PL246007B1 - Sposób identyfikacji hybrydy F1 zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty - Google Patents
Sposób identyfikacji hybrydy F1 zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty Download PDFInfo
- Publication number
- PL246007B1 PL246007B1 PL374843A PL37484303A PL246007B1 PL 246007 B1 PL246007 B1 PL 246007B1 PL 374843 A PL374843 A PL 374843A PL 37484303 A PL37484303 A PL 37484303A PL 246007 B1 PL246007 B1 PL 246007B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plant
- resistance
- clubroot
- oleracea
- plants
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
- A01H6/20—Brassicaceae, e.g. canola, broccoli or rucola
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
- A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/13—Plant traits
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Cultivation Of Plants (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Niniejszy wynalazek ujawnia rośliny Brasica oleracea odporne na kiłę kapusty (ang. clubroot disease). Rośliny według niniejszego wynalazku w szczególności obejmują jednogenową, dominującą odporność na kiłę kapusty nabytą w wyniku introgresji z B. rapa. Taka odporność jest ulepszoną odpornością na chorobę w porównaniu z istniejącymi wcześniej odpornościami u B.oleracea.
Description
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji hybrydy F1 zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty.
Kiła kapusty jest rozpowszechnioną chorobą, która prowadzi do poważnych problemów na wielu obszarach z uprawą kapusty (patrz praca przeglądowa np. Dixon (1999) Grower, kwiecień 29, str. 2829). Choroba jest wywoływana przez jednokomórkowy organizm Plasmodiophora brassicae. Objawy choroby obejmują zniekształcenia korzenia z twardymi naroślami (maczugami), które w końcu gniją. Choroba także powoduje karłowatość poprzez zahamowanie wzrostu i w czasie stresu wodnego obserwowane jest więdnięcie liści. Chemiczna kontrola choroby nie jest skuteczna. Zatem, dla ochrony przed chorobą ważna jest dobra odporność genetyczna roślin uprawnych.
Rodzaj kapustowatych (Brassicas) obejmuje wiele gatunków o znaczeniu komercyjnym, takich jak B. ropa (kapusta pekińska, kapusta Pak Choi, rzepa), B. napus (rzepak, brukiew pastewna), B. juncea (gorczyca), B. nigra (gorczyca czarna) i B. oleracea (kalafior, brokuł, kapusta, kapusta brukselska, kapusta włoska, jarmuż, kalarepa, borecole i inne). Chociaż podgatunki w obrębie gatunku rodzaju Brassica są zazwyczaj zgodne płciowo nie musi się tak dziać pomiędzy różnymi gatunkami rodzaju Brassica. Przykładowo, B. rapa i B. oleracea nie posiadają tej samej liczby chromosomów (10 chromosomów versus 9 chromosomów), zatem nie są zgodne płciowo. Sprawia to, że przeniesienie cechy z jednego gatunku Brassica do drugiego jest szczególnie trudne.
Opisano szereg źródeł odporności na kiłę kapusty dla rodzaju Brassica (patrz, np. Bradshaw i wsp. (1997) Ann. Appl. Biol. 130:337-348; Gowers (1982) Euphytica 31:971-976). Niektóre z odporności są jednogenowe, niektóre wielogenowe, niektóre są dominujące, a niektóre recesywne. Dominujące odporności jednogenowe, opisano dla B. rapa i B. napus, jak przykładowo dominującą odporność jednogenową u kapusty pekińskiej B. rapa (Yoshikawa (1983) Japan Agricultural Research Quarterly, Vol. 17, nr 1, str. 6-11). Pokazano, że hybrydy F1 kapusty pekińskiej z taką odpornością są dobrze chronione przed kiłą kapusty, chociaż niewielka liczba szczepów („ras”) kiły kapusty jest w stanie sforsować tę odporność. Wydaje się, że rasy takie przeważają bardziej w Azji niż w Europie.
Dla kontrastu, dla gatunku B. oleracea opisano tylko wielogenowe, recesywne źródła odporności (patrz, np. Voorrips (1995) Euphytica 83:139-146). Udowodniono, że źródła takie są nie tylko niewystarczające dla odporności na kiłę kapusty, lecz, że są one także bardzo trudne do przeniesienia pomiędzy komercyjnymi liniami B. oleracea. Sprawia to, że proces dziedziczenia odporności jest zadaniem trudnym i wymagającym czasu.
Dlatego też, postęp w obszarze komercyjnej hodowli roślin, jak również procesów produkcji nasion jest niezwykle pożądany. Zatem, istnieje niezrealizowane zapotrzebowanie na rośliny B. oleracea z udoskonaloną odpornością na kiłę kapusty, gdzie odporność jest także z łatwością dziedziczona i przenoszona do komercyjnych linii B. oleracea. Zgodnie z powyższym, niniejszy wynalazek odnosi się do problemu niezadowalającej odporności na kiłę kapusty u B. oleracea.
Dla osiągnięcia udoskonalonej odporności na chorobę u B. oleracea, niniejszy wynalazek dostarcza sposobu identyfikacji hybrydy F1 zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty, obejmujący testowanie uprzednio otrzymanej rośliny, będącej hybrydą rośliny B. rapa odpornej na kiłę kapusty, zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty, i rośliny B. oleracea, która to hybryda F1 jest uzyskana w wyniku odzyskiwania zarodków i regenerowania rośliny ze wspomnianych odzyskanych zarodków;
pod kątem obecności fragmentu DNA możliwego do uzyskania przez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEQ ID NO: 1) lub startera Y13 (SEQ ID NO: 2) dla zidentyfikowania hybrydy F1 rośliny Brassica odpornej na kiłę kapusty.
Korzystnie, roślina B. rapa zawiera odporność na kiłę kapusty z hybrydy F1 Parkin Kapusty pekińskiej. Również korzystnie, jednogenową i dominującą odpornością na kiłę kapusty jest ta zawarta w reprezentatywnej linii B. oleracea CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134.
W korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku, rośliną B. oleracea jest brokuł, biała kapusta głowiasta, kalafior, kapusta brukselska, jarmuż, kapusta włoska lub czerwona kapusta głowiasta.
W kolejnym korzystnym sposobie według niniejszego wynalazku, rośliną B. oleracea jest żeńska linia chowu wsobnego.
Niniejszy opis ujawnia ponadto przeniesienie jednogenowej, dominującej odporności na kiłę kapusty z kapusty pekińskiej (B. rapa) do brokuła B. oleracea, a następnie do innych B. oleracea, takich jak kapusta głowiasta biała, kalafior i kapusta brukselska. W celu obejścia niezgodności płciowej pomiędzy B rapa i B. oleracea, odporność na kiłę kapusty przeniesiono sposobem międzygatunkowej hybrydyzacji, przy użyciu techniki odzyskiwania zarodka, a następnie poprzez powtarzanie krzyżówek wstecznych i stosowanie testów oceny choroby we wszystkich pokoleniach krzyżówek wstecznych. W uzyskanych roślinach B. oleracea osiągnięto wysoki poziom odporności na kiłę kapusty. Odporność jest stabilna i może być przekazywana na dalsze pokolenia i przenoszona do podatnych lub mniej odpornych roślin B. oleracea.
Zatem, niniejszym ujawniono rośliny B. oleracea odporne na kiłę kapusty, gdzie odporność na kiłę kapusty jest jednogenowa i dominująca, obejmujące nasiona i materiały pochodzące od omawianych roślin i ich potomstwo. Niniejszym ujawniono także sposoby wytwarzania roślin B. oleracea odpornych na kiłę kapusty, sposoby przenoszenia odporności na kiłę kapusty do podatnych lub mniej odpornych roślin B. oleracea. W niniejszym opisie ujawniono ponadto także markery molekularne sprzężone z odpornością na kiłę kapusty.
Niniejszym wykazano szczególną przewagę nad istniejącymi odpornościami na kiłę kapusty u B. oleracea ze względu na to, że odporność ujawniona w przedmiotowym opisie jest z łatwością przenoszona pomiędzy roślinami B. oleracea i liniami komercyjnymi. Ze względu na brak choroby u roślin odpornych uzyskiwane są wyższe zbiory. Ponadto, w hodowli roślin B. oleracea według niniejszego ujawnienia wymagana jest znacznie mniejsza ochrona chemiczna zbiorów lub nie jest w ogóle wymagana ochrona chemiczna zbiorów przed kiłą kapusty.
