PT1573017E

PT1573017E - Preparação de uma proteína anticongelante

Info

Publication number: PT1573017E
Application number: PT03758088T
Authority: PT
Inventors: John William Chapman; Teun Van De Laar; Nigel Malcolm Lindner; Christiaan Visser
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2002-12-20
Filing date: 2003-11-03
Publication date: 2008-10-16
Also published as: EP1573017B1; CN100383251C; AU2003274102A1; AU2003274102B2; MXPA05006527A; IL168654A; JP2006510368A; WO2004057007A1; BRPI0315943B1; NZ540743A; MY136665A; ZA200503977B; CA2510378C; ES2309343T3; ATE400662T1; EP1573017A1; CN1729295A; JP4546257B2; US20070155956A1; DE60322106D1

Description

ΡΕ1573017 1 DESCRIÇÃO "PREPARAÇÃO DE UMA PROTEÍNA ANTICONGELANTE"

Antecedentes da Invenção

As proteínas anticongelantes (AFP) são poli-péptidos produzidos por uma vasta gama de espécies, particularmente as indígenas aos climas frios, que apresentam a capacidade para inibir o congelamento da água e materiais aquosos a temperaturas abaixo de 0°C. De modo geral, pensa-se que estas proteínas funcionam por meio da interacção com e da inibição do crescimento de cristais de gelo, mas é agora evidente que existem diferentes classes de proteínas anticongelantes que podem apresentar mecanismos de acção diferentes e efeitos diferentes. Por exemplo, adicionalmente a causarem stress térmico no comportamento de congelamento/fusão dos sistemas gelo/ãgua, as AFP podem influenciar a forma e o tamanho dos cristais de gelo formado quando ocorre o congelamento, e inibir a recristali-zação do gelo. Mais recentemente, foi sugerido que estas proteínas fossem preferencialmente por outro lado conhecidas como proteínas estruturantes de gelo (ISP) (Clarke, C.J., Buckley, S.L., e Lindner, N., Cryoletters., 23 (2002) 89-92).

Estes atributos das AFP significam que elas podem 2 ΡΕ1573017 apresentar profundos efeitos nas propriedades tais como a facilidade de produção, a textura e a estabilidade durante o tempo de armazenamento de diversas preparações congeladas e, nos recentes anos, apresentaram muito interesse na sua possibilidade de aplicação comercial, especialmente na indústria alimentar. Por exemplo, o controlo das dimensões dos cristais de gelõ pode conduzir a texturas particularmente favoráveis nas confecções congeladas. Os melhoramentos nas propriedades de armazenamento resultam também da inclusão das AFP na formulação. Uma revisão da ocorrência das AFP e da sua potencial utilização na indústria alimentar foi apresentada por Griffith e Vanya Ewart em Biotechnology Advances, vol. 13, pag. 375-402 (1995).

Para ser adequada ao referido propósito uma AFP necessita de combinar os efeitos desejáveis nos materiais congelados nos quais é incorporada, e ser rapidamente preparado numa escala industrial. Este último requisito pode ser particularmente problemático uma vez que muitas das espécies nas quais as AFP têm sido identificadas não estão prontamente favoráveis ao crescimento ou processamento comercial. Verificou-se que algumas AFP são muito susceptíveis â desnaturação, o que coloca constrangimentos graves nos métodos de isolamento que podem lhes ser aplicados. Em virtude destas dificuldades, houve um interesse considerável na produção das AFP através da expressão de genes clonados que as codificam em hospedeiros de expressão mais conveniente, tais como micro-organismos ou plantas facilmente cultivadas e processadas. Para muitas 3 ΡΕ1573017 AFP, no entanto, isto provou ser problemático: elas são muitas vezes obtidas com pouco rendimento e às vezes com falta de actividade.

De entre as AFP maia potencialmente úteis que foram identificadas como AFP do tipo III a partir do peixe-carneiro americano, que foi designado por HPLC-12. Verificou-se que esta proteína prime pela sua capacidade em auxiliar no controlo da forma e tamanho dos cristais de gelo. Verificou-se que a proteína, por exemplo, suplantou as bem conhecidas AFP do tipo I em testes de recrista-lização. Uma propriedade adicionalmente vantajosa identificada para as HPLC-12 do tipo III foi que apesar de não ser produzida em quantidades substanciais na E. Coll, pode ser produzida com bom rendimento por expressão de um gene clonado codificando a sua sequência numa levedura, proporcionando assim uma fonte potencialmente muito mais conveniente e economicamente viável para a produção em escala industrial que o peixes no qual a proteína ocorre natu-ralmente. A glicosilação da proteína envolve um vasto número de enzimas e as deficiências numa ou mais destas pode alterar potencialmente o padrão da glicosilação. A perda de actividade da enzima responsável pela transferência do primeiro resíduo de açúcar para a proteína pode impedir potencialmente qualquer glicosilação. Do mesmo modo, a utilização da referida estirpe de levedura mutante 4 ΡΕ1573017 deficiente em proteína transferase de manosilo (pmt) foi sugerida como uma via para superar o problema da glicosi-laçao anormal das proteínas expressadas heterologamente (WO 94/04687). No entanto a situação é complicada pelo facto de que não existe apenas uma enzima com esta função mas sim diversas, com diferentes especificidades proteicas. Por exemplo, numa revisão na O-manosilação proteica, Strahl-Bolsinger et al (Biochimica et Biophysica acta 1426 (1999) 297-307) verificou-se que em dez estudos a proteínas O glicosiladas, seis são glicosiladas em levedura através das enzimas pmtl e pmt2, enquanto que os outros quatro apresentam uma diminuição ou falta de O-manosilação exclusivamente nas estirpes onde a actividade da enzima pmt4 foi abolida. Nenhuma das proteínas analisadas foi considerada hipo-glicosilada em outra classe de rautante, na qual a actividade da enzima pmt3 foi perdida, no entanto esta mutação resultou na redução da O-manosilação da quitinase nos antecedentes genéticos de uma mutação dupla pmtlpmt2. Não foram identificadas quaisquer correlação entre a especificidade de manoeilação e quaisquer características da sequência ou estrutural do substrato proteico, assim não é possível prever quais os enzima(s) transferase que são particularmente responsáveis pela iniciação da glicosilação de qualquer uma proteína em particular, quer seja uma proteína nativa da espécie glicosilante, ou uma proteína estranha produzida pela sua expressão heteróloga. 5 ΡΕ1573017

Sumário da Invenção

Os presentes inventores verificaram agora, no entanto, que a HPLC-12 do tipo III produzida na levedura tem uma actividade específica, como medido num ensaio de inibição da recristalização, que é menor que o da proteína isolada do sangue do peixe-carneiro americano. Eles foram capazes de apresentar que isto é uma consequência da 0-glicosilação da proteína na levedura, o que não ocorre quando a proteína nativa ê produzida pelo peixe. Surpreendentemente, somente as espécies não-glicosiladas são activas.

