BRPI0510063B1 - Plasmina recombinante modificada, polinucleotídeo codificando a mesma, vetor de expressão e micro-organismo transgênico - Google Patents

Abstract

plasmina modificada recombinantemente. a presente invenção refere-se aos polinucleotídeos e polipeptídeos que se referem a uma molécula de plasmin (ogênio) modificada recombinantemente. a molécula de plasmin (ogênio) tem um domínio simples de kringle n-terminal ao sítio de ativação presente na molécula de plasminogênio humano nativo e exibe ligação com usina e características enzimáticas significativas associadas com a enzima nativa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLASMINA RECOMBINANTE MODIFICADA, POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO A MESMA, VETOR DE EXPRESSÃO E MICRO-ORGANISMO TRANSGÊNICO".

Antecedentes da invenção A presente invenção refere-se a plasminogênio humano é uma proteína de cadeia simples que contém 791 resíduos de aminoácido. A ativação de plasminogênio a plasmina resulta de uma divagem simples da ligação de peptídeo Arg561-Val562 no zimogênio. A molécula de plasmina resultante é uma serina protease de duas cadeias, ligada a dissulfeto com especificidade semelhante à tripsina (clivada depois de Lys e Arg). A cadeia pesada amino-terminal de plasmina (resíduos 1-561, aproximadamente 60 kDa) é composta de cinco domínios de kringle, cada um contendo aproximadamente 80 resíduos de aminoácido. Os domínios de kringle são responsáveis pelas propriedades reguladoras de plasminogênio, tal como interação com inibidores de ativação, por exemplo, íons de Cl'1; com estimuladores de ativação, por exemplo, o ácido ε-aminocapróico; com células de mamíferos e bacteria-nas e com outras proteínas, tais como plasmina substituído fisiológico fibrina e inibidor de plasmina oc2-antiplasmina. De todos cinco kringles, o kringle 1 é um dos mais multifuncionais: foi demonstrado que a sua atividade de ligação com lisina tem sido responsável pela interação da plasmina com a oc2-antiplasmina e a fibrina. Vide Wiman, B.e outros, Biochim. Biophys. Acta 579:142-154 (1979); e Lucas, M.A.e outros, J. Biol. Chem. 258:4249^256 (1983). A cadeia leve C-terminal de plasmina (resíduos 562-791, aproximadamente 25kDa) é uma serina protease típica, homóloga à tripsina e que contém a tríade catalítica da serina protease: His603, Asp646 e Ser741. O plasminogênio contém 24 pontes de dissulfeto e 2 sítios de glicosilação, em Asn289 e Thr346.

Tem sido demonstrado que a proteólise limitada de plasminogênio por elastase resulta em três fragmentos (Sottrup-Jensen, L.e outros, Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3: 191-209 (1978)). O primeiro fragmento, K1-3, inclui os primeiros três kringles e pode ser isolado em duas versões, Tyr79-Val338 e Tyr79-Val354. O segundo fragmento, K4, corresponde ao quarto kringle e inclui os resíduos Val355-Ala440, O último fragmento, C-ter- minai (o chamado miniplasminogênio) inclui os resíduos Val443-Asn791 e consiste do quinto kringie e do domínio da serina protease. O miniplasmino-gênio pode ser ativado da mesma maneira que o plasminogênio, formando a miniplasmina.

Em virtude da estrutura complexa da molécula de plasminogênio de comprimento total, não se provou que ós sistemas de expressão bacteri-anos eram úteis para a produção de plasminogênio recombinante. O plasminogênio é produzido na forma de corpos de inclusão e não são redobráveis daquele estado. Além disso, a expressão de plasminogênio em células de mamíferos é complicada pela ativação intracelular de plasminogênio na plasmina e a citotoxicidade resultante. A produção de plasminogênio totalmente ativo que usa células de inseto é possível, entretanto, este sistema não é adequado para uma produção em grande escala em virtude do seu baixo rendimento.

Consequentemente, é desejável uma proteína recombinante modificada, que possui as características desejáveis de plasmina / plasminogênio ao mesmo tempo apresentando falta de certas características negativas e que é capaz de produção em células bacterianas em quantidades substanciais.

Sumário da invenção A presente invenção fornece um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem um único domínio de kringie N-terminal homólogo a um domínio de kringie de plasminogênio humano nativo; e um sítio de ativação de domínio C-terminal e de domínio de serina protease homólogo aos domínios correspondentes em plasminogênio humano; em que o polipeptídeo se liga à lisina imobilizada. O domínio de kringie N-terminal pode ser homólogo ao kringie t ou ao kringie 4 do plasminogênio humano nativo .

