BRPI0312962B1

BRPI0312962B1 - Processo para produção de uma planta de b. oleracea compreendendo uma resistência monogênica e dominante à hérnia das crucíferas e processo de identificação de uma planta de b. oleracea resistente à hérnia das crucíferas

Info

Publication number: BRPI0312962B1
Application number: BRPI0312962-4A
Authority: BR
Inventors: Enrio Gerardus Albertus Linders; Peter Tjeertes; Johannes Maria De Haas; Cia-Cheng Huang
Original assignee: Syngenta Participations Ag
Priority date: 2002-07-26
Filing date: 2003-07-25
Publication date: 2021-04-13
Also published as: US20100037343A1; RU2369090C2; US9295207B2; EP2302061A1; BR0312962A; RU2005105563A; KR20130090427A; JP2010284166A; JP2005533520A; US10017780B2; CA2523011C; US20050262583A1; CN1678747A; AU2003250175A1; EP1525317A1; US20160177331A1; US8013209B2; AU2003250175B2; KR20050026012A; PL374843A1

Abstract

"PLANTAS DE BRASSICA OLERACEA RESISTENTES À RAIZ TORTA". A presente invenção descreve vegetais B. oleracea resistentes à doença da raiz torta. Em particular, os vegetais da presente invenção compreendem uma resistência monogênica dominante à doença da raiz torta introduzida pelo B. rapa. Esta resistência fornece resistência melhorada à doença comparada às resistências existentes anteriormente no B. oleracea.

Description

A presente invenção refere-se a plantas resistentes a doenças, em particular a plantas de Brassica oleracea resistentes à doença da raiz torta.

A raiz torta é uma doença amplamente espalhada que causa problemas graves em muitas áreas de cultivos de Brassica (para uma revisão, ver, por exemplo, Dixon (1999) Grower 29 de abril, pp. 28-29). A doença é causada por Plasmodiophora brassicae, um organismo unicelular. Os sintomas da doença incluem malformações da raiz com intumecimentos duros (conglomerados), que eventualmente enraízam. A doença causa ainda interrupção do desenvolvimento através do crescimento reduzido e o mur- chamento das folhas é observado sob estresse hídrico. O controle químico da doença não é eficiente. Portanto, boa resistência genética da planta de cultivo é importante para sua proteção contra a doença.

O gênero das Brassicas compreende várias espécies de interesse comercial, tais como B. rapa (repolho chinês, repolho paquistanês, nabo), B. napus (semente oleosa, sueca), B. juncea (mostarda), B. nigra (mostarda negra) e B. oleracea (couve-flor, brócolis, repolho, repolhinho de Bruxelas, repolho Savoy, Borecole, couve-rábano, Borecole e outras). Embora as subespécies dentro de uma espécie do gênero Brassica seja geralmente sexualmente compatíveis, este não é necessariamente o caso entre espécies diferentes do gênero Brassica. Por exemplo, B. rapa e B. oleracea não possuem o mesmo número de cromossomos (10 cromossomos versus 9 cromossomos) e são, portanto, incompatíveis sexualmente. Isto torna a transferência de uma característica de uma espécie de Brassica para uma outra particularmente difícil.

Várias fontes de resistência à raiz torta foram descritas dentro do gênero Brassica (ver, por exemplo, Bradshaw e outros (1997) Ann. Appl.

Biol. 130:337-348; Gowers (1982) Euphytica 31:971-976). Algumas resistências são monogênicas, algumas poligênicas, algumas são dominantes, algumas recessivas. As resistências monogênicas foram descritas em B. rapa e B. napus, tal como, por exemplo, uma resistência dominante monogênica no repolho chinês B. rapa (Yoshikawa (1983) Japan Agricultural Research Quarterly, Vol. 17, No 1, pp. 6-11). Os híbridos F1 do repolho chinês com esta resistência mostraram possuir boa proteção contra a raiz torta, embora um pequeno número de linhagens ('raças') de raiz torta tenha sido capaz de forçar essa resistência. Tais raças parecem mais prevalecentes na Ásia que na Europa.

Em contraste, somente fontes poligênicas, recessivas de resistência foram descritas na espécie de Brassica B. oleracea (ver, por exemplo, Voorrips (1995) Euphytica 83:139-146). Tais fontes provaram ser não só insuficientemente resistentes à raiz torta, mas são também muito difíceis de transferir entre linhagens comerciais de B. oleracea. Isto torna o cultivo da resistência uma dificuldade e uma tarefa demorada.

Portanto, há uma necessidade não satisfeita para plantas de B. oleracea com uma resistência maior à raiz torta, em que a resistência é também fácil de cultivar e de transferir para linhagens comerciais de B. oleracea.

Conseqüentemente, a presente invenção se dirige ao problema de resistência insatisfatória à doença da raiz torta em B. oleracea. Para atingir maior resistência à doença em B. oleracea, a presente invenção descreve a transferência de uma resistência dominante monogênica à raiz torta partindo do repolho chinês (B. rapa) para o brócolis B. oleracea e então ainda para outras B. oleraceas, tais como o repolho branco, a couve-flor e a repo- lhinho de Bruxelas. Com a finalidade de contornar a incompatibilidade sexual entre B. rapa e B. oleracea, a resistência à raiz torta foi transferida através da hibridização interespecífica utilizando uma técnica de resgate do embrião, seguida por retrocruzamentos repetidos e testes de doenças em todas as gerações retrocruzadas. O alto nível de resistência à raiz torta é obtido nas plantas de B. oleracea resultante. A resistência é estável e pode ser transmitida para gerações adicionais e transferidas para plantas de B. oleracea sus- cetíveis ou menos resistentes.

Assim, a presente invenção descreve plantas de B. oleracea re-sistentes à raiz torta, em que a resistência à raiz torta é monogênica e dominante, incluindo sementes e materiais das ditas plantas e da progênie das mesmas. A presente invenção descreve ainda métodos para a produção de plantas de B. oleracea resistentes à raiz torta, métodos para transferir a resistência à raiz torta para plantas de B. oleracea suscetíveis ou menos resistentes. A presente invenção descreve ainda marcadores moleculares ligados à resistência da raiz torta.

A presente invenção é particularmente vantajosa em relação às resistências existentes à raiz torta em B. oleracea pelo fato de que a resistência da presente invenção é facilmente transferida entre plantas de B. ole- racea e linhagens comerciais. Rendimentos maiores são obtidos por causa da ausência de doença em plantas resistentes. Além disso, muito menos produtos químicos de proteção à planta de cultivo ou nenhum produto químico de proteção à planta de cultivo é não absolutamente necessário contra a raiz torta quando as plantas de B. oleracea da presente invenção são cultivadas.