Niniejszym ujawniono także:
Roślinę B. oleracea odporną na kiłę kapusty, w szczególności na kiłę kapusty wywołaną przez patogen Plasmodiophora brassicae. W konkretnym aspekcie według niniejszego ujawnienia, odporność na kiłę kapusty jest jednogenowa i dominująca. Korzystnie, roślina B. oleracea jest szacowana na 2 lub poniżej w teście oceny choroby w skali 1-9, korzystnie tak jak opisano w Przykładzie 2. Korzystnie, roślina B. oleracea jest szacowana na 1 lub poniżej w teście oceny choroby w skali 1-9, korzystnie tak jak opisano w Przykładzie 2. Korzystnie, roślina B. oleracea jest szacowana na 1 lub poniżej w teście oceny choroby w skali 0-5, korzystnie tak jak opisano w Przykładzie 2. Korzystnie, roślina B. oleracea jest szacowana na 0 w teście oceny choroby w skali 0-5, korzystnie tak jak opisano w Przykładzie 2. W innym aspekcie, roślina B. oleracea jest odporna na zakażenie korzeni włośnikowych. W innym aspekcie, rośliną B. oleracea jest brokuł, kapusta głowiasta biała, kalafior, kapusta brukselska, jarmuż, kapusta włoska lub kapusta głowiasta czerwona. W innym korzystnym aspekcie, roślina B. oleracea jest homozygotą lub heterozygotą pod względem odporności na kiłę kapusty. W innym aspekcie, odporność na kiłę kapusty jest genetycznie sprzężona z markerem molekularnym. Korzystnie, marker molekularny można uzyskać poprzez amplifikacje PCR. Korzystnie, odporność jest odległa od omawianego markera molekularnego o 10 cM, korzystnie poniżej 6 cM, korzystnie poniżej 5 cM, korzystniej poniżej 3 cM, jeszcze korzystniej poniżej 1,5 cM. W innym aspekcie, odporność na kiłę kapusty jest sprzężona z markerem molekularnym, który można uzyskać poprzez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEKW. NR ID.: 1) lub startera Y13 (SEKW. NR ID.: 2). W innym aspekcie, odporność można uzyskać z rośliny B. rapa odpornej na kiłę kapusty, korzystnie z hybrydy F1 Parkin kapusty pekińskiej. W innym aspekcie, odporność na kiłę kapusty według niniejszego ujawnienia można uzyskać z linii CF667, zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134. W innym aspekcie, odporność pochodzi lub jest uzyskana z linii CF667 lub potomka lub przodka linii CF667 obejmującego omawianą odporność. W innym aspekcie, roślina jest uzyskana w hodowli wsobnej lub jest hybrydą. W innym aspekcie, roślina jest dihaploidem. W jeszcze innym aspekcie, roślina jest męską rośliną sterylną cytoplazmatycznie (ang. cytoplasmic male sterile, CMS). W innym aspekcie ujawniono roślinę B. oleracea obejmującą locus nadający odporność na kiłę kapusty. W szczególnym przypadku, locus jest odległy o 10 centiMorganów (cM) od markera molekularnego, który można uzyskać poprzez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEKW. NR ID.: 1) lub startera Y13 (SEKW. NR ID.: 2), o 6 cM, w szczególności o 5 cM, w jeszcze bardziej szczególnym przypadku o 3 cM, zwłaszcza o 1,5 cM od omawianego startera molekularnego. W innym aspekcie, odporność jest nadawana przez locus odpowiadający locus znajdującemu się w linii CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134 i korzystnie segreguje wraz z odpornością obecną w linii CFL667. W innym aspekcie, locus nadające odporność na kiłę kapusty można uzyskać z linii CFL667, zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134 lub z potomka lub przodka linii CF667 obejmującego omawianą odporność. W innym aspekcie, locus nadające odporność pochodzi lub jest uzyskane z linii CFL667 lub z potomka lub przodka linii CF667 obejmującego omawianą odporność.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Nasiono rośliny ujawnionej powyżej, w tym jego potomstwo, gdzie nasiono lub potomstwo obejmują odporność jak niniejszym ujawniono.
Owoc rośliny ujawnionej powyżej. Część rośliny ujawnionej powyżej, obejmującą pyłek, zalążek i zarodek omawianej rośliny.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Roślinę B. oleracea obejmującą odporność na kiłę kapusty, gdzie omawiana roślina jest homozygotą pod względem omawianej odporności i omawiana roślina homozygotyczna pod względem omawianej odporności jest krzyżowana z „testerem” będącym rośliną homozygotyczną pod względem jednogenowej i dominującej odporności na kiłę kapusty, gdzie rośliny z pierwszego pokolenia uzyskane w wyniku krzyżówki wykazują segregację odporności na kiłę kapusty 1:0. W jednym aspekcie, gdy rośliny potomstwa z pierwszego pokolenia są poddawane samozapyleniu, rośliny uzyskane w drugim pokoleniu wykazują segregację odporności na kiłę kapusty 1:0. W innym aspekcie, roślina „testera” jest rośliną linii CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134 i obejmującą jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty znajdującą się w linii CFL667, lub potomkiem lub przodkiem linii CF667 obejmującym jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty znajdującą się w linii CFL667. W kolejnym aspekcie, roślina „testera” jest rośliną pochodzącą z linii CFL667 lub rośliną potomną linii CFL667 pochodzącą z fuzji komórek. W jeszcze innym aspekcie, roślina „testera” jest sterylną rośliną męską.
Roślina B. oleracea obejmująca odporność na kiłę kapusty, gdzie omawiana roślina jest heterozygotą pod względem odporności i roślina heterozygotyczna pod względem odporności jest krzyżowana z „testerem” będącym rośliną heterozygotyczną pod względem jednogenowej i dominującej odporności na kiłę kapusty, gdzie rośliny z pierwszego pokolenia uzyskane w wyniku krzyżówki wykazują segregację odporności na kiłę kapusty 3:1. W jednym aspekcie, wówczas, gdy rośliny omawianego potomstwa z pierwszego pokolenia są dalej krzyżowane z rośliną heterozygotyczną pod względem odporności na kiłę kapusty, rośliny uzyskane w drugim pokoleniu wykazują segregację odporności na kiłę kapusty 5:1. W kolejnym aspekcie, roślina „testera” jest rośliną linii CFL667, zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134, lub potomkiem lub przodkiem linii CF667, obejmującym jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty znajdującą się w linii CFL667 lub rośliną potomną linii CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134 i obejmującą jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty znajdującą się w linii CFL667. W innym aspekcie, kiedy liczone jest potomstwo pojedynczych roślin, uzyskane potomstwo z drugiego pokolenia wykazuje stosunek segregacji 3:1, 1:0 lub 1:1 pod względem odporności, co jest zależne od genetycznego statusu pojedynczej rośliny w potomstwie z pierwszego pokolenia (odpowiednio, heterozygota, homozygota odporna lub homozygota podatna).
W jeszcze innym aspekcie, odporność na kiłę kapusty jest jednogenowa, korzystnie jednogenowa i dominująca. W kolejnym aspekcie, roślina B. oleracea jest homozygotą pod względem odporności. W innym aspekcie, roślina B. oleracea jest heterozygotą pod względem odporności.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Nasiono rośliny ujawnionej powyżej, w tym jego potomstwo, gdzie nasiono lub potomstwo obejmują odporność według niniejsze ujawnienia.
Owoc rośliny ujawnionej powyżej. Część rośliny ujawnionej powyżej, obejmującą pyłek, zalążek i zarodek rośliny.
Niniejszym ujawniono również:
Wykorzystanie jednogenowej i dominującej odporności na kiłę kapusty jak niniejszym ujawniona do nadawania roślinie B. oleracea odporności na chorobę. Odporność taką można uzyskać z rośliny B. rapa, korzystnie z hybrydy F1 Parkin kapusty pekińskiej.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Sposób wytwarzania rośliny B. oleracea obejmującej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty obejmujący etapy: a) uzyskania rośliny B. rapa odpornej na kiłę kapusty; b) krzyżowania rośliny B. rapa z rośliną B. oleracea; c) odzyskania zarodka uzyskanego w wyniku krzyżowania w etapie b); d) regeneracji rośliny z zarodka z etapu c); e) wyselekcjonowania rośliny z etapu d), która jest odporna na kiłę kapusty; f) krzyżowania wstecznego rośliny uzyskanej w etapie e) z rośliną B. oleracea. W pewnym aspekcie, sposób obejmuje ponadto introgresję odporności do elitarnej B. oleracea z chowu wsobnego. W innym aspekcie, sposób obejmuje ponadto krzyżowanie potomstwa chowu wsobnego z innym potomstwem chowu wsobnego B. oleracea do wytworzenia hybrydy.
Niniejszym ujawniono dodatkowo:
Roślinę B. oleracea obejmującą roślinę hybrydową, którą można uzyskać przy pomocy sposobu ujawnionego powyżej.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Sposób przenoszenia jednogenowej i dominującej odporności na kiłę kapusty do rośliny B. oleracea podatnej lub mniej odpornej na chorobę obejmujący etapy: a) uzyskania rośliny B. oleracea obejmującej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty; b) krzyżowania omawianej rośliny B. oleracea z etapu a) z rośliną B. oleracea podatną lub mniej odporną na kiłę kapusty; c) wyselekcjonowania rośliny z krzyżówki w etapie b), która jest odporna na kiłę kapusty. W pewnym aspekcie, sposób obejmuje ponadto wprowadzenie odporności do rośliny B. oleracea podatnej lub mniej odpornej na kiłę kapusty poprzez krzyżowanie wsteczne. W innym aspekcie, roślina B. oleracea podatna lub mniej odporna na kiłę kapusty jest szacowana na poziomie 4 lub powyżej, korzystnie 3 lub powyżej w teście oceny choroby w skali 1-9, lub na poziomie 3 lub powyżej, korzystnie 2 lub powyżej w teście oceny choroby w skali 0-5.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Fragment DNA amplifikowany z genomu Brassica, gdzie fragment DNA posiada długość około 400 bp i obejmuje SEKW. NR ID.: 1.
Fragment DNA amplifikowany z genomu Brassica, gdzie fragment DNA posiada długość około 640 bp i obejmuje SEKW. NR ID.: 2.
Zgodnie z jednym aspektem, fragment DNA ujawniony powyżej jest wskaźnikiem obecności dominującej i jednogenowej odporności na kiłę kapusty w roślinie Brassica.
Zastosowanie fragmentu DNA ujawnionego powyżej do identyfikacji rośliny Brassica, która jest odporna na kiłę kapusty.
Zastosowanie startera O20 (SEKW. NR ID.: 1) do wykrywania fragmentu DNA o wielkości około 400 bp w genomie Brassica.
Zastosowanie startera Y13 (SEKW. NR ID.: 2) do wykrywania fragmentu DNA o wielkości około 640 bp w genomie Brassica.
Zastosowanie startera O20 lub Y13 do identyfikacji rośliny Brassica odpornej na kiłę kapusty.
W jednym aspekcie, rośliną Brassica jest B. oleracea.
W opisie ujawniono także zestaw do wykrywania jednogenowej i dominującej odporności na kiłę kapusty w roślinie B. oleracea obejmujący oligonukleotyd przedstawiony w SEKW. NR ID.: 1 lub SEKW. NR ID.: 2.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Sposób przenoszenia jednogenowej i dominującej odporności na kiłę kapusty do rośliny B. oleracea podatnej lub mniej odpornej na chorobę obejmujący etapy: a) uzyskania rośliny B. oleracea obejmującej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty; b) krzyżowania omawianej rośliny B. oleracea z etapu a) z rośliną B. oleracea podatną lub mniej odporną na kiłę kapusty; c) wyselekcjonowania rośliny obejmującej fragment DNA możliwy do uzyskania poprzez amplifikację PCR, który segreguje wraz z odpornością. Korzystnie fragment DNA można uzyskać poprzez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEKW. NR ID.: 1) i startera Y13 (SEKW. NR ID.: 2). Korzystnie, omawiana roślina z etapu c) jest odporna na kiłę kapusty. W jednym aspekcie, sposób obejmuje ponadto wprowadzenie omawianej odporności do rośliny B. oleracea podatnej lub mniej odpornej na kiłę kapusty poprzez krzyżowanie wsteczne.
