BRPI0315943B1

BRPI0315943B1 - Método para a produção de proteína anticongelante

Info

Publication number: BRPI0315943B1
Application number: BRPI0315943-4A
Authority: BR
Inventors: John William Chapman; Teun Van Der Laar; Nigel Malcolm Lindner; Christiaan Visser
Original assignee: Unilever N.V.
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-11-03
Publication date: 2019-07-09
Also published as: ZA200503977B; EP1573017B1; IL168654A; JP2006510368A; CN1729295A; AU2003274102B2; BR0315943A; ES2309343T3; MXPA05006527A; ATE400662T1; NZ540743A; JP4546257B2; DE60322106D1; US20070155956A1; CN100383251C; CA2510378C; CA2510378A1; WO2004057007A1; AU2003274102A1; MY136665A

Abstract

"método para a produção de uma proteína anticongelante e composição". a presente invenção trata de um método para aumentar a atividade específica de uma proteína anticongelante do tipo iii quando a dita proteína é preparada por meio da expressão em uma espécie fúngica heteróloga de um gene que codifica a seqüência da proteína, por meio da redução da extensão da glicosilação da proteína.

Description

“MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA ANTICONGELANTE”

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método para aumentar a atividade específica de uma proteína anticongelante do tipo III e a uma composição contendo dita proteína.

Antecedentes da Invenção

As proteínas anticongelantes (AFPs) são polipeptídeos produzidos por uma ampla gama de espécies, em particular aquelas nativas de climas mais frios, que têm capacidade de inibir o congelamento da água e de materiais aquosos a temperaturas abaixo de 0°C. Em geral, acredita-se que essas proteínas funcionam por meio de interação com cristais de gelo e de inibição do crescimento dos mesmos, mas agora está claro que há classes diferentes de proteínas anticongelantes que podem ter mecanismos de ação diferentes e efeitos diferentes. Por exemplo, além de causar uma histerese térmica no comportamento de congelamento/derretimento de sistemas de gelo/água, as AFPs pode influenciar a forma e o tamanho dos cristais de gelo formados quando ocorre o congelamento e inibem a recristalização do gelo. Mais recentemente, foi sugerido que essas proteínas deveríam ser, por outro lado, conhecidas como proteínas de estruturação de gelo (ISPs) (Clarke, C.J., Buckley, S.L., and Lindner, N., Cryoletters., 23 (2002) 89-92).

Esses atributos das AFPs significam que podem ter efeitos profundos em propriedades, tais como a facilidade de produção, a textura e a estabilidade durante o armazenamento de vários preparados congelados e, nos últimos anos, tem havido muito interesse em sua possível aplicação comercial, em especial na indústria de alimentos. Por exemplo, o controle das dimensões dos cristais de gelo pode resultar em texturas particularmente favoráveis em confeitos congelados. As melhoras nas propriedades de armazenamento

também são a resultante da inclusão de AFPs na formulação. Uma revisão da ocorrência de AFPs e de seu uso potencial na indústria de alimentos foi apresentada por Griffith e Vanya Ewart em Biotechnology Advances, vol. 13, páginas 375-402 (1995).

Para ser bem apropriada para tal finalidade, uma AFP precisa combinar efeitos desejáveis nos materiais congelados em que foi incorporada, e ser preparada de imediato em uma escala industrial. Este último requisito pode ser particularmente problemático, uma vez que muitas das espécies em que as AFPs foram identificadas não são sujeitas de imediato à coleta ou ao processamento comercial. Verificou-se que algumas AFPs são muito suscetíveis à desnaturação, o que impõe sérias restrições nos métodos de isolamento que podem ser aplicados às mesmas. Em vista dessas dificuldades, tem havido um interesse considerável na produção de AFPs por meio da expressão de genes clonados que as codificam em hospedeiros de expressão mais convenientes, tais como microorganismos ou plantas facilmente cultivadas e processadas. Para muitas AFPs, no entanto, isto provou ser problemático: elas são normalmente obtidas com um fraco rendimento e algumas vezes com ausência de atividade.

Dentre as AFPs mais potencialmente úteis que foram identificadas, há uma AFP do tipo III de peixe-carneiro americano, a qual foi designada como HPLC-12. Verificou-se que essa proteína se distingue em sua capacidade de ajudar a controlar a forma e o tamanho dos cristais de gelo. Foi verificado que a proteína, por exemplo, tem um desempenho superior ao das AFPs do tipo I bem conhecidas nos testes de recristalização. Uma outra propriedade vantajosa identificada em HPLC-12 do tipo III foi que, embora não fosse produzida em quantidades substanciais em E. coli, ela podería ser produzida com um bom rendimento através da expressão de um gene clonado codificando a sua seqüência em uma levedura transformada resultando, desse

modo, em uma fonte potencialmente muito economicamente viável para a produção em escala industrial do que os peixes em que a proteína ocorre naturalmente.

A glicosilação da proteína envolve um grande número de enzimas e as deficiências em uma ou mais destas podem alterar potencialmente o padrão da glicosilação. Uma perda da atividade da enzima responsável pela transferência do primeiro resíduo de açúcar a uma proteína pode impedir potencialmente qualquer glicosilação. Por conseguinte, o uso de uma linhagem de levedura mutante deficiente em tal proteína manosil-transferase (pmt) foi sugerido como uma maneira para superar o problema da glicosilação anormal das proteínas heterologamente expressadas (WO 94/04687). No entanto, a situação é complicada devido ao fato de que não há apenas uma enzima com essa função, mas várias com diferentes especificidades protéicas. Por exemplo, em uma revisão sobre a O-manosilação de proteínas, StrahlBolsinger et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1426 (1999) 297-307) notaram que entre 10 proteínas O-glicosiladas estudadas, 6 são glicosiladas em levedura pelas enzimas pmt1 e pmt2, enquanto que as 4 outras mostram uma diminuição ou falta de O-manosilação exclusivamente nas linhagens onde a atividade da enzima pmt4 foi abolida. Observou-se que nenhuma das proteínas analisadas foi hipoglicosilada em uma outra classe de mutante em que a atividade da enzima pmt3 é perdida, no entanto, essa mutação resultou em uma O-manosilação reduzida de quitinase na base genética de uma mutação dupla de pmt1pmt2. Não foi identificada nenhuma correlação entre a especificidade da manosilação e quaisquer seqüências ou características estruturais do substrato de proteína, de modo que não é possível predizer quais enzimas de transferase particulares serão, provavelmente, responsáveis pela iniciação da glicosilação de qualquer proteína particular, quer se trate de uma proteína nativa da espécie glicosilante, quer se trate de uma proteína

estranha produzida pela expressão heteróloga na mesma.

Descrição Resumida da Invenção

Os inventores da presente invenção verificaram agora, entretanto, que a HPLC-12 do tipo III produzida em levedura tem uma atividade específica, tal como medida em um ensaio de inibição da recristalização, a qual é mais baixa que aquela da proteína isolada do sangue de peixe-carneiro americano.

Pôde-se demonstrar que esta é uma conseqüência da O-glicosilação da proteína pela levedura, o que não ocorre quando a proteína nativa é produzida pelos peixes. Surpreendentemente, somente a espécie não-glicosilada é ativa.