A presente invenção descreve, portanto: Uma planta de B. oleracea resistente à doença da raiz torta, mais particularmente à doença da raiz torta causada pelo agente patogênico Plasmodiophora brassicae. Em uma modalidade específica da invenção, a resistência à doença da raiz torta é monogênica e dominante. Preferencialmente, a planta de B. oleracea é classificada no nível 2 ou menos em um teste para a doença que possui uma escala de 1-9, preferencialmente tal como descrito no Exemplo 2. Preferencialmente, a planta B. oleracea é classificada no nível 1 em um teste para a doença que possui uma escala de 19, preferencialmente tal como a descrita no Exemplo 2. Preferencialmente, a planta de B. oleracea é classificada no nível 1 ou menos em um teste para a doença que possui uma escala de 0-5, preferencialmente tal como descrito no Exemplo 2. Preferencialmente, a planta de B. oleracea é classificada no nível 0 em um teste para a doença que possui uma escala de 0-5, preferen- cialmente tal como a descrita no Exemplo 2. Em uma outra modalidade preferida, a planta de B. oleracea é resistente à infecção de pelos da raiz. Em uma outra modalidade preferida, a planta de B. oleracea é o brócolis o repolho branco, a couve-flor, a couve de Bruxelas, Borecole, Savoy e repolho roxo. Em uma outra modalidade preferida, a planta de B. oleracea é homozi- gota ou heterozigota em relação à resistência à raiz torta. Em uma outra modalidade preferida, a resistência à raiz torta está ligada geneticamente a um marcador molecular. Preferencialmente, o marcador molecular que pode ser obtido através da amplificação pela PCR. Preferencialmente, a resistência fica dentro de 10 cM do dito marcador molecular, preferencialmente dentro de menos de 6 cM, preferencialmente dentro de menos de 5 cM, mais preferencialmente dentro de menos de 3 cM, ainda mais preferencialmente dentro de menos de 1,5 cM. Em uma outra modalidade preferida, a resistência à raiz torta está ligada a um marcador molecular que pode ser obtido através da amplificação pela PCR utilizando o iniciador O20 (SEQ ID No: 1) ou o iniciador Y13 (SEQ ID No: 2). Em uma outra modalidade preferida, a resistência pode ser obtida de uma planta B. rapa resistente à raiz torta, preferencialmente do híbrido de F1 do repolho chinês Parkin. Em uma outra modalidade preferida, a resistência à raiz torta de acordo com a presente invenção pode ser obtida da linhagem CFL667, depositada no NCIMB sob o número de acesso do NCIMB 41134. Em uma outra modalidade preferida, a resistência é derivada ou obtida da linhagem CFL667 ou de uma progênie ou ancestral da linhagem CFL667 que compreende a dita resistência. Em uma outra modalidade preferida, a planta é um endógamo ou um híbrido. Em uma outra modalidade preferida, a planta é um dihaplóide. Ainda em outra moda-lidade preferida, a planta é um macho estéril citoplásmico (CMS). Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção descreve uma planta de B. oleracea que compreende um lócus que confere resistência à raiz torta. Preferencialmente, o lócus fica dentro de 10 centi-Morgan (cM) de um marcador molecular que pode ser obtido através da amplificação pela PCR utilizando o iniciador O20 (SEQ ID No:1) ou o iniciador Y13 (SEQ ID No: 2), preferencialmente dentro de 6 cM, preferencialmente dentro de 5 cM, mais preferencial- mente dentro de 3 cM, ainda mais preferencialmente dentro de 1,5 cM do dito marcador molecular. Em uma outra modalidade preferida, a resistência em um lócus que corresponde ao lócus compreendido na linhagem CFL667, depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134 e preferencialmente se co-segrega com a presente resistência na linhagem CFL667. Em uma outra modalidade preferida, o lócus que confere a resistência à raiz torta pode ser obtido da linhagem CFL667 depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134 ou de uma progênie ou ancestral da linhagem CFL667 que compreende a dita resistência. Em uma outra modalidade preferida, o lócus para a resistência é derivado ou obtido da linhagem CFL667 ou de uma progênie ou ancestral da linhagem CFL667 que compreende a dita resistência.

A presente invenção descreve ainda: Uma semente de uma planta descrita anteriormente, que inclui a progênie da mesma, em que a dita semente ou progênie compreende a re-sistência da presente invenção. Um fruto de uma planta descrita aqui. Parte de uma planta descrita aqui, incluindo pólen, óvulo e embrião da dita planta.

A presente invenção descreve ainda: Uma planta de B. oleracea que compreende uma resistência à doença da raiz torta, em que a dita planta é homozigota para a dita resistência e a dita planta homozigota para a dita resistência é cruzada com uma planta homozigota "testadoras" em relação à resistência monogênica e dominante à doença da raiz torta, as plantas da progênie da primeira geração resultando do dito cruzamento exibindo uma segregação de 1:0 em relação à resistência à doença da raiz torta. Em uma modalidade preferida, quando as ditas plantas da dita progênie da primeira geração são autopolinizadas, as plantas da progênie da segunda geração resultante exibem uma segregação de 1:0 em relação à resistência à doença da raiz torta. Em uma modalidade preferida, a planta "testadora" é uma planta derivada da linhagem CFL667 depositada no NCIMB sob o número de acesso 41134 e que compreende a resistência monogênica e dominante à raiz torta compreendida na dita linhagem CFL667 ou uma progênie ou um ancestral da dita linhagem CFL667 compreendendo a resistência monogênica e dominante à raiz torta compreendida na dita linhagem CFL667. Em uma modalidade preferida, a planta "testadora" é derivada de uma planta da linhagem CFL667 ou de uma planta de progênie da linhagem CFL667 por fusão celular. Em uma outra modalidade preferida, a planta "testadora" é do sexo masculino fértil.

Uma planta de B. oleracea que compreende uma resistência à doença da raiz torta, em que quando a dita é heterozigota para a dita resistência e a dita planta heterozigota para a dita resistência é cruzada com uma planta heterozigota "testadora" para uma resistência monogênica e dominante à raiz torta, as plantas da progênie da primeira geração resultando do dito cruzamento exibem uma segregação de 3:1 para resistência à doença da raiz torta. Em uma modalidade preferida, quando as ditas plantas da progê- nie da primeira geração são adicionalmente cruzadas com a dita planta hete- rozigota em relação à dita resistência, as plantas da progênie da segunda geração resultante exibe uma segregação de 5:1 em relação à doença da raiz torta. Em uma modalidade adicionalmente preferida, a planta "testadora" é uma planta da linhagem CFL667 depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134 ou uma progênie ou ancestral da dita linhagem CFL667 que compreende uma resistência monogênica e dominante à raiz torta compreendida na dita linhagem CFL667 ou uma planta derivada da dita linhagem CFL667 depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134 e que compreende a resistência monogênica e dominante à raiz torta compreendida na dita linhagem CFL667. Em uma modalidade preferida, quando as progênies de plantas individuais são avaliadas, a progênie da segunda geração resultante exibe uma proporção de segregação de 3:1, 1:0 ou 1:1 para a resistência, denpendendo do estado genético das plantas individuais na prole da primeira geração (heterozigota, resistente homozigota ou homozigota suscetível, respectivamente).

Em uma outra modalidade preferida, a dita resistência à raiz torta é monogênica, preferencialmente, monogênica e dominante. Em uma modalidade preferida, a planta de B. oleracea é homozigota em relação à resis- tência. Em uma outra modalidade preferida, a planta de B. oleracea é hete- rozigota em relação à resistência.

A presente invenção descreve ainda: A semente de uma planta descrita anteriormente, incluindo a progênie da mesma, em que a dita semente ou progênie compreende a resistência da presente invenção.

O fruto de uma planta descrita aqui. Parte de uma planta descrita aqui, incluindo pólen, óvulo e embrião da dita planta.

A presente invenção descreve ainda: O uso de uma resistência monogênica e dominante à raiz torta de acordo com a presente invenção para conferir a resistência de uma planta de B. oleracea à dita doença. Preferencialmente, a dita resistência pode ser obtida de uma planta B. rapa, preferencialmente do híbrido F1 do repolho chinês Parkin.

A presente invenção descreve ainda: Um processo para a produção de uma planta de B. oleracea que compreende uma resistência monogênica e dominante à raiz torta que com-preende as etapas de: a) obtenção de uma planta B. rapa resistente à raiz torta; b) cruzamento da dita planta de B. rapa com uma planta de B. olera- cea; c) recuperação dos embriões resultantes do cruzamento da etapa b); d) regeneração de uma planta partindo de um embrião da etapa c); e) seleção de uma planta da etapa d) que é resistente à raiz torta; f) retrocruzamento de uma planta que resulta da etapa e) com uma planta de B. oleracea. Em uma modalidade preferida, o método compreende ainda introgressão a resistência em um endógamo de elite da B. oleracea. Em uma outra modalidade preferida, o método compreende ainda o cruzamento do dito endógamo com um outro endógamo de B. oleracea para produzir um híbrido.

