BRPI0713039A2 - molécula de ácido nucléico e polipeptìdeo isolados, vetor, célula hospedeira, planta e semente transgênicas e métodos para produzir um polipeptìdeo com atividade de resistência a herbicidas, para conferir resistência a um herbicida em uma planta e para gerar um polinucleotìdeo variante de um polinucleotìdeo parental grg33, grg35, grg37, grg38, grg39, ou grgr50. - Google Patents

molécula de ácido nucléico e polipeptìdeo isolados, vetor, célula hospedeira, planta e semente transgênicas e métodos para produzir um polipeptìdeo com atividade de resistência a herbicidas, para conferir resistência a um herbicida em uma planta e para gerar um polinucleotìdeo variante de um polinucleotìdeo parental grg33, grg35, grg37, grg38, grg39, ou grgr50. Download PDF

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Abstract

MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO E POLIPEPTìDEO ISOLADOS, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, PLANTA E SEMENTE TRANSGêNICAS E MéTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTìDEO COM ATIVIDADE DE RESISTêNCIA A HERBICIDAS, PARA CONFERIR RESISTêNCIA A UM HERBICIDA EM UMA PLANTA E PARA GERAR UM POLINUCLEOTìDEO VARIANTE DE UM POLINUCLEOTìDEO PARENTAL GRG33, GRG35, GRG36, GRG37, GRG38, GRG39, OU GRG5O. São providos composições e métodos para conferir resistência a herbicidas para bactérias, plantas, células, tecidos e sementes vegetais. Composições incluem moléculas de ácidos nucléicos codificando polipeptideos de resistência ou tolerância a herbicidas, vetores compreendendo tais moléculas de ácidos nucléicos e células hospedeiras compreendendo os vetores. As seqúências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microrganismos e plantas. Composições também compreendem bactérias, plantas, células tecidos e semente vegetais transformados. Em particular, a presente invenção provê moléculas de ácidos nucléicos isoladas compreendendo a sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, uma sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22, a sequência de nucleotídeos de resistência a herbicidas depositada em um hospedeiro bacteriano como Nos. de Acesso NRRL B-30932, B-30933, B-30934, B-30945, B-30946, B-30947, ou B-30948, assim como variantes e fragmentos dessas.

Description

MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO E POLIPEPTÍDEO ISOLADOS, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, PLANTA E SEMENTE TRANSGÊNICAS E MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE DE RESISTÊNCIA A HERBICIDAS, PARA CONFERIR RESISTÊNCIA A UM HERBICIDA EM UMA PLANTA E PARA GERAR UM POLINUCLEOTÍDEO VARIANTE DE XJM POLINUCLEOTÍDEO PARENTAL GRG33, GRG35, GRG36, GRG37, GRG38, GRG39, OU GRG50
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção provê novos genes codificando 5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP) sintase que provêm resistência a herbicidas. Estes genes são úteis em biologia vegetal, melhoramento de cultivos, e cultura de células vegetais.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
N-fosfonometilglicina, comumente referida como glifosato, é um importante químico agrícola. Glifosato inibe a enzima que converte ácido fosfoenolpirúvico (PEP) e ácido 3-fosfochiquímico para ácido 5-enolpiruvil-3- fosfochiquímico. A inibição desta enzima (5- enolpiruvilchiquimato-3-fosfato sintase; aqui referida como "EPSP sintase") mata células vegetais desligando a via de chiquimato, inibindo, dessa forma, a biossíntese de ácidos aromáticos. Como os herbicidas de classe do glifosato inibem a biossíntese de aminoácidos aromáticos, eles podem não apenas matar células vegetais, mas são também tóxicos a células bacterianas. Glifosato inibe várias EPSP sintases bacterianas, e, assim, é tóxico para essas bactérias. Contudo, certas EPSP sintases bacterianas possuem uma alta tolerância a glifosato.
Células vegetais resistentes a toxicidade de glifosato podem ser produzidas transformando células vegetais para expressar sintases EPSP bacterianas resistentes a glifosato. Notavelmente, o gene bacteriano de Agrobacterium tumefaciens linhagem CP4 foi usado para conferir resistência a herbicidas em células vegetais em seguida da expressão em plantas. Uma EPSP sintase de Salmonella typhimurium linhagem CT7 confere resistência a glifosato em células bacterianas, e confere resistência a glifosato em células vegetais (Patentes Norte-Americanas Nos. 4.535.060; 4.769.061; e 5.094.945).
A Patente Norte-Americana 6.040.497 relata enzimas EPSP sintases de milho mutante tendo substituições de treonina para isoleucina na posição 102 e prolina para serina na posição 106 (a mutação "TIPS"). Tais alterações conferem resistência a glifosato na enzima de milho. Uma EPSP sintase mutada de Salmonella typhimurium linhagem CT7 confere resistência a glifosato em células bacterianas, e é relatado por conferir resistência a glifosato em células vegetais (Patentes Norte-Americanas Nos. 4.535.060; 4.769.061; e 5.094.945). He et al. ((2001) Biochim et Biophysica Acta 1568: 1-6) desenvolveram EPSP sintases com tolerância a glifosato aumentada por mutagênese e recombinação entre os genes de EPSP sintase de E. coli e Salmonella typhimurium, e sugerem que mutações na posição 42 (T42M) e posição 23 0 (Q23 0K) são prováveis de serem responsáveis pela resistência observada.
Um trabalho subseqüente (He et al. (2003) Biosci. Biotech. Biochem. 67: 1405-1409) mostra que a mutação T42M (treonina para metionina) é suficiente para melhorar a tolerância de ambas enzimas de E. coli e Salmonella typhimurium. Essas enzimas contêm substituições de aminoácidos em seus sítios ativos que previnem a ligação de glifosato sem afetar a ligação por PEP ou S3P. Mutações que ocorrem na região de junta entre os dois domínios globulares de EPSP sintase foram mostradas por alterar a afinidade de ligação de glifosato, mas não PEP (He et al. 2003, supra). Portanto, tais enzimas possuem atividade catalítica elevada, mesmo na presença de glifosato.
Devido às várias vantagens que plantas com resistência a herbicidas fornecem, métodos para identificar genes de resistência a herbicidas com atividade de resistência a glifosato são desejáveis.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO São providos composições e métodos para conferir resistência ou tolerância a herbicidas para bactérias, plantas, células, tecidos e sementes vegetais. Composições incluem moléculas de ácidos nucléicos codificando polipeptídeos de resistência ou tolerância a herbicidas, vetores compreendendo aquelas moléculas de ácidos nucléicos, e células hospedeiras compreendendo os vetores. Composições também incluem anticorpos para os polipeptídeos de resistência ou tolerância a herbicidas. Como notado, as seqüências de nucleotídeos da invenção podem ser usadas em construções de DNA ou cassetes de expressão para transformação e expressão em organismos, incluindo microorganismos e plantas. Composições também compreendem bactérias, plantas, células, tecidos, e sementes vegetais transformadas. Além disso, são providos métodos para produzir os polipeptídeos codificados pelos nucleotídeos sintéticos da invenção.
Em particular, moléculas de ácidos nucléicos isoladas e variantes dessas codificando polipeptídeos de resistência ou tolerância a herbicidas são providas. Adicionalmente, seqüências de aminoácidos e variantes dessas codificadas pelos polinucleotídeos que conferem resistência ou tolerância a herbicidas são englobadas. Em particular, a presente invenção provê moléculas de ácidos nucléicos isoladas compreendendo a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22, a seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas depositada em um hospedeiro bacteriano como Nos. de Acesso NRRL B-30932, B- 30933, B-30934, B-30945, B-30946, B-30947, ou B-30948, assim como variantes e fragmentos dessas. Seqüências de nucleotídeos que são complementares a uma seqüência de nucleotídeos da invenção, ou que hibridizam a uma seqüência da invenção ou a um complemento de uma seqüência da invenção são também englobadas.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 mostra um alinhamento da seqüência de aminoácidos de GRG33 (SEQ ID NO: 2) e GRG3 5 (SEQ ID NO: 5) com seqüências de EPSP sintase de Streptomyces cooelicolor (SEQ ID NO: 24), Streptomyces avermitilis (SEQ ID NO: 25), Zea mays (SEQ ID NO: 38), e E. coli (SEQ ID NO: 37). O alinhamento mostra os resíduos de aminoácidos mais altamente conservados destacados em preto e os resíduos de aminoácidos altamente conservados destacados em cinza.
A figura 2 mostra -um alinhamento da seqüência de aminoácidos de GRG3 6 (SEQ ID NO: 8) com seqüências de EPSP sintase de Bacillus halodurans (SEQ ID NO: 26), Bacillus claussi (SEQ ID NO: 27), Zea mays (SEQ ID NO: 38), e E. coli (SEQ ID NO:37). O alinhamento mostra os resíduos de aminoácidos mais altamente conservados destacados em preto e os resíduos de aminoácidos altamente conservados destacados em cinza. A figura 3 mostra um alinhamento de GRG3 8 (SEQ ID NO: 16) e GRG 50 (SEQ ID NO: 22) com outras enzimas EPSP sintases, incluindo GRG 8 (SEQ ID NO: 29), GRGl 2 (SEQ ID NO: 30), GRGl 5 (SEQ ID NO:31), GRG 5 (SEQ ID NO:32), GRG 6 (SEQ ID NO: 33), GRG7 (SEQ ID NO: 34), GRG 9 (SEQ ID NO: 35), GRGl (SEQ ID NO:41), a EPSP sintase descrita em Pedido de Patente Internacional No. W02005014820 (SEQ ID NO:36), e enzimas EPSP sintase de E. coli (SEQ ID NO: 37), Zea mays (SEQ ID NO: 38), Agrobacterium tumefaciens (SEQ ID NO: 39), e Bacillus subtilis (SEQ ID NO:40). O alinhamento mostra os resíduos de aminoácidos mais altamente conservados destacados em preto, e os resíduos de aminoácidos altamente conservados destacados em cinza.
DESCRIÇÃO DETALHADA
A presente invenção é projetada para composições e métodos para regular resistência a herbicidas em organismos, particularmente em plantas ou células vegetais. Os métodos envolvem transformar organismos com uma seqüência de nucleotídeos codificando um gene de resistência a glifosato da invenção. Em particular, uma seqüência de nucleotídeos da invenção é útil para preparar plantas que apresentam tolerância aumentada ao herbicida glifosato. Assim, bactérias, plantas, células vegetais, tecidos vegetais e sementes transformadas são providas. Composições incluem ácidos nucléicos e proteínas relacionando-se a tolerância a herbicidas em microorganismos e plantas, assim como bactérias, plantas, tecidos vegetais e sementes transformadas. Mais particularmente, seqüências de nucleotídeos dos genes de resistência a glifosato (grg33, syngrg33, grg35, syngrg35, grg36, syngrg36, grg37, syngrg37, grg38, syngrg38, grg39, syngrg39, grg50, syngrgSO) e as seqüências de aminoácidos das proteínas codificadas por estas são descritas. As seqüências são úteis na construção de vetores de expressão para transformação subseqüente em plantas de interesse, como sondas para o isolamento de outros genes de resistência a glifosato, como marcadores selecionáveis, e similares. Assim, por "gene de resistência a glifosato da invenção" entende-se a seqüência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, e fragmentos e variantes dessas que codificam um polipeptídeo de resistência ou tolerância a glifosato. Da mesma forma, um "polipeptídeo de resistência a glifosato da invenção" é um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22, e fragmentos e variantes dessas que conferem resistência ou tolerância a glifosato a uma célula hospedeira.
Plasmídeos contendo as seqüências de nucleotídeos de resistência a herbicidas da invenção foram depositados na coleção permanente da Coleção de Cultura do Serviço de Pesquisa Agrícola (Agricultural Research Service Culture Collection), Northern Regional Research Laboratory (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, Estados Unidos da América, em 9 de junho de 2006, e designadas como Nos. de Acesso NRRL B-30932 (para grg33), NRRL B-30933 (para grg35), e NRRL B-30934 (para grg36); e em 26 de junho de 2006, e designados como Nos. de Acesso NRRL B-30945 (para grg37), NRRL B-30946 (para grg38), NRRL B-30947 (para grg39), e NRRL B-30948 (para grg50). Este depósito será mantido sob os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimento de Patentes (International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure). Este depósito foi feito meramente como uma conveniência para aqueles especialistas na arte e não é uma admissão de que um depósito é necessário sob 35 U.S.C. §112.
Por "glifosato" entende-se qualquer forma herbicida de N-fosfonometilglicina (incluindo qualquer sal desse) e outras formas que resultam na produção de ânion de glifosato em planta. Uma "proteína de resistência a herbicidas" ou uma proteína resultante da expressão de uma "molécula de ácido nucléico codificando resistência a herbicidas" inclui proteínas que conferem em uma célula a habilidade de tolerar uma concentração mais alta de um herbicida do que células que não expressam a proteína, ou tolerar uma certa concentração de um herbicida por um período de tempo maior do que células que não expressam a proteína. Uma "proteína de resistência a glifosato" inclui uma proteína que confere em uma célula a habilidade de tolerar uma concentração de glifosato mais alta do que células que não expressam a proteína, ou a tolerar uma certa concentração de glifosato por um período de tempo maior do que células que não expressam a proteína. Por "tolerar" ou "tolerância" entende-se tanto sobreviver, ou conduzir funções celulares essenciais, tais como síntese de proteínas e respiração de uma maneira que não seja prontamente discernível de células não tratadas.
Moléculas de ácidos nucléicos isoladas, e variantes e fragmentos dessas
Um aspecto da invenção pertence a moléculas de ácidos nucléicos isoladas ou recombinantes compreendendo seqüências de nucleotídeos codificando proteínas e polipeptídeos de resistência a herbicidas ou porções biologicamente ativas dessas, assim como moléculas de ácidos nucléicos suficientes para uso como sondas de hibridização para identificar ácido nucléicos codificando resistência a herbicidas. Como aqui usado, o termo "molécula de ácido nucléico" deve incluir moléculas de DNA (e.g., DNAc, DNA recombinante, ou DNA genômico) e moléculas de RNA (e.g., RNAm) e análogos do DNA ou RNA geradas usando análogos de nucleotídeos. As moléculas de ácidos nucléicos podem ser de fita simples ou de dupla-fita, mas preferivelmente são DNA de dupla-fita.
Seqüências de nucleotídeos codificando as proteínas da presente invenção incluem as seqüências apresentadas em SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, as seqüências de nucleotídeos de resistência a herbicidas depositadas em um hospedeiro bacteriano como Nos. de Acesso NRRL B-30932, B-30933, B-30934, B-30945, B- 30946, B-30947, ou B-30948, e variantes, fragmentos, e complementos dessas. Por "complemento" entende-se uma seqüência de nucleotideos que é suficientemente complementar a uma dada seqüência de nucleotideos de forma que esta hibridize à dada seqüência de nucleotideos para, dessa forma, formar um duplex estável. Em algumas concretizações, o complemento hibridiza pelo comprimento total da seqüência da invenção. Em outra concretização, o complemento hibridiza através de pelo menos cerca de 50% da seqüência da invenção, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 91%, pelo menos cerca de 92%, pelo menos cerca de 93%, pelo menos cerca de 94%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% de uma seqüência da invenção. As seqüências de aminoácidos correspondentes para as proteínas de resistência a herbicidas codificadas por essas seqüências de nucleotideos são apresentadas em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22. A invenção também engloba moléculas de ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotideos codificando proteínas de resistência a herbicidas de comprimento parcial, e complementos dessa. Em algumas concretizações, os polinucleotídeos da presente invenção codificam polipeptídeos que são enzimas EPSP sintase de Classe III. Para os propósitos da presente invenção, uma "enzima EPSP sintase de Classe III" é um polipeptídeo tolerante a herbicida ou resistente a herbicida contendo uma ou mais dos domínios de seqüência de aminoácidos descritos no Pedido de Patente Norte-Americano No. 11/400.598, que é aqui incorporado por referência em sua íntegra.
Uma molécula de ácido nucléico "isolada" ou "purificada" ou proteína, ou porção biologicamente ativa dessa, é substancialmente livre de outro material celular, ou meio de cultura quando produzida por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos ou outros químicos quando quimicamente sintetizadas. Preferencialmente, um ácido nucléico "isolado" é sem seqüências (preferencialmente seqüências codificando proteínas) que naturalmente flanqueiam o ácido nucléico (i.e., seqüências localizadas nas extremidades 5' e 3' do ácido nucléico) no DNA genômico do organismo do qual o ácido nucléico é derivado. Para propósitos da invenção, "isolado" quando usado para referir-se a moléculas de ácidos nucléicos exclui cromossomos isolados. Por exemplo, em várias concretizações, a molécula de ácido nucléico isolada codificando resistência a glifosato pode conter menos do que cerca de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüência de nucleotídeos que naturalmente flanqueia a molécula de ácido nucléico no DNA genômico da célula do qual o ácido nucléico é derivado. Uma proteína de resistência a herbicidas que é substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteínas tendo menos do que cerca de 30%, 20%, 10%, ou 5% (por peso seco) de proteínas que não as de resistência a herbicidas (também referidas aqui como "proteína contaminante").
Moléculas de ácidos nucléicos que são fragmentos dessas seqüências de nucleotídeos codificando resistência a herbicidas são também englobadas pela presente invenção. Por "fragmento" entende-se uma porção de uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína de resistência a herbicidas. Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos pode codificar uma porção biologicamente ativa de uma proteína de resistência a herbicidas, ou pode ser um fragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridização ou primer de PCR usando métodos descritos abaixo. Moléculas de ácidos nucléicos que são fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas compreendem pelo menos cerca de 15, 20, 50, 75, 100, 200, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450 nucleotídeos contíguos, ou até o número de nucleotídeos presentes em uma seqüência de nucleotídeos de comprimento total codificando resistência a herbicidas aqui descrita (por exemplo, 1329 nucleotídeos para SEQ ID NO: 1; 1353 nucleotídeos para SEQ ID NO: 4; 1344 nucleotídeos para SEQ ID NO: 7, etc.) dependendo do uso pretendido. Por nucleotídeos "contíguos" entende-se resíduos de núcleotídeos que são imediatamente adjacentes um ao outro.
Fragmentos das seqüências de nucleotídeos da presente invenção geralmente codificarão fragmentos de proteínas que retêm a atividade biológica da proteína de resistência a glifosato de comprimento total; i.e., atividade de resistência a herbicidas. Por "retém a atividade de resistência a herbicidas" entende-se que o fragmento tenha pelo menos cerca de 3 0%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 7 0%, ou pelo menos cerca de 80% da atividade de resistência a herbicidas da proteína de resistência a glifosato de comprimento total aqui descrita como SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicidas são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos. 4.535.060, e 5.188.642, cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra.
Um fragmento de uma seqüência de nucleotídeos codificando resistência a herbicidas que codifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína da invenção irá codificar pelo menos cerca de 15, 25, 30, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos contíguos, ou até o número total de aminoácidos presente em uma proteína de resistência a herbicidas da invenção de comprimento total (por exemplo, 442 aminoácidos para SEQ ID NO: 2; 450 para SEQ ID NO: 5; 447 aminoácidos para SEQ ID NO: 8, etc.). Proteínas de resistência a herbicidas preferidas da presente invenção são codificadas por uma seqüência de nucleotídeos suficientemente idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23. O termo "suficientemente idêntico" deve significar um aminoácido ou seqüência de nucleotídeos que possui pelo menos cerca de 60% ou 65% identidade de seqüência, cerca de 7 0% ou 75% de identidade de seqüência, cerca de 80% ou 85% de identidade de seqüência, ou cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência comparada a uma seqüência referência usando um dos programas de alinhamento aqui descritos usando parâmetros padrão. Um especialista na arte reconhecerá que esses valores podem ser apropriadamente ajustados para determinar a identidade correspondente de proteínas codificada por duas seqüências de nucleotídeos levando-se em consideração a degeneração de códons, similaridade de aminoácidos, posicionamento do quadro de leitura, e similares.
Para determinar a identidade percentual de duas seqüências de aminoácidos ou de dois ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadas para propósitos de comparação ótima. A identidade percentual entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (i.e., identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (e.g., posições se sobrepondo) χ 100). Em uma concretização, as duas seqüências são do mesmo comprimento. A identidade percentual entre duas seqüências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas abaixo, permitindo ou não espaços vazios. Quando calculando a identidade percentual, são contadas tipicamente as correspondências exatas.
A determinação da identidade percentual entre duas seqüências pode ser conseguida usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitante de iam algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin and Altschul (1990) Prod. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como em Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas BLASTN e BLASTX de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403. Buscas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa BLASTN, pontuação = 100, tamanho de palavra = 12, para se obter seqüências de nucleotídeos homólogas a moléculas de ácidos nucléicos resistentes a glifosato da invenção. Buscas BLAST de proteínas podem ser efetuadas com o programa BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3, para se obter seqüências de aminoácidos homólogas a moléculas proteína de resistência a herbicidas da invenção. Para se obter alinhamentos com espaços para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al. (1997) Nucleie Aeids Res. 25:3389. Alternativamente, PSI-Blast pode ser usado para efetuar uma busca iterada que detecte relações distantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quando utilizando os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (e.g., BLASTX e BLASTN) podem ser usados. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de ClustalW (Higgins et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). ClustalW compara seqüências e alinha a totalidade da seqüência de aminoácidos ou de DNA e, assim, pode prover dados acerca da conservação de seqüência de toda a seqüência de aminoácidos. 0 algoritmo de ClustalW é usado em diversos pacotes de software de análise de DNA/aminoácido comercialmente disponíveis, tais como o módulo ALIGNX de Vector NTI Program Suite (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Após o alinhamento de seqüências de aminoácidos com ClustalW, a identidade percentual de aminoácidos pode ser avaliada. Um exemplo não limitante de um software útil para análise em alinhamentos de ClustalW é GENEDOC™. GENEDOC™ (Karl Nicholas) permite a obtenção da similaridade e identidade de aminoácidos (ou DNA) entre múltiplas proteínas. Outro exemplo não limitante de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), que é parte do pacote de software de alinhamento de seqüências GCG (disponibilizado pela Accelrys, Inc., 9865 Scranton Rd., San Diego, Califórnia, USA). Quando utilizando o programa ALIGN para comparar seqüências de aminoácidos, uma tabela de peso de resíduos PAM 120, uma penalidade por comprimento de espaço (gap length penal ty) de 12, e uma penalidade por espaço (gap penal ty) de 4 podem ser usadas.
A menos que declarado ao contrário, GAP Versão 10, que usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) supra, será usado para determinar a identidade ou similaridade de seqüências usando os seguintes parâmetros: % identidade e % similaridade para uma seqüência de nucleotídeos usando peso GAP (GAP Weight) de 50 e peso de comprimento (Length Weight) de 3, e a matriz de pontuação de nwsgapdna. cmp; % identidade ou % similaridade para uma seqüência de aminoácidos usando peso GAP de 8 e peso de comprimento de 2, e o programa de pontuação BLOSUM62. Programas equivalentes também podem ser usados. Por "programa equivalente" entende-se qualquer programa de comparação de seqüências que, para quaisquer duas seqüências em questão, gere um alinhamento tendo correspondências de resíduos de nucleotídeos idênticas e identidade de seqüência percentual idêntica quando comparado ao alinhamento correspondente gerado pelo programa GAP Versão 10.
A invenção também engloba moléculas de ácidos nucléicos variantes. "Variantes" das seqüências de nucleotídeos codificando resistência a herbicidas incluem aquelas seqüências que codificam uma proteína de resistência a herbicidas aqui descrita, mas que diferem conservativamente por causa da degeneração do código genético, assim como aquelas que são suficientemente idênticas, como discutido acima. Variantes alélicos naturalmente ocorrentes podem ser identificados com o uso de técnicas de biologia molecular bem conhecidas, tal como reação de cadeia de polimerase (PCR) e técnicas de hibridização, como destacado abaixo. Seqüências de nucleotídeos variantes também incluem seqüências de nucleotídeos derivadas sinteticamente que foram gerados, por exemplo, usando-se mutagênese sítio-direcionada, mas que ainda codificam as proteínas de resistência a herbicidas descrita na presente invenção, como discutido abaixo. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas retém a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, atividade de resistência a herbicidas. Por "retém a atividade de resistência a herbicidas" entende-se que o variante tenha pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80% da atividade de resistência a herbicidas da proteína nativa. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicidas são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos. 4.535.060, e 5.188.642, cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra.
0 especialista na arte irá ainda ponderar que mudanças podem ser introduzidas por mutação nas seqüências de nucleotídeos da invenção levando, dessa forma, a mudanças na seqüência de aminoácidos da proteína de resistência a herbicidas codificada, sem alterar a atividade biológica da proteína. Assim, moléculas de ácidos nucléicos variantes isoladas podem ser criadas introduzindo-se um ou mais substituições, adições ou deleções de nucleotídeos na seqüência de nucleotídeos correspondente aqui descrita, de forma que um ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácidos sejam introduzidas na proteína codificada.
Mutações podem ser introduzidas por técnicas padrão, tal como mutagênese sítio-direcionada e mutagênese mediada por PCR, ou técnicas de embaralhamento de genes. Tais seqüências de nucleotídeos variantes são também englobadas pela presente invenção.
Por exemplo, substituições de aminoácidos conservativas podem ser feitas em um ou mais resíduos previstos, preferencialmente resíduos de aminoácido não essenciais. Um resíduo de aminoácido "não essencial" é um resíduo que pode ser alterado a partir da seqüência de tipo selvagem de uma proteína de resistência a herbicidas sem alterar a atividade biológica, enquanto que um resíduo de aminoácido "essencial" é necessário para a atividade biológica. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma na qual o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares foram definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais apolares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais beta-ramifiçadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Substituições de aminoácidos podem ser feitas em regiões não conservadas que retenham a função. Em geral, tais substituições não seriam feitas para resíduos de aminoácidos conservados, ou para resíduos de aminoácidos residindo em iam motivo conservado, onde tais resíduos são essenciais para a atividade da proteína. Entretanto, um especialista na arte entenderia que variantes funcionais podem ter pequenas alterações conservativas ou não conservativas ou modificações nos resíduos conservados. Exemplos de resíduos que são conservados e que podem ser essenciais para a atividade de proteína incluem, por exemplo, resíduos que são idênticos entre todas as proteínas contidas no alinhamento de Figuras 1, 2, ou 3. Exemplos de resíduos que são conservados, mas que podem permitir substituições de aminoácidos conservativas e ainda reter a atividade incluem, por exemplo, resíduos que possuem apenas substituições conservativas entre todas as proteínas contidas no alinhamento das Figuras 1, 2, ou 3.
Lis-22, Arg-124, Asp-313, Arg-344, Arg-386, e Lis-411, são resíduos conservados da EPSP sintase de E. coli (Schõnbrunn et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 137 6-13 80). Resíduos conservados importantes para a atividade de EPSP sintase também incluem Arg-100, Asp-242, e Asp-384 (Selvapandiyan et al. (1995) FEBS Letters 374: 253-256). Arg-27 se liga a S3P (Shuttleworth et al. (1999) Biochemistry 38:296-302).
Alternativamente, seqüências de nucleotídeos variantes podem ser feitas introduzindo-se mutações randomicamente ao longo de toda ou parte da seqüência codificadora, tal como por mutagênese de saturação, e os mutantes resultantes podem ser rastreados para a habilidade de conferir atividade de resistência a herbicidas para identificar mutantes que retêm atividade. Após a mutagênese, a proteína codificada pode ser expressa de forma recombinante, e a atividade da proteína pode ser determinada usando técnicas de teste padrão.
Usando métodos, tais como PCR, hibridização, e similares, seqüências de resistência a herbicidas correspondentes podem ser identificadas, tais seqüências possuem identidade substancial em relação às seqüências da invenção. Ver, por exemplo, Sambrook J., and Russell, D.W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) e Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NY).
Em um método de hibridização, toda ou parte da seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas pode ser usada para rastrear bibliotecas de DNAc ou genômico. Métodos para a construção de tais bibliotecas de DNAc ou genômico são geralmente conhecidos na arte e são descritos em Sambrook and Russell, 2001, supra. As chamadas sondas de hibridização podem ser fragmentos de DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA, ou outros oligonucleotídeos, e podem ser rotuladas com um grupamento detectável, tal como 32P, ou qualquer outro marcador detectável, tal como outros radioisótopos, um composto fluorescente, uma enzima, ou um co-fator enzimático. Sondas para hibridização podem ser feitas rotulando-se oligonucleotídeos sintéticos baseado na seqüência de nucleotídeos codificando resistência a herbicidas conhecida aqui descrita. Primers degenerados projetados com base nos nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos conservados nas seqüências de nucleotídeos ou seqüências de aminoácidos codificadas podem ser adicionalmente usados. A sonda compreende tipicamente uma região de seqüência de nucleotídeos que hibridiza sob condições estringentes a pelo menos cerca de 12, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1300 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de nucleotídeos da invenção codificando resistência a herbicidas ou um fragmento ou variante dessa. Métodos para a preparação de sondas para hibridização são geralmente conhecidos na arte e são descritos em Sambrook and Russell (2001) supra, e Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), ambas são aqui incorporadas por referência. Por exemplo, uma seqüência inteira de resistência a herbicidas aqui descrita, ou uma ou mais porções dessa, pode ser usada como uma sonda capaz de hibridizar especificamente a seqüências resistência a herbicidas correspondentes e RNAs mensageiros. Para alcançar hibridização específica sob uma variedade de condições, tais sondas incluem seqüências que são únicas e são de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos em comprimento, ou de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos em comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar seqüências de resistência a herbicidas correspondentes por PCR de um organismo escolhido. Esta técnica pode ser usada para isolar seqüências codificadoras adicionais de um organismo desejado ou como um teste diagnóstico para determinar a presença de seqüências codificadoras em um organismo. Técnicas de hibridização incluem rastreamento de hibridização de bibliotecas de DNA plaqueado (tando placas como colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
A hibridização de tais seqüências pode ser conduzida sob condições estringentes. Por "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" entende-se condições sob as quais uma sonda hibridizará a sua seqüência alvo em um grau detectavelmente maior do que a outras seqüências (e.g., pelo menos 2 vezes sobre a base). Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em circunstâncias diferentes. Controlando a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falta de correspondência em seqüências, de forma que níveis menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Geralmente, uma sonda é de menos do que cerca de 1000 nucleotídeos em comprimento, ou menos do que cerca de 500 nucleotídeos em comprimento.
Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sais é de menos do que cerca de 1,5 M de íon Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de íons de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., maiores do que 50 nucleotídeos). Condições estringentes podem ser também alcançadas com a adição de agentes desestabilizantes, tais como formamida. Condições exemplares de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, 1% SDS (sódio dodecil sulfato) a 37°C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3,0 M / trissódio citrato 0,3 M) a 50 a 55°C. Condições exemplares de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% formamida, NaCl 1,0 M, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 55 a 60°C. Condições exemplares de estringência elevada incluem hibridização em 50% formamida, NaCl 1 Μ, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0, IX SSC a 60 a 65 0C por pelo menos 30 minutos. Opcionalmente, tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cerca de 1% SDS. A duração de hibridização é de geralmente menos do que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas. A menos que especificado ao ao contrário, as condições de hibridização estão sob alta estringência.