Isto foi inesperado uma vez que tal evidência experimental como está relacionada com as AFP não revela nenhum teste padrão claro e consistente no que diz respeito à glicosilação e à funcionalidade: de facto algumas AFP são naturalmente glicosiladas extensivamente. Por exemplo, DeVries et al (Science 172 (1971) 1152), relatou que a actividade de uma AFP encontrada em bacalhau do Norte e em espécies de peixe do antárctico perdem a sua actividade se os dissacarídeos pendentes são removidos. Noutros casos, a gi icosilação que ocorre na natureza mostrou não ser importante para a actividade das AFP. Por exemplo, Worrall et al (Science 282 (1998) 115-117), verificou que quando uma AFP naturalmente glicosilada a partir de cenouras foi produzida sem os seus glicanos de superfície, a sua actividade de inibição de recristalização não foi afectada. Uma falta de dependência semelhante na glicosilação, mesmo 6 ΡΕ1573017 que quando está naturalmente presente, para a actividade das AFP verifícou-se pelos actuais inventores no caso de uma AFP a partir do grão de centeio expressa heterolo-gicamente. Logo não houve indicação clara de uma ligação geral entre a glicosilação e actividade entre as AFP.

Adicionalmente, como consequência desta descoberta inesperada, os actuais inventores foram capazes de conceber um método para suprimir substancialmente esta glicosilação anormal da AFP do tipo III, e portanto proporcionaram um meio de produção de AFP do tipo III, tais como a proteína HPLC-12 do tipo III que combina a conveniência e a rentabilidade da levedura como organismo do hospedeiro, enquanto rentabiliza um produto com uma potência que se aproxima das da proteína nativa. Os actuais inventores verificaram que utilizando este método, tanto o rendimento da proteína recombinante como a actividade específica da proteína recombinante podem ser aumentados, i.e. mais proteína pode ser recuperada a partir de células hospedeiras, e dessas proteínas, uma grande proporção da proteína é activa. Do mesmo modo, num primeiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a produção de uma proteína anticongelante do tipo III (AFP) no qual o método compreende a expressão numa célula hospedeira fúngica que é deficiente na glicosilação da AFP do tipo III em comparação com a estirpe progenitora, uma sequência de ácido nucleico codifica a AFP, em que a célula hospedeira fúngica é uma levedura que é uma cadeira mutante deficiente em pmtl e/ou uma estirpe mutante deficiente em pmt2. 7 ΡΕ1573017

Numa forma de realização preferida, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

Num aspecto relacionado, a presente invenção também proporciona um método para o aumento da actividade anticongelante específica de uma proteína anticongelante (AFP) do tipo III, ou um seu equivalente funcional, quando a referida proteína é preparada por expressão numa espécie fúngica heteróloga de uma sequência de um gene/sequência de ácido nucleico que codifica a proteína, através da redução da extensão da glicosilação da proteína.

Preferencialmente, a actividade específica da AFP é medida através de um ensaio da inibição da recrista-lizaçao do gelo.

Numa forma de realização preferida, a redução na glicosilação da proteína é atingida por meio da selecção de uma cadeira das espécies de expressão que é deficiente na actividade de umas ou mais enzimas envolvidas na glicosilação proteica, preferencialmente uma ou mais enzimas transferase da proteína do manosilo.

Uma estirpe apropriada deficiente em glicosilação é tipicamente seleccionada de entre a gama das referidas estirpes através da análise da proteína AFP do tipo III que é produzida quando um gene que codifica a referida proteína é expresso nas referidas estirpes. Preferencialmente, as 8 ΡΕ1573017 análises da proteína AFP do tipo III são baseadas num ensaio da sua actividade ou funcionalidade AFP, mais preferencialmente a sua actividade inibidora da recris-talização do gelo.

Num segundo aspecto, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um recombinante da proteína anticongelante do tipo III (AFP) em que cerca de 50% atê 99% de AFP é não-glicosiladas. Preferencialmente, a AFP do tipo III é HPLC-12 do tipo III.

Numa forma de realização preferida, a composição é obtida, mais preferencialmente obtida, pelo método do primeiro aspecto da invenção.

Num terceiro aspecto, a presente invenção proporciona um método para a identificação de uma estirpe hospedeira fúngica capaz de expressar uma AFP do tipo III de modo a que menos que cerca de 5 0% da AFP expressa seja glicosilada, o referido método compreende: (i) proporcionar uma pluralidade de células hospedeiras fúngicas compreendendo uma sequência de ácido nucleico que direccione a expressão da AFP na célula de hospedeiro; (ii) a cultura de células hospedeiras sob condições que permitem a expressão da AFP; e (iii) determinação da extensão da glicosilação da AFP expressada. 9 PE1573Q17

Numa forma de realização preferida, a pluralidade das células hospedeiras têm sido sujeita a uma etapa de mutagénese.

Descrição Pormenorizada da Invenção

Esta invenção é baseada na descoberta de que quando a proteína anticongelante o HPLC-12 do tipo III é preparada por expressão numa estirpe de levedura normal de uma sequência de ácido nucleico que codifica a proteína, uma proporção substancial do produto proteico segregado foi glicosilado. Tal glicosilação não está presente na proteína nativa, e os ensaios de inibição da recristalização nas fracções glicosiladas e não-glicosiladas separadas apresentaram, surpreendentemente, que a glicosilação aboliu eficazmente a actividade AFP da proteína.

Em virtude desta descoberta surpreendente, os inventores foram conceber um método para o aumento da actividade específica da proteína anticongelante HPLC-12 do tipo III, ou um seu equivalente funcional, quando a referida proteína é preparada por expressão numa espécie fúngica heteróloga de uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência da proteína, por meio da redução da extensão da glicosilação da proteína. A menos que esteja definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o 10 ΡΕ1573017 mesmo significado que os normalmente compreendidos pelos comuns especialistas na matéria (e.g. na cultura celular, na genética molecular, na química de ácido nucleico, nas técnicas de hibridação e na bioquímica). As técnicas padrão são utilizadas para métodos moleculares, genéticos e bioquímicos (ver geralmente, Sambrook et al, Molecular Cloning: A laboratory manual, 3rd ed. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. e Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4**1 Ed, John Wiley & Sons, Inc. - e a versão completa intitulada curr-ent protocols in molecular biology, e métodos químicos.

Proteínas anticongelantes

Para efeitos desta invenção, uma proteína anticongelante é uma proteína que tem propriedades de inibição de recristalização do gelo significativas e é por isso uma proteína estruturante de gelo (ISP) . As propriedades de inibição de recristalização do gelo podem convenientemente ser medidas por meio de um ensaio de esmagamento modificado, como descrito na WO 00/53029, Uma actividade inibidora de recristalização de gelo significativa pode ser definida como onde 0,01% em peso de solução de AFP em 3 0% em peso de sacarose, arrefecida rapidamente (a pelo menos Δ 50°C por minuto) a -40°C, aquecida rapidamente (a pelo menos Á50°C por minuto) a -6°C e de seguida mantida a esta temperatura resulta num aumento em média do tamanho dos cristais de gelo ao longo de uma hora de menos d 5 μπι. A actividade específica é uma 11 ΡΕ1573017 medida, por unidade de concentração de AFP dissolvida, desta capacidade da proteína limitar a extensão do aumento no tamanho dos cristais de gelo em consequência da recristalização, num dado tempo.

As proteínas anticongelantes de acordo com a presente invenção são AFP do tipo III. Estas AFP têm até â data sido identificadas num número de peixes polares da família Zoarcidae tais como o Macrozoarces americannus (peixe-carneiro europeu, peixe-carneiro americano) e Anarhichas lúpus (peixe lobo) - Barrett, 2 001, Int. J. Biochem. Cel Biol. 33: 105-117. As AFP do tipo III apresentam tipicamente um peso molecular de desde cerca de 6,5 até cerca de 14 kDa, uma estrutura secundária de sanduíche beta e uma estrutura terciária globular.