A presente invenção descreve ainda: Uma planta de B. oleracea, que inclui uma planta híbrida, pode ser obtida através do método descrito anteriormente.

A presente invenção descreve adicionalmente: Um método para a transferência de uma resistência monogênica e dominante à raiz torta a uma planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à doença que compreende as etapas de: a) obtenção de uma planta de B. oleracea que compreende uma resistência monogênica e dominante à raiz torta; b) cruzamento da dita planta de B. oleracea da etapa a) com uma planta de B. oleracea susceptível ou menos resistentes à raiz torta; c) seleção de uma planta proveniente do cruzamento da etapa b) que é resistente à raiz torta. Em uma modalidade preferida, o método compreende ainda o retrocruzamento da dita resistência na dita planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à raiz torta. Em uma modalidade preferida, uma planta de B. oleracea susceptível ou menos resiste à doença é classificada no nível 4 ou acima, preferencialmente 3 ou acima, em um teste para a doença que possui uma escala de 1-9 ou no nível 3 ou acima, preferencialmente 2 ou acima, em um teste para a doença que possui uma escala de 05.

A presente invenção descreve ainda; Um fragmento de DNA amplificado de um genoma de Brassica, em que o dito fragmento de DNA possui aproximadamente 400 pb de comprimento e compreende a SEQ ID No: 1.

Um fragmento de DNA amplificado de um genoma de Brassica, em que o dito fragmento de DNA possui aproximadamente 640 pb de comprimento e compreende a SEQ ID No: 2.

Em uma modalidade preferida, um fragmento de DNA descrito anteriormente é indicativo da presença de uma resistência dominante e mo- nogênica à raiz torta em uma planta de Brassica.

O uso de um fragmento de DNA descrito anteriormente para identificar uma planta de Brassica que é resistente à raiz torta.

O uso do iniciador O20 (SEQ ID No: 1) para detectar um fragmento de DNA de aproximadamente 400 pb em um genoma de Brassica.

O uso do iniciador Y13 (SEQ ID No: 2) para detectar um fragmento de DNA de aproximadamente 640 pb em um genoma de Brassica.

O uso de um iniciador O20 ou Y13 para identificar uma planta de Brassica resistente à raiz torta.

Em uma modalidade preferida, a planta de Brassica é B. olera- cea.

Um kit para a detecção de uma resistência monogênica e dominante à raiz torta em uma planta de B. oleracea que compreende um oligo- nucleotídeo que é apresentado na SEQ ID No: 1 ou na SEQ ID No: 2.

A presente invenção descreve ainda: Um método para a transferência de uma resistência monogênica e dominante à raiz torta para uma planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à doença que compreende as etapas de: a) obtenção de uma planta de B. oleracea que compreende uma resistência monogênica e dominante à raiz torta; b) cruzamento da dita planta de B. oleracea da etapa 2) com uma planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à raiz torta; c) seleção de uma planta que compreende um fragmento de DNA que pode ser obtido através da amplificação pela PCR e que se co-segrega com a resistência. Preferencialmente, o fragmento de DNA pode ser obtido através da amplificação pela PCR utilizando o iniciador O20 (SEQ ID No: 1) ou o iniciador Y13 (SEQ ID No: 2). Preferencialmente, a dita planta da etapa c) é resistente à raiz torta. Em uma modalidade preferida, o método compreende ainda o retrocruzamento da dita resistência na dita planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à raiz torta.

A presente invenção descreve ainda: Um método de identificação de uma planta de B. oleracea resistente à raiz torta que compreende as etapas de: a) obtenção de uma amostra de uma planta de B. oleracea; b) detecção na dita amostra de um fragmento de DNA que pode ser obtido através da amplificação pela PCR utilizando o iniciador O20 (SEQ ID No: 1) ou o iniciador Y13 (SEQ ID No: 2), em que a dita planta de B. oleracea da etapa b) é resistente à raiz torta.

A presente invenção descreve ainda: Um método de seleção de uma plante de B. oleracea resistente à raiz torta de uma população de plantas de B. oleracea que compreende as etapas de: a) fornecimento de uma população de plantas de B. oleracea; b) obtenção de uma amostra da dita população; c) detecção na dita amostra de um fragmento de DNA que pode ser obtido através da amplificação pela PCR utilizando o iniciador O20 (SEQ ID No: 1) ou o iniciador Y13 (SEQ ID No: 2), em que a dita planta de B. oleracea da etapa b) é resistente à raiz torta.

Definições

Traço: característica ou fenótipo, por exemplo, uma resistência a uma doença. Um traço pode ser herdado de uma maneira dominante ou recessiva ou pode ser monogênico ou poligênico. Um traço é, por exemplo, uma resistência a uma doença, tal como a raiz torta.

Resistência: característica ou fenótipo de uma planta para exibir nenhum sintoma ou sintomas insignificantes de uma doença. Resistência é: assim preferencialmente a capacidade de uma planta de reduzir o desenvol-vimento de um agente patogênico. (ver, por exemplo, Robinson, R. A., 1969: Review Applied Mycology 48, 593-606). Monogênico: determinado por um único lócus gênico. Poligênico: determinado por mais de um lócus. Dominante: determina o fenótipo quando presente no estado heterozigoto ou homozigoto. Recessivo: somente exibido quando presente no estado homo- zigoto.

Lócus: região de um cromossomo, que compreende um ou mais fatores genéticos, por exemplo, um ou vários genes, que contribuem para um traço, tal como uma resistência a uma doença.

Ligação genética: tendência de regiões cromossômicas de serem herdadas juntas como um resultado de sua localização no mesmo cromossomo. Medida pela recombinação percentual entre loci (centi-Morgan, cM).

Isogênica: plantas que são geneticamente idênticas, exceto pelo fato de que podem diferir pela presença ou ausência de uma seqüência de DNA heteróloga.

Seleção auxiliada por marcador: se refere ao processo de seleção de um traço desejado ou de traços desejados em uma planta ou plantas através da detecção de um ou mais ácidos nucléicos da planta, em que o ácido nucléico está associado com o traço desejado.

Dihaplóide: duplicação do estado haplóide (cromossomos isolados) do genoma (por exemplo, através do cultivo de anteras ou do cultivo de microsporos) fornecendo uma planta homozigota completa.

Planta "testadora": planta utilizada para caracterizar geneticamente um traço em uma planta que será testada. Tipicamente, a planta que será testada é cruzada com uma planta "testadora" e a proporção de segregação do traço na progênie do cruzamento é classificada.

A presente invenção descreve plantas de B. oleracea resistentes à doença da raiz torta, mais particularmente à doença da raiz torta causada pelo agente patogênico Plasmodiophora brassicae. Em particular, a presente invenção descreve plantas de B. oleracea, que compreendem uma resistência monogênica dominante à doença. Esta resistência fornece maior resistência à doença, quando comparada às resistências existentes em B. olera- cea e pode ser facilmente transferida entre plantas de B. oleracea.

As espécies e as subespécies de Brassica são, por exemplo, descritas em P. H. Williams (Screening Crucifers for multiple disease resistance, Workshop 1981, Um. Wisconsin-Madison) e foram analisadas geneticamente em Song, K M e outros TAG 75, 1988, 784-794; TAG 76, 1988, 593-600 e TAG 79, 1990, 497-506 (Série de 3 artigos).