A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós hibridização, com os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267- 1284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500 / L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do hibrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob definidas força iônica e pH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de falta de correspondência; assim, Tm e condições de hibridização, e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar a seqüências da identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C menores do que o ponto térmico de derretimento (Tm) para a seqüência especifica e seu complemento em uma definida força iônica e pH. Contudo, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4 0C a menos do que o ponto térmico de derretimento (Tm) ; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C a menos do que o ponto térmico de derretimento (Tm) ; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C a menos do que o ponto térmico de derretimento (Tm). Usando a equação, condições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aqueles de habilidade ordinária entenderão que variações na estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de falta de correspondência resulta em uma Tm de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de forma que uma maior temperatura possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel, et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York). Ver, Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
Proteínas Isoladas e Variantes e Fragmentos destas
Proteínas de resistência a herbicidas são também englobadas na presente invenção. Por "proteína de resistência a herbicidas" entende-se uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22. Fragmentos, porções biologicamente ativas, e variantes desssa são também providas, e podem ser usadas para praticar os métodos da presente invenção.
"Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeos compreendendo uma porção de uma seqüência de aminoácidos codificando uma proteína de resistência a herbicidas descrita em SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22, e que retenha atividade de resistência a herbicidas. Uma porção biologicamente de uma proteína de resistência a herbicidas pode ser um polipeptídeo que é, por exemplo, de 10, 25, 50, 100 ou mais aminoácidos em comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser preparadas por técnicas de recombinação e avaliadas para atividade de resistência a herbicida. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicidas são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos. 4.535.060, e 5.188.642, cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra. Como usado aqui, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22. A invenção engloba outros fragmentos, contudo, tal como qualquer fragmento na proteína maior do que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, ou 400 aminoácidos.
Por "variantes" entende-se proteínas ou polipeptídeos tendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos de cerca de 60%, 65%, cerca de 70%, 75%, cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, 5, 8, 11, 14, 16, 19, ou 22. Variantes também incluem polipeptídeos codificados por uma molécula de ácido nucléico que hibridiza à molécula de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas, sob condições estringentes. Variantes incluem polipeptídeos que diferem em seqüência de aminoácidos devido a mutagênese. Proteínas variantes englobadas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, retém a atividade de resistência a herbicidas. Métodos para medir a atividade de resistência a herbicidas são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Patentes Norte-Americanas Nos. 4.535.060, e 5.188.642, cada qual é aqui incorporada por referência em sua íntegra.
Genes bacterianos, tais como os genes grg e syngrg desta invenção, muito freqüentemente possuem múltiplos códons de iniciação de metionina em proximidade ao inicio do quadro de iniciação de leitura. Freqüentemente, a iniciação de tradução em um ou mais desses códons de iniciação levarão à geração de uma proteína funcional.
Esses códons de iniciação podem incluir códons ATG. Contudo, bactérias tais como Bacillus sp. também reconhecem o códon GTG como códon de iniciação, e proteínas que iniciam a tradução em códons GTG contêm uma metionina no primeiro aminoácido. Adicionalmente, não é freqüentemente determinado a priori quais desses códons são usados naturalmente na bactéria. Assim, é entendido que usar um dos códons de metionina alternativos podem levar à geração de variantes de grg e syngrg que conferem resistência a herbicidas. Essas proteínas de resistência a herbicidas são englobadas na presente invenção e podem ser usadas nos métodos da presente invenção.
Anticorpos para os polipeptídeos da presente invenção, ou para variantes ou fragmentos desses, são também englobados. Métodos para produzir anticorpos são bem conhecidos na arte (ver, por exemplo, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Patente Norte- Americana No. 4.196.265).
Variantes Alterados ou Melhorados
É reconhecido que a seqüência de DNAs dos genes grg ou syngrg da invenção pode ser alterada por vários métodos, e que essas alterações podem resultar em seqüências de DNA codificando proteínas com seqüências de aminoácidos diferentes daquelas codificadas pelas seqüências grg ou syngrg aqui descritas. Essa proteína pode ser alterada de vários jeitos, incluindo substituições, deleções, truncações, e inserções de aminoácidos de um ou mais aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, incluindo até cerca de 2, cerca de 3, cerca de 4, cerca de 5, cerca de 6, cerca de 7, cerca de 8, cerca de 9, cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20, cerca de 25, cerca de 30, cerca de 35, cerca de 40, cerca de 45, cerca de 50, cerca de 55, cerca de 60, cerca de 65, cerca de 70, cerca de 75, cerca de 80, cerca de 85, cerca de 90, cerca de 100 ou mais substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
Métodos para tais manipulações são geralmente conhecidos na arte. Por exemplo, variantes de seqüências de aminoácidos das proteínas GRG aqui descritas podem ser preparados por mutações no DNA. Isso pode ser também conseguido por uma de diversas formas de mutagênese e/ou em evolução direcionada. Em alguns aspectos, as mudanças codificadas na seqüência de aminoácidos não afetarão substancialmente a função da proteína. Tais variantes possuirão a atividade de resistência a herbicidas desejada. Contudo, é entendido que a habilidade das proteínas GRG aqui descritas de conferir resistência a herbicidas pode ser melhorada por uso de tais técnicas nas composições desta invenção. Por exemplo, pode-se expressar as seqüências de grg ou syngrg aqui descritas em células hospedeiras que exibem altas taxas de falta de incorporação de bases durante a replicação de DNA, tais como XL-I Red (Stratagene, La Jolla, CA). Após a propagação em tais linhagens, pode-se isolar o DNA da invenção (por exemplo preparando-se DNA de plasmídeo, ou amplificando-se por PCR e clonando o fragmento de PCR resultante em um vetor), cultivar as mutações grg em uma linhagem não mutagênica, e identificar genes mutados com resistência melhorada a um herbicida, tal como glifosato, por exemplo cultivando-se células em concentrações crescentes de glifosato e testando clones que conferem habilidade de tolerar concentrações crescentes de glifosato.
Alternativamente, alterações podem ser feitas na seqüência da proteína de várias proteínas nos terminais amino ou carboxi sem afetar substancialmente a atividade. Isso pode incluir inserções, deleções, ou alterações introduzidas por métodos moleculares modernos, tais como PCR, incluindo amplificações de PCR que alterar ou estendem a seqüência codificadora de proteína em virtude da inclusão de seqüências codificando aminoácidos nos oligonucleotídeos utilizados na amplificação por PCR. Alternativamente, as seqüências de proteínas adicionadas podem incluir as seqüências codificadoras de proteínas inteiras, tais como aquelas usadas comumente na arte para gerar fusões de proteínas. Tais proteínas de fusão são freqüentemente usadas para (1) aumentar a expressão de uma proteína de interesse, (2) introduzir um domínio de ligação, atividade enzimática, ou epitopo para facilitar tanto a purificação de proteína, detecção de proteína, ou outros usos experimentais conhecidos na arte, ou, (3) direcionar a secreção ou tradução de uma proteína para uma organela subcelular, tal como o espaço periplasmático de bactérias gram-negativas, ou o retículo endoplasmático de células eucariontes, este último freqüentemente resulta em glicosilação da proteína.
Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos variantes da presente invenção também englobam seqüências derivadas de procedimentos mutagênicos e recombinogênicos, tais como embaralhamento de DNA. Com tal procedimento, um ou mais regiões codificadoras de proteína de resistência a herbicidas diferentes podem ser usadas para criar uma nova proteína de resistência a herbicidas possuindo as propriedades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de seqüência relacionados compreendendo regiões de seqüência que possuem identidade de seqüência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. Por exemplo, usando esta abordagem, motivos de seqüência codificando um domínio de interesse podem ser embaralhadas entre o gene de resistência a herbicidas da invenção e outros genes de resistência a herbicidas conhecidos para obter um novo gene codificando uma proteína com uma propriedade de interesse melhorada, tal como atividade de resistência a glifosato melhorada. Estratégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504- 4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291; e Patentes Norte-Americanas Nos. 5.605.793 e 5.837.458.
Transformação de Células Bacterianas ou Vegetais
Aqui providos estão novos genes isolados que conferem resistência a um herbicida. Também providas são seqüências de aminoácidos das proteínas GRG da invenção. A proteína resultante de tradução deste gene permite que células funcionem na presença de concentrações de um herbicida que são, de outra forma, tóxicas a células incluindo células vegetais e células bacterianas. Em um aspecto da invenção, os genes grg ou syngrg são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais.
Métodos para detectar a presença de um transgene em uma planta, órgão vegetal (e.g., folhas, caules, raízes, etc.), sementes, célula vegetal, propágulo, embrião ou progênie da mesma são bem conhecidos na arte.
Manipulando-se os genes da invenção a serem expressos a partir de um promotor conhecido por estimular a transcrição no organismo a ser testado e corretamente traduzido para gerar um peptídeo GRG intacto, e posicionar as células em uma concentração de herbicida de outra forma tóxica, pode-se identificar células que foram transformadas com o DNA em virtude de sua resistência a herbicidas. Por "promotor" entende-se uma seqüência de ácidos nucléicos que funcione para direcionar a transcrição de uma seqüência codificador abaixo. 0 promotor, junto com outras seqüências de ácidos nucléicos reguladoras de transcrição e tradução, (também denominadas "seqüências controle") é necessário para a expressão de uma seqüência de DNA de interesse.
A transformação de células bacterianas é conseguida por uma de diversas técnicas conhecidas na arte, incluindo mas não se limitando a, eletroporação ou transformação química (ver, por exemplo, Ausubel, ed. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., Indianapolis, IN). Marcadores conferindo resistência a substâncias tóxicas são úteis para identificar células transformadas (tendo absorvido e expresso o DNA de teste) de células não transformadas (aquelas não contendo ou não expressando o DNA de teste). Em um aspecto da invenção, os genes grg ou syngrg aqui descritos são úteis como marcadores para avaliar a transformação de células bacterianas ou vegetais.
A transformação de células vegetais pode ser conseguida de modo similar. Por "planta" entende-se plantas inteiras, órgãos vegetais (por exemplo, folhas, caules, raízes, etc.), sementes, células vegetais, propágulos, embriões e descendentes das mesmas. Células vegetais podem ser diferenciadas ou indiferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em suspensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floema, pólen). "Plantas transgênicas" ou "plantas transformadas" ou planta "estavelmente transformadas" ou células ou tecidos, referem-se a plantas que têm incorporado ou integrado seqüências de ácidos nucléicos exógenas ou fragmentos de DNA na célula vegetal. Por "transformação estável" entende- se que a construção de nucleotídeo introduzida em uma planta se integre no genoma da planta e seja capaz de ser herdado pela progênie desta.
Os genes grg da invenção podem ser modificados para se obter ou intensificar a expressão em células vegetais. As seqüências de resistência a herbicidas da invenção podem ser providas em cassetes de expressão para expressão na planta de interesse. "Cassete de expressão vegetal" inclui construções de DNA, incluindo construções de DNA recombinantes, que são capazes de resultar na expressão de uma proteína a partir de um quadro de iniciação de leitura em uma célula vegetal. 0 cassete incluirá na direção de transcrição 5' -3', uma região de iniciação transcricional (i.e., promotor, particularmente um promotor heterólogo) operacionalmente ligado a uma seqüência de DNA da invenção, e/ou uma região de terminação transcricional e de tradução (i.e., região de terminação) funcional em plantas. 0 cassete pode conter adicionalmente pelo menos um gene adicional a ser co-transformado no organismo, tal como um gene marcador de seleção. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode ser provido em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete de expressão é provido com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção da seqüência de resistência a herbicidas a estar sob a regulação transcricional das regiões reguladoras.
0 promotor pode ser nativo ou análogo, ou estrangeiro ou heterólogo, em relação ao hospedeiro vegetal e/ou em relação à seqüência de DNA da invenção. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Onde o promotor é "nativo" ou "homólogo" em relação ao hospedeiro vegetal, entende-se que o promotor seja encontrado na planta nativa na qual o promotor é introduzido. Onde o promotor é "estrangeiro" ou "heterólogo" em relação à seqüência de DNA da invenção, entende-se que o promotor não seja o promotor nativo ou naturalmente ocorrente em relação à seqüência de DNA da invenção operacionalmente ligada. "Heterólogo" geralmente refere-se às seqüências de ácidos nucléicos que não são endógenas à célula ou parte do genoma nativo no qual estão presentes, e foram adicionadas à célula por infecção transfecção, microinjeção, eletroporação, microprojeção, ou similares. Por "operacionalmente ligado" entende-se uma ligação funcional entre um promotor e uma segunda seqüência, caracterizado pelo fato de que a seqüência promotora inicia e media a transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as seqüências de ácidos nucléicos sendo ligadas são contíguas e, onde necessário para juntar duas regiões codificadoras de proteínas, contíguas e no mesmo quadro de leitura.
Freqüentemente, tais construções também conterão regiões 5' e 3' não traduzidas. Tais construções podem conter uma "seqüência sinal" ou "seqüência líder" para facilitar o transporte co-tradução ou pós-tradução do peptídeo de interesse para certas estruturas intracelulares, tais como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático, ou aparelho de Golgi, o para ser secretado. Por exemplo, o gene pode ser manipulado para conter um peptídeo sinal para facilitar a transferência do peptídeo para o retículo endoplasmático. Por "seqüência sinal" entende-se uma seqüência que é conhecida ou suspeita de resultar em transporte co-tradução ou pós-tradução de peptídeo através da membrana celular. Em eucariontes, isso tipicamente envolve a secreção no aparelho e Golgil com alguma glicosilação resultante. Por "seqüência líder" entende-se qualquer seqüência que, quando traduzida, resulte em uma seqüência de aminoácidos suficiente para iniciar o transporte co-tradução da cadeia peptídica para uma organela sub-celular. Assim, isso inclui seqüências líder direcionando o transporte e/ou glicosilação por passagem no retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeo incluindo cloroplastos, mitocôndria, e similares. Pode ser também preferível construir o cassete de expressão de vegetal para conter um íntron, tal como o processamento de RNAm do íntron é necessário para a expressão. Por "região 3' não traduzida" entende-se uma seqüência de nucleotideos localizada abaixo de uma seqüência codificador. Seqüências de sinal de poliadenilação e outras seqüências codificando sinais regulatórios capazes de afetar a adição de traços de ácido poliadenilico à extremidade 3' do precursor de RNAm são regiões 3' não traduzidas. Por "região 5' não traduzida" entende-se uma seqüência de nucleotideos localizada acima de uma seqüência codificadora.
Outros elementos não traduzidos acima ou abaixo incluem intensificadores. Intensificadores são seqüências de nucleotideos que atuam para aumentar a expressão de uma região promotora. Intensificadores são bem conhecidos na arte e incluem, mas não estão limitados a, a região intensificadora SV40 e o elemento intensificador 35S.
A região de terminação pode ser nativa em relação à região de iniciação transcricional, pode ser nativa em relação à seqüência de resistência a herbicidas da presente invenção, ou pode ser derivada de outra fonte. Regiões de terminação convenientes são disponíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141-144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671-674; Sanfecon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151-158; Bailas t al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627-9639.
Em um aspecto da invenção, seqüências de DNA sintéticas são projetadas para um dado polipeptídeo, tais como os polipeptídeos da invenção. A expressão do quadro de iniciação de leitura da seqüência de DNA sintética em uma célula resulta na produção do polipeptídeo da invenção. Seqüências de DNA sintéticas podem ser úteis para simplesmente remover sítios de restrição de endonuclease indesejados, para facilitar estratégias de clonagem de DNA, para alterar ou remover qualquer tendência de códon em potencial, para alterar ou melhorar o conteúdo de GC, para remover ou alterar quadros de leitura alternados, e/ou para alterar ou remover sítios de reconhecimento de spliee íntron/éxon, sítios de poliadenilação, seqüências Shine- Delgarno, elementos promotores indesejados e similares que possam estar presentes na seqüência de DNA nativa. É também possível que seqüências de DNA sintéticas possam ser utilizadas para introduzir outras melhorias a uma seqüência de DNA, tal como introdução de uma seqüência íntron, criação de uma seqüência de DNA que é expressa como uma proteína de fusão para seqüências direcionando organelas, tais como peptídeos de trânsito de cloroplastos, peptídeos direcionando apoplasto/vacúolo, ou seqüências peptídicas que resultam em retenção do peptídeo resultante no retículo endoplasmático. Genes sintéticos podem ser também sintetizados usando códons preferidos de célula hospedeira para expressão melhorada, ou podem ser sintetizados usando códons em uma freqüência de uso de códons preferida de hospedeiro. Ver, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1-11; Patentes Norte-Americanas Nos. 6.320.100; 6.075.185; 5.380.831; e 5.436.391, U.S. Published Application Nos. 20040005600 e 20010003849, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477-498, aqui incorporadas por referência.
Em uma concretização, os ácidos nucléicos de interesse são direcionados para o cloroplasto para expressão. Dessa maneira, onde o ácido nucléico de interesse não é diretamente inserido no cloroplasto, o cassete de expressão conterá adicionalmente um ácido nucléico codificando um peptideo de trânsito para direcionar o produto gênico de interesse para os cloroplastos. Tais peptídeos de trânsito são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414-1421; e Shah et al. (1986) Science 233: 478-481.
Os ácidos nucléicos de interesse a serem direcionados para o cloroplasto podem ser otimizados para expressão no cloroplasto para contabilizar diferenças no uso de códons entre o núcleo vegetal e esta organela. Dessa maneira, os ácidos nucléicos de interesse podem ser sintetizados usando códons preferidos de cloroplastos. Ver, por exemplo, Patente Norte-Americana No. 5.380.831, aqui incorporada por referência.
Tipicamente este "cassete de expressão vegetal" será inserido em um "vetor de transformação vegetal". Por "vetor de transformação" entende-se uma molécula de DNA que é necessária para a transformação eficiente de uma célula. Tal molécula pode consistir de um ou mais cassetes de expressão, e pode estar organizada em mais de uma molécula de DNA "vetor". Por exemplo, vetores binários são vetores de transformação vegetais que utilizam dois vetores de DNA não contíguos para codificar todas as funções requisito cis- e trans- atuantes para a transformação de células vegetais (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science 5: 446-451). "Vetor" refere-se a uma construção de ácidos nucléicos projetado para transferência entre células hospedeiras diferentes. "Vetor de expressão" refere-se a um vetor que possui a habilidade de incorporar, integrar e expressar seqüências de DNA heterólogas ou fragmentos em uma célula estrangeira.
Este vetor de transformação vegetal pode ser compreendido de um ou mais vetores de DNA necessários para conseguir a transformação vegetal. Por exemplo, é uma prática comum na arte utilizar vetores de transformação vegetais que são compreendidos de mais de um segmento de DNA contíguo. Esses vetores são freqüentemente na arte referidos com "vetores binários". Vetores binários, assim como vetores com plasmídeos ajudantes são mais freqüentemente usados para transformação mediada por Agrobacterium, onde o tamanho e a complexidade de segmentos de DNA necessários para se conseguir transformação eficiente é bem grande, e é mais vantajoso separar funções em moléculas de DNA separadas. Vetores binários tipicamente contêm um vetor de plasmídeo que contém as seqüências cis- atuantes necessárias para a transferência de T-DNA (tal como limite esquerdo e limite direito), um marcador de seleção que é manipulado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal, e um "gene de interesse" (um gene manipulado para ser capaz de expressão em uma célula vegetal para a qual a geração de plantas transgênicas é desejada). Também presentes no vetor de plasmídeo estão seqüências requeridas par a replicação bacteriana. As seqüências cis-atuantes são arranjadas do modo a permitir a transferência eficiente em células vegetais e expressão nas mesmas. Por exemplo, o gene marcador de seleção e o gene de interesse estão localizados entre os limites esquerdo e direito. Freqüentemente um segundo vetor de plasmídeo contém os fatores trans-atuantes que mediam a transferência de T-DNA de Agrobacterium para células vegetais. Este plasmídeo freqüentemente contém funções de virulência (genes Vir) que permitem a infecção de células vegetais por Agrobacterium, e transferência de DNA por clivagem nas seqüências dos limites e transferência de mediada por vir, como é entendido na arte (Hellens and Mullineaux (2000) Trends in Plant Science, 5: 446-451). Diversos tipos de linhagens de Agrobacterium (e.g. LBA4404, GV3101, EHAlOl, EHA105, etc.) podem ser usados para a transformação vegetal. O segundo vetor de plasmídeo não é necessário para transformar as plantas por outros métodos tais como microprojeção, microinjeção, eletroporação, polietileno glicol, etc.
Transformação Vegetal
Métodos da invenção envolvem introduzir uma construção de nucleotideo em uma planta. Por "introduzir" entende-se apresentar à planta a construção de nucleotídeos de forma que a construção ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não requerem que um método em particular para introdução de uma construção de nucleotídeos em uma planta seja usado, apenas que a construção de nucleotídeos ganhe acesso ao interior de ao menos uma célula da planta. Métodos para introduzir construções de nucleotídeos em plantas são conhecidos na arte incluindo, mas não se limitando a, métodos de transformação estável, métodos de transformação transiente, e métodos mediados por vírus.
Em geral, os métodos de transformação vegetal envolvem transferir DNA heterólogo para células vegetais alvo (e.g., embriões imaturos ou maduros, culturas em suspensão, calo indiferenciado, protoplastos, etc.), seguido da aplicação de um nível limite máximo de seleção apropriado (dependendo do gene marcador selecionável e, neste caso, "glifosato") para se recuperar as células vegetais transformadas a partir de um grupo de massa de células não transformadas. Explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Subseqüentemente, as células transformadas são diferenciadas em brotos após a colocação em meio de regeneração suplementado com um nível limite máximo do agente de seleção (e.g. "glifosato"). Os brotos são então transferidos para um meio de enraizamento seletivo recuperar os brotos com raiz ou plântulas. As plântulas transgênicas então crescem em plantas maduras e produzem sementes férteis (por exemplo, Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282; Ishida et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14: 745- 750). Os explantes são tipicamente transferidos para um suprimento fresco do mesmo meio e cultivados rotineiramente. Uma descrição geral das técnicas e métodos para gerar plantas transgênicas é encontrada em Ayres and Park (1994) Criticai Reviews in Plant Science 13: 219-239 e Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120. Como o material transformado contém muitas células, tanto células transformadas e não transformadas estão presentes em qualquer pedaço do calo ou tecido ou grupo de células submetido a alvo. A habilidade de matar células não transformadas e permitir que as células transformadas se proliferem resulta em culturas vegetais transformadas. Freqüentemente, a habilidade para remover células não transformadas é uma limitação à recuperação rápida de células vegetais transformadas e geração bem-sucedida de plantas transgênicas. Métodos moleculares e bioquímicos podem ser então usados para se confirmar a presença e do polinucleotídeo(s) de interesse integrado no genoma da planta transgênica.
A geração de plantas transgênicas pode ser realizada por um dentre diversos métodos, incluindo, mas não se limitando a, introdução de DNA heterólogo por Agrobacterium em células vegetais (transformação mediada por Agrobacterium), bombardeamento de células vegetais com DNA estrangeiro heterólogo aderido a partículas, e vários outros métodos não mediados diretamente por partículas (por exemplo, Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282; Ishida et al. (199 6) Nat. Biotechnol 14: 745-750; Ayres and Park (1994) CRC Crit. Rev. Plant Sei. 13: 219-239; Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42: 107-120) para transferência de DNA.
Métodos para a transformação de cloroplastos são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Svab et al. (1990) Proe. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proe. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913-917; Svab and Maliga (1993) EMBO J. 12: 601-606. O método confia na entrega de partículas por pistola de DNA contendo um marcador selecionável e o direcionamento do DNA para o genoma do plastídeo através de recombinação homóloga. Adicionalmente, transformação de plastídeo pode ser conseguida por transativação de um transgene silencioso transmitido por plastídeo por expressão preferencial de tecido de uma RNA polimerase codificada nuclearmente e direcionada por plastídeo. Tal sistema foi relatado em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 7301- 7305.
As células que foram transformadas podem ser cultivadas a plantas de acordo com meios convencionais. Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84. Essas plantas podem ser, então, cultivadas e tanto polinizadas com a mesma linhagem transformada quanto com linhagens diferentes, e o híbrido resultante tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para assegurar que a expressão da característica fenotípica desejada foi estavelmente mantida e herdada e, então, as sementes colhidas para asseguras que a expressão da característica fenotípica desejada foi alcançada. Dessa maneira, a presente invenção provê sementes transformadas (também referidas como "sementes transgênicas") tendo uma construção de nucleotídeos da invenção, por exemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmente incorporado em seu genoma.
Plantas
A presente invenção pode ser usada para a transformação de qualquer espécie de planta, incluindo, mas não se limitando a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos de plantas de interesse incluem, mas não são limitados a, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, e colzas, Brassica sp., alfafa, centeio, milheto, cártamo, amendoim, batata doce, mandioca, café, coco, abacaxi, frutas cítricas, cacau, chá, banana, abacate, figo, goiaba, manga, azeitona, mamão-papaia, caju, macadâmia, amêndoa, aveia, verduras, plantas ornamentais, e coníferas.
Verduras incluem, mas não estão limitadas a, tomates, alface, feijão verde, feijões, ervilhas, e membros do gênero Curcumis tais como pepino, cantalupo, e meloeiro. Plantas ornamentais incluem, mas não são limitadas a, azaléia, hortênsia, hibisco, rosas, tulipas, narcisos, petúnias, cravo, bico-de-papagaio, e crisântemo. Preferencialmente, plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, cruciferas, pimentas, batatas, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada, colza, etc).
Esta invenção é particularmente adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas, incluindo, mas não se limitando a, milho, arroz, cevada, aveia, trigo, sorgo, centeio, cana-de-açúcar, abacaxi, inhame, cebola, banana, coco e tâmaras.
Avaliação da Transformação Vegetal
Após a introdução de DNA heterólogo estrangeiro em células vegetais, a transformação ou integração de gene heterólogo no genoma da planta é confirmada por vários métodos, tais como análise de ácidos nucléicos, proteínas e metabólitos associados com o gene integrado.
Análise de PCR é um método rápido para rastrear células, tecidos ou partes aéreas transformados para a presença do gene incorporado no estágio inicial antes do transplante para o solo (Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). PCR é conduzido usando primers de oligonucleotídeos específicos para o gene de interesse ou base de Agrobacterium vetor, etc.
A transformação vegetal pode ser confirmada por análise de Southern blot de DNA genômico (Sambrook and Russell, 2001, supra). Em geral, DNA total é extraído do transformante, digerido com enzimas de restrição apropriadas, fracionada em um gel de agarose e transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou náilon. A membrana ou "blot" é, então, sondada com, por exemplo, fragmentos de DNA alvo radio-rotulados com 32P para confirmar a integração do gene introduzido no genoma vegetal de acordo com técnicas padrão (Sambrook and Russell, 2001, supra).
Na análise Northern, RNA é isolado de tecidos específicos de transformante, fracionado em um gel de agarose de formaldeído, blotted em um filtro de náilon de acordo com procedimentos padrão que são rotineiramente usados na arte (Sambrook and Russell, 2001, supra). A expressão de RNA codificado pelos genes aqui descritos é, então, testada hibridizando o filtro a uma sonda radioativa derivada de um polinucleotídeo da invenção, por métodos conhecidos na arte (Sambrook and Russell, 2001, supra)
Western blot e testes bioquímicos e similares podem ser conduzidos nas plantas transgênicas para se determinar a presença de proteína codificada pelo gene de resistência a herbicidas por procedimentos padrão (Sambrook and Russell, 2001, supra) usando anticorpos que se ligam a um ou mais epitopos presentes na proteína de resistência a herbicidas.
Métodos para aumentar a produção vegetal
Métodos para aumentar a produção vegetal são providos. Os métodos compreendem introduzir em uma planta ou célula vegetal um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de grg aqui descrita. Como aqui definido, a "produção" da planta refere-se à qualidade e/ou quantidade de biomassa produzida pela planta. Por "biomassa" entende-se qualquer produto vegetal mensurável. Um aumento na produção de biomassa é qualquer melhoria na produção do produto vegetal mensurável. Aumentar a produção vegetal possui diversas aplicações comerciais. Por exemplo, aumentar a biomassa foliar pode aumentar a produção de verduras folhosas para consumo humano ou animal. Adicionalmente, aumentar a biomassa foliar pode ser usado para aumentar a produção de produtos farmacêuticos derivados de plantas ou produtos industriais. Um aumento em produção pode compreender qualquer aumento estatisticamente significativo, incluindo, mas não se limitando a, pelo menos 1% de aumento, pelo menos 3% de aumento, pelo menos 5% de aumento, pelo menos 10% de aumento, pelo menos 20% de aumento, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 100% ou aumento maior.
Em métodos específicos, a planta é tratada com uma concentração efetiva de um herbicida, onde a aplicação de herbicida resulta em produção vegetal. Por "concentração efetiva" entende-se a concentração que permite o aumento de produção na planta. Tais concentrações efetivas para herbicidas de interesse são geralmente conhecidas na arte. O herbicida pode ser aplicado tanto pré ou após a emergência de acordo com técnicas usuais para aplicação de herbicidas a campos compreendendo cultivares que foram vistos por ser resistentes ao herbicida por expressão heteróloga de um gene grg da invenção.
Métodos para conferir resistência a herbicidas em uma planta ou parte de planta são também providos. Em tais métodos, um polinucleotídeo grg aqui descrito é introduzido na planta, caracterizado pelo fato de que a expressão do polinucleotídeo resulta em tolerância ou resistência a glifosato. Plantas produzidas por este método podem ser tratadas com uma concentração efetiva de um herbicida e apresentam uma tolerância aumentada ao herbicida. Uma "concentração efetiva" de um herbicida nesta aplicação é uma quantidade suficiente para diminuir ou parar o crescimento de plantas ou partes de plantas que não são naturalmente resistentes ou vistas como resistentes ao herbicida.
Em outra concretização, métodos para conferir resistência a herbicidas em uma planta ou parte de planta são providos, caracterizado pelo fato de que a planta ou parte de planta é cultivada sob temperaturas maiores ou menores do que a temperatura ambiente como descrito supra. Enzimas EPSP sintases tolerantes a glifosato tendo estabilidade térmica em temperaturas maiores ou menores, ou possuem uma temperatura ótima em maiores ou menores temperaturas, são úteis para conferir tolerância a glifosato em plantas que são cultivadas sob tais condições.
