BRPI0412855B1

BRPI0412855B1 - formulações de vacina

Info

Publication number: BRPI0412855B1
Application number: BRPI0412855A
Authority: BR
Inventors: Alexis Guy Andre Parisot; Catherine Charreyre; Robert M Nordgren; Stephanie Marie-Catherine Desgouilles-Blechet
Original assignee: Merial Ltd
Priority date: 2003-07-24
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2016-01-05
Also published as: US7608279B2; ATE392905T1; US20080187555A1; AU2004259034A1; DE602004013331D1; JP2006528647A; EP1651265B1; KR101146545B1; US20050079185A1; MXPA06000942A; CN1852735B; CA2533581A1; WO2005009462A2; WO2005009462A3; BRPI0412855A; KR20060069429A; DE602004013331T2; UA84024C2; NZ545289A; BRPI0412855B8

Abstract

"formulações de vacina". a presente invenção refere-se a uma nova emulsão óleo-em-água (o/a) com estabilidade aumentada na presença de suspensões bacterianas ou virais, especialmente aquelas concentradas e não-purificadas ou fracamente purificadas. a emulsão da presente invenção pode agir como um veículo para a aplicação de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um imunógeno e, em particular, um imunógeno selecionado do grupo compreendendo um patógeno inativado, um patógeno atenuado, uma subunidade, um vetor de expressão recombinante e um plasmídeo ou suas combinações. em uma modalidade, a presente invenção provê uma emulsão injetável óleo-em-água (o/a) compreendendo: (1) uma solução aquosa contendo um imunógeno, o dito imunógeno selecionado do grupo compreendendo uma bactéria mycoplasma hyopneumoniae inativada, um vírus circovírus de porco inativado do tipo 2 (pcv-2) inativado ou suas combinações; (2) um óleo mineral; (3) um tensoativo lipofílico; e (4) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de hlb baixo que compreende diésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado (geralmente tendo um valor de hlb entre 11 e 13).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES DE VACINA".

O presente pedido de patente reivindica prioridade do Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/490.345 depositado em 24 de julho de 2003, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a emulsões óleo-em-água, seu uso como adjuvantes e composições farmacêuticas, imunológicas ou de vacina compreendendo as mesmas.

DESCRIÇÃO DA TÉCNICA RELACIONADA O uso de adjuvantes em vacinas é bem-conhecido. Um adjuvan-te é um composto que, quando combinado com um antígeno de vacina, aumenta a resposta imune ao antígeno de vacina conforme comparado com a resposta induzida pelo antígeno de vacina sozinho. Dentre as estratégias que promovem a imunogenicidade de antígeno estão aquelas que dão antí-genos de vacina em partícula, aquelas que polimerizam ou emulsificam antí-genos de vacina, métodos de encapsulação de antígenos de vacina, modos de aumento da respostas de citocina inata hospedeiro e métodos que direcionam antígenos de vacina a células apresentando antígeno (Nossa], 1999; In: Fundamentai Immunology. Paul (Ed.), Lippincott-Raven Publishers, Phi-ladelphia, Pa.; Vogei e Powell, 1995; In: Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach. Powell e Newman (Eds.), Plenum Press, N.Y., N.Y., p. 141). Devido ao fato do papel essencial que os adjuvantes desempenham no aperfeiçoamento da imunogenicidade de antígenos de vacina, o uso de adjuvantes na formulação de vacina tem sido virtualmente onipresente (Nossa], 1999, supra; Vogei e Powell, 1995, supra; vide também publicação PCT WO 97/18837, cujos ensinamentos são aqui incorporados a título de referência). Adjuvantes convencionais, bem-conhecidos na técnica, são diferentes em natureza. Eles podem, por exemplo, consistir em sais inorgânicos insolúveis em água, lipossomas, micelas ou emulsões, isto é, adjuvante de Freund. Outros adjuvantes podem ser encontrados em Vogei e Powell. 1995, mencionados supra. Embora não haja nenhum único mecanismo de reação de adjuvante, uma característica essencial é sua habilidade em aumentar signi-ficantemente a resposta imune a um antígeno de vacina conforme comparado com a resposta induzida por antígeno de vacina sozinho (Nossal. 1999, supra; Voael e Powell. 1995, supra). Com relação a isso, alguns adjuvantes são mais eficazes no aumento das respostas imune humorais; outros adjuvantes são mais eficazes no aumento de respostas imune mediadas por célula (Vogei e Powell. 1995, supra); e ainda um outro grupo de adjuvantes aumenta ambas respostas imune humoral e mediada por célula contra antí-genos de vacina (Vogei e Powell. 1995, supra).

Em geral, emulsões usadas em formulação de vacina compreendem uma mistura de óleo, solução aquosa e tensoativos. Algumas emulsões incorporam um tensoativo lipofílico tal como Span80® e um tensoativo hidrofílico tal como Tween 80®. Essas emulsões podem também conter compostos tal como lecitina ou saponina sabidas ter propriedades de tensoativo iônico.

No entanto, problemas de estabilidade podem ser observados com emulsões usadas como adjuvantes de vacina, em particular durante armazenamento e transporte. Isso é particularmente verdade quando essas composições contêm imunógenos concentrados, especialmente imunógenos concentrados não-purificados. Tipicamente, esse é o caso com adjuvantes usados em vacinas inativadas (mortas). Este problema é ainda mais signifi-cante com composições de vacina multivalente porque os imunógenos são mais concentrados no mesmo volume de díluente.

Um outro problema com uso de adjuvante está ligado a um risco de casos adversos tal como toxidez ou inflamação local no local da injeção. Por exemplo, uma resposta inflamatória local e/ou granuloma pode(m) resultar após injeção. A fim de limitar tal reação adversa, os tensoativos e outros componentes na emulsão podem ser reduzidos; no entanto, a redução pode então resultar em um aumento na estabilidade da composição de vacina. Há, no entanto, uma necessidade quanto a novos adjuvantes e composições de vacina contendo tais adjuvantes com segurança e estabilidade aumentadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma primeira modalidade a presente invenção provê uma emulsão óleo-em-água (O/A) com estabilidade aumentada na presença de suspensões bacterianas ou virais, especialmente aquelas concentradas e não-purificadas ou fracamente purificadas.

Uma outra modalidade da presente invenção provê uma emulsão O/A estável, segura e facilmente administrável, em particular injetável, que age como um veículo para aplicação de uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um ingrediente ativo que pode ser, mais particuíar-mente, um imunógeno.

Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção provê uma emulsão O/A estável, segura e injetável que age como um adjuvante para aumentar a resposta imune induzida por um imunógeno. Em particular, a presente invenção provê um novo adjuvante que, quando usado em uma composição de vacina contendo um imunógeno, aumenta a resposta imune celular da vacina, a resposta imune humoral ou, de preferência, ambas para o imunógeno.

Ainda uma outra modalidade da presente invenção provê uma composição ou vacina estável, segura e imunogêníca compreendendo uma emulsão O/A.

Uma modalidade adicional da presente invenção provê um método de fabricação de uma composição de vacina usando o adjuvante da presente invenção; a composição de vacina desse modo obtida; e métodos para seu uso.

Ainda uma outra modalidade da presente invenção provê um kit compreendendo um imunógeno ou outro produto farmacêutico em um primeiro frasco e um adjuvante feito de acordo com a presente invenção em um segundo frasco, com o adjuvante feito para ser misturado com o imunógeno ou outro produto de vacina antes do uso.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção provê uma emulsão óleo-em-água (O/A) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa contendo um imunógeno; (2) um óleo mineral; (3) um tensoativo lipofílico não-iônico; (4) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo que compreende diésteres de ácido graxo de sorbitano etoxilado (geralmente tendo um valor de HLB entre 11 e 13).

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção provê uma emulsão óleo-em-água (O/A) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa contendo um imunógeno; (2) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) maior do que 13 e menor do que 40, em particular HLB > 13,5 e de preferência HLB > 14; (3) um óleo mineral; (4) um tensoativo lipofílico não-iônico; (5) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo (valor de HLB de cerca de 9 a cerca de 13).

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção provê uma composição de vacina compreendendo uma nova emulsão contendo pelo menos um imunógeno adequado para elicitação de uma resposta imune em um vacinado. A invenção provê ainda tais composições, onde a emulsão age como um adjuvante para aumentar a resposta imune induzida pelo imunógeno, em particular, para aumentar a resposta celular, a resposta humoral ou de preferência ambas.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção provê um método de fabricação de uma composição de vacina onde um imunógeno, especialmente um imunógeno em forma liofilizada ou em uma solução aquosa, é misturado com o adjuvante de acordo com a presente invenção. O imunógeno pode ser selecionado do grupo consistindo em: patógenos inati-vados, patógenos atenuados, antígenos de subunidade, vetores de expressão recombinantes incluindo plasmídeos e similar. Os patógenos podem ser de origem bacteriana, viral, protozoário ou fungo ou o imunógeno pode constituir uma antítoxina.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção provê um método de indução de uma resposta imune em uma vacina contra um patógeno compreendendo administrar a composição de vacina da presente invenção ao vacinado.

Em uma outra modalidade preferida, a presente invenção provê kits compreendendo pelo menos dois frascos, em um primeiro frasco um imunógeno, especialmente um imunógeno na forma liofilizada ou em solução em um meio aquoso, e em um segundo frasco um adjuvante ou emulsão de acordo com a presente invenção. É notado que nesta descrição e particularmente nas reivindicações termos tal como "compreende", "compreendido", "compreendendo" e similar podem ter o significado atribuído a tais termos na lei de patente U.S., por exemplo, eles podem significar "inclui", "incluído", "incluindo" e similar; e que os termos tal como "consistindo essencialmente em" e "consiste essencialmente em" têm o significado atribuído a eles pela lei de patente U.S., por exemplo, eles permitem elementos não-explicitamente citados, mas excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção.