Em uma modalidade preferida, as plantas de B. oleracea da presente invenção são, por exemplo: Brassica oleracea L. (plantações de repolho) • var. acephala DC. (couves) • var. albiflora Sun [= B. alboglabra] (couve chinesa) • var. alboglabra [= B. alboglabra] (couve chinesa) • var. botrytis L. (couve-flor, certo tipo de brócolis) • var. capitata L. (repolho) • var. chinensis Prain (sarson da Birmânia) • var. fimbriata Mill. (couve de cozinha) • var. fruticosa Metz. (couve de mil cabeças) • var. gemmifera DC. (couve de Bruxelas) • var. gongylodes L. (couve-rábano) • var. itálica Plenck. (brócolis, calabresa) • var. sabauda L. (repolho savoy) • var. sabellica (variedade de couve) • var. tronchuda L. H. Bailey (repolho tronchudo) • var. costata (repolho português) • var. medullosa (couve de caule de medula) • var. pamifolia (couve chinesa) • var. selensia (borecole)

As plantas de B. oleracea preferidas da presente invenção são o repolho branco, a couve-flor, a couve de Bruxelas e o brócolis.

De acordo com a presente invenção, uma resistência dominante monogênica à raiz torta é transferida do repolho chinês (B. rappa) para o brócolis (B. oleracea). A hibridização interespecífica é realizada entre o bró- colis (B. oleracea var. itálica) como parental do sexo feminino e B. rapa como parental do sexo masculino.

As linhagens endógamas de brócolis foram escolhidas como fêmeas para prevenir organelas celulares de origens diferentes nos produtos finais do cruzamento. O parental do sexo masculino no cruzamento interes- pecífico era um híbrido F1 do repolho chinês resistente à raiz torta proveniente do Japão, disponível comercialmente sob o nome "Parkin" (Takii Seeds, Japão). Após cada cruzamento ou retrocruzamento, os cromossomos das plantas resultantes foram contados para avaliar o nível de ploidia das plantas e o progresso em direção à obtenção de um conjunto cromossômico de B. oleracea. A contagem de cromossomos foi realizada de acordo com o método de Chiang e outros (1979) Euphytica 28: 41-45. O trabalho com citômetro de fluxo foi feito com um Partec CA II (Partech, Reino Unido).

Os híbridos F1 resultantes do cruzamento foram obtidos através do resgate de embriões. O resgate de embriões tinha que ser utilizado uma vez que B. rapa e B. oleracea não possuem o mesmo número de cromossomos e são, portanto, incompatíveis sexualmente. O resgate de embriões

permite resolver os problemas da degradação do endosperma. A técnica de resgate de embriões descrita por Harbert e outros (Euphytica 18 (1969) pp. 425-429) foi utilizada. Os óvulos esterilizados de 10-12 dias de idade após a polinização são cortados na metade e introduzidos em um meio de cultura mantida em movimento constante. O meio de cultura é basicamente o meio de White com 8% de sacarose e 400 ppm de hidrolisado de caseína. Os embriões são lavados dos óvulos e cultivados no meio líquido.

As plantas F1 resistentes à raiz torta foram cruzadas com bróco- lis (isto é, retrocruzadas). O resgate de embriões como descrito anteriormente foi também necessário para a obtenção de plantas que resultam do primeiro retrocruzamento (isto é, plantas BC1).

As plantas BC1 resistentes à raiz torta foram retrocruzadas novamente com brócolis e três plantas BC2 resistentes à raiz torta foram obtidas através de um conjunto normal de sementes. As plantas foram novamente retrocruzadas com brócolis e as plantas resultantes do quarto retro- cruzamento (BC4) foram utilizadas como fonte da resistência para outras plantas de cultivo de B. oleracea.

O protocolo experimental detalhado que leva à transferência da resistência à raiz torta à B. oleracea é descrito no Exemplo 1. Os testes para doenças utilizados para testar em relação à presença da resistência são descritos no Exemplo 2. Os resultados dos testes de campo demonstrando resistência à raiz torta são mostrados no Exemplo 3.

Uma linhagem representativa de B. oleracea que compreende a resistência dominante monogênica à raiz torta de acordo com a presente invenção, a linhagem CFL667, foi depositada no NCIMB, Aberdeen AB2 1RY, Escócia, Reino Unido sob o número de acesso NCIMB 41134 em 28 de junho de 2002. As plantas da linhagem CFL667 são uma linhagem estéril do sexo masculino citoplásmico e são heterozigotas em relação à resistência.

Conseqüentemente, a resistência à raiz torta de acordo com a presente invenção pode ser obtida partindo da linhagem CFL667, depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma planta de B. oleracea resistente à raiz torta é definida como uma planta avaliada na classificação de 0 ou 1 na escala de 0-5 do exemplo 2 contido aqui ou como uma planta avaliada na classificação de 1 ou 2 na escala de 1-9 do exemplo 2 contido aqui.

A resistência à raiz torta foi transferida para outras B. oleraceas, em particular para o repolho branco, a couve-flor e a couve de Bruxelas, utilizando técnicas de cultivo padronizadas bem conhecidas na técnica da Brassica. O traço foi também submetido à introgressão em linhagens de elite de B. oleracea. A introgressão da resistência na linhagem de elite é, por exemplo, atingida pelo cultivo com seleção recorrente, por exemplo, através de retrocruzamento. Neste caso, a linhagem de elite (parental recorrente) é em primeiro lugar cruzada com um endógamo doador (o parental não recorrente) que carrega à resistência. A progênie deste cruzamento é então cruzada de volta com o parental recorrente seguido pela seleção na progênie resultante para a resistência à raiz torta. Após três, preferencialmente quatro, mais preferencialmente cinco ou mais gerações de retrocruzamentos com o parental recorrente com seleção para a resistência à raiz torta, a pro- gênie é heterozigota em relação ao lócus que porta a resistência, mas é similar ao parental recorrente para a maioria ou quase todos os outros genes (ver, por exemplo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4a Ed., 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol. 1: Theory and Technique, 360-376, incorporados aqui como referência). A seleção pela resistência à raiz torta é realizada após cada cruzamento. Em uma modalidade preferida, a presente invenção compreende, portanto, um método de transferência de uma resistência dominante e monogênica à raiz torta na planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à doença que compreende as etapas a seguir: o cruzamento de uma primeira planta de B. ole- racea com uma segunda planta de B. oleracea, em que a primeira planta compreende uma resistência dominante e monogênica à raiz torta, a seleção de uma planta resultante do cruzamento que é resistente à raiz torta. Uma planta de B. oleracea susceptível ou menos resistente à doença é, por exemplo, classificada no nível 4 ou acima, preferencialmente 3 ou acima, em um teste para a doença que possui uma escala de 0-5. O método compreende ainda o retrocruzamento de uma planta selecionada anteriormente com a segunda planta de B. oleracea até que a resistência tenha sido transferida para a segunda planta de B. oleracea.

A resistência à raiz torta é preferencialmente transferida para linhagens comerciais de B. oleracea. Tais linhagens são, por exemplo, linhagens endógamas. Alternativamente, as linhagens comerciais são híbridas, que são obtidas através do cruzamento de duas linhagens endógamas. Neste caso, a resistência à raiz torta pode estar presente em um dos endóga- mos parentais ou em ambos. Portanto, em uma modalidade preferida, a presente invenção descreve uma linhagem de B. oleracea endógama ou híbrida que compreende uma resistência dominante monogênica à raiz torta, incluindo sementes e materiais do dito endógamo ou híbrido e a progênie da mesma. Preferencialmente, a resistência pode ser obtida partindo de uma B. rapa, preferencialmente do híbrido F1 de repolho chinês "Parkin". Em uma outra modalidade preferida, a resistência à raiz torta de acordo com a presente invenção está presente na linhagem CFL667, depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134.