Métodos para controlar as ervas daninhas em um campo de cul tivo
Métodos para se controlar seletivamente as ervas daninhas em um campo contendo uma planta também são providos. Em uma concretização, as sementes da planta ou as plantas são resistentes a glifosato, como resultado de um polinucleotídeo grg aqui descrito sendo inserido na semente da planta ou na planta. Em métodos específicos, a planta é tratada com uma concentração efetiva de um herbicida, onde a aplicação de herbicidas resulta em um controle seletivo das ervas daninhas ou outras plantas não transformadas. Por "concentração efetiva" entende-se a concentração que controla o crescimento ou dispersão das ervas daninhas ou outra planta não transformada sem afetar significativamente as plantas resistentes a herbicidas ou as sementes dessas plantas. Tais concentrações efetivas para os herbicidas de interesse são geralmente conhecidas na arte. 0 herbicida pode ser aplicado tanto pré- ou pós emergência de acordo com técnicas usuais para a aplicação de herbicida nos campos compreendendo plantas ou sementes de plantas que tenham se tornado resistentes ao herbicida.
Os exemplos a seguir são fornecidos a título de ilustração e não de limitação.
EXPERIMENTAL
Exemplo 1. Isolamento de EPSP sintases glifosato resistentes.
Linhagens capazes de crescer na presença de glifosato foram isoladas por plaqueamento de amostras de solo em meio de sais minerais HEPES "HEPES Mineral Salts Médium" (HMSM) contendo glifosato como a única fonte de fósforo. Desde que HMSM não contem nenhum aminoácido aromático, a linhagem deve ser resistente a glifosato para poder crescer neste meio.
Dois gramas de solo foram suspensos em aproximadamente 10 ml de água, agitados em vortex por 15 segundos e deixados para assentar por 15 minutos. Uma alçada de 10 μl desta suspensão foi adicionada para 3 ml de HMSM suplementado com 10 mM de glifosato (pH 7,0). HMSM contém (por litro): 10 g de glicose, 2 g de NH4SO4, 9,53 g de HEPES, 1, 0 ml de 0, 8 M MgSO4, 1,0 ml de 0,1 M CaCl2, 1, 0 ml de Solução de metais traços (em 100 ml de solução 1000x: 0,1 g de FeS04-7H20, 0,5 mg de CuS04-5H20, 1,0 mg de H3BO3, 1,0 mg de MnS04-5H20, 7,0 mg de ZnS04-7H20, 1,0 mg de MoO3, 4,0 g de KCl). A cultura foi cultivada em uma incubadora com agitação por quatro dias a 28°C e então 20 μl foi usado para inocular 2,5 ml de HMSM fresco contendo 10 mM de glifosato como a única fonte de fósforo. Após dois dias, 20 μl foi usado para inocular outros 2,5 ml de cultura fresca. Após 5 dias, 20 μl foi usado para inocular 2,5 ml de uma cultura fresca. Após crescimento suficiente, a cultura foi plaqueada em meio sólido estriando-se uma alçada de 1 μl sobre a superfície de placa agar contendo HMSM agar contendo 100 mM de glifosato como a única fonte de fósforo e estocado a 28°C. A cultura foi então replaqueada por isolamento. As linhagens listadas na Tabela 1 estavam entre as linhagens selecionadas devido à habilidade destas em crescer na presença de altas concentrações de glifosato.
Tabela 1.
<table>table see original document page 54</column></row><table> Exemplo 2. Isolamento das EPSP sintases grg37 e grg39 resistentes a glifosato.
Linhagens capazes de crescer na presença de glifosato foram isoladas por plaqueamento das amostras de solo em vários meios de crescimento contendo glifosato. Algumas linhagens foram isoladas em meio de sais minerais suplementado com glifosato. Outras linhagens foram isoladas sob meio rico na presença de glifosato e depois testadas em meio de sais minerais suplementado com glifosato. Desde que o meio de sais minerais não contenha nenhum aminoácido aromático, a linhagem deve ser resistente a glifosato para poder crescer neste meio.
As linhagens ATX21800 e ATX21804 foram isoladas por incubação sob condições ricas e suplementação com glifosato. Estas linhagens foram então testadas para suas habilidades em crescer na presença de glifosato sem aminoácidos aromáticos. A linhagem ATX21804 foi isolada a partir de solo (0,01 gramas) que foi seco ao ar livre por dois dias e plaqueado em agar caldo nutriente suplementado com 100 mM de glifosato. Uma pequena quantidade (10 μl) foi então usada para inocular uma placa de agar eosina azul de metileno contendo 300 mM de glifosato. ATX21800 foi isolada por incubação de 0,01 gramas de solo com 3 ml de caldo nutriente suplementado com 100 mM de glifosato. Após isolamento inicial, cada linhagem foi inoculada em placas Luria Bertani agar para confirmar tipo único de colônia. Estas linhagens foram então testadas em meio mínimo Brunner contendo IOOmM de glifosato e foram confirmadas para crescimento na presença de glifosato sem aminoácidos aromáticos.
As linhagens listadas na Tabela 2 estavam entre as linhagens selecionadas devido suas habilidades para crescer na presença de altas concentrações de glifosato.
Tabela 2.
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As Linhagens capazes de crescer na presença de glifosato foram isoladas por plaqueamento das amostras de solo em vários meios de crescimento contendo glifosato. Algumas linhagens foram isoladas em meio de sais minerais suplementado com glifosato. Outras linhagens foram isoladas sob meio rico na presença de glifosato e depois testadas em meio de sais minerais suplementado com glifosato. Desde que o meio de sais minerais não contenha nenhum aminoácido aromático, a linhagem deve ser resistente a glifosato para poder crescer neste meio. A linhagem ATX20103 foi isolada suspendendo-se aproximadamente 2 gramas de solo em 10 ml de água, agitando-se em vortex por 15 segundos e deixando-se assentar por 15 minutos. Uma alçada de 10 μΐ desta suspensão foi adicionada em 3 ml de Tris MSM (TMSM) suplementado com 10 mM de glifosato (pH 7,0). TMSM contem (por litro): 10 g de glicose, 2 g de NH4SO4, 12,12 g de Tris, 1,0 ml de 0,8 M MgSO4, 1,0 ml de 0,1 M CaCl2, 1,0 ml de solução de metais traços (Em 100 ml de solução 1000x: 0,1 g de FeS04-7H20, 0,5 mg de CuS04-5H20, 1,0 mg de H3BO3, 1,0 mg de MnS04-5H20, 7,0 mg de ZnS04-7H20, 1,0 mg de MoO3, 4,0 g de KCl). A cultura foi então incubada a 28°C para isolamento ao longo de repetidas ciclos de seleção e então inoculadas sobre agar Luria Bertani para confirmar tipo único de colônia. ATX20103 foi então reconfirmada para crescimento em TMSM na presença de glifosato sem aminoácidos aromáticos. A linhagem ATX21806 foi isolada através de incubação sob condições ricas e suplementando-se com glifosato. Esta linhagem foi então testada para sua habilidade em crescer na presença de glifosato sem aminoácidos aromáticos.
A linhagem ATX21806 foi isolada de solo (0,01 gramas) que tinha sido suspenso em 10 ml de água durante a noite. Uma pequena quantidade (10 μl) foi então usada para inocular uma placa de agar eosina azul de metileno contendo 300 mM de glifosato. Após cada isolamento inicial, a linhagem foi inoculada em placas agar Luria Bertani para confirmar tipo único de colônia. A linhagem foi então testada no meio mínimo Brunner com 100 mM de glifosato e foi confirmada para crescimento na presença de glifosato sem aminoácidos aromáticos.
As linhagens listadas na Tabela 3 estavam entre as linhagens selecionadas devido suas habilidades para crescer na presença de altas concentrações de glifosato.
Tabela 3.
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Exemplo 4. Clonagem de EPSP Sintases resistentes a glifosato
O DNA genômico foi extraído a partir das linhagens descritas nas Tabelas 1, 2, e 3, e o DNA resultante foi parcialmente digerido com a enzima de restrição Sau3A 1 para produzir fragmentos de DNA de aproximadamente 5 quilobases em tamanho. Estas moléculas de DNA foram selecionadas por tamanho em géis de agarose, purificadas, e ligadas no braços do vetor LAMBDA ZAP® pré-digerido com BamH I. Os braços ligados foram então empacotados em partículas de fago, e a titulação de fago determinada como conhecido na arte. As bibliotecas resultantes foram amplificadas por métodos conhecidos na arte para gerar uma titulação da biblioteca de entre 3 χ 10^7 e 3 χ 10^8 PFU/mL. Para cada biblioteca independente, E. coli (XLl Blue MRF') foi então co-transfectada com fago de uma biblioteca amplificada assim como com fago M13 ajudante para permitir excisão de massa da biblioteca na forma de um DNA fita simples infectante e circular conforme conhecido na arte (Short et al. (1988) Nucleic Acids Research 16: 7583-7600). Após centrifugação das células co-infectadas, o sobrenadante contendo fago foi aquecido para 65-70°C por 15- 20 minutos para incapacitar qualquer partícula residual de fago lambda. Diluições da biblioteca de plasmídeo DNA fita simples resultante foram transfectadas para culturas fresca de células de E. coli XL-Blue MRF1(Oreyv) (XLl Blue MRF')competentes. As células transfectadas resultantes foram plaqueadas em placas M63 contendo canamicina, 0,1 mM de IPTG e tanto 0 mM, 20 mM ou 50 mM de glifosato.
A E. coli XL-Blue MRF' (aroA) usada para a transfecção expressa o pilus F, e também contem uma deleção do gene aroA codificando a enzima EPSP sintase endógena de E. coli. Esta linhagem também é referida aqui como àaroA. Esta linhagem àaroA é incapaz de crescer em meio mínimo sem aminoácidos aromáticos, ao menos que complementada por uma EPSP sintase funcional. Desde que o glifosato é um potente inibidor de EPSP sintases glifosato-sensitivas típicas, como a EPSP sintase tipo I, clones transf ectados expressando uma EPSP sintase não resistente a glifosato seriam capazes de crescer em placas M63 sem glifosato, mas seriam incapazes de crescer em M63 contendo tanto 20 mM ou 50 mM de glifosato. Para poder crescer em placas de M63 contendo 20 mM ou 50 mM de glifosato, as células devem conter um plasmídeo que expresse uma EPSP sintase que seja tanto (1) capaz de complementar a mutação AaroA destas células, e (2) resistente a glifosato. Então, este método de rastreamento permite a identificação de clones contendo EPSP sintases resistentes a glifosato.
Colônias crescendo em 20 mM ou 50 mM de glifosato foram escolhidas e seus plasmídeos analisados por digestão com enzimas de restrição para identificação de plasmídeos com perfis de digestão compartilhados. Plasmídeos individuais foram seqüenciados por métodos conhecidos na arte.
Usando-se esta abordagem, como às vezes modificada para cada biblioteca como conhecido e apreciado na arte, os clones das bibliotecas contendo genes de EPSP sintase foram identificados para cada uma das linhagens listadas na Tabela 4.
Exemplo 5. Seqüências de DNA e proteína de EPSP sintases
As seqüências de DNA das EPSP sintases glifosato- resistente foram determinadas para cada um dos clones descritos acima por métodos bem conhecidos na arte.
grg33. A seqüência de DNA de grg33 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 1. 0 produto previsto da tradução de grg33 (GRG33) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 2. Uma seqüência sintética codificando GRG33 (syngrg33) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO:3.
grg35. A seqüência de DNA de grg35 é fornecida aqui como SEQ ID NO:4. O produto previsto da tradução de grg35 (GRG35) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 5. Uma seqüência sintética codificando GRG3 5 (syngrg35) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO:6.
grg36. A seqüência de DNA de grg36 é fornecida aqui como SEQ ID NO:7. O produto previsto da tradução de grg36 (GRG36) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 8. Uma seqüência sintética codificando GRG36 (syngrg36) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO:9.
grg37. A seqüência de DNA de grg37 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 10. O produto previsto da tradução de grg37 (GRG37) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 11. Uma seqüência sintética codificando GRG37 (syngrg37) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO: 12.
grg38. A seqüência de DNA de grg38 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 15. O produto previsto da tradução de grg38 (GRG38) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 16. Uma seqüência sintética codificando GRG38 (syngrg38) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO: 17. grg39. A seqüência de DNA de grg39 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 18. 0 produto previsto da tradução de grg39 (GRG39) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 19. Uma seqüência sintética codificando GRG39 (syngrg39) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO: 20.
grg50. A seqüência de DNA de grg50 é fornecida aqui como SEQ ID NO: 21. O produto previsto da tradução de grg50 (GRG50) é fornecido aqui como SEQ ID NO: 22. Uma seqüência sintética codificando GRG50 (syngrg50) também foi concebida e é fornecida aqui como SEQ ID NO: 23.
Clones contendo cada um dos genes das EPSP sintase grg33, grg35, grg36, grg37, grg38, grg39, e grg50 foram depositados no NRRL em 9 de junho de 2006 ou 26 de junho de 2007 e os números de depósito assinados conforme na Tabela 4.
Tabela 4. Clones contendo EPSP sintases resistentes a
<table>table see original document page 62</column></row><table> Cada uma das proteínas GRG33, GRG35, e GRG3 6 demonstraram regiões de homologia para enzimas EPSP sintase no banco de dados NCBI por pesquisa de BLAST. A enzima EPSPS com a maior identidade de seqüência de proteína para cada enzima GRG é listada na Tabela 5.
Tabela 5. Homologia de GRG33-GRG36 para EPSP sintases conhecidas
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As seqüências de aminoácido de GRG33 e GRG35 são 88% idênticas. Uma pesquisa de banco de dados públicos de proteína com a seqüência de aminoácido de GRG33 demonstrou que esta proteína é 86% idêntica sobre 430 aminoácidos à EPSP sintase de Streptomyces coelicolor (SEQ ID NO: 24 GENBANK® No. de Acesso NP 629359.1), e 82% idêntica sobre 430 aminoácidos à EPSP sintase de Streptomyces avermitilis (SEQ ID NO: 25; GENBANK® No. de Acesso NP824218.1).
Similarmente, a seqüência de aminoácido de GRG35 é 85% idêntica sobre 434 aminoácidos a EPSP sintase de Streptomyces coelicolor (SEQ ID NO: 24; GENBANK® No. de Acesso NP 629359.1), e 81% idêntica sobre 441 aminoácidos a EPSP sintase de Streptomyces avermitilis (SEQ ID NO: 25; GENBANK® No. de Acesso NP 824218.1).
Tabela 6. Identidade de aminoácido de GRG33 e GRG35 com EPSP sintases de Streptomyces
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Uma pesquisa de banco de dados públicos de proteína com a seqüência de aminoácido de GRG36 demonstra que esta proteína é relacionada a EPSP sintase de Bacillus halodurans, (64% idêntica sobre 441 aminoácidos, SEQ ID NO: 26; GENBANK® No. de Acesso BAB06432.1), e numa menor extensão para a EPSP sintase de Bacillus clausii (55% idêntica sobre 439 aminoácidos; SEQ ID NO: 27; GENBANK® No. de Acesso BAD63759.1) Tabela 7. Identidade de aminoácido de GRG36 com EPSP sintases
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Uma pesquisa de banco de dados de proteína públicos com a seqüência de aminoácido de GRG37 demonstra que esta proteína é 81% idêntica a EPSP sintase de Arthrobacter sp. FB24 (SEQ ID NO: 28, GENBANK® No. de Acesso ZP 00413033.1)
O quadro de iniciação de leitura grg37 tem dois potenciais códons de iniciação. O ATG acima (a seqüência de aminoácido predita MTAS PMGAS ADNS.......(correspondente as posições de aminoácido 1 até 13 da SEQ ID NO: 10)) contém o melhor sítio de ligação ao ribossomo na proximidade correta. Entretanto, um segundo ATG abaixo pode ser usado. Esta ORF produz a seqüência aminoácido prevista MGASADNS (correspondente as posições de aminoácido 6 até 13 da SEQ ID NO: 10)). 0 ATG acima parece ter um sítio de ligação ao ribossomo ("RBS") que é mais próximo a seqüência consenso do RBS. Entretanto, o quadro de leitura aberto originado a partir deste ATG acima parece ser acoplado por tradução a um quadro de leitura aberto anterior. O pareamento de tradução é uma estratégia conhecida na arte para ser empregada por bactérias para garantir a boa inicialização e poder substituir um sítio de ligação ao ribossomo. A seqüência de nucleotídeo para o sítio de iniciação abaixo é fornecida aqui como SEQ ID NO: 13, e a seqüência de aminoácido codificada são fornecidas aqui como SEQ ID NO: 14.
GRG39 demonstra 96% de identidade de aminoácido a seqüência da GRG30 EPSP sintase, e é altamente homóloga a seqüência da GRG29 EPSP sintase descrita na Pedido de Patente Norte-Americano No. 11/760.570 preenchida em 8 de junho de 2007.
GRG3 8 demonstra 94% de identidade de aminoácido a GRG 12 EPSP sintase descrita na Pedido de Patente Norte- Americano No. 11/400.598, preenchida em 7 de abril de 2006 (Tabela 8). GRG38 também contem os domínios das EPSP sintases Classe III descritas na Pedido de Patente Norte- Americano No. 11/400.598.
GRG50 demonstra 95% de identidade de aminoácido a GRG8 EPSP sintase descrita na Pedido de Patente Norte-Americano No. 11/315.678 preenchida em 22 de dezembro de 2005 (Tabela 8). GRG50 também contem os domínios das EPSP sintases Classe III descritas na U.S. Application 11/400.598, preenchida em 7 de abril de 2006. Tabela 8. Comparação com outras EPSP sintases Classe III
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Exemplo 6. Clonagem de uma nova EPSP sintase glifosato- resistente em um vetor de expressão de E. coli
Os genes da EPSP sintase contidos nos clones da Tabela 4 foram sub-clonados no vetor de expressão de E. coli pRSFlb (Invitrogen). Os clones resultantes foram confirmados por seqüenciamento de DNA, e usados para expressão induzida de cada EPSP sintase em E. coli. As proteínas com etiqueta His expressas foram então purificadas como conhecido na arte.
Exemplo 7. Resistência a Glifosato das EPSP sintases GRG33. GRG35. e GRG3 6 Os clones em pRSFlb foram plaqueados em placas M63+ contendo antibióticos e tanto OmM ou 50mM de glifosato. O crescimento recebeu uma pontuação após dois dias de crescimento a 37°C. Cada uma das três EPSP sintases foi observada para conferir resistência a 50 mM de glifosato em células de E. coli (Tabela 9).
Tabela 9. Rastreamento de Glifosato
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Exemplo 8. Resistência a Glifosato das EPSP sintases GRG37 e GRG39
Células contendo os clones plasmidiais demonstrados na Tabela 4 foram plaqueados em placas M63+ contendo antibiótico e tanto OmM ou 20mM de glifosato. O crescimento foi pontuado após dois dias de crescimento a 37°C. Cada uma das EPSP sintases foi observada para conferir resistência a 20 mM de glifosato em células de E. coli (Tabela 10). Tabela 10. Rastreamento de glifosato
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Exemplo 9. Resistência a Glifosato das EPSP sintases GRG38 e GRG50
As células contendo os clones de plasmídeo mostrados na Tabela 4 foram plaqueadas em placas M63+ contendo antibiótico e tanto OmM ou 2OmM de glifosato. 0 crescimento foi pontuado após dois dias de crescimento a 37°C. Cada uma das EPSP sintases foi observada para conferir resistência a 20 mM de glifosato em células de E. coli (Tabela 11).
Tabela 11. Rastreamento de glifosato
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Exemplo 10. Construindo grg33, grg35, grg36, grg37, grg38, grg39, grg50, svngrg33, svngrg35, svngrg36, svngrg37, svngrg38, svngrg39, e svngrg50 para Transformação em Planta
0 quadro de leitura aberto (ORF) para cada um dos genes grg é amplificado por PCR a partir do molde de cDNA íntegro. Sítios de restrição Hind III são adicionados para cada final da orF durante o PCR. Adicionalmente, a seqüência de nucleotídeo ACC é adicionada imediatamente a 5' do códon de início do gene para aumentar a eficiência de tradução (Kozak (1987) Nucleic Acids Research 15: 8125- 8148; Joshi (1987) Nucleic Acids Research 15: 6643-6653). O produto de PCR é clonado e seqüenciado, usando técnicas bem conhecidas na arte, para garantir que nenhuma mutação seja introduzida durante o PCR. O plasmídeo contendo o grg produto de PCR é digerido com, por exemplo, Hind III e o fragmento contendo o orF intacto é isolado.
Pode-se talvez se gerar construções similares que contenham uma seqüência de cloroplasto alvo ligada a um polinucleotídeo da invenção por métodos conhecidos na arte.
Um fragmento de DNA contendo a EPSP sintase (e tanto contendo ou não contendo uma seqüência de cloroplasto alvo) é clonado dentro de um plasmídeo, por exemplo no sítio Hind III de pAX200. pAX200 é um vetor de expressão em plantas contendo o promotor de actina de arroz (McElroy et a (1991) Molec. Gen. Genet. 231: 150-160), e o terminador PinII (An et a (1989) The Plant Célula 1: 115-122). O fragmento promotor-gene-terminador (ou o fragmento promotor-líder- gene-terminador) deste plasmídeo intermediário é subclonado dentro de um plasmídeo como um pSBl 1 (Japan Tobacco, Inc.) para formar um plasmídeo final, referido aqui como, por exemplo, pSBl 1GRG33. pSBl 1GRG33 é organizado de forma que o fragmento de DNA contendo, por exemplo, a construção promotor-grg36-terminador (ou a construção promotor-líder- grg35-terminador) pode ser retirado por enzimas de restrição apropriadas e também usados para transformação em plantas, por exemplo, por injeção de feixe de aerossol. A estrutura do pSBl 1GRG33 é verificada por digestão com enzima de restrição e gel eletroforese, assim como por seqüenciamento ao longo das várias junções das clonagens. O mesmo método pode ser usado para gerar um plasmideo final para cada um dos genes grg descritos aqui.
O plasmideo é mobilizado dentro da linhagem de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que também carrega o plasmideo pSBl (Japan Tobacco, Inc.), usando procedimentos de conjugação triparental bem conhecidos na arte, e plaqueamento em meio contendo antibiótico. O plasmideo pSBl 1GRG3 6 carrega resistência a espectinomicina, mas é um plasmideo de estreita faixa de hospedeiros e não pode se replicar em Agrobacterium. Colônias resistentes a antibiótico surgem quando pSBl 1GRG3 6 se integra dentro do plasmideo de vasta faixa de hospedeiros pSBl através de recombinação homóloga. O produto co-integrado resultante é verificado por hibridação por Southern. A linhagem de Agrobacterium carregando o co-integrado pode ser usado para transformar milho, por exemplo, através do método de PureIntro (Tabaco do Japão).
Exemplo 11. Transformação de grg33, grg35, grg36, grg3 7, grg3 8, grg39, grg50, svngrg33, svngrg35, svngrg36, svngrg3 7, svngrg38, svngrg39, e svngrg50 em Células vegetais
Espigas de milho são melhor colhidas entre 8-12 dias após polinização. Os embriões são isolados a partir das espigas, e os embriões de 0,8-1,5 mm em tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com lado do escutelo virado para cima em um meio de incubação adequado, como o meio DN62A5S (3,98 g/L Sais N6; 1 mL/L (de Estoque 1000x) Vitaminas N6; 800 mg/L de L- Asparagina; 100 mg/L de Mio-inositol; 1,4 g/L de L-Prolina; 100 mg/L de Casaminoácidos; 50 g/L de sacarose; 1 mL/L (de Estoque 1 mg/mL) 2,4-D). Entretanto, outros meios e sais além de DN62A5S são adequados e são conhecidos na arte. Os embriões são incubados durante a noite a 25°C no escuro. Entretanto, não é necessário por si se incubar os embriões durante a noite.
Os explantes resultantes são transferidos para malha quadrada (30-40 por placa), transferidos sobre meio osmótico por cerca de 30-45 minutos, e então transferidos para uma placa de bombardeamento (ver, por exemplo, Publicação de Pedido PCT No. W0/0138514 e Patente Norte- Americana No. 5,240,842).
Construções de DNA desenhadas para expressar as proteínas GRG da presente invenção em células vegetais são aceleradas para dentro do tecido vegetal usando um acelerador de feixe de aerossol, usando as condições essencialmente como descrito na Publicação de Pedido PCT No. W0/0138514. Após bombardeamento, os embriões são incubados por cerca de 30 min em meio osmótico, e plaqueados sobre meio de incubação durante a noite a 25°C no escuro. Para evitar explantes indevidamente danificados pelo bombardeamento, eles são incubados por ao menos 24 horas antes da transferência para o meio de recuperação. Os embriões são então espalhados sobre o meio de período de recuperação, por cerca de 5 dias, a 25°C no escuro, e então transferidos para o meio de seleção. Os explantes são incubados em meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particularmente utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação do embrião, até a formação de embriões somáticos maduros ser observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são então plaqueados sob luz baixa, e o processo de regeneração é iniciado por métodos conhecidos na arte. Os brotos resultantes são deixados para enraizar no meio de enraizamento, e as plantas resultantes são transferidas para os potes de viveiro e propagadas como plantas transgênicas.
Materiais Tabela 12. Meio DN62A5S
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0 pH da solução é ajustado para pH 5,8 com IN de KOH/IN KCl, Gelrite (Sigma) é adicionado na concentração de até 3 g/L, e o meio é autoclavado. Após resfriamento para 50°C, 2 ml/L de uma solução estoque de 5 mg/ml de nitrato de prata (Phytotechnology Labs) é adicionada.
Exemplo 12. A transformação de grg33, grg35, grg36, grg37, grg3 8, grg39, grg50, svngrg33, svngrg35, svngrg36, svngrg37, svngrg38, svngrg39, e svngrg50 para Células vegetais de Milho por Transformação mediada por Agrobacterium Espigas são melhor colhidas entre 8-12 dias após polinização. Os embriões são isolados a partir de espigas, e os embriões de 0.8-1.5 mm em tamanho são preferidos para uso na transformação. Os embriões são plaqueados com lado do escutelo virado para cima em um meio de incubação adequado, e incubados durante a noite a 25°C no escuro. Entretanto, não é necessário por si se incubar os embriões durante a noite. Os embriões são postos em contato com uma linhagem de Agrobacterium contendo os vetores apropriados para a transferência mediada por plasmideo Ti por cerca de 5-10 min, e então plaqueados em meio de co-cultivação por cerca de 3 dias (25°C no escuro). Após co-cultivo os explantes são transferidos para meio de período de recuperação por cerca de cinco dias (a 25°C no escuro). Os explantes são incubados no meio de seleção por até oito semanas, dependendo da natureza e características da seleção particularmente utilizada. Após o período de seleção, o calo resultante é transferido para o meio de maturação de embrião, até a formação de embriões somáticos maduros ser observada. Os embriões somáticos maduros resultantes são então plaqueados sob luz baixa, e então o processo de regeneração é inicializado como conhecido na arte. Os brotos resultantes são deixados para enraizar em meio de enraizamento, e as plantas resultantes são transferidas para potes de viveiro e propagadas como plantas transgênicas.
Todas as publicações e aplicações de patentes mencionadas na especificação são indicativas do nível de especialização daqueles especialistas na arte a qual esta invenção pertence. Todas as publicações e aplicações de patentes são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação ou aplicação de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada para serem incorporadas por referência.