Essas e outras modalidades são descritas ou são óbvias da e compreendidas pela descrição detalhada que segue.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Uma descrição completa e habilitada da presente invenção, incluindo o seu melhor modo, para uma pessoa versada na técnica, é descrita mais particularmente no restante do relatório, incluindo referência às figuras acompanhantes, onde: A Figura 1 ilustra registros de lesão pulmonar de leitões provocados 28 dias após vacinação de acordo com o exemplo 3. O valor médio é mostrado por uma cruz, o quarto inferior e o quarto superior por uma caixa, a média estatística por uma linha horizontal na caixa, o valor mínimo para o máximo por uma linha vertical. A Figura 2 ilustra registros de lesão pulmonar de leitões provocados 20 semanas após vacinação de acordo com o exemplo 4.0 valor médio é mostrado por uma cruz, o quarto inferior e o quarto superior por uma caixa, a média estatística por uma linha horizontal na caixa, o valor mínimo para o máximo por uma linha vertical. A Figura 3 provê um gráfico mostrando a progressão de doença clínica conforme exemplificado por registro clínico seguindo provocação de acordo com o exemplo 6. A Figura 4 mostra os resultados de um teste de eficácia de campo onde leitões (n = 889 leitões) nascidos de porcas vacinadas uma vez antes de parir com uma composição de vacina de PCV-2 feita de acordo com a presente invenção mostraram uma redução significante na mortalidade (75% menor) devido a uma síndrome de enfraquecimento de multissistema pós-desmame (PMWS) conforme comparado com leitões de controle (n = 713) paridos por porcas não-vacinadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Outros objetos, características e aspectos da presente invenção são descritos na, ou são óbvios a partir da, descrição detalhada. Deve ser compreendido por uma pessoa versada na técnica que a presente discussão é uma descrição de modalidades exemplares apenas e não pretende limitar os aspectos mais amplos da presente invenção, cujos aspectos mais amplos são concretizados na construção exemplar. Na realidade, ficará aparente àqueles versados na técnica que várias modificações e variações podem ser feitas na presente invenção sem se afastar do escopo ou espírito da invenção. Por exemplo, características ilustradas ou descritas como parte de uma modalidade podem ser usadas em uma outra modalidade para dar ainda uma modalidade adicional. É pretendido que a presente invenção compreenda tais modificações e variações que se encaixarem no escopo das reivindicações apensas e seus equivalentes. Os conteúdos de todas as referências, patentes publicadas e patentes citadas em todo o presente pedido são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.

Para conveniência, certos termos empregados no Relatório, E-xemplos e Reivindicações Apensas são reunidos aqui.

Conforme aqui usado, o termo "animal" inclui todos os animais vertebrados incluindo seres humanos. Ele também inclui um animal individu- al em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo estágios embriônico e fetal. Em particular, o termo "animal vertebrado" inclui, mas não está limitado a, seres humanos, caninos (por exemplo, cachorros), felinos (por exemplo, gatos); equinos (por exemplo, cavalos), bovinos (por exemplo, gado), porcino (por exemplo, porcos) bem como aves. O termo "ave” conforme aqui u-sado refere-se a qualquer espécie ou subespécie de uma classe taxonômica ava, tal como, mas não limitada a, galinhas (reprodutoras, para assar, poedeiras), perus, patos, ganso, codorna, papagaios, tentilhões, falcões, corvos e ratitas, incluindo avestruz, emas e casuar.

Conforme aqui usado, o termo "porco" ou "leitão” significa um animal de origem porcina, enquanto "porca" refere-se a uma fêmea de idade e capacidade reprodutiva.

Conforme aqui usado, o termo "virulento" significa um isolado que retém sua habilidade em ser infeccioso em um hospedeiro animal.

Conforme aqui usado, o termo "vacina inativada" significa uma composição de vacina contendo um organismo infeccioso ou patógeno que não é mais capaz de replicação ou crescimento. O patógeno pode ser de origem bacteriana, viral, protozoário ou fungo. A inativação pode ser realizada através de uma variedade de métodos incluindo congelamento-desconge-lamento, tratamento químico (por exemplo, tratamento com timerosal ou formalina), sonificação, radiação, calor ou qualquer outro meio convencional suficiente para prevenir replicação ou crescimento do organismo enquanto mantendo sua imunogenicidade.

Conforme aqui usado, o termo "imunogenicidade" significa capaz de produzir uma resposta imune em um animal hospedeiro contra um antí-geno ou antígenos. Esta resposta imune forma a base da imunidade protetora elicitada por uma vacina contra um organismo infeccioso específico.

Conforme aqui usado, o termo "resposta imune" refere-se a uma resposta elicitada em um animal. Uma resposta imune pode se referir à imunidade celular (CMI); imunidade humoral ou pode envolver ambas. A presente invenção refere-se também a uma resposta limitada a uma parte do sistema imune. Por exemplo, uma composição de vacina da presente invenção pode especificamente induzir uma resposta gama interferon aumentada.

Conforme aqui usado, o termo "antígeno" ou "imunógeno" significa uma mudança que induz uma resposta imune específica em um animal hospedeiro. O antígeno pode compreender um organismo inteiro, morto, a-tenuado ou vivo; uma subunidade ou porção de um organismo; um vetor re-combinante contendo uma inserção com propriedades imunogênicas; um pedaço ou fragmento de DNA capaz de induzir uma resposta imune quando da apresentação a um animal hospedeiro; uma proteína, um polipeptídeo, um peptídeo, um epítopo, um hapteno ou qualquer combinação deles. Alternativamente, o imunógeno ou antígeno pode compreender uma toxina ou uma antitoxina.

Conforme aqui usado, o termo "multivalente'1 significa uma vacina contendo mais de um antígeno seja da mesma espécie (isto é, isolados diferentes de Mycoplasma hyopneumonia), de uma espécie diferente (isto é, isolados de ambas Pasteurella hemolytica e Pasteurella multodda), ou uma vacina contendo uma combinação de antígenos de gêneros diferentes (por exemplo, uma vacina compreendendo antígenos de Pasteurella multodda, Salmonella, Escheríchia coli, Haemophilus somnus e Clostrídium).

Conforme aqui usado, o termo "adjuvante" significa uma substância adicionada a uma vacina para aumentar a imunogenicidade da vacina. O mecanismo como um adjuvante opera não é completamente conhecido. Alguns adjuvantes são acreditados aumentar a resposta imune ao lentamente liberar o antígeno, enquanto outros adjuvantes são fortemente imu-nogênicos por si só e são acreditados funcionar sinergicamente. Adjuvantes de vacina conhecidos incluem, mas não estão limitados a, emulsões em óleo e água (por exemplo, adjuvante de Freund completo e adjuvante de Freund incompleto), Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, hidróxido de alumínio, glicano, sulfato de dextrano, óxido de ferro, alginato de sódio, adjuvante bacto, certos polímeros sintéticos tal como poliaminoácidos e co-polímeros de aminoácidos, saponinas, "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), "AVRIDINE" (N,N-díoctadecil-N’,N’-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina), óleo de parafina, muramil dipeptídeo e similar.

Conforme aqui usado, os termos "carreador farmaceuticamente aceitável" e "veículo farmaceuticamente aceitável" são intercomutáveis e referem-se a um veículo fluido para conter antígenos de vacina que podem ser injetados no hospedeiro sem efeitos adversos. Os carreadores farmaceu-ticamente aceitáveis adequados conhecidos na técnica incluem, mas não estão limitados a, água estéril, solução salina, glicose, dextrano ou soluções tamponadas. Carreadores podem incluir agentes auxiliares incluindo, mas não limitado a, diluentes, estabilizadores (isto é, açúcares e aminoácidos), conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, agentes de tam-ponamento de pH, aditivos de aumento da viscosidade, corantes e similar.

Conforme aqui usado, o termo "composição de vacina" inclui pelo menos um antígeno ou imunógeno em um veículo farmaceuticamente a-ceitável útil para indução de uma resposta imune em um hospedeiro. As composições de vacina podem ser administradas em dosagens e através de técnicas bem-conhecidas daqueles versados na técnica médica ou veterinária, levando em consideração fatores tal como a idade, sexo, peso, espécie e condição do animal recipiente e a via de administração. A via de administração pode ser percutânea, através de administração mucosal (por exemplo, oral, nasal, anal, vaginal) ou através de via parenteral (intradermal, intra-muscular, subcutânea, intravenosa ou intraperitoneal). As composições de vacina podem ser administradas sozinhas ou podem ser co-administradas ou seqüencialmente administradas com outros tratamentos ou terapias. Formas de administração podem incluir suspensões, xaropes ou elixires e preparações para administração parenteral, subcutânea, intradermal, intra-muscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável) tal como suspensões ou emulsões estéreis. As composições de vacina podem ser administradas como um spray ou misturadas em alimento e/ou água ou liberadas em mistura com um carreador, diluente ou excípiente adequado tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose ou similar. As composições podem conter substâncias auxiliares tai como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH, adjuvantes, aditivos de aumento de geleificação ou viscosidade, conservantes, agentes aromatizan- tes, corantes e similar, dependendo da via de administração e da preparação desejada, Os textos farmacêuticos padrão, tal como "Remington's Pharma-ceutical Sciences", 1990, podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida. A presente invenção provê um adjuvante ou emulsão óleo-em-água (O/A) compreendendo: (1) uma solução aquosa contendo um antígeno de vacina ou í-munógeno capaz de induzir uma resposta imune em um hospedeiro; (2) um tensoativo hidrofílico não-íônico tendo um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) maior do que 13 e menor do que 40 (HLB>13, em particular HLB >: 13,5 e de preferência HLB > 14; (3) um óleo mineral; (4} um tensoativo lipofílico não-iônico; e (5) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo (valor de HLB de cerca de 9 a cerca de 13).

As emulsões feitas de acordo com a presente invenção são baseadas em uma combinação de pelo menos 3 tensoativos escolhidos dentre os membros de três grupos diferentes de tensoativos, e é possível usar um ou mais tensoativos pertencentes a cada grupo.

Em uma modalidade preferida, a concentração de tensoativo hidrofílico não-iônico (5) na emulsão (no presente pedido isso significa a emulsão final compreendendo todos os ingredientes a menos que de outro modo indicado) é de a partir de 1% a 8%, em particular de a partir de 1,5% a 6%, de preferência de a partir de 2% a 5%, com mais preferência de a partir de 2,5% a 4%, expressa como porcentagem em peso por volume de emulsão (p/v).

Este grupo de tensoativos compreende tensoativos hidrofílicos não-iônicos tendo um valor de HLB baixo (valor de HLB entre 9 e 13). Este grupo inclui, mas não está limitado a, monoéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado (em particular 5 grupos etóxi) (por exemplo, monooleato de sorbitano etoxilado tal como Tween 81®, diésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado, triésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado (em particular 20 grupos etoxila) (por exemplo, trioleato de sorbitano etoxilado tal como Tween 85®), triestearato de sorbitano etoxilado tal como Tween 65®, álcoois graxos etoxilados (em particular 5-10 grupos etoxila) (por exemplo, Brij 76®. Brij 56®, Brij 96®), ácidos graxos etoxilados (em particular 5-10 grupos etoxila) (por exemplo, Simulsol 2599®, Myrj 45®}, óleo de rícino etoxilado (em particular, 25-35 grupos etoxila) (por exemplo, 650® Arlatone G®) e suas combinações.

Os diésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado e triésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado são preferidos, bem como combinações de ambas espécies. O ácido graxo é de preferência selecionado do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e suas combinações. O triéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado preferido compreende trioleato de sorbitano etoxilado tal como Tween 85®) ou triestearato de sorbitano etoxilado tal como Tween 65®).