Niniejszym ujawniono ponadto:
Sposób identyfikacji rośliny B. oleracea odpornej na kiłę kapusty obejmujący etapy: a) uzyskania próbki z rośliny B. oleracea; b) wykrycia w próbce fragmentu DNA, który można uzyskać poprzez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEKW. NR ID.: 1) i startera Y13 (SEKW. NR ID.: 2), gdzie roślina B. oleracea z etapu b) jest odporna na kiłę kapusty.
Niniejszym ujawniono również:
Sposób selekcjonowania rośliny B. oleracea odpornej na kiłę kapusty z populacji roślin B. oleracea obejmujący etapy: a) dostarczenia populacji roślin B. oleracea; b) uzyskania próbki rośliny z populacji; c) wykrycia w próbce fragmentu DNA, który można uzyskać poprzez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEKW. NR ID.: 1) i startera Y13 (SEKW. NR ID.: 2), gdzie roślina B. oleracea z etapu b) jest odporna na kiłę kapusty.
Definicje
Cecha: właściwość lub fenotyp, przykładowo odporność na chorobę. Cecha może być dziedziczona w sposób dominujący lub recesywny, lub może być jednogenowa lub wielogenowa. Cechą jest przykładowo odporność na chorobę, taką jak kiła kapusty. Odporność: właściwość lub fenotyp rośliny wykazujący brak lub mało znaczące objawy choroby. Odporność jest zatem zdolnością rośliny do ograniczenia rozwoju patogenu (patrz, przykładowo, Robinson, R.A., 1969: Review Applied Mycology 48, 593-606).
Jednogenowa: determinowana przez pojedyncze locus.
Wielogenowa: determinowana przez więcej niż jedno locus.
Dominująca: ujawnia się fenotypowo, kiedy jest obecna w heterozygocie lub homozygocie.
Recesywna: ujawnia się tylko kiedy jest obecna w homozygocie.
Locus: obszar chromosomu, który obejmuje jeden lub większą liczbę czynników genetycznych, przykładowo, jeden lub kilka genów, przypisanych do cechy, takiej jak odporność na chorobę.
Sprzężenie genetyczne: tendencja obszarów chromosomów do jednoczesnego dziedziczenia co wynika z położenia na tym samym chromosomie. Mierzone procentem rekombinacji pomiędzy loci (centiMorgan, cM).
Izogeniczne: rośliny, które są zasadniczo identyczne, z wyjątkiem tego, że mogą różnić się obecnością lub brakiem heterologicznej sekwencji DNA.
Selekcja z udziałem markera: odnosi się do procesu selekcji pożądanej cechy lub pożądanych cech u rośliny lub roślin poprzez wykrycie jednego lub większej liczby kwasów nukleinowych w roślinie, gdzie kwas nukleinowy jest związany z pożądaną cechą.
Dihaploid: duplikacja haploidalnego (pojedynczego garnituru chromosomów) genomu (np. poprzez inną hodowlę lub hodowlę mikrospory) dająca w pełni homozygotyczną roślinę.
Roślina „testera”: roślina stosowana do charakterystyki cechy genetycznej rośliny poddawanej testowi. Zazwyczaj, roślina poddawana testowi jest krzyżowana z rośliną „testera” i jest obliczany stosunek segregacji cechy w potomstwie krzyżówki.
Niniejszym ujawniono rośliny B. oleracea odporne na kiłę kapusty, konkretniej, na kiłę kapusty wywoływaną przez patogen Plasmodiophora brassicae. W szczególności, niniejszym ujawniono rośliny B. oleracea, które obejmują jednogenową, dominującą odporność na chorobę. Odporność dostarcza udoskonalenie odporności na chorobę, w porównaniu z odpornościami istniejącymi u B. oleracea i może być z łatwością przenoszona pomiędzy roślinami B. oleracea.
Gatunki i podgatunki rodzaju Brassica zostały przykładowo opisane w P.H. Williams (Screening Crucifers for multiple resistance, Workshop 1981, Un. Wisconsin-Madison), a następnie przeanalizowane genetycznie w Song, KM i wsp. TAG 75, 1988, 784-794; TAG 76, 1988, 593-600 i TAG 79, 1990, 497-506 (seria 3 artykułów).
W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, roślinami B. oleracea są przykładowo:
Brassica oleracea L. (zbiory kapusty) • var. acephala DC (kapusty włoskie) • var. albiflora Sun [=B. alboglabra] (kapusta pekińska) • var. alboglabra [=B. alboglabra] (kapusta pekińska) • var. botrytis L. (kalafior, brokuł zwyczajny) • var. capitata L. (kapusta głowiasta) • var. chinensis Prain (gorczyca birmańska) • var. fimbriata Mill. (ang. kitchen kale) • var. fruticosa Metz. (ang. thousand-head kale) • var. gemminifera DC. (kapusta brukselska) • var. gongylodes (kalarepa) • var. italica Plenck. (brokuł, ang. calabrese) • var. sabauda L. (kapusta włoska) • var. sabellica (jarmuż) • var. tronchuda L.H Bailey (ang. tronchuda cabbage) • var. costata (kapusta portugalska) • var. medullosa (kapusta pastewna) • var. pamifolia (kapusta, kapusta Jersey) • var. ramosa (ang. thousand-head kale) • var. selensia (jarmuż)
Korzystnymi roślinami B. oleracea według niniejszego wynalazku są biała kapusta głowiasta, kalafior, kapusta brukselska i brokuł.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jednogenowa, dominująca odporność na kiłę kapusty jest przenoszona z kapusty pekińskiej (B. rapa) do brokuła (B. oleracea). Międzygatunkowa hybrydyzacja jest przeprowadzana pomiędzy brokułem (B. oleracea var. italica) jako rodzicem żeńskim i B. rapa, jako rodzicem męskim. Jako żeńskie wybrano linie chowu wsobnego brokuła dla zachowania organelli komórkowych różnego pochodzenia w końcowych produktach krzyżówki. Rodzicem męskim w krzyżówce międzygatunkowej była odporna na kiłę kapusty hybryda F1 kapusty pekińskiej z Japonii, komercyjnie dostępna pod nazwą „Parkin” (Takii Seeds, Japonia). Po każdej krzyżówce lub krzyżówce wstecznej, w uzyskanych roślinach liczono chromosomy w celu oszacowania poziomu ploidalności roślin i postępowania w celu uzyskania zestawu chromosomów B. oleracea. Liczenie chromosomów przeprowadzono według metody Chiang i wsp. (1997) Euphytica 28:41-45. Pracowano na cytometrze przepływowym Partec CA II (Partech, UK).
Hybrydy F1 uzyskane w wyniku z krzyżówki otrzymywano poprzez odzyskiwanie zarodka. Konieczne było zastosowanie odzyskiwania zarodka, ponieważ B. rapa i B. oleracea nie posiadają tej samej liczby chromosomów, i zatem nie są zgodne płciowo. Odzyskiwanie zarodka pozwala na obejście problemów rozpadu bielma. Zastosowano technikę odzyskiwania zarodka opisaną przez Harbert i wsp. (Euphytica 18 (1969) str. 425-429). Jałowione zalążki 10-12 dni po zapyleniu rozcinano na połowę i wprowadzano do pożywki hodowlanej utrzymywanej ze stałym mieszaniem. Pożywka hodowlana jest zasadniczo podłożem Whitea z 8% sacharozą i 400 ppm hydrolizatu kazeiny. Zarodki odpłukiwano od zalążka i hodowano w płynnej pożywce.
Rośliny F1 odporne na kiłę kapusty skrzyżowano z brokułem (tzn. przeprowadzono krzyżówkę wsteczną). Zarodki odzyskiwane tak jak opisano powyżej były także konieczne do uzyskania roślin otrzymanych w wyniku pierwszej krzyżówki wstecznej (tzn. roślin BC1).
Rośliny BC1 odporne na kiłę kapusty ponownie krzyżowano wstecznie z brokułem i trzy rośliny BC2 odporne na kiłę kapusty uzyskano z normalnego zestawu nasion. Rośliny dalej krzyżowano wstecznie z brokułem i rośliny uzyskane w wyniku czwartej krzyżówki wstecznej (BC4) zastosowano jako źródło odporności dla innych zbiorów B. oleracea.
Szczegółowy protokół doświadczalny prowadzący do przeniesienia odporności na kiłę kapusty do B. oleracea opisano w Przykładzie 1. Test oceny choroby zastosowany do badania obecności odporności opisano w Przykładzie 2. Wyniki badań przeprowadzonych na polu przedstawiające odporność na kiłę kapusty pokazano w Przykładzie 3.
Reprezentatywną linię B. oleracea obejmującą jednogenową, dominującą odporność na kiłę kapusty według niniejszego wynalazku, linię CFL667, zdeponowano w NCIMB, Aberdeen AB21RY, Szkocja, UK pod numerem dostępu NCIMB 41134, 28 czerwca 2002. Rośliny linii CFL667 są męską rośliną sterylną cytoplazmatycznie i są heterozygotyczne pod względem odporności.
Zatem, odporność na kiłę kapusty według niniejszego wynalazku jest możliwa do uzyskania z linii CFL667, zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134.
W korzystnym aspekcie zgodnie z niniejszym ujawnieniem, roślina B. oleracea odporna na kiłę kapusty jest zdefiniowana jako roślina oszacowana tu na 0 lub 1 w skali 0-5 z Przykładu 2 lub jako roślina oszacowana tu na 1 lub 2 w skali 1-9 z Przykładu 2.