Isto foi inesperado, uma vez que essa evidência experimental como tal relacionada com as AFPs não revela nenhum padrão claro e consistente com respeito a glicosilação e a funcionalidade: de fato, algumas AFPs são intensamente glicosiladas naturalmente. Por exemplo, DeVries et al.

(Science, 172 (1971) 1152) relataram que a atividade de uma AFP encontrada em bacalhaus do Norte e em nototenióides da Antártica é perdida se os dissacarídeos pendentes forem removidos. Em outros casos, demonstrou-se que a glicosilação que ocorre na natureza não é importante para a atividade da

AFP. Por exemplo, Worrall et al.. (Science, 282 (1998)115-117) descobriram que quando uma AFP naturalmente glicosilada de cenouras era produzida sem os seus glicanos de superfície, a sua atividade de inibição da recristalização não era afetada. Uma falta similar da dependência na glicosilação, mesmo que estivesse naturalmente presente, para a atividade da AFP foi observada pelos inventores da presente invenção no caso de uma AFP heterologamente expressa da grama de centeio. Desse modo, não há nenhuma indicação clara de uma ligação geral entre a glicosilação e a atividade entre as AFPs.

Além disso, em conseqüência dessa descoberta inesperada, os inventores da presente invenção puderam elaborar um método para suprimir substancialmente essa glicosilação anormal da AFP do tipo III e, desse modo,

forneceram um meio para produzir as AFPs do tipo III, tal como a proteína de

HPLC-12 do tipo III que combina a conveniência e a economia da levedura como um organismo hospedeiro, enquanto que resulta em um produto com uma potência que se aproxima daquela da proteína nativa. Os inventores da presente invenção descobriram que, ao se utilizar esse método, o rendimento da proteína recombinante e a atividade específica da proteína recombinante podem ser aumentados, ou seja, mais proteína pode ser recuperada das células hospedeiras e, dessa proteína, uma proporção maior de proteína é ativa.

Por conseguinte, em um primeiro aspecto, a presente invenção apresenta um método para a produção de uma proteína anticongelante (AFP) do tipo III, em que o método compreende a expressão, em uma célula hospedeira fúngica que é deficiente na glicosilação da proteína, de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a AFP.

Em uma realização preferida, a célula hospedeira fúngica é deficiente na glicosilação da proteína em virtude de uma mutação em um ou mais genes que codificam as enzimas envolvidas na glicosilação da proteína.

De preferência, a célula fúngica é deficiente na O-glicosilação, de maior preferência, deficiente na atividade de uma ou mais enzimas da proteína manosil-transferase.

Em uma realização preferida, a célula hospedeira fúngica é uma levedura, tal como Saccharomyces cerevisiae, de preferência, uma linhagem de levedura mutante deficiente em pmt1 e/ou deficiente em pmt2.

Em um aspecto correlato, a presente invenção também apresenta um método para aumentar a atividade anticongelante específica de uma proteína anticongelante (AFP) do tipo III ou um equivalente funcional da mesma, quando dita proteína for preparada através da expressão em uma espécie fúngica heteróloga de uma seqüência de gene/ácido nucléico que codifica a proteína por meio da redução da extensão da glicosilação da proteína.

A atividade da AFP específica é, de preferência, medida por meio de um ensaio de inibição da recristalização do gelo.

Em uma realização preferida, a redução na glicosilação da proteína é obtida por meio da seleção de uma linhagem da espécie de expressão que é deficiente na atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na glicosilação da proteína, de preferência, uma ou mais enzimas protéicas manosil-transferase.

Uma linhagem deficiente em glicosilação apropriada é selecionada tipicamente a partir de uma gama de tais linhagens, pela análise da proteína AFP do tipo III que é produzida quando um gene que codifica dita proteína for expresso em ditas linhagens. De preferência, a análise da proteína AFP do tipo III é baseada em um ensaio de sua atividade ou funcionalidade de AFP, de maior preferência, a sua atividade inibidora da recristalização do gelo.

Em um segundo aspecto, a presente invenção apresenta uma composição que compreende a proteína anticongelante (AFP) do tipo III recombinante em que de cerca de 50 a 99% da AFP são não-glicosiladas. De preferência, a AFP do tipo III é a HPLC-12 do tipo III.

Em uma realização preferida, a composição pode ser obtida, de maior preferência, pelo método do primeiro aspecto da invenção.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção apresenta um método para a identificação de uma linhagem hospedeira fúngica capaz de expressar uma AFP do tipo III, tal que menos que cerca de 50% da AFP expressa é glicosilada, sendo que o método compreende:

(i) fornecimento de uma pluralidade de células hospedeiras fúngicas que compreendem uma seqüência de ácido nucléico que dirige a expressão da AFP na célula hospedeira;

(ii) o cultivo das células hospedeiras sob condições que permitam a expressão da AFP; e

(iii) a determinação da extensão da glicosilação da AFP expressada

Em uma realização preferida, a pluralidade de células hospedeiras foi submetida a uma etapa de mutagênese.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção é baseada na descoberta de que quando a proteína anticongelante HPLC-12 do tipo III é preparada pela expressão em uma linhagem de levedura normal de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína, uma proporção substancial do produto protéico secretado foi glicosilada. Tal glicosilação não está presente na proteína nativa e os ensaios de inibição da recristalização nas frações glicosiladas e nãoglicosiladas separadas revelaram, surpreendentemente, que a glicosilação aboliu com eficácia a atividade da AFP da proteína.

Em vista dessa descoberta surpreendente, os inventores da presente invenção se dispuseram a elaborar um método para aumentar a atividade específica da proteína anticongelante HPLC-12 do tipo III ou um equivalente funcional da mesma, quando dita proteína for preparada pela expressão em uma espécie fúngica heteróloga de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência da proteína por meio da redução da extensão da glicosilação da proteína.

A menos que esteja definido de alguma outra maneira, todos os termos técnicos e científicos empregados no presente possuem o mesmo significado que é geralmente compreendido por um técnico no assunto (por exemplo, na cultura de células, na genética molecular, na química do ácido nucléico, em técnicas de hibridização e na bioquímica). Técnicas padrão são empregadas para métodos moleculares, genéticos e bioquímicos (vide, de maneira geral, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^a ed.

(2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4^a Ed., John Wiley & Sons,

Inc. - e a versão completa intitulada Current Protocols in Molecular Biology que são incorporados ao presente a título de referência) e métodos químicos.

Proteínas Anticongelantes

Para as finalidades da presente invenção, uma proteína anticongelante é uma proteína que possui propriedades significativas de inibição da recristalização do gelo e é, portanto, uma proteína de estruturação do gelo (ISP). As propriedades de inibição da recristalização do gelo podem ser medidas convenientemente por meio de um ensaio de painel modificado, tal como descrito no documento WO 00/53029. A atividade inibidora da recristalização do gelo significativa pode ser definida como onde uma solução de 0,01% em peso da AFP em 30% em peso de sacarose, resfriada rapidamente (pelo menos A50°C por minuto) até -40°C, aquecida rapidamente (pelo menos A50°C por minuto) até -6°C e então mantida nessa temperatura, resulta em um aumento no tamanho médio do cristal de gelo em 1 hora de menos de 5 μπη. A atividade específica é uma medida, por unidade de concentração da AFP dissolvida, dessa capacidade da proteína de limitar a extensão do aumento no tamanho de cristais de gelo como uma conseqüência da recristalização em um determinado momento.