Em uma modalidade preferida, a concentração de tensoativo hidrofííico não-iônico (2) é geralmente de a partir de 0,1% a 1,5%, em particular de a partir de 0,2% a 1,4%, de preferência de a partir de 0,3% a 1,3%, com mais preferência de a partir de 0,4% a 1,2%, expressa como uma porcentagem em peso em volume de emulsão (p/v).

Este segundo grupo de tensoativos compreende tensoativos hi-drofílicos nâo-íônicos tendo um valor de equilíbrio hidrofílico-lipofílico alto (HLB) (HLB > 13, em particular HLB 2 13,5 e de preferência HLB >14). Este grupo compreende monoésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado (em particular 20 grupos etoxila) (por exemplo, monolaurato de sorbitano etoxilado tal como Tween 20®, monopalmitato de sorbitano etoxilado tal como Tween 40®, monoestearato de sorbitano etoxilado (tal como Tween 60®, mo-nooleato de sorbitano etoxilado tal como Tween 80®, álcoois graxos etoxilados (em particular, 15-30 grupos etoxila) (por exemplo, Brij 78®, Brij 98®, Brij 721®), ácidos graxos etoxilados (em particular 15-30 grupos etoxila) (por e-xemplo, Myrj 49®, Myrj 51®, Myrj 52®, Myrj 53®, copolímeros em bloco não-iônicos (por exemplo, copolímero de polioxietileno/polioxípropíleno (POE-POP), tal como Lutrol F127®, Lutrol F68®) e suas combinações.

Para os copolímeros em bloco não-iônicos, as porcentagens po- dem ser diminuídas e podem ser em particular de a partir de 0,1 a 0,5%, mais particularmente de a partir de 0,2% a 0,4% (peso em volume de emulsão (p/v)).

Os tensoativos (2) preferidos compreendem monoésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado, tal como aqueles descritos acima.

Em uma modalidade preferida, a concentração de tensoativo lipofílico não-iôníco (4) é de a partir de 0,1% a 2,5%, em particular de a partir de 0,2% a 2%, de preferência de a partir de 0,2% a 1,5%, com mais preferência de a partir de 0,2% a 1,2%, expressa como porcentagem em peso em volume de emulsão (p/v).

Este grupo de tensoativos compreende ésteres de sorbitano de ácido graxo (por exemplo, monolaurato de sorbitano, tal como Span 20®’ monopalmitato de sorbitano, tal como Span 40®, monoestearato de sorbitano, tal como Span 60®, triestearato de sorbitano, tal como Span 65®, monoo-leato de sorbitano, tal como Span 80®, trioleato de sorbitano, tal como Span 85®, monoisoestearato de sorbitano, tal como Arlacel 987®, isoestearato de sorbitano, tal como Crill 6®), ésteres de ácido graxo de manida (por exemplo, Montanida 80®, monooleato de manida (tal como Arlacel A®), dioleato de manida, trioleato de manida, tetraoleato de manida), ésteres de manida de ácido graxo etoxilado (2, 3 ou 4 grupos etoxila) (por exemplo, Montanida 888®, Montanida 103®, monooleato de manida etoxilado, dioleato de manida etoxilado, trioleato de manida etoxilado, tetraoleato de manida etoxilado) e suas combinações. O ácido graxo é de preferência selecionado do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e suas combinações.

Os tensoativos (4) preferidos compreendem os ésteres de sorbitano de ácido graxo, em particular aqueles acima descritos, e suas combinações.

Os tensoativos da invenção podem ter ácidos graxos de origem animal ou vegetal. A mudança de uma origem para a outra (por exemplo, Tween 80® animal para Tween 80® vegetal) poderia ser feita simplesmente com apenas um ajuste mínimo na formulação da emulsão.

Uma emulsão de acordo com a invenção pode ter uma concentração geral de tensoativos, em peso por volume de emulsão, de a partir de 1,2% a 10%, em particular de a partir de 2% a 8%, de preferência de a partir de 3% a 7%, com mais preferência de a partir de 5% a 6%.

Em geral, a emulsão de acordo com a invenção pode ter uma temperatura de inversão de fase (PIT) que é > 33°C, em particular varia de 33°C a 65°C, mais particularmente de a partir de 36°C a 60°C, de preferência de a partir de 37°C a 55°C, e com mais preferência de a partir de 38°C a 50°C. A PIT é a temperatura na qual a emulsão água-em-óleo muda para uma emulsão óleo-em-água ou acaba a fase (quebra da emulsão e separação das 2 fases). O valor da PIT pode ser medido através de vários meios, tal como, por exemplo, através de aparência visual (por exemplo, vide exemplo 2) ou através de condutividade. A emulsão é posta em uma temperatura abaixo da PIT da emulsão, por exemplo, de cerca de 25°C em um banho de água. A temperatura é progressivamente aumentada. A mudança do aspecto visual da emulsão é observada em comparação com uma emulsão de controle, notavelmente a fluidez, a viscosidade, a separação em duas fases, a mudança do aspecto da superfície devido à migração da fase de óleo para a superfície. A temperatura, para a qual esta mudança de aspecto visual foi observada, é o valor da PIT da emulsão. Alternativamente, a PIT é determinada pela rápida passagem de um valor de condutividade de cerca de 5-8 milliSiemens/centímetro (mS/cm) (emulsão óleo-em-água) para um valor de cerca de 0 mS/cm (emulsão água-em-óleo) medido por uma sonda posta em uma emulsão, próximo à sua superfície. A temperatura, para a qual a transição foi observada, é o valor da PIT da emulsão. Uma pessoa versada na técnica será capaz de determinar combinações de tensoativos e óleo, incluindo suas respectivas concentrações, a fim de produzir e-mulsões de acordo com a invenção, e em particular emulsões tendo um valor de PIT dentro da faixa acima definida sem experimentação indevida.

Em uma modalidade particular da presente invenção, uma emulsão conforme aqui descrito não contém qualquer tensoativo ou qualquer composto sabido ter propriedades tensoativas iônícas, tal como lecitina ou saponina. Em geral, as emulsões de acordo com a presente invenção podem conter, em volume por volume de emulsão, de a partir de 3% a 55% de óleo, em particular de a partir de 5% a 50% em óleo, de preferência de a partir de 10% a 40% de óleo, e, com mais preferência, de a partir de 20% a 40% de óleo. Por definição, faixas de valores no presente relatório incluem sempre o limite da faixa, a menos que de outro modo indicado. O óleo usado pode ser um óleo mineral incluindo, mas não limitado a, óleo de parafina tal como óleo isoparafínico e/ou óleo naftênico, es-qualano, pristano, óleo de poliisobuteno, óleo de poliisobuteno hidrogenado, óleo de polideceno, óleo de poliisopreno, óleo de poliisopropeno e similar. Um óleo mineral vantajoso útil na presente invenção pode incluir um óleo compreendendo uma cadeia de carbono linear ou ramificada tendo um número de átomos de carbono maior do que 15, de preferência de a partir de 15 a 32, e livre de compostos aromáticos. Tais óleos podem, por exemplo, ser aqueles comercializados sob a marca registrada "MARCOL 52®'' ou "MARCOL 82®" (produzidos pela Esso, França) ou "DRAKEOL 6VR®" (produzido pela Penreco, USA). O óleo pode ser também uma mistura de óleos compreendendo pelo menos 2 óleos selecionados dentre os óleos descritos aqui e em qualquer proporção. A mistura de óleos pode também compreender pelo menos um óleo selecionado dentre os óleos descritos acima e pelo menos um óleo vegetal, e esse óleo vegetal representa de a partir de cerca de 0,1% a cerca de 33% da fase de óleo, de preferência de a partir de cerca de 10% a cerca de 25% v/v. Esses óleos vegetais são óleos insaturados ricos em ácido oléi-co que são biodegradáveis e de preferência líquidos na temperatura de armazenamento (cerca de +4°C) ou pelo menos tomam possível dar emulsões que sejam líquidas neste temperatura. Por exemplo, o óleo vegetal pode ser óleo de amendoim, óleo de noz, óleo de girassol, óleo de açafrão, óleo de soja, óleo de onagro.

Em uma modalidade preferida, os tensoativos hidrofílicos (2) e (5) incluem de preferência tensoativos tendo a mesma parte hidrofílica das moléculas. Por exemplo, é feito uso de ésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado para cada um dos tensoativos hidrofílicos (2) e (5). Por exemplo, se Tween 85® for escolhido como tensoativos hidrofílicos não-iônicos tendo um valor de HLB baixo, o tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo vai ter vantajosamente uma parte hidrofílica constituída com um sorbitano etoxilado, tal como Tween 80® Em geral, a presente invenção prevê uso de uma solução aquo-sa compreendendo um veículo, excipiente ou diluente veterinário adequado ou farmaceuticamente aceitável incluindo, mas não limitado a, água estéril, solução salina fisiológica, glicose, tampão e similar. O veículo, excipiente ou diluente pode também incluir polióis, glicídeos ou agentes de tamponamento de pH. O veículo, excipiente ou diluente pode, por exemplo, também compreender aminoácidos, peptídeos, antioxidantes, compostos bactericidas, bacteriostáticos. A solução aquosa é adicionada ao óleo e aos tensoativos em uma quantidade para se obter 100% do volume da emulsão de acordo com a invenção. O equilíbrio hidrofílico-lipofílico (HLB) de uma emulsão permite uma estimativa da força hidrofílica ou lipofílica de um tensoativo. O HLB de uma molécula anfifílica é geralmente calculado como segue: O HLB pode ter um valor variando de a partir de 0 (para a molécula mais lipofílica) a 20 (para a molécula mais hidrofílica). De acordo com a composição química do tensoativo (notavelmente, por exemplo, a adição de grupos etoxila ou de óxidos de alceno), esta estimativa pode mudar e o domínio do valor de HLB pode aumentar (por exemplo, o Lutrol F68® tem um HLB de 29). Com uma mistura de tensoativos, o HLB da mistura é a adição do HLB de cada tensoativo, equilibrado pela sua razão em peso: Em uma modalidade de uma emulsão feita de acordo com a presente invenção, o HLB final da emulsão é de a partir de cerca de 9 a cerca de 12, de preferência de a partir de cerca de 9,5 a cerca de 11,5 e com mais preferência de a partir de cerca de 10 a cerca de 11,5. A presente invenção compreende uma emulsão compreendendo um óleo de parafina (em particular em uma concentração de a partir de cerca de 10% a cerca de 40%, e de preferência de a partir de cerca de 20% a cerca de 40%, expressa como um volume por volume de emulsão (v/v)); um monoéster de ácido graxo de sorbitano (como tensoativo lipofílico não-iônico), um triéster de ácido graxo etoxilado de sorbitano (como tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo); e um monoéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado (um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB alto). Em particular, o monoéster de sorbitano de ácido graxo é um monooleato de sorbitano (em particular na concentração de a partir de 0,2% a 1,5%, de preferência de a partir de 0,2% a 1,2%, expresso como um peso por volume de emulsão (p/v)), o triéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado é um trioleato de sorbitano de ácido graxo (em particular na concentração de a partir de 2% a 5%, de preferência de a partir de 2,5% a 4% p/v)) e o monoéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado é um monooleato de sorbitano etoxilado (em particular na concentração de a partir de 0,3% a 1,3%, de preferência de a partir de 0,4% a 1,2% p/v). Por exemplo, a emulsão compreende o óleo de parafina em cerca de 29,3% em volume por volume de emulsão, o monooleato de sorbitano a 0,6% em peso por volume de emulsão, o trioleato de sorbitano etoxilado a 3,4% em peso por volume de emulsão e o monooleato de sorbitano etoxilado a 0,75% em peso por volume de emulsão.