Um número de genes codificantes das AFP tipo III foi clonado (Davies and Hew, 1990, FASEB J. 4:2460- 2468). Uma AFP do tipo III particularmente preferida é HPLC-12 do tipo III. A sequência de aminoácido da HPLC-12 de tipo III do peixe-carneiro americano é apresentado como SEQ ID N.°l. Os polipéptidos HPLC-12 de tipo III de acordo com a presente invenção incluem polipéptidos contendo a sequência de aminoácido apresentada como SEQ ID N°1 e seus equivalentes funcionais.

Por "equivalente funcional" pretende-se significar qualquer polipéptido cuja a sequência apresenta pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, 90% ou 12 ΡΕ1573017 95% da identidade da sequência com a sequência HPLC-12 do tipo III como apresentado na SEQ ID N.°l e que exibe activídade AFP, em particular actividade inibidora da recristalização (RI) do gelo. Prefere-se que os equivalentes funcionais apresentem pelo menos 50% da actividade de RI de um polipéptido contendo a sequência de aminoãcido HPLC-12 do tipo III como apresentado na SEQ ID N.°l, mais preferencialmente pelo menos 60%, 70% ou 80% da actividade RI de um polipéptido contendo a sequência de aminoácido HPLC-12 do tipo III como apresentado na SEQ ID N. “1. A actividade RI pode ser convenientemente medida por meio de um ensaio de esmagamento modificado, como descrito na WO 00/53029.

Os cálculos da identidade da sequência são tipicamente realizados com o auxílio de programas de comparação de sequência prontamente disponíveis. Estes programas informáticos comercialmente disponíveis podem calcular % de homologação, tipicamente % da identidade, entre duas ou mais sequências. A maioria dos métodos de comparação de sequência é concebida para produzir alinhamentos óptimos que têm em consideração possíveis inserções e remoções sem penalizar impropriamente o resultado total da homologação. Isto é atingido através da inserção de "espaços" no alinhamento da sequência para tentar maximizar a homologação local.

No entanto, estes métodos mais complexos desi- 13 ΡΕ1573017 gnados "penalidades de espaço" para cada espaço que ocorre no alinhamento de modo a que, para o mesmo número de amino-ãcidos idênticos, um alinhamento de sequência com tantos espaços quanto possível - reflectindo elevadas conexões entre as duas sequências comparadas - irã atingir um resultado mais elevado que o com muitos espaços. "Os custos de espaços afins 11 são tipicamente utilizados o que acarreta um custo relativamente elevado para a existência de um espaço e uma penalidade menor para cada resíduo subsequente no espaço. Este é o sistema, de contabilização de espaços mais vulgarmente utilizado. As penalidades de espaço elevadas irão como é lógico produzir alinhamentos optimi-zados com menos espaços. A maioria dos programas de alinhamento permite a modificação das penalidades de espaço. No entanto, é preferido a utilização dos valores iniciais quando se utiliza o referido software para comparações de sequência. Por exemplo quando se utiliza o pacote GCG Wisconsin Bestfit (ver seguidamente) a penalidade de espaço inicial para sequências de aminoãcido é -12 para um espaço e 4 para cada extensão. O cálculo da % máxima de homologação requer portanto primeiramente a produção de um alinhamento óptimo, tendo em consideração penalidades de espaço. Um programa informático apropriado para realizar o referido alinhamento é o pacote GCG Wisconsin Bestfit (Universidade de Wisconsin, EUA; Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Research 12:387) . Exemplos de outro software que pode executar comparações de sequência incluem, mas não estão 14 ΡΕ1573017 limitados a, o pacote BLAST {ver Ausubel et al, 1999 ibid-Capítulo 18), FASTA (Atschul et al, 1990, J. Mol. Biol. , 403-410) e as ferramentas de comparação apropriadas GENEWORKS, Tanto o BLAST como o FASTA estão disponíveis para pesquisa "online" e "offline" (ver Ausubel et al, 1999 ibid, páginas 7-58 a 7-60). No entanto ê preferível utilizar o programa GCG Bestfit.

Apesar da % de homologação final poder ser medida em termos de identidade, o processo de alinhamento por si só não é tipicamente baseado numa comparação de pares tudo ou nada. Em vez disso, é geralmente utilizada uma matriz de resultados de similaridade em escala que atribui resultados a cada comparação dos pares baseada na similaridade química ou na distância evolutiva. Um exemplo de tal matriz de utilização geral é a matriz BLOSUM62-a matriz inicial para a série BLAST dos programas. Os programas GCG Wisconsin geralmente utilizam os valores iniciais públicos ou uma tabela de comparação de símbolos normais se proporcionado (ver o manual do utilizador para maiores pormenores). É preferida a utilização dos valores iniciais públicos para o pacote GCG, ou no caso de outro software, a matriz inicial, tal como BLOSUM62.

Uma vez que o software produziu um alinhamento óptimo, é possível calcular a % de homologação, preferencialmente % da identidade da sequência. O software faz tipicamente isto como parte da comparação da sequência e gera um resultado numérico. 15 ΡΕ1573017

Numa forma de realização altamente preferida, o polipéptido AFP é ligado a uma sequência de sinal que direcciona a secreção da proteína AFP de tipo III da célula hospedeira. As sequências de sinal apropriadas incluem a sequência de sinal S. cerevisiae invertase e a pré-sequência do factor αacoplamento da S. cerevisiae. A AFP pode ser fundida a uma sequência heteróloga para formar uma proteína de fusão, para auxiliar na extracção e purificação. Os exemplos dos padrões proteicos de fusão incluem glutationa-S-transferase (GST), hexa-histidina, GAL4 (ADN ligante e/ou domínios de activação transcriptional) e β-galactosidase. Pode também ser conveniente incluir um local de segmentação proteolítico entre os padrões proteicos de fusão e a sequência proteica de interesse para permitir a remoção das sequências proteicas de fusão. Preferencialmente a proteína de fusão não impedirá a actividade RI da AFP. No entanto, para a produção das AFP para a utilização na preparação dos géneros alimentícios, é preferível evitar a utilização de padrões de fusão. Ácidos nucleicos codificantes de AFP e vectores de expressão O método da invenção compreende a expressão das AFP do tipo III num hospedeiro fúngico deficiente em glicosilação. Isto é atingido através da introdução num 16 ΡΕ1573017 hospedeiro fúngico de uma sequência de ácido nucleico, tipicamente um vector de expressão que codifica AFP do tipo III, em conjunto com sequências exigidas para direccionar a expressão da AFP do tipo III na célula do hospedeiro. Logo, as sequências de ácido nucleico codificantes de uma AFP do tipo III são geralmente incorporadas num vector de ácido nucleico replicável recombinante apropriado para a introdução na célula de hospedeiro fúngico. Uma sequência de ácido nucleico codificando uma AFP do tipo III pode, por exemplo, ser uma sequência cADN, uma sequência de ADN do genoraa, uma sequência de ADN híbrida, ou uma sequência de ADN sintética ou semi-sintética. É preferível utilizar uma cDNA do que uma ADN do genoma. A sequência de ácido nucleico codificante de AFP do tipo III é ligada operacionalmente a uma sequência de controlo que é capaz de proporcionar a expressão da sequência de codificação pela célula do hospedeiro, i.e. o vector é um vector de expressão. O termo "ligado operacionalmente" significa que os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionar na sua forma pretendida. Uma sequência de regulação "ligada operacionalmente" a uma sequência de codificação é ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação é atingida sob condições comparáveis com as sequências de controlo.