Em algumas modalidades, polipeptídeo codificado é pelo menos 90%, 95%, ou 98% idêntico à seqüência apresentada na ID SEQ N° 2. Além disso, o polipeptídeo codificado pode ser a seqüência apresentada na ID SEQ N°: 2. A seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo pode ser a se- qüência apresentada na ID SEQ N°: 1 ou variações degeneradas da mesma. A sequência de nucleotídeo pode codificar um polipeptídeo que tenha um domínio N-terminal de kringie homólogo ao domínio de kringle 1 ou de kringle 4 do plasminogênio humano nativo; e um sítio de ativação de domínio C-terminal e domínio de serina protease homólogo aos domínios correspondentes. A seqüência de nucleotídeo também pode codificar um polipeptídeo que tenha um único domínio de kringle N-terminal pelo menos 90% idêntico ao domínio de kringle 1 ou de kringle 4 do plasminogênio humano nativo; e um domínio C-terminal pelo menos 90% idêntico ao sítio de ativação e ao domínio da serina protease de plasminogênio humano. Os polipep-tídeos codificados podem se ligará lisina imobilizada.

Em um outro aspecto, a invenção fornece polipeptídeos que tenham do domínio N-temninal de kringle homólogo a um domínio de kringle do plasminogênio humano nativo e um sítio de ativação do domínio C-terminal e domínio de serina protease homólogo aos domínios correspondentes em plasminogênio humano.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ter um domínio de kringle N-terminal homólogo ao kringle 1 ou ao kringle 4 do plasminogênio humano nativo.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem exibir uma atividade fibrinolítica que é inibida pela a.2-antiplasmina a uma taxa que é pelo menos de aproximadamente 5 vezes mais rápida do que a taxa de inibição da atividade fibrinolítica da miniplasmina pela a2-antiplasmina. A taxa de inibição pela a2-antiplasmina também pode ser de pelo menos aproximadamente 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes ou 40 vezes maior do que a taxa de inibição da miniplasmina.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ser ligar à lisina imobilizada. A lisina imobilizada pode ser a lisina ligada a uma matriz de suporte sólido selecionada do grupo que consiste de lisina -agarose, lisina -BIOGEL (BioRad, Hercules, CA), lisina -HYPERD (Pall Life Sciences, East Hills, NY, a lisina -hidrogel), lisina -SEPHAROSE (SEPHAROSE é a agarose reticulada). A lisina imobilizada pode ser lisina -SEPHAROSE.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem exibir uma menor afinidade de Ügação por fibrinogênio do que a afinidade de ligação para o fibrinogênio da minipiasmina Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem exibir uma maior afinidade de ligação por fibrina parcialmente clivada de minipiasmina.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ter um único domínio de kringle N-terminal localizado em um sítio de ativarão de plasminogênio e de um domínio de serina protease de plasminogênio, em que o domínio de kringle tem pelo menos um resíduo de identidade de seqüência de aminoácido maior com do kringle 1 ou do kringle 4 do plasminogênio humano nativo do que com o kringle 5 do plasminogênio humano nativo. Para estas modalidades, será entendido que as substituições conservadoras das regiões de kringle dos polipeptídeos da invenção, relativas às seqüências nativas dos kringles 1 e 4 do plasminogênio humano, seriam consideradas como diferentes das seqüências nativas para as finalidades da comparação de identidade com o kringle 5.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos podem ter uma seqüência de aminoácido com apresentada na ID SEQ N°: 2 e substituições conservadoras das mesmas. Os polipeptídeos podem ter um resíduo a uma posição relativa análoga àquela da posição 76 de uma seqüência de amino-ácido apresentada na ID SEQ N°: 2 que é arginina.

Em um outro aspecto, a invenção inclui vetores que compreendem os polinucleotídeos da invenção e células hospedeiras cultivadas que compreendem os vetores.