Em uma segunda modalidade de acordo com a presente invenção, a emulsão compreende um óleo de parafina (em particular em uma concentração de a partir de 10% a 40%, de preferência de a partir de 20% a 40% v/v), um monoéster de sorbitano de ácido graxo (como tensoativo lipofílico não-iônico), um triéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado (como tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo) e um copolímero em bloco não-iônico (como tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB alto). Em particular, o monoéster de sorbitano de ácido graxo é um monooleato de sorbitano (em particular na concentração de a partir de 0,2% a 1,5%, de preferência de a partir de 0,2% a 1,2% p/v), o triéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado é um trioleato de sorbitano etoxilado (em particular na concentração de a partir de 2% a 5%, de preferência de a partir de 2,5% a 4% p/v) e o copolímero em bloco não-iônico é um polímero de polio-xietileno/polioxipropileno (POE-POP) (em particular na concentração de a partir de 0,1% a 0,5%, de preferência de a partir de 0,2% a 0,4% p/v). Por exemplo, a emulsão compreende o óleo de parafina em cerca de 29,3% v/v, o monooleato de sorbitano a 0,6% p/v, o trioleato de sorbitano etoxilado a 3,4% p/v e o monooleato de sorbitano etoxilado a 0,25% p/v.

Em uma modalidade particular, a invenção compreende uma emulsão óleo-em-água (O/A) injetável compreendendo: (1) uma solução aquosa contendo o ingrediente ativo tal como uma droga ou um imunógeno, de preferência um imunógeno; (2) um óleo mineral; (3) um tensoativo lipofílico não-iônico; e (4) um tensoativo hidrofílico não-iônico tendo um valor de HLB baixo que compreende um diéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado (que pode ter um valor de HLB entre 11 e 13).

Uma emulsão de acordo com a presente modalidade compreende diésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilados que podem conter até 20 grupos etóxi. Os ácidos graxos podem ser de origem animal ou de origem vegetal e podem ser selecionados do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e suas combinações. Em uma modalidade, o ácido graxo etoxilado é de preferência oleato. Os outros ingredientes, bem como as propriedades gerais da emulsão tal como PIT, podem ter as mesmas características que aquelas descritas acima.

De preferência, o tensoativo (4) compreende diésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado, tal como dioleato de sorbitano etoxilado, dies-tearato de sorbitano etoxilado ou diisoestearato de sorbitano etoxilado, di- palmitato de sorbitano etoxilado, dilaurato de sorbitano etoxilado e suas combinações.

Opcionalmente, outros compostos podem ser adicionados como coadjuvantes à emulsão, incluindo, mas não limitado a, alume; oligonucleotí-deos de CpG (ODN), em particular, ODN 2006, 2007, 2059 ou 2135 (Ponta-rollo. R.A. e outros. Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84:43-59; Wemette. C.M. e outros, Vet. Immunol. Immunopath., 2002, 84:223-236; Mutwiri, G. e outros, Vet. ImmunoUmmunopath., 2003, 91:89-103); poliA-polill ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell e Mark, J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6:03); brometo de dime-tildioctadecílamônio (DDA) ("Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach", editado por Michael F. Powell e Mark, J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, volume 6:157), N,N-dioctadecil-N’,N’-bis(2-hidroxietil) propa-nodiamina (tal como Avridine®) (Ibid, p. 148), carbômero, quitosano (vide Patente U.S. N° de Série 5.980.912 por exemplo). A presente invenção também provê um método de fabricação de uma composição de vacina ou composição imunológica compreendendo pelo menos um antígeno ou imunógeno e um adjuvante ou emulsão feita de acordo com a presente invenção. O imunógeno pode ser incorporado durante a formação da emulsão ou, em uma modalidade alternativa, o imunógeno pode ser adicionado à emulsão mais tarde como, por exemplo, um pouco antes do uso. A quantidade integral da solução aquosa usada pode estar presente na emulsão primeiro produzida. Ou ela pode ser apenas uma parte desta solução aquosa que é usada para formar a emulsão, e a quantidade restante da solução aquosa é adicionada após incorporação do imunógeno. O imunógeno ou antígeno pode estar em uma forma liofilizada ou presente em alguma outra forma sólida apropriada e então misturado com a emulsão ou, alternativamente, o antígeno pode estar em solução, em particular em uma solução aquosa, e esta solução misturada com a emulsão.

Tensoativos são, de preferência, adicionados ou ao óleo ou à solução aquosa de acordo com sua solubilidade. Por exemplo, os tensoati- vos lipofílicos não-iônicos são adicionados ao óleo de acordo com a invenção, enquanto os tensoativos hidrofílicos não-iônicos tendo um valor de HLB alto são adicionados à solução aquosa. A emulsificação pode ser preparada de acordo com métodos convencionais conhecidos de uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, em uma modalidade da presente invenção, a emulsão pode ser preparada em uma temperatura abaixo da PIT da emulsão, em particular em temperatura ambiente, por exemplo, por volta de 25°C. A fase aquosa e a fase oleosa são misturadas juntas através de agitação mecânica, por exemplo, com uma turbina equipada com um rotor-estator capaz de criar uma força de ci-salhamento alta. De preferência, a agitação começa em uma velocidade de rotação baixa e lentamente aumenta em relação à adição progressiva geralmente da solução aquosa no óleo. De preferência, a solução aquosa é progressivamente adicionada ao óleo. A razão de óleo/solução aquosa pode ser adaptada para se obter uma emulsão água-em-óleo {NO), por exemplo, em uma concentração de cerca de 40% a cerca de 55% de óleo (v/v). Quando a agitação é parada, a emulsão muda progressivamente para uma emulsão O/A (inversão de fase). Após a inversão e, se necessário, a emulsão é diluída através da adição de uma solução aquosa para se obter a concentração de óleo desejada na emulsão final. A emulsão pode ser armazenada em cerca de 5°C.

Em uma outra modalidade, a emulsão pode ser preparada em uma temperatura maior do que a PIT da emulsão. Em uma primeira etapa, a fase aquosa e a fase de óleo são misturadas juntas em uma temperatura maior do que a PIT da emulsão. De preferência, a solução aquosa é pro-gressivamente adicionada ao óleo. A razão de óleo/solução aquosa pode ser adaptada para se obter uma emulsão água-em-óleo {NO), por exemplo, em uma concentração de cerca de 40% a cerca de 55% de óleo (v/v). A emulsi-ficação pode ser feita através de uma agitação com uma força de cisalha-mento baixa ou sem nenhuma, por exemplo, com um misturador estático ou uma hélice marinha ou com uma turbina em uma velocidade de giro muito baixa. A emulsão obtida é uma emulsão água-em-óleo {NO). Em uma se- gunda etapa, a emulsão é esfriada progressivamente abaixo da PIT. Durante esta etapa, a emulsão muda para uma emulsão O/A (inversão de fase). A-pós a inversão, e, se necessário, a emulsão é diluída através da adição de uma solução aquosa para se obter a concentração desejada de óleo na e-mulsão final. A emulsão pode ser armazenada a cerca de 5°C. O tamanho das gotículas na emulsão pode ser de a partir de cerca de 100 mm a cerca de 500 mm. A emulsão pode ser usada, por e-xemplo, como um adjuvante para formular uma composição de vacina ou uma composição farmacêutica. A emulsão pode ser também usada como um solvente para dissolver um produto seco, especialmente um produto liofi-lizado contendo, por exemplo, microorganismos atenuados ou vetores re-combinantes vivos.

Em uma modalidade particular, uma pré-emulsão é produzida com apenas uma parte da solução aquosa. Esta pré-emulsão pode ser diluída com a adição de uma suspensão de um ingrediente ativo tal como uma droga ou um imunógeno, de preferência um imunógeno, para se obter a composição final. Altemativamente, a pré-emulsão pode ser diluída com uma solução aquosa e usada para dissolver um produto seco tal como um produto liofilizado. O imunógeno ou antígeno adequado para uso na presente invenção pode ser selecionado do grupo consistindo em patógenos inativados, patógenos atenuados, subunidades imonogênicas (por exemplo, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, epítopos, haptenos), ou vetores de expressão re-combinantes, incluindo plasmídeos tendo inserções imunogênicas. Em uma modalidade da presente invenção, o imunógeno é um microorganismo inati-vado ou morto. Em uma outra modalidade da invenção, a composição de vacina compreende um imunógeno selecionado do grupo de patógenos de ave incluindo, mas não limitado a, Salmonella typhimurium, Salmonella ente-ritidis, Vírus da Bronquite Infeccioso (IBV), vírus da Doença de Newcastle (NDV), vírus da síndrome da queda de postura (EDS) ou vírus da Doença da Bursa Infecciosa (IBDV), vírus influenza da ave e similar e suas combinações.

Altemativamente, a composição de vacina compreende um imu-nógeno selecionado de um patógeno de felino tal como, mas não limitado a, herpesvírus de felino (FHV), calcivírus de felino (FCV), vírus da leucemia de felino (FeLV), vírus da imunodeficiência de felino (FIV), vírus da raiva e similar, e suas combinações.

Em ainda uma outra modalidade, uma composição de vacina da presente invenção compreende um imunógeno selecionado de um patógeno canino incluindo, mas não limitado a, vírus da raiva, herpesvírus canino (CHV), parvovírus canino (CPV), coronavírus canino, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorfe-ri, Bordetella bronchiseptica e similar, e suas combinações.

Em ainda uma outra modalidade da invenção, a composição compreende um imunógeno selecionado de um patógeno de eqüino, tal como herpesvírus eqüino (tipo 1 ou tipo 4), vírus influenza de eqüino, tétano, vírus do nilo do oeste e similar ou suas combinações.