Apesar de a invenção precedente ter sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será óbvio que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Depositante: Athenix Corporation
Cheryl Peters Brian Vande Berg Brian Carr Daniel John Tomso
<120> Título da Invenção: GRG33, GRG35 GRG36, GRG37, GRG38, GRG39,
e GRG50: Novos genes de EPSP sintase conferindo resistência a herbicida
<130> Referência do documento: 45600/329203
<150> Número do Documento de Prioridade: 60/816.676
<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 27-06-2006
<150> Número do Documento de Prioridade: 60/819.122
<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 07-07-2006
<150> Número do Documento de Prioridade: 60/819.119
<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 07-07-2006
<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 41
<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> SEQ ID NO: 1
<211> Comprimento: 1329
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: Isolado de amostra de solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1). . .(i:
<400> Seqüência: 1 atg acc gac age aac ccg tcc Met Thr Asp Ser Asn Pro Ser 1 5
gcc ccg tac gcg gcc ggc gcc Ala Pro Tyr Ala Ala Gly Ala 20
tcg aag tcg gtc acc aac cgc Ser Lys Ser Val Thr Asn Arg 35
gag ccg ggc tgg gtg cgc cgc Glu Pro Gly Trp Val Arg Arg 50 55
atg gcg gag gcg ctg cgc acc Met Ala Glu Ala Leu Arg Thr 65 70
329)
acc gac ccg ctc acc ggc cgc tgg ccc 48 Thr Asp Pro Leu Thr Gly Arg Trp Pro 10 15
gtc gac gcc acc gtc acc gtg ccc gga 96 Val Asp Ala Thr Val Thr Val Pro Gly 25 30
gcc ctg gtg ctc gcc gcg ctg gcc gcc 144 Ala Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala 40 45
ccg ctg cgc tcg cgc gac acc ctg ctg 192 Pro Leu Arg Ser Arg Asp Thr Leu Leu 60
ctg ggc gtg aag ate gac gag ggc gtg 240 Leu Gly Val Lys Ile Asp Glu Gly Val 75 80 ggc ccg gac ggc acc ggc gag gcc tgg cgg ate ate ccg gcc ggg ctg Gly Pro Asp Gly Thr Gly Glu Ala Trp Arg Ile Ile Pro Ala Gly Leu 85 90 95
288
cgc ggc ccg gcg acc gtc gac gtc ggc aac gcg ggc acg gtc atg cgc 336 Arg Gly Pro Ala Thr Val Asp Val Gly Asn Ala Gly Thr Val Met Arg 100 105 HO
ttc ctg ccg ccg gtg gcg gcg ctc gcg aac ggc gcg gtg cgc ttc gac 384 Phe Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu Ala Asn Gly Ala Val Arg Phe Asp 115 120 125
ggc gac ccg cgc tcc cac gag cgc ccg ctg cac ggg gtg ate gac gcg 432 Gly Asp Pro Arg Ser His Glu Arg Pro Leu His Gly Val Ile Asp Ala 130 135 140
ctg cgc gcg ctg ggc gcc cgg ate gac gac gac ggg cgc ggc gcg ctg 480 Leu Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile Asp Asp Asp Gly Arg Gly Ala Leu 145 150 155 160
ccg atg acc gtg cac ggc gcc ggc ggc ctg gag ggc ggg gtc gtg gag 528 Pro Met Thr Val His Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Gly Val Val Glu 165 170 175
ate gac gcc tcc tcg tcc tcc cag ttc gtc age gcg ctg ctg ctc tcc 576 Ile Asp Ala Ser Ser Ser Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Ser 180 185 190
ggc gcc cgc ttc aac cag ggc gtg gag gtg cgg cac gtc ggc acc cgg 624 Gly Ala Arg Phe Asn Gln Gly Val Glu Val Arg His Val Gly Thr Arg 195 200 205
ctg ccc tcg ctg ccg cac ate cgg atg acg gtc gac atg ctg cgc gcg Leu Pro Ser Leu Pro His Ile Arg Met Thr Val Asp Met Leu Arg Ala 210 215 220
ggc ggc cgg gtc acc gtg ccg gac tgg ccg gcc agg acc acc cag ccc Gly Gly Arg Val Thr Val Pro Asp Trp Pro Ala Arg Thr Thr Gln Pro 275 280 285
672
gtc ggc gcc cag gtc gac gag ccg gag cac ggc ggg cgt ccc gac gtg 720 Val Gly Ala Gln Val Asp Glu Pro Glu His Gly Gly Arg Pro Asp Val 225 230 235 240
tgg cgg gtc acc ccg tcc gcg ctg ctc ggc cgg gac ctg gtg gtg gag 768 Trp Arg Val Thr Pro Ser Ala Leu Leu Gly Arg Asp Leu Val Val Glu 245 250 255
ccg gac ctg tcg aac gcc cag ccg ttc ctg gcg gcg gcg ctg gtc acc 816 Pro Asp Leu Ser Asn Ala Gln Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Val Thr 260 265 270
864
ggt gac gcg ctg cgg cag ate ttc acc gag atg ggt ggc tcc tgc gag 912 Gly Asp Ala Leu Arg Gln Ile Phe Thr Glu Met Gly Gly Ser Cys Glu 290 295 300
ctc acc gac cgg ggt ctc acc ttc acc gga acc ggc cgg ate cac ggc 960 Leu Thr Asp Arg Gly Leu Thr Phe Thr Gly Thr Gly Arg Ile His Gly 305 310 315 320 ate gac gtc gac ctc ggc gag gtc ggc gag ctg acc ccg ggc ate gcg 1008 Ile Asp Val Asp Leu Gly Glu Val Gly Glu Leu Thr Pro Gly Ile Ala 325 330 335
gcg gtc gcc gcg ctc gcc gac tcc ccg tcc acc ctg cgc ggg gtg gcg 1056 Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp Ser Pro Ser Thr Leu Arg Gly Val Ala 340 345 350
cac ctg cgg ctg cac gag acc gac cgg ctc gcc gcg ctc acc cgg gag 1104 His Leu Arg Leu His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala Leu Thr Arg Glu 355 360 365
ate aac gcg ctg ggc ggc gac gtc acg gag acc gag gac ggc ctg cac 1152 Ile Asn Ala Leu Gly Gly Asp Val Thr Glu Thr Glu Asp Gly Leu His 370 375 380
ate cgc ccg cgc ccg ctg cac ggc ggc ctc ttc cac acg tac cac gac 1200 Ile Arg Pro Arg Pro Leu His Gly Gly Leu Phe His Thr Tyr His Asp 385 390 395 400
cac cgg atg gcg acc gcg ggc gcg ctc ate ggc ctg gcc gtg aag ggc 1248 His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly Leu Ala Val Lys Gly 405 410 415
gtg gag ate gag aac gtg aag acg acc gag aag acc ttg ccc gac ttc 1296 Val Glu Ile Glu Asn Val Lys Thr Thr Glu Lys Thr Leu Pro Asp Phe 420 425 430
ccc agg atg tgg acc gaa atg ctc gga gtc tga 1329
Pro Arg Met Trp Thr Glu Met Leu Gly Val * 435 440
<210> SEQ ID NO: 2 <211> Comprimento: 442 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: Isolado de amostra de solo <400> Seqüência: 2
Met Thr Asp Ser Asn Pro Ser Thr Asp Pro Leu Thr Gly Arg Trp Pro
1 5 10 15
Ala Pro Tyr Ala Ala Gly Ala Val Asp Ala Thr Val Thr Val Pro Gly
20 25 30
Ser Lys Ser Val Thr Asn Arg Ala Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala
35 40 45
Glu Pro Gly Trp Val Arg Arg Pro Leu Arg Ser Arg Asp Thr Leu Leu
50 55 60
Met Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Val Lys Ile Asp Glu Gly Val 65 70 75 80
Gly Pro Asp Gly Thr Gly Glu Ala Trp Arg Ile Ile Pro Ala Gly Leu
85 90 95
Arg Gly Pro Ala Thr Val Asp Val Gly Asn Ala Gly Thr Val Met Arg
100 105 110
Phe Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu Ala Asn Gly Ala Val Arg Phe Asp
115 120 125
Gly Asp Pro Arg Ser His Glu Arg Pro Leu His Gly Val Ile Asp Ala 130 135 140 Leu Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile Asp Asp Asp Gly Arg Gly Ala Leu 145 150 155 160 Pro Met Thr Val His Gly Ala Gly Gly Leu Glu Gly Gly Val Val Glu 165 170 175 Ile Asp Ala Ser Ser Ser Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Ser 180 185 190 Gly Ala Arg Phe Asn Gln Gly Val Glu Val Arg His Val Gly Thr Arg 195 200 205 Leu Pro 210 Ser Leu Pro His Ile 215 Arg Met Thr Val Asp 220 Met Leu Arg Ala Val Gly Ala Gln Val Asp Glu Pro Glu His Gly Gly Arg Pro Asp Val 225 230 235 240 Trp Arg Val Thr Pro Ser Ala Leu Leu Gly Arg Asp Leu Val Val Glu 245 250 255 Pro Asp Leu Ser Asn Ala Gln Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Val Thr 260 265 270 Gly Gly Arg Val Thr Val Pro Asp Trp Pro Ala Arg Thr Thr Gln Pro 275 280 285 Gly Asp Ala Leu Arg Gln Ile Phe Thr Glu Met Gly Gly Ser Cys Glu 290 295 300 Leu Thr Asp Arg Gly Leu Thr Phe Thr Gly Thr Gly Arg Ile His Gly 305 310 315 320 Ile Asp Val Asp Leu Gly Glu Val Gly Glu Leu Thr Pro Gly Ile Ala 325 330 335 Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp Ser Pro Ser Thr Leu Arg Gly Val Ala 340 345 350 His Leu Arg 355 Leu His Glu Thr Asp 360 Arg Leu Ala Ala Leu 365 Thr Arg Glu Ile Asn Ala Leu Gly Gly Asp Val Thr Glu Thr Glu Asp Gly Leu His 370 375 380 Ile Arg Pro Arg Pro Leu His Gly Gly Leu Phe His Thr Tyr His Asp 385 390 395 400 His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Leu Ile Gly Leu Ala Val Lys Gly 405 410 415 Val Glu Ile Glu 420 Asn Val Lys Thr Thr 425 Glu Lys Thr Leu Pro 430 Asp Phe Pro Arg Met Trp Thr Glu Met Leu Gly Val 435 440
<210> SEQ ID NO: 3 <211> Comprimento: 1326 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg33
<400> Seqüência: 3
atg aca gac age aac cca age acc gac gcg ccc tac gcc gcc ggc gcc gtc gac age aag age gtc acc aac agg gcg ctg gaa CCt gga tgg gtg cgg cgg ccg ctg atg gcg gag gcg ctg agg acg ctc ggc gga CCt gat gga act gga gaa gea tgg cgc ggc ccg gcg acg gtg gat gtt ggc ttc ctg ccg ccg gtg gcg gcg ctg gcc ggc gac cca aga agt cat gaa agg CCt ctc cgc gcg ctg gga gea agg ate gac cca atg aca gtt cat ggc gcc ggc ggc
ccg ctc acc ggc cgc tgg ccg 48
gcc acc gtc acc gtg cct gga 96
gtg ctg gcg gcg ctg gct gct 144
agg age agg gac acc tta ttg 192
gtc aag att gat gaa gga gtt 240
agg ate ate ccc gcc ggc ctc 288
aac gcc ggc acc gtg atg agg 336
aac ggc gcc gtc cgc ttc gac 384
cta cat ggc gtc ate gac gcg 432
gac gac ggc cgc ggc gcg ctg 480
ctg gag ggc ggc gtg gtg gag 528 att gat gea age age age ggc gcg cgc ttc aac caa ctg cca tca ttg ccg cac gtc ggc gct caa gtt gat tgg agg gtg acg ccg tcg cca gat ctc tca aat gct ggc ggc cgc gtc acc gtg ggc gac gcg ctg cgg cag ctc acc gac cgc ggc ctc att gat gtg gac ctc ggc gcc gtg gcg gcg ctc gcc cac ctc cgc cta cat gaa ate aac gcg ctc ggc ggc ate agg ccg cgg ccg cta cac agg atg gcc acc gcc gtg gag att gaa aat gtg cca agg atg tgg acg gag
age cag ttc gtc tcg gcg gga gtg gag gtg cgg cat ate agg atg acg gtg gac gag ccg gag cat gga gga gcg ctg ctg gga aga gat caa ccc ttc ctg gcg gcg cca gat tgg ccg gea agg ate ttc acc gag atg gga acc ttc acc ggc act gga gag gtg gga gag ctg acg gac tcg ccg tcg acg ctc aca gat cgg ctg gcg gcg gac gtc acc gag aca gaa cat gga ggc ctc ttc cac ggc gcg ctc ate ggc ctc aag aca aca gag aag acg atg ctg ggc gtc
ctg ctg ctg age 576
gtt gga aca agg 624
atg ctg cgc gcc 672
agg cca gat gtt 720
ctg gtg gtg gag 768
gcg ctg gtg acc 816
acg acg cag ccc 864
gga tca tgt gag 912
agg att cat ggc 960
ccg ggc ate gcc 1008
cgc ggc gtg gct 1056
ctg aca agg gag 1104
gat ggc etc cac 1152
acc tac cat gat 1200
gcc gtc aag ggc 1248
ctg ccg gac ttc 1296
1326
<210> SEQ ID NO: 4 <211> Comprimento: 1353 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1353)
<400> Seqüência: 4
atg acc gea gct tcc ccc gcg cac ccc gat ccg tcg cag ccc gcc gtc 48 Met Thr Ala Ala Ser Pro Ala His Pro Asp Pro Ser Gln Pro Ala Val 1 5 10 15
ccc gcc ggc ccg gac ctc tgg ccc gcc ccg tac gcg age ggc ccc gtc 96 Pro Ala Gly Pro Asp Leu Trp Pro Ala Pro Tyr Ala Ser Gly Pro Val 20 25 30
gac gcg acc gtg acc gtg ccc ggc tcg aag tcg gtc acc aac cgc gcc Asp Ala Thr Val Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Val Thr Asn Arg Ala 35 40 45
144
ctg gtg ctc gcc gcg ctc gcc gcc gag ccc ggc tgg gtg cgg cgc ccg 192 Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Glu Pro Gly Trp Val Arg Arg Pro 50 55 60
ctc cgc tcc cgc gac acc ctc ctg atg gcc gag ggc ctg cgc acc ctg 240 Leu Arg Ser Arg Asp Thr Leu Leu Met Ala Glu Gly Leu Arg Thr Leu 65 70 75 80
ggc gtg aag ate gag gag ggc gtg ggc ccg gac ggc acc ggc gag gcc 288 Gly Val Lys Ile Glu Glu Gly Val Gly Pro Asp Gly Thr Gly Glu Ala 85 90 95
tgg cgg ate ate ccg gcc ccg ctg cgc ggc ggc gcc acg gtc gac gtc 33 6 Trp Arg Ile Ile Pro Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ala Thr Val Asp Val 100 105 HO
ggc aac gcg ggc acg gtc atg cgc ttc ctg ccg ccg gtc gcc gcg ctc 384 Gly Asn Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu 115 120 125 gcc gac ggc ccg gtc cgc ttc gac ggc gac ccc cgc tcc cac gag cgc Ala Asp Gly Pro Val Arg Phe Asp Gly Asp Pro Arg Ser His Glu Arg 130 135 140
432
ccg ctg cac ggg gtg ate gac gcg ctg cgc gcg ctc ggc gcc cgg ate 480 Pro Leu His Gly Val Ile Asp Ala Leu Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile 145 150 155 160
gac gac gag ggc cgc ggc gcc ctc ccg atg acc gtg cac ggc gcc ggc 528 Asp Asp Glu Gly Arg Gly Ala Leu Pro Met Thr Val His Gly Ala Gly 165 170 175
ggc ctg gag ggc ggc acg gtc gag ate gac gcc tcc tcg tcc tcc cag 576 Gly Leu Glu Gly Gly Thr Val Glu Ile Asp Ala Ser Ser Ser Ser Gln 180 185 190
ttc gtc age gcc ctg ctg ctc tcc ggc gcc cgc ttc aac cag ggc gtc 624 Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Ser Gly Ala Arg Phe Asn Gln Gly Val 195 200 205
gag gtc cgg cac gcg ggc ggc cgg ctg ccg tcg atg ccg cac ate cgg 672 Glu Val Arg His Ala Gly Gly Arg Leu Pro Ser Met Pro His Ile Arg 210 215 220
atg acc gtg gac atg ctc cgc gcg gtg ggc gcg aag gtc gac gag ccg 720 Met Thr Val Asp Met Leu Arg Ala Val Gly Ala Lys Val Asp Glu Pro 225 230 235 240
gag cac ggc ggc gag ccg gac gtg tgg cgg gtg gcc ccg tcg gcg ctg 768 Glu His Gly Gly Glu Pro Asp Val Trp Arg Val Ala Pro Ser Ala Leu 245 250 255
cgc ggc cgc gac ctg gtc ate gag ccc gac ctg tcg aac gcc cag ccg 816 Arg Gly Arg Asp Leu Val Ile Glu Pro Asp Leu Ser Asn Ala Gln Pro 260 265 270
ttc ctg gcg gcc gcg ctg gtc acc ggc ggc cgg gtg acc gtc ccg gac 864 Phe Leu Ala Ala Ala Leu Val Thr Gly Gly Arg Val Thr Val Pro Asp 275 280 285
tgg ccg gcc cgc acc acc cag ccc ggc gac gag ctg cgc cgc ate ttc 912 Trp Pro Ala Arg Thr Thr Gln Pro Gly Asp Glu Leu Arg Arg Ile Phe 290 295 300
acc gag atg ggc ggc gcc tgc gag ctc acc gac gcc ggt ctc acc ttc 960 Thr Glu Met Gly Gly Ala Cys Glu Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Phe 305 310 315 320
acc ggc acc ggc cgg ate cac ggc ate gac gtg gac ctc ggc gag gtc 1008 Thr Gly Thr Gly Arg Ile His Gly Ile Asp Val Asp Leu Gly Glu Val 325 330 335
ggc gag ctg acc ccc ggc ate gcg gcg gtc gcc gcc ctc gcc gac tcc Gly Glu Leu Thr Pro Gly Ile Ala Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp Ser 340 345 350
1056
ccc tcc acc ctg cgc ggc gtg gcc cac ctg cgg ctc cac gag acc gac 1104 Pro Ser Thr Leu Arg Gly Val Ala His Leu Arg Leu His Glu Thr Asp 355 360 365 cgg ctc gcg gcg ctc acc cgg gag ate aac ggt ctg ggc ggc gac gtc 1152 Arg Leu Ala Ala Leu Thr Arg Glu Ile Asn Gly Leu Gly Gly Asp Val 370 375 380
acc gag acc gag gac ggc ctg cac ate cgg ccg cgc ccg ctg acc ggc 1200 Thr Glu Thr Glu Asp Gly Leu His Ile Arg Pro Arg Pro Leu Thr Gly 385 390 395 400
ggc gtc ttc cac acg tac cac gac cac cgg atg gcg acc gcg ggc gcg 1248 Gly Val Phe His Thr Tyr His Asp His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala 405 410 415
ate ate ggc ctc gcc gtg aag ggc gtg gag ate gag gac gtg gcg acg 1296 Ile Ile Gly Leu Ala Val Lys Gly Val Glu Ile Glu Asp Val Ala Thr 420 425 430
acc gcc aag acc ttg ccg gac ttc ccg ggg atg tgg acc gaa atg ctc 1344 Thr Ala Lys Thr Leu Pro Asp Phe Pro Gly Met Trp Thr Glu Met Leu 435 440 445
gga gcc tga 13 53
Gly Ala * 450
<210> SEQ ID NO: 5 <211> Comprimento: 450 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações i: isolado dc ι solo <400> Seqüência: 5 Met Thr Ala Ala Ser Pro Ala His Pro Asp Pro Ser Gln Pro Ala Val 1 5 10 15 Pro Ala Gly Pro Asp Leu Trp Pro Ala Pro Tyr Ala Ser Gly Pro Val 20 25 30 Asp Ala Thr Val Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Val Thr Asn Arg Ala 35 40 45 Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Glu Pro Gly Trp Val Arg Arg Pro 50 55 60 Leu Arg Ser Arg Asp Thr Leu Leu Met Ala Glu Gly Leu Arg Thr Leu 65 70 75 80 Gly Val Lys Ile Glu Glu Gly Val Gly Pro Asp Gly Thr Gly Glu Ala 85 90 95 Trp Arg Ile Ile Pro Ala Pro Leu Arg Gly Gly Ala Thr Val Asp Val 100 105 110 Gly Asn Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu 115 120 125 Ala Asp Gly Pro Val Arg Phe Asp Gly Asp Pro Arg Ser His Glu Arg 130 135 140 Pro Leu His Gly Val Ile Asp Ala Leu Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile 145 150 155 160 Asp Asp Glu Gly Arg Gly Ala Leu Pro Met Thr Val His Gly Ala Gly 165 170 175 Gly Leu Glu Gly Gly Thr Val Glu Ile Asp Ala Ser Ser Ser Ser Gln 180 185 190 Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Ser Gly Ala Arg Phe Asn Gln Gly Val
195 200 205 Glu Val Arg His Ala Gly Gly Arg Leu Pro Ser Met Pro His Ile Arg 210 215 220 Met Thr Val Asp Met Leu Arg Ala Val Gly Ala Lys Val Asp Glu Pro 225 230 235 240 Glu His Gly Gly Glu 245 Pro Asp Val Trp Arg 250 Val Ala Pro Ser Ala 255 Leu Arg Gly Arg Asp 260 Leu Val Ile Glu Pro 265 Asp Leu Ser Asn Ala 270 Gln Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Val Thr Gly Gly Arg Val Thr Val Pro Asp 275 280 285 Trp Pro Ala Arg Thr Thr Gln Pro Gly Asp Glu Leu Arg Arg Ile Phe 290 295 300 Thr Glu Met Gly Gly Ala Cys Glu Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Phe 305 310 315 320 Thr Gly Thr Gly Arg 325 Ile His Gly Ile Asp 330 Val Asp Leu Gly Glu 335 Val Gly Glu Leu Thr Pro Gly Ile Ala Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp Ser 340 345 350 Pro Ser Thr 355 Leu Arg Gly Val Ala 360 His Leu Arg Leu His 365 Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala Leu Thr Arg Glu Ile Asn Gly Leu Gly Gly Asp Val 370 375 380 Thr Glu Thr Glu Asp Gly Leu His Ile Arg Pro Arg Pro Leu Thr Gly 385 390 395 400 Gly Val Phe His Thr Tyr His Asp His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala 405 410 415 Ile Ile Gly Leu 420 Ala Val Lys Gly Val 425 Glu Ile Glu Asp Val 430 Ala Thr Thr Ala Lys 435 Thr Leu Pro Asp Phe 440 Pro Gly Met Trp Thr 445 Glu Met Leu
Gly Ala 450
<210> SEQ ID NO: 6 <211> Comprimento: 1326 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg35
<400> Seqüência: 6
gttgatccaa gccagccggc ggtgccggcg gggccggacc tctggccggc gccatatgct 60 tctgggccgg tggacgccac cgtcaccgtg cctggaagca agagcgtcac caacagggcg 12 0 ctggtgctgg cggcgctggc tgctgaacct ggatgggtgc ggcggccgct gaggagcagg 180 gacaccttgc tgatggcaga agggctaagg acgctcggcg tcaagatcga ggagggcgtc 240 ggccctgatg gaactggaga agcatggagg atcatcccgg cgccgctccg cggcggcgcc 300 accgtcgacg tcggcaacgc cggcaccgtg atgaggttcc tgccgccggt ggcggcgctc 360 gccgacgggc cggtgagatt tgatggagat ccaagaagtc atgaaaggcc tctacatggc 420 gtcatcgacg cgctccgcgc gctcggcgcc aggattgatg atgaaggccg cggcgcgctg 480 ccaatgacag ttcatggcgc cggcggcctg gaaggaggaa cagtggagat tgatgcaagc 540 agcagcagcc agttcgtctc ggcgctgctg ctgagcggcg cgcgcttcaa ccaaggagtg 600 gaggtgcggc acgccggcgg ccggctgcca tcaatgcctc acatcaggat gacggtggac 660 atgctgcgcg ccgtcggcgc caaggtggat gagccggagc atggaggaga acctgatgtt 720 tggagggtgg cgccgtcggc gctccgcggc cgcgacctgg tgattgagcc agatctctca 780 aatgctcaac ccttcctggc ggcggcgctg gtgaccggcg gccgcgtcac cgtgccagat 840 tggccggcaa ggacgacgca gcccggcgac gagctaagga ggatcttcac cgagatgggc 900 ggcgcctgcg agctcaccga cgccggcctc accttcaccg gcactggaag gattcatggc 960 attgatgtgg acctcggcga ggtgggagag ctgacgccgg gcatcgccgc cgtggcggcg 1020 ctcgccgact cgccgtcgac gctccgcggc gtggctcacc tccgcctaca tgaaacagat 1080 cggctggcgg cgctgacaag ggagatcaat gatggactac acatcaggcc gcggccgctc cacaggatgg ccaccgccgg cgccatcatc gatgtggcca ccaccgccaa gacgctgccg ggcgcc
ggcctcggcg gcgacgtcac cgagacagaa 1140 accggcggcg tcttccacac ctaccatgat 1200 ggcctcgccg tgaagggcgt ggagattgaa 1260 gacttccctg ggatgtggac ggagatgctg 1320
1326
<210> SEQ ID NO: 7 <211> Comprimento: 1344 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1344)
<400> Seqüência: 7
atg aaa aat caa aat ttt gat gct aaa gcc cgt age ccg tgg aca ccg Met Lys Asn Gln Asn Phe Asp Ala Lys Ala Arg Ser Pro Trp Thr Pro 1 5 10 15
tta aaa ggt gta aat aag ata agt gtt tca cct agt aaa gga aga ata Leu Lys Gly Val Asn Lys Ile Ser Val Ser Pro Ser Lys Gly Arg Ile 20 25 30
aat gga acc gtt act att cct ggt age aag agt tta acc aac aga gct Asn Gly Thr Val Thr Ile Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Ala 35 40 45
tta ate ata agt tet cta gct agt gga aag tca aaa gtg caa ggt att Leu Ile Ile Ser Ser Leu Ala Ser Gly Lys Ser Lys Val Gln Gly Ile 50 55 60
tta aaa age gat gat tca ttt tgg tgt tta gac tcc ttg aaa aag cta Leu Lys Ser Asp Asp Ser Phe Trp Cys Leu Asp Ser Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80
gga gta aat gtg aaa att caa gga gat aca gct ttt ate gaa gga aac Gly Val Asn Val Lys Ile Gln Gly Asp Thr Ala Phe Ile Glu Gly Asn 85 90 95
att gea cga ttt cta cct gga gea tta gea gtt tca ggt aca ggc ata Ile Ala Arg Phe Leu Pro Gly Ala Leu Ala Val Ser Gly Thr Gly Ile 115 120 125
tgg gag tta gaa gcc agt aaa agt atg agt aaa cga cct att tca ccc Trp Glu Leu Glu Ala Ser Lys Ser Met Ser Lys Arg Pro Ile Ser Pro 130 135 140
tta gta gat gct tta aaa gag ctt ggg gct gaa ata aca tat cta age Leu Val Asp Ala Leu Lys Glu Leu Gly Ala Glu Ile Thr Tyr Leu Ser 145 150 155 160
48
96
144
192
240
288
ggt ggt aaa tgg gaa tca ggt gat tta tat att ggt gea gea gga acg 336 Gly Gly Lys Trp Glu Ser Gly Asp Leu Tyr Ile Gly Ala Ala Gly Thr 100 105 HO
384
432
480
gat caa ggc tac tat ccg ttg tta gtt aaa gga aaa caa cta aat ggg Asp Gln Gly Tyr Tyr Pro Leu Leu Val Lys Gly Lys Gln Leu Asn Gly 165 170 175
528 ggc gag gtt gaa ctc tca ggt aga att tct agt cag ttt ata agt ggt 576 Gly Glu Val Glu Leu Ser Gly Arg Ile Ser Ser Gln Phe Ile Ser Gly 180 185 190
cta ttg att gcc tcg cct tat tta aat gat cca ate aag att aat att Leu Leu Ile Ala Ser Pro Tyr Leu Asn Asp Pro Ile Lys Ile Asn Ile 195 200 205
aaa gat cac ate gtt caa cac tca tat gta ctc tta act ttg gaa tta Lys Asp His Ile Val Gln His Ser Tyr Val Leu Leu Thr Leu Glu Leu 210 215 220
atg aaa aag ttt ggt gea aaa gtt aaa tac gat agt age cta aaa gaa Het Lys Lys Phe Gly Ala Lys Val Lys Tyr Asp Ser Ser Leu Lys Glu 225 230 235 240
ata gtc gtc tat cca tct aag tac act cca caa gat ata aat tta gaa Ile Val Val Tyr Pro Ser Lys Tyr Thr Pro Gln Asp Ile Asn Leu Glu 245 250 255
gea gat gtt tcc act gea tgt tat ttt ctg gct ctt gct gea gtg acc Ala Asp Val Ser Thr Ala Cys Tyr Phe Leu Ala Leu Ala Ala Val Thr 260 265 270
aac ggt aaa gta caa att gat aat cta act tat gaa aca aaa caa cca Asn Gly Lys Val Gln Ile Asp Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Lys Gln Pro 275 280 285
gat ata aaa atg gtt gat ate ctt gaa cgg atg gga tgc aaa gta aca Asp Ile Lys Met Val Asp Ile Leu Glu Arg Met Gly Cys Lys Val Thr 290 295 300
aga ggt tct tca ttc att gaa ata gag gga gtt agt caa tta aaa ggt Arg Gly Ser Ser Phe Ile Glu Ile Glu Gly Val Ser Gln Leu Lys Gly 305 310 315 320
gga ttt gaa ate tct atg agg gaa atg tct gac caa gtg tta act cta Gly Phe Glu Ile Ser Met Arg Glu Met Ser Asp Gln Val Leu Thr Leu 325 330 335
gea gea att gct cca ttc gea gat gaa cca ata acc ata aaa gac gtt Ala Ala Ile Ala Pro Phe Ala Asp Glu Pro Ile Thr Ile Lys Asp Val 340 345 350
gaa cat ata cgc cat cac gaa tca aat cga ate agt gta cta gtt gat Glu His Ile Arg His His Glu Ser Asn Arg Ile Ser Val Leu Val Asp 355 360 365
tca cta tct agg tta gga att ata gta gaa gaa ttt aaa gat gga cta 1152 Ser Leu Ser Arg Leu Gly Ile Ile Val Glu Glu Phe Lys Asp Gly Leu 370 375 380
aaa gtg tat ccg ggt aat ccg aaa gcc act tta cta gat aca cac gat 1200 Lys Val Tyr Pro Gly Asn Pro Lys Ala Thr Leu Leu Asp Thr His Asp 385 390 395 400
gat cat aga gtt gea atg gea tta tca ctt ata ggt tca aga gtt gaa 1248 Asp His Arg Val Ala Met Ala Leu Ser Leu Ile Gly Ser Arg Val Glu 405 410 415
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104 ggt ata caa ata aat gat cca gga tgt gta tct aaa act tgt cct cag 1296 Gly Ile Gln Ile Asn Asp Pro Gly Cys Val Ser Lys Thr Cys Pro Gln 420 425 430
tat ttt gaa tta ttg gaa aaa cta ggt ttg aat ata att aaa cat tga 1344 Tyr Phe Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gly Leu Asn Ile Ile Lys His * 435 440 445
<210> SEQ ID NO: 8 <211> Comprimento: 447 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<400> Seqüência: 8
Met Lys Asn Gln Asn Phe Asp Ala Lys Ala Arg Ser Pro Trp Thr Pro 1 5 10 15 Leu Lys Gly Val Asn Lys Ile Ser Val Ser Pro Ser Lys Gly Arg Ile 20 25 30 Asn Gly Thr Val Thr Ile Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Ala 35 40 45 Leu Ile 50 Ile Ser Ser Leu Ala 55 Ser Gly Lys Ser Lys 60 Val Gln Gly Ile Leu Lys Ser Asp Asp Ser Phe Trp Cys Leu Asp Ser Leu Lys Lys Leu 65 70 75 80 Gly Val Asn Val Lys Ile Gln Gly Asp Thr Ala Phe Ile Glu Gly Asn 85 90 95 Gly Gly Lys Trp Glu Ser Gly Asp Leu Tyr Ile Gly Ala Ala Gly Thr 100 105 110 Ile Ala Arg 115 Phe Leu Pro Gly Ala 120 Leu Ala Val Ser Gly 125 Thr Gly Ile Trp Glu 130 Leu Glu Ala Ser Lys 135 Ser Met Ser Lys Arg 140 Pro Ile Ser Pro Leu Val Asp Ala Leu Lys Glu Leu Gly Ala Glu Ile Thr Tyr Leu Ser 145 150 155 160 Asp Gln Gly Tyr Tyr Pro Leu Leu Val Lys Gly Lys Gln Leu Asn Gly 165 170 175 Gly Glu Val Glu Leu Ser Gly Arg Ile Ser Ser Gln Phe Ile Ser Gly 180 185 190 Leu Leu Ile 195 Ala Ser Pro Tyr Leu 200 Asn Asp Pro Ile Lys 205 Ile Asn Ile Lys Asp 210 His Ile Val Gln His 215 Ser Tyr Val Leu Leu 220 Thr Leu Glu Leu Met Lys Lys Phe Gly Ala Lys Val Lys Tyr Asp Ser Ser Leu Lys Glu 225 230 235 240 Ile Val Val Tyr Pro 245 Ser Lys Tyr Thr Pro 250 Gln Asp Ile Asn Leu 255 Glu Ala Asp Val Ser 260 Thr Ala Cys Tyr Phe 265 Leu Ala Leu Ala Ala 270 Val Thr Asn Gly Lys 275 Val Gln Ile Asp Asn 280 Leu Thr Tyr Glu Thr 285 Lys Gln Pro Asp Ile 290 Lys Met Val Asp Ile 295 Leu Glu Arg Met Gly 300 Cys Lys Val Thr Arg Gly Ser Ser Phe Ile Glu Ile Glu Gly Val Ser Gln Leu Lys Gly 305 310 315 320 Gly Phe Glu Ile Ser Met Arg Glu Met Ser Asp Gln Val Leu Thr Leu 325 330 335 Ala Ala Ile Ala Pro Phe Ala Asp Glu Pro Ile Thr Ile Lys Asp Val
