+	77,3
26140(CP4EPSPS Syn)	P-FMV	+	100,0

EXEMPLO 12

Plantas de trigo transformadas com os novos polinucleotídeos CP4EPSPS são comparadas quanto a eficiência de transformação e a expressão da enzima CP4EPSPS determinada pelo ELISA (Tabela 25). O CP4EPSPS_ZM fornece a expressão da enzima CPEPSPS pelo menos sete vezes mais alta do que o CP4EPSPS_AT. A expressão média de CP4EPSPS nas folhas de plantas de trigo contendo o polinucleotídeo CP4EPSPS_ZM é de cerca de 64 % daquele encontrado no trigo resistente ao glifosato que contém um constructo de cassete duplo, pMON30139: Pe35S/l-Hsp70/CP4EPSPS_Nat e P-OsAct1/l-OsAct1/CP4EPSPS_Nat (WO/0022704).

Tabela 25. Desempenho de polinucleotídeos CP4EPSPS diferentes no trigo

pMON	Promotor/lntron	TE (%)	CP4 Exp. (%)
58400 CP4EPSPS AT	P-e35S/l-Hsp70	0.25	9,2
58401 CP4EPSPS ZM	P-e35S/l-Hsp70	0.35	64,0
30139 CP4EPSPS Nat	P-e35S:P-OsAct1	-	100,0

EXEMPLO 13

Este exemplo serve para ilustrar a detecção de polinucleotídeos artificiais diferentes em plantas transgênicas, especificamente CP4EPSPS_AT e CP4EPSPS_ZM. Os outros polinucleotídeos artificiais, OsEPSPS_AT, OsEPSPS_ZM, GmEPSPS_GM, ZmEPSPS_ZM, CTP2_AT, CTP2_ZM, Bar1_AT e Bar1_ZM podem ser todos especificamente detectados em plantas transgênicas pelos métodos que fornecem um amplicon de DNA ou pela hibridização de uma sonda de DNA a uma amostra de planta. Aqueles versados na técnica da detecção de DNA podem facilmente planejar moléculas preparadoras a partir das seqüências de polinucleotídeo artificiais fornecidas na presente invenção para permitir um método que especificamente detectará o polinucleotídeo artificial em uma amostra de planta. O uso de um método ou de um kit que forneça iniciadores de DNA ou sondas homólogas ou complementares aos polinucleotídeos artificiais aqui descritos é um aspecto da presente invenção.

Um método de detecção de DNA (reação de cadeia da polime• · · · · · • · • ·

rase, PCR) é planejado para detectar os polinucleotídeos CP4EPSPS artificiais em plantas transgênicas. Os conjuntos únicos de iniciadores de DNA mostrados na Tabela 26 são planejados para amplificar um polinucleotídeo de CP4EPSPS específico e para fornecer amplicons distintamente dimenci5 onados. Os amplicons diferem suficientemente no comprimento de polinucleotídeo entre os vários polinucleotídeos CP4EPSPS para tornar fácil a separação dos amplicons pela eletroforese em gel de agarose padrão. A presença de mais do que um dos polinucleotídeos artificiais pode ser detectada em uma planta usando-se um método de PCR multiplex.

Tabela 26. Seqüência de iniciadores usados para a detecção de genes CP4 diferentes em plantas transgênicas.

Par de iniciador	Especificidade de gene	produto de PCR (bps)
SEQ ID NOs: 24 e 25	CP4EPSPS AT	938 (940)
SEQ ID NOs: 26 e 27	CP4EPSPS ZM	595 (600)
SEQ ID NOs: 28 e 29	CP4EPSPS Nat	712 (710)
SEQ ID NOs: 30 e 31	CP4EPSPS Syn	443 (440)

Os pares iniciadores de DNA (Tabela 26) são usados para produzir um diagnóstico de amplicon para um polinucleotídeo CP4EPSPS específico em uma planta transgênica. Estes pares iniciadores incluem, mas não são limitados à SEQ ID NO: 24 e SEQ ID NO: 25 para o polinucleotídeo CP4EPSPS_AT; SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27 para o CP4EPSPS_ZM; SEQ ID NO: 28 e SEQ ID NO: 29 para o CP4EPSPS_Nat e SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31 para a molécula de polinucleotídeo CP4EPSPS_Syn. Além destes pares preparadores, qualquer par preparador derivado da SEQ ID

NO: 17 ou SEQ ID NO: 18 que quando usados em uma reação de amplificação de DNA produz um diagnóstico de amplicon de DNA para o respectivo polinucleotídeo CP4EPSPS é um aspecto da presente invenção.