Em uma outra modalidade preferida, uma planta de B. oleracea resistente à raiz torta da presente invenção é do sexo masculino estéril. A esterilidade do sexo masculino tem valor no cultivo das sementes híbridas de B. oleracea porque as flores normais são autopolinizadoras. As linhagens estéreis do sexo masculino não produzem pólen viável e não podem se au- topolinizar. Através da eliminação do pólen de uma variedade parental em um cruzamento, um criador de plantas garante a obtenção de uma semente híbrida de qualidade uniforme. Um sistema de esterilidade do sexo masculino particularmente vantajoso é a esterilidade do sexo masculino citoplásmico (CMS). Um exemplo de tal CMS em Brassica é o CMS de Ogura encontrado originalmente no rabanete (ver, por exemplo, Ogura (1968) Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 6: 39-78; Makaroff (1989) Journal of Biol. Chem. 264: 11706-11713; Patente U.S. No 5.254.802). Portanto, a presente invenção descreve um macho estéril, em particular CMS, planta de B. oleracea que compreende uma resistência monogênica dominante à raiz torta, que inclui sementes e materiais das ditas plantas e a progênie das mesmas. Preferen-cialmente, a resistência pode ser obtida de B. rapa, preferencialmente do híbrido F1 do repolho chinês "Parkin". Preferencialmente, o CMS é derivado de um genoma de Ogura.

A fertilidade do sexo masculino de plantas estéreis do sexo masculino pode ser restaurada através de métodos bem conhecidos na técnica. A fertilidade do sexo masculino de plantas CMS, em particular de plantas CMS de B. oleracea, é preferencialmente restaurada pela fusão de células. Para isso, as células de uma planta de CMS são fundidas com células de uma planta fértil do sexo masculino para substituir o núcleo da planta fértil pelo núcleo da planta estéril na estrutura citoplásmica fértil e restaurar a fertilidade. As técnicas de fusão de células são bem conhecidas na técnica e são, por exemplo, descritas em Sigareva e Earle (1997) Theor. Appl. Genet. 94: 213-320. Utilizando tais técnicas, as plantas férteis do sexo masculino são regeneradas e é permitido que seja autopolinizadas ou cruzadas com uma outra planta.

Os traços, em particular, os traços com um fenótipo que pode ser classificado tal como uma resistência a uma doença, podem ser passados geneticamente através de cruzamentos e a segregação do traço pode ser classificado na progênie que resulta do cruzamento. Isto permite, por exemplo, determinar se um traço é dominante ou recessivo. Isto permite ainda testar se fatores genéticos para os traços estão no mesmo lócus (por exemplo, no(s) mesmo(s) gene(s) ou em genes diferentes, no(s) mesmo(s) alelo(s) ou em alelos diferentes) ou em loci ligados ou não ligados diferentes.

Por exemplo, quando uma planta homozigota para um traço é cruzada com uma planta homzigota "testadora" em relação a um traço dominante que possui o mesmo fenótipo, a progênie do cruzamento não se segrega em relação ao fenótipo do traço (proporção de 1:0). Esta proporção de 1:0 é avaliada quando os fatores genéticos para o traço estão no mesmo lócus ou em loci diferentes. Quando as plantas da progênie da primeira ge- ração do cruzamento anterior são autopolinizadas, é observada uma proporção de 1:0 para os traços dominantes com base nos fatores genéticos no mesmo lócus para a planta que será testada e para a planta "testadora". Em contraste, uma proporção de 15:1 é observada para os traços dominantes com base nos fatores genéticos em loci não ligados diferentes para a planta que será testada e para a planta "testadora". Se os fatores genéticos estiverem em loci diferentes, mas ligados geneticamente, a proporção fica geralmente entre estes 1:0 e 15:1.

Em um outro exemplo, quando uma planta que será testada he- terozigota para um traço dominante for cruzada com uma planta "testadora" também heterozigota para o traço dominante que possui o mesmo fenótipo, a progênie do cruzamento se segrega 3:1 em relação ao fenótipo resistente. Esta proporção de 3:1 é avaliada quando os fatores genéticos para o traço estão no mesmo lócus ou em loci diferentes. Quando as plantas da progênie da primeira geração do cruzamento anterior são cruzadas com plantas da linhagem "testadora" ou novamente com a planta que será testada heterozi- gota em relação ao traço, é observada uma proporção de 3:1 para os traços dominantes com base nos fatores genéticos no mesmo lócus, enquanto que uma proporção de 23:9 é observada para os traços dominantes com base nos fatores genéticos em loci não ligados diferentes. Se dois fatores genéticos estiverem em loci diferentes, mas ligados geneticamente, a proporção fica geralmente entre estas duas proporções. Em uma outra modalidade preferida, as progênies da segunda geração de plantas individuais são analisadas separadamente. Neste caso, para os fatores genéticos no mesmo lócus, na segunda geração, 50% das plantas da prole se segregam novamente em 3:1, 25% em 1:0 e 25% em 1:1 quando cruzadas com uma planta heterozi- gota. Com um fator genético não ligado na planta que será testada, na segunda geração, 50% das plantas da prole se segregam novamente em 3:1, 25% em 7:1 e 25% em 1:1 (nenhuma planta se fixou em relação à resistência na segunda geração).

Se o traço for uma resistência a uma doença e o teste da doença resultar na morte de plantas susceptíveis ou prevenir plantas susceptíves de florescerem, são avaliadas proporções de segregação diferentes na pro- gênie da segunda geração por causa da morte ou da falta de progênie das plantas da progênie da primeira geração sensíveis. Por exemplo, neste caso, ao invés de 3:1 e de 23:9 anteriores, as proporções de 5:1 e 19:1, respectivamente são observadas. Se plantas individuais forem avaliadas, as progê- nies de segunda geração são 2/3 3:1 e 1/3 1:0 em relação aos fatores genéticos no mesmo lócus e 2/3 3:1 e 1/3 7:1 para os fatores genéticos em loci diferentes.

Outras estratégias de cruzamento também são utilizadas, por exemplo, com outras combinações de plantas homozigotas ou heterozigotas ou com plantas que não compreendem o traço. A segregação do traço na progênie é então avaliada. Estas estratégias de cruzamento e suas proporções de segregação correspondente são bem conhecidas pelo perito na técnica, que também sabe como obter e utilizar plantas "testadoras" apropriadas e como interpretar as proporções de segregação obtidas de tais cruzamentos. Em uma outra modalidade preferida, os esquemas de cruzamento ilustrados anteriormente são aplicados à resistência à doença da raiz torta no contexto da presente invenção. Conseqüentemente, em uma outra modalidade preferida, a presente invenção descreve uma planta de B. oleracea homozigota ou heterozigota em relação a uma resistência à raiz torta, em que a dita resistência à raiz torta é homozigota em uma planta que será testada e a dita planta que será testada é cruzada com uma planta "testadora" homozigota para uma resistência à raiz torta, a progênie da primeira geração do dito cruzamento mostra uma proporção de segregação de 1:0 para a resistência à raiz torta. Uma planta "testadora" para tal cruzamento é, por exemplo, uma planta derivada da linhagem CFL667 depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134 e que compreende a resistência da presente invenção. Em uma modalidade preferida, uma planta "testadora" é derivada de uma planta da linhagem CFL667 ou de uma progênie de uma planta em uma linhagem CFL667 através da fusão de células. Outras plantas férteis do sexo masculino que compreendem a resistência da presente invenção podem ser também utilizadas como planta "testadora". Em uma modalidade preferida, quando se permite que as plantas da progênie da primeira geração se autopolinizem, a progênie da segunda geração resultante exibe uma proporção de segregação de 15:1 em relação à resistência. Ainda em uma outra modalidade preferida, uma proporção de segregação entre 1:0 e 15:1 é avaliada na progênie da segunda geração após a autopolinização. Assim, com base nas proporções de segregação, é determinado se a resistência da planta que será testada e a resistência das plantas "testadoras" estão localizadas no mesmo lócus ou em loci diferentes ligados ou não ligados.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção descreve uma planta de B. oleracea homozigota ou heterozigota em relação à resistência à raiz torta, em que a dita resistência à raiz torta é heterozigota em uma planta que será testada e a dita planta que será testada é cruzada com uma planta "testadora" heterozigota em relação à resistência à raiz torta, a progênie da primeira geração do dito cruzamento exibe uma proporção de segregação de 3:1 para a resistência à raiz torta. Uma planta "testadora" para cada cruzamento é, por exemplo, uma planta da linhagem CFL667 depositada no NCIMB sob o número de acesso NCIMB 41134 ou uma planta de progênie da linhagem CFL667 que compreende a resistência da presente invenção. Qualquer outra planta que compreenda a resistência da presente invenção é também utilizada como a planta "testadora". Em uma outra modalidade preferida, quando as plantas da progênie da primeira geração são adicionalmente cruzadas com plantas que devem ser testadas heterozigotas em relação à resistência, espera-se que a progênie de segunda geração resultante exiba uma proporção de segregação de 3:1 em relação à resistência. Entretanto, uma vez que plantas sensíveis geralmente não sobrevivem ao teste da doença em relação à resistência à raiz torta ou são prevenidas de florescerem após tal teste, a progênie de segunda geração fornece uma proporção de segregação de 5:1. Em uma outra modalidade preferida, quando as plantas da progênie da primeira geração são cruzadas com plantas da linhagem "testadora", espera-se que a progênie da segunda geração resultante exiba uma proporção de segregação de 23:9 em relação à resistência, mas geralmente fornece uma proporção de segregação de 19:5. Ain- da em uma outra modalidade preferida, uma proporção de segregação entre 5:1 e 19:5 é avaliada na progênie de segunda geração. Quando as progê- nies de plantas individuais são avaliadas separadamente, as proporções descritas anteriormente são observadas. Assim, com base nas proporções de segregação, é determinada se a resistência da planta que será testada e a resistência das plantas "testadora" estão localizadas no mesmo lócus ou em loci diferentes ligados ou não ligados.