340 345 350
Glu His Ile Arg His His Glu Ser Asn Arg Ile Ser Val Leu Val Asp
355 360 365
Ser Leu Ser Arg Leu Gly Ile Ile Val Glu Glu Phe Lys Asp Gly Leu
370 375 380
Lys Val Tyr Pro Gly Asn Pro Lys Ala Thr Leu Leu Asp Thr His Asp 385 390 395 400
Asp His Arg Val Ala Met Ala Leu Ser Leu Ile Gly Ser Arg Val Glu
405 410 415
Gly Ile Gln Ile Asn Asp Pro Gly Cys Val Ser Lys Thr Cys Pro Gln
420 425 430
Tyr Phe Glu Leu Leu Glu Lys Leu Gly Leu Asn Ile Ile Lys His 435 440 445
<210> SEQ ID NO: 9 <211> Comprimento: 1344 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg36
<400> Seqüência: 9
atgaagaacc agaacttcga cgccaaggca agaagcccct ggacgccgct caagggcgtc 60 aacaagatct ccgtctcgcc aagcaaagga aggatcaatg gcaccgtcac catccctgga 120 agcaagagct tgacaaatag agctctcatc atcagcagct tagcaagcgg caagagcaag 180 gttcaaggca tcctcaagag cgacgacagc ttctggtgcc tggattcatt gaagaagctc 240 ggcgtcaatg tgaagatcca aggagacacc gccttcattg aaggaaatgg aggaaaatgg 300 gagagtggag atctctacat cggcgccgcc ggcaccattg caagatttct tcctggcgcg 360 ctggcggtga gcggcaccgg catctgggag ctggaggcaa gcaagagcat gagcaagagg 420 cccatctcac cgctggtgga tgctctcaag gagctcggcg ccgagatcac ctacctctct 480 gatcaaggct actacccgct gctggtgaag ggcaagcagc tcaatggagg agaggtggag 540 ctctctggaa ggatcagcag ccagttcatc agcggcctgc tgattgcttc accatatttg 600 aatgatccca tcaagatcaa catcaaggac cacatcgtgc agcacagcta tgtgctgctg 660 acgctggagc tgatgaagaa gttcggcgcc aaggtgaagt acgacagcag cttgaaggag 720 atcgtcgtct acccaagcaa gtacacgccg caggacatca acctggaagc tgatgtttca 780 acagcatgct acttcctggc gctggcggcg gtgacaaatg gcaaggtgca aattgacaac 840 ctcacctacg agaccaagca gccggacatc aagatggtgg acatcctgga gaggatgggc 900 tgcaaggtga caagaggaag cagcttcatc gagattgaag gagtgagcca gctgaagggc 960 ggcttcgaga tctcaatgag ggagatgagc gaccaggtgc tgacgctggc ggccatcgcg 1020 ccatttgctg atgagcccat caccatcaag gatgtggagc acatccgcca tcatgaaagc 1080 aacaggatct ccgtgctggt ggacagcctc tcaaggctgg gcatcatcgt ggaggagttc 1140 aaggatggcc tcaaggtgta ccctggaaat ccaaaggcga cgctgctgga cacccatgat 1200 gatcaccgcg tggcaatggc gctgagcttg attggatcaa gggtggaagg catccagatc 1260 aatgatcctg gctgcgtcag caagacctgc cctcaatatt ttgagctgct ggagaagctg 1320 ggcctcaaca tcatcaagca ctag 1344
<210> SEQ ID NO: 10 <211> Comprimento: 1407 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1407)
<400> Seqüência: 10 atg aca gca tca ccc atg ggc gcg tcc gct gac aac tcc ggc gct gct 48 Met Thr Ala Ser Pro Met Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala Ala 1 5 10 15
ccg cac tgg ccc gcg ccg ttt gcg gag cag ccc gtt gac gcc acg gtc 96 Pro His Trp Pro Ala Pro Phe Ala Glu Gln Pro Val Asp Ala Thr Val 20 25 30
cgc gtg ccg ggc tcc aag tcg ctg acc aac agg tac ctg gtg ctc gcc 144 Arg Val Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Tyr Leu Val Leu Ala 35 40 45
gcg ctg gcc gac ggg ccg tcc cgg ctc cgg gcg ccg ctg cat tcc cgc 192 Ala Leu Ala Asp Gly Pro Ser Arg Leu Arg Ala Pro Leu His Ser Arg 50 55 60
gac tca gcg ctg atg ate gcc gcc ctg cgc cag ctc ggc gcg gac ate 240 Asp Ser Ala Leu Met Ile Ala Ala Leu Arg Gln Leu Gly Ala Asp Ile 65 70 75 80
cgg gag gtg ccg ggc gac ggc gcc ttc ggc ccg gac ctg gag gtg acg 288 Arg Glu Val Pro Gly Asp Gly Ala Phe Gly Pro Asp Leu Glu Val Thr 85 90 95
ccg att ccg gca aac gcc ggg ggt gcc gac gtc gcc ate gac tgc ggc 336 Pro Ile Pro Ala Asn Ala Gly Gly Ala Asp Val Ala Ile Asp Cys Gly 100 105 110
ctg gcc ggg acc gtc atg agg ttt gtt ccg ccg ctg gcg gcg ctc cgc 384 Leu Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Val Pro Pro Leu Ala Ala Leu Arg 115 120 125
age ggt acc acc gtt ttc gac ggc gat ccc cac gcc cgg gag cgc ccg 432 Ser Gly Thr Thr Val Phe Asp Gly Asp Pro His Ala Arg Glu Arg Pro 130 135 140
atg ggg acc ate ate gag gcg ctt gcg ggc ctt ggc gtt acc gtc age 480 Met Gly Thr Ile Ile Glu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Val Thr Val Ser 145 150 155 160
ggc gag gac ggc gga acg cct gct tca ctg ccg ttc cgc gtc gaa ggc 528 Gly Glu Asp Gly Gly Thr Pro Ala Ser Leu Pro Phe Arg Val Glu Gly 165 170 175
acc ggg cag gtc cgc ggc ggg cac ctc gtc ata gac gcc age gcc tcc 576 Thr Gly Gln Val Arg Gly Gly His Leu Val Ile Asp Ala Ser Ala Ser 180 185 190
tcc cag ttc gtc tcc gcg ctg ctg ctg gtg ggg gcc cgg ttc acg gac 624 Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Arg Phe Thr Asp 195 200 205
ggc ctg cat ctg gag cac tcc ggc age acc gtg ccg age ctg gac cac 672 Gly Leu His Leu Glu His Ser Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Asp His 210 215 220
ate aac atg acc ate gct acg ctg cgc ggc gcg ggc gtg gcg gtg gat 720 Ile Asn Met Thr Ile Ala Thr Leu Arg Gly Ala Gly Val Ala Val Asp 225 230 235 240 gac tcc acg ccc aac cac tgg att gtg ggc ccc ggg ccg ate cgc gcc 768 Asp Ser Thr Pro Asn His Trp Ile Val Gly Pro Gly Pro Ile Arg Ala 245 250 255
ttc gac cag cgg ate gag cag gac ctg tcc aac gcc ggc ccg ttc ctg 816 Phe Asp Gln Arg Ile Glu Gln Asp Leu Ser Asn Ala Gly Pro Phe Leu 260 265 270
gcg gcc gcg ctg gea acc ggc ggc acg gtg cgg att ccg gac tgg ccg 864 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Gly Thr Val Arg Ile Pro Asp Trp Pro 275 280 285
gag cac acc acg cag gtg ggt gac atg tgg cgc agt ate ctc agt gac 912 Glu His Thr Thr Gln Val Gly Asp Met Trp Arg Ser Ile Leu Ser Asp 290 295 300
atg ggg gea acc gtc acc ctg cag gac ggc acc ctg acc gtg acc ggc 960 Met Gly Ala Thr Val Thr Leu Gln Asp Gly Thr Leu Thr Val Thr Gly 305 310 315 320
ggc age aaa ate aac ggc gcg gac ttc gcc gag acc age gaa ctg gcg 1008 Gly Ser Lys Ile Asn Gly Ala Asp Phe Ala Glu Thr Ser Glu Leu Ala 325 330 335
ccc acc gtc gct gcg ctc tgc gcg ctg gea tcc ggt ccc tcg cgg ctg 1056 Pro Thr Val Ala Ala Leu Cys Ala Leu Ala Ser Gly Pro Ser Arg Leu 340 345 350
acc ggc ate gcc cac ctc cgg gga cat gag acg gac cgg ctc gcc gcg 1104 Thr Gly Ile Ala His Leu Arg Gly His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala 355 360 365
ctc gtc acc gaa ate aac cgc ctc ggc ggc gat gcc gag gaa acc gcc 1152 Leu Val Thr Glu Ile Asn Arg Leu Gly Gly Asp Ala Glu Glu Thr Ala 370 375 380
gac gga ctc gtc ate cgc ccc gcg gaa ctg cac gcg ggg gtg gtg cac 1200 Asp Gly Leu Val Ile Arg Pro Ala Glu Leu His Ala Gly Val Val His 385 390 395 400
age tac gcg gac cac cgg atg gcc aca gcc gga gcc ate ctc ggc ctg 1248 Ser Tyr Ala Asp His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Ile Leu Gly Leu 405 410 415
gcg gtc agg ggc gtg gaa gtg cag gac ate gcc acc aca tcc aag acc 1296 Ala Val Arg Gly Val Glu Val Gln Asp Ile Ala Thr Thr Ser Lys Thr 420 425 430
atg ccg gac ttc ccc aag ctg tgg gcg gac atg ctc ggc cgg cag acc 1344 Met Pro Asp Phe Pro Lys Leu Trp Ala Asp Met Leu Gly Arg Gln Thr 435 440 445
gat gea gct aca aac aca gcg ggt acc aac acc gcg ggg acc gcc ggt 1392 Asp Ala Ala Thr Asn Thr Ala Gly Thr Asn Thr Ala Gly Thr Ala Gly 450 455 460
ggc acg cag cac tga 1407
Gly Thr Gln His *
465 <210> SEQ ID NO: 11 <211> Comprimento: 468 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<400> Seqüência: 11
Met Thr Ala Ser Pro Met Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala Ala
1 5 10 15
Pro His Trp Pro Ala Pro Phe Ala Glu Gln Pro Val Asp Ala Thr Val
20 25 30
Arg Val Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Tyr Leu Val Leu Ala
35 40 45
Ala Leu Ala Asp Gly Pro Ser Arg Leu Arg Ala Pro Leu His Ser Arg
50 55 60
Asp Ser Ala Leu Met Ile Ala Ala Leu Arg Gln Leu Gly Ala Asp Ile 65 70 75 80
Arg Glu Val Pro Gly Asp Gly Ala Phe Gly Pro Asp Leu Glu Val Thr
85 90 95
Pro Ile Pro Ala Asn Ala Gly Gly Ala Asp Val Ala Ile Asp Cys Gly
100 105 110
Leu Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Val Pro Pro Leu Ala Ala Leu Arg
115 120 125
Ser Gly Thr Thr Val Phe Asp Gly Asp Pro His Ala Arg Glu Arg Pro
130 135 140
Met Gly Thr Ile Ile Glu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Val Thr Val Ser 145 150 155 160
Gly Glu Asp Gly Gly Thr Pro Ala Ser Leu Pro Phe Arg Val Glu Gly
165 170 175
Thr Gly Gln Val Arg Gly Gly His Leu Val Ile Asp Ala Ser Ala Ser
180 185 190
Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Arg Phe Thr Asp
195 200 205
Gly Leu His Leu Glu His Ser Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Asp His
210 215 220
Ile Asn Met Thr Ile Ala Thr Leu Arg Gly Ala Gly Val Ala Val Asp 225 230 235 240
Asp Ser Thr Pro Asn His Trp Ile Val Gly Pro Gly Pro Ile Arg Ala
245 250 255
Phe Asp Gln Arg Ile Glu Gln Asp Leu Ser Asn Ala Gly Pro Phe Leu
260 265 270
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Gly Thr Val Arg Ile Pro Asp Trp Pro
275 280 285
Glu His Thr Thr Gln Val Gly Asp Met Trp Arg Ser Ile Leu Ser Asp
290 295 300
Met Gly Ala Thr Val Thr Leu Gln Asp Gly Thr Leu Thr Val Thr Gly 305 310 315 320
Gly Ser Lys Ile Asn Gly Ala Asp Phe Ala Glu Thr Ser Glu Leu Ala
325 330 335
Pro Thr Val Ala Ala Leu Cys Ala Leu Ala Ser Gly Pro Ser Arg Leu
340 345 350
Thr Gly Ile Ala His Leu Arg Gly His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala
355 360 365
Leu Val Thr Glu Ile Asn Arg Leu Gly Gly Asp Ala Glu Glu Thr Ala
370 375 380
Asp Gly Leu Val Ile Arg Pro Ala Glu Leu His Ala Gly Val Val His 385 390 395 400
Ser Tyr Ala Asp His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Ile Leu Gly Leu 405 410 415 Ala Val Arg Gly Val Glu Val Gln 420
Met Pro Asp Phe Pro Lys Leu Trp 435 440
Asp Ala Ala Thr Asn Thr Ala Gly
450 455
Gly Thr Gln His 465
Asp Ile Ala Thr Thr Ser Lys Thr 425 430
Ala Asp Met Leu Gly Arg Gln Thr 445
Thr Asn Thr Ala Gly Thr Ala Gly 460
<210> SEQ ID NO: 12 <211> Comprimento: 1404 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg37
<400> Seqüência: 12
atgacagctt ctccaatggg cgcctccgcc gacaacagcg gcgccgcgcc gcactggccg 60 gcgcccttcg ccgagcagcc ggtggacgcc accgtccgcg tgcctggaag caagagcctc 120 accaacagat atttggtgct ggcggcgctg gctgatgggc catcaaggct ccgcgcgccg 180 ctgcattcaa gagattcggc gctgatgatc gccgcgctcc gtcagctcgg cgccgacatc 240 agggaggtgc ccggcgacgg cgccttcggc cctgatctgg aggtgacgcc catcccggcc 300 aacgccggcg gcgccgacgt cgccatcgac tgcggcctcg ccggcaccgt gatgaggttc 360 gtgccgccgc tggcggcgct gagatcaggc accaccgtct ttgatggaga tcctcatgca 420 agagaaaggc caatgggcac catcatcgag gcgctcgccg gcctcggcgt caccgtcagc 480 ggcgaggacg gcggcacgcc ggcgtcgctg cccttccgcg tggaaggaac tggtcaagtt 540 cgcggcggcc acctggtgat tgatgcttca gcaagcagcc agttcgtctc ggcgctgctg 600 ctggtgggag caaggttcac cgacggcctc cacctggagc acagcggcag caccgtgcca 660 agcctggatc acatcaacat gaccatcgcc accctccgcg gcgccggcgt cgccgtggat 720 gattcaacgc ccaaccactg gatcgtcggc cccggcccca tcagggcatt tgatcaaaga 780 attgagcaag atctttcaaa tgctggaccc ttcctggcgg cggcgctggc caccggcggc 840 accgtgagga ttccagattg gccggagcac accacccaag ttggtgacat gtggaggagc 900 atcctctccg acatgggcgc caccgtcacc cttcaagatg gcaccttgac cgtcaccggc 960 ggcagcaaga tcaacggcgc cgacttcgcc gagacatcag agctggcgcc gacggtggcg 1020 gcgctctgcg cgctggcttc tgggccaagc cgcctcaccg gcattgctca cctccgcggc 1080 catgaaacag atcggctggc ggcgctggtg acagagatca acaggctcgg cggcgacgcc 1140 gaggagaccg ccgacggcct ggtgatcagg ccggcggagc tacatgctgg agtggtgcac 1200 agctatgctg atcacaggat ggccaccgcc ggcgccatcc tcggcctcgc cgtcagagga 1260 gtggaggtgc aagatatagc aacaacaagc aagaccatgc cggacttccc caagctctgg 1320 gccgacatgc tgggccgcca aacagatgct gccaccaaca ccgccggcac caacaccgcc 1380 ggcaccgccg gcggcaccca gcac 1404
<210> SEQ ID NO: 13 <211> Comprimento: 13 92 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1392)
<400> Seqüência: 13 atg ggc gcg tcc gct gac aac tcc ggc Met Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ser Gly 1 5
gct gct ccg cac tgg ccc gcg 48 Ala Ala Pro His Trp Pro Ala 10 15 ccg ttt gcg gag cag ccc gtt gac gcc acg gtc cgc gtg ccg ggc tcc 96
Pro Phe Ala Glu Gln Pro Val Asp Ala Thr Val Arg Val Pro Gly Ser 20 25 30
aag tcg ctg acc aac agg tac ctg gtg ctc gcc gcg ctg gcc gac ggg 144
Lys Ser Leu Thr Asn Arg Tyr Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Asp Gly 35 40 45
ccg tcc cgg ctc cgg gcg ccg ctg cat tcc cgc gac tca gcg ctg atg 192
Pro Ser Arg Leu Arg Ala Pro Leu His Ser Arg Asp Ser Ala Leu Met
50 55 60
ate gcc gcc ctg cgc cag ctc ggc gcg gac ate cgg gag gtg ccg ggc 240
Ile Ala Ala Leu Arg Gln Leu Gly Ala Asp Ile Arg Glu Val Pro Gly 65 70 75 80
gac ggc gcc ttc ggc ccg gac ctg gag gtg acg ccg att ccg gea aac 288
Asp Gly Ala Phe Gly Pro Asp Leu Glu Val Thr Pro Ile Pro Ala Asn 85 90 95
gcc ggg ggt gcc gac gtc gcc ate gac tgc ggc ctg gcc ggg acc gtc 336
Ala Gly Gly Ala Asp Val Ala Ile Asp Cys Gly Leu Ala Gly Thr Val 100 105 110
atg agg ttt gtt ccg ccg ctg gcg gcg ctc cgc age ggt acc acc gtt 3 84
Met Arg Phe Val Pro Pro Leu Ala Ala Leu Arg Ser Gly Thr Thr Val
115 120 125
ttc gac ggc gat ccc cac gcc cgg gag cgc ccg atg ggg acc ate ate 432
Phe Asp Gly Asp Pro His Ala Arg Glu Arg Pro Met Gly Thr Ile Ile
130 135 140
gag gcg ctt gcg ggc ctt ggc gtt acc gtc age ggc gag gac ggc gga 480
Glu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Val Thr Val Ser Gly Glu Asp Gly Gly 145 150 155 160
acg cct gct tca ctg ccg ttc cgc gtc gaa ggc acc ggg cag gtc cgc 528
Thr Pro Ala Ser Leu Pro Phe Arg Val Glu Gly Thr Gly Gln Val Arg 165 170 175
ggc ggg cac ctc gtc ata gac gcc age gcc tcc tcc cag ttc gtc tcc 57 6
Gly Gly His Leu Val Ile Asp Ala Ser Ala Ser Ser Gln Phe Val Ser 180 185 190
gcg ctg ctg ctg gtg ggg gcc cgg ttc acg gac ggc ctg cat ctg gag 624
Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Arg Phe Thr Asp Gly Leu His Leu Glu
195 200 205
cac tcc ggc age acc gtg ccg age ctg gac cac ate aac atg acc ate 672
His Ser Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Asp His Ile Asn Met Thr Ile
210 215 220
gct acg ctg cgc ggc gcg ggc gtg gcg gtg gat gac tcc acg ccc aac 720
Ala Thr Leu Arg Gly Ala Gly Val Ala Val Asp Asp Ser Thr Pro Asn 225 230 235 240
cac tgg att gtg ggc ccc ggg ccg ate cgc gcc ttc gac cag cgg ate 768
His Trp Ile Val Gly Pro Gly Pro Ile Arg Ala Phe Asp Gln Arg Ile 245 250 255 gag cag gac ctg tcc aac gcc ggc ccg ttc ctg gcg gcc gcg ctg gca 816 Glu Gln Asp Leu Ser Asn Ala Gly Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ala 260 265 270
acc ggc ggc acg gtg cgg att ccg gac tgg ccg gag cac acc acg cag 864 Thr Gly Gly Thr Val Arg Ile Pro Asp Trp Pro Glu His Thr Thr Gln 275 280 285
gtg ggt gac atg tgg cgc agt ate ctc agt gac atg ggg gca acc gtc 912 Val Gly Asp Met Trp Arg Ser Ile Leu Ser Asp Met Gly Ala Thr Val 290 295 300
acc ctg cag gac ggc acc ctg acc gtg acc ggc ggc age aaa ate aac 960 Thr Leu Gln Asp Gly Thr Leu Thr Val Thr Gly Gly Ser Lys Ile Asn 305 310 315 320
ggc gcg gac ttc gcc gag acc age gaa ctg gcg ccc acc gtc gct gcg 1008 Gly Ala Asp Phe Ala Glu Thr Ser Glu Leu Ala Pro Thr Val Ala Ala 325 330 335
ctc tgc gcg ctg gca tcc ggt ccc tcg cgg ctg acc ggc ate gcc cac 1056 Leu Cys Ala Leu Ala Ser Gly Pro Ser Arg Leu Thr Gly Ile Ala His 340 345 350
ctc cgg gga cat gag acg gac cgg ctc gcc gcg ctc gtc acc gaa ate 1104 Leu Arg Gly His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala Leu Val Thr Glu Ile 355 360 365
aac cgc ctc ggc ggc gat gcc gag gaa acc gcc gac gga ctc gtc ate 1152 Asn Arg Leu Gly Gly Asp Ala Glu Glu Thr Ala Asp Gly Leu Val Ile 370 375 380
cgc ccc gcg gaa ctg cac gcg ggg gtg gtg cac age tac gcg gac cac 1200 Arg Pro Ala Glu Leu His Ala Gly Val Val His Ser Tyr Ala Asp His 385 390 395 400
cgg atg gcc aca gcc gga gcc ate ctc ggc ctg gcg gtc agg ggc gtg 1248 Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Ile Leu Gly Leu Ala Val Arg Gly Val 405 410 415
gaa gtg cag gac ate gcc acc aca tcc aag acc atg ccg gac ttc ccc 1296 Glu Val Gln Asp Ile Ala Thr Thr Ser Lys Thr Met Pro Asp Phe Pro 420 425 430
aag ctg tgg gcg gac atg ctc ggc cgg cag acc gat gca gct aca aac 1344 Lys Leu Trp Ala Asp Met Leu Gly Arg Gln Thr Asp Ala Ala Thr Asn 435 440 445
aca gcg ggt acc aac acc gcg ggg acc gcc ggt ggc acg cag cac tga 1392 Thr Ala Gly Thr Asn Thr Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gln His * 450 455 460
<210> SEQ ID NO: 14 <211> Comprimento: 463 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo 19/49
<400> Seqüência: 14
Met Gly Ala Ser Ala Asp Asn Ser Gly Ala Ala Pro His Trp Pro Ala
1 5 10 15
Pro Phe Ala Glu Gln Pro Val Asp Ala Thr Val Arg Val Pro Gly Ser
20 25 30
Lys Ser Leu Thr Asn Arg Tyr Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Asp Gly
35 40 45
Pro Ser Arg Leu Arg Ala Pro Leu His Ser Arg Asp Ser Ala Leu Met
50 55 60
Ile Ala Ala Leu Arg Gln Leu Gly Ala Asp Ile Arg Glu Val Pro Gly 65 70 75 80
Asp Gly Ala Phe Gly Pro Asp Leu Glu Val Thr Pro Ile Pro Ala Asn
85 90 95
Ala Gly Gly Ala Asp Val Ala Ile Asp Cys Gly Leu Ala Gly Thr Val
100 105 110
Met Arg Phe Val Pro Pro Leu Ala Ala Leu Arg Ser Gly Thr Thr Val
115 120 125
Phe Asp Gly Asp Pro His Ala Arg Glu Arg Pro Met Gly Thr Ile Ile
130 135 140
Glu Ala Leu Ala Gly Leu Gly Val Thr Val Ser Gly Glu Asp Gly Gly 145 150 155 160
Thr Pro Ala Ser Leu Pro Phe Arg Val Glu Gly Thr Gly Gln Val Arg
165 170 175
Gly Gly His Leu Val Ile Asp Ala Ser Ala Ser Ser Gln Phe Val Ser
180 185 190
Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Arg Phe Thr Asp Gly Leu His Leu Glu
195 200 205
His Ser Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Asp His Ile Asn Met Thr Ile
210 215 220
Ala Thr Leu Arg Gly Ala Gly Val Ala Val Asp Asp Ser Thr Pro Asn 225 230 235 240
His Trp Ile Val Gly Pro Gly Pro Ile Arg Ala Phe Asp Gln Arg Ile
245 250 255
Glu Gln Asp Leu Ser Asn Ala Gly Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ala
260 265 270
Thr Gly Gly Thr Val Arg Ile Pro Asp Trp Pro Glu His Thr Thr Gln
275 280 285
Val Gly Asp Met Trp Arg Ser Ile Leu Ser Asp Met Gly Ala Thr Val
290 295 300
Thr Leu Gln Asp Gly Thr Leu Thr Val Thr Gly Gly Ser Lys Ile Asn 305 310 315 320
Gly Ala Asp Phe Ala Glu Thr Ser Glu Leu Ala Pro Thr Val Ala Ala
325 330 335
Leu Cys Ala Leu Ala Ser Gly Pro Ser Arg Leu Thr Gly Ile Ala His
340 345 350
Leu Arg Gly His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala Leu Val Thr Glu Ile
355 360 365
Asn Arg Leu Gly Gly Asp Ala Glu Glu Thr Ala Asp Gly Leu Val Ile
370 375 380
Arg Pro Ala Glu Leu His Ala Gly Val Val His Ser Tyr Ala Asp His 385 390 395 400
Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Ile Leu Gly Leu Ala Val Arg Gly Val
405 410 415
Glu Val Gln Asp Ile Ala Thr Thr Ser Lys Thr Met Pro Asp Phe Pro
420 425 430
Lys Leu Trp Ala Asp Met Leu Gly Arg Gln Thr Asp Ala Ala Thr Asn
435 440 445
Thr Ala Gly Thr Asn Thr Ala Gly Thr Ala Gly Gly Thr Gln His 450 455 460 <210> SEQ ID NO: 15
<211> Comprimento: 1239
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1239)
<400> Seqüência: 15
gtg acc gtt aca ccg ccc aat ttc ccc ctc aat ggc aag gtc gcg ccc 48
Val Thr Val Thr Pro Pro Asn Phe Pro Leu Asn Gly Lys Val Ala Pro 1 5 10 15
ccc ggc tcc aaa tcc att acc aac cgc gcc ctg ttg ctg gcg gcc ctg 96 Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu 20 25 30
gcc aag ggc acc age cgt ctc age ggc gcg ctc aag age gac gac acc 144 Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr 35 40 45
cgc cat atg tcg gtg gcc ctg cgc caa atg ggc gtg acc ate gat gag 192 Arg His Met Ser Val Ala Leu Arg Gln Met Gly Val Thr Ile Asp Glu 50 55 60
ccg gac gac acc acc ttc gtt gtc acc ggc aac ggc aaa ctg cac ctg 240 Pro Asp Asp Thr Thr Phe Val Val Thr Gly Asn Gly Lys Leu His Leu 65 70 75 80
ccg tcg caa ccg ctg ttc ctc ggc aat gcc ggt act gcc atg cgc ttt 2 88 Pro Ser Gln Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Phe 85 90 95
ctc acg gct gcg gtg gcc acg gtc gaa ggc acc gtg gtg ctg acc ggc 336 Leu Thr Ala Ala Val Ala Thr Val Glu Gly Thr Val Val Leu Thr Gly 100 105 110
gac gac tac atg caa aaa cgc ccg ate ggc ccg ttg ctg gcg acc ctc 384 Asp Asp Tyr Met Gln Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Leu Ala Thr Leu 115 120 125
ggc cag aac ggc ate cag gtc gac age ccg acc ggt tgc ccg ccg gtc 432 Gly Gln Asn Gly Ile Gln Val Asp Ser Pro Thr Gly Cys Pro Pro Val 130 135 140
acc gtg cat ggc gtg ggc aag ate aag gcc aag cgc ttc gag ate gac 480 Thr Val His Gly Val Gly Lys Ile Lys Ala Lys Arg Phe Glu Ile Asp 145 150 155 160
ggc ggc ctg tcc age cag tac gtg tcg gcg ctg ctg atg ctc gcg gcc 528 Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu Met Leu Ala Ala 165 170 175
tgc ggc gaa gcg ccg att gaa gtg gcg ctg acc ggc aag gac ate ggt Cys Gly Glu Ala Pro Ile Glu Val Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ile Gly 180 185 190
576 gcc cgt ggc tat gtc gac ctg acc ctg gac tgc atg cgc gcc ttc ggt 624
Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Asp Cys Met Arg Ala Phe Gly 195 200 205
gcc cag gtt gaa gcc gtt gac gac acc acc tgg tgc gtg gcc ccg acc 672
Ala Gln Val Glu Ala Val Asp Asp Thr Thr Trp Cys Val Ala Pro Thr 210 215 220
ggc tac ate gcc cac gac tac ctg ate gaa ccc gac gcc tcc gcc gcc 720
Gly Tyr Ile Ala His Asp Tyr Leu Ile Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala
225 230 235 240
act tac ctg tgg gcc gct gaa gtg ttg acc ggg ggg cgc ate gac ate 768
Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu Thr Gly Gly Arg Ile Asp Ile 245 250 255
ggc gtg gcc gcg cag gat ttc acc cag ccg gac gcc aag gcc cag gcc 816
Gly Val Ala Ala Gln Asp Phe Thr Gln Pro Asp Ala Lys Ala Gln Ala 260 265 270
gtg ate gcg cag ttc ccg cat atg caa gcc acg gtg gtc ggc tcg cag 864
Val Ile Ala Gln Phe Pro His Met Gln Ala Thr Val Val Gly Ser Gln 275 280 285
atg cag gac gcc ate ccg acc ctg gcg gtg ctc gcg gct ttc aac aac 912
Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Asn Asn 290 295 300
acg ccg gtg cgt ttc acc gag ttg gcc aac ctg cgg gtc aag gag tgc 960
Thr Pro Val Arg Phe Thr Glu Leu Ala Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys
305 310 315 320
gac cgt gtg cag gea ctg cat gac ggc ctc aat gea ate cgc ccg ggc 1008
Asp Arg Val Gln Ala Leu His Asp Gly Leu Asn Ala Ile Arg Pro Gly 325 330 335
ctg gcg acc ate gaa ggc gac gac ctg ctg gta gcc age gac ccc gea 1056
Leu Ala Thr Ile Glu Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Ser Asp Pro Ala 340 345 350
ttg gcc ggc acc gcg tgc acc gcg ctg ate gac acc cac gcc gac cac 1104
Leu Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Leu Ile Asp Thr His Ala Asp His 355 360 365
cgc ate gcc atg tgc ttt gcc ctg gcc ggg ctg aag gtt tcg ggt att 1152
Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly Leu Lys Val Ser Gly Ile 370 375 380
cgc ate cag gac ccg gat tgc gtg gea aag acc tat ccc gag tac tgg 1200
Arg Ile Gln Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys Thr Tyr Pro Glu Tyr Trp
385 390 395 400
aag gcc ctg ggc agt ctc ggg gtg cag ctg age tat taa 1239
Lys Ala Leu Gly Ser Leu Gly Val Gln Leu Ser Tyr * 405 410
<210> SEQ ID NO: 16 <211> Comprimento: 412 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido <220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<400> Seqüência: 16