As sequências de controlo irão inclui sequências tais como promotores, e opcionalmente elementos poten-ciadores transcripcionais. Preferencialmente, o promotor é 17 ΡΕ1573017 um promotor forte tal como o promotor GAPDH de S. cerevisiae ou o promotor GAL7, Os promotores podem ser constitutivos, tais como o promotor de GAPDH ou induzíveis, tais como o promotor GAL7. O vector nucleico é transformado numa célula de hospedeiro fúngico apropriada utilizando técnicas correntes tais como choque por aquecimento ou electroporação, para proporcionar a expressão da AFP do tipo III. Este processo pode compreender o cultivo de uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão como descrito anteriormente sob condições de modo a proporcionar a expressão pelo vector da sequência de codificação que codifica a AFP do tipo III, e opcionalmente recuperando a proteína expressa.

Um método apropriado para a expressão do polipéptido HPLC-12 do tipo III na S. cerevisiae é descrito na WO 97/02343, no entanto a célula hospedeira será deficiente em glicosilação como descrito abaixo.

Onde a AFP do tipo III não está ligada a uma sequência de sinal, a proteína pode ser recuperada a partir das células hospedeiras por técnicas correntes tais como a lise das células e purificação da proteína recombinante do lisato celular. Onde uma sequência de sinal é utilizada, a proteína pode ser recuperada a partir do supernadante da cultura. 18 ΡΕ1573017 Células hospedeiras fúngicas com glicosilação reduzida

Uma redução na glicosilação da AFP é tipicamente atingida através da inibição ou abolição da actividade dos produtos do gene, tais como as enzimas, envolvidas nos percursos da glicosilação da célula hospedeira. Preferencialmente, a referida glicosilação é O-glicosilação, na qual se pretende a ligação das unidades dos hidratos de carbono pendentes aos resíduos de serina e/ou de treonina na superfície proteica.

Numa forma de realização preferida a redução na glicosilação é atingida por meio da selecção de uma estirpe do organismo de expressão que é deficiente na actividade de um ou vários enzimas envolvidos na glicosilação proteica. Preferencialmente o referido enzima é o envolvido na ligação de um resíduo de açúcar directamente na estirpe lateral do aminoácido do substrato proteico. Mais preferencialmente é um enzima envolvido na ligação de um resíduo do manosilo para o grupo hidróxilo de um resíduo de serina ou treonina de um substrato proteico (O-glicosilação) . Uma vez que existem tipicamente diversos dos referidos enzimas activos numa dada estirpe fúngica, é necessário seleccionar estirpes deficientes na actividade dos enzimas específicos que são eficazes na glicosilação especificamente de HPLC-12 do tipo III. A estirpe hospedeira é tipicamente deficiente na actividade de uma enzima de interesse devido a uma ou mais 19 ΡΕ1573017 mutações no gene correspondente. A mutação pode ser na sequência de codificação, tais como uma inserção, remoção ou substituição afectando a actividade, conformação e/ou estabilidade do polipéptido resultante. A mutação pode também ser nas sequências reguladoras de controlo, tais como o promotor e/ou 5' UTR, conduzindo a uma redução na expressão do produto do gene. No entanto, é também possível que a actividade de um enzima de interesse seja afectada pela mutação noutro produto de gene que interaja com o enzima de interesse.

Tipicamente, uma estirpe apropriada para expressão é seleccionada de entre as estirpes mutantes deficientes em glicosilação que já foram identificadas para as espécies nas quais a expressão vai ser realizada. No caso da expressão na S. cerevisiae, por exemplo, pelo menos quatro genes foram identificados que codificam proteínas envolvidas na transferência de um resíduo de manosilo para os resíduos proteicos de serina ou treonina, os referidos genes são designados pmtl, pmt2, pmt3 e pmt4. Os actuais inventores foram capazes de investigar mutantes nos quais a actividade de um ou mais desses genes se verificou ser interrompida. Eles foram portanto capazes de determinar que a interrupção quer do pmtl ou do pmt2 foi eficaz na redução da extensão da glicosilação da HPLC-12 do tipo III secretada. Verificou-se também que o rendimento da proteína secretada foi afectado pelas mutações e verificou-se que a interrupção do gene mais preferido para os objectivos desta invenção é a do pmtl, uma vez que este produz o rendimento 20 ΡΕ1573017 mais elevado de proteína HPLC-12 do tipo II, activa, não-glicosilada. Por contraste, a interrupção do gene pmt4 não apresentou um efeito apreciável na extensão da glicosilação ou rendimento.

Do mesmo modo, a invenção proporciona um método para preparação de HPLC-12 do tipo III, ou um seu equivalente funcional, com um aumento da actividade específica da AFP (em comparação com a obtida quando a proteína é produzida na estirpe progenitora) por meio da expressão de uma sequência nucleótida codificante da referida proteína numa estirpe hospedeira fúngica deficiente na actividade dos enzimas codificados por um ou mais dos genes pmtl e pmt2, ou seus homólogos. Preferencialmente, o gene interrompido ê pmtl.

Neste contexto, o termo "seu homólogo" significa um gene que codifica um produto do gene contendo a mesma função que os produtos do gene pmtl ou pmt2.

Numa forma de realização preferida, a célula de hospedeiro fúngica é uma célula de Sacaharomyces cerevisiae com um gene de pmtl interrompido e/ou um gene de pmt2 interrompido. A extensão da glicosilação de HPLC-12 do tipo III produzida por qualquer estirpe de expressão seleccionada pode ser prontamente calibrada por métodos que são sensíveis ao aumento do peso molecular da proteína modificada. 21 ΡΕ1573017

Por exemplo, a massa adicional das ligações de glicano é prontamente evidente na SDS-PAGE. A aplicação deste método pode adicionalmente ser auxiliada pela utilização de uma preparação de anticorpo, específica para HPLC-12, para realizar um método de "Western Blot" no qual as bandas devido à AFP (glicosiladas e não-glicosiladas) são detectadas especificamente, com o fundo de outras proteínas suprimidas. Isto permite a identificação de estirpes que são eficazes na supressão da glicosilação HPLC-12 a ser identificada, por exemplo, sem a necessidade de purificar a proteína HPLC-12 a partir do meio no qual é secretada, Os anticorpos monoclonais ou policlonais apropriados podem ser prontamente preparados por métodos convencionais. Alternativamente, o nível de HPLC-12 do tipo III glicosilada e não-glicosilada pode ser determinado utilizando HPLC de fase reversa. Adicionalmente, o sistema de HPLC acoplado à espectrometria de massa pode ser utilizado para investigar glicoformas específicas.

Os métodos tais como electroforese em gel SDS, "Western blot", análise por HPLC e HPLC acoplado com espectrometria de massa foram utilizados pelos actuais inventores para identificar as estirpes preferidas de S. cerevisiae para a produção de HPLC-12 do tipo III. Poderia prontamente ser estendida para investigar ainda as estirpes mutantes desta ou de outras espécies, de modo a procurar especialmente hospedeiros de expressão. Alternativamente, um ensaio baseado nas propriedades de inibição de recristalização de pelo menos uma preparação contendo HPLC- 22 ΡΕ1573017 12 do tipo III parcialmente purificada pode ser utilizado para detectar condições ou estirpes que produzam um bom rendimento da proteína activa.