Ainda em uma outra modalidade preferida, a presente invenção descreve marcadores moleculares, que estão ligados à resistência dominante monogênica à raiz torta. Tais marcadores moleculares permitem diferenciar no nível molecular entre plantas resistentes e susceptíveis e são assim indicadores da resistência monogênica e dominante em plantas de Brassica, preferencialmente plantas de B. oleracea. Estes marcadores moleculares se baseiam nos polimorfismos genéticos entre as plantas resistentes e susceptíveis e ficam localizados no lócus da resistência ou nas proximidades íntimas. Os marcadores moleculares são, por exemplo, utilizados para o cultivo e para a obtenção de plantas resistentes, para seguir a presença da resistência durante o cultivo ou para controlar a presença da resistência em um lote de sementes comerciais.

Assim, em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece métodos para o mapeamento da resistência à raiz torta em plantas de Brassica, preferencialmente plantas de B. oleracea, métodos para a determinação do fato da resistência estar presente em uma planta de Brassica, preferencialmente uma planta de B. oleracea e métodos para a transferência da resistência para uma planta de Brassica susceptível ou menos resistente, preferencialmente uma planta de B. oleracea. Por exemplo, os métodos são utilizados no cultivo de novas plantas ou linhagens resistentes ou para controlar a qualidade do lote de sementes. Os marcadores moleculares descritos aqui permitem uma liberação mais rápida de linhagens resistentes para o mercado e para um melhor controle de qualidade de lotes de sementes comerciais. Um ensaio para doenças pode ser assim evitado e substituído pelo uso de um marcador comercial.

Os marcadores comerciais e os métodos da presente invenção são particularmente benéficos nas várias etapas que levam a uma variedade comercial, tal como nos programas de cultivo e no processo de produção de sementes. Por exemplo, a presente invenção é utilizada para a introgressão a resistência em uma planta de B. oleracea, por exemplo, uma linhagem en- dógama de elite. A seleção em relação à resistência à raiz torta é realizada através do teste de sementes ou de plantas que resultam de cada cruzamento com marcadores moleculares. Em uma modalidade preferida, a presente invenção abrange, portanto, métodos de transferência de uma resistência dominante ou monogênica à raiz torta em uma planta de B. oleracea susceptível ou menos tolerante à doença que compreende as etapas a seguir: cruzamento de uma primeira planta resistente à doença com uma segunda planta susceptível ou menos resistente, coleta das sementes resultantes do cruzamento, obtenção de uma amostra da semente ou de uma planta cultivada partindo da mesma, detecção na dita amostra de um marcador molecular da presente invenção, a presença do dito marcador molecular sendo indicativo da resistência à doença na dita semente ou planta, seleção de uma planta positiva em relação à presença do dito marcador, em que a dita planta é preferencialmente resistente à doença. Preferencialmente, a resistência é então adicionalmente retrocruzada na planta susceptível ou menos resistente.

Os marcadores moleculares da presente invenção são ainda convenientemente utilizados na produção de linhagens ou cultivares endó- gamos homogêneos estáveis (também chamados algumas vezes de variedades), através da qual uma linhagem particular é autopolinizada até a pureza e a homogeneidade satisfatórias da linhagem ser atingida. A presente invenção é similarmente utilizada para a produção comercial de sementes de uma linhagem ou cultivar particular. Aqui novamente, após cada cruzamento, é aplicado um método da presente invenção às sementes que resultam do cruzamento e somente as plantas resistentes são selecionadas. Em uma modalidade preferida, a presente invenção, portanto, abrange métodos de produção de sementes ou plantas resistentes à raiz torta que compreendem as etapas a seguir: cruzamento de uma planta resistente com a mesma, coleta das sementes resultantes do cruzamento, obtenção de uma amostra da semente ou de uma planta cultivada partindo da mesma, detecção na dita amostra de um marcador molecular da presente invenção, a presença do dito marcador molecular sendo indicativa da resistência à doença na dita semente ou planta.

Similarmente, a presente invenção é utilizada na produção de sementes híbridas. Neste caso, a presente invenção é utilizada para garantir que todas as sementes híbridas que germinam e crescem no campo sejam resistentes à doença. Preferencialmente, os marcadores moleculares da presente invenção são também utilizados na garantia da qualidade para garantir que a resistência à doença está presente nas sementes híbridas. Em uma modalidade preferida, a presente invenção abrange, portanto, métodos para a produção de sementes que compreendem as etapas a seguir: cruzamento de uma primeira planta com uma segunda planta, obtenção de uma amostra da semente ou de uma planta cultivada partindo da mesma, detecção na dita amostra de um marcador molecular da presente invenção, a presença do dito marcador molecular sendo indicativa da resistência à doença na dita semente ou planta. A presente invenção fornece assim um avanço significativo no cruzamento comercial e nos processos de produção de sementes.

Em uma modalidade preferida, um marcador molecular da presente invenção fica dentro de 10 centi-Morgan (cM) partindo do lócus da resistência à raiz torta, preferencialmente dentro de 6 cM, preferencialmente dentro de 5 cM, mais preferencialmente dentro de 3 cM, ainda mais preferencialmente dentro de 1,5 cM partindo do lócus da resistência à raiz torta e assim se co-segrega firmemente com a resistência.

Os polimorfismos preferidos no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, repetições de seqüências individuais (SSR, ver, por exemplo, Hearne e outros (1992) Trends Genet 8:288-294), polimorfismos de nucleotídeos individuais (SNP, Botstein B e outros (1980) Am J Hum Genet 32:314-331) e quaisquer outros tipos de rearranjos de DNA, tais como deleções, amplificações, interseções. Os métodos para a detecção de poli- morfismos bem conhecidos na técnica podem ser aplicados no contexto da presente invenção para produzir um marcador molecular ligado à resistência. Os métodos preferidos incluem os métodos baseados na técnica de amplificação pela PCR, por exemplo, a tecnologia de SSR e a tecnologia de RAPDs (Williams e outros (1990) Nucl Acids Res 18:6531-6535). Em geral, os oligonucleotídeos preferidos para a PCR possuem aproximadamente 8 até 50 nucleotídeos de comprimento, mais preferencialmente 10 até 30 nu- cleotídeos de comprimento. Os fragmentos amplificados pela PCR que compreendem um sítio compreendendo um polimorfismo da presente invenção possuem preferencialmente aproximadamente 100-3.000 de comprimento, mais preferencialmente aproximadamente 200 até 2.000 nucleotídeos de comprimento, ainda mais preferencialmente aproximadamente 300 até 1.000 nucleotídeos de comprimento. Outros métodos para a seleção ou a detecção de polimorfismos, que podem ser aplicados na presente invenção incluem o seqüenciamento direto de ácidos nucléicos, o ensaio de polimorfismo de um filamento isolado, a reação em cadeia da ligase, a clivagem enzimática e a hibridização por southern.