As proteínas anticongelantes de acordo com a presente invenção são AFPs do tipo III. Essas AFPs foram identificadas até a presente data em uma série de peixes polares da família Zoarcidae, tais como Macrozoarces americanus (enguia, peixe-carneiro americano) e Anarhichas lupus (peixe lobo) Barrett, 2001, Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 105-117. As AFPs do tipo III têm tipicamente um peso molecular de cerca de 6,5 a cerca de 14 kDa, uma estrutura secundária do tipo β-sanduíche e a uma estrutura terciária do tipo globular.

Uma série de genes que codificam as AFPs do tipo III foi clonada (Davies, and Hew, 1990, FASEB J., 4:2460-2468). Um tipo particularmente preferido de AFP do tipo III é a HPLC-12 do tipo III.

A seqüência de aminoácido da HPLA-12 do tipo III do peixecarneiro americano é mostrada como SEQ ID N°: 1. Os polipeptídeos de HPLC12 do tipo III de acordo com o presente invenção incluem os polipeptídeos que têm a seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID N°: 1 e seus equivalentes funcionais.

Equivalente funcional refere-se a qualquer polipeptídeo cuja seqüência possui pelo menos 80%, de maior preferência, pelo menos 85%, 90% ou 95% de identidade de seqüência com a seqüência da HPLC-12 do tipo III, tal como mostrado na SEQ ID N°: 1 e que exibe a atividade de AFP, em particular, a atividade de inibição da recristalização do gelo (RI). É preferível que os equivalentes funcionais tenham pelo menos 50% de atividade de RI de um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácido da HPLC-12 do tipo III, tal como mostrado na SEQ ID N°: 1. De maior preferência, pelo menos 60%, 70% ou 80% da atividade de RI de um polipeptídeo que possui a seqüência de aminoácido da HPLC-12 do tipo III, tal como mostrado na SEQ ID N°: 1. A atividade de RI pode ser medida convenientemente por meio de um ensaio de painel modificado, tal como descrito no documento WO 00/53029.

Os cálculos da identidade da seqüência são executados tipicamente com o auxílio de programas de comparação de seqüência de disponibilidade imediata. Esses programas de computador comercialmente disponíveis podem calcular a porcentagem de homologia, tipicamente a porcentagem de identidade, entre duas ou mais seqüências.

A maior parte dos métodos de comparação de seqüência destinase a produzir os alinhamentos ideais que levam em consideração as inserções e as eliminações possíveis sem penalizar de maneira inadequada à classificação total da homologia. Isto é obtido mediante a inserção de “intervalos” ou “gaps” no alinhamento da seqüência para tentar maximizar a homologia local.

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No entanto, esses métodos mais complexos atribuem “penalidades de intervalos” ou “gap penalties” ao intervalo que ocorre no alinhamento de modo que, para o mesmo número de aminoácidos idênticos, um alinhamento de seqüência com tão poucos intervalos quanto possível, refletindo uma maior relatividade entre as duas seqüências comparadas, irá obter uma classificação mais elevada que aquela com muitos intervalos. Os “custos de intervalos afins” ou “affine gap costs” são utilizados tipicamente, os quais acarretam em um custo relativamente elevado para a existência de um intervalo e uma penalidade menor para cada resíduo subseqüente no intervalo.

Esse é o sistema de classificação de intervalos mais comumente utilizado. É claro que as penalidades de intervalos elevadas irão produzir alinhamentos otimizados com poucos intervalo. A maior parte dos programas de alinhamento permite que as penalidades de intervalo sejam modificadas. No entanto, é preferível utilizar os valores padrão quando é empregado tal software para as comparações de seqüência. Por exemplo, quando é empregado o pacote GCG

Wisconsin Bestfit (vide abaixo), a penalidade de intervalo padrão para as seqüências de aminoácido é -12 para um intervalo e -4 para cada extensão.

O cálculo da porcentagem máxima de homologia requer, portanto, em primeiro lugar a produção de um alinhamento ideal levando em consideração as penalidades de intervalos. Um programa de computador apropriado para efetuar tal alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, EUA; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research

12:387). Os exemplos de um outro software que pode executar comparações de seqüência incluem, mas sem ficar a eles limitados, o pacote BLAST (vide

Ausubel et al., 1999 ibid - Capítulo 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol.

Biol., 403-410) e o conjunto de ferramentas de comparação GENEWORKS.

Ambos BLAST e FASTA estão disponíveis para a busca offline e online (vide

Ausubel et al., 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). No entanto, é preferível utilizar

o programa GCG Bestfit.

Embora a porcentagem de homologia final possa ser medida em termos de identidade, o processo de alinhamento per se não é tipicamente baseado em uma comparação de pares do tipo tudo ou nada. Ao invés disto, uma matriz de classificação de similaridade escalonada é em geral empregada, a qual atribui classificações a cada comparação de pares baseada na similaridade química ou na distância evolucionária. Um exemplo de tal matriz normalmente utilizada é a matriz BLOSUM62, a matriz padrão para o conjunto de programas BLAST. Os programas GCG Wisconsin utilizam, em geral, os valores padrão públicos ou uma tabela de comparação de símbolos sob medida, se for fornecida (vide o manual do usuário para maiores detalhes). É preferível utilizar os valores padrão públicos para o pacote GCG ou, no caso de um outro software, a matriz padrão, tal como BLOSUM62.

Uma vez que o software tenha produzido um alinhamento ideal, é possível calcular a porcentagem de homologia, de preferência, a porcentagem de identidade de seqüência. O software tipicamente faz isto como parte da comparação da seqüência e gera um resultado numérico.

Em uma realização altamente preferida, o polipeptídeo de AFP é ligado a uma seqüência sinal que dirige a secreção da proteína AFP do tipo III da célula hospedeira. As seqüências de sinal apropriadas incluem a seqüência de sinal da invertase de S. cerevisiae e a pré-seqüência do fator de aacoplamento de S. cerevisiae.

A AFP pode ser fundida a uma seqüência heteróloga para formar uma proteína de fusão para ajudar na extração e na purificação. Os exemplos de parceiros da proteína de fusão incluem a glutationa-S-transferase (GST), a hexahistidina, GAL4 (domínios de ligação de DNA e/ou de ativação transcricional) e a β- galactosidase. Também pode ser conveniente a inclusão de um sítio de divagem proteolítica entre o parceiro da proteína de fusão e a

seqüência de proteína de interesse para permitir a remoção de seqüências de proteína de fusão. De preferência, a proteína de fusão não impede a atividade de RI da AFP. No entanto, para a produção de AFPs para ser uso na preparação de gêneros alimentícios, é preferível evitar o uso de parceiros de fusão.

Ácidos Nucléicos e Vetores de Expressão de Codificação de AFP

O método da presente invenção compreende a expressão de AFPs do tipo III em um hospedeiro fúngico deficiente em glicosilação. Isto é obtido mediante a introdução, no hospedeiro fúngico, de uma seqüência de ácido nucléico, tipicamente um vetor de expressão que codifique a AFP do tipo III, junto com as seqüências requeridas para dirigir a expressão da AFP do tipo III na célula hospedeira. Desse modo, a seqüência de ácido nucléico que codifica uma AFP do tipo III é, em geral, incorporada em um vetor de ácido nucléico replicável recombinante apropriado para a introdução na célula hospedeira fúngica. Uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma AFP do tipo III pode, por exemplo, ser uma seqüência de cDNA, uma seqüência de DNA genômico, uma seqüência de DNA híbrido, ou uma seqüência de DNA sintético ou semi-sintético. É preferível utilizar um cDNA ao invés de um DNA genômico.