Através da identificação da ausência de glico-silação como o critério chave na avaliação da utilidade do produto como uma proteína anticongelante, e assim proporcionando métodos convenientes para a sua analise, os inventores proporcionaram assim um método geral para identificar estirpes fúngicas apropriadas à produção de HPLC-12 do tipo III activo com bom rendimento.

Na 3. cerevisiae existe um número de outros genes que foram identificados, cujos produtos de expressão são enzimas envolvidos nos últimos estados de glicosilação e que, em alguns casos estão envolvidos na glicosilação tanto da ligação O como da ligação N (Strahl-Bolsinger et al (Biochimica e Biophysica Acta 1426 (1999) 297-307) ) . Os mutantes nos quais estes genes foram interrompidos podem também, por princípio ser investigados para calibrar a sua adequabilidade para a produção de HPLC-12 do tipo III ou um equivalente funcional. O método pode também ser prontamente estendido a outras espécies. Em alguns casos os mutantes deficientes em glicosilação jã foram descritos e noutros casos eles podem ser prontamente identificados. Por exemplo, a WO 94/04687 descreve a clonagem de um homologo de pmtl a partir de outra levedura, Kluyveromyces lactís. Isto foi prontamente 23 ΡΕ1573017 atingido por PCR, utilizando os primeiros projectos que utilizaram informação da sequência do gene dos Saccha-romyces. Os autores continuam a descrever como a sequen-ciação do gene Kluyveromyces lactis irá permitir um mutante de interrupção para ser construído para esta espécie. A mesma estratégia pode ser aplicada directamente a outros fungos. À luz das descobertas dos actuais inventores que os enzimas codificados pela pmtl e pela pmt2 são maia eficazes na glicosilação da HPLC-12 do tipo III nos Saccharomyces, é provável que proteínas homólogas a estas possam ser alvos apropriados para a interrupção noutras espécies. Quando candidatos apropriados a mutantes de glicosilação são assim adquiridos ou se necessário, construídos para outras espécies fúngicas, a mesma estratégia foi exemplificada pelos autores para a Saccharomyces deve ser aplicável para identificar a estirpe na qual o melhor rendimento de HPLC-12 do tipo III activa é obtido.

Noutra forma de realização, as células hospedeiras deficientes em glicosilação apropriadas podem ser obtidas sujeitando a população de células de hospedeiro a mutagéneses para obter uma população de células de hospedeiro do mutante e de seguida seleccionar a população das células como descrita anteriormente para células que são defeituosas na glicosilação proteica, em particular na glicosilação de AFP do tipo III. A mutagénese das células pode ser realizada utilizando técnicas comuns tais como a mutagénese aleatória, utilizando por exemplo químicos danificantes de ADN ou irradiação UV/raios-X, ou mutagé- 24 ΡΕ1573017 neses dirigidas localmente, utilizando por exemplo primeiramente direccionando aos genes pmt conhecidos numa espécie fúngica para atingir uma sequência homóloga noutra espécie. A espécie na qual a expressão ê realizada pode ser qualquer espécie fúngica apropriada, compreendendo leveduras tais como (mas não limitadas a) aquelas do género Saccharomyces, Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Schizosaccharomyces e outras semelhantes, e espécies de filamentos tais como (mas não limitadas a) aquelas do género Aspergilos, Trichoderma, Mucor, Neurospora, Fusarium e outras semelhantes. Preferencialmente a espécie seleccionada é uma levedura, mais preferencialmente a espécie dos Saccharomyces tais como S. cerevisiae. A glicosilação anormal apresentou ser uma característica da expressão de genes heterólogos em muitos desses géneros.

No entanto, numa forma de realização alternativa, pode ser desejável utilizar uma estirpe de hospedeiro fúngico de uma espécie que não realiza naturalmente uma glicosilação 0 significativa. Logo o termo "deficiente na glicosilação" no contexto da presente invenção não está limitado às células de hospedeiro que foram manipuladas geneticamente para reduzir a glicosilação proteica. Todavia, tipicamente, uma célula de hospedeiro deficiente em glicosilação é uma que compreende mutações em um ou mais genes envolvidos na glicosilação proteica. 25 ΡΕ1573017

Composições AFP O método da invenção torna possível a obtenção de preparações altamente activas de AFP do tipo III contendo uma elevada proporção de AFP não-glicosilada.

Logo a presente invenção proporciona uma composição compreendendo pelo menos cerca de 50% em peso de AFP do tipo III não-glicosiladas calculada como uma percentagem da AFP do tipo III total, obtida através da expressão de uma sequência de ácido nucleico codificante de AFP do tipo III numa célula hospedeira fúngica deficiente em glicosilação. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos cerca de 60%, 65%, 70% ou 80% em peso de AFP do tipo III não-glicosilada calculada como uma percentagem de aFP do tipo III total.

Do mesmo modo, a composição da invenção também compreende menos de cerca de 50% em peso de AFP do tipo III glicosilada, calculada como uma percentagem de AFP do tipo III total, mais preferencialmente menos que cerca de 40, 35, 30 ou 20%. Expressada alternativamente, uma composição da invenção compreende AFP do tipo III não-glicosilada e AFP do tipo III glicosiladas numa razão em peso de cerca de 1:1 até 100:1, mais preferencialmente cerca de 1,5:1 até 100:1, mais preferencialmente cerca de 2:1, 3:1 ou 4:1 até 100:1. Uma vez que a AFP do tipo III é expressa num hospedeiro fúngico, em vez de num hospedeiro procariótico, irã geralmente haver pelo menos quantidades vestigiais de 26 ΡΕ1573017 AFP do tipo III glicosiladas, que não está presente na AFP do tipo III expressa numa célula hospedeira procariótica.

Numa forma de realização preferida, a composição da invenção compreende desde 50 até 99% em peso de AFP do tipo III sem glicosilação de 0.

Adicionalmente, é preferido que a composição seja pelo menos 3 0% pura no que diz respeito a AFP do tipo III (não obstante o tipo de glicosilação) baseada no teor proteico total, mais preferencialmente a pelo menos 40, 50 ou 60% pura. Onde a AFP é utilizada em aplicações cosméticas ou farmacêuticas prefere-se assim que a AFP seja pelo menos 90% pura no que diz respeito a AFP do tipo III (não obstante o tipo de glicosilação) baseada no teor proteico total, mais preferencialmente a pelo menos 95, 98 ou 99% pura. A presente invenção irá ser agora descrita com referência aos seguintes exemplos que são somente ilustrativos e não-limitativos. Os exemplos referem-se às figuras:

Descrição das figuras A figura la é uma representação esquemática da cassete de integração rADN utilizada nos exemplos. A cassete contêm as seguintes sequências: 27 ΡΕ1573017