Breve Descrição das Ilustrações A figura 1 é uma representação esquemática de plasmina nativa depois da ativação por proteolítica . K1-K5 são as regiões de kringle 1-5 e SP é o domínio da serina protease. "a2-AP" é o sítio de ligação da a2-anti-plasmina no kringle 1. A figura 2 é uma representação esquemática de um mutante da invenção de deleção de plasminogênio que usa a mesma nomenclatura que na figura 1 e que apresenta a deleção de K2-5. A figura 3 apresenta a seqüência de aminoácido plasminogênio humano, que apresenta a seqüência líder de 19 resíduos numerados de -19 até -1 e a sequência de plasminogênio apresentada como os resíduos 1-791 (Ver ID SEQ N°: 3 (seqüência de cDNA para plasminogênio humano) e a ID SEQ N°: 4, a seqüência de aminoácido codificada, como apresentada na figura 3). Algumas características são apresentadas, inclusive as seguintes: a seqüência de delta-plasminogênio (sombreada); domínios de kringle 1-5 (sublinhado duplo); sítios de glicosilações Asjq289 e Thr346 íem negrito); o sítio de ativação (em negrito) Arg-Val de plasminogênio e sítios de ligação de lisina no kringle 1 (em sublinhado e com numeração de posição específica). A figura 4 apresenta comparações de seqüência de polipeptídeo entre os cinco domínios de kringle (1-5) de plasmina (plasminogênio) humano nativo. Os resíduos de aminoácido que são idênticos aos da mesma posição relativa no kringle 1 são apresentados em sublinhado. A figura 5 apresenta um gradiente de 8-25% de SDS-PAGE de uma preparação de delta-plasminogênio não reduzida (Pista 1) e reduzida (Pista 2). A ativação de delta-plasminogênio na delta-plasmina com estrep-toquinase (Pista 3), Ativador de Plasminogênio de tecido (tPA) (Pista 4) e uroquinase (Pista 5) resulta na formação da molécula de duas cadeias que consiste de kringle 1 (K1) e do domínio da serina protease (SP) ligados por duas pontes de dissulfeto. A figura 6 é uma representação gráfica de ativação de delta-plasminogênio por uroquinase. A uroquinase (5,8 nM) foi adicionada a uma solução de delta-plasminogênio 5 μΜ em PBS que contém S-2251 1,0 mM a 37 °C. Os aumentos na absorbância for a monitorados a 405 nm. A figura 7 é um cromatograma que apresenta à ligação de delta-plasminogênio a lisina -SEPHAROSE 4B: 0,5 mg de Delta-plasminogênio purificado foi aplicado à coluna de lisina -SEPHAROSE 4B (1x3 cm) equilibrada com o soro fisiológico Tris-tamponado, pH 7,4. A proteína ligada foi eluída da coluna por um gradiente de 0-20 mM de ácido ε-aminocapróico (ε-ACA) como um único pico. A absorbância a 280 nm e a concentração de ε-ACA, como uma função do volume do efluente são apresentados no gráfico. A figura 8 apresenta a ligação de delta-plasminogênio à fibrina. Concentrações variáveis de delta-plasminogênio foram incubadas com coá- gulos de fibrina em uma placa de microtítulo durante 1 hora a 37°C. Depois da incubação os coágulos foram lavados extensivamente com PBS e foi adicionada uma solução de 0,1 mg/ml de tPA a cada cavidade. Depois de uma incubação durante 2 horas a 37°C o líquido foi removido e os coágulos sólidos restantes foram reconstituídos com 100 μΙ de NaOH 1 Μ. A quantidade de fibrina restante foi avaliada quantitativamente pela medida da absorbân-cia a 280 nm destes coágulos reconstituídos. Ò grau de fibrinólise, que é üm resultado da ligação de delta-plasminogênio à fibrina, foi comparado no gráfico como uma função da concentração de delta-plasminogênio (linha cheia). A linha pontilhada representa a melhor ajuste de dados experimentais a uma equação de ligação. A figura 9 apresenta um gradiente de 8-25% de SDS-PAGE de delta-plasminogênio de partida sob condições não reduzidas (Pista 1) e reduzidas (Pista 2) e preparação final de delta-plasmina, também sob condições não reduzidas (Pista 3) e reduzidas (Pista 4). A figura 10 apresenta diagramas esquemáticos de plasmina, de miniplasmina, de microplasmina e de delta-plasmina, juntamente com uma caracterização correspondente de atividade enzimática (k^t e KM em relação ao substrato S-2251 (D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH)). A figura 11 é uma representação gráfica de lise induzida por delta-plasmina de coágulos de sangue integral retraídos. Cada coágulo (0,8 x 7 cm) foi injetado com um volume de 1 ml de veículo (soro fisiológico acidifica-do, pH 3,6), plasmina (1,0 mg/ml) ou delta-plasmina (0,44 mg/ml) e foi deixada se processar a dissolução do coágulo a 37 °C durante 1 hora.