Odporność na kiłę kapusty przenoszono do innych B. oleracea, w szczególności do białej kapusty głowiastej, kalafiora i kapusty brukselskiej przy użyciu standardowych technik hodowli dobrze znanych w dziedzinie kapustowatych. Ponadto Cecha podlegała dalszej introgresji do elitarnych linii B. oleracea. Introgresja odporności do linii elitarnej jest przykładowo osiągana poprzez wsteczne hodowanie z selekcją, przykładowo krzyżowanie wsteczne. W tym przypadku, linia elitarna (rodzic powtarzalny) jest najpierw krzyżowana z dawcą z chowu wsobnego (rodzic niepowtarzalny), który niesie odporność. Potomstwo tej krzyżówki jest następnie parowane wstecznie z rodzicem powtarzalnym, a następnie przeprowadzana jest selekcja wśród uzyskanego potomstwa pod kątem odporności na kiłę kapusty. Po trzech, korzystnie czterech, korzystniej pięciu lub większej liczbie pokoleń krzyżówek wstecznych z rodzicem powtarzalnym z selekcją pod kątem odporności na kiłę kapusty, potomstwo jest heterozygotyczne ze względu na locus niosący odporność, lecz jest podobne z rodzicem powtarzalnym pod względem większości lub prawie wszystkich innych genów (patrz, przykładowo, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops wyd. 4, 172-175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, vol. 1: Theory and Technique, 360-376). Po każdej krzyżówce przeprowadzana jest selekcja pod kątem odporności na kiłę kapusty. W korzystnym aspekcie, niniejszym ujawniono zatem sposób przeniesienia dominującej i jednogenowej odporności na kiłę kapusty do rośliny B. oleracea, podatnej lub mniej odpornej na chorobę, obejmujący następujące etapy: krzyżowanie pierwszej rośliny B. oleracea z drugą rośliną B. oleracea, gdzie pierwsza roślina obejmuje dominującą i jednogenową odporność na kiłę kapusty, wyselekcjonowanie rośliny uzyskanej w wyniku krzyżówki, która jest odporna na kiłę kapusty. Roślina B. oleracea podatna lub mniej odporna na chorobę jest przykładowo szacowana na poziomie 4 lub powyżej, korzystnie 3 lub powyżej w teście oceny choroby w skali 1-9, lub na poziomie 3 lub powyżej, korzystnie 2 lub powyżej w teście oceny choroby w skali 0-5. Sposób obejmuje ponadto krzyżowanie wsteczne rośliny wyselekcjonowanej powyżej z drugą rośliną B. oleracea dopóki odporność nie zostanie przeniesiona do drugiej rośliny B. oleracea.
Odporność na kiłę kapusty jest w szczególności przenoszona do komercyjnych linii B. oleracea. Takie linie są przykładowo liniami chowu wsobnego. Alternatywnie, linie komercyjne są hybrydami, uzyskanymi przez krzyżowanie dwóch linii chowu wsobnego. W tym przypadku, odporność na kiłę kapusty może być obecna u jednego z rodziców chowu wsobnego lub u obu. Zatem, zgodnie z jednym aspektem, niniejszym ujawniono linię B. oleracea wsobną lub hybrydową obejmującą jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty, włączając nasiona i materiały omawianej linii wsobnej lub hybrydowej i ich potomstwo. Korzystnie, odporność można uzyskać z B. rapa, korzystnie z hybrydy F1 „Parkin” kapusty pekińskiej. Zgodnie z innym aspektem, odporność na kiłę kapusty według niniejszego ujawnienia jest obecna w linii CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134.
W innym korzystnym aspekcie, roślina B. oleracea odporna na kiłę kapusty według niniejszego ujawnienia jest sterylną rośliną męską. Sterylność roślin męskich jest zaletą w hodowli nasion hybrydy B. oleracea ponieważ normalne kwiaty podlegają samozapyleniu. Sterylne linie męskie nie wytwarzają żywotnego pyłku i nie podlegają samozapyleniu. Poprzez eliminację pyłku od jednej zmiennej rodzicielskiej w krzyżówce, hodowca roślin ma pewność, że uzyska nasiona hybrydowe o jednorodnej jakości. Szczególnie korzystnym sterylnym systemem męskim jest cytoplazmatyczna sterylność męska (CMS). Przykładem takiej CMS u Brassica jest Ogura CMS wyjściowo znaleziona w rzodkwi (patrz, przykładowo, Ogura ((1968) Mem. Fac. Agric. Kagoshima Univ. 6:39-78; Makaroff (1989) Journal of Biol. Chem. 264:11706-11713; patent USA 5254802). Zatem, niniejszym ujawniono sterylną roślinę męską, w szczególności CMB, roślinę B. oleracea obejmującą jednogenową, dominującą odporność na kiłę kapusty, w tym nasiona i materiały omawianych roślin i ich potomstwo. Korzystnie, odporność jest możliwa do uzyskania z B. rapa, korzystnie z hybrydy F1 „Parkin” kapusty pekińskiej. Korzystnie, CMS pochodzi z genomu Ogura.
Płodność męską sterylnych roślin męskich można przywrócić sposobami dobrze znanymi w dziedzinie. Płodność męska roślin CMS, w szczególności roślin CMS B. oleracea jest korzystnie przywracana poprzez fuzję komórek. W tym celu, komórki roślin CMS są poddawane fuzji z komórkami płodnych roślin męskich dla wymiany jąder rośliny płodnej na jądra rośliny sterylnej w płodnym tle cytoplazmatycznym i przywrócenia płodności. Techniki fuzji komórek są dobrze znane w dziedzinie i są przykładowo opisane przez Sigareva i Earle (1997) Theor. Appl. Genet. 94:213-320. Przy użyciu tych technik, regenerowane są płodne rośliny męskie i jest możliwe dopuszczenie do ich samozapylenia lub są krzyżowane z inną rośliną.
Cechy, w szczególności cechy o możliwym do oceny fenotypie, jak odporność na chorobę, można śledzić genetycznie poprzez krzyżowanie i u potomstwa uzyskanego z krzyżówki można oceniać segregację cechy. Pozwala to, przykładowo, na określenie czy cecha jest dominująca czy recesywna. Pozwala to także na badanie czy czynniki genetyczne warunkujące cechy znajdują się w tym samym locus (np. są tym samym genem (genami) lub różnymi genami, są tym samym allelem (allelami) lub różnymi allelami) czy w różnych sprzężonych lub nie loci.
Przykładowo, wówczas, gdy roślina homozygotyczna pod względem cechy jest krzyżowana z homozygotyczną rośliną „testera” pod względem dominującej cechy, posiadającą ten sam fenotyp, potomstwo krzyżówki nie segreguje pod względem fenotypu cechy (stosunek 1:0). Taki stosunek 1:0 jest uzyskiwany wówczas, gdy czynniki genetyczne warunkujące cechę znajdują się w tym samym locus lub w różnych loci. Kiedy rośliny potomstwa z pierwszego pokolenia powyższej krzyżówki są poddawane samozapyleniu, stosunek 1:0 jest obserwowany dla cech dominujących, warunkowanych przez czynniki genetyczne znajdujące się w tym samym locus dla rośliny poddawanej testowi i rośliny „testera”. Dla kontrastu, stosunek 15:1 jest obserwowany dla cech dominujących warunkowanych przez czynniki genetyczne w różnych, niesprzężonych loci dla rośliny poddawanej testowi i rośliny „testera”. Jeśli czynniki genetyczne leżą w różnych loci lecz są genetycznie sprzężone stosunek zazwyczaj wynosi pomiędzy 1:0 i 15:1.
W innym przykładzie, wówczas, roślina heterozygotyczna pod względem cechy dominującej jest krzyżowana z rośliną „testera”, także heterozygotyczną pod względem cechy dominującej, posiadającą ten sam fenotyp, potomstwo krzyżówki segreguje w stosunku 3:1 pod względem fenotypu odporności. Taki stosunek 3:1 jest uzyskiwany wówczas, gdy czynniki genetyczne warunkujące cechę znajdują się w tym samym locus lub w różnych loci. Kiedy rośliny potomstwa z pierwszego pokolenia powyższej krzyżówki są krzyżowane z roślinami linii „testera” lub ponownie z poddawaną testowi rośliną heterozygotyczną pod względem cechy, stosunek 3:1 jest obserwowany dla cech dominujących warunkowanych przez czynniki genetyczne znajdujące się w tym samym locus, podczas gdy stosunek 23:9 jest obserwowany dla cech dominujących warunkowanych przez czynniki genetyczne znajdujące się w różnych, niesprzężonych loci. Jeśli dwa czynniki genetyczne znajdują się w różnych, lecz genetycznie sprzężonych loci stosunek mieści się pomiędzy tymi dwoma stosunkami.
Zgodnie z innym aspektem, potomstwo z drugiego pokolenia pojedynczych roślin jest analizowane oddzielnie. W tym przypadku, dla czynników genetycznych położonych w tym samym locus, w drugim pokoleniu 50% roślin potomnych segreguje jak 3:1,25% 1:0 i 25% 1:1, kiedy są krzyżowane z rośliną heterozygotyczną. Dla niesprzężonego czynnika genetycznego w roślinie poddawanej testowi w potomstwie z drugiego pokolenia 50% roślin potomnych znowu segreguje jak 3:1,25% 7:1 i 25% 1:1 (brak roślin z utrwaloną odpornością w drugim pokoleniu).
Jeśli cechą jest odporność na chorobę i test oceny choroby daje śmierć roślin podatnych lub w jego wyniku powstają rośliny podatne niezdolne do kwitnienia, różne stosunki segregacji są uzyskiwane w potomstwie z drugiego pokolenia ze względu na śmierć lub brak potomstwa roślin podatnych z pierwszej generacji. Przykładowo, w tym przypadku, zamiast powyższych stosunków 3:1 i 23:9, obserwowane są odpowiednio stosunki 5:1 i 19:5. Jeśli badane są pojedyncze rośliny, w drugim pokoleniu 2/3 potomstwa segreguje jak 3:1 a 1/3 jak 1:0 dla czynników genetycznych leżących w tym samym locus i 2/3 jak 3:1 i 1/3 jak 7:1 dla czynników genetycznych leżących w różnych loci.
Stosowane są także inne strategie krzyżowania, np. z innymi kombinacjami roślin homozygotycznych lub heterozygotycznych lub roślinami nieobejmującymi cechy. Następnie, określana jest segregacja cechy w potomstwie. Te strategie krzyżowania i odpowiadające im stosunki segregacji są dobrze znane specjalistom w dziedzinie, którzy także wiedzą, jak uzyskać i zastosować odpowiednie rośliny „testerów”, i jak interpretować stosunki segregacji uzyskane z takich krzyżówek.