1-126 NTS1 - separador não transcrito de S. cerevisiae rADN 127-2186 Cromossoma IX do ADN da S. cerevisiae 114-348 orfl parcial = Proteína hipotética 485-916 Subunidade P da ARNase 1165-1959 fraca similaridade a glucosidase, exo sialidade, mucinas 2103-2165 orf questionável 2165-2096 metabolismo do a.a. activador transcripci-onal de enxofre 2397-2197 Proteína anticongelante HPLC-12 do tipo III 2457-2398 ISS - Sequência de signal I(Invertase) SUC2 de S. cerevisiae 2775-2486 Pgal7 - promotor GAL7 de S. cerevisiae (sintético) 4009-2801 LEU2d - S. cerevisiae LEU2d 4100-4413 2u - fragmento plamídeo 2u de S. cerevisiae (não funcional) 4420-5460 NTS2 separador não transcrito de S. cerevisiae rADN 55461-5581 5S - S. cerevisiae rADN 5S ARN 5582-6238 NTS1 - separador não transcrito de S. cerevisiae rADN A figura lb é uma representação esquemática de plasmídeo pUR.3993. A figura 2 apresenta um cromatograma de HPLC. 28 ΡΕ1573017

Exemplos

Exemplo 1. Determinação da. actividade de inibição da recristalização das formas glicosiladas e não-glicosiladas de HPLC-12 da AFP do tipo III produzida Saccharomyces Cerevisxae

Fracções enriquecidas de AFP do tipo III glicosilada e não-glicosilada foram preparadas a partir da fermentação do caldo. A fermentação do caldo contendo HPLC-12 de AFP do tipo III (15mL) foi pipetada para tubos cónicos em separado e adicionou-se 10 mL de etanol arrefecido e agitou-se durante 5 segundos.

Onde o pH foi menor que 6,0, corrigiu-se o pH com NaOH 1 Μ. O tubo foi de seguida mantido no gelo durante pelo menos 20 minutos ou durante a noite num congelador antes de ser centrifugado a uma temperatura de 5°C durante 5 minutos a 3000 rpm. O supernadante foi de seguida decantado para um tubo cónico em separado. 0 precipitado foi lavado através da adição de etanol a 40% a pH 6,0, agitado, colocado em gelo pelo menos 20 minutos ou durante a noite num congelador e de seguida centrifugado como anteriormente. Finalmente, o precipitado foi lavado com água ultra-pura num frasco pré-pesado, congelado e seco por liofilização. 29 ΡΕ1573017

Os supernadantes anteriores foram decantados em tubos de centrífuga pré-pesados e centrifugados de novo a aproximadamente 4000 rpm durante um mínimo de 20 minutos. Os supernadantes foram transferidos para um balão de fundo redondo separado para evaporação rotativa. O etanol foi removido do supernadante através de evaporação rotativa em que a temperatura do banho da água não excedeu os 35°C. Depois da remoção do etanol, o supernadante aquoso foi transferido para uma frasco pré-pesado, congelado e a água removida por liofilização.

Os teores de AFP d tipo III não-glicosilada e glicosilada das preparações liofilizadas resultantes é apresentado na tabela 1.

Tabela 1: Perfis de AFP do tipo III do precipitado e supernadante de etanol liofilizado

Material AFP não AFP glicosilada glicosilada como % como % de de proteína total proteína total Supernadante de 0,4 41 etanol liofilizado Precipitado de 39, 5 19 etanol liofilizado

Uma vez que o precipitado de etanol ainda contém algum material não-glicosilado, o supernadante é altamente 30 ΡΕ1573017 enriquecido em material glicosilado (41% da proteína total) comparado com o componente não-glicosilado (0,4% da proteína total).

Ensaio de Inibição de Recristalização (RI) A actividade de inibição de recristalização da HPLC-12 glicosilada foi utilizada para determinar a actividade da AFP do tipo III glicosilada e não-glicosilada. Uma amostra de 0,0004% de proteína em solução de sacarose a 30% foi preparada e medida (3 repetições) no ensaio de RI. Duas amostras de controlo foram também medidas: solução de sacarose a 30% (í.e. não contendo nenhuma AFP) e 0,0004% de HPLC-12 não-glicosilado. Os resultados são apresentados como a mudança no tamanho médio do cristal de gelo após ter-se submetido a recristalização a -6°C durante 1 hora (tabela 2).

Tabela 2: Resultados da inibição RI

Solução teste Crescimento (mrcrones) Solução de sacarose de 13 ± 0,5 controlo AFP HPLC-12 não glicosilada 0,7 ± 0,5 do tipo III AFP HPLC-12 glicosilada do 13,4 + 0,5 tipo III

Os resultados anteriores mostram que HPLC-12 da - 31 ΡΕ1573017 AFP do tipo III não-glicosilada é activa uma vez que reduz significativamente a quantidade de crescimento comparada com a solução de sacarose de controlo. No entanto, a HPLC-12 glicosilada apresenta o mesmo crescimento que a solução de sacarose. Consequentemente, a HPLC-12 da AFP do tipo III glicosilada não apresenta nenhum efeito na recristalização, i.e. é inactiva.

Exemplo 2: Preparação de mutantes deficientes em transferase da proteína manosilo (pmt)

Os mutantes deficientes em pmt foram construídos em Saccharomyces cerevisiae VWK18gall (MATa, leu2, gall·. URA3, ura3) utilizando o sistema de interrupção de gene cre/lox descrito por Guldener et al. {Nucleic Acids Res 24 (13): 2519-24,1996). Os fragmentos de ADN com. homologação de flanqueamento curto foram gerados por PCR utilizando uma cassete de loxP-Kan-loxP. A correcta integração da cassete foi verificada por PCR de diagnóstico e subsequentemente o gene de Kan foi removido por expressão da recombinase cre. A correcta remoção da cassete resulta numa eliminação do gene com um local loxP restante como verificado por PCR de diagnóstico.

As remoções seguintes foram construídas: pmtl(201,2350)::loxP pmt2(50,2229)::loxP pmt4(09,2289)::loxP 32 ΡΕ1573017

Exemplo 3 s Construção de estirpes de Saccharomyces mutantes transformadas com um gene codificante de HPLC-12 de AFP do tipo III.

Para construir uma estirpe capaz de expressar eficiente e controladamente as AFP, os mutantes pmt da estirpe hospedeira VWK18gall foram transformados com múltiplas cópias de uma cassete de expressão ISP derivada do plasmídeo pUR3993, concebido para integrar no local de rADN como descrito por Lopes et ai (gene 1989 Jul 15; 79 (2): 199-206). A cassete de integração de rADN foi removida a partir do plasmídeo completo por digestão com Hpal e aproximadamente 6283bp de fragmento introduzidos na estirpe do hospedeiro por transformação utilizando o método de acetato do litio (Gietz R.D. e Woods R.A. Methods Enzymol 2002; 350:87-96). O pormenor da cassete de integração de rADN e o plasmídeo pUR3993 é apresentado nas figuras 1 (a) e (b) respectivamente. Os transformantes foram seleccionados pela sua capacidade de crescimento num meio mínimo sem leucina e seleccionados para a produção de AFP durante o crescimento no meio contendo glicose como fonte de carbono e a galactose como indutor.

Exemplo 4: Determinação do teor de HPLC-12 de AFP do tipo III em amostras de fermentação

Os componentes da amostra foram separados por 33 ΡΕ1573017 HPLC de fase reversa utilizando uma coluna C18 e o teor de HPLC-12 de AFP do tipo II determinado por detecção UV a 214nm tendo como referência um padrão purificado.