As condições de amplificação para esta análise é ilustrada na Tabela 27 e Tabela 28, entretanto, qualquer modificação destas condições incluindo o uso de fragmentos das moléculas de DNA da presente invenção ou seus complementos como moléculas iniciadoras, produzindo um diagnóstico de molécula de DNA de amplicon para os polinucleotídeos artificiais ···· ····

aqui descritos está dentro da vesatilidade da técnica. As moléculas de DNA da presente invenção incluem pelo menos a SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 35. As moléculas de DNA que funcionam como moléculas iniciadores em um método de amplificação de DNA para detectar a presença dos polinucleotídeos artificiais incluem, mas não são limitadas à SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 31.

Em um método para determinar a presença de polinucleotídeos da presente invenção, a análise de amostra de extrato de DNA de tecido vegetal deve incluir um controle positivo conhecido conter o polinucleotideo artificial e um controle de extrato de DNA negativo de uma planta que não é transgênica ou não contém o polinucleotideo artificial e um controle negativo que não contenha nenhum padrão no extrato de DNA.

As moléculas iniciadoras de DNA adicionais de comprimento suficiente pode ser selecionada da SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 e condições otimizadas para a produção de um amplicon que pode diferir dos métodos mostrados na Tabela 27 e Tabela 28, mas resultam em um diagnóstico de amplicon para os polinucleotídeos artificiais. O uso destas seqüências preparadoras de DNA homólogas ou complementares à SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 usadas com ou sem as modificações para os métodos das Tabelas 27 e 28 estão dentro do escopo da invenção. O ensaio para os amplicons CP4EPSPS_AT e CP4EPSPS_ZM pode ser realizado pelo uso de um termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine, PerkinElmer 9700 ou Eppendorf Mastercycler Gradient como mostrado na Tabela 28 ou pelos métodos e aparelho conhecido por aqueles versados na técnica.

.··.···;···: .

Tabela 27. Procedimento de amplificação de DNA e mistura de reação para a confirmação de polinucleotídeo de EPSPS artificial CP4EPSPS_AT em plantas de milho.

Etapa	Reagente	Quantidade	Comentários
1	Água isenta de Nuclease	adicionar até volume final de 20 μΙ	-
2	tampão de reação 10X (com MgCI₂)	2,0 μΙ	Concentração final de 1X de tampão, concentração final de 1,5 mM de MgCI₂
3	10 mM de solução de dATP, dCTP, dGTP e dTTP	0,4 μΙ	Concentração final de 200 μΜ de cada dNTP
4	Iniciador (SEQ ID NO: 24) (ressuspenso em tampão 1X TE ou água isenta de nuclease a uma concentração de 10 μΜ)	0,4 μΙ	Concentração final de 0,2 μΜ
5	Iniciador (SEQ ID NO: 25) (ressuspenso em tampão 1X TE ou água isenta de nuclease a uma concentração de 10 μΜ)	0,4 μΙ	Concentração final de 0,2 μΜ
6	Iniciador de controle (SEQ ID NO: 32) (ressuspenso em tampão 1X TE ou água isenta de nuclease a uma con- centração de 10 μΜ)	0,2 μΙ	Concentração final de 0,1 μΜ

100

Etapa	Reagente	Quantidade	Comentários
7	Iniciador de controle (SEQ ID NO: 33) (ressuspenso em tampão 1X TE ou água isenta de nuclease a uma con- centração de 10 μΜ)	0,2 μΙ	Concentração final de 0,1 μΜ
8	RNase, DNase livre (500 ng/μΙ)	0,1 μΙ	50 ng/reação
9	REDTaq DNA polimerase (1 unidade/μΙ)	1,0 μΙ (recomendado sacudir as pipetas antes da etapa seguinte)	1 unidade/reação
10	DNA extraído (padrão): • Amostras a serem analisadas • folhas individuais • folhas agrupadas (máximo de 50 folhas/ agrupamento) • Controle negativo • Controle negativo • Controle positivo	• 10 a 200 ng de DNA genômico • 200 ng de DNA genômico • 50 ng de DNA genômico de planta não transgênica • nenhum DNA padrão • 5 ng DNA plasmídico

Tabela 28. Parâmetros de PCR Sugeridos para termocicladores diferentes

Mistura suave e, se necessário (nenhum topo quente no termociclador), adicionar 1 a 2 gotas de óleo mineral no topo de cada reação. Processar com a PCR em um termociclador Stratagene Robocycler, MJ Engine,

Perkin-Elmer 9700 ou Eppendorf Mastercycler Gradient usando os seguintes parâmetros de ciclização.