Val Thr Val Thr Pro Pro Asn Phe Pro Leu Asn Gly Lys Val Ala Pro 1 5 10 15 Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu 20 25 30 Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr 35 40 45 Arg His Met Ser Val Ala Leu Arg Gln Met Gly Val Thr Ile Asp Glu 50 55 60 Pro Asp Asp Thr Thr Phe Val Val Thr Gly Asn Gly Lys Leu His Leu 65 70 75 80 Pro Ser Gln Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Phe 85 90 95 Leu Thr Ala Ala Val Ala Thr Val Glu Gly Thr Val Val Leu Thr Gly 100 105 110 Asp Asp Tyr Met Gln Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Leu Ala Thr Leu 115 120 125 Gly Gln Asn Gly Ile Gln Val Asp Ser Pro Thr Gly Cys Pro Pro Val 130 135 140 Thr Val His Gly Val Gly Lys Ile Lys Ala Lys Arg Phe Glu Ile Asp 145 150 155 160 Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu Met Leu Ala Ala 165 170 175 Cys Gly Glu Ala Pro Ile Glu Val Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ile Gly 180 185 190 Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Asp Cys Met Arg Ala Phe Gly 195 200 205 Ala Gln Val Glu Ala Val Asp Asp Thr Thr Trp Cys Val Ala Pro Thr 210 215 220 Gly Tyr Ile Ala His Asp Tyr Leu Ile Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala 225 230 235 240 Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu Thr Gly Gly Arg Ile Asp Ile 245 250 255 Gly Val Ala Ala Gln Asp Phe Thr Gln Pro Asp Ala Lys Ala Gln Ala 260 265 270 Val Ile Ala Gln Phe Pro His Met Gln Ala Thr Val Val Gly Ser Gln 275 280 285 Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Asn Asn 290 295 300 Thr Pro Val Arg Phe Thr Glu Leu Ala Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys 305 310 315 320 Asp Arg Val Gln Ala Leu His Asp Gly Leu Asn Ala Ile Arg Pro Gly 325 330 335 Leu Ala Thr Ile Glu Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Ser Asp Pro Ala 340 345 350 Leu Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Leu Ile Asp Thr His Ala Asp His 355 360 365 Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly Leu Lys Val Ser Gly Ile 370 375 380 Arg Ile Gln Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys Thr Tyr Pro Glu Tyr Trp 385 390 395 400 Lys Ala Leu Gly Ser Leu Gly Val Gln Leu Ser Tyr 405 410
<210> SEQ ID NO: 17 <211> Comprimento: 1236 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg38
<400> Seqüência: 17 atgacggtga cgccgccaaa cttcccgctc agcatcacca acagggcgct gctgctggcg ggcgcgctga agagcgacga cacccgtcac accattgatg aacctgatga caccaccttc ccatcacagc cgctcttcct cggcaacgcc gtggccaccg tggaaggaac agtggtgctc attggacctc tactggcgac gctgggccaa tgcccgccgg tgacagttca tggcgtcggc ggcggcctca gcagccaata tgtttcagcg cccatcgagg tggcgctcac cggcaaggac ttggactgca tgagggcctt cggcgctcaa gtggcgccga cgggctacat tgctcatgac acctacctat gggcggcgga ggtgctcacc caagatttca cccaacctga tgccaaggct caagcaacag tggtgggcag ccagatgcaa gccttcaaca acacgccggt gaggttcacc gacagggtgc aagctcttca tgatggcctc gaaggagatg atctgctggt ggcttcagat ctcatcgaca cccacgccga ccaccgcatc gtgagcggca tcaggattca agatccagat aaggcgctgg gcagcctcgg cgtgcagctg
aatggcaagg tggcgccgcc gggcagcaag 60 gcgctggcca agggcacctc aaggctgagc 120 atgagcgtgg cgctgcggca gatgggcgtc 180 gtcgtcaccg gcaatggcaa gctgcatctt 240 ggcaccgcca tgaggttctt gacggcggcg 300 actggagatg actacatgca aaagaggcca 360 aatggcatcc aggtggactc gccgacgggc 420 aagatcaagg ccaagagatt tgagatcgac 480 ctgctgatgc tggcggcctg cggcgaggcg 540 atcggcgcgc gcggctatgt ggacctcacc 600 gtggaggcgg tggatgacac cacctggtgc 660 tacctcatcg agccagatgc ctccgccgcc 720 ggcggcagga tcgacatcgg cgtcgccgct 780 caagctgtga ttgctcaatt tcctcacatg 840 gatgccatcc cgacgctggc ggtgctggcg 900 gagctggcca acctacgagt gaaggaatgt 960 aacgccatca ggccagggct ggccaccatt 1020 ccggcgctcg ccggcaccgc ctgcacggcg 1080 gccatgtgct tcgcgctcgc cggcctcaag 1140 tgtgtggcca agacctaccc ggagtactgg 1200 agctac 1236
<210> SEQ ID NO: 18 <211> Comprimento: 1296 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1296)
<400> Seqüência: 18
atg gac gtt ate gtt aaa cca acc cca tcc ctg aac ggg gaa att gga 48 Met Asp Val Ile Val Lys Pro Thr Pro Ser Leu Asn Gly Glu Ile Gly 1 5 10 15
gct ttg tet tcc aaa aac tac acc aca cgc tac ttg cta gct gct gcg 96 Ala Leu Ser Ser Lys Asn Tyr Thr Thr Arg Tyr Leu Leu Ala Ala Ala 20 25 30
ctg gea gaa ggc aca agt aca ate cat tac ccg gct cat agt gaa gat 144 Leu Ala Glu Gly Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro Ala His Ser Glu Asp 35 40 45
agt gat gct atg cgc aga tgt att cgt gac ctt ggg gcg gtg ctt gaa 192 Ser Asp Ala Met Arg Arg Cys Ile Arg Asp Leu Gly Ala Val Leu Glu 50 55 60
gaa gat gat age aaa ate gtt ate caa gga ttc ggc age cat ccg cgt 240 Glu Asp Asp Ser Lys Ile Val Ile Gln Gly Phe Gly Ser His Pro Arg 65 70 75 80 gat gtg cgt gaa tta aat gta ggc aat gcg ggt gca gtg ctg cgt ttc 288
Asp Val Arg Glu Leu Asn Val Gly Asn Ala Gly Ala Val Leu Arg Phe 85 90 95
ctg atg gga gta acg gca ctt tgt cca gag gtg acg ttt gta aat acg 336
Leu Met Gly Val Thr Ala Leu Cys Pro Glu Val Thr Phe Val Asn Thr 100 105 110
tac ccg gat tct ctt ggc aaa cgc cca cat gat gac ctg ate gat gcg 3 84
Tyr Pro Asp Ser Leu Gly Lys Arg Pro His Asp Asp Leu Ile Asp Ala 115 120 125
ctt ggt cag ctc ggt gtt gag gta cag cac gaa caa gga cgc ttg cca 432
Leu Gly Gln Leu Gly Val Glu Val Gln His Glu Gln Gly Arg Leu Pro 130 135 140
ate acg ate aaa ggg ggt cag gct aag ggt gga cat ate cgt gta tcc 480
Ile Thr Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Gly Gly His Ile Arg Val Ser 145 150 155 160
ggt tct gtc age tcc cag tat ttg age gcg ttg ctg ttt gta act cct 528
Gly Ser Val Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Phe Val Thr Pro 165 170 175
ctt ctg gcc gaa gac age aca att gaa gta tta aac gac ttg aaa tcc 576
Leu Leu Ala Glu Asp Ser Thr Ile Glu Val Leu Asn Asp Leu Lys Ser 180 185 190
aaa gtg gtt att ggt cag acg ctg gaa gta ctg gaa cag gcg ggg att 624
Lys Val Val Ile Gly Gln Thr Leu Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ile 195 200 205
gtc att cat gcg agt gat gat tac atg tcc ttc cgt gta cct ggt ggt 672
Val Ile His Ala Ser Asp Asp Tyr Met Ser Phe Arg Val Pro Gly Gly 210 215 220
caa gct tat aaa ccg caa aca tat acc gtt caa ggc gac tat cca gga 720
Gln Ala Tyr Lys Pro Gln Thr Tyr Thr Val Gln Gly Asp Tyr Pro Gly 225 230 235 240
tca gca gct gtc ctc gcg gcc gcg gct gtc acc caa tca gat gtt aaa 7 68
Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Val Thr Gln Ser Asp Val Lys 245 250 255
att ttg cga ttg atg gaa cag age aaa cag ggt gag cgt gct att gtt 816
Ile Leu Arg Leu Met Glu Gln Ser Lys Gln Gly Glu Arg Ala Ile Val 260 265 270
gac gtt ctg cgt atg atg gaa gtg cca ttg acg cat gag aac gat gtg 864 Asp Val Leu Arg Met Met Glu Val Pro Leu Thr His Glu Asn Asp Val 275 280 285
gta cac gtg caa ggt aac ggt aca ttg aaa gcc gtg gaa ttc gac gga 912
Val His Val Gln Gly Asn Gly Thr Leu Lys Ala Val Glu Phe Asp Gly 290 295 300
gat gcc gcg aca gac gcg gtt ttg gcc atg gta gcg gcg gca gtg ttt 960
Asp Ala Ala Thr Asp Ala Val Leu Ala Met Val Ala Ala Ala Val Phe 305 310 315 320 gcg gaa ggc acc tca cgg ttc tat aat gta gag aac tta cgt tac aag 1008 Ala Glu Gly Thr Ser Arg Phe Tyr Asn Val Glu Asn Leu Arg Tyr Lys 325 330 335
gaa tgt gac cga att acg gat tat ttg aac gaa ctg cgg aag gca gga 1056 Glu Cys Asp Arg Ile Thr Asp Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Lys Ala Gly 340 345 350
gcc aac gta gaa gaa cgt cag gcc gag att ate gta cat ggt cgt ccg 1104 Ala Asn Val Glu Glu Arg Gln Ala Glu Ile Ile Val His Gly Arg Pro 355 360 365
gaa ggc gtc gaa ggc ggc gtt gag att aac gct cac tac gat cat cgc 1152 Glu Gly Val Glu Gly Gly Val Glu Ile Asn Ala His Tyr Asp His Arg 370 375 380
gta att atg gca ctg acc gtt gtt ggt ttg cgt tcc aaa gaa ccg ctt 1200 Val Ile Met Ala Leu Thr Val Val Gly Leu Arg Ser Lys Glu Pro Leu 385 390 395 400
cgt att cgg gat gca cac cat gta gcg aag tet tat cca caa tat ttc 1248 Arg Ile Arg Asp Ala His His Val Ala Lys Ser Tyr Pro Gln Tyr Phe 405 410 415
gat cat ttg cag gcg ctt ggc gcc tcg gtt caa tgg gta aaa gag taa 1296 Asp His Leu Gln Ala Leu Gly Ala Ser Val Gln Trp Val Lys Glu * 420 425 430
<210> SEQ ID NO: 19 <211> Comprimento: 431 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: isolado do solo <400> Seqüência: 19
Met Asp Val Ile Val Lys Pro Thr Pro Ser Leu Asn Gly Glu Ile Gly
1 5 10 15 Ala Leu Ser Ser 20 Lys Asn Tyr Thr Thr 25 Arg Tyr Leu Leu Ala 30 Ala Ala Leu Ala Glu 35 Gly Thr Ser Thr Ile 40 His Tyr Pro Ala His 45 Ser Glu Asp Ser Asp 50 Ala Met Arg Arg Cys 55 Ile Arg Asp Leu Gly 60 Ala Val Leu Glu Glu Asp Asp Ser Lys Ile Val Ile Gln Gly Phe Gly Ser His Pro Arg 65 70 75 80 Asp Val Arg Glu Leu 85 Asn Val Gly Asn Ala 90 Gly Ala Val Leu Arg 95 Phe Leu Met Gly Val 100 Thr Ala Leu Cys Pro 105 Glu Val Thr Phe Val 110 Asn Thr Tyr Pro Asp 115 Ser Leu Gly Lys Arg 120 Pro His Asp Asp Leu 125 Ile Asp Ala Leu Gly 130 Gln Leu Gly Val Glu 135 Val Gln His Glu Gln 140 Gly Arg Leu Pro Ile Thr Ile Lys Gly Gly Gln Ala Lys Gly Gly His Ile Arg Val Ser 145 150 155 160 Gly Ser Val Ser Ser 165 Gln Tyr Leu Ser Ala 170 Leu Leu Phe Val Thr 175 Pro Leu Leu Ala Glu Asp Ser Thr Ile Glu Val Leu Asn Asp Leu Lys Ser
180 185 190
Lys Val Val Ile Gly Gln Thr Leu Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ile
195 200 205
Val Ile His Ala Ser Asp Asp Tyr Met Ser Phe Arg Val Pro Gly Gly
210 215 220
Gln Ala Tyr Lys Pro Gln Thr Tyr Thr Val Gln Gly Asp Tyr Pro Gly 225 230 235 240
Ser Ala Ala Val Leu Ala Ala Ala Ala Val Thr Gln Ser Asp Val Lys
245 250 255
Ile Leu Arg Leu Met Glu Gln Ser Lys Gln Gly Glu Arg Ala Ile Val
260 265 270
Asp Val Leu Arg Met Met Glu Val Pro Leu Thr His Glu Asn Asp Val
275 280 285
Val His Val Gln Gly Asn Gly Thr Leu Lys Ala Val Glu Phe Asp Gly
290 295 300
Asp Ala Ala Thr Asp Ala Val Leu Ala Met Val Ala Ala Ala Val Phe 305 310 315 320
Ala Glu Gly Thr Ser Arg Phe Tyr Asn Val Glu Asn Leu Arg Tyr Lys
325 330 335
Glu Cys Asp Arg Ile Thr Asp Tyr Leu Asn Glu Leu Arg Lys Ala Gly
340 345 350
Ala Asn Val Glu Glu Arg Gln Ala Glu Ile Ile Val His Gly Arg Pro
355 360 365
Glu Gly Val Glu Gly Gly Val Glu Ile Asn Ala His Tyr Asp His Arg
370 375 380
Val Ile Met Ala Leu Thr Val Val Gly Leu Arg Ser Lys Glu Pro Leu 385 390 395 400
Arg Ile Arg Asp Ala His His Val Ala Lys Ser Tyr Pro Gln Tyr Phe
405 410 415
Asp His Leu Gln Ala Leu Gly Ala Ser Val Gln Trp Val Lys Glu 420 425 430
<210> SEQ ID NO: 20 <211> Comprimento: 1293 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg39
<400> Seqüência: 20
atggatgtca tcgtcaagcc gacgccaagc ctcaatggag agatcggcgc gctgagcagc 60 aagaactaca caacaagata tttgctggcg gcggcgctgg cagaaggaac aagcaccatc 120 cactaccctg ctcattcaga agattctgat gccatgagaa gatgcatcag ggacctcggc 180 gccgtgctgg aagaagatga cagcaagatc gtcatccaag gcttcggctc acatccaaga 240 gatgtgaggg agctcaatgt tggaaatgct ggcgccgtgc tgcgcttctt gatgggcgtg 300 acggcgctct gcccggaggt gaccttcgtc aacacctacc ccgacagcct cggcaagagg 360 cctcatgatg acctcatcga cgcgctgggg cagctaggag tggaggtgca gcatgagcaa 420 ggaaggctgc ccatcaccat caagggcggc caagcaaaag gaggccacat cagagtttct 480 ggaagcgtca gctctcagta cctctcggcg ctgctcttcg tgacgccgct gctggcagaa 540 gattccacca tcgaggtgct aaatgacctc aagagcaagg tggtgatcgg ccagacgctg 600 gaggtgctgg agcaagctgg catcgtcatc catgcttcag atgactacat gagcttcaga 660 gttcctggag gacaagccta caagccgcag acctacaccg tccaaggaga ttatcctgga 720 agcgccgccg tgctggccgc cgccgccgtc acccaaagtg atgtgaagat cctccggctg 780 atggagcaat caaagcaagg agaaagggcc atcgtggatg tgctgaggat gatggaggtg 840 ccgctcaccc atgaaaatga tgtggtgcat gttcaaggaa atggcacctt gaaggcggtg 900 gagtttgatg gagatgctgc aacagatgct gtgctggcaa tggtggcggc ggcggtgttt 960 gctgaaggaa catcaagatt ctacaatgtg gagaacttga gatacaagga atgtgacagg 1020 atcaccgact acctcaacga gctgaggaag gccggcgcca atgtggagga gaggcaagct 1080 gagatcattg ttcatggaag gccagaagga tacgaccacc gcgtcatcat ggcgctaaca aggatcagag atgctcatca tgtggccaag gctctcggcg cctccgtgca gtgggtgaag
gtggagggcg gcgtggagat caatgctcac 1140 gtggtggggc tgaggagcaa ggagccgctg 1200 agctaccctc aatattttga tcatcttcaa 1260 gag 1293
<210> SEQ ID NO: 21 <211> Comprimento: 1260 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Rhizobium leguminosarum
<220> Características:
<221> Nome/Chave: CDS
<222> Localização: (1)...(1260)
<400> Seqüência: 21
atg atg atg ggt aga gcc aaa ctc acg att ate ccg ccg ggc aag cct 48 Met Met Met Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ile Pro Pro Gly Lys Pro
1 5 10 15
ttg acc gga cgc gcc atg ccg ccg gga tcg aag tcg ate acc aac cgc 96
Leu Thr Gly Arg Ala Met Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg
20 25 30
gcg ctg ctg ctg gea ggc ctt gcc aag ggc acg age cgg ctg acc ggc 144
Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thr Gly
35 40 45
gcg ctg aaa age gac gat acc cgc tat atg gcc gaa gcg ttg cgc gcc 192
Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg Tyr Met Ala Glu Ala Leu Arg Ala
50 55 60
atg ggc gtt gcg ate gac gag ccc gac gac acc acc ttc ate gtg aca 240
Met Gly Val Ala Ile Asp Glu Pro Asp Asp Thr Thr Phe Ile Val Thr
65 70 75 80
ggc agt ggc aag ctg cag gcg ccg gea gcc cct ctt ttc ctc ggc aat 288
Gly Ser Gly Lys Leu Gln Ala Pro Ala Ala Pro Leu Phe Leu Gly Asn
85 90 95
gcc ggc acg gea acg cgc ttc ctg aca gea gea gea gcg cta gtc gaa 336
Ala Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Val Glu
100 105 110
ggc aag gtc gtc gtt gat ggc gat gcc cat atg cgc aaa cgg ccg ate 384
Gly Lys Val Val Val Asp Gly Asp Ala His Met Arg Lys Arg Pro Ile
115 120 125
ggc ccg ctg gtc gac gcg ctc cgc tcg ctc ggc gtg gac gcc tcg acg 432
Gly Pro Leu Val Asp Ala Leu Arg Ser Leu Gly Val Asp Ala Ser Thr
130 135 140
gaa acc ggc tgc cca ccc gta aca ate aat ggc acc ggc cgt ttc gaa 480
Glu Thr Gly Cys Pro Pro Val Thr Ile Asn Gly Thr Gly Arg Phe Glu
145 150 155 160
gct age cgc gtg cag ate gac ggc ggc ctg tcc age cag tat gtc tcg 528
Ala Ser Arg Val Gln Ile Asp Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser
165 170 175 gcg ctg ttg atg atg gcg gcc ggc ggc gac cgc gcc gtc gat ate gag 576 Ala Leu Leu Met Met Ala Ala Gly Gly Asp Arg Ala Val Asp Ile Glu 180 185 190
ctg ctc ggc gaa cat ate ggt gct ctg gga tac ate gac ctg acc gtt 624 Leu Leu Gly Glu His Ile Gly Ala Leu Gly Tyr Ile Asp Leu Thr Val 195 200 205
gcc gcc atg cgc gcc ttc ggt gcc aag gtc gag cgc gtg age cca gtc 672 Ala Ala Met Arg Ala Phe Gly Ala Lys Val Glu Arg Val Ser Pro Val 210 215 220
gcc tgg cgt gtc gag ccc acc ggc tac cat gct gcc gat ttc ctg ate 720 Ala Trp Arg Val Glu Pro Thr Gly Tyr His Ala Ala Asp Phe Leu Ile 225 230 235 240
gag ccg gat gcc tet gct gcg acc tat ctc tgg gct gcc gaa gtg ctt 768 Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu 245 250 255
ggt ggg ggc aag ate gat ctc ggg acg ccg gcg gaa caa ttc tcg cag 816 Gly Gly Gly Lys Ile Asp Leu Gly Thr Pro Ala Glu Gln Phe Ser Gln 260 265 270
ccg gat gcg aaa gea tat gat ctg ate tcg aaa ttc ccg cat ctg ccc 864 Pro Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Leu Ile Ser Lys Phe Pro His Leu Pro 275 280 285
gcc gtc ate gac ggt tcg cag atg cag gac gcc ate ccg acg ctt gcg 912 Ala Val Ile Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala 290 295 300
gtt ctc gcc gct ttc aac gag acg ccg gtg cgc ttc gtc ggc ate gag 960 Val Leu Ala Ala Phe Asn Glu Thr Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Glu 305 310 315 320
aat ctc cgc gtc aag gaa tgc gat cgt ate cgc gcg ctg tcg age ggc 1008 Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Arg Ala Leu Ser Ser Gly 325 330 335
ctg tcg cgc gtc gtt ccg aac ctc ggc acg gaa gag ggc gac gat ctg 1056 Leu Ser Arg Val Val Pro Asn Leu Gly Thr Glu Glu Gly Asp Asp Leu 340 345 350
ate gtc gea tcc gat ccg age ctc gcc ggc aag acc ctg ccc gea gag 1104 Ile Val Ala Ser Asp Pro Ser Leu Ala Gly Lys Thr Leu Pro Ala Glu 355 360 365
ate gac age ttt gcc gat cat cgc att gcc atg age ttt gcg ctt gcc 1152 Ile Asp Ser Phe Ala Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ala Leu Ala 370 375 380
ggc ctg aag ate ggc ggc ate acc att ctc gac ccc gat tgc gtc gcc 1200 Gly Leu Lys Ile Gly Gly Ile Thr Ile Leu Asp Pro Asp Cys Val Ala 385 390 395 400
aag acc ttc ccg tcc tat tgg aac gtg ctg gct tcg ctt gga gtc aca 1248 Lys Thr Phe Pro Ser Tyr Trp Asn Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Thr 405 410 415 tac gaa gac tga 1260
Tyr Glu Asp *
<210> SEQ ID NO: 22 <211> Comprimento: 419 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Rhizobium leguminosarum
<400> Seqüência: 22
Met Met Met Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ile Pro Pro Gly Lys Pro
1 5 10 15
Leu Thr Gly Arg Ala Met Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg
20 25 30
Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thr Gly
35 40 45
Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg Tyr Met Ala Glu Ala Leu Arg Ala
50 55 60
Met Gly Val Ala Ile Asp Glu Pro Asp Asp Thr Thr Phe Ile Val Thr 65 70 75 80
Gly Ser Gly Lys Leu Gln Ala Pro Ala Ala Pro Leu Phe Leu Gly Asn
85 90 95
Ala Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Val Glu
100 105 110
Gly Lys Val Val Val Asp Gly Asp Ala His Met Arg Lys Arg Pro Ile
115 120 125
Gly Pro Leu Val Asp Ala Leu Arg Ser Leu Gly Val Asp Ala Ser Thr
130 135 140
Glu Thr Gly Cys Pro Pro Val Thr Ile Asn Gly Thr Gly Arg Phe Glu 145 150 155 160
Ala Ser Arg Val Gln Ile Asp Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser
165 170 175
Ala Leu Leu Met Met Ala Ala Gly Gly Asp Arg Ala Val Asp Ile Glu
180 185 190
Leu Leu Gly Glu His Ile Gly Ala Leu Gly Tyr Ile Asp Leu Thr Val
195 200 205
Ala Ala Met Arg Ala Phe Gly Ala Lys Val Glu Arg Val Ser Pro Val
210 215 220
Ala Trp Arg Val Glu Pro Thr Gly Tyr His Ala Ala Asp Phe Leu Ile 225 230 235 240
Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu
245 250 255
Gly Gly Gly Lys Ile Asp Leu Gly Thr Pro Ala Glu Gln Phe Ser Gln
260 265 270
Pro Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Leu Ile Ser Lys Phe Pro His Leu Pro
275 280 285
Ala Val Ile Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala
290 295 300
Val Leu Ala Ala Phe Asn Glu Thr Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Glu 305 310 315 320
Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Arg Ala Leu Ser Ser Gly
325 330 335
Leu Ser Arg Val Val Pro Asn Leu Gly Thr Glu Glu Gly Asp Asp Leu
340 345 350
Ile Val Ala Ser Asp Pro Ser Leu Ala Gly Lys Thr Leu Pro Ala Glu
355 360 365
Ile Asp Ser Phe Ala Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ala Leu Ala
370 375 380
Gly Leu Lys Ile Gly Gly Ile Thr Ile Leu Asp Pro Asp Cys Val Ala 385 390 395 400 Lys Thr Phe Pro Ser Tyr Trp Asn Val Leu Ala Ser Leu Gly Val Thr 405 410 415
Tyr Glu Asp
<210> SEQ ID NO: 23 <211> Comprimento: 1257 <212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência Artificial
<220> Características:
<223> Outras Informações: syngrg50
<400> Seqüência: 23
atgatgatgg gccgcgccaa gctcaccatc atcccgccgg gcaagccgct caccggccgc 60 gccatgccgc cgggcagcaa gagcatcacc aacagggcgc tgctgctggc cggcctcgcc 120 aagggcacct caaggctcac cggcgcgctg aagagcgacg acacccgcta catggcggag 180 gcgctgagag caatgggcgt cgccatcgac gagccagatg acaccacctt catcgtcacc 240 ggctcaggca agctgcaagc gccggcggcg ccgctcttcc tcggcaacgc cggcacggca 300 acaagattct tgacggcggc ggcggcgctg gtggaaggca aggtggtggt ggatggtgat 360 gctcacatga ggaagaggcc aattgggccg ctggtggacg cgctgaggag cctcggcgtg 420 gatgcttcaa cagaaactgg ctgcccgccg gtgaccatca atggaactgg aagatttgaa 480 gcatcaagag ttcagatcga cggcggcctc agctctcaat atgtctcggc gctgctgatg 540 atggccgccg gcggcgaccg cgccgtggac attgagctgc tgggagagca catcggcgcg 600 ctgggctaca tcgacctcac cgtcgccgcc atgagggcct tcggcgccaa ggtggagagg 660 gtgtcaccag tggcatggag ggtggagcca actggctacc atgctgctga cttcctcatc 720 gagccagatg cttctgctgc cacctacctc tgggcggcgg aggtgctggg cggcggcaag 780 atagatcttg ggacgccggc ggagcagttc agccaacctg atgccaaggc ctacgacctc 840 atctcaaaat ttcctcatct tcccgccgtc atcgacggca gccagatgca agatgccatc 900 ccgacgctgg cggtgctggc ggccttcaat gagacgccgg tgaggttcgt cggcatcgag 960 aacctccgcg tcaaggaatg tgacaggatc agggcgctga gcagcggcct ctcaagggtg 1020 gtgcccaacc tcggcacaga agaaggagat gacctcatcg tggcttcaga tccaagcctc 1080 gccggcaaga cgctgccggc ggagatcgac agctttgctg atcaccgcat cgccatgagc 1140 ttcgcgctcg ccggcctcaa gatcggcggc atcaccatcc ttgatccaga ttgtgtggcc 1200 aagaccttcc caagctactg gaatgtgctg gcaagcctcg gcgtcaccta tgaagat 1257
<210> SEQ ID NO: 24 <211> Comprimento: 438 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: : Streptomyces coelicolor A3(2) <400> Seqüência: : 24 Met Thr Val Asn Pro Thr His Thr Ala Leu Trp Pro Ala Pro His Ala 1 5 10 15 Ser Gly Ala Val Asp Ala Thr Val His Val Pro Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 Thr Asn Arg Ala Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Pro Gly Trp 35 40 45 Leu Arg Arg Pro Leu Arg Ser Arg Asp Thr Leu Leu Met Ala Glu Ala 50 55 60 Leu Arg Thr Leu Gly Val Glu Ile Glu Glu Gly Val Gly Pro Glu Gly 65 70 75 80 Thr Gly Glu Phe Trp Arg Val Ile Pro Ala Gly Leu Arg Gly Pro Ala 85 90 95 Thr Val Asp Val Gly Asn Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Leu Pro Pro 100 105 110 Val Ala Thr Leu Ala Asp Gly Ala Val Arg Phe Asp Gly Asp Pro Arg 115 120 125 Ser Tyr Glu Arg Pro Leu His Gly Val Ile Asp Ala Leu Arg Val Leu 130 135 140 Gly Ala Arg Ile Asp Asp Asp Gly Arg Gly Ala Leu Pro Leu Thr Val 145 150 155 160
His Gly Gly Gly Ala Leu Glu Gly Gly Pro Val Glu Ile Asp Ala Ser
165 170 175
Ser Ser Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Ser Gly Pro Arg Phe
180 185 190
Asn Gln Gly Val Glu Val Arg His Thr Gly Ser Ala Leu Pro Ser Met
195 200 205
Pro His Ile Arg Met Thr Val Asp Met Leu Arg Ala Val Gly Ala Gln
210 215 220
Val Asp Thr Pro Glu Ser Gly Gly Glu Pro Asn Val Trp Arg Val Thr 225 230 235 240
Pro Gly Ala Leu Leu Gly Arg Asp Leu Thr Val Glu Pro Asp Leu Ser
245 250 255
Asn Ala Gln Pro Phe Leu Ala Ala Ala Leu Val Thr Gly Gly Lys Val
260 265 270
Val Ile Pro Asp Trp Pro Ser Arg Thr Thr Gln Pro Gly Asp Arg Leu
275 280 285
Arg Glu Ile Phe Thr Asp Met Gly Gly Ser Cys Glu Leu Thr Asp Phe
290 295 300
Gly Leu Val Phe Thr Gly Ser Gly Ala Ile His Gly Ile Asp Val Asp 305 310 315 320
Leu Ser Glu Val Gly Glu Leu Thr Pro Gly Ile Ala Ala Val Ala Ala
325 330 335
Leu Ala Asp Ser Pro Ser Thr Leu Arg Gly Val Ala His Leu Arg Leu
340 345 350
His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala Leu Thr Lys Glu Ile Asn Glu Leu
355 360 365
Gly Gly Asp Val Thr Glu Thr Ala Asp Gly Leu His Ile Arg Pro Arg
370 375 380
Arg Leu His Gly Gly Val Phe His Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala 385 390 395 400
Thr Ala Gly Ala Val Leu Gly Leu Ala Val Glu Gly Val Gln Ile Glu
405 410 415
Asn Val Ala Thr Thr Ala Lys Thr Leu Pro Asp Phe Pro Asp Leu Trp
420 425 430
Thr Gly Met Leu Gly Ala 435
<210> SEQ ID NO: 25 <211> Comprimento: 446 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Streptomyces avermitilis MA-4680 <400> Seqüência: 25
Met Thr Val Asn Pro Ala His Thr Ala Leu Trp Pro Ala Pro His Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ala Val Asp Ala Thr Val His Val Pro Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
Thr Asn Arg Ala Leu Val Leu Ala Ala Leu Ala Ser Glu Pro Gly Trp
35 40 45
Leu Arg Arg Pro Leu Arg Ser Arg Asp Thr Leu Leu Met Ala Ala Ala
50 55 60
Leu Arg Glu Met Gly Val Gly Ile Glu Glu Thr Val Ser Ser Ser Ser 65 70 75 80
Ser Val Gly Gly Gly Ser Asp Gly Ser Gly Glu Ala Trp Arg Val Ile
85 90 95
Pro Ala Ala Leu His Gly Pro Ala Thr Val Asp Val Gly Asn Ala Gly 100 105 110 Thr Val Met Arg Phe Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu Ala Asp Gly Pro
115 120 125
Ile Arg Phe Asp Gly Asp Pro Arg Ser Tyr Glu Arg Pro Leu Asn Gly
130 135 140
Val Ile Asp Ala Leu Arg Ala Leu Gly Ala Arg Ile Asp Asp Asp Gly 145 150 155 160
Arg Gly Ala Leu Pro Leu Thr Val His Gly Gly Gly Ala Leu Asp Gly
165 170 175
Gly Pro Val Ala Ile Asp Ala Ser Ser Ser Ser Gln Phe Val Ser Ala
180 185 190
Leu Leu Leu Ser Gly Pro Arg Phe Asn Gln Gly Val Glu Val Arg His
195 200 205
Thr Gly Ser Thr Leu Pro Ser Met Pro His Ile Arg Met Thr Val Asp
210 215 220
Met Leu Arg Ala Val Gly Ala Gln Val Asp Thr Pro Glu Ser Gly Gly 225 230 235 240
Glu Ala Asn Val Trp Arg Val Thr Pro Gly Ala Leu Leu Gly Arg Asp
245 250 255
Leu Thr Val Glu Pro Asp Leu Ser Asn Ala Gln Pro Phe Leu Ala Ala
260 265 270
Ala Leu Val Thr Gly Gly Lys Val Val Ile Pro Asp Trp Pro Glu Arg
275 280 285
Thr Thr Gln Pro Gly Asp Lys Leu Arg Glu Ile Phe Thr Glu Met Gly
290 295 300
Gly Ser Cys Glu Leu Thr Glu Gln Gly Leu Glu Phe Thr Gly Ser Gly 305 310 315 320
Ala Val His Gly Ile Asp Val Asp Leu Ser Glu Val Gly Glu Leu Thr
325 330 335
Pro Gly Ile Ala Ala Val Ala Ala Leu Ala Asp Ser Pro Ser Thr Leu
340 345 350
Arg Gly Val Ala His Leu Arg Leu His Glu Thr Asp Arg Leu Ala Ala
355 360 365
Leu Thr Lys Glu Ile Asn Glu Leu Gly Gly Asp Val Thr Glu Thr Ala