Equipamentos: AKTA Explorer XT 10 Balança analítica Material de vidro diverso Diversas pipetas (mínimo classe b)

Reagentes:

Sistema de água Millipore grau HPLC, UV longínquo grau HPLC grau HPLC Água ultra-pura Acetonitrilo Ácido trifluoroacético (TFA)

Isopropanol

Preparação dos eluentes:

Eluente A: 0,05% de TFA em água utra-pura

Um volume de 1 mL de TFA foi diluído em dois litros com água utra-pura e agitado.

Preparação do eluente B: 0,05% de TFA em acetonitrilo

Um volume de 0,5 mL de TFA foi diluído num litro com acetonitrilo.

Para preparar as amostras pipetou-se/pesou-se com exactidao um volume ou massa de material de teste, em triplicado, para balões volumétricos de 50 mL em separado e completou-se o volume com o eluente A. As amostras foram filtradas 34 ΡΕ1573017 antes de serem analisadas utilizando as condições especificadas AKTA seguintes. Utilizou-se como padrão de quantificação uma AFP do tipo III não glicosilada purificada. Apresenta-se na figura 2 um croraatograma de uma amostra de fermentação típica.

As condições de HPLC utilizadas na analise da AFP do tipo III foram as seguintes:

Tipo de injecção Enchimento parcial "Loop" de injecção 10 0 μΒ Volume de injecção 50 μ]3 Lavagem de seringa 20% IPA Manuseamento dos : Computador Compaq deskpro dados Windows NT Software UNICORN V3.21 Software UNICORN/A-900 Coluna : Vydac Proteína/Pêptido C18 218TP54 Fase Móvel : All, 0,05% de TFA em água ultra-pura Bl, 0,05% de TFA em acetonitrilo Gradiente T0~> T5: 100% All T5"3> T35: 100% All“> 42% All, 58% Bl T36"> T40 : 42% All, 58% Bl -> 100% Bl T40-> T41,5 : 100% Bl~> 100% All T41, 5 -> T44 : 100% All Velocidade de fluxo 1,0 mL/min 35 ΡΕ1573017 O sistema cromatográfico AKTA Explorer 10XT foi equipado com um mostrador automático A900 e um detector ultravioleta de comprimento de onda triplo. A quantificação foi conseguida utilizando o sinal de 214 nm. Outros comprimentos de onda tais como 2 54 e 280 nm foram utilizados somente com a finalidade de identificação única.

Exemplo 5: Efeito da remoção de pmt na produção de HPLC-12 de AFP do tipo III em fermentadores de escala laboratorial.

As fermentações foram realizadas com cada mutante de pmt para determinar o efeito da remoção na produção de AFP comparado com a estirpe progenitora sem qualquer deficiência de pmt. As fermentações foram realizadas como descrito seguidamente.

Preparação do inoculo

Um frasco de agitação contendo 50 mL de meio constituído de 6,7 g/L YNB (caldo com nutriente de levedura) aminoácidos w/o (Difco) e 5g/L de glicose-laq (Avebe) foi inoculado com 1,4 mL de stock de glicerol da estirpe e incubada durante 48 horas a cerca de 30 °C a 12 0 RPM. Subsequentemente, o inoculo foi transferido para um frasco de agitação contendo 500 mL de meio constituído de 10 g/L de extracto de levedura (Difco), 20 g/L de Bacto Pepton (Difco) e 20 g/L de glicose-laq seguido pela incubação durante 24 horas, 30“C a 120 rpm. 36 ΡΕ1573017

Fermentações contínuas alimentadas

Um meio contínuo de 5,5 L constituído de 22 g/kg glicose-laq, 10 g/kg de extracto de levedura KatG (Ohly), 2,1 g/kg KH2P04, 0,6 g/kg MgS04.7H20, 0,4 g/kg de Struktol J673 (Schill & Seilacher), 10 g/kg metais vestigiais Egli (uma solução lOOx de 5,5 g/L CaCl3.2H20, de 3,73 g/L de FeS04.7H20, de 1,4 g/L MnS04.lH20, de 1,35 g/L ZnS04.7H20, de 0,4 g/L CuS04.5H20, de 0,45 g/L CoCl2.6H20, de 0,25 g/L NaMo04.2H20, de 0,4 g/L H3BO3, de 0,25 g/L Kl, de 30 g/L NaEDTA), 1 g/kg de vitaminas Egli (uma solução a lOOOx de 5 g/L tiamina, 47g/L meso-inosita, 1,2 g/L de piridoxina, de 23 g/L de ácido pantotémico, 0,05 g/L de biotina). O meio de alimentação de 4 L continha 440 g/kg de glicose-laq, 3g/L de galactose (Duchefa), 25 g/kg de extracto de levedura, 12 g/kg de KH2P04, 2,5 g/kg MgS04-7H20, 0,8 g/kg de Struktol J673, 20 g/kg de metais vestigiais Egli, 2 g/kg de vitaminas Egli.

As fermentações contínuas alimentado foram realizadas em bio-reactores normais com um volume de trabalho de 10 litros. Mediu-se o oxigénio dissolvido (D02) com um eléctrodo D02 Ingold (Mettler-Toledo) e controlado por um ajuste automático da velocidade de um impulsor laminado com 6 lâminas da Rushton a um máximo de 1000 RPM. O pH foi medido com um eléctrodo de gel Ingold Impro 3100 (Mettler-Toledo) e controlado utilizando ácido fosfórico 3M (Baker) e 12,5% v/v de amónia (Merck) . A temperatura foi medida por um eléctrodo PT100 e controlado através de um revestimento de arrefecimento e de colectores de arrefecimento e aquecimento. 37 ΡΕ1573017 A fase contínua foi iniciada através da transferência de 500 mL de inoculo de crescimento total para um meio contínuo. A temperatura foi mantida a 30°C e o fluxo do ar a 2 L/min. O D02 foi controlado acima de 3 0% e o pH a 5,0. Quando o sinal de etanol na saída de gás diminuiu abaixo de 300 ppm a fase da alimentação foi iniciada. Na fase de alimentação a temperatura foi diminuída a 21°C e o fluxo de ar foi ajustado a 6 L/min. A velocidade de alimentação foi aplicada de acordo com um perfil exponencial exigido para manter uma taxa de crescimento de 0,06 L/h. O exponencial de alimentação continuou até ao nível de D02 no fermentador diminuísse abaixo dos 15% daí em adiante a velocidade de alimentação foi mantida linear.

Tabela 3: Rendimentos da HPLC-12 da AFP do tipo III gliçosilada e não glicosilada determinados por HPLG de fase reversa

Organismo de Teste Productividade da AFP total normalizada para a estirpe progenitora AFP não glicosilada como % total Aumento da dobra na produção de AFP não glicosilada estirpe 1,0 23% 1 progeni t ora Mutante pmtl 0,79 67% 2,3 Mutante pmt2 0,61 71% 1,9 Mutante pmt4 0,93 23% 0,93 38 ΡΕ1573017 O rendimento da AFP total após 60 horas de fermentação e o efeito da remoção de pmt na produtividade da AFP não-glicosilada foi determinado utilizando HPLC de fase reversa como apresentado na tabela 3.