Descrição da invenção Para fornecer uma molécula simples, não-glicosilada que tivesse as propriedades de ligação à fibrina e à antiplasmina da plasmina de comprimento total, a presente invenção fornece um mutante de deleção de plasminogênio. Neste mutante, aqui denominado delta-plasminogênio, pelo menos uma parte da seqüência de aminoácido nativo entre um domínio homólogo ao kringie 1 e ao sítio de ativação é deletada. Em um aspecto, o domínio homólogo ao domínio de kringie 1 nativo de plasminogênio humano pode estar ligado diretamente à parte de serina protease do plasminogênio ou um homólogo, um análogo funcional do mesmo, com substancialmente apenas a seqüência nativa de intervenção que contém o sítio de ativação do plasminogênio permanecendo entre os domínios. O Delta-plasmin (ogênio) de acordo com a presente invenção pode ser caracterizado por: o peso molecular mais baixo (37.198 Da) de del-ta-plasmina pode resultar em maior atividade específica (por mg de proteína); a falta de pelo menos dois sítios de glicosilação encontrados na proteína nativa (Ver figura 3), combinada com o peso molecular relativamente baixo, pode facilitar a produção recombinante desta proteína utilizando-se sistemas de expressão de bactérias e de levedura relativamente econômicos; o delta-plasminogênio pode ser ativado por ativadores de plasminogênio tPA, uro-quinase e estreptoquinase; a presença do domínio homólogo ao kringle 1 nativo preserva as propriedades de ligação com a fibrina da plasmina o que pode ser importante para a eficiência trombolítica; a presença dos sitos de ligação com a a2-antiplasmina no domínio homólogo ao kringle 1 pode permitir que a delta-plasmina seja inibida rapidamente por este inibidor fisiológico de plasmina (uma característica que pode evitar hemorragia); o menor tamanho da delta-plasmina pode facilitar a sua inibição pela a2-macro-globulina, diminuindo ainda mais a chance de complicações por hemorragia relativas à plasmina. Em modalidades em particular, a ausência de kringle 5, que mantém o sítio de ligação primário para o fibrin (ogênio) intacto, não digerido, pode permitir o uso de delta-plasmina com esgotamento reduzido de fibrinogênio em circulação.

Geralmente, a invenção fornece moléculas de plasmin (ogênio) recombinante que tenham uma única região N-terminal de kringle ao sítio de ativação e ao domínio de serina protease, tendo certas vantagens relativas a mini-plasmin (ogênio). Embora os polipeptídeos de delta-plasminogênio da invenção tenham apenas uma região de kringle, como tal, N-terminal ao sítio de ativação, algumas modalidades incluem seqüências adicionais N-ter-minais ao sítio de ativação. As seqüências adicionais N-terminais podem ser derivadas daquelas de regiões nativas de kringle de plasminogênio.

Os domínios N-terminais de kringle da presente invenção inclu- em seqüências de kringle dos kringles 1 e 4 de plasmin (ogênio) nativo e de equivalentes funcionais dos mesmos. Em particular, vide a discussão a seguir que fornece orientação em relação à preservação da função em variantes de polipeptídeo, inclusive a preservação dos resíduos que participam na ou que influenciam a ligação com lisina.

Definições Os termos "domínio" e "região" de um polipeptídeo são geralmente sinônimos como usado neste caso, a não ser se for indicado ao contrário. Quando citados juntamente com designações estruturais ou funcionais bem reconhecidas tais como "kringle" ou "serina protease" etc., tais termos irão introduzir uma característica de polipeptídeo que se refere a pelo menos algum (s) característica (s) comumente reconhecida (s) e entendida (s) como estando associadas com as estruturas do polipeptídeo correspondentes a tais designações.

Uma "célula hospedeira cultivada," como usado neste caso, refe-re-se a uma célula pró-cariótica ou eucariótica que contém DNA heterólogo que foi introduzido na célula por qualquer meio, por exemplo, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, microtnjeção, transformação, infecção viral e similares. "Heterólogo" como usado neste caso significa "de origem natural diferente" ou que representa um estado não natural. Por exemplo, se uma célula hospedeira cultivada for transformada com um DNA ou com um gene derivado de um outro organismo, particularmente de uma outra espécie, a-quele gene é heterólogo em relação àquela célula hospedeira cultivada e também em relação aos descendentes da célula hospedeira cultivada que contém aquele gene. Similarmente, "heterólogo" refere-se a uma seqüência de nucleotídeo derivada de e inserida no mesmo tipo de célula original, natural, porém que está presente em um estado não natural, por exemplo, um número de cópia diferente ou sob o controle de diferentes elementos reguladores.