370 375 380
Asp Gly Leu Ser Ile Arg Pro Arg Arg Leu His Gly Gly Ile Phe His 385 390 395 400
Thr Tyr Asp Asp His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Ile Ile Gly Leu
405 410 415
Ala Val Asp Gly Val Gln Ile Glu Asn Val Ala Thr Thr Ala Lys Thr
420 425 430
Leu Pro Asp Phe Pro Asp Leu Trp Thr Gly Met Leu Gly Asn 435 440 445
<210> SEQ ID NO: 26 <211> Comprimento: 447 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Bacillus halodurans C-125 <400> Seqüência: 26
Met Thr Arg Phe Asp Glu Asn Ala Arg Ser Pro Trp Thr Pro Leu His
1 5 10 15
Asp Val Lys Thr Val Glu Leu Phe Pro Leu Asn Gln Arg Leu Asp Gly
20 25 30
Ser Ile Thr Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Ala Leu Ile
35 40 45
Ile Ser Ala Leu Ala Asn Ser Asp Ser Met Leu Thr Gly Met Leu Lys
50 55 60
Ser Asp Asp Thr Tyr Trp Cys Ile Gln Ala Leu Lys Arg Leu Gly Val 65 70 75 80 Gln Ile Asn Val Gln Gly Glu Thr Thr Ser Ile Arg Gly Ile Gly Gly 85 90 95 Gln Trp Lys Ser Ser Ser Leu Tyr Ile Gly Ala Ala Gly Thr Leu Ala 100 105 110 Arg Phe Leu Leu Gly Ala Leu Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asn Trp Glu 115 120 125 Ile Glu Ala Ser Gln Ser Met Ser Lys Arg Pro Ile Glu Pro Leu Val 130 135 140 Gly Val Leu Arg Glu Leu Gly Ala Thr Ile His Tyr Leu Arg Arg Glu 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Pro Leu Ser Ile His Gly Asn Gly Leu Ala Gly Gly Thr 165 170 175 Val Arg Leu Ser Gly Gln Met Ser Ser Gln Tyr Ile Ser Gly Leu Leu 180 185 190 Ile Ala Ala Pro Tyr Ala Asp Thr Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Gly 195 200 205 Ser Ile Val Gln His Ala Tyr Val Phe Leu Thr Leu His Leu Met Lys 210 215 220 Ser Phe Gly Ala Gln Val Glu Tyr Asp Gln Gln Leu Gln Thr Ile Val 225 230 235 240 Val His Pro Thr Pro Tyr Thr Cys Gln Asp Ile Asp Leu Glu Ala Asp 245 250 255 Ala Ser Thr Ala Cys Tyr Phe Leu Ala Leu Ala Ala Leu Thr Lys Gly 260 265 270 Arg Ile Arg Leu Asn Asn Leu Thr Ala Ser Thr Thr Gln Pro Asp Leu 275 280 285 His Met Leu Thr Val Phe Glu Lys Met Gly Cys Thr Val Thr Arg Gly 290 295 300 Ser Ser Phe Ile Glu Leu Glu Gly Val Ser Gln Leu Lys Gly Gly Phe 305 310 315 320 Gln Ile Ser Met Asn Glu Met Ser Asp Gln Ala Leu Thr Leu Ala Ala 325 330 335 Ile Ala Pro Phe Ala Asp Gly Pro Ile Thr Ile Thr Asp Val Glu His 340 345 350 Ile Arg Tyr His Glu Ser Asp Arg Ile Ala Val Ile Cys Glu Ala Leu 355 360 365 Thr Arg Leu Gly Ile Gln Val Asp Glu Phe Glu Asp Gly Leu Thr Val 370 375 380 Tyr Pro Gly Thr Pro Lys Pro Thr Leu His Pro Leu Ser Thr Tyr Asp 385 390 395 400 Asp His Arg Val Ala Met Ser Leu Ser Leu Ile Gly Thr Lys Val Lys 405 410 415 Gly Leu Arg Leu Asn Asp Pro Gly Cys Val Ala Lys Thr Cys Pro Ser 420 425 430 Tyr Phe Gln Leu Leu Glu Gln Leu Gly Ile Gln Val His Tyr Gln 435 440 445
<210> SEQ ID NO: 27 <211> Comprimento: 446 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Bacillus clausii KSM-Kl6 <400> Seqüência: 27
Het Val Gln Phe Asp Ser Gln Ala Arg Ser Pro 1 5 10 Gly Val Glu Arg Leu Arg Leu Thr Pro Ser Gln
20 25
Thr Leu Glu Val Pro Gly Ser Lys Ser Ala Thr 35 40
Trp Thr Pro Leu Ala 15
Lys Arg Ile Asn Ala 30
Asn Arg Ala Leu Leu 45 Leu Ala Ala Val Ala Ser Gly Thr Ser Thr Leu Arg Asn Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Asp Asp Thr Tyr Trp Cys Ile Glu Ala Leu Lys Lys Thr Gly Val 65 70 75 80 Glu Ile Ala Val Asp Gly Ser Asn Val Thr Val Tyr Gly Arg Gly Gly 85 90 95 Val Phe His Ser Gly Ser Leu Tyr Ile Gly Ser Ala Gly Thr Ala Gly 100 105 110 Arg Phe Leu Pro Gly Met Leu Ala Ala Ala Thr Gly Asn Trp His Val 115 120 125 Glu Ala Ser His Ser Met Asn Lys Arg Pro Ile Ala Pro Leu Val Lys 130 135 140 Thr Leu Gln Ala Leu Gly Ala Asn Ile Gln Tyr Gly Ser Arg Arg Gly 145 150 155 160 His Tyr Pro Leu Ser Ile Ser Gly Glu Gly Leu Asn Gly Gly Lys Val 165 170 175 Asn Met Ser Gly Gln Leu Ser Ser Gln Phe Ile Ser Gly Cys Leu Leu 180 185 190 Ala Ala Pro Leu Ala Lys Asn Pro Val Ser Ile Thr Val Lys Asp Gly 195 200 205 Ile Val Gln Gln Ala Tyr Val Arg Ile Thr Ile Asp Leu Met Ala Ala 210 215 220 Phe Gly Val Glu Val Lys Ala Ala Pro Asp Trp Ser Leu Leu Glu Val 225 230 235 240 Asn Pro Ser Pro Tyr Val Ala Asn Asp Ile Ala Ile Glu Ala Asp Ala 245 250 255 Ser Thr Ala Cys Tyr Phe Leu Ala Leu Ala Ala Ile Thr Ala Gly Lys 260 265 270 Ile Arg Ile Arg His Phe Ser Thr Lys Thr Ser Gln Pro Asp Ile Leu 275 280 285 Phe Val Ser Ile Leu Lys Arg Met Gly Cys Asn Phe Glu Ile Gly Pro 290 295 300 Ser Phe Val Glu Gly Glu Gly Pro Thr Arg Leu Arg Gly Gly Phe Thr 305 310 315 320 Val Asn Met Asn Glu Leu Ser Asp Gln Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ile 325 330 335 Ser Pro Phe Ala Asp Gly Pro Ile Ala Ile Glu Gly Val Gly His Ile 340 345 350 Arg His His Glu Cys Asp Arg Ile Arg Ala Ile Cys Thr Glu Leu Ser 355 360 365 Arg Leu Gly Ile Arg Val Glu Glu Arg His Asp Gly Leu Thr Val Tyr 370 375 380 Pro Gly Gln Pro Lys Pro Thr Val Val Asn Thr Tyr Asp Asp His Arg 385 390 395 400 Met Ala Met Ala Leu Ala Leu Ile Gly Ala Lys Val Asp Gly Ile Glu 405 410 415 Leu Asp Asp Pro Gly Cys Val Ala Lys Thr Cys Pro Ser Tyr Phe Ser 420 425 430 Met Leu Ala Gln Thr Gly Ile Gly Val Lys Ala Val Ser Pro 435 440 445 <210> SEQ ID NO: : 28
<211> Comprimento: 460 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Arthrobacter sp. FB24
<400> Seqüência: 28
Met Thr Gly Thr Ala Pro Thr Glu Ser Ala Thr Ser Gly Pro Val Ala 1 5 10 15 Asp Val Pro His Trp Pro Ala Pro Phe Ala Glu Ala Pro Val Asp Ala
20 25 30
Thr Val Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Leu Thr Asn Arg Tyr Leu Val
35 40 45
Leu Ala Ala Leu Ala Asp Gly Pro Ser Arg Leu Arg Ala Pro Leu His
50 55 60
Ser Arg Asp Ser Ala Leu Met Ile Glu Ala Leu Arg Gln Leu Gly Ala 65 70 75 80
Gly Ile Arg Glu Val His Ser Asp Gly Ala Phe Gly Pro Asp Leu Glu
85 90 95
Val Thr Pro Leu Arg Ala Asp Ala Ala Ala Thr Asp Ala Ala Ile Asp
100 105 110
Cys Gly Leu Ala Gly Thr Val Met Arg Phe Val Pro Pro Val Ala Ala
115 120 125
Leu Arg Asn Gly Ala Thr Val Phe Asp Gly Asp Pro His Ala Arg Lys
130 135 140
Arg Pro Met Gly Thr Ile Ile Glu Ala Leu Ala Ala Leu Gly Val Asp 145 150 155 160
Val Arg Ala Ala Asp Gly Thr Pro Pro Ser Ala Leu Pro Phe Thr Val
165 170 175
Ala Gly Ser Gly His Val Arg Gly Gly His Leu Val Ile Asp Ala Ser
180 185 190
Ala Ser Ser Gln Phe Val Ser Ala Leu Leu Leu Val Gly Ala Arg Phe
195 200 205
Thr Glu Gly Leu His Leu Glu His Val Gly Lys Pro Val Pro Ser Leu
210 215 220
Asp His Ile Asn Met Thr Val Ala Val Leu Arg Glu Val Gly Val Ser 225 230 235 240
Val Asp Asp Ser Val Pro Asn His Trp Val Val Ala Pro Gly Arg Ile
245 250 255
Arg Ala Phe Asp Arg Arg Ile Glu Gln Asp Leu Ser Asn Ala Gly Pro
260 265 270
Phe Leu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Arg Gly Thr Val Arg Ile Pro Asn
275 280 285
Trp Pro Ser Pro Thr Thr Gln Val Gly Asp Leu Trp Arg Ser Ile Leu
290 295 300
Thr Ala Met Gly Ala Thr Val Thr Leu Asp Asn Gly Thr Leu Thr Val 305 310 315 320
Thr Gly Gly Pro Glu Ile Thr Gly Ala Asp Phe Ala Asp Thr Ser Glu
325 330 335
Leu Ala Pro Thr Val Ala Ala Leu Cys Ala Leu Ala Thr Gly Pro Ser
340 345 350
Arg Leu Thr Gly Ile Ala His Leu Arg Gly His Glu Thr Asp Arg Leu
355 360 365
Ala Ala Leu Val Thr Glu Ile Asn Arg Leu Gly Gly Asp Ala Glu Glu
370 375 380
Thr Ser Asp Gly Leu Val Ile Arg Pro Ala Lys Leu His Gly Gly Val 385 390 395 400
Val His Ser Tyr Ala Asp His Arg Met Ala Thr Ala Gly Ala Ile Leu
405 410 415
Gly Leu Ala Val Pro Gly Val Glu Val Glu Asp Ile Gly Thr Thr Ser
420 425 430
Lys Thr Met Pro Asp Phe Pro Gln Leu Trp Glu Ser Met Leu Thr Gln
435 440 445
Gln Pro Gly Arg Gln Thr Glu Gln Ala Arg Gly Ala 450 455 460
<210> SEQ ID NO: 29 <211> Comprimento: 419 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Brevundomonas vesicularis
<400> Seqüência: : 29 Met Met Met Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ile Pro Pro Gly Lys Pro 1 5 10 15 Leu Thr Gly Arg Ala Met Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg 20 25 30 Ala Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thr Gly 35 40 45 Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg Tyr Met Ala Glu Ala Leu Arg Ala 50 55 60 Met Gly Val Thr Ile Asp Glu Pro Asp Asp Thr Thr Phe Ile Val Lys 65 70 75 80 Gly Ser Gly Lys Leu Gln Pro Pro Ala Ala Pro Leu Phe Leu Gly Asn 85 90 95 Ala Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Val Asp 100 105 110 Gly Lys Val Ile Val Asp Gly Asp Ala His Met Arg Lys Arg Pro Ile 115 120 125 Gly Pro Leu Val Asp Ala Leu Arg Ser Leu Gly Ile Asp Ala Ser Ala 130 135 140 Glu Thr Gly Cys Pro Pro Val Thr Ile Asn Gly Thr Gly Arg Phe Glu 145 150 155 160 Ala Ser Arg Val Gln Ile Asp Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser 165 170 175 Ala Leu Leu Met Met Ala Ala Gly Gly Asp Arg Ala Val Asp Val Glu 180 185 190 Leu Leu Gly Glu His Ile Gly Ala Leu Gly Tyr Ile Asp Leu Thr Val 195 200 205 Ala Ala Met Arg Ala Phe Gly Ala Lys Val Glu Arg Val Ser Pro Val 210 215 220 Ala Trp Arg Val Glu Pro Thr Gly Tyr His Ala Ala Asp Phe Val Ile 225 230 235 240 Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu 245 250 255 Ser Gly Gly Lys Ile Asp Leu Gly Thr Pro Ala Glu Gln Phe Ser Gln 260 265 270 Pro Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Leu Ile Ser Lys Phe Pro His Leu Pro 275 280 285 Ala Val Ile Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala 290 295 300 Val Leu Ala Ala Phe Asn Glu Met Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Glu 305 310 315 320 Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Arg Ala Leu Ser Ser Gly 325 330 335 Leu Ser Arg Ile Val Pro Asn Leu Gly Thr Glu Glu Gly Asp Asp Leu 340 345 350 Ile Ile Ala Ser Asp Pro Ser Leu Ala Gly Lys Ile Leu Thr Ala Glu 355 360 365 Ile Asp Ser Phe Ala Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ala Leu Ala 370 375 380 Gly Leu Lys Ile Gly Gly Ile Thr Ile Leu Asp Pro Asp Cys Val Ala 385 390 395 400 Lys Thr Phe Pro Ser Tyr Trp Asn Val Leu Ser Ser Leu Gly Val Ala 405 410 415 Tyr Glu Asp
<210> SEQ ID NO: 3 0 <211> Comprimento: 444 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Ochrobactrum/Brucella cepa C58
<400> Seqüência: 30
Met Ala Cys Leu Pro Asp Asp Ser Gly Pro His Val Gly His Ser Thr 1 5 10 15 Pro Pro Cys Leu Asp Gln Glu Pro Cys Thr Leu Ser Ser Gln Lys Thr 20 25 30 Val Thr Val Thr Pro Pro Asn Phe Pro Leu Thr Gly Lys Val Ala Pro 35 40 45 Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu 50 55 60 Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr 65 70 75 80 Arg His Met Ser Val Ala Leu Arg Gln Met Gly Val Thr Ile Asp Glu 85 90 95 Pro Asp Asp Thr Thr Phe Val Val Thr Ser Gln Gly Ser Leu Gln Leu 100 105 110 Pro Ala Gln Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Phe 115 120 125 Leu Thr Ala Ala Val Ala Thr Val Gln Gly Thr Val Val Leu Asp Gly 130 135 140 Asp Glu Tyr Met Gln Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Leu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Gly Gln Asn Gly Ile Gln Val Asp Ser Pro Thr Gly Cys Pro Pro Val 165 170 175 Thr Val His Gly Ala Gly Lys Val Gln Ala Arg Arg Phe Glu Ile Asp 180 185 190 Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu Met Leu Ala Ala 195 200 205 Cys Gly Glu Ala Pro Ile Glu Val Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ile Gly 210 215 220 Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Asp Cys Met Arg Ala Phe Gly 225 230 235 240 Ala Gln Val Asp Ile Val Asp Asp Thr Thr Trp Arg Val Ala Pro Thr 245 250 255 Gly Tyr Thr Ala His Asp Tyr Leu Ile Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala 260 265 270 Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu Thr Gly Gly Arg Ile Asp Ile 275 280 285 Gly Val Ala Ala Gln Asp Phe Thr Gln Pro Asp Ala Lys Ala Gln Ala 290 295 300 Val Ile Ala Gln Phe Pro Asn Met Gln Ala Thr Val Val Gly Ser Gln 305 310 315 320 Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Asn Asn 325 330 335 Thr Pro Val Arg Phe Thr Glu Leu Ala Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys 340 345 350 Asp Arg Val Gln Ala Leu His Asp Gly Leu Asn Glu Ile Arg Pro Gly 355 360 365 Leu Ala Thr Ile Glu Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Ser Asp Pro Ala 370 375 380 Leu Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Leu Ile Asp Thr His Ala Asp His 385 390 395 400 Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly Leu Lys Val Ser Gly Ile 405 410 415 Arg Ile Gln Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys Thr Tyr Pro Asp Tyr Trp 420 425 430 Lys Ala Leu Ala Ser Leu Gly Val His Leu Ser Tyr 435 440 <210> SEQ ID NO: 31 <211> Comprimento: 425 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Agrobacterium tumefaciens cepa C58 <400> Seqüência: 31
Met Ile Glu Leu Thr Ile Thr Pro Pro Gly His Pro Leu Ser Gly Lys
1 5 10 15
Val Glu Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Lys Gly Lys Ser Arg Leu Thr Gly Ala Leu Lys Ser
35 40 45
Asp Asp Thr Leu Tyr Met Ala Glu Ala Leu Arg Glu Met Gly Val Lys
50 55 60
Val Thr Glu Pro Asp Ala Thr Thr Phe Val Val Glu Ser Ser Gly Gly 65 70 75 80
Leu His Gln Pro Glu Lys Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala
85 90 95
Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Ala Ala Leu Val Asp Gly Ala Val Ile
100 105 110
Ile Asp Gly Asp Glu His Met Arg Lys Arg Pro Ile Met Pro Leu Val
115 120 125
Glu Ala Leu Arg Ser Leu Gly Val Glu Ala Glu Ala Pro Thr Gly Cys
130 135 140
Pro Pro Val Thr Val Cys Gly Lys Gly Thr Gly Phe Pro Lys Gly Ser 145 150 155 160
Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu
165 170 175
Met Ala Ala Ala Cys Gly Asp Lys Pro Val Asp Ile Ile Leu Lys Gly
180 185 190
Glu Glu Ile Gly Ala Lys Gly Tyr Ile Asp Leu Thr Thr Ser Ala Met
195 200 205
Glu Ala Phe Gly Ala Lys Val Glu Arg Val Ser Asn Ala Ile Trp Arg
210 215 220
Val His Pro Thr Gly Tyr Thr Ala Thr Asp Phe His Ile Glu Pro Asp 225 230 235 240
Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Gly Ala Glu Leu Leu Thr Gly Gly
245 250 255
Ala Ile Asp Ile Gly Thr Pro Ala Asp Lys Phe Thr Gln Pro Asp Ala
260 265 270
Lys Ala His Glu Val Met Ala Gln Phe Pro His Leu Pro Ala Glu Ile
275 280 285
Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Ile Ala Val Leu Ala
290 295 300
Ala Phe Asn Glu Thr Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Ala Asn Leu Arg 305 310 315 320
Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Arg Ala Val Ser Leu Gly Leu Asn Glu
325 330 335
Ile Arg Asp Gly Leu Ala His Glu Glu Gly Asp Asp Leu Ile Val His
340 345 350
Ser Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gln Thr Val Asn Ala Ser Ile Asp Thr
355 360 365
Phe Ala Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ala Leu Ala Ala Leu Lys
370 375 380
Ile Gly Gly Ile Ala Ile Gln Asn Pro Ala Cys Val Gly Lys Thr Tyr 385 390 395 400
Pro Gly Tyr Trp Lys Ala Leu Ala Ser Leu Gly Val Glu Tyr Ser Glu
405 410 415
Lys Glu Thr Ala Ala Glu Pro Gln His 420 425 <210> SEQ ID NO: 32 <211> Comprimento: 418 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Pseudomonas syringae cepa 1448a <400> Seqüência: 32
Met Arg Pro Gln Ala Thr Leu Thr Val Leu Pro Val Glu Arg Pro Leu
1 5 10 15
Val Gly Arg Val Ser Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala
20 25 30
Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thr Gly Ala
35 40 45
Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg Val Met Ser Glu Ala Leu Arg Leu Met
50 55 60
Gly Val Gln Val Asp Glu Pro Asp Asp Ser Thr Phe Val Val Thr Ser 65 70 75 80
Ser Gly His Trp Gln Ala Pro Gln Gln Ala Leu Phe Leu Gly Asn Ala
85 90 95
Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Leu Ala Asn Phe Glu Gly
100 105 110
Asp Phe Val Val Asp Gly Asp Glu Tyr Met Arg Lys Arg Pro Ile Gly
115 120 125
Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Arg Met Gly Val Glu Val Ser Ala Pro
130 135 140
Ser Gly Cys Pro Pro Val Ala Ile Lys Gly Lys Gly Gly Leu Glu Ala 145 150 155 160
Gly Arg Ile Glu Ile Asp Gly Asn Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala
165 170 175
Leu Leu Met Ala Gly Ala Cys Gly Lys Gly Pro Val Glu Val Ala Leu
180 185 190
Thr Gly Ser Glu Ile Gly Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Ala
195 200 205
Ala Met Gln Ala Phe Gly Ala Glu Val Gln Ala Ile Gly Glu Thr Ala
210 215 220
Trp Lys Val Ser Ala Thr Gly Tyr Arg Ala Thr Asp Phe His Ile Glu 225 230 235 240
Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Gln Ala Leu Thr
245 250 255
Glu Gly Asp Ile Asp Leu Gly Val Ala Ser Asp Ala Phe Thr Gln Pro
260 265 270
Asp Ala Leu Ala Ser Gln Ile Ile Ala Ser Phe Pro Asn Met Pro Ala
275 280 285
Val Ile Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val
290 295 300
Leu Ala Ala Phe Asn Arg Gln Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Ala Asn 305 310 315 320
Leu Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Ala Leu Ser His Gly Leu
325 330 335
Cys Ala Ile Ala Pro Gly Leu Ala Val Glu Glu Gly Asp Asp Leu Leu
340 345 350
Val His Ala Asn Pro Ala Leu Ala Gly Thr Thr Val Asp Ala Leu Ile
355 360 365
Asp Thr His Ser Asp His Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly
370 375 380
Leu Lys Ile Ala Gly Ile Arg Ile Leu Asp Pro Asp Cys Val Gly Lys 385 390 395 400
Thr Tyr Pro Gly Tyr Trp Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Val Arg Val 405 410 415
Gln Arg <210> SEQ ID NO: 33 <211> Comprimento: 418 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Pseudomonas syringae cepa DC3000 <400> Seqüência: 33
Met Arg Pro Gln Ala Thr Leu Thr Val Met Pro Val Glu Arg Pro Leu
1 5 10 15
Val Gly Arg Val Ser Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala
20 25 30
Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thr Gly Ala
35 40 45
Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg Val Met Ser Glu Ala Leu Arg Leu Met
50 55 60
Gly Val Gln Val Asp Glu Pro Asp Asp Ser Thr Phe Val Val Thr Ser 65 70 75 80
Ser Gly His Trp Gln Ala Pro Gln Gln Ala Leu Phe Leu Gly Asn Ala
85 90 95
Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Leu Ala Asn Phe Glu Gly
100 105 110
Asp Phe Val Val Asp Gly Asp Glu Tyr Met Arg Lys Arg Pro Ile Gly
115 120 125
Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Arg Met Gly Val Glu Ile Ser Ala Pro
130 135 140
Ser Gly Cys Pro Pro Val Ala Ile Lys Gly Lys Gly Gly Leu Gln Ala 145 150 155 160
Gly Arg Ile Glu Ile Asp Gly Asn Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala
165 170 175
Leu Leu Met Ala Gly Ala Cys Gly Lys Gly Ser Leu Glu Val Ala Leu
180 185 190
Thr Gly Ser Glu Ile Gly Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Ala
195 200 205
Ala Met Gln Ala Phe Gly Ala Glu Val Gln Ala Ile Gly Asp Ala Ala
210 215 220
Trp Lys Val Ser Ala Thr Gly Tyr His Ala Thr Asp Phe His Ile Glu 225 230 235 240
Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Gln Ala Leu Thr
245 250 255
Glu Gly Asn Ile Asp Leu Gly Val Ala Ser Asp Ala Phe Thr Gln Pro
260 265 270
Asp Ala Leu Ala Ser Gln Ile Ile Asp Ser Phe Pro Asn Met Pro Ala
275 280 285
Val Ile Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val
290 295 300
Leu Ala Ala Phe Asn Arg Gln Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Ala Asn 305 310 315 320
Leu Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Ala Leu Cys Asp Gly Leu
325 330 335
Cys Ala Ile Ala Pro Gly Leu Ala Val Glu Glu Gly Asp Asp Leu Ile
340 345 350
Val His Ala Asn Pro Ala Leu Ala Gly Thr Thr Val Asn Ala Leu Ile
355 360 365
Asp Thr His Ser Asp His Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly
370 375 380
Leu Lys Ile Lys Gly Ile His Ile Gln Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys 385 390 395 400 Thr Tyr Pro Gly Tyr Trp Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Val Ser Val 405 410 415
Gln Arg
<210> SEQ ID NO: 34 <211> Comprimento: 418 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Pseudomonas syringae cepa B728
<400> Seqüência: : 34 Met Arg Pro Gln Ala Thr Leu Thr Val Leu Pro Val Glu Arg Pro Leu 1 5 10 15 Val Gly Arg Val Ser Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala 20 25 30 Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Thr Gly Ala 35 40 45 Leu Lys Ser Asp Asp Thr Arg Val Met Ser Glu Ala Leu Arg Leu Met 50 55 60 Gly Val Gln Val Asp Glu Pro Asp Asp Ser Thr Phe Val Val Thr Ser 65 70 75 80 Ser Gly His Trp Gln Ala Pro Gln Gln Ala Leu Phe Leu Gly Asn Ala 85 90 95 Gly Thr Ala Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Leu Ala Asn Phe Glu Gly 100 105 110 Asp Phe Val Val Asp Gly Asp Glu Tyr Met Arg Lys Arg Pro Ile Gly 115 120 125 Pro Leu Val Asp Ala Leu Gln Arg Met Gly Val Glu Val Ser Ala Pro 130 135 140 Ser Gly Cys Pro Pro Val Ala Ile Lys Gly Lys Gly Gly Leu Glu Ala 145 150 155 160 Gly Arg Ile Glu Ile Asp Gly Asn Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala 165 170 175 Leu Leu Met Ala Gly Ala Cys Gly Lys Gly Pro Val Glu Val Ala Leu 180 185 190 Thr Gly Ser Glu Ile Gly Ala Arg Gly Tyr Leu Asp Leu Thr Leu Ala 195 200 205 Ala Met Arg Ala Phe Gly Ala Glu Val Gln Ala Ile Gly Asp Ala Ala 210 215 220 Trp Lys Val Ser Ala Thr Gly Tyr Arg Ala Thr Asp Phe His Ile Glu 225 230 235 240 Pro Asp Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Gln Ala Leu Thr 245 250 255 Glu Gly Ala Ile Asp Leu Gly Val Ala Ser Asn Ala Phe Thr Gln Pro 260 265 270 Asp Ala Leu Ala Ser Gln Ile Ile Ala Ser Phe Pro Asn Met Pro Ala 275 280 285 Val Ile Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val 290 295 300 Leu Ala Ala Phe Asn Arg Gln Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Ala Asn 305 310 315 320 Leu Arg Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Ala Leu Ser Asn Gly Leu 325 330 335 Cys Ala Ile Ala Pro Gly Leu Ala Val Glu Glu Gly Asp Asp Leu Ile 340 345 350 Val Thr Ala Asn Pro Thr Leu Ala Gly Thr Thr Val Asp Ala Leu Ile 355 360 365 Asp Thr His Ser Asp His Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly 370 375 380 Leu Lys Ile Ala Gly Ile Arg Ile Leu Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys 385 390 395 400 Thr Tyr Pro Gly Tyr Trp Asp Ala Leu Ala Ser Leu Gly Val Ser Val 405 410 415 Gln Arg <210> SEQ ID NO : 35 <211> Comprimento: 425 <212> Tipo: PRT <213> Organismo : Agrobacterium tumefaciens cepa C58 <400> Seqüência : 35 Met Ile Glu Leu Thr Ile Thr Pro Pro Gly His Pro Leu Ser Gly Lys 1 5 10 15 Val Glu Pro Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu 20 25 30 Ala Gly Leu Ala Lys Gly Lys Ser His Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser 35 40 45 Asp Asp Thr Leu Tyr Met Ala Glu Ala Leu Arg Glu Met Gly Val Lys 50 55 60 Val Thr Glu Pro Asp Ala Thr Thr Phe Val Val Glu Gly Thr Gly Val 65 70 75 80 Leu Gln Gln Pro Glu Lys Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala 85 90 95 Thr Arg Phe Leu Thr Ala Ala Gly Ala Leu Val Asp Gly Ala Val Ile 100 105 110 Ile Asp Gly Asp Glu His Met Arg Lys Arg Pro Ile Leu Pro Leu Val 115 120 125 Gln Ala Leu Arg Ala Leu Gly Val Glu Ala Asp Ala Pro Thr Gly Cys 130 135 140 Pro Pro Val Thr Val Arg Gly Lys Gly Met Gly Phe Pro Lys Gly Ser 145 150 155 160 Val Thr Ile Asp Ala Asn Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu 165 170 175 Met Ala Ala Ala Cys Gly Asp Lys Pro Val Asp Ile Ile Leu Lys Gly 180 185 190 Glu Glu Ile Gly Ala Lys Gly Tyr Ile Asp Leu Thr Thr Ser Ala Met 195 200 205 Glu Ala Phe Gly Ala Lys Val Glu Arg Val Ser Asn Ala Ile Trp Arg 210 215 220 Val His Pro Thr Gly Tyr Thr Ala Thr Asp Phe His Ile Glu Pro Asp 225 230 235 240 Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Leu Trp Gly Ala Glu Leu Leu Thr Gly Gly 245 250 255 Ala Ile Asp Ile Gly Thr Pro Ala Asp Lys Phe Thr Gln Pro Asp Ala 260 265 270 Lys Ala Tyr Glu Val Met Ala Gln Phe Pro His Leu Pro Ala Glu Ile 275 280 285 Asp Gly Ser Gln Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Ile Ala Val Ile Ala 290 295 300 Ala Phe Asn Glu Thr Pro Val Arg Phe Val Gly Ile Ala Asn Leu Arg 305 310 315 320 Val Lys Glu Cys Asp Arg Ile Arg Ala Val Ser Leu Gly Leu Asn Glu 325 330 335 Ile Arg Glu Gly Leu Ala His Glu Glu Gly Asp Asp Leu Ile Val His 340 345 350 Ala Asp Pro Ser Leu Ala Gly Gln Thr Val Asp Ala Ser Ile Asp Thr 355 360 365 Phe Ala Asp His Arg Ile Ala Met
370 375
Ile Gly Gly Ile Ala Ile Gln Asn 385 390
Pro Gly Tyr Trp Lys Ala Leu Ala 405
Lys Glu Ser Ala Ala Glu Pro Gln 420
43/49