Os dados na tabela 3 mostram que a remoção quer de pmtl ou de pmt2 resulta num aumento da % de AFP não-glicosilada produzida comparada com a estirpe progenitora. Apesar do rendimento da AFP total ser ligeiramente inferior tanto para os mutantes pmtl e pmt2, o rendimento não-glicosilado aumentou devido â diminuição da actividade de glicosilaçao resultando em 2,3 vezes e 1,9 vezes da diminuição total na AFP não-glicosilada para pmtl e pmt2 respectivamente. Por contraste, a remoção de pmt4 aparentemente tem pouco ou nenhum efeito na % do produto não-glicosílado produzido mas parece diminuir ligeiramente o rendimento total da AFP. Uma comparação dos perfis proteicos para a estirpe progenitora e o mutante pmtl no gel SDS apresenta que a estirpe não deficiente original contém tanto AFP glicosilada e não-glicosilada enquanto que o mutante pmtl produz predominantemente AFP não-glicosilada (resultados não apresentados). Resultados semelhantes foram obtidos a partir das experiências de selecção do frasco de agitação.

Isto proporciona relativamente rápido para um método de selecção identificar estirpes com capacidade reduzida para glicosilar a proteína AFP. 39 ΡΕ1573017

Exemplo 6: Análise dos Padrões de Glicosilação de HPLC-12 de AFP do tipo III secretada por uma estirpe mutante transformada A investigação dos padrões de glicoformas de AFP do tipo III do mutante pmtl comparados com a estirpe original não deficiente foi realizada por HPLC-MS. O grau de glicosilação e a abundância relativa da AFP versus as suas glicoformas principais (AFP com 5-13 unidades de manose) são comparados utilizando as respostas espectro-métricas de massa da monitorização de ião seleccionado (SIM) dos seus respectivos iões moleculares protonados mais abundantes. A detecção é realizada por espectrometria de massa de ionização de electrospray positiva. A separação foi atingida por eluição de gradiente utilizando uma coluna de HPLC de fase reversa como descrita seguidamente.

Equipamentos e Reagentes: Módulo de HPLC 1050 {Hewlett Packard)

Espectrómetro de massa Quattro I (VG, agora Micromass) Coluna PRP 1 4,6 x 250 mm (Hamilton)

Água ultra-pura Sistema água Millipore-Q Acetonitrilo gradiente de grau HPLC

Preparação das fases móveis para HPLC A: 1% de ácido acético em água B: 1% de acido acético em acetonitrilo aquoso a 80% 40 ΡΕ1573017

Preparação da amostra

As amostras foram diluídas 1 para 50 em agua (1 g em 50 mL de água) e filtradas (0,45 μτη ou filtros de seringa mais pequenos) antes da análise.

Condições operatórias:

Sistema HPLC Detector UV 214 nm Volume de injecção 2 0 μΐ, (enchimento de "loop" parcial Coluna Phenomenex Júpiter x 2,1 id mm C18 300A pore, 150 Fases móveis Mantidas a 30 “C A: 1% de ácido acético em água B: 1% de ácido acético em acetonitrilo aquoso a 80% Velocidade de fluxo 1 mL/min Tempo total de análise 74 minutos Gradiente Minutos % B 0 10 10 10 55 65 57 100 62 100 64 10 74 10 41 ΡΕ1573017

Foi aplicada uma variação na velocidade de l/5 após a separação cromatogrãfica para proporcionar 2 00 pLi/min ao espectrómetro de massa. O Espectrómetro de Massa Quattrol

Parâmetros de ajuste de página Capilaridade Cone Lentes HV Temperatura de bloqueio da Fonte Temperatura de dessolvatação Muitipplicador Fluxo de gás de dessolvatação Fluxo de gás nebulizador 3,2 V Programada como parte do método 0, 6 V 150 "C 150 °C 650 V 300 L/h 25 L/h Método EM Resultados recolhidos entre 20 e 60 minutos Varrimento: m/z 100 a 2 000 (tempo de varrimento: 5 s, intervalo inter-varrimentos: 0,1 s) Função SIR 1 (localização de um fragmento de uma AFP III) 42 ΡΕ1573017 (continuação) m/z 284,4 a uma voltagem de cone de 70 V (marcador para os últimos 3 amino ácidos da extremidade do terminal-C da AFP III) e m/z 163,01 (ião oxónio, marcador para os glicopéptidos)(amplitude 1 Da, intervalo de tempo 0,08 s, intervalo inter-canal 0,02 s) Função SIR 2 (iões para 6 estados carregados de glicoformas AFP) m/z 1308, 1335, 1362, 1389, 1416, 1443, 1470 e 1497 a uma voltagem de cone de 2 0 V (amplitude 1 Da, intervalo de tempo 0,08 s, intervalo inter-canal 0,02 s) A tabela 4 mostra que o rendimento da AFP do tipo III não glicosilada aumenta de 23% para 67% utilizando a estirpe pmtl e que apesar do nível de produto glicosilado ser reduzido o padrão de glicosilação é semelhante ao obtido a partir da estirpe progenitora não deficiente. 43 ΡΕ1573017

Tabela 4 % da HPLC-12 da AFP do tipo III total Parente Mutante pmtl Tipo de glicosilação Não glicosilada 25 67 +5 manose 4,5 2,2 +6 manose 10,5 4 +7 manose 11 5,5 +8 manose 13 5,8 +9 manose 12,5 5 +10 manose 9 3,2 +11 manose 8 4 +12 manose 6,5 3,3

Diversas modificações e variações aos métodos descritos e ao sistema da invenção irão ser evidentes aos especialistas na matéria sem sair do âmbito da invenção. Apesar da invenção ter sido descrita em conjunto com formas de realização específicas preferidas, deve compreender-se que a invenção como reivindicada não deve ser incorrec-tamente limitada âs formas de realização específicas. De facto, diversas modificações dos modos de realização da invenção descritos que são evidentes aos especialistas em biologia molecular ou áreas afins pretendem estar dentro do âmbito das seguintes reivindicações. 44 ΡΕ1573017

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS QUE FAZEM PARTE DA DESCRIÇÃO

<210> 1 <211> 66 <212 > PRT <213 > Macrozoarces americanus <400> 1

Asn Gin Ala Ser Vai Vai Ala Asn Gin Leu Ile Pro Ile Asn Thr Ala •1 5 10 15

Leu Thr Leu Vai Met· Met Arg Ser Glu Vai Vai Thr Pro Vai Gly Ile 20 25 30

Pro Ala Glu Asp Ile Pro Arg Leu Vai Ser Met Gin Vai Asn Arg Ala 35 40 45

Vai Pro Leu Gly Thr Thr Leu Met Pro Asp Met Vai Lys Gly Tyr Pro 50 55 60

Pro Ala 65 (A proteína anticongelante do tipo ΙΓΙ HPLC-12 é identificada especificamente pelo número de acesso P19614 na base de dados de proteínas Swiss-Prot)

Lisboa, 6 de Outubro de 2008

Claims

ΡΕ1573017 í - REIVINDICAÇÕES 1. Método para preparação de uma proteína anticongelante do tipo III (AFP} cujo método compreende uma expressão numa célula hospedeira fúngica que é deficiente na glicosilação da AFP tipo III comparativamente a uma estirpe progenitora, uma sequência de acido nucleico codificante da AFP, em que a célula fúngica é uma levedura que é uma estirpe mutante deficiente em pmtl e pmt2.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a AFP do tipo III é do tipo HPLC-12 . Lisboa, 6 de Outubro de 2008