Uma molécula de "vetor" é uma molécula de ácido nucléico na qual pode ser inserido um ácido nucléico que pode então ser introduzido em uma célula hospedeira cultivada apropriada. Os vetores de preferência têm uma ou mais origens de replicação e um ou mais sítios nos quais pode ser inserido o DNA recombinante. Os vetores freqüentemente têm meios convenientes pelos quais as células com vetores podem ser selecionadas entre aquelas sem, por exemplo, que elas codifiquem genes de resistência à fár-maco. Os vetores comuns incluem plasmídeos, genomas virais e (principalmente em leveduras e em bactérias) "cromossomcTs artificiáis.1' Como usado neste caso, o termo "seqüência de controle trans-cricional" refere-se a seqüências de ácido nucléico, tais como seqüências de iniciador, seqüências de melhoradores e seqüências de promotores, que induzem, reprimem ou então controlam a transcrição de seqüências de ácido nucléico que codificam proteína à qual elas estão operavelmente ligadas. O termo "polipeptídeo" é usado intercambiavelmente neste caso com os termos "peptídeo" e "proteína." Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico” são usados intercambiavelmente neste caso e podem se referir a qualquer ácido nucléico que contenha a informação necessária para a finalidade indicada pelo contexto. Isto é, o ácido nucléico ser DNA ou RNA, seja de filamento simples ou de filamento duplo ou ácido nucléico, desde que o polímero seja capaz de representar a informação apropriada, por exemplo, em relação a um peptídeo codificado e pode incluir seqüências complementares, por exemplo, filamentos sentido e filamento antissentido de polímeros de ácido nucléico. O termo "variante" de um polipeptídeo refere-se a uma seqüência de aminoácido que é alterada por um ou mais aminoácidos. A variante pode ter mudanças "conservadoras", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas similares, por exemplo, substituição de leucina por isoleucina. Alternativamente, uma variante pode ter mudanças "não conservadoras", por exemplo, substituição de uma glicina por um triptó-fano. Uma variação mínima análoga também pode incluir deleção ou inserção de aminoácido ou ambas. Uma forma especial de uma "variante" de polipeptídeo é um polipeptídeo "funcionaImente equivalente", isto é, um polipeptídeo que exiba atividade in vivo ou in vitro substancia Imente similar aos exemplos do polipeptídeo da invenção, como descrito com mais detalhe a seguir. Pode ser encontrada orientação para a determinação de quais resí- duos de aminoácido podem ser substituído, inseridos ou deíetados sem eliminar a atividade biológica ou imunológica usando-se programas de computador bem-conhecidos na técnica, por exemplo, software DNASTAR (DNAS-TAR, Inc., Madison, Wí). Além disso, é fornecida a seguir uma orientação específica, inclusive aquela fornecida dentro das referências citadas que es- Os termos "N-terminal" e "C-terminal" são usados neste caso para designar a posição relativa de qualquer seqüência de aminoácido ou de domínio de polipeptídeo ou estrutura à qual eles são aplicados. O posicionamento relativo será evidente pelo contexto. Isto é, uma característica "N-terminal" estará localizada pelo menos mais próxima ao N-terminal da molécula de polipeptídeo do que uma outra característica discutida no mesmo contexto (a outra características possível denominada "C-terminal" em relação à primeira característica). Similarmente, os termos ”5’-" e "3’-” podem ser usados neste caso para designar posições relativas de características de polínucleotídeos.

Os polipeptídeos delta-plasminogênio/plasmina aqui citados como tendo um domínio N-terminal "homólogo a um domínio de kringle do plasminogênio humano nativo" exibem características estruturais e funcionais similares aos domínios nativos de kringle de plasminogênio. Além disso, os delta-plasminogênio/plasmina aqui citados como tendo um domínio N-terminal "homólogo ao kringle 1" exibem características similares ao kringle 1 nativo, pelo menos até a extensão que os polipeptídeos podem ter uma maior afinidade pelos ácidos ω-aminocarboxílicos (e homólogos funcionais tais como o ácido frans-4-aminometilciclohexano-1-carboxílico, um ácido cíclico) do que kringle 5. vide, por exemplo, Chang, Y.e outros, Biochemistry 37: 3258-3271 (1998), aqui incorporado como referência, para condições e protocolos para comparação de ligação de domínios isolados de polipeptídeo de kringle a ácido 5-aminopentanóico (5-APnA); ácido 6-aminohe-xanóico (6-AHxA), também conhecido como ácido e-aminocapróico (eACA); ácido 7-aminoheptanóico (7-AHpA) e ácido frans-4-aminometilciclohexano-1-carboxílico (t-AMCHA).