Ser Phe Ala Leu Ala Ala Leu Lys 380
Pro Ala Cys Val Ala Lys Thr Tyr 395 400
Ser Leu Gly Val Asp Tyr Thr Glu 410 415
His 425
<210> SEQ ID NO: 36 <211> Comprimento: 444 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: Desconhecido
<220> Características:
<223> Outras Informações: Isolado de amostra de solo
<400> Seqüencia: 36
Met Ala Cys Leu Pro Asp Asp Ser Gly Pro His Val Gly His Ser Thr 1 5 10 15 Pro Pro Arg Leu Asp Gln Glu Pro Cys Thr Leu Ser Ser Gln Lys Thr 20 25 30 Val Thr Val Thr Pro Pro Asn Phe Pro Leu Thr Gly Lys Val Ala Pro 35 40 45 Pro Gly Ser Lys Ser Ile Thr Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala Ala Leu 50 55 60 Ala Lys Gly Thr Ser Arg Leu Ser Gly Ala Leu Lys Ser Asp Asp Thr 65 70 75 80 Arg His Met Ser Val Ala Leu Arg Gln Met Gly Val Thr Ile Asp Glu 85 90 95 Pro Asp Asp Thr Thr Phe Val Val Thr Ser Gln Gly Ser Leu Gln Leu 100 105 110 Pro Ala Gln Pro Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Phe 115 120 125 Leu Thr Ala Ala Val Ala Thr Val Gln Gly Thr Val Val Leu Asp Gly 130 135 140 Asp Glu Tyr Met Gln Lys Arg Pro Ile Gly Pro Leu Leu Ala Thr Leu 145 150 155 160 Gly Gln Asn Gly Ile Gln Val Asp Ser Pro Thr Gly Cys Pro Pro Val 165 170 175 Thr Val His Gly Met Gly Lys Val Gln Ala Lys Arg Phe Glu Ile Asp 180 185 190 Gly Gly Leu Ser Ser Gln Tyr Val Ser Ala Leu Leu Met Leu Ala Ala 195 200 205 Cys Gly Glu Ala Pro Ile Glu Val Ala Leu Thr Gly Lys Asp Ile Gly 210 215 220 Ala Arg Gly Tyr Val Asp Leu Thr Leu Asp Cys Met Arg Ala Phe Gly 225 230 235 240 Ala Gln Val Asp Ala Val Asp Asp Thr Thr Trp Arg Val Ala Pro Thr 245 250 255 Gly Tyr Thr Ala His Asp Tyr Leu Ile Glu Pro Asp Ala Ser Ala Ala 260 265 270 Thr Tyr Leu Trp Ala Ala Glu Val Leu Thr Gly Gly Arg Ile Asp Ile 275 280 285 Gly Val Ala Ala Gln Asp Phe Thr Gln Pro Asp Ala Lys Ala Gln Ala 290 295 300 Val Ile Ala Gln Phe Pro Asn Met Gln Ala Thr Val Val Gly Ser Gln 305 310 315 320 Met Gln Asp Ala Ile Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Ala Phe Asn Asn 325 330 335 Thr Pro Val Arg Phe Thr Glu Leu Ala Asn Leu Arg Val Lys Glu Cys
340 345 350
Asp Arg Val Gln Ala Leu His Asp Gly Leu Asn Glu Ile Arg Pro Gly
355 360 365
Leu Ala Thr Ile Glu Gly Asp Asp Leu Leu Val Ala Ser Asp Pro Ala
370 375 380
Leu Ala Gly Thr Ala Cys Thr Ala Leu Ile Asp Thr His Ala Asp His 385 390 395 400
Arg Ile Ala Met Cys Phe Ala Leu Ala Gly Leu Lys Val Ser Gly Ile
405 410 415
Arg Ile Gln Asp Pro Asp Cys Val Ala Lys Thr Tyr Pro Asp Tyr Trp
420 425 430
Lys Ala Trp Pro Ser Leu Gly Val His Leu Asn Asp 435 440
<210> SEQ ID NO: 37 <211> Comprimento: 427 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Escherichia coli <400> Seqüência: 37
Met Glu Ser Leu Thr Leu Gln Pro Ile Ala Arg Val Asp Gly Thr Ile
1 5 10 15
Asn Leu Pro Gly Ser Lys Ser Val Ser Asn Arg Ala Leu Leu Leu Ala
20 25 30
Ala Leu Ala His Gly Lys Thr Val Leu Thr Asn Leu Leu Asp Ser Asp
35 40 45
Asp Val Arg His Met Leu Asn Ala Leu Thr Ala Leu Gly Val Ser Tyr
50 55 60
Thr Leu Ser Ala Asp Arg Thr Arg Cys Glu Ile Ile Gly Asn Gly Gly 65 70 75 80
Pro Leu His Ala Glu Gly Ala Leu Glu Leu Phe Leu Gly Asn Ala Gly
85 90 95
Thr Ala Met Arg Pro Leu Ala Ala Ala Leu Cys Leu Gly Ser Asn Asp
100 105 110
Ile Val Leu Thr Gly Glu Pro Arg Met Lys Glu Arg Pro Ile Gly His
115 120 125
Leu Val Asp Ala Leu Arg Leu Gly Gly Ala Lys Ile Thr Tyr Leu Glu
130 135 140
Gln Glu Asn Tyr Pro Pro Leu Arg Leu Gln Gly Gly Phe Thr Gly Gly 145 150 155 160
Asn Val Asp Val Asp Gly Ser Val Ser Ser Gln Phe Leu Thr Ala Leu
165 170 175
Leu Met Thr Ala Pro Leu Ala Pro Glu Asp Thr Val Ile Arg Ile Lys
180 185 190
Gly Asp Leu Val Ser Lys Pro Tyr Ile Asp Ile Thr Leu Asn Leu Met
195 200 205
Lys Thr Phe Gly Val Glu Ile Glu Asn Gln His Tyr Gln Gln Phe Val
210 215 220
Val Lys Gly Gly Gln Ser Tyr Gln Ser Pro Gly Thr Tyr Leu Val Glu 225 230 235 240
Gly Asp Ala Ser Ser Ala Ser Tyr Phe Leu Ala Ala Ala Ala Ile Lys
245 250 255
Gly Gly Thr Val Lys Val Thr Gly Ile Gly Arg Asn Ser Met Gln Gly
260 265 270
Asp Ile Arg Phe Ala Asp Val Leu Glu Lys Met Gly Ala Thr Ile Cys
275 280 285
Trp Gly Asp Asp Tyr Ile Ser Cys Thr Arg Gly Glu Leu Asn Ala Ile 290 295 300 Asp Met Asp Met Asn His Ile Pro Asp Ala Ala Met Thr Ile Ala Thr 305 310 315 320 Ala Ala Leu Phe Ala Lys Gly Thr Thr Thr Leu Arg Asn Ile Tyr Asn 325 330 335 Trp Arg Val Lys Glu Thr Asp Arg Leu Phe Ala Met Ala Thr Glu Leu 340 345 350 Arg Lys Val Gly Ala Glu Val Glu Glu Gly His Asp Tyr Ile Arg Ile 355 360 365 Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Phe Ala Glu Ile Ala Thr Tyr Asn Asp 370 375 380 His Arg Met Ala Met Cys Phe Ser Leu Val Ala Leu Ser Asp Thr Pro 385 390 395 400 Val Thr Ile Leu Asp Pro Lys Cys Thr Ala Lys Thr Phe Pro Asp Tyr 405 410 415 Phe Glu Gln Leu Ala Arg Ile Ser Gln Ala Ala 420 425 <210> SEQ ID NO: : 38 <211> Comprimento: 444 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: : Zea mays <400> Seqüência: : 38 Ala Gly Ala Glu Glu Ile Val Leu Gln Pro Ile Lys Glu Ile Ser Gly 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Pro Gly Ser Lys Ser Leu Ser Asn Arg Ile Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Ala Leu Ser Glu Gly Thr Thr Val Val Asp Asn Leu Leu Asn 35 40 45 Ser Glu Asp Val His Tyr Met Leu Gly Ala Leu Arg Thr Leu Gly Leu 50 55 60 Ser Val Glu Ala Asp Lys Ala Ala Lys Arg Ala Val Val Val Gly Cys 65 70 75 80 Gly Gly Lys Phe Pro Val Glu Asp Ala Lys Glu Glu Val Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Gly Asn Ala Gly Thr Ala Met Arg Pro Leu Thr Ala Ala Val Thr 100 105 110 Ala Ala Gly Gly Asn Ala Thr Tyr Val Leu Asp Gly Val Pro Arg Met 115 12 0 125 Arg Glu Arg Pro Ile Gly Asp Leu Val Val Gly Leu Lys Gln Leu Gly 130 135 140 Ala Asp Val Asp Cys Phe Leu Gly Thr Asp Cys Pro Pro Val Arg Val 145 150 155 160 Asn Gly Ile Gly Gly Leu Pro Gly Gly Lys Val Lys Leu Ser Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Ser Gln Tyr Leu Ser Ala Leu Leu Met Ala Ala Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Asp Val Glu Ile Glu Ile Ile Asp Lys Leu Ile Ser Ile Pro 195 200 205 Tyr Val Glu Met Thr Leu Arg Leu Met Glu Arg Phe Gly Val Lys Ala 210 215 220 Glu His Ser Asp Ser Trp Asp Arg Phe Tyr Ile Lys Gly Gly Gln Lys 225 230 235 240 Tyr Lys Ser Pro Lys Asn Ala Tyr Val Glu Gly Asp Ala Ser Ser Ala 245 250 255 Ser Tyr Phe Leu Ala Gly Ala Ala Ile Thr Gly Gly Thr Val Thr Val 260 265 270 Glu Gly Cys Gly Thr Thr Ser Leu Gln Gly Asp Val Lys Phe Ala Glu 275 280 285 Val Leu Glu Met Met Gly Ala Lys Val Thr Trp Thr Glu Thr Ser Val
290 295 300
Thr Val Thr Gly Pro Pro Arg Glu Pro Phe Gly Arg Lys His Leu Lys 305 310 315 320
Ala Ile Asp Val Asn Met Asn Lys Met Pro Asp Val Ala Met Thr Leu
325 330 335
Ala Val Val Ala Leu Phe Ala Asp Gly Pro Thr Ala Ile Arg Asp Val
340 345 350
Ala Ser Trp Arg Val Lys Glu Thr Glu Arg Met Val Ala Ile Arg Thr
355 360 365
Glu Leu Thr Lys Leu Gly Ala Ser Val Glu Glu Gly Pro Asp Tyr Cys
370 375 380
Ile Ile Thr Pro Pro Glu Lys Leu Asn Val Thr Ala Ile Asp Thr Tyr 385 390 395 400
Asp Asp His Arg Met Ala Met Ala Phe Ser Leu Ala Ala Cys Ala Glu
405 410 415
Val Pro Val Thr Ile Arg Asp Pro Gly Cys Thr Arg Lys Thr Phe Pro
420 425 430
Asp Tyr Phe Asp Val Leu Ser Thr Phe Val Lys Asn 435 440
<210> SEQ ID NO: 39 <211> Comprimento: 455 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Agrobacterium sp. CP4 <400> Seqüência: 39
Met Ser His Gly Ala Ser Ser Arg Pro Ala Thr Ala Arg Lys Ser Ser
1 5 10 15
Gly Leu Ser Gly Thr Val Arg Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His
20 25 30
Arg Ser Phe Met Phe Gly Gly Leu Ala Ser Gly Glu Thr Arg Ile Thr
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Gly Glu Asp Val Ile Asn Thr Gly Lys Ala Met Gln
50 55 60
Ala Met Gly Ala Arg Ile Arg Lys Glu Gly Asp Thr Trp Ile Ile Asp 65 70 75 80
Gly Val Gly Asn Gly Gly Leu Leu Ala Pro Glu Ala Pro Leu Asp Phe
85 90 95
Gly Asn Ala Ala Thr Gly Cys Arg Leu Thr Met Gly Leu Val Gly Val
100 105 110
Tyr Asp Phe Asp Ser Thr Phe Ile Gly Asp Ala Ser Leu Thr Lys Arg
115 120 125
Pro Met Gly Arg Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Met Gly Val Gln Val
130 135 140
Lys Ser Glu Asp Gly Asp Arg Leu Pro Val Thr Leu Arg Gly Pro Lys 145 150 155 160
Thr Pro Thr Pro Ile Thr Tyr Arg Val Pro Met Ala Ser Ala Gln Val
165 170 175
Lys Ser Ala Val Leu Leu Ala Gly Leu Asn Thr Pro Gly Ile Thr Thr
180 185 190
Val Ile Glu Pro Ile Met Thr Arg Asp His Thr Glu Lys Met Leu Gln
195 200 205
Gly Phe Gly Ala Asn Leu Thr Val Glu Thr Asp Ala Asp Gly Val Arg
210 215 220
Thr Ile Arg Leu Glu Gly Arg Gly Lys Leu Thr Gly Gln Val Ile Asp 225 230 235 240
Val Pro Gly Asp Pro Ser Ser Thr Ala Phe Pro Leu Val Ala Ala Leu 245 250 255 Leu Val Pro Gly Ser Asp Val Thr Ile Leu Asn Val Leu Met Asn Pro
260 265 270
Thr Arg Thr Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Glu Met Gly Ala Asp Ile
275 280 285
Glu Val Ile Asn Pro Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Asp Leu
290 295 300
Arg Val Arg Ser Ser Thr Leu Lys Gly Val Thr Val Pro Glu Asp Arg 305 310 315 320
Ala Pro Ser Met Ile Asp Glu Tyr Pro Ile Leu Ala Val Ala Ala Ala
325 330 335
Phe Ala Glu Gly Ala Thr Val Met Asn Gly Leu Glu Glu Leu Arg Val
340 345 350
Lys Glu Ser Asp Arg Leu Ser Ala Val Ala Asn Gly Leu Lys Leu Asn
355 360 365
Gly Val Asp Cys Asp Glu Gly Glu Thr Ser Leu Val Val Arg Gly Arg
370 375 380
Pro Asp Gly Lys Gly Leu Gly Asn Ala Ser Gly Ala Ala Val Ala Thr 385 390 395 400
His Leu Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Leu Val Met Gly Leu Val
405 410 415
Ser Glu Asn Pro Val Thr Val Asp Asp Ala Thr Met Ile Ala Thr Ser
420 425 430
Phe Pro Glu Phe Met Asp Leu Met Ala Gly Leu Gly Ala Lys Ile Glu
435 440 445
Leu Ser Asp Thr Lys Ala Ala 450 455
<210> SEQ ID NO: 40 <211> Comprimento: 42 8 <212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Bacillus subtilis
<400> Seqüência: 40
Met Lys Arg Asp Lys Val Gln Thr Leu His Gly Glu Ile His Ile Pro 1 5 10 15 Gly Asp Lys Ser 20 Ile Ser His Arg Ser 25 Val Met Phe Gly Ala 30 Leu Ala Ala Gly Thr 35 Thr Thr Val Lys Asn 40 Phe Leu Pro Gly Ala 45 Asp Cys Leu Ser Thr 50 Ile Asp Cys Phe Arg 55 Lys Met Gly Val His 60 Ile Glu Gln Ser Ser Ser Asp Val Val Ile His Gly Lys Gly Ile Asp Ala Leu Lys Glu 65 70 75 80 Pro Glu Ser Leu Leu 85 Asp Val Gly Asn Ser 90 Gly Thr Thr Ile Arg 95 Leu Met Leu Gly Ile 100 Leu Ala Gly Arg Pro 105 Phe Tyr Ser Ala Val 110 Ala Gly Asp Glu Ser 115 Ile Ala Lys Arg Pro 120 Met Lys Arg Val Thr 125 Glu Pro Leu Lys Lys 130 Met Gly Ala Lys Ile 135 Asp Gly Arg Ala Gly 140 Gly Glu Phe Thr Pro Leu Ser Val Ser Gly Ala Ser Leu Lys Gly Ile Asp Tyr Val Ser 145 150 155 160 Pro Val Ala Ser Ala 165 Gln Ile Lys Ser Ala 170 Val Leu Leu Ala Gly 175 Leu Gln Ala Glu Gly 180 Thr Thr Thr Val Thr 185 Glu Pro His Lys Ser 190 Arg Asp His Thr Glu 195 Arg Met Leu Ser Ala 200 Phe Gly Val Lys Leu 205 Ser Glu Asp Gln Thr Ser Val Ser Ile Ala Gly Gly Gln Lys Leu Thr Ala Ala Asp 210 215 220 Ile Phe Val Pro Gly Asp Ile Ser Ser Ala Ala Phe Phe Leu Ala Ala 225 230 235 240 Gly Ala Met Val Pro Asn Ser Arg Ile Val Leu Lys Asn Val Gly Leu 245 250 255 Asn Pro Thr Arg Thr Gly Ile Ile Asp Val Leu Gln Asn Met Gly Ala 260 265 270 Lys Leu Glu Ile Lys Pro Ser Ala Asp Ser Gly Ala Glu Pro Tyr Gly 275 280 285 Asp Leu Ile Ile Glu Thr Ser Ser Leu Lys Ala Val Glu Ile Gly Gly 290 295 300 Asp Ile Ile Pro Arg Leu Ile Asp Glu Ile Pro Ile Ile Ala Leu Leu 305 310 315 320 Ala Thr Gln Ala Glu Gly Thr Thr Val Ile Lys Asp Ala Ala Glu Leu 325 330 335 Lys Val Lys Glu Thr Asn Arg Ile Asp Thr Val Val Ser Glu Leu Arg 340 345 350 Lys Leu Gly Ala Glu Ile Glu Pro Thr Ala Asp Gly Met Lys Val Tyr 355 360 365 Gly Lys Gln Thr Leu Lys Gly Gly Ala Ala Val Ser Ser His Gly Asp 370 375 380 His Arg Ile Gly Met Met Leu Gly Ile Ala Ser Cys Ile Thr Glu Glu 385 390 395 400 Pro Ile Glu Ile Glu His Thr Asp Ala Ile His Val Ser Tyr Pro Thr 405 410 415 Phe Phe Glu His Leu Asn Lys Leu Ser Lys Lys Ser 420 425 <210> SEQ ID NO: : 41 <211> Comprimento: 431 <212> Tipo: PRT <213> Organismo: : Enterobacteriaceae <400> Seqüência: : 41 Met Lys Val Thr Ile Gln Pro Gly Asp Leu Thr Gly Ile Leu Gln Ser 1 5 10 15 Pro Ala Ser Lys Ser Ser Met Gln Arg Ala Cys Ala Ala Ala Leu Val 20 25 30 Ala Lys Gly Ile Ser Glu Ile Ile Asn Pro Gly His Ser Asn Asp Asp 35 40 45 Lys Ala Ala Arg Asp Ile Val Ser Arg Leu Gly Ala Arg Leu Glu Asp 50 55 60 Gln Pro Asp Gly Ser Leu Gln Ile Thr Ser Glu Gly Val Lys Pro Val 65 70 75 80 Ala Pro Phe Ile Asp Cys Gly Glu Ser Gly Leu Ser Ile Arg Met Phe 85 90 95 Thr Pro Ile Val Ala Leu Ser Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Gly Ser 100 105 110 Gly Ser Leu Val Thr Arg Pro Met Asp Phe Phe Asp Glu Ile Leu Pro 115 120 125 His Leu Gly Val Lys Val Lys Ser Asn Gln Gly Lys Leu Pro Leu Val 130 135 140 Ile Gln Gly Pro Leu Lys Pro Ala Asp Val Thr Val Asp Gly Ser Leu 145 150 155 160 Ser Ser Gln Phe Leu Thr Gly Leu Leu Leu Ala Tyr Ala Ala Ala Asp 165 170 175 Ala Ser Asp Val Ala Ile Lys Val Thr Asn Leu Lys Ser Arg Pro Tyr 180 185 190 Ile Asp Leu Thr Leu Asp Val Met Lys Arg Phe Gly Leu Lys Thr Pro
195 200 205
Glu Asn Arg Asn Tyr Glu Glu Phe Tyr Phe Lys Ala Gly Asn Val Tyr
210 215 220
Asp Glu Thr Lys Met Gln Arg Tyr Thr Val Glu Gly Asp Trp Ser Gly 225 230 235 240
Gly Ala Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Ile Ala Gly Pro Ile Thr Val
245 250 255
Arg Gly Leu Asp Ile Ala Ser Thr Gln Ala Asp Lys Ala Ile Val Gln
260 265 270
Ala Leu Met Ser Ala Asn Ala Gly Ile Ala Ile Asp Ala Lys Glu Ile
275 280 285
Lys Leu His Pro Ala Asp Leu Asn Ala Phe Glu Phe Asp Ala Thr Asp
290 295 300
Cys Pro Asp Leu Phe Pro Pro Leu Val Ala Leu Ala Ser Tyr Cys Lys 305 310 315 320
Gly Glu Thr Lys Ile Lys Gly Val Ser Arg Leu Ala His Lys Glu Ser
325 330 335
Asp Arg Gly Leu Thr Leu Gln Asp Glu Phe Gly Lys Met Gly Val Glu
340 345 350
Ile His Leu Glu Gly Asp Leu Met Arg Val Ile Gly Gly Lys Gly Val
355 360 365
Lys Gly Ala Glu Val Ser Ser Arg His Asp His Arg Ile Ala Met Ala
370 375 380
Cys Ala Val Ala Ala Leu Lys Ala Val Gly Glu Thr Thr Ile Glu His 385 390 395 400
Ala Glu Ala Val Asn Lys Ser Tyr Pro Asp Phe Tyr Ser Asp Leu Lys
405 410 415
Gln Leu Gly Gly Val Val Ser Leu Asn His Gln Phe Asn Phe Ser 420 425 430

Claims (22)

1. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizada por compreender uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em: a) seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, - 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas; b) seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação à nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, ou um complemento dessas; c) seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência em relação à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas; d) seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas do inserto de DNA do plasmídeo depositado como Nos. de Acesso NRRL B-30934, B-30932, B-30933, B-30945, B-30946, B- - 30947, ou B-30948, ou um complemento dessas; e) seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, - 2, 5, 11, 14, 16, 19, ou 22; f) seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% identidade de seqüência de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, - 5, 11, ou 14; e, g) seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 97% identidade de seqüência de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 19, ou 22.
2. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que dita seqüência de nucleotídeos é uma seqüência sintética que foi projetada para expressão em uma planta.
3. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico da reivindicação 1.
4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender ainda uma molécula de ácido nucléico codificando um polipeptídeo heterólogo.
5. Célula hospedeira caracterizada por conter o vetor da reivindicação 3.
6. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por ser uma célula hospedeira bacteriana.
7. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por ser uma célula vegetal.
8. Planta transgênica caracterizada por compreender a célula hospedeira da reivindicação 7.
9. Planta de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que dita planta é selecionada do grupo consistindo de milho, sorgo, trigo, girassol, tomate, crucíferas, pimentas, batata, algodão, arroz, soja, beterraba, cana-de-açúcar, tabaco, cevada e colza.
10. Semente transgênica caracterizada por compreender a molécula de ácido nucléico da reivindicação 1.
11. Polipeptídeo isolado caracterizado por ser selecionado do grupo consistindo em: a) polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14, 16, 19, ou 22; b) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23; c) polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, - 5, 11, ou 14, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; d) polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 19, ou 22, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; e) polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, 10, 12, ou 13, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; f) polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 97% idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; e, g) polipeptídeo que é codificado pela seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas do inserto de DNA do plasmídeo depositado como Nos. de Acesso NRRL B-30934, B-30932, B-30933, B-30945, B-30946, B-30947, ou B-30948.
12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender ainda uma seqüência de aminoácidos heteróloga.
13. Método para produzir um polipeptídeo com atividade de resistência a herbicidas, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira da reivindicação 5 sob condições nas quais uma molécula de ácido nucléico codificando o polipeptídeo é expressa, dito polipeptídeo sendo selecionado do grupo consistindo em: a) polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14, 16, 19, OU 22; b) polipeptídeo codificado pela seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23; c) polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, - 5, 11, ou 14, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; d) polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 19, ou 22, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; e) polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, 10, 12, ou 13, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; f) polipeptídeo que é codificado por uma seqüência de nucleotídeos que é pelo menos 97% idêntica à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; e, g) a polipeptídeo que é codificado pela seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas do inserto de DNA do plasmídeo depositado como Nos. de Acesso NRRL B-30934, B-30932, B-30933, B-30945, B-30946, B-30947, ou B-30948.
14. Método para conferir resistência a um herbicida em uma planta, caracterizado por compreender transformar dita planta com uma construção de DNA, dita construção compreendendo um promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal operacionalmente ligada com uma seqüência de nucleotídeos, e regenerar uma planta transformada, em que dita seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo em: a) seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, - 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas; b) seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, 10, 12, ou 13, ou um complemento dessas, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; c) seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência em relação à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; d) seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas do inserto de DNA do plasmídeo depositado com os Nos. de Acesso NRRL B-30934, B-30932, B-30933, B- 30945, B-30946, B-3 0947, ou B-3 0948, ou um complemento desses; e) seqüência de nucleotídeos que codificada um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, 5, 11, 14, 16, 19, ou 22; f) seqüência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo tendo pelo menos 90% identidade de seqüência de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, - 5, 11, ou 14, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; e, g) seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 97% identidade de seqüência de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 19, ou 22, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que dita planta produz um polipeptídeo tendo atividade de resistência a herbicidas.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que dito herbicida é um glifosato.
17. Planta caracterizada por ter estavelmente incorporada em seu genoma uma construção de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína tendo atividade de resistência a herbicidas, em que dita seqüência de nucleotídeos é selecionada do grupo consistindo em: a) seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, - 9, 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas; b) seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 90% de identidade de seqüência em relação à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, 10, 12, ou 13, ou um complemento dessas, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; c) seqüência de nucleotídeos tendo pelo menos 97% de identidade de seqüência em relação à seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um complemento dessas, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; d) seqüência de nucleotídeos de resistência a herbicidas do inserto de DNA do plasmídeo depositado como Nos. de Acesso NRRL B-30934, B-30932, B-30933, B- 30945, B-30946, B-3 0947, ou B-3 0948, ou um complemento desses; e) seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, - 2, 5, 11, 14, 16, 19, ou 22; f) seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo tendo pelo menos 90% identidade de seqüência de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, 2, - 5, 11, ou 14, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; e, g) seqüência de nucleotídeos codificando a polipeptídeo tendo pelo menos 97% identidade de seqüência de aminoácidos em relação à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, 19, ou 22, em que dito polipeptídeo possui atividade de resistência a herbicidas; em que dita seqüência de nucleotídeos é operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão de uma seqüência codificadora em uma célula vegetal.
18. Planta de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que dita planta é uma célula vegetal.
19. Método para gerar um polinucleotídeo variante de um polinucleotídeo parental grg33, grg35, grg36, grg37, grg38, grg39, ou grg50, caracterizado por compreender usar a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, 1, 3, 4, 6, 9, - 10, 12, 13, 15, 17, 18, 20, 21, ou 23, ou um fragmento dessas, em um procedimento recombinogênico, e testar um polipeptídeo codificado pela seqüência de polinucleotídeos resultante para uma atividade de interesse.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a atividade de interesse é atividade de resistência a glifosato.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo codificado pela seqüência de polinucleotídeos resultante possui uma atividade de resistência a glifosato maior do que um polipeptídeo codificado por dito polinucleotídeo parental.
22. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que dito procedimento recombinogênico é embaralhamento de DNA.
BRPI0713039-2A 2006-06-27 2007-06-27 molécula de ácido nucléico e polipeptìdeo isolados, vetor, célula hospedeira, planta e semente transgênicas e métodos para produzir um polipeptìdeo com atividade de resistência a herbicidas, para conferir resistência a um herbicida em uma planta e para gerar um polinucleotìdeo variante de um polinucleotìdeo parental grg33, grg35, grg37, grg38, grg39, ou grgr50. BRPI0713039A2 (pt)

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US60/819,122 2006-07-07
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