W innym korzystnym aspekcie, zilustrowane schematy krzyżowania stosowane są do odporności na kiłę kapusty w kontekście niniejszego ujawnienia. Zgodnie z tym, w innym korzystnym aspekcie, niniejszym ujawniono homozygotyczną lub heterozygotyczną roślinę B. oleracea pod względem odporności na kiłę kapusty, gdzie odporność na kiłę kapusty jest homozygotyczną w roślinie poddawanej testowi i roślina poddawana testowi jest skrzyżowana z homozygotyczną pod względem odporności na kiłę rośliną „testera”, potomstwo z pierwszego pokolenia krzyżówki wykazuje stosunek segregacji 1:0 pod względem odporności na kiłę kapusty. Roślina „testera” do takiej krzyżówki jest przykładowo rośliną pochodzącą z linii CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134 i obejmującą odporność według niniejszego ujawnienia. W korzystnym aspekcie, roślina „testera” pochodzi od rośliny z linii CFL667 lub od potomstwa rośliny z linii CFL667 dzięki fuzji komórek. Jako roślina „testera” mogą także być stosowane inne płodne rośliny męskie obejmujące odporność według niniejszego ujawnienia. W korzystnym aspekcie, kiedy roślinom potomstwa z pierwszego pokolenia umożliwione zostanie samozapylenie, uzyskane potomstwo z drugiego pokolenia wykazuje stosunek segregacji 1:0 dla odporności. W innym korzystnym aspekcie kiedy roślinom potomstwa z pierwszego pokolenia umożliwione zostanie samozapylenie, uzyskane potomstwo z drugiego pokolenia wykazuje stosunek segregacji 15:1 dla odporności. W jeszcze innym korzystnym aspekcie, uzyskiwany jest stosunek segregacji pomiędzy 1:0 i 15:1 w potomstwie z drugiego pokolenia po samozapyleniu. Zatem, w oparciu o stosunki segregacji ustalane jest czy odporność rośliny poddawanej testowi i odporność roślin „testera” są położone w tym samym locus czy w różnych sprzężonych czy niesprzężonych loci.
W innym korzystnym aspekcie, niniejszym ujawniono roślinę B. oleracea homozygotyczną lub heterozygotyczną pod względem odporności na kiłę kapusty, przy czym roślina poddawana testowi jest heterozygotyczna względem odporności na kiłę kapusty i roślina poddawana testowi jest krzyżowana z rośliną „testera” heterozygotyczną pod względem odporności na kiłę kapusty, potomstwo z pierwszego pokolenia krzyżówki wykazuje stosunek segregacji 3:1 dla odporności na kiłę kapusty. Roślina „testera” do takiej krzyżówki jest przykładowo rośliną z linii CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134 lub potomstwem rośliny z linii CFL667, obejmującym odporność według niniejszego ujawnienia. Dowolna inna roślina obejmująca odporność według niniejszego ujawnienia jest także stosowana jako roślina „testera”. Zgodnie z jednym aspektem, wówczas, gdy rośliny potomstwa z pierwszego pokolenia są dalej krzyżowane z poddawanymi testowi roślinami heterozygotycznymi pod względem odporności, oczekuje się, że uzyskane potomstwo z drugiej generacji wykaże stosunek segregacji
3:1 pod względem odporności. Jednakże, ponieważ rośliny podatne na chorobę zazwyczaj nie przeżywają testu oceny choroby dotyczącego odporności na kiłę kapusty lub są niezdolne do kwitnienia po takim teście, potomstwo z drugiego pokolenia daje stosunek segregacji 5:1.
W innym aspekcie, wówczas, gdy rośliny potomstwa z pierwszego pokolenia są dalej krzyżowane z roślinami linii „testera”, oczekuje się, że uzyskane potomstwo w drugim pokoleniu powinno wykazywać stosunek segregacji 23:9 dla odporności, lecz zazwyczaj daje stosunek segregacji 19:5. W jeszcze innym korzystnym aspekcie, uzyskiwany jest stosunek segregacji pomiędzy 5:1 i 19:5 dla potomstwa w drugim pokoleniu. Opisane powyżej stosunki obserwowane są, gdy liczone jest potomstwo pojedynczych roślin. Zatem, w oparciu o stosunki segregacji ustalane jest czy odporność rośliny poddawanej testowi i odporność roślin „testera” są położone w tym samym locus czy w różnych sprzężonych czy niesprzężonych loci.
W jeszcze innym aspekcie, niniejszym ujawniono markery molekularne, które są sprzężone z jednogenową, dominującą odpornością na kiłę kapusty. Takie markery molekularne pozwalają na rozróżnienie na poziomie molekularnym roślin odpornych i podatnych i zatem są wskaźnikiem dla jednogenowej i dominującej odporności u roślin Brassica, korzystnie roślin B. oleracea. Markery molekularne oparte są na polimorfizmie genetycznym pomiędzy roślinami odpornymi oraz podatnymi i są zlokalizowane w locus odporności lub blisko niego. Markery molekularne są przykładowo stosowane w hodowli i uzyskiwaniu roślin odpornych, do obserwowania obecności odporności podczas hodowli lub do kontroli obecności odporności w nasionach komercyjnych danej serii.
Zatem, w jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie dostarcza sposobów mapowania odporności na kiłę kapusty u roślin Brassica, korzystnie roślin B. oleracea, sposobów ustalania czy odporność jest obecna u rośliny Brassica, korzystnie rośliny B. oleracea i sposobów przenoszenia odporności do podatnych lub mniej odpornych roślin Brassica, korzystnie roślin B. oleracea. Przykładowo, sposoby są stosowane w hodowli nowych roślin odpornych lub linii lub do kontrolowania jakości danej serii nasion. Ujawniane tu markery molekularne pozwalają na szybsze wypuszczenie na rynek linii odpornych i na lepszą kontrolę jakości komercyjnych nasion danych serii. Można zatem uniknąć testu oceny choroby i zastąpić go użyciem markera molekularnego.
Markery molekularne i sposoby według niniejszego ujawnienia są w szczególności pożyteczne w różnych etapach prowadzących do powstania odmian komercyjnych, takich jak programy hodowli oraz w procesie produkcji nasion. Przykładowo, niniejsze ujawnienie jest stosowane do introgresji odporności do rośliny B. oleracea, przykładowo elitarnej linii chowu wsobnego. Selekcja na odporność na kiłę kapusty jest przeprowadzana poprzez badanie nasion lub roślin uzyskanych z każdej krzyżówki przy użyciu markerów molekularnych. W korzystnym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje zatem sposoby przenoszenia dominującej i jednogenowej odporności na kiłę kapusty do rośliny B. oleracea podatnej lub mniej tolerującej chorobę, które obejmują następujące etapy: krzyżowanie pierwszej rośliny odpornej na chorobę z drugą rośliną podatną lub mniej odporną, zebranie nasion uzyskanych z krzyżówki, uzyskanie próbki z nasiona lub z rośliny, która z niego wyrosła, wykrycie w próbce markera molekularnego według niniejszego ujawnienia, gdzie obecność markera molekularnego jest wskaźnikiem odporności na chorobę w nasieniu lub roślinie, wybranie roślin pozytywnych pod względem obecności markera, gdzie roślina jest korzystnie odporna na chorobę. Korzystnie odporność jest następnie wprowadzana do rośliny podatnej lub mniej odpornej poprzez krzyżówkę wsteczną.
Markery molekularne według niniejszego ujawnienia są także powszechnie stosowane przy produkcji stabilnych homogennych linii w chowie wsobnym lub kultywarów (czasami nazywanych także odmianami), gdzie określona linia podlega samozapyleniu dopóki nie zostanie osiągnięta satysfakcjonująca czystość i homogenność linii. Niniejsze ujawnienie jest podobnie wykorzystywane do komercyjnej produkcji nasion określonej linii lub kultywaru. W tym przypadku ponownie, po każdej krzyżówce stosowany jest sposób według niniejszego ujawnienia do badania nasion uzyskanych z krzyżówki i selekcjonowane są tylko rośliny odporne. W jednym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje zatem sposoby wytwarzania nasion lub roślin odpornych na kiłę kapusty obejmujące następujące etapy: krzyżowanie odpornej rośliny ze sobą, zebranie nasion uzyskanych z krzyżówki, uzyskanie próbki z nasiona lub z rośliny, która z niego wyrosła, wykrycie w próbce markera molekularnego według niniejszego ujawnienia, gdzie obecność markera molekularnego jest wskaźnikiem odporności na chorobę w nasieniu lub roślinie.
Podobnie, niniejsze ujawnienie jest stosowane w produkcji nasion hybrydowych. W tym przypadku, niniejsze ujawnienie jest stosowane do potwierdzenia, że wszystkie nasiona hybrydowe, które wzeszły i rosną na polu są odporne na chorobę. Przykładowo, markery molekularne według niniejszego ujawnienia są także stosowane w kontroli jakości dla zapewnienia, że odporność na chorobę jest obecna w nasionach hybrydowych. W pewnym aspekcie, niniejsze ujawnienie obejmuje zatem sposoby wytwarzania nasion obejmujące następujące etapy: krzyżowanie pierwszej rośliny z drugą rośliną, gdzie jedna z roślin jest odporna na kiłę kapusty, zebranie nasion uzyskanych z krzyżówki, uzyskanie próbki z nasiona lub z rośliny, która z niego wyrosła, wykrycie w próbce markera molekularnego według niniejszego ujawnienia, gdzie obecność markera molekularnego jest wskaźnikiem odporności na chorobę w nasieniu lub roślinie. Niniejsze ujawnienie wnosi także znaczący postęp do komercyjnej hodowli i procesów produkcji nasion.
W korzystnym aspekcie, marker molekularny według niniejszego ujawnienia mieści się w odległości 10 centiMorganów (cM) od locus nadającego odporność na kiłę kapusty, korzystnie 6 cM, korzystnie 5 cM, korzystniej 3 cM, jeszcze korzystniej 1,5 cM od locus nadającego odporność na kiłę kapusty, a zatem wspólnie segreguje z odpornością.