Em ainda uma outra modalidade da invenção, a composição compreende um imunógeno selecionado de um patógeno de bovino, tal como vírus da raiva, rotavírus bovino, vírus parainfluenza de bovino tipo 3 (bPIV-3), coronavírus bovino, vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da doença do pé e da boca (FMDV), vírus sincial respiratório bovino (BRSV), vírus da Rinotraqueíte Bovina Infecciosa (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica e similar e suas combinações.

Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, a composição compreende um imunógeno selecionado de um patógeno de porcino tal como, mas não limitado a, vírus influenza de suíno (SIV), circovírus de porcino do tipo 2 (PCV-2), vírus da síndrome respiratória reprodutiva de porcino (PRRS), vírus da pseudo-raiva (PRV), parvovírus de porcino (PPV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli e similar e suas combinações.

Uma modalidade preferida da invenção provê composições de vacina compreendendo pelo menos um imunógeno e uma emulsão em um veículo farmaceuticamente aceitável. Imunógenos compreendendo vírus, bactérias, fungos e similar podem ser produzidos através de métodos de cultura in vitro usando meio de cultura ou tipos de célula hospedeiro apropriados e métodos convencionais bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, PRRS pode ser cativado em um tipo de célula apropriado, tal como tipo de célula MA-104 (vide Patentes U.S. N°s de Série 5.587.164; 5.866.401; 5.840.563; 6.251.404 dentre outras). De uma maneira similar, PVC-2 pode ser cativado usando tipos de célula PK-15 (vide Patente U.S. N° de Série 6.391.314); SIV pode ser cativado em ovos (Patente U.S. N° de Série 6.048.537); e Mycoplasma hyopneumoniae pode ser cativada em um meio de cultura apropriado (U.S. Nos de Série 5.968.525; U.S. 5.338.543; Ross, R.F. e outros, Am. J. Vet. Res.t 1984,45:1899-1905). A fim de se obter uma composição imunológica, ou de vacina, inativada, o patógeno é de preferência inativado após colheita e, opcionalmente, submetido à clarificação por meio de tratamento químico usando, por exemplo, formalina ou formaldeído, beta-propiolactona, etilenoimina, etileno-imina binária (BEI), timerosal e similar e/ou um tratamento físico (por exemplo, um tratamento com calor ou sonificação). Métodos de inativação são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Por exemplo, o vírus PRRS pode ser inativado através de tratamento com beta-propiolactona (Piana-Duran e outros. Vet. Microbiol., 1997, 55:361-370) ou através de tratamento com BEi (Patente U.S. N° de Série 5.587.164); inativação do vírus PCV-2 pode ser realizada usando tratamento de etilenoimina ou através de tratamento com beta-propiolactona (Patente U.S. N° de Série 6.391.314); vírus influenza de suíno pode ser inativado usando um detergente do tipo Triton, ou com tratamento com formaldeído (Patente U.S. N° de Série 6.048.537); a bactéria Mycoplasma hyopneumoniae pode ser inativada através de tratamento com formaldeído (Ross, R.F, supra) através de tratamento com etilenoimina ou BEI (vide WO 91/18627) ou através de tratamento com timerosal (Patentes U.S. N°s de Série 5.968.525 e 5.338.543). O patógeno inativado pode ser concentrado através de técnicas de concentração convencionais, em particular através de ultrafiltragem, e/ou purificado através de meios de purificação convencionais, em particular u-sando técnicas de cromatografia incluindo, mas não limitado a, gel-filtragem, ultracentrifugação em um gradiente de sacarose, ou precipitações seletivas, em particular na presença de polietileno glicol (PEG).

Imunógenos úteis em composições de vacina de acordo com a presente invenção também incluem vetores de expressão. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, vetores de expressão recombinante in vivo tal como vetor de polinucleotídeo ou um plasmídeo (EP-A2-1001025; Chaudhuri P„ Res. Vet. Sei., 2001, 70:255-6), vetores de vírus tal como, mas não limitado a, vetores de adenovírus, vetores de poxvírus tal como "fowl-pox" (Patentes U.S. N°s de Série 5.174.993; 5.505.941; e 5.766.599) ou vetores de "canarypox" (Patente U.S. N° de Série 5.756,103) ou vetores bacte-rianos (Escheríchia coli ou Salmonella sp.). A presente invenção também compreende a formulação de composições imunológicas multivalentes ou composições de vacina em combinação, Por exemplo, antígenos úteis em uma bacterina bovina de combinação feita de acordo com a presente invenção da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Mycoplasma bovis, Pasteurella sp., particularmente P. multocida e P. haemolytica, Haemophilus sp., particularmente H. somnus, Clostridium sp., Salmonella, Corynebacteríum, Streptococcus, Sta-phylococcus, Moraxella, E. coli e similar. A presente invenção provê ainda métodos para indução de uma resposta imune em um hospedeiro, por exemplo, um animal, compreendendo administrar ao hospedeiro uma composição imunológica ou uma composição de vacina de acordo com a invenção. As respostas imune elicitadas desta maneira são notavelmente respostas de anticorpo e/ou imune celulares, e, em particular, uma resposta gama-interferon.

Em particular, a presente invenção provê métodos para imunizar contra, ou para prevenir ou reduzir os sintomas causados por, infecção de um animal com um organismo patogênico (por exemplo, infecção por um parasita vírus, bactéria, fungo ou protozoário).0 método da presente invenção é útil em animais vertebrados incluindo, mas não limitado a, seres hu- manos, animais caninos (por exemplo, cachorros), felinos (por exemplo, gatos); equinos (por exemplo, cavalos), bovinos (por exemplo, gado) e porcinos (por exemplo, porcos), bem como em aves incluindo, mas não limitado a, galinhas, perus, patos, um ganso, uma codorna, um faisão, papagaios, tentilhões, falcões, corvos ou ratitas (avestruz, ema, casuar e similar).

Em um aspecto particular da invenção, esses métodos consistem na vacinação de fêmeas grávidas antes do parto através da administração de uma composição de vacina feita de acordo com a invenção. Esses métodos incluem ainda a indução de anticorpos de proteção elicitados por um protocolo de vacinação e a transferência desses anticorpos de proteção de fêmeas grávidas vacinadas para seus filhos. A transferência de tais anticorpos maternais subseqüentemente protege os filhos de doença. A dosagem da composição de vacina feita de acordo com a presente invenção vai depender das espécies, raça, idade, tamanho, história de vacinação e estado de saúde do animal a ser vacinado. Outros fatores tal como concentração de antígeno, componentes adicionais da vacina e via de administração (isto é, administração subcutânea, intradermal, oral, intramus-cular ou intravenosa) vão também impactar a dosagem eficaz. A dose de vacina a ser administrada é facilmente determinada com base na concentração de antígeno da vacina, a via de administração e a idade e condição do animal a ser vacinado. Cada batelada de antígeno pode ser individualmente calibrada. Altemativamente, testes de imunogenicidade metódicos de dosa-gens diferentes, bem como estudos de LD50 e outros procedimentos de avaliação podem ser usados para determinar a dosagem eficaz para uma composição de vacina de acordo com a presente invenção sem experimentação indevida. A partir dos exemplos apresentados abaixo, ficará prontamente aparente qual dosagem aproximada e qual volume aproximado seriam apropriados para uso da composição de vacina descrita aqui. O fator crítico é que a dosagem proveja pelo menos um efeito protetor parcial contra infecção natural, conforme evidenciado pela redução na mortalidade e morbidez associadas com infecção natural. O volume apropriado é da mesma maneira facilmente verificado por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, em espécies de ave, o volume de uma dose pode ser de a partir de 0,1 ml a cerca de 0,5 ml e, vantajosamente, de a partir de cerca de 0,3 ml a cerca de 0,5 ml. Para espécies de felino, canino e eqüino, o volume de uma dose pode ser de a partir de cerca de 0,2 ml a cerca de 3,0 ml, vantajosamente de a partir de cerca de 0,3 ml a cerca de 2,0 ml, e mais vantajosamente de a partir de cerca de 0,5 ml a cerca de 1,0 ml. Para espécies de bovino e porcino, o volume da dose pode ser de a partir de cerca de 0,2 ml a cerca de 5,0 ml, vantajosamente de a partir de cerca de 0,3 ml a cerca de 3,0 ml, e mais vantajosamente de a partir de 0,5 ml a cerca de 2,0 ml.

Vacinações repetidas podem ser preferidas em intervalos de tempo periódicos para aumentar a resposta imune inicialmente ou quando um longo período de tempo passou desde a última dose. Em uma modalidade da presente invenção, a composição de vacina é administrada como uma injeção parenteral (isto é, subcutaneamente, intradermalmente ou intramus-cularmente). A composição pode ser administrada como uma dose ou, em modalidades alternativas, administrada em doses repetidas de a partir de cerca de duas a cerca de cinco doses dadas em intervalos de cerca de duas a cerca de seis semanas, de preferência de a partir de cerca de duas a cerca de cinco semanas. No entanto, uma pessoa versada na técnica vai reconhecer que o número de doses e o intervalo de tempo entre as vacinações dependem de vários fatores incluindo, mas não limitado a, idade do animal vacinado; a condição do animal; a via de imunização; quantidade de antíge-no disponível por dose; e similar. Para vacinação inicial, o período será geralmente maior do que uma semana e de preferência será entre cerca de duas a cerca de cinco semanas. Para os animais anteriormente vacinados, uma vacinação de reforço, antes ou durante a gravidez, em um intervalo de cerca de um ano pode ser realizada. A presente invenção também compreende administração de uma composição de vacina usando um injetor sem agulha tal como Pigjet®, Avi-jet®, Dermojet® ou Biojector® (Bioject, Oregon, USA). Uma pessoa versada na técnica é capaz de ajustar as especificações do injetor conforme requerido com relação a fatores tal como espécie do animal a ser vacinado; a idade e o peso do animal, e similar, sem experimentação indevida.