Nota: Os termocicladores MJ Engine ou Eppendorf Mastercycler Gradient devem ser conduzidos no modo calculado. Conduzir o termociclador Perkin-Elmer 9700 com a velocidade de elevação ajustada no máximo.

101

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N° de Ciclos	Ajustes: Stratagene Robocycler
1	94° C 3 minutos
38	94° C 1 minuto 60° C 1 minuto 72° C 1 minuto e 30 segundos
1	72° C 10 minutos

N⁹ de Ciclos	Ajustes: MJ Engine ou Perkin-Elmer 9700
1	94° C	3 minutos
38	94° C 60° C 72° C	10 segundos 30 segundos 1 minuto
1	72° C	10 minutos

N° de Ciclos	Ajustes: Eppendorf Mastercycler Gradient
1	94° C	3 minutos
38	94° C 60° C 72° C	15 segundos 15 segundos 1 minuto
1	72° C	10 minutos

Todas as composições e métodos descritos e reivindicados aqui podem ser feitas e executadas considerando-se a presente descrição. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritas, estará evidente por aqueles de habilidade na técnica que as variações podem ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodos aqui descritos sem divergir do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, estará evidente que certos agentes que são tanto química e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos no lugar dos agentes aqui descritos enquanto os mesmos resultados ou similares podem ser obtidos. Todos de tais substitutos e modificações similares evidentes àqueles versados na técnica são considerados estar dentro do espirito, escopo e conceito da invenção como definido pelas reivindicações anexas.

Todas as publicações e pedidos de patente aqui citados são in15 corporados por referência em sua totalidade no mesmo grau como se cada

102 publicação ou pedido de patente individual fosse específico e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para reduzir o silenciamento de transgene em plantas transgênicas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

a) obter um construto de DNA compreendendo um polinucleotí5 deo artificial que codifica um peptídeo de trânsito de cloroplasto operavelmente ligado à SEQ ID NO: 18;

b) transformar o referido construto de DNA dentro de uma célula vegetal que compreende SEQ ID NO: 16; e

c) regenerar a referida célula vegetal em uma planta transgênica

10 fértil.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido polinucleotídeo artificial é expresso na referida planta transgênica fértil.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo 15 fato de que o referido polinucleotídeo artificial fornece um fenótipo agronomicamente útil selecionado do grupo que consiste em: tolerância a herbicida e resistência às doenças.
4. Molécula de polinucleotídeo artificial, caracterizada pelo fato de que compreende SEQ ID NO: 18.

20 5. Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende: uma molécula promotora que funciona em plantas, operavelmente ligada à referida molécula de polinucleotídeo artificial como definida na reivindicação 4.

6. Método de detectar um polinucleotídeo artificial em célula ve25 getal, planta ou sua progênie que compreende uma molécula de polinucleotídeo artificial, como definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas:

(a) contatar uma amostra de DNA isolado da referida célula vegetal, planta ou sua progênie com uma molécula de DNA, em que a referida

30 molécula de DNA compreende pelo menos uma molécula de DNA de um par de moléculas de DNA que quando usado em uma reação de amplificação de ácido nucléico produz um amplicon que é diagnóstico para a referida moléPetição 870160006724, de 26/02/2016, pág. 4/10 cuia de polinucleotídeo artificial, como definida na reivindicação 4, em que a molécula de DNA compreende um fragmento de SEQ ID NO: 18;

(b) realizar uma reação de amplificação de ácido nucléico, produzindo deste modo o amplicon; e

5 (c) detectar o amplicon.

7. Kit de detecção de DNA, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNA de comprimento suficiente para ser especificamente homóloga ou complementar a um polinucleotídeo artificial, como definido na reivindicação 4, em que a molécula de DNA compre10 ende um fragmento de SEQ ID NO: 18 e a molécula de DNA não é complemente complementar a SEQ ID NO: 16, em que a referida molécula de DNA é útil como uma sonda de DNA ou iniciador de DNA.

Petição 870160006724, de 26/02/2016, pág. 5/10

1/52

ÍM>

Figura 3A Figura 5A Figura 3B * Figura 5B Figura 3C Figura 5C Figura 3D Figura 5D Figura 3E ’ Figura 5E Figura 3F Figura 5F Figura 3G Figura 5G

Fig 3 Fig 5

Figi 2

2/52 ·· ········ • · * -*

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