Użyteczne polimorfizmy w kontekście niniejszego ujawnienia obejmują przykładowo powtórzenia pojedynczej sekwencji (SSR, patrz np. Hearne i wsp. (1992) Trends Genet 8:288-294), polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP, Bostein B i wsp. (1980) Am J Hum Genet 32:314-331) oraz dowolne typy rearanżacji DNA, takie jak delecje, amplifikację, rekombinacje.
Sposoby wykrywania polimorfizmów, dobrze znane w dziedzinie, można zastosować w kontekście niniejszego ujawnienia do wytwarzania markera molekularnego sprzężonego z odpornością. Korzystne sposoby obejmują sposoby oparte na technice amplifikacji PCR, przykładowo, technice SSR i technice RAPD (Williams i wsp. (1990) Nucl Acids Res 18:6531-6535). Zasadniczo, korzystne oligonukleotydy do PCR wynoszą około 8 do 50 nt, korzystniej 10 do 30 nt. Fragmenty DNA zamplifikowane przy pomocy PCR obejmujące miejsce zawierające polimorfizm według niniejszego ujawnienia wynoszą korzystnie około 100-3000 nt, korzystniej około 200 do 2000 nt, jeszcze korzystniej około 300 do 1000 nt. Inne sposoby poszukiwania lub wykrywania polimorfizmu, które mają zastosowanie według niniejszego ujawnienia obejmują bezpośrednie sekwencjonowanie kwasów nukleinowych, test na polimorfizm pojedynczej nici, reakcję łańcuchową ligazy, cięcie enzymatyczne i hybrydyzację typu Southern.
Alternatywne sposoby obejmują wiele metod wykrywania ciętych zamplifikowanych sekwencji polimorficznych (ang. Cleaved Amplified Polymorphic Sequences, CAPS; Konieczny i wsp., The Plant Journal 4(2):403-410, 1993) i wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP) metodą zwaną „CAMPS” od ang. Cleaved Amplified Modified Polymorphic Sequences, znanej także jako dCAPS (Neff i wsp., 1998, Plant J. 14:387-392; Michaels i Amasino, 1998, Plant J. 14:381-385). W metodzie CAPS, kwas nukleinowy zawierający polimorficzne miejsce restrykcyjne jest amplifikowany przy użyciu starterów flankujących miejsce restrykcyjne. Uzyskany produkt PCR jest trawiony endonukleazą restrykcyjną odpowiadającą polimorficznemu miejscu restrykcyjnemu i strawione produkty są analizowane poprzez rozdział elektroforetyczny w żelu.
Hybrydyzacja typu Southern jest także metodą skutecznej identyfikacji różnych sekwencji, w szczególności przy użyciu RFLP (polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych) (Bostein B i wsp. (1980) Am J Hum Genet 32:314-331).
W korzystnym aspekcie, niniejszym ujawniono markery molekularne blisko sprzężone z odpornością na kiłę kapusty uzyskane przy użyciu techniki RAPD (patrz Przykład 4).
Poniższe przykłady mają na celu zilustrowanie zastosowania niniejszego wynalazku.
P rzy kła d y
Przykład 1. Przenoszenie odporności do B. oleracea F1
Przeprowadzono kilkaset krzyżówek pomiędzy odporną na kiłę kapusty hybrydą F1 kapusty pekińskiej Perkin i brokułem (B. oleracea). Z krzyżówek tych odzyskano zarodki (Harbert i wsp., Euphytica 18(1969) str. 425-429). Cztery z tych zarodków rozwinęły się w rośliny, z których dwie okazały się odporne na chorobę. Te dwie odporne rośliny posiadały 19 chromosomów. Fenotyp miał cechy hybrydy pomiędzy kapustą pekińską i brokułem.
BC1
Odzyskany zarodek był ponownie prowadzony, aby uzyskać rośliny BC1. Jako rodzica w krzyżówce wstecznej dla następujących generacji zastosowano brokuła linii chowu wsobnego. Tylko jedna z dwóch wspomnianych powyżej roślin F1 zareagowała i 5 zarodków rozwinęło się w rośliny. Cztery z nich były odporne na kiłę kapusty.
Fenotyp roślin F1 był bliższy fenotypowi brokuła będącego rodzicem w krzyżówce wstępnej.
Ponieważ rozmieszczenie chromosomów z genomu B. rapa w roślinach BC1 jest losowe, rośliny zawierają 18 chromosomów B. oleracea i 0-10 chromosomów z B. rapa. Zatem, obserwowano rośliny z 18-28 chromosomami.
BC2
Rośliny BC2 uzyskano z nasion umieszczonych na roślinach BC1. Dziewięć roślin pochodzących z nasion na roślinie oznaczonej jako roślina B z BC1 powyższej, było odpornych na kiłę kapusty. Ustalono liczbę chromosomów i określono odchylenie od normalnej zawartości DNA za pomocą cytometrii przepływowej. W dalszym programie zastosowano trzy rośliny, B23, B27 i B28.
BC3 i BC4
BC3 i BC4 także uzyskano z nasion. Roślina B27, która była już diploidalna w BC2, posiadała wprowadzony dominujący gen warunkujący odporność na kiłę kapusty. Pokolenia krzyżówki wstecznej BC3 i BC4 wykazywały oczekiwaną segregację 1:1.
Odporność ulegała także introgresji do roślin B23 i B28, co pokazały dalsze pokolenia.
Test polowy
Wstępny test polowy przeprowadzono z roślinami odpornymi z testu na sadzonkach z BC3 z B27. Rośliny hodowano na polu silnie nawiedzanym chorobami w naszej stacji badawczej w Klave, Niemcy. Wszystkie wykopane dojrzałe rośliny były zdrowe i nie wykazywały objawów.
Przenoszenie odporności do innych B. oleracea
Odporną roślinę B27 wykorzystano jako źródło odporności na kiłę kapusty w programie krzyżowania wstecznego dla brokuła, kalafiora, kapusty i kapusty brukselskiej, co doprowadziło, przykładowo, do uzyskania odpornych odmian ujawnionych w Przykładzie 3.
Przykład 2. Test oceny choroby
Sadzonki przenoszono tydzień po wysianiu do wielodoniczkowych naczyń zawierających mieszaninę piasku i torfu w stosunku 2:1 z pH <6. Dzień po przeniesieniu do doniczek wstrzykiwano 1 ml roztworu 1x106 cyst/ml. Roztwór był mieszaniną źródeł kiły kapusty z kodami ECD 16/3/30, 16/23/30, 16/3/14 i 16/7/30 (Buczacki i wsp., 1975: Trans. Br. Mycol. Soc., 65:295-303). Przez pierwsze dwa tygodnie ziemia była mokra, po czym ziemię trochę osuszano. Temperatura inkubacji w szklarni wynosiła 18-20°C. 4-5 tygodni po przeniesieniu dokładnie płukano korzenie i odczytywano objawy choroby.
Alternatywnie, nasiona wysiewano bezpośrednio do tacek z wieloma doniczkami w standardowej mieszaninie piasek : torf (2:1 EGO, pH 5-6, 1 nasiono na jedną doniczkę). Zazwyczaj testowano 20-30 roślin /rząd. W przybliżeniu 7-10 dni po wysianiu rośliny zaszczepiano i drugie zaszczepienie przeprowadzano 2-5 dni po pierwszym. Jeśli spodziewano się, że nasiona będą słabo kiełkować, wysiewano je w czarnych tackach w rzędach i rośliny przenoszono po 7-10 dniach do tacek z wieloma doniczkami. Temperatura inkubacji wynosiła 20-22°C.
Standardowy preparat do zaszczepiania zawierał izolat 9 (agresywny izolat z zakażonego pola w Niemczech). Preparat do zaszczepiania pochodził z zakażonych korzeni przechowywanych w zamrażarce w -20°C w plastykowej torebce. Korzenie przenoszono do miksera (1 część korzeni, 5 części wody) na około 2 min. Następnie, małe cząsteczki filtrowano przez gazę i liczono cysty (okrągłe, jasnenieco niebieskie). Jeden ml 0,5-1x107 cyst/ml dodawano na łodygę/korzeń u podstawy rośliny za pomocą pipety typu Eppendorf. Preparat do zaszczepiania wymaga regularnego mieszania dla homogennego wymieszania cyst dostępnych w zawiesinie.
W zależności od rozmiaru badania, konieczna jest obecność odpowiednich kontroli. Kontrolami podatnymi są przykładowo: White Rock (kalafior), Maximus lub inne F1 (kapusta brukselska), Marathon (biała kapusta głowiasta). Jako kontrolę odporności można dodać Parkin lub Sorkin (kapusta pekińska). Można dodać Hopkin (wrażliwa kapusta pekińska), jako, że we wczesnym stadium wskazuje ona czy zaszczepienie powiodło się.
Rośliny powinny być utrzymywane w czasie badania w wilgotnych warunkach. Wymagane jest prawidłowe nawożenie, chociaż roślinom nie wolno rosnąć nadmiernie. Temperatura wynosi 20-22°C (dzień/noc), 16 godz. światła. Po 4 (letnich) - 6 (zimowych) tygodniach od zaszczepienia rośliny zbierano w pule, płukano i oceniano objawy.
Przykładowa skala obserwowanych zmian w teście oceny choroby:
= brak maczugowatych narośli, zdrowy układ korzeniowy = 1-2 małe maczugowate narośla na bocznych korzeniach, czasami korzenie wykazują pewne zbrązowienia = kilka małych maczugowatych narośli na bocznych korzeniach, korzeń główny czasem trochę pogrubiony = pogrubione większe partie korzenia głównego = korzeń główny znacznie pogrubiony i zlany z korzeniami bocznymi o maczugowatych naroślach, nadal obecne niektóre prawidłowe korzenie
PL 246007 Β1 = jedna maczugowata narośl z korzeni, brak korzeni prawidłowych
Rośliny z oceną 0 (czasem także 1, w zależności od ostrości testu w szklarni i użytej genetyki) z testu w szklarni są następnie przenoszone na pole zakażone kiłą kapusty (np. pole De Wit w Enkhuizen). Zazwyczaj, pomimo, że nie wykazywały objawów w szklarni stawały się silnie zakażone na polu i były z łatwością dostrzegane (karłowate). Jednakże, były to bardzo rzadkie przypadki roślin.