Os métodos alternativos incluem vários métodos para a detecção de Cleaved Amplified Polymorphic Sequences (Seqüências Polimórficas Amplificadas Clivadas) (CAPS: Konieczny e outros, The Plant Journal 4(2):403-410, 1993) e para a detecção de Polimorfismos de Nucleotídeos Individuais (SNPs) com um método denominado "CAMPS" para as Seqüên- cias Polimórficas Modificadas Amplificadas Clivadas, também conhecidas como dCAPS (Neff e outros, 1998. Plant J. 14: 387-392; Michaels e Amasi- no, 1998. Plant J 14: 381-385). No método de CAPS, um ácido nucléico contendo um sítio de restrição polimórfico é amplificado utilizando iniciadores que flanqueiam o sítio de restrição. O produto da PCR resultante é digerido com a endonuclease de restrição correspondente ao sítio de restrição polimórfi- co e os produtos digeridos são analisados através de eletroforese em gel.

A hibridização por Southern é também um método eficiente de identificação de diferenças nas seqüências, em particular, utilizando a tecnologia de RFLP (polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição) (Botstein B e outros (1980) Am J Hum Genet 32:314-331).

Em uma modalidade preferida, a presente invenção descreve marcadores moleculares ligados intimamente à resistência à raiz torta obtidos utilizando a tecnologia de RAPDs (ver o exemplo 4 contido aqui).

Pretende-se que os exemplos a seguir forneçam ilustrações da aplicação da presente invenção. Não é pretendido que os exemplos a seguir definam completamente ou diferentemente limitem o âmbito da invenção.

Todas as referências citadas aqui são incorporadas como referência no pedido de patente em suas totalidades.

Exemplos Exemplo 1: Transferência da resistência à B. oleracea F1 Algumas centenas de cruzamentos entre o híbrido F1 do repolho chinês e do brócolis resistentes à raiz torta (B. oleracea) foram realizadas. Destes cruzamentos, os embriões foram recuperados (Harbert e outros, Euphytica 18 (1969) pp. 425-429). Quatro destes embriões se desenvolveram em plantas, dos quais dois provaram ser resistentes à doença. Estas duas plantas resistentes possuíam 19 cromossomos. O fenótipo era um híbrido entre o repolho chinês e o brócolis. BC1

A recuperação dos embriões foi realizada novamente para a obtenção de plantas BC1. As linhagens endógamas de brócolis foram utilizadas como o parental para retrocruzamento. As linhagens de brócolis foram também utilizadas como um parental para retrocruzamento para as gerações seguintes. Somente uma das duas plantas F1 mencionadas anteriormente respondeu e 5 embriões se desenvolveram em plantas. Quatro dos mesmos eram resistentes à raiz torta. O fenótipo das plantas BC1 era mais próximo ao do parental de retrocruzamento do brócolis.

Como a distribuição dos cromossomos do genoma de B. rapa nas plantas BC1 é aleatória, as plantas contêm 18 cromossomos de B. ole- racea e 0-10 cromossomos de B. rapa. Conseqüentemente, foram observa- das plantas com 18-28 cromossomos. BC2 As plantas BC2 foram obtidas através do grupo de sementes das plantas BC1. Nove plantas originadas do conjunto de sementes em uma planta denominada como planta B da BC1 anterior provaram ser resistentes à raiz torta. O número de cromossomos foi determinado e o desvio do conteúdo normal de DNA foi determinado com um citômetro de fuxo. Três plantas, B23, B27 e B28 foram utilizadas adicionalmente no programa. BC3 e BC4

As BC3 e as BC4 foram também obtidas através de um conjunto de sementes. A planta B27, que já era diplóide na BC2, tinha incorporado o gene de resistência dominante à raiz torta. As gerações de retrocruzamento BC3 e BC4 exibem a segregação 1:1 esperada.

A resistência também submetida à introgressão nas plantas B23 e B28, como foi mostrado nas últimas gerações.

Teste de campo

Um teste de campo preliminar foi realizado com as plantas resistentes provenientes do teste de plantas novas de BC3 e B27. As plantas foram plantadas em um campo bastante infestado na estação testadora de Kleve, Alemanha. Todas as plantas permaneceram saudáveis e não exibiram sintomas quando colidas na maturidade.

Transferência de outras B. oleraceas

A B27 resistente foi utilizada como fonte da resistência à raiz torta para um programa de retrocruzamento no brócolis, na couve-flor, no repolho e na couve de Bruxelas, levando, por exemplo, a variedades resistentes descritas no Exemplo 3.

Exemplo 2: Teste de doença

As plantas novas são transplantadas uma semana após a semeadura em vários vasos contendo uma mistura de areia e solo de turfa a uma proporção de 2:1 com pH < 6. Um dia após o transplante, 1 mL de uma solução de 1 x 106 cistos/mL é injetado nos vasos. A solução é feita de uma mistura de fontes de raiz torta com os códigos ECD 16/3/30, 16/23/30, 16/3/14 e 16/7/30 (Buczacki e outros, 1975: Trans. Br. Mycol. Soc. 65, 295303). Nas primeiras duas semanas o solo é mantido úmido, após as quais o solo pode secar um pouco. A temperatura de incubação é de 18-20°C na estufa. 4-5 semanas após o transplante, as raízes são limpas por lavagem e avaliadas em relação à doença.

Alternativamente, as sementes são semeadas diretamente em bandejas com vários vasos em uma mistura padronizada de areia : solo de turfa (2:1 EGO, pH 5-6, 1 semente por vasos múltiplos). Normalmente, são testadas 20-30 plantas/linhagem. Aproximadamente 7-10 dias após a semeadura, as plantas são inoculadas, uma segunda inoculação é sucedida 2-5 dias após a primeira inoculação. Se for suspeito que as sementes estejam germinando de forma ruim, a semeadura é feita em bandejas negras em fileiras e as plantas são transplantadas após 7-10 dias para as bandejas de vários vasos. A temperatura de incubação é de 20-22°C.

O inóculo padronizado é o isolado 9 (um isolado ativo obtido de um campo infectado na Alemanha). O inóculo é preparado partindo de raízes infectadas armazenadas a -20°C em sacos plásticos. As raízes são transferidas para uma mistura (1 parte de raízes, 5 partes de água) durante cerca de 2 min. As partículas pequenas são então filtradas com gaze grosseira de algodão e o número de cistos (arredondados, coloridos suavemente (azul- claro) é contado. Um mL de 0,5 - 1 x 107 cistos/mL é adicionado ao cau- le/raiz na base da planta com uma pipeta Eppendorf. O inóculo precisa ser agitado regularmente para misturar os cistos disponíveis na suspensão de forma homogênea.

Dependendo do tamanho do teste, controles suficientes precisam estar presentes. Os controles susceptíveis são, por exemplo: White Rock (couve-flor), Maximus ou outra F1 (couve de Bruxelas), Marathon (repolho branco). Como controle de resistência pode ser adicionado Parkin ou Storkin (repolho chinês). Hopkin (repolho chinês susceptível) pode ser adicionado, uma vez que fornece em um estágio intermediário uma indicação do fato da inoculação ter ocorrido.