A seqüência de ácido nucléico que codifica a AFP do tipo III é operacionalmente ligada a uma seqüência de controle que é capaz de fornecer a expressão da seqüência de codificação pela célula hospedeira, ou seja, o vetor é um vetor de expressão. A expressão “operacionalmente ligada” significa que os componentes descritos estão em uma relação que permite que eles funcionem em sua maneira pretendida. Uma seqüência reguladora ‘Operacionalmente ligada” a uma seqüência de codificação é ligada de uma tal maneira que a expressão da seqüência de codificação é obtida sob condições compatíveis com as seqüências de controle.

As seqüências de controle incluirão seqüências, tais como promotores e, opcionalmente, elementos intensificadores transcricionais. De

preferência, o promotor é um promotor forte, tal como um promotor GAPDH de S. cerevisiae ou o promotor GAL7. Os promotores podem ser constitutivos, tal como o promotor GAPDH, ou induzíveis, tal como o promotor GAL7.

O vetor nucléico é transformado em uma célula hospedeira fúngica apropriada ao se empregar técnicas padrão, tais como choque de calor ou eletroporação, para se obter a expressão da AFP do tipo III. Esse processo pode compreender o cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão, tal como descrito acima, sob condições para se obter a expressão pelo vetor da seqüência de codificação que codifica a AFP do tipo III e, opcionalmente, a recuperação da proteína expressa.

Um método apropriado para a expressão de um polipeptídeo de HPLC-12 do tipo III em S. cerevisiae é descrito no documento WO 97/02343, exceto pelo fato de que a célula hospedeira será deficiente em glicosilação, tal como descrito abaixo.

Onde a AFP do tipo III não for ligada a uma seqüência de sinal, a proteína pode ser recuperada a partir das células hospedeiras por meio de técnicas padrão, tais como a lise das células e a purificação da proteína recombinante do lisado da célula. Onde uma seqüência de sinal for utilizada, a proteína pode ser recuperada do sobrenadante da cultura.

Células Hospedeiras Fúngicas com Glicosilação Reduzida

Uma redução na glicosilação da AFP é tipicamente obtida mediante a inibição ou a abolição da atividade de produtos de genes, tais como enzimas, envolvidos nas rotas de glicosilação da célula hospedeira. De preferência, a dita glicosilação é a O-glicosilação, a qual significa a ligação de porções carboidrato pendentes a resíduos de serina e/ou treonina na superfície da proteína.

Em uma realização preferida, a redução na glicosilação é obtida por meio da seleção de uma linhagem do organismo de expressão que é

deficiente na atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na glicosilação da proteína. De preferência, a dita enzima é aquela envolvida na ligação de um resíduo de açúcar diretamente a uma cadeia lateral de aminoácido do substrato da proteína. É preferida uma enzima envolvida na ligação de um resíduo de manosil ao grupo hidroxila de um resíduo de serina ou treonina do substrato da proteína (O-glicosilação). Devido ao fato de que há tipicamente diversas de tais enzima ativas em uma determinada linhagem fúngica, é necessário selecionar as linhagens deficientes na atividade das enzimas específicas que são eficazes na glicosilação da HPLC-12 do tipo III especificamente.

A linhagem hospedeira é tipicamente deficiente na atividade de uma enzima de interesse devido a uma ou mais mutações no gene correspondente. A mutação pode estar na seqüência de codificação, tal como uma inserção, uma eliminação ou uma substituição que afeta a atividade, a conformação e/ou a estabilidade do polipeptídeo resultante. A mutação também pode estar nas seqüências de controle regulador, tais como o promotor e/ou 5'UTR, tendo como resultante uma redução na expressão do produto gênico. No entanto, também é possível que a atividade de uma enzima de interesse seja afetada por uma mutação em um outro produto gênico que interaja com a enzima de interesse.

Tipicamente, uma linhagem apropriada para a expressão é selecionada entre as linhagens mutantes deficientes em glicosilação que já foram identificadas para a espécie em que a expressão deve ser realizada. No caso da expressão em S. cerevisiae, por exemplo, pelo menos quatro genes foram identificados, os quais codificam as proteínas envolvidas na transferência de um resíduo de manosil para os resíduos de proteína serina ou treonina, e ditos genes são designados como pmt1, pmt2, pmt3 e pmt4. Os inventores da presente invenção puderam investigar os mutantes nos quais era sabido que a atividade de um ou mais desses genes estava rompida. Desse modo, eles

puderam determinar que o rompimento de pmt1 ou de pmt2 era eficaz na redução da extensão da glicosilação da HPLC-12 do tipo III secretada. Também se verificou que o rendimento da proteína secretada era afetado pelas mutações e verificou-se que o rompimento do gene preferido para as finalidades da presente invenção é aquele de pmt1, uma vez que este produz o rendimento mais elevado da proteína HPLC-12 do tipo III ativa não-glicosilada. Por outro lado, o rompimento do gene pmt4 não teve um efeito apreciável na extensão da glicosilação nem no rendimento.

Por conseguinte, a presente invenção apresenta um método para a preparação de HPLC-12 do tipo III ou um equivalente funcional da mesma, com atividade de AFP específica intensificada (em comparação com aquela obtida quando a proteína é produzida na linhagem original) por meio da expressão de uma seqüência de nucleotídeo que codifica dita proteína em uma linhagem hospedeira fúngica deficiente na atividade das enzimas codificadas por um ou mais dos genes pmt1 e pmt2 ou dos seus homólogos. De preferência, o gene rompido é pmt1.

Neste contexto, o termo homólogo do mesmo refere-se a um gene que codifica um produto gênico que possui a mesma função que os produtos dos genes pmt1 ou pmt2.

Em uma realização preferida, a célula hospedeira fúngica é uma célula de Saccharomyces cerevisiae com um gene pmt1 rompido e/ou um gene pmt2 rompido.

A extensão da glicosilação da HPLC-12 do tipo III produzida por qualquer linhagem de expressão escolhida pode ser calibrada de imediato por métodos que são sensíveis ao aumento do peso molecular da proteína modificada. Por exemplo, a massa adicional das ligações de glicano é imediatamente aparente em SGS-PAGE. A aplicação desse método também pode ser ajudada pelo uso de um preparado de anticorpo, específico para a

HPLC-12 para executar uma mancha Western em que as faixas devidas a AFP (glicosilada e não-glicosilada) são detectadas, especificamente, com a base de outras proteínas suprimidas. Isto permite a identificação das linhagens que são eficazes na supressão da glicosilação da HLPC-12 a ser identificada, por exemplo, sem a necessidade de purificar a proteína HPLC-12 do meio no qual ela é secretada. Os anticorpos monoclonais ou policlonais apropriados podem ser preparados de imediato por métodos convencionais. Alternativamente, o nível da HPLC-12 do tipo III glicosilada e não-glicosilada pode ser determinado ao se empregar HPLC de fase reversa. Além disso, o sistema de HPLC acoplado com a espectroscopia de massa pode ser utilizado para investigar as glicoformas específicas.