Przykładowa inna skala obserwowanych zmian w teście oceny choroby:
= brak widocznego uszkodzenia korzenia = pojedyncze uszkodzenie korzeni bocznych = kilka małych uszkodzeń korzeni bocznych (roślina zdrowa) = łagodne uszkodzenie korzenia głównego, kilka małych uszkodzeń korzeni bocznych = umiarkowane uszkodzenie korzenia głównego, dużo drobnych lub kilka większych uszkodzeń korzeni bocznych = poważne uszkodzenie korzenia głównego, liczne duże uszkodzenia korzeni bocznych = poważne uszkodzenie, pozostało kilka zdrowych korzeni = poważne uszkodzenie, obecnych niewiele zdrowych korzeni = poważne uszkodzenie, brak zdrowych korzeni
Przykład 3. Wyniki badań przeprowadzonych na polu
Tabela 1
Badania na polu w Werribee, Victoria, Australia. Rośliny przeniesiono w styczniu 2002 do ziemi zakażonej kiłą kapusty.
Ocena po 6 tygodniach od przeniesienia pokazuje (Tab. 1) wynik dla odpornych na kiłę kapusty hybryd kalafiora według niniejszego wynalazku (F308 i F311) w porównaniu z odmianami podatnymi (White Rock i Triumphant) i odmiany podatnej (Triumphant) traktowanymi różnymi ilościami środka przeciwgrzybiczego (Shirlane) i dodatkowego wapna (zwiększającego pH posiadającego redukujący wpływ na siłę objawów kiły kapusty, np. Dixon i Page, 1998, Acta Horticulturae, 459, 343-349). W badaniu poniżej zastosowano przedstawioną powyżej skalę obserwowanych wyników z zakresem 1-9.
Odczyt w skali
| Podawanie | 0-9 dla korzenia kalafiora, |
| 1 Quicklime (2,5 t/ha) 2 Shirlan (3 L/ha) | 4, 11 2,33 |
| 3 Shirlan (3 L/ha) + Quicklime t/ha) 4 Shirlan (2 L/ha) 5 kontrola - Triumphant 6 F308 7 F311 8 White Rock | (2,5 2,22 3, 00 5, 06 1, 00 1, 00 5, 11 |
Tabela 2
Wyniki badania młodych roślin kalafiora z izolatami pochodzącymi z 3 różnych miejsc w Australii (Córa Lyn, Werribee i Trentham). Izolaty zaszczepiano sposobem porównywalnym z opisanym powyżej. White Rock jest kontrolą podatną a E70 jest odporną hybrydą kalafiora według niniejszego wynalazku. W badaniu poniżej zastosowano przedstawioną powyżej skalę obserwowanych wyników z zakresem 1-9.
Średnie z podawania
| Córa Lyn | Werribee | Trentham | |
| white Rock | 8,2 | 8, 7 | 3,9 |
| E 70 | 1 | 1 | 1 |
PL 246007 Β1
Tabela 3
Wynik testów na polu przeprowadzonych w różnych miejscach w Europie naturalnie zakażonych kiłą kapusty w ciągu dwóch lat. D249, D506, E245, E246 są odpornymi hybrydami kalafiora według niniejszego wynalazku, White Rock jest podatną odmianą kalafiora, SPR666 i A876 są hybrydami B. sprouts według niniejszego wynalazku, Romulus i Maximus są podatnymi odmianami B. sprouts, F1182, F1187 są odpornymi hybrydami białej kapusty głowiastej według niniejszego wynalazku i Marathon jest podatną odmianą białej kapusty głowiastej. Oszacowanie (di05) przeprowadzono pod koniec sezonu wzrostu w skali 0-5 (patrz powyżej).
| pozycj a | typ | miej sce | rok | di05 |
| D249 | kalafior | Hanower | 2000 | 0,0 |
| D506 | kalafior | Hanower | 2000 | 0,0 |
| White Rock | kalafior | Hanower | 2000 | 1,3 |
| D2 4 9 | kalafior | Halsall-UK | 2000 | 0, 0 |
| White Rock | kalafior | Haisaii-υκ | 2000 | 4,3 |
| SPR666 | B. sprouts | Halsall-UK | 2000 | 0, 0 |
| Romulus | B. sprouts | Halsall-UK | 2000 | 4,5 |
| SPR666 | B. sprouts | Roeselaere- Belgia | 2000 | 0,0 |
| Romulus | B. sprouts | Roeselaere- Belgia | 2000 | 3, 3 |
| A876 | B. sprouts | Halsall-UK | 2001 | 0, 0 |
| Maximus | B. sprouts | Halsall-UK | 2001 | 4,5 |
| E245 | kalafior | Halsall-UK | 2001 | 0,0 |
| White Rock | kalafior | Halsall-UK | 2001 | 4, 6 |
| F1187 | biała kapusta głowiasta | Halsall-UK | 2001 | 0, 0 |
| Marathon | biała kapusta głowiasta | Halsall-UK | 2001 | 3, 5 |
| E246 | kalafior | Hanower | 2001 | 0, 0 |
| White Rock | kalafior | Hanower | 2001 | 1, 9 |
| F1182 | biała kapusta głowiasta | Hanower | 2001 | 0, 0 |
| Marathon | biała kapusta głowiasta | Hanower | 2001 | 3, 6 |
PL 246007 Β1
Przykład 4. markery molekularne
Markery RAPD sprzężone z odpornością ustalano przy użyciu dwóch populacji białej kapusty głowiastej (D1544 i D1545). Dwa markery molekularne, uzyskane przy użyciu odpowiednio starterów 020 i Y13, dały produkty silnie sprzężone z odpornością na kiłę kapusty. Zarówno 020 jak i Y13 dają 94,6% (53 z 56) korelacji z wynikiem (odporny lub wrażliwy) testu oceny choroby w populacji D1544, co wskazuje na odległość 5,4 cM. Dla populacji D1545 starter 020 dał 100% podczas gdy dla Y13 95,7% (45 z 47) korelacji z wynikiem, co sugeruje silne sprzężenie (0 cM) pomiędzy 020 i odpornością oraz 4,3 cM pomiędzy Y13 i odpornością. Kiedy badano RAPD w populacji 140 roślin dihaploidalnej białej kapusty głowiastej, 020 wykazał 100% (0 cM), a Y13 98,6% (1,4 cM) korelacji z wynikiem testów oceny choroby.
Starter 020 (5'-ACA CAC GCT G-3') daje specyficzny fragment około 400 bp. Starter Y13 (5'-GGG TCT CGG T-3j daje specyficzny fragment około 640 bp. Warunki amplifikacji opisano poniżej. Po PCR 25 μΙ DNA rozdzielano w 1,8% żelu agarozowym.
: μΐ (rozcieńczonego DNA ze standartowego minipreparatu
- Starter (10 μΜ) : 1,0 μΐ
- dNTP (2,5 μΜ) : 2, 0 μΐ „ . π, . . „ Ί ... : 2,5 μΐ (200 mM Tris-HCl ρΗ
- Bufor Platinum Tag ΙΟχ
8,4,
500 mM KC1 bez MgCl?)
- MgC12 (50 mM) :0,75 μΐ
- Platinum Tag (BRL/life) : 0,2 μΐ (5 jedn./μΐ) , , : μΐ (w zależności od
- jałowa woda: , . 7 .
objętości użytego DNA) μΐ końcowej objętości
| Program PCR: 3' 94°C | 94°C 3 6°C | 0,10 0,30 | 1 cykl, cykl PCR (Perkin Elmer 9600) | ||
| ramp ramp | 0:00 0:00 | ||||
| ramp | 0:45 | 72°C | 1, | 05 | |
| 3' 94 ramp | °C 0:00 | 94°C | 0, | 10 | |
| ramp | 0:00 | 3 6°C | 0, | 30 | 40 cykli, cykl PCR (Perkin Elmer |
| ramp | 0:45 | 72°C | 1, | 05 | 9600) |
5' 72UC
PL 246007 Β1
Lista sekwencji <110> Syngenta Participations AG <120> Kapustowate odporne na chorobę <130> 70059WO_PCT <140>
<141>
<150 GB 0217406.8 <151 >2002-07-26 <160> 2 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd <400> 1 acacacgctg <210> 2 <211> 10 < 212> DNA < 213> Sewencja sztuczna <220>
< 223> Oligonukleotyd <400> 2 gggtctcggt
Claims (5)
1. Sposób identyfikacji hybrydy F1 zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty, obejmujący testowanie uprzednio otrzymanej rośliny, będącej hybrydą rośliny B. rapa odpornej na kiłę kapusty, zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty, i rośliny B. oleracea, która to hybryda F1 jest uzyskana w wyniku odzyskiwania zarodków i regenerowania rośliny ze wspomnianych odzyskanych zarodków;
pod kątem obecności fragmentu DNA możliwego do uzyskania przez amplifikację PCR przy użyciu startera O20 (SEQ ID NO: 1) lub startera Y13 (SEQ ID NO: 2) dla zidentyfikowania hybrydy F1 rośliny Brassica odpornej na kiłę kapusty.
2. Sposób według zastrz. 1, w którym roślina B. rapa zawiera odporność na kiłę kapusty z hybrydy F1 Parkin Kapusty pekińskiej.
3. Sposób według zastrz. 1, w którym jednogenową i dominującą odpornością na kiłę kapusty jest ta zawarta w reprezentatywnej linii B. oleracea CFL667 zdeponowanej w NCIMB pod numerem dostępu NCIMB 41134.
4. Sposób według któregokolwiek spośród poprzednich zastrz. od 1 do 3, w którym rośliną B. oleracea jest brokuł, biała kapusta głowiasta, kalafior, kapusta brukselska, jarmuż, kapusta włoska lub czerwona kapusta głowiasta.