Em uma modalidade da presente invenção, o método compreende uma administração única de uma composição de vacina formulada com uma emulsão de acordo com a invenção. Por exemplo, em uma modalidade, a composição de vacina é uma vacina de Mycoplasma hyopneumoniae inati-vada, enquanto uma modalidade alternativa provê uma vacina compreendendo uma composição de vírus PCV2 inativado. Outras composições ou vacinas ímunológicas são adequadas para uso em um regime de dose única incluindo, mas não limitado a, PRRS e SIV inativados. Em particular, para a composição de vacina de Mycoplasma hyopneumoniae, a dose única pode ser administrada entre o nascimento e o abate de um porco, em particular entre cerca de 3 a cerca de 56 dias de vida, de preferência entre cerca de 10 a cerca de 35 dias de vida, com mais preferência entre cerca de 15 e cerca de 30 dias de vida. A vacina pode ser administrada também na presença de anticorpos preexistentes. A invenção refere-se ainda a métodos para tratar um hospedeiro, por exemplo, um animal, compreendendo administrar ao hospedeiro uma composição farmacêutica feita de acordo com a invenção e compreendendo pelo menos um imunógeno selecionado do grupo consistindo em proteínas ou peptídeos, anticorpos, alérgenos, CpG ODN, fatores de crescimento, ci-tocinas, ou antibióticos, e, em particular, CpG ODN ou citocinas. Essas composições farmacêuticas podem ser usadas para melhorar os desempenhos de crescimento em um animal tal como uma galinha, um porco ou uma vaca. A presente invenção refere-se ainda a um kit compreendendo um primeiro frasco contendo um ingrediente tal como um imunógeno ou composição farmacêutica e, em um segundo frasco, uma emulsão feita de acordo com a presente invenção. O imunógeno pode estar em uma forma liofilizada, uma forma seca ou em uma solução aquosa conforme aqui descrito. A invenção será agora descrita mais por meio de exemplos não-limitantes que seguem.

Exemplo 1: Método de Fabricação de Emulsão A emulsão é produzida em duas etapas, conforme descrito como segue: Primeira etapa: Um emulsificador Silverson de rotor-estator de alto císalhamento (tipo L4RT com um cabeçote de desintegração com um diâmetro de 10 mm) foi usado para produzir as formulações. Para produzir uma emulsão, um volume de fase de óleo foi emulsificado a 25°C com um volume de fase aquosa N° 1. A fase aquosa foi adicionada â fase de óleo sob agitação, 500 rpm (rotação por minuto) por 1 minuto. A velocidade de rotação foi progressivamente aumentada com o aumento do volume para 8300 rpm durante 1 minuto. Durante esta etapa, a emulsão era uma emulsão água-em-óleo. Para a emulsão TS6, a composição de fase era como segue: Fase de óleo (120 ml): - monooleato sorbitano (Span 80®) : 1,8 p/v, - trioleato sorbitano (20 OE) (Tween 85®) : 10,2 p/v - óleo de parafina (Marcol 82®) : 88% v/v Fase aquosa N° 1 (120 ml): - solução a 20% (p/v) de monooleato sorbitano (20 OE) (Tween 80®) : 11,25% p/v - tampão de isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8) :85,75% v/v > mercurotiolato de sódio (Thiomersal®) 1 % em água : 1,5% V/V

Monooleato sorbitano (Span 80®) e trioleato sorbitano (20 OE) (Tween 85®) foram introduzidos na fase de óleo. O monooleato sorbitano (20 OE) (Tween 80®) não era miscível em óleo de parafina. Uma solução a 20% (p/v) de Tween 80® foi preparada no mesmo tampão que a vacina, por e-xemplo, em tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico 0,02 M (pH 7,8). Mercurotiolato de sódio age como um conservante e não é essencial para a emulsão.

Quando a agitação parou, a emulsão mudou para uma emulsão óleo-em-água. A emulsão foi posta em uma câmara fria a 5°C por pelo menos 4 horas. Neste estágio, a emulsão era uma pré-emulsão contendo 50% de fase de óleo.

Segunda etapa: A fase aquosa N° 2 foi preparada com 120 ml de tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M pH 7,8 com imunógenos (imunógeno de Mycoplasma hyopneumoniae inativada ou imu-núgeno de PCV-2, conforme descrito infra). A pré-emulsão conforme preparado na primeira etapa foi esfriada para cerca de 5°C, diluída através da adição de meio volume da fase aquosa N° 2 na mesma temperatura e misturada através de rotação de uma barra magnética por 1 minuto. A concentração de tensoativo final na emulsão TS6 era 4,75% (p/v).

Conforme aqui preparado, vacinas de TS6 são estáveis por pelo menos um ano a 5°C.

Usando o mesmo método de preparação, outras emulsões podem ser obtidas conforme descrito abaixo: Emulsão TS7 A emulsão TS7 é uma emulsão O/A contendo 33% de uma fase de óleo. A fase de óleo (120 ml) contém Marcol 82® 88% v/v, Span 80® 1,8% p/v e Tween 85® 10,2% p/v. A fase aquosa N° 1 (120 ml) contém tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8) 97,75% v/v, Thiomersal® 1% em água 1,5% v/v e Lutrol F127® 0,75% p/v. A fase a-quosa N° 2 (120 ml) é constituída com o tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8), opcionalmente contendo imunógenos. A concentração de tensoativo final na emulsão TS7 é 4,25% p/v. Emulsão TS8 A emulsão TS8 é uma emulsão O/A contendo 50% de uma fase de óleo. A fase de óleo (160 ml) contém Marcol 82® 92% v/v, Span 85 1,8% p/v e Brij 96®% 6,2% p/v. A fase aquosa N° 1 (160 ml) contém tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8) 98,5% v/v, Thiomersal® 1% em água 1,0% v/v e Lutrol F127® 0,5% p/v, opcionalmente contendo imunógenos. A concentração de tensoativo final na emulsão TS8 é 4,25% p/v.

Emulsão TS9 A emulsão TS9 é uma emulsão O/A contendo 10% de uma fase de óleo. A fase de óleo (120 ml) contém Marcol 82® 60% v/v, Span 40® 17,2% p/v e Arlatone 650® 22,8% p/v. A fase aquosa N° 1 (120 ml) contém tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8) 97,75% v/v e Tween 20® 2,5% p/v. A fase aquosa N° 2 foi preparada com tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8), opcionalmente contendo imunógenos. 100 ml da pré-emulsão foram diluídos com os 400 ml da fase aquosa N° 2 para se obter e emulsão TS9. A concentração de tensoativo final na emulsão TS9 é 4,25% p/v.

Exemplo 2: Determinação da Temperatura de Inversão de Fase (ΡΓΠ de uma Emulsão 10 ml da emulsão TS6 foram postos em um tubo de vidro em um banho de água em uma temperatura de cerca de 25°C. A emulsão TS6 era uma emulsão homogênea branca. A temperatura no banho de água foi pro-gressivamente aumentada. Mudanças na emulsão foram visualmente observadas (a emulsão ficou como duas fases separadas devido á migração da fase oleosa amarelo-marrom para a superfície). Esta mudança é característica da quebra da emulsão. A temperatura na qual esta mudança é observada é o valor da PIT da emulsão. Para a emulsão TS6, a PIT era 40-45°C, enquanto a PIT para a emulsão TS7 era 44-49°C.

Exemplo 3: Composição de Vacina de Mvcoplasma tivooneumoniae e Provocação Heteróloaa Materiais e Métodos: a composição de vacina foi formulada contendo a emulsão TS6, preparada conforme descrito no Exemplo 1, e Mvcoplasma hvopneumoniae inativada, cepa BQ14 (Kobisch. M. e outros. Ann. Inst Pasteur Immunol., 1987, 138:693-705) em uma concentração de 8,7 log10 CCU (unidade de mudança de cor) por ml de vacina. Vinte e dois (22) leitões, três semanas de vida e tendo anticorpos maternais (nascidos de mães soropositivas para Mycoplasma hyopneumoniae), foram aleatoriamente alocados em dois grupos. Um grupo de dez (10) leitões foi vacinado no dia 0 com 2 ml da composição de vacina através de injeção intramuscular, enquanto o grupo de controle de doze (12) leitões não foi vacinado.

Em intervalos selecionados durante o experimento (dias 0, 27, 42 e 56), esfregaços nasais foram tomados de leitões em ambos grupos e anticorpos secretores anti-BQ14 determinados através de ELISA. No dia 27, os leitões foram sangrados e células mononucleares de sangue periférico (PBMN) obtidas para determinar os níveis de IFNy no sangue periférico. No dia 28, todos os leitões foram provocados intranasalmente com uma solução contendo aproximadamente 6,6 log10 CCU/ml de Mycoplasma hyopneumoni-ae. A cepa Mp88c (cepa isolada de um porco doente na Dinamarca e cultivada conforme descrito por Kobisch e Friis em Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz., 1996, 15:1569-1605) com aproximadamente 5 mL sendo aplicados a cada narina. A provocação foi repetida 24 horas mais tarde. Os porcos foram sacrificados e os pulmões coletados na necropsia. As pontuações de pulmão foram determinadas através de estimativa da área de superfície (expressa em porcentagem da superfície do lóbulo integral) da lesão para cada um dos sete lóbulos pulmonares. As pontuações foram determinadas como segue: Uma pontuação total foi calculada através da adição das pontuações para os lóbulos individuais de cada pulmão, resultando em um registro máximo por animal de 28.

Resultados: Porcos vacinados com a formulação de vacina de TS6 exibiram uma resposta celular forte, e uma que era significantemente maior do que o grupo de controle, conforme demonstrado pelo número de pontos secretando IFNy de células mononucleares de sangue periférico 5 x 105 (PBMN). Os porcos do grupo vacinado tinham em média 139 pontos (desvio padrão 25) conforme comparado com 11 (desvio padrão de 5) nos controles não-vacinados.

Os níveis de anticorpos secretores anti-BQ14 em vacinados e de controle são sumarizados na tabela que segue, com resultados mostrando que os porcos vacinados tinham níveis significantemente mais altos de anticorpos secretores duas a três semanas após a provocação, conforme comparado com controles não-tratados: Referindo-se agora à Figura 1, os animais vacinados com composição de vacina de TS6 exibem um registro de pulmão médio de 2,1 ± 1,9 {média ± desvio padrão) conforme comparado com os controles não-tratados com um registro de pulmão médio de 7,8 ±4,1. Esses resultados mostram uma redução significante nas lesões pulmonares para os leitões vacinados com a composição de vacina conforme comparado com os controles não-vacinados.

Exemplo 4: Duração de proteção contra uma provocação com heteróloqo de Mvcoplasma hvopneumoniae Materiais e Métodos: Trinta e oito (38) leitões, três semanas de vida com anticorpos maternais (nascidos de mães que eram soropositivas para Mycoplasma hyopneumortiae), foram aleatoriamente alocados em três grupos como segue: Grupo 1 (12 leitões) foram vacinados através de uma via intra-muscular no dia 0 com 2 ml da composição de vacina conforme descrito no Exemplo 3.

Grupo 2 (12 leitões) foram vacinados no dia 0 através de injeção intramuscular com 2 ml de uma vacina inativada de Mycoplasma hyopneu-moniae comercial.

Grupo 3 (14 leitões) serviram como controles não-vacinados.