Métodos tais como a eletroforese com gel SDS, a mancha Western, a análise de HPLC e a HPLC acoplada com a espectroscopia de massa foram utilizados pelos inventores da presente invenção para identificar as linhagens preferidas de S. cerevisiae para a produção de HPLC-12 do tipo

III. Isso podería ser estendido de imediato para investigar outras linhagens mutantes dessa ou de outras espécies, a fim de encontrar hospedeiros de expressão ainda mais eficazes. Alternativamente, um ensaio baseado nas propriedades de inibição da recristalização de um preparado contendo HPLC12 do tipo III pelo menos parcialmente purificada podería ser utilizado para detectar as condições ou as linhagens que produzem um bom rendimento de proteína ativa.

Através da identificação da ausência de glicosilação como o critério chave na avaliação da utilidade do produto como uma proteína anticongelante e, desse modo, fornecendo métodos convenientes para analisar isto, os inventores da presente invenção apresentaram assim um método geral para identificar as linhagens fúngicas adequadas à produção da HPLC-12 do tipo III ativa com um bom rendimento.

'ALA

Na S. cerevisiae há uma série de outros genes que foram identificados cujos produtos da expressão são enzimas envolvidas nos últimos estágios de glicosilação e que, em alguns casos, são envolvidas na glicosilação ligada a O e a N (Strahl-Bolsinger et al (Biochimica et Biophysica Acta 1426 (1999) 297-307)). Os mutantes nos quais esses genes foram rompidos também puderam, em princípio, ser investigados para calibrar a sua adequação para a produção da HPLC-12 do tipo III ou um equivalente funcional.

O método também poderia ser estendido de imediato a outras espécies. Em alguns casos, os mutantes deficientes em glicosilação já tinham sido descritos e em outros casos estes poderíam ser identificados de imediato.

Por exemplo, o documento WO 94/04687 descreve a clonagem de um homólogo de pmt1 de uma outra levedura, Kluyveromyces lactis. Isto foi obtido de imediato através de PCR, usando os primers (iniciadores) projetados utilizando-se as informações da seqüência do gene de Saccharomyces. Os inventores prosseguem descrevendo como a seqüência do gene de Kluyveromyces lactis deve permitir que um mutante de rompimento seja construído para essa espécie. A mesma estratégia pode ser aplicada diretamente a outros fungos. À luz da descoberta dos inventores da presente invenção que as enzimas codificadas por pmt1 e pmt2 são as mais eficazes na glicosilação da HPLC-12 do tipo III em Saccharomyces, é provável que as proteínas homólogas a estas sejam alvos apropriados para o rompimento em outras espécies. Uma vez que os mutantes de glicosilação candidatos apropriados são desse modo adquiridos ou, caso necessário, construídos para outras espécies fúngicas, a mesma estratégia que foi exemplificada pelos inventores para Saccharomyces deve ser aplicável para identificar a linhagem em que pode ser obtido o melhor rendimento da HPLC-12 do tipo III ativa.

Em uma realização, as células hospedeiras deficientes em glicosilação apropriadas podem ser obtidas ao se sujeitar uma população de

células hospedeiras a mutagênese para se obter uma população de células hospedeiras mutantes e, então, a população das células, tal como descrito acima, é selecionada para as células que são defeituosas na glicosilação da proteína, em particular a glicosilação de uma AFP do tipo III. A mutagênese de células pode ser realizada ao se empregar técnicas padrão, tais como a mutagênese aleatória, ao se utilizar, por exemplo, produtos químicos que danificam o DNA, ou a irradiação de raios UV/raios X, ou a mutagênese dirigida a sítio, ao se empregar, por exemplo, primers (iniciadores) dirigidos a genes pmt conhecidos em uma espécie fúngica para visar uma seqüência homóloga em outras espécies.

A espécie na qual a expressão é realizada pode ser qualquer espécie fúngica apropriada, englobando leveduras tais como (mas sem ficar a elas limitadas) aquelas dos gêneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizosaccharomyces e outras ainda, e espécies filamentosas tais como (mas sem ficar a elas limitadas) aqueles dos gêneros Aspergillus, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium e outras ainda. De preferência, a espécie selecionada é uma levedura, com maior preferência, uma espécie de Saccharomyces, tal como S. cerevisiae. Verificou-se que a glicosilação anormal é uma característica da expressão de genes heterólogos em muitos desses gêneros.

No entanto, em uma realização alternativa, pode ser desejável utilizar uma linhagem hospedeira fúngica de uma espécie que não realize naturalmente uma O-glicosilação significativa. Desse modo, a expressão deficiente em glicosilação, no contexto da presente invenção, não fica limitada a células hospedeiras que foram manipuladas geneticamente para reduzir a glicosilação da proteína. No entanto, tipicamente, uma célula hospedeira deficiente em glicosilação é aquela que compreende mutações em um ou mais genes envolvidos na glicosilação da proteína.

Composições de AFP

O método da presente invenção torna possível a obtenção de preparados altamente ativos de AFPs do tipo III que contêm uma proporção elevada de AFP não-glicosilada.

Desse modo, a presente invenção apresenta uma composição que compreende pelo menos cerca de 50% em peso de AFP do tipo III nãoglicolisada calculado como uma porcentagem total da AFP do tipo III, que pode ser obtida pela expressão de uma seqüência de ácido nucléico que codifica a AFP do tipo III em uma célula hospedeira fúngica deficiente em glicosilação. De preferência, a composição compreende pelo menos cerca de 60%, 65%, 70% ou 80% em peso da AFP do tipo III não-glicosilada calculada como uma porcentagem total da AFP do tipo III.

Por conseguinte, a composição da presente invenção também compreende menos que cerca de 50% em peso de AFP do tipo III glicosilada, calculada como uma porcentagem do total da AFP do tipo III, de maior preferência, menos que cerca de 40%, 35%, 30% ou 20%. Expressa de maneira alternativa, uma composição da presente invenção compreende a AFP do tipo III não-glicosilada e a AFP do tipo III glicosilada em uma razão em peso de 1:1 a 100:1, de maior preferência, de 1,5:1 a 100:1, de maior preferência ainda, de 2:1, 3:1 ou 4:1 a 100:1. Uma vez que a AFP do tipo III é expressa em um hospedeiro fúngico e não em um hospedeiro procariótico, em geral, haverá pelo menos quantidades minúsculas da AFP do tipo III glicosilada que não deve estar presente na AFP do tipo III expressa em uma célula hospedeira procariótica.

Em uma realização preferida, a composição da presente invenção compreende de 50% a 99% em peso da AFP do tipo III sem O-glicosilação.

Além disso, é preferível que a composição seja pelo menos 30% pura com relação a AFP do tipo III (independentemente do tipo de glicosilação), com base no teor de proteína total, de maior preferência, pelo menos 40%, 50%

ou 60% pura. Onde a AFP deve ser utilizada para aplicações cosméticas ou farmacêuticas, é preferível, então, que a AFP seja pelo menos 90% pura com relação a AFP do tipo III (independentemente do tipo de glicosilação) com base no teor de proteína total, de maior preferência, pelo menos 95,98% ou 99% pura.

A presente invenção será descrita agora com referência aos exemplos a seguir, os quais são apenas ilustrativos e não-limitadores. Os exemplos referem-se às figuras.