5. Sposób według któregokolwiek spośród poprzednich zastrz. od 1 do 4, w którym rośliną B. oleracea jest żeńska linia chowu wsobnego.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0217406.8A GB0217406D0 (en) | 2002-07-26 | 2002-07-26 | Disease resistant brassicas |
| GB0217406.8 | 2002-07-26 | ||
| PCT/EP2003/008197 WO2004013334A1 (en) | 2002-07-26 | 2003-07-25 | Clubroot resistant brassica oleracea plants |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL374843A1 PL374843A1 (pl) | 2005-11-14 |
| PL246007B1 true PL246007B1 (pl) | 2024-11-18 |
Family
ID=9941201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL374843A PL246007B1 (pl) | 2002-07-26 | 2003-07-25 | Sposób identyfikacji hybrydy F1 zawierającej jednogenową i dominującą odporność na kiłę kapusty |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20050262583A1 (pl) |
| EP (2) | EP1525317B1 (pl) |
| JP (2) | JP2005533520A (pl) |
| KR (2) | KR20130090427A (pl) |
| CN (1) | CN1678747B (pl) |
| AU (1) | AU2003250175B2 (pl) |
| BR (2) | BRPI0312962B1 (pl) |
| CA (1) | CA2523011C (pl) |
| GB (1) | GB0217406D0 (pl) |
| MX (1) | MXPA05001010A (pl) |
| PL (1) | PL246007B1 (pl) |
| RU (1) | RU2369090C2 (pl) |
| WO (1) | WO2004013334A1 (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100876971B1 (ko) * | 2007-04-13 | 2009-01-09 | 이관호 | 식물 신품종 로얄채 및 그 육종방법 |
| JP2009183224A (ja) * | 2008-02-07 | 2009-08-20 | Mie Prefecture | 病害抵抗性種子繁殖型イチゴ品種の一代雑種育種法 |
| EP2308285A1 (en) | 2009-09-22 | 2011-04-13 | Syngenta Participations AG | Brassica oleracea plants resistant to Albugo candida |
| WO2011143344A2 (en) * | 2010-05-12 | 2011-11-17 | Agrigenetics, Inc. | Use of brown midrib-3 gene specific markers in maize for trait introgression |
| UA128552C2 (uk) * | 2010-11-29 | 2024-08-14 | Бейо Заден Б.В. | Застосування локусу кількісної ознаки 1 (qtl1) для відбору стійкої до plasmodiophora brassicae рослини brassica oleracea |
| US8754290B2 (en) | 2011-02-09 | 2014-06-17 | Dow Agrosciences, Llc | HO/LL canola with resistance to clubroot disease |
| RU2618846C2 (ru) * | 2011-09-27 | 2017-05-11 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Канола ho/ll с устойчивостью к заболеванию килой крестоцветных |
| EP2745679A1 (en) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | Rijk Zwaan Zaadteelt en Zaadhandel B.V. | Brassica plants resistant to clubroot |
| KR101483595B1 (ko) | 2013-04-22 | 2015-01-16 | 대한민국 | 양배추 뿌리혹병 저항성 품종을 식별하기 위한 snp 마커 및 그의 용도 |
| RU2717017C2 (ru) * | 2013-09-10 | 2020-03-17 | ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи | Молекулярные маркеры гена rlm2 резистентности к черной ножке brassica napus и способы их применения |
| WO2015038470A1 (en) * | 2013-09-10 | 2015-03-19 | Dow Agrosciences Llc | Molecular markers for blackleg resistance gene rlm4 in brassica napus and methods of using the same |
| CN106011134B (zh) * | 2016-06-22 | 2018-10-19 | 沈阳农业大学 | 大白菜抗根肿病CRb基因的共分离分子标记TCR540、引物及应用 |
| TWI873082B (zh) * | 2017-08-17 | 2025-02-21 | 日商莎卡達種子股份有限公司 | 甘藍（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）植物之異型檢出法 |
| KR102139804B1 (ko) | 2018-07-30 | 2020-07-31 | 재단법인 전남생물산업진흥원 | 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가된 붉은 배추 추출물 제조방법 |
| KR20200090566A (ko) | 2019-01-21 | 2020-07-29 | 재단법인 전남생물산업진흥원 | 붉은 배추를 이용한 붉은 배추 발효 식초의 제조방법 |
| EA202192253A1 (ru) * | 2019-02-15 | 2022-01-19 | БАСФ АГРИКУЛЬЧУРАЛ СОЛЮШНС СИД УС ЛЛСи | Растения brassica, обладающие устойчивостью к киле крестоцветных |
| CN110999779B (zh) * | 2019-12-13 | 2023-01-20 | 西北农林科技大学 | 利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法 |
| CN110972931A (zh) * | 2019-12-17 | 2020-04-10 | 山西省农业科学院蔬菜研究所 | 一种抗病耐抽薹春白菜的选育方法 |
| CN114015801B (zh) * | 2021-12-01 | 2025-01-10 | 湖北省农业科学院经济作物研究所 | 一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用 |
| CN116472954A (zh) * | 2023-05-09 | 2023-07-25 | 江苏省农业科学院 | 一种创制抗根肿病甘蓝纯系的方法 |
| EP4573903A1 (en) | 2023-12-21 | 2025-06-25 | Fine Agrochemicals Limited | Method for prevention or treatment of plant gall development |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5254802A (en) * | 1987-12-17 | 1993-10-19 | Sietske Hoekstra | Male sterile brassica plants |
| JP2730670B2 (ja) * | 1995-10-26 | 1998-03-25 | 農林水産省 野菜・茶業試験場長 | 根こぶ病抵抗性ハクサイの選抜に用いる合成オリゴヌクレオチド |
| WO2000055340A1 (en) * | 1999-03-15 | 2000-09-21 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for enhancing the disease resistance of plants |
| KR100490483B1 (ko) * | 2001-02-09 | 2005-05-17 | 충남대학교산학협력단 | 무사마귀병 내성 식물의 효과적 선발을 위한 유전자 마커,프라이머 키트 및 무사마귀병 내성 식물의 선발 방법 |
| EP1402037A1 (en) * | 2001-06-22 | 2004-03-31 | Syngenta Participations AG | Plant genes involved in defense against pathogens |
-
2002
- 2002-07-26 GB GBGB0217406.8A patent/GB0217406D0/en not_active Ceased
-
2003
- 2003-07-25 BR BRPI0312962-4A patent/BRPI0312962B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2003-07-25 EP EP03766293.9A patent/EP1525317B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-25 CA CA2523011A patent/CA2523011C/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-25 EP EP10176191.4A patent/EP2302061B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-25 WO PCT/EP2003/008197 patent/WO2004013334A1/en not_active Ceased
- 2003-07-25 AU AU2003250175A patent/AU2003250175B2/en not_active Expired
- 2003-07-25 CN CN038207362A patent/CN1678747B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-25 KR KR1020137020547A patent/KR20130090427A/ko not_active Withdrawn
- 2003-07-25 JP JP2004525312A patent/JP2005533520A/ja not_active Withdrawn
- 2003-07-25 RU RU2005105563/13A patent/RU2369090C2/ru active
- 2003-07-25 PL PL374843A patent/PL246007B1/pl unknown
- 2003-07-25 BR BR0312962-4A patent/BR0312962A/pt active IP Right Grant
- 2003-07-25 US US10/522,094 patent/US20050262583A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-25 KR KR1020057001468A patent/KR20050026012A/ko not_active Ceased
- 2003-07-25 MX MXPA05001010A patent/MXPA05001010A/es active IP Right Grant
-
2009
- 2009-10-06 US US12/573,963 patent/US8013209B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-07-16 JP JP2010161513A patent/JP5551534B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-05-24 US US13/114,176 patent/US9295207B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2016
- 2016-03-01 US US15/057,684 patent/US10017780B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8013209B2 (en) | 2011-09-06 |
| US10017780B2 (en) | 2018-07-10 |
| EP1525317A1 (en) | 2005-04-27 |
| RU2005105563A (ru) | 2005-11-20 |
| AU2003250175B2 (en) | 2008-05-08 |
| GB0217406D0 (en) | 2002-09-04 |
| US20160177331A1 (en) | 2016-06-23 |
| US20050262583A1 (en) | 2005-11-24 |
| EP2302061A1 (en) | 2011-03-30 |
| MXPA05001010A (es) | 2005-05-16 |
| EP2302061B1 (en) | 2022-09-21 |
| CA2523011C (en) | 2014-07-08 |
| KR20130090427A (ko) | 2013-08-13 |
| JP5551534B2 (ja) | 2014-07-16 |
| RU2369090C2 (ru) | 2009-10-10 |
| BR0312962A (pt) | 2005-06-14 |
| EP1525317B1 (en) | 2019-12-25 |
| CN1678747B (zh) | 2010-05-26 |
| CA2523011A1 (en) | 2004-02-12 |
| AU2003250175A1 (en) | 2004-02-23 |
| US20100037343A1 (en) | 2010-02-11 |
| CN1678747A (zh) | 2005-10-05 |
| BRPI0312962B1 (pt) | 2021-04-13 |
| PL374843A1 (pl) | 2005-11-14 |
| US9295207B2 (en) | 2016-03-29 |
| JP2010284166A (ja) | 2010-12-24 |
| KR20050026012A (ko) | 2005-03-14 |
| WO2004013334A1 (en) | 2004-02-12 |
| JP2005533520A (ja) | 2005-11-10 |
| US20110231951A1 (en) | 2011-09-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10017780B2 (en) | Clubroot resistant Brassica oleracea plants | |
| US8492619B2 (en) | Seedless pepper plant | |
| EP2887796A2 (en) | Multiple-virus-resistant melon | |
| CN105142394A (zh) | 抗根肿病的芸苔属植物 | |
| BR112018000541B1 (pt) | Métodos para selecionar uma população de plantas ou sementes de algodão staygreen (stg), para selecionar uma planta ou semente de algodão e para avaliar uma coleção de germoplasma de algodão | |
| US20220295719A1 (en) | Prolific flowering watermelon | |
| US8878012B2 (en) | Methods for improving the yield of cucumber plants | |
| US20130191940A1 (en) | Dominant earliness mutation and gene in sunflower (helianthus annuus) | |
| JP6329767B2 (ja) | Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ抵抗性のアブラナ属植物、その種子および植物部位ならびにそれらを獲得する方法 | |
| CA3238354A1 (en) | Novel squash plants with downy mildew resistance | |
| KR20260047584A (ko) | 파파야 링스팟 바이러스(prsv) 저항성을 갖는 신규한 스쿼시 식물 | |
| HK1151314A (en) | Clubroot resistant brassica oleracea plants |