As plantas precisam manter umidade suficientemente durante o teste. A fertilização regular é necessária, entretanto, as plantas não podem crescer excessivamente. A temperatura é de 22-20°C (dia/noite), 16 h de luz. Após 4 semanas (verão) - 6 (inverno) após a inoculação, as plantas podem ser retiradas do solo, lavadas e avaliadas em relação aos sintomas.

Uma escala de observação para um teste de doença é, por exemplo: 0 = sem tortuosidades, sistema de raiz saudável 1 = 1 - 2 pequenas tortuosidades nas raízes laterais, algumas vezes as raízes exibem coloração marrom 2 = várias tortuosidades pequenas nas raízes laterais, a raiz principal algumas vezes um pouco espessada 3 = raiz principal espessada na maior parte 4 = raiz principal gravemente espessada e coalescida com as raízes laterais tortas, algumas raízes normais ainda presentes 5 = um grumo de raízes, nenhuma raiz normal presente

As plantas com escore 0 (algumas vezes também as 1s, dependendo da gravidade do teste de estufa e da genética envolvida) fora do teste de estufa são então transferidas para um campo infectado pela raiz torta (por exemplo, campo De Wit em Enkhuizen). Normalmente, plantas que retornaram ao estado silvestre na estufa se tornam gravemente infectadas no campo e são facilmente visíveis (crescimento interrompido). Entretanto, estas são somente plantas muito raras.

Uma outra escala de observação para um teste da doença é, por exemplo: 1 = Nenhuma formação de galha visível na raiz 2 = Uma única galha nas raízes laterais 3 = Várias galhas pequenas nas raízes laterais (planta saudável) 4 = Formação suave de galhas da raiz principal, muitas galhas pequenas nas raízes laterais 5 = Formação moderada de galhas da raiz principal, muitas galhas pequenas e várias grandes nas raízes laterais 6 = Formação grave de galhas da raiz principal, muitas galhas grandes nas laterais 7 = Galhas graves, várias raízes saudáveis remanescentes 8 = Galhas graves, algumas raízes saudáveis presentes 9 = Galhas graves, nenhuma raiz saudável presente Exemplo 3: Resultados de testes de campo Tabela 1

Teste de campo em Werribee, Victória, Austrália. Plantas trans-plantadas em janeiro de 2002 em solo infestado com raiz torta. Uma avaliação depois de 6 semanas após o transplante mostra (Tabela 1) já o efeito dos híbridos de couve-flor resistentes à raiz torta de acordo com a presente invenção (F308 e F311) comparados com as variedades susceptíveis (White Rock e Triumphant) e uma variedade susceptível (Triumphant) tratada com quantidades diferentes de um fungicida (Shirlane) e adição de cal (aumentando o pH que possui um efeito redutor sobre a gravidade da raiz torta, por exemplo, Dixon & Page, 1998, Acta Horticulture, 459, 343-349). A escala de observação anterior com a classificação de 1-9 foi utilizada no teste abaixo.

Tabela 2 Os resultados provenientes de um teste com plantas jovens de couve-flor com isolados originados de 3 locais diferentes na Austrália (Cora Lyn, Werribee e Trentham). Os isolados foram inoculados com um processo que pode ser comparado como descrito anteriormente. White Rock é um controle susceptível e E70 é uma couve-flor híbrida resistente de acordo com a presente invenção. A escala de observação anterior com a classificação de 1-9 foi utilizada no teste abaixo.

Tabela 3 Resultados de testes de campo foram realizados em localiza- 10 ções diferentes na Europa infestadas naturalmente com a raiz torta em dois anos. D249, D506, E245, E246 são híbridos da couve-flor resistentes de acordo com a presente invenção, White Rock é uma variedade de couve-flor susceptível, SPR666 e A876 são híbridos de B. sprouts resistentes de acor-do com a presente invenção, Romulus e Maximus são variedades de B. 15 sprouts susceptíveis, F1182, F1187 são híbridos do repolho branco resisten-tes de acordo com a presente invenção e Marathon é uma variedade de re-polho branco susceptível. As avaliações (di05) foram feitas no final da esta-ção de cultivo em uma escala de 0-5 (ver abaixo).

Exemplo 4: Marcadores moleculares

Os marcadores de RAPDs ligados à resistência foram desenvol- vidos utilizando dois tipos de populações de repolho branco (D1544 e D1545). Dois marcadores moleculares obtidos com os iniciadores O20 e Y13, respectivamente, resultaram em produtos da amplificação da PCR que estão fortemente ligados à resistência à raiz torta. Tanto O20 quanto Y13 estão 94,6% (53 de 56) correlacionados com o resultado (resistente ou sensível) do teste para a doença na população D1544, indicando uma distância de ligação de 5,4 cM. Para a população D1555, O20 está 100%, enquanto Y13 está 95,7% (45 de 47) correlacionados com o teste para a doença, sugerindo uma ligação forte (0 cM) entre O20 e a resistência e 4,3 cM entre Y13 e a resistência. Quando se testam os RAPDs em uma população de repolho branco diplóide de 140 plantas, O20 exibe 100% (0 cM) e Y13 98,6% (1,4 cM) de correlação com o resultado dos testes para a doença.

O iniciador O20 (5'-ACA CAC GCT G-3') fornece um fragmento específico de 400 pb.

O iniciador Y13 (5'-GGG TCT CGG T-3') fornece um fragmento específico de 640 pb.

As condições de amplificação são descritas abaixo. Após a PCR, 25 μL de DNA são corridos em um gel de agarose a 1,8%.

Claims

1. Processo para produção de uma planta de B. oleracea compreendendo uma resistência monogênica e dominante à hérnia das crucíferas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) obtenção de uma planta B. rapa resistente à hérnia das crucíferas compreendendo uma resistência monogênica e dominante à hérnia das crucíferas; (b) cruzamento da referida planta de B. rapa com uma planta de B. oleracea; (c) resgate de embriões resultantes do cruzamento da etapa (b); (d) regeneração de uma planta de um embrião da etapa (c); (e) seleção de uma planta da etapa (d) que é resistente a hérnia das crucíferas compreendendo uma resistência monogênica e dominante à hérnia das crucíferas; (f) retrocruzamento de uma planta resultante da etapa (e) com uma planta B. oleracea; (g) resgate de embriões resultantes do cruzamento da etapa (f); e (h) seleção de uma planta da etapa (g) que é resistente à hérnia das crucíferas compreendendo uma resistência monogênica e dominante à hérnia das crucíferas.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a introgressão da resistência em uma linhagem pura elite B. oleracea.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o cruzamento da referida linhagem pura com outra linhagem pura de B. oleracea para produzir um híbrido.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a resistência é obtida a partir de um híbrido de F1 do repolho chinês Parkin.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a referida planta de B. ole- racea é brócolis, repolho branco, couve-flor couve de Bruxelas, couve- de-folhas, repolho savoy ou repolho roxo.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a referida planta de B. ole- racea é homozigota para a referida resistência.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida planta de B. ole- racea é heterozigota para a referida resistência.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida planta de B. ole- racea é de linhagem pura ou duplo haploide.

9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a referida planta de B. ole- racea é um híbrido.

10. Processo, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, carac-terizado pelo fato de que a referida planta de B. oleracea é macho estéril citoplasmático.

11. Processo de identificação de uma planta de B. oleracea resistente à hérnia das crucíferas, caracterizado pelo fato de que a re-sistência à hérnia das crucíferas é obtida a partir do híbrido de F1 do repolho chinês Parkin e compreende as etapas de: (a) obtenção de uma amostra proveniente de uma planta B. oleracea; (b) detecção na dita amostra de um fragmento de DNA que pode ser obtido por amplificação de PCR usando-se o iniciador O20 (SEQ ID N°. 1) ou o iniciador Y13 (SEQ ID N°. 2), sendo que a presença do referido fragmento de DNA indica que a referida planta de B. oleracea da etapa (b) é resistente à hérnia das crucíferas.