Todos os porquinhos foram intranasalmente provocados 20 semanas após a vacinação com cerca e 5 ml/por narina de uma cepa de provocação Mp88c de Mycoplasma hyopneumoniae (6,6 log10 CCU/ml) conforme descrito acima. A provocação foi repetida 24 horas mais tarde. O sangue foi coletado de todos os grupos e células mononucleares de sangue periférico (PBMN) obtidas para determinar os níveis de IFNy conforme descrito a-cima. Anticorpos de soro anti-BQ14 IgA e lgG1 foram determinados no Dia 138 para cada grupo. Seguindo a necropsia, as numerações de pulmão (média ± desvio padrão) foram calculadas conforme descrito no Exemplo 3 acima.

Resultados: Com referência agora à Figura 2, leitões do Grupo 1 vacinados com a composição de vacina de TS6 demonstraram um registro de pulmão médio de 0,4 ± 0,9, uma redução estatisticamente significante do registro de pulmão de leitões vacinados com a vacina comercial (4,0 ±5,1) ou os controles não-vacinados (6,1 ± 5,8).

Os resultados médios (± o desvio padrão) de anticorpos em circulação anti-BQ14 IgA e lgG1 no soro coletados de cada grupo do Dia 138 são sumarizados como segue: A tabela que segue sumariza os resultados médios (± desvio padrão) em número de pontos para 5 x 105 células mononucleares de sangue periférico (PBMN) secretando gama-interferon (IFNy) no sangue periférico: * se um leitão expressando um número anormalmente alto de pontos (109) for excluído, a média do grupo de controle é 4 ± 1.

Conforme esperado ao usar uma vacina inativada, a freqüência de células T secretando IFNy anti-BQ14 detectáveís no dia 138 pós-vacinação era muito menor do que no dia 28. Interessante, a maioria dos leitões vacinados com TS6 eram ainda positivos no dia 138 sugerindo que a resposta celular era mantida neste grupo. A freqüência de células T secretando IFNy anti-BQ14 circulando no dia 152 (13 dias pós-provocação) era muito diferente entre os três grupos. O grupo vacinado com TS6 desenvolveu uma resposta celular muito alta conforme oposto aos outros grupos. Esse resultado sugere que a provocação eficientemente traz de volta a memória imune induzida pela vacina de TS6.

Exemplo 5: Resultados de soroloqia após administração de uma dose de um adiuvante de vacina de PCV-2 com a emulsão TS6 Materiais e Métodos: Dez leitões livres de patógeno específicos (SPF), 2-3 meses de vida, foram aleatoriamente alocados em 2 grupos. Um grupo de 5 leitões foi vacinado através de uma via intramuscular (no dia 0) com 2 ml de uma vacina contendo PCV-2 inativado (cepa imp1010) em 6,8 logio CCID50 por dose (grupo vacinado). O grupo de controle de 5 leitões não foi vacinado. Amostras de sangue foram tomadas em DO, D7, D14, D21 e D28 pós-vacinação para titulação dos anticorpos PCV-2 ORF2 através de ELISA.

Resultados: Conforme demonstrado na tabela que segue, todos os vacinados mostraram uma resposta de anticorpo anti-PCV-2 ORF2 signi-ficante a partir do dia 7 ao 40 após vacinação: Exemplo 6: Proteção contra provocação elicitada por uma vacina de PCV-2 tendo como adjuvante a emulsão TS6 Materiais e Métodos: Dezesseis (16) leitões SPF, 4-5 dias de vida, foram aleatoriamente alocados em 2 grupos como segue: um grupo de 8 leitões foi vacinado duas vezes através de injeção intramuscular nos dias 0 e 21 com 2 ml da vacina contendo PVC-2 inativado (cepa imp1010) a 7,55 log10 CCID50 por dose (grupo vacinado), enquanto 0 grupo de controle de 8 leitões não foi vacinado. Todos os leitões foram intranasalmente provocados no dia 35 com a cepa Imp1011-48285 de PCV-2 (depositada na ECACC sob 0 número de acesso V98011608) contendo cerca de 5,5 logio CCID50 por ml com aproximadamente 5 mL sendo aplicados a cada narina. Ambos ELISA e estudos de soroneutralização (SN) foram realizados e registros clínicos determinados para cada leitão como segue: * No caso de morte, 0 registro usado é 0 valor correspondendo ao dia antes da morte.

Seguindo a necropsia, um registro de lesão foi calculado como segue: Resultados: Resultados de sorología conforme realizado através de ELISA e títulos de anticorpo de neutralização de soro nos dias 30 e 63 mostram leitões vacinados com níveis mais altos do que aqueles vistos nos controles não-tratados. A tabela abaixo sumariza resultados de isolamento de vírus PCV-2 de esfregaços fecais e tecido gangliônico bem como mostra registros clínicos e de lesão médios de grupos vacinados e de controle. Os resultados mostram níveis mais altos de ambos anticorpos em circulação e títulos SN em vacinados comparado com controles. Os registros clínicos e lesões pulmonares são significantemente reduzidos nos leitões vacinados também. A evolução do registro clínico após provocação é mostrada na Figura 3.

Exemplo 7: Resultados de eficácia de campo seguindo vacinação de uma dose com uma vacina de PCV-2 inativada tendo como adiuvante TS6 Composição da vacina: O adjuvante TS6 foi preparado conforme descrito no Exemplo 1. O vírus PCV-2 foi desenvolvido em células PK/15 e multiplicação viral realizada conforme descrito na patente U.S. N° de Série 6.517.843 ÍEIlis e outros; cujos conteúdos são aqui incorporados em sua totalidade). Resumindo, no final da cultura viral, as células infectadas são colhidas, lisadas e a colheita viral inativada com métodos convencionais. Por exemplo, a inativação pode ser realizada com etilenoimina a 0,1% por 18 horas a +37°C; com beta-propiolactona 0,5% por 24 horas a +28°C; ou com beta-propiolactona 0,2% e 0,1% por 24 horas a +4°C. Se o título do vírus antes da inativação fosse inadequado, a suspensão viral seria concentrada através de ultrafiltragem usando uma membrana com um corte de 150-300 kDa. A suspensão viral inativada foi armazenada a +5°C antes da formulação da vacina. O teor de antígeno da vacina foi ajustado a 2,1 log10 Unidades de antígeno por dose. Com base neste teor, a atividade da vacina determinada através da quantificação do ingrediente ativo no produto final através de um método ELISA foi arbitrariamente ajustada em um mínimo de 100 Unidades por dose ELISA.

Protocolo de vacinação: Para testar a eficácia da composição de vacina sob condições de campo, uma fazenda foi escolhida, a qual exibe tipicamente ataques endêmicos de síndrome de debilitação multissistêmica pós-desmame (PMWS) causada por infecção por PCV-2 em leitões. As mães foram divididas em dois grupos com as vacinadas recebendo uma injeção intramuscular (dose de 2 ml) da vacina inativada com PCV-2 com ad-juvante TS6 duas a três semanas antes do parto. O segundo grupo não foi vacinado e serviu como um controle. As mães foram deixadas parir e os leitões das mães vacinadas (n = 889) e mães de controle (n = 713) foram monitorados quanto à mortalidade até a idade do abatimento.

Resultados: A Figura 4 mostra um gráfico mostrando a porcentagem de casos de PMWS em leitões até o momento do abate. Como pode ser visto a partir do gráfico, houve uma redução de 75% no número de casos de PMWS em leitões nascidos de mães vacinadas conforme comparado com o número de casos em leitões de controles não-vacinados. Esses resultados mostram uma diminuição significante na doença clínica associada com infecção por PCV-2 e demonstraram a possibilidade de vacinação de mães um pouco antes do parto com uma vacina de PCV2 inativada com adjuvante TS6 para prevenir a mortalidade e a morbidez associadas com infecção por PCV2 em leitões. Esses resultados ainda demonstram que uma redução significante de PMWS entre leitões em condições de campo reais pode ser conseguida usando apenas aquela dose de uma composição de vacina de acordo com a presente invenção.

Exemplo 8: Emulsão LF2 Usando o método descrito acima no Exemplo 1, uma emulsão óleo-em-água (O/A) contendo emulsão de fase em óleo a 10% e chamada LF2 foi feita. A fase de óleo (100 ml) continha Marcol 82® 88% v/v, Span 80® 1,8% p/v e Tween 85® 10,2 p/v. A fase aquosa N° 1 (100 ml) continha tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8) 88,5% v/v e solução a 20% (p/v) de Tween 80® 11,5% p/v. A fase aquosa N° 2 (400 ml) foi constituída com o tampão isotônico de fosfato dissódico e monopotássico a 0,02 M (pH 7,8), opcionalmente contendo imunógenos. 100 ml da pré-emulsão foram diluídos com 400 ml da fase aquosa N° 2 para se obter a emulsão LF2. A concentração de tensoativo final na emulsão LF2 era 1,43% p/v. A PIT da emulsão LF2 era >45°C, conforme determinado através da condutividade.

Exemplo 9: Análise soroiógica após administração de uma vacina de influen-za de suíno com emulsão LF2 como adiuvante Materiais e Métodos: Quinze (15) leitões, de cerca de 10 semanas de vida, foram aleatoriamente alocados em 3 grupos. O grupo um (vacinado) tinha 5 leitões vacinados duas vezes (no dia 0 e no dia 28) com 2 ml de uma vacina de influenza de suíno recombinante a 7,7 lob10 CCID50 por dose através de injeção íntramuscular. Essa vacina de vetor de expressão recombinante continha um vetor "canarypox" codificando e expressando nu-cleoproteína (NP) e hemaglutinina (HA) de um vírus de gripe suína H1N1. O segundo grupo de 5 leitões foi vacinado duas vezes (através de injeção in-tramuscular no dia 0 e dia 28) com 2 ml de vacina influenza de suíno recombinante (a 7,7 logio CCID50 por dose) com emulsão LF2 como adjuvante (grupo vacinado com LF2). Cinco leitões foram deixados sem vacinar (grupo de controle). Amostras de sangue foram tomadas nos dias D0, D14, D28, D42 e D56 pós-vacinação para determinação dos títulos de inibição de he-maglutinina (Hl).

Resultados: Conforme sumarizado na tabela que segue, todos os vacinados mostraram uma resposta de anticorpo de gripe anti-suína signi-ficante de 42 a 56 dias após a vacinação (ANOVA, p<0,0001) conforme comparado com controles não-tratados. No entanto, os porcos vacinados com a vacina tendo LF2 como adjuvante mostram um aumento significante na resposta de anticorpo nos dias 42 a 56 pós-vacinação conforme comparado com porcos recebendo a vacina recombinante sem adjuvante {ANOVA, p<0,0001).

Conforme demonstrado através desses resultados, o afeito adjuvante da emulsão LF2 permite que a vacina induza uma resposta de anticorpo maior contra o vírus da gripe suína, conforme comparado com a vacina sem adjuvante.