Descrição das Figuras

A Figura 1a é uma representação esquemática do cassete de integração de rDNA utilizado nos exemplos. O cassete contém as seguintes seqüências:

1-126	NTS1 - espaçador não-transcrito de rDNA de S. cerevisiae
127-2186	DNA de cromossomo 9 de S. cerevisiae
114-348	orf1 parcial = proteína hipotética
485-916	subunidade P de RNAse
1165-1959	pouca similaridade a glicosidase, exosialidase, mucina
2103-2165	orf questionável
2165-2096	ativador transcricional de metabolismo de a.a. de enxofre
2397-2197	Proteína anticongelante HPLC-12 do tipo III
2457-2398	ISS - seqüência de sinal de SUC2 l(lnvertase) de S. cerevisiae
2775-2486	Pga17 - promotor GAL7 de S. cerevisiae (sintético)
4009-2801	LEU2d - LEU2d de S. cerevisiae
4100-4413	2u - fragmento de plasmídeo 2u de S. cerevisiae (não-funcional)
4420-5460	NTS2 - espaçador não-transcrito de rDNA de S. cerevisiae
55461-5581	5S - RNA 5S de rDNA de S. cerevisiae
5582-6238	NTS1 - espaçador não-transcrito de rDNA de S. cerevisiae

A Figura 1 b é uma representação esquemática do plasmídeo pUR3993.

A Figura 2 mostra um cromatograma de HPLC.

Exemplos

Exemplo 1

Determinação da Atividade de Inibição da Recristalização de Formas Glicosiladas e Não-Glicosiladas de AFP HPLC-12 do tipo III Produzidas por Saccharomyces cerevisiae

Frações enriquecidas de AFP do tipo III glicosiladas e nãoglicosiladas foram preparadas a partir de caldo de fermentação.

O caldo de fermentação contendo AFP HPLC-12 do tipo III (15 ml) foi pipetado em tubos cônicos separados e 10 ml de etanol esfriado foram adicionados e misturados por 5 segundos.

Onde o pH era mais baixo que 6,0, o pH foi corrigido com NaOH à 1M. O tubo foi deixado, então, no gelo por pelo menos 20 minutos ou durante a noite no freezer antes de ser centrifugado a uma temperatura de 5°C por 5 minutos a 3.000 rpm. O sobrenadante foi então decantado em um tubo cônico separado. O precipitado foi lavado mediante a adição de etanol a 40% em um pH 6,0, misturado, colocado em gelo por pelo menos 20 minutos ou durante a noite no freezer e a seguir centrifugado tal como antes. Finalmente, o precipitado foi lavado com água Ultrapure em um frasco previamente pesado, congelado e seco por meio de liofilização.

Os sobrenadantes do material acima foram decantados em frascos de centrifugação previamente pesados e centrifugados outra vez a cerca de 4.000 rpm por um mínimo de 20 minutos. Os sobrenadantes foram transferidos para um frasco de fundo redondo separado para a evaporação rotativa. O etanol foi removido do sobrenadante por evaporação em que a temperatura do banho de água não excedeu 35°C. Depois da remoção do etanol, o sobrenadante aquoso foi transferido para um frasco previamente

pesado, congelado e a água foi removida por meio de secagem por liofilização.

Os teores de AFP do tipo III não-glicosilada e glicosilada dos preparados liofilizados resultantes são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

Perfis de AFP do tipo III do Precipitado e Sobrenadante de Etanol Liofilizado

Material	AFP do tipo III não-glicosilada como porcentagem total da proteína	AFP do tipo III glicosilada como porcentagem total da proteína
Sobrenadante de etanol liofilizado	0,4	41
Precipitado de etanol liofilizado	39,5	19

Embora o precipitado de etanol ainda contenha algum material não-glicosilado, o sobrenadante é altamente enriquecido no material glicosilado (41% do total da proteína) em comparação com o componente não-glicosilado (0,4% do total da proteína).

Ensaio de Inibição da Recristalização (RI)

A atividade de inibição da recristalização da HPLC-12 glicosilada foi utilizada para determinar a atividade da AFP do tipo III glicosilada e nãoglicosilada. Uma amostra de 0,0004% de proteína em uma solução de sacarose a 30% foi preparada e medida (3 repetições) no ensaio de RI. Duas amostras de controle também foram medidas: solução de 30% de sacarose (ou seja, não contendo nenhuma AFP) e 0,0004% de HPLC-12 não-glicosilada. Os resultados são apresentados como a mudança no tamanho médio do cristal de gelo depois de ter sido submetido à recristalização a -6°C por 1 hora (Tabela 2).

Tabela 2

Resultados da inibição de RI

Solução de teste	Crescimento (mícrons)
Solução de sacarose de controle	13,0 ±0,5
AFP HPLC-12 do tipo III não-glicosilada	0,7 ±0,5
AFP HPLC-12 do tipo III glicosilada	13,4 ±0,5

Os resultados acima mostram que a AFP HPLC-12 do tipo III nãoglicosilada é ativa porque reduz significativamente a proporção de crescimento em comparação com a solução de sacarose de controle. No entanto, a HPLC glicosilada mostra o mesmo crescimento que a solução de sacarose.

Portanto, a AFP HPLC-12 do tipo III glicosilada não tem nenhum efeito na recristalização, ou seja, é inativa.

Exemplo 2

Preparação de Mutantes Deficientes em Proteína Manosil Transferase (PMT)

Os mutantes deficientes em pmt foram construídos em VWK18ga11 de Saccharomyces cerevisiae (MATa, Ieu2, gall:URA3, ura3) ao se utilizar o sistema do rompimento de gene cre/lox descrito por Guldener et al. (Nucleic Acid Res, 24(13):2519-24, 1996). Os fragmentos de DNA com homologia de flanco curto foram gerados por meio de PCR ao se utilizar um cassete de loxP-Kan-loxP. A integração correta do cassete foi verificada por meio de PCR de diagnóstico e o gene Kan foi removido subseqüentemente pela expressão da recombinase cre. A remoção correta do cassete resultando em um gene deletado com um sítio loxP remanescente foi verificada por meio de PCR de diagnóstico.

As seguintes deleções foram construídas:

pmt1 (201,2350): : loxP pmt2 (50, 2229): : loxP

pmt4 (09, 2289):: ΙοχΡ

Exemplo 3

Construção de Linhagens de Saccharomyces Mutantes Transformadas com um Gene que Codifica a AFP HPLC-12 do tipo III

Para construir uma linhagem com capacidade de expressão controlada e eficiente de AFP, mutantes pmt da linhagem hospedeira VWK18gall de S. cerevisiae foram transformados com múltiplas cópias de um cassete de expressão ISP derivado do plasmídeo pUR3993, destinado a integrar no locus do rDNA, tal como descritos por Lopes et al. {Gene, 15 de 10 julho de 1989; 79(2):199-206). O cassete de integração de rDNA foi excisado do plasmídeo completo através de digestão com Hpal e o fragmento de cerca de 6.283 bp foi introduzido na linhagem hospedeira através de transformação ao se empregar o método de acetato de lítio (Gietz R.D. e Woods R.A., Methods Enzymol, 2002; 350:87-96).