As referências a domínios de kringle "homólogos ao kringie 4” são definidas similarmente, como observado acima em relação à expressão "homólogo ao kringle 1." Isto é, elas exibem características funcionais similares a kringle 1 do plasminogênio humano nativo como discutido acima. Estes polipeptídeos também se ligam à lisina imobilizada como descrito acima.

Os polipeptídeos da invenção se ligam à lisina imobilizada. Como usado neste caso, a expressão "ligação à lisina imobilizada" significa que os polipeptídeos assim caracterizados são retardados em seu progresso em relação ao miniplasminogênio quando sujeitos a uma cromatografia em coluna que usa lisina -SEPHAROSE como o meio cromatográfico. Tipicamente, os polipeptídeos da invenção podem ser eluídos de tais meios cromato-gráficos (resinas com afinidade com lisina) usando-se soluções que contêm o ligando específico, por exemplo, cACA, como eluentes.

Além disso, além de Chang e outros, acima, outras referências podem ser consultadas pelos versados na técnica para determinar quais resíduos podem ser variados por substituição conservadora ou não conservadora, deleção ou adição para fornecer um mutante por deleção dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, as referências a seguir fornecem informação referentes, em particular aos resíduos dos domínios nativos de kringle que podem ser importantes para a ligação de ácidos ω aminocar-boxílicos: Patente U.S. N°. 6.538.103 de Ji e outros; Patente U.S. N°. 6.218.517 de Suzuki; Douglas, J.T.e outros, Biochemistry 41 (10) :3302-10 (2002); Zajicek, J.e outros, J. Mol. Biol., 301 (2) : 333-47 (2000); Lee, H.e outros, Arch Biochem Biophys., 375 (2): 359-63 (2000); Castellino, F. e S. McCance, Ciba Found Symp. 212 : 46-60 (1997); McCance, S.e outros, J. Biol. Chem., 269 : 32405-32410 (1994); Rejante, M.R. e M. Llinas, Eur. J. Biochem., 221 (3 ) :939-49 (1994); Wu, T.P.e outros, Blood Coagul. Fibri-nolysis, 5(2 ) : 157-66 (1994); Hoover, C.J.e outros, Biochemistry, 32 (41) : 10936-43 (1993); Menhart, N.e outros, Biochemistry, 32:8799-8806 (1993); Thewes, T.e outros, J. Biol. Chem., 265 3906-3915 (1990); Novokhatny, V.e outros, Thromb Res., 53(3):243-52 (1989); Motta, A.e outros, Biochemistry, 26(13):3327-36 (1987); Novokhatny, V.e outros, J. Mol. Biol., 779:215-232 (1984); Lerch, P.G.e outros, Eur. J. Biochem., 107(1):7-13 (1980); Sottrup-Jensen, L.e outros, Prog. Chem. Fibrinol. Thrombol., 3:191-209 (1978); e Wirrtan, B. e D. Colfen, Nature 272, 549-545 (1978), tudo aqui incorporado como referência em sua totalidade.

Pelo fato de os presentes inventores terem reconhecido que pode ser preparada uma molécula valiosa, de plasmin (ogênio) simplificada que tem um domínio de kringie N-terminal tendo características funcionais vantajosas (que pode ser avaliada, em parte, por testagem para a ligação de lisina imobilizada cõmo aqui descrito), a presente íhvênçãõ’ pode ã&fãngér' outros domínios ou regiões N-terminais de ligação com fibrina ao sítio de ativação. Por exemplo, a invenção pode incluir polipeptídeos em que o domínio de plasmina da serina protease está ligado a um kringie de ligação de fibrina selecionado do grupo que inclui, porém não limitado a, kringie 4 de plasminogênio humano, kringie 2 de tPA, ou um kringie de apolipoproteína (a). Além disso, a invenção pode incluir polipeptídeos em que um domínio de plasmina de serina protease esteja ligado a quaisquer outros módulos de ligação de fibrina conhecidos, tal como o domínio "finger" de tPA ou de fibro-nectina, ou o fragmento FAB de IgG fibrina-específico.