Exemplo 10: Proteção induzida por uma vacina de Mannheimia haemolvtica tendo como adjuvante emulsão LF2 Materiais e Métodos: Vinte (20) bezerros, cinco meses de vida, negativos ou com poucos títulos de anticorpo de leucotoxina de Mannheimia haemolytica, foram aleatoriamente alocados em dois grupos de 10 bezerros cada. Uma emulsão LF2 foi feita conforme descrito no Exemplo 8 acima e uma vacina formulada contendo Mannheimia haemolytica (cepa A1) em a-proximadamente 60 a 70 unidades ELISA (correspondente a cerca de 0,34 mL a 1,1 mL de cultura bacteriana não-concentrada bruta) por dose de vacina e adjuvante com a emulsão de LF2. Um grupo de 10 bezerros foi vacinado no dia 0 com 2 ml de composição de vacina de LF2 através de injeção subcutânea, enquanto o grupo de controle de 10 bezerros não foi vacinado. A partir do dia da vacinação (DO) até o dia da provocação (D20), todos os bezerros vacinados foram regularmente examinados quanto a reações gerais e locais à vacinação. Exame clínico compreendia uma avaliação de reações sistêmicas (tal como apatia, anorexia, polipnéia, salivação, tremedeira), registro da temperatura reta e uma medição da reação local em locais de injeção. Nenhum dos bezerros apresentou qualquer reação sistêmica à vacinação. As temperatura retais (em °C, média +/- desvio padrão) sumarizadas na tabela que segue mostram que uma fase transiente e leve de hipertermia foi observada no grupo vacinado, com um pico dentro de 24 horas após a vacinação.

As reações locais em bezerros vacinados (medidas como a área de superfície em cm2, média +/- desvio padrão) mostraram uma reação local forte que apareceu aproximadamente 24 a 48 horas pós-vacinação em todos os animais vacinados e então diminuiu rapidamente para um tamanho de aproximadamente 3 cm2 por volta de D14. Essas reações tinham quase que desaparecido por volta de D20. As reações são resumidas como segue: Amostras de sangue foram obtidas de todos os animais em vários intervalos (DO, D7, D14, D20 e D28) e níveis de anticorpos contra a leu-cotoxina A1 de Mannheimia haemolytica apresentados através de ELISA (título em log10 OD50). Os resultados mostraram que todos os bezerros eram negativos antes da vacinação. Por volta de D20, após uma única vacinação, oito dos dez vacinados tinham soro-convertido enquanto todos os bezerros de controle continuavam neoativos de DO a D20. Os resultados de ELISA são sumarizados como segue: Protocolo de provocação: Todos os bezerros foram provocados no dia 20 através de administração intratecal de uma provocação de 30 ml contendo cerca de 9,2 log10 CFU/ml (unidade de formação de colônia por mililitro) de cepa A1 de Mannheimia haemoiytica. A provocação foi repetida 24 horas mais tarde. A partir do dia da provocação até o final do estudo, todos os bezerros foram examinados diariamente quanto a sinais clínicos gerais incluindo síndrome respiratória. Os sinais monitorados incluíam condição geral, anorexia, temperatura retal, descarga nasal, tosse, taxa respiratória e dispnéia. Registros clínicos globais foram calculados de acordo com a fórmula que segue e registros parciais dados na tabela: Registro clínico global: Σ (registro parcial x coeficiente)/14 Para os animais mortos, o registro clínico máximo diário individual de 2 foi aplicado.

Os registros de lesão pulmonar (expressos em porcentagens) foram também determinados para cada bezerro usando a fórmula que segue: Registro de lesão pulmonar Σ (superfície da lesão em um lóbu- lo/superfície do lóbulo integral x 100 X LRM) Onde LRM é a massa relativa do pulmão, com um valor de: 0,11 para o lóbulo craniano direito e o lóbulo craniano médio direito 0,07 para o lóbulo caudal médio direito 0,35 para o lóbulo caudal direito 0,05 para o lóbulo craniano esquerdo 0,06 para o lóbulo médio esquerdo 0,32 para o lóbulo causai esquerdo, e 0,04 para o lóbulo ázigo.

Resultados da provocação: Registros clínicos globais para cada grupo, apresentados na tabela que segue, mostraram que o grupo vacinado demonstrou uma redução significante nos registros clínicos globais conforme comparado com controles não-tratados (p=0,046, ANOVA).

Todos os animais que sucumbiram à provocação apresentaram 60% ou mais de seus pulmões afetados. Havia uma tendência estatística (p=0,08) de animais vacinados terem menos lesões no pulmão do que aqueles no grupo de controle. O número de animais por grupo tendo mais de um terço de seus pulmões afetados era 2/10 (20%) para os vacinados e 7/10 (70%) para os animais de controle. O número de animais tendo mais de um terço de seus pulmões afetado era significantemente menor (p=0,03, Teste Exato de Fischer, uma via) no grupo vacinado. Os resultados dos registros de lesão pulmonar são sumarizados na tabela que segue: * animais que sucumbiram à provocação.

Havia uma correlação altamente significante (p<0,001) e forte (R2=0,86) entre registros clínicos globais e a porcentagem de lesões pulmonares. Embora todos os animais vacinados exibissem uma leve hipertermia seguindo a vacinação, nenhuma outra reação geral à vacinação foi observada. Reações locais fortes foram observadas após a vacinação, mas rapidamente reduziram para um tamanho muito aceitável e lesões significantes foram observadas na necropsia. Esses resultados demonstram a segurança da vacina tendo como adjuvante a emulsão LF2.

Os resultados deste experimento, mostrando que ambos os registros clínicos médios e os registros de lesões pulmonares foram significan-temente reduzidos em vacinados conforme comparado com controles, demonstram que uma única injeção de vacina de Mannheimia haemolytica tendo como adjuvante emulsão LF2 protege bezerros inocentes contra uma provocação de Mannheimia haemolytica.

Tendo então descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, deve ser compreendido que a invenção definida nos parágrafos acima não deve ser limitada aos detalhes particulares descritos na descrição acima uma vez que muitas variações aparentes dela são possíveis sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.

Claims

1. Composição de vacina caracterizada pelo fato de compreender uma emulsão óleo-em-água injetável (0/A) compreendendo: (i) uma solução aquosa contendo pelo menos um imunógeno; (ii) um óleo mineral; (iii) um tensoativo lipofilico não-iônico; (iv) um tensoativo hidrofilico não-iônico tendo um valor de equilíbrio hidrofilico-lipofílico (HLB) alto entre 13 e 40; e (v) um tensoativo hidrofilico não-iônico tendo um valor de equilíbrio hidrofilico-lipofílico (HLB) baixo entre 9 e 13.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo hidrofilico não-iônico de HLB alto estar presente em uma concentração de 0,1% a 1,5% e ser expresso como um peso em volume de emulsão (p/v).

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de a porcentagem de tensoativo ser de 4% a 6% em peso/volume.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo hidrofilico não-iônico de HLB alto estar presente em uma concentração de 1 a 8% e ser expresso como um peso em volume de emulsão (p/v).

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo lipofilico não-iônico estar presente em uma concentração de 0,1% a 2,5% e ser expresso como um peso em volume de emulsão (p/v).

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o óleo mineral estar presente em uma concentração de 20% a 40% (v/v).

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a emulsão ter uma temperatura de inversão de fase (PT) entre 33 a 66°C.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo hidrofilico não-iônico de HLB baixo ser selecionado do grupo consistindo em triésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado, diésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado, monoésteres sorbitano de ácido graxo etoxilado, álcoois graxos etoxilados, óleo de rícino etoxilado de ácidos graxos etoxilados e suas combinações.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de o éster do dito éster de ácido graxo etoxilado ser selecionado do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e suas combinações.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo lipofilico não-iônico ser selecionado do grupo consistindo em ésteres de sorbitano de ácido graxo, ésteres de manida de ácido graxo, ésteres de manida de ácido graxo dietoxilado, ésteres de manida de ácido graxo trietoxilado, ésteres de manida de ácido graxo tetraetoxilado e suas combinações.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de o éster dos ésteres de ácido graxo ser selecionado do grupo consistindo em oleato, palmitato, estearato, isoestearato, laurato e suas combinações.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo hidrofilico não-iônico de HLB alto ser selecionado do grupo consistindo em monoésteres de sorbitano de ácido graxo etoxilado, álcoois graxos etoxilados, ácidos graxos etoxilados, copolimero em bloco não-iônico e suas combinações.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de o monoéster de sorbitano etoxilado ser selecionado do grupo consistindo em monolaurato de sorbitano etoxilado, monopalmitato de sorbitano etoxilado, monoestearato de sorbitano etoxilado, monooleato de sorbitano etoxilado e suas combinações.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o óleo mineral ser selecionado do grupo consistindo em óleo de parafina, esqualano, pristano, óleo de poliisobuteno, óleo de poliisobuteno hidrogenado, óleo de polideceno, óleo de poliisopreno, óleo de poliisopropeno e suas combinações.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender um óleo de parafina, um monoéster de ácido graxo de sorbitano como um tensoativo lipofilico não-iônico, um triéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado de sorbitano como um tensoativo hidrofilico não-iônico de HLB baixo e um copolimero em bloco não-iônico como um tensoativo hidrofilico não-iônico de HLB alto.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de o monoéster de ácido graxo de sorbitano ser um monooleato de sorbitano, o triéster de sorbitano de ácido graxo etoxilado é um trioleato de sorbitano etoxilado e o copolimero em bloco não-iônico é um polímero de polioxietileno/ polioxipropileno (POE-POP).

17. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de o óleo de parafina estar presente em uma concentração de 10% a 40% v/v, o monooleato de sorbitano estar presente em uma concentração de 0,2% a 1,5% p/v, o trioleato etoxilado de sorbitano estar presente em uma concentração de 2% a 5% p/v e o POE-POP estar presente em uma concentração de 0,1 % a 0,5% p/v.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de o óleo de parafina estar presente em uma concentração de 29,3% v/v, o monooleato de sorbitano estar presente em uma concentração de 0,6% p/v, o trioleato de sorbitano etoxilado estar presente em uma concentração de 3,4% p/v e o POE-POP estar presente em uma concentração de 0,25% p/v.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o imunógeno ser selecionado do grupo consistindo em um patógeno inativado, um patógeno atenuado, uma subunidade, um vetor de expressão recombinante e um plasmideo ou combinações deles.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de o patógeno ser selecionado do grupo consistindo em um vírus, uma bactéria, um fungo, parasita protozoário ou suas combinações.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de o imunógeno ser um vírus inativado.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de o imunógeno ser um vírus circovírus de porco inativado do tipo 2 (PCV-2).

23. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de o imunógeno ser uma bactéria Mycoplasma hyopneumoniae inativada.