Os detalhes do cassete de integração de rDNA e do plasmídeo pUR3993 são mostrados nas Figuras 1(a) e 1 (b), respectivamente. Os transformantes foram selecionados quanto à sua capacidade de crescer em um meio mínimo sem leucina e selecionados quanto à produção de AFP durante o crescimento no meio contendo glicose como fonte de carbono e galactose como indutor.

Exemplo 4

Determinação do Teor de AFP HPLC-12 do tipo III em Amostras de Fermentação

Os componentes da amostra são separados através de HPLC de fase reversa ao se utilizar uma coluna C18 e o teor de AFP HPLC-12 do tipo III 25 foi determinado pela detecção em UV a 214 nm por meio de referência a um padrão purificado.

Aparelho

AKTA ExplorerXT 10

Balança analítica

Várias vidrarias

Várias pipetas (mínimo classe b)

Reagentes

Água ultrapura Sistema de água Millipore

Acetonitrila grau HPLC, Far UV

Ácido trifluoroacético (TFA) grau HPLC

Isopropanol grau HPLC

Preparação de Eluentes

Eluente A: 0,05% de TFA em água ultrapura

Um volume de 1 ml de TFA foi diluído em 2 litros com água ultrapura e misturado.

Preparação do eluente B: 0,05% de TPA em acetonitrila

Um volume de 0,5 ml de TFA foi diluído em 1 litro com acetonitrila.

Para preparar as amostras, um volume ou peso do material de teste foi pipetado/pesado com precisão, em triplicata, em frascos volumétricos de 50 ml separados e avolumados com o eluente A. As amostras foram filtradas antes da análise ao se empregar as condições AKTA abaixo especificadas. A AFP do tipo III não-glicosilada purificada foi utilizada como 20 padrão da quantificação. Um cromatógrafo de uma amostra de fermentação típica é mostrado na Figura 2.

As condições da HPLC utilizadas para a análise da AFP do tipo III foram tal como segue:

Tipo de injeção		Carga parcial
Circuito de injeção		100 μΙ
Volume de injeção		50 μΙ
Lavagem da agulha		20% IPA
Manipulação dos dados		Computador Compaq deskpro

Pis.

Windows NT

Software UNICORN V3.21

Software UNICORN/A-900

Coluna

Linha da fase móvel

Proteína/peptídeo Vydac C18 218TP54

A1,0,05% de TFA em água ultrapura

B1,0,05% de TFA em acetonitrila

Gradiente

Vazão

TO-> T5:100% de A11

T5 -> T35:100% A11 -> 42% de A11, 58% de B1

T36 -> T40: 42% de A11, 58% de B -> 100% de B1

T40 -> T41.5: 100% de B1 100% de A11

T41.5-»T44: 100% deA11

1,0 ml/min

O sistema de cromatografia AKTA Explorer 10XT foi equipado com o auto-amostrador A900 e um detector UV de comprimento de onda triplo.

A quantificação foi obtida ao se utilizar o sinal de 214 nm. Outros comprimentos de onda, tais como 254 e 280 nm, foram utilizados apenas para fins de identificação.

Exemplo 5

Efeito de Eliminação de PMT na Produção de AFP HPLC-12 do tipo III em

Fermentadores de Escala de Laboratório

As fermentações foram realizadas com cada mutante pmt para determinar o efeito da deleção na produção de AFP em comparação com a linhagem original sem nenhuma deficiência de pmt. As fermentações foram realizadas tal como detalhado abaixo.

Preparação do Inóculo

Um frasco de agitação contendo 50 ml de um meio que consiste em 6,7 g/l de YNB (caldo de nutriente de levedura) com/sem aminoácidos (Difco) e 5 g/l de glicose laq (Avebe) foi inoculado com 1,4 ml de um macerado

de glicerol das matérias primas de origem da linhagem e incubado durante 48 horas a 30°C a 120 rpm. Em seguida, o inóculo foi transferido para um frasco de agitação contendo um meio de 500 ml que consistia em 10 g/l de extrato de levedura (Difco), 20 g/l de Bacto peptona (Difco) e 20 g/l de glicoselaq, seguido pela incubação por 24 horas, a 30°C a 120 rpm.

Fermentações Alimentadas em Misturas

O meio de mistura de 5,5 litros consistia em 22 g/kg de glicose laq, 10 g/kg de extrato de levedura KatG (Ohly), 2,1 g/kg de KH₂PO₄, 0,6 g/kg de MgSO₄-7H₂O, 0,4 g/kg de Struktol J673 (Schill & Seilacher), 10 g/kg de metais vestigiais Egli (uma solução de 100 x de 5,5 g/l de CaCI₂-2H₂O, 3,73 g/l de FeSO₄-7H₂O, 1,4 g/l de MnSO₄-1H₂O, 1.35 g/l de ZnSO₄-7H₂O, 0,4 g/l de CuSO₄-5H₂O, 0,45 g/l de COCI₂-6H₂O, 0,25 g/l de NaMoO₄-2H₂O, 0,4 g/l de H3BO3, 0,25 g/l de Kl, 30 g/l de NaEDTA), 1 g/kg de vitaminas Egli (uma solução de 1.000 x de 5 g/l de tiamina, 47 g/l de meso-inosit, 1,2 g/l de piridoxina, 23 g/l de ácido pantotênico, 0,05 g/l de biotina). O meio de alimentação de 4 litros continha 440 g/kg de glicose laq, 3 g/l de galactose (Duchefa), 25 g/kg de extrato de levedura, 12 g/kg de KH₂PO₄, 2,5 g/kg de MgSO₄-7H₂O, 0,8 g/kg de Struktol J673, 20 g/kg de metais vestigiais Egli, 2 g/kg de vitaminas Egli.

As fermentações alimentadas em misturas foram executadas em biorreatores padrão com um volume de trabalho de 10 litros. O oxigênio dissolvido (DO₂) foi medido com um eletrodo Ingold DO₂ (Mettler-Toledo) e controlado pelo ajuste automático da velocidade da hélice Rushton de seis pás até um máximo de 1.000 rpm. O pH foi medido com um eletrodo de gel Ingold Impro 3100 (Mettler-Toledo) e controlado ao se utilizar ácido fosfórico 3 M (Baker) e 12,5 % em volume/volume de amônia (Merck). A temperatura foi medida por um eletrodo PT100 e controlada através de uma camisa de arrefecimento e pontas de resfriamento e aquecimento.

A fase de mistura foi iniciada com a transferência de 500 ml do inóculo crescido todo para o meio de mistura. A temperatura foi mantida em 30°C e a um fluxo de ar a 2 l/min. O DO₂ foi controlado acima de 30%, o pH a 5,0. Quando o sinal do etanol no gás de escape diminuiu abaixo de 300 ppm, a fase de alimentação foi iniciada. Na fase de alimentação, a temperatura foi diminuída para 21°C e o fluxo de ar foi ajustado em 6 l/min. A taxa de alimentação foi aplicada de acordo com um perfil exponencial requerido para manter uma taxa de crescimento de 0,06 l/h. A alimentação exponencial continuou até que o nível de DO₂ no fermentador diminuiu abaixo de 15% e depois disto a taxa de alimentação foi mantida linear.