Em modalidades em particular, os resíduos em certas posições do domínio de kringie N-terminal de delta-plasminogênio são conservados em relação ao kringie 1 de plasminogênio humano nativo. Estes podem ser os resíduos nas posições associadas com a ligação de lisina e incluem Pro136-Pro140, Pro143-Tyr146, e Arg153-Tyr156 (posições numeradas como apresentado na figura 3). Algumas modalidades do delta-plasminogênio da invenção podem ter Arg na posição 153. Em outras modalidades, as posições específicas dos citados resíduos podem variar um pouco enquanto ainda estão presentes no polipeptídeo em posições estruturalmente e funcionalmente análogas (isto é, em relação à estrutura de kringie do domínio N-terminal; vide Chang, Y. e outros, como discutido acima). Em algumas modalidades, a região kringie região N-terminal do polipeptídeo delta plasmin (ogênio) tem pelo menos uma identidade residual maior de resíduo com kringie 1 ou kringie 4 do plasminogênio humano nativo do que com kringie 5 do plasminogênio humano nativo .

Adicionalmente, as modalidades em particular da invenção podem ser caracterizadas funcionalmente por contraste com mini-plasmin (o- gênio) que tem composição de domínio similar, é. kringle-serina protease (K-SP) (Ver Sottrup-Jensen, L.e outros, Progress in Chemical Fibrinolysis e T-hrombolysis, Vol. 3, (Eds: J. F. Davidson, et aí) Raven Press, New York (1978)). Em modalidades preferidas, o delta-plasmina da invenção exibe uma maior taxa de inibição por a2-antiplasmina, por exemplo, tanto quanto aproximadamente uma ou duas ordens de grandeza mais rapidamente do que a taxa de inibição da miniplasmina. Além disso, em modalidades em particular, a delta-plasmina se liga a lisina imobilizada (por exemplo, lisina -SEPHAROSE). A caracterização do domínio de kringle de delta-plasminogênio como "N-terminal" significa apenas que o domínio está presente N-terminal ao sítio de ativação e não significa que não estão presentes os resíduos de aminoácidos adicionais N-terminais ao próprio domínio. Além disso, o número e a identidade dos resíduos interpostos entre o domínio homólogo ao kringle 1 e o sítio de ativação de plasminogênio pode ser variada sem sair do escopo da presente invenção. Um versado na técnica será capaz de determinar estas variações que alcançam as vantagens da invenção (ligação semelhante a kringle 1 de ácidos ω aminocarboxílicos, sem aumento substancial no tamanho da deleção mutante ou introdução de sítios de glicosilação potencialmente problemáticos) sem experimentação indevida baseado na descrição neste caso e nas referências aqui citadas para orientação em relação à função e à estrutura de kringle 1.

Conseqüentemente, a invenção refere-se a polínucleotídeos, polipeptídeos, métodos recombinantes para a produção dos polipeptídeos, vetores contendo os polínucleotídeos, sistemas de expressão para a produção dos polipeptídeos e células hospedeiras cultivadas que compreendem tais sistemas de expressão.

Como observado, em um aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo aqui descrito ou um polipeptídeo que tem substituições conservadoras de aminoácido do mesmo. A orientação em relação à seleção de substituições "conservadoras" de aminoácido é fornecida com mais detalhe a seguir. Em uma modalidade, o polinucleotídeo é DNA.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo de obtenção de um vetor que compreende inserir o poiinucleotídeo da invenção em um vetor. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um vetor produzido pelo processo da invenção.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo de obtenção de uma célula hospedeira cultivada que compreende introduzir o vetor da invenção em uma célula hospedeira cultivada. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma célula hospedeira cultivada produzida pelo processo da invenção.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídeo isolado da invenção, produzido por um método que compreende: (a) introduzir um vetor que compreende um poiinucleotídeo que codifica o polipeptídeo em uma célula hospedeira cultivada; (b) cultura da célula hospedeira; e (c) recuperação do polipeptídeo. Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a produção de um polipeptídeo que compreende: (a) cultura da célula hospedeira da invenção sob condições que o vetor está expresso; e (b) recuperação do polipeptídeo.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a células que contêm pelo menos um poiinucleotídeo da invenção.

Em uma modalidade, o poiinucleotídeo compreende a seqüência de nucleotídeo como apresentada na ID SEQ N°: 1. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido como apresentada na ID SEQ N°: 2.

Polinucleotídeos Os polinucleotídeos da invenção incluem variantes que têm substituições, deleções, e/ou adições que possam envolver um ou mais nu-cleotídeos. As variantes podem ser alteradas em regiões de codificação, em regiões de não codificação ou em ambas. As alterações nas regiões de codificação podem produzir substituições, deleções ou adições conservadoras ou não conservadoras em um aminoácido. Especialmente preferidas entre estas estão as substituições, adições e deleções silenciosas, que não alteram as propriedades e as atividades da proteína delta-plasmin (ogênio) ou partes da mesma. Também especialmente preferidas sob este aspecto são as substituições conservadoras (Ver a seguir).

Outras modalidades da invenção incluem moléculas de ácido nucléico que compreendem um polinucleotídeo que tem uma seqüência de nucleotídeo pelo menos 90% idêntica e mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico a (a) a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo delta-plasminogênio que tem a seqüência de aminoá-cido completa em ID SEQ N°: 2; (b) a seqüência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo delta-plasminogênio que tem a seqüência de aminoácido em ID SEQ N°: 2; e (c) a seqüência de nucleotídeo complementar a qualquer uma das seqüências de nucleotídeo em (a) ou (b) acima.

Por um polinucleotídeo que tem uma seqüência de nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma seqüência de referência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo a delta-plasminogênio pretende-se que a seqüência de nucleotídeo do polinucleotídeo seja idêntica à seqüência de referência exceto que a seqüência de polinucleotídeo pode incluir até cinco mutações de ponto para cada 100 nucleotídeos da seqüência de referência de nucleotídeo que codifica o polipeptídeo delta-plasminogênio. Em outras palavras, para se obter um polinucleotídeo que tenha uma seqüência de nucleotídeo de pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de nucleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeos na seqüência de referência podem ser deletados ou substituídos por um outro nucleotídeo ou um número de nucleotídeos de até 5% dos nucleotídeos totais na seqüência de referência pode ser inserido na seqüência de referência. Estas mutações da seqüência de referência podem ocorrer nas posições 5’ ou 3’ terminal da seqüência de referência de nucleotídeo ou em qualquer ponto entre estas duas posições terminais, interspersas individualmente entre nucleotídeos na seqüência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Como observado acima, duas ou mais seqüências de polinucleotídeo podem ser comparadas por determinação de sua identidade percentual. Duas ou mais seqüências de aminoácido similarmente podem ser comparadas por determinação de sua identidade percentual. A identidade percentual de duas seqüências, sejam seqüências de ácido nucléico ou de peptí- deo, é geralmente descrita como o número de combinações exatas entre duas seqüências alinhadas dividido pelo comprimento da seqüência mais curta e multiplicado por 100, Um alinhamento aproximado para seqüências de ácido nucléico é fornecido pelo algoritmo de homologia locai de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Este algoritmo pode ser estendido para uso com seqüências de peptídeo que usam a matriz de medição desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, Μ. O. Dayhoff ed., 5 supl. 3 : 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, e normalizadas porGribskov, Nucl. Acids Res. 74(6):6745-6763 (1986). Uma implementação deste algoritmo para seqüências de ácido nucléico e de peptídeo é fornecida pelo Ge-netics Computer Group (Madison, Wis.) em sua aplicação de instalação BESTFIT. Os parâmetros pré-estabelecidos para este processo são descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Versão 8 (1995) (disponível pelo Genetics Computer Group, Madison, Wis.).

Evídentemente, em virtude da degenerescêncta do código genético, um versado na técnica irá imediatamente reconhecer que um grande número de moléculas de ácido nucléico que tenham uma seqüência de menos 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência de ácido nucléico apresentada na ID SEQ N°: 1 irá codificar um polipeptídeo delta-plasminogênio. De fato, sendo que as variantes degeneradas destas seqüências de nucleotídeo todas codificam o mesmo polipeptídeo, isto será evidente ao versado na técnica até mesmo ser realizar ensaios funcionais ou medidas aqui descritas. Será também reconhecido na técnica que, para tais moléculas de ácido nucléico que não são variantes degeneradas, um número razoável também irá codificar um polipeptídeo que tem atividade de polipeptídeo delta-plasminogênio. Isto é porque o versado na técnica é completamente ciente de substituições de aminoácido que são menos prováveis ou não são prováveis de efetuar significativamente a função da proteína (por exemplo, substituindo-se um aminoácido alifático com um segundo aminoácido alifático).

Recentemente, avanços na produção sintética de seqüências de polinucleotídeo mais longas permitiram a produção sintética de ácidos nu- cléicos que codificam significativamente polipeptídeos mais tongos sem o uso de técnicas tradicionais de clonagem. Os fornecedores comerciais de tais serviços incluem Blue Heron, Inc., Bothell, WA (http://www.blueheronbio.com). A tecnologia utilizada por Blue