Tabela 3

Rendimentos de AFP HPLC-12 do tipo III Glicosilada e Não-Glicosilada

Determinados por meio de HPLC de Fase Reversa

Organismo de teste	Total de AFP normalizado para a produtividade da linhagem original	AFP não-glicosilada como porcentagem total	Proporção de aumento na produção de AFP não-glicosilada
Linhagem original	1,0	23%	1
Mutante pmt1	0,79	67%	2,3
Mutante pmt2	0,61	71%	1,9
Mutante pmt4	0,93	23%	0,93

O rendimento de AFP total depois de 60 horas de fermentação e o efeito da deleção de pmt na produtividade de AFP não-glicosilada foram determinados ao se utilizar HPLC de fase reversa e são mostrados na Tabela 3.

Os dados na Tabela 3 mostram de que a deleção de pmt1 ou de pmt2 resulta em um aumento na porcentagem de AFP não-glicosilada produzida em comparação com a linhagem original. Embora o rendimento total de AFP seja diminuído ligeiramente para os mutantes pmt1 e pmt2, o rendimento não-glicosilado é aumentado devido à atividade diminuída de

Z, Vi a

glicosilação resultando em 2,3 a mais e 1,9 a mais o aumento total na AFP não-glicosilada para pmt1 e pmt2, respectivamente. Por outro lado, a eliminação de pmt4 não porcentagem do produto ligeiramente o rendimento tem, aparentemente, quase nenhum efeito na não-glicosilado produzido, mas parece diminuir total da AFP. Uma comparação dos perfis da proteína para a linhagem original e o mutante pmt1 em gel de SDS revelou que a linhagem não deficiente original contém AFP glicosilada e não-glicosilada, enquanto que o mutante pmt1 produz predominantemente AFP não-glicosilada (dados não mostrados). Resultados similares foram obtidos das experiências de seleção do frasco da agitação.

Isto fornece um método de seleção relativamente rápido para identificar as linhagens com capacidade reduzida de glicosilar a proteína AFP.

Exemplo 6

Análise dos Padrões de Glicosilação de AFP HPLC-12 do tipo III Secretada por uma Linhagem Mutante Transformada

A investigação dos padrões de glicoforma da AFP do tipo III do mutante pmt1 em comparação com a cepa não deficiente original foi executada através de HPLC-MS. O grau de glicosilação e a abundância relativa de AFP versus as suas principais glicoformas (AFP com 5 a 13 unidades de manose) são comparados ao se utilizar as respostas espectrométricas de massa de monitoramento de íons selecionado (SIM) de seus respectivos íons moleculares protonados mais abundantes. A detecção é executada pela espectrometria de massa com ionização de electrospray positiva. A separação foi obtida através da eluição de gradiente ao se utilizar uma coluna de HPLC de fase reversa tal como descrito abaixo.

Aparelhos e reagentes

Módulo 1050 HPLC (Hewlett Packard)

Espectrômetro de massa Quattro I (VG, agora Micromass)

Coluna PRP1 de 4,6 x 250 mm (Hamilton)

Água ultrapura - sistema de água Millipore-Q

Gradiente de acetonitrila de grau HPLC

Preparação de Fases Móveis para a HPLC

A: ácido acético a 1 % em água

B: ácido acético a 1% em acetonitrila aquoso a 80%

Preparação da amostra

As amostras foram diluídas em 50 L de água (1 g em 50 ml de água) e filtradas (filtro de 0,45 μιτι ou seringa menor) antes da análise.

Condições do Equipamento

Sistema de HPLC
Detector UV Volume de injeção Coluna Fases móveis Vazão Tempo total da análise	214 nm 20 μΙ (preenchimento de circuito parcial) Phenomenex Júpiter C18 poro de 300^a, i.d. de 150 x 2,1 mm Mantidas a 30°C
A: ácido acético a 1% em água B: ácido acético a 1 % em 80% 1 ml/min 74 minutos	de acetonitrila aquosa
Gradiente	Minutos	Porcentagem de B
	0	10%
	10	10%
	55	65%
	57	100%
	62	100%
	64	10%
	74	10%

Uma taxa de separação de 1/5 foi aplicada após a separação cromatográfica, para se obter 200 μΙ/min para o espectrômetro de massa.

O ESPECTRÕMETRO DE MASSA QlIATTRO I

Ajustes da página de sintonização (arquivo)	Capilar Cone Lentes UV Temperatura do bloco da fonte Temperatura de dessolvação Multiplicadora Fluxo do gás de dessolvação Fluxo do gás do nebulizador	3,2 V programado como parte do método 0,6 V 150°C 150°C 650 V 300 l/h 25 l/h

Método MS	Os dados são coletados entre 20 e 60 minutos
	Varredura: m/z 100 a 2.000 (tempo de varredura: 5 s, retardamento entre varreduras: 0,1 s)
	Função SIR 1 (acompanhamento de um fragmento de AFP III)
	M/z 284,4 à voltagem do cone de 70 V (marcador para os três últimos aminoácidos na extremidade do terminal C da AFP III) e m/z 163,01 (íon de oxônio, marcador para glicopeptídeos) (intervalo de 1 Da, tempo de residência de 0,08 s, retardo entre canais de 0,02 s)
	Função SIR 2 (íons para seis estados de carga de glicoformas da AFP) M/z 1.308, 1.335, 1.362, 1.389, 1.416, 1.443, 1.470 e 1.497 à voltagem do cone de 20 V (intervalo de 1 Da, tempo de residência de 0,08 s, retardo entre canais de 0,02 s).

A Tabela 4 mostra que o rendimento da AFP do tipo III não5 glicosilada é aumentado de 23% para 67% ao se utilizar a linhagem pmt1 e que, embora o nível de produto glicosilado seja reduzido, o padrão de glicosilação é similar àquele obtido da linhagem original não deficiente.

Tabela 4

	Porcentagem Total da AFP HPLC-12 do tipo III
	Progenitor	Mutante pmt1
Tipo de glicosilação
Não-glicosilada	25	67
+5 Manose	4,5	2,2
+6 Manose	10,5	4
+7 Manose	11	5,5
+8 Manose	13	5,8
+9 Manose	12,5	5
+10 Manose	9	3,2
+11 Manose	8	4
+12 Manose	6,5	3,3

Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são incorporadas ao presente a título de referência. Várias modificações e variações dos métodos e do sistema descritos da presente invenção serão 5 aparentes aos técnicos no assunto sem que se desvie do âmbito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação às realizações preferidas específicas, deve ficar compreendido que a presente invenção, tal como reivindicada, não deve ser limitada de maneira inadequada a tais realizações específicas. De fato, várias modificações dos modos 10 descritos para a execução da presente invenção que são aparentes aos técnicos em biologia molecular ou campos correlatos devem se enquadrar dentro do âmbito das reivindicações a seguir.

Claims

Reivindicações

1. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE PROTEÍNA ANTICONGELANTE HPLC-12 do tipo III, caracterizado pelo fato de que o método compreende a expressão em uma célula hospedeira fúngica que é deficiente em glicosilação de AFP do tipo III, em comparação com a linhagem original, de uma sequência de ácido nucleico que codifica a AFP, em que a célula fúngica é Saccharomyces cerevisiae, a qual é uma linhagem mutante deficiente em pmt1 e/ou uma linhagem mutante deficiente em pmt2.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Saccharomyces cerevisiae é de uma linhagem mutante deficiente em pmt1.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Saccharomyces cerevisiae é de uma linhagem mutante deficiente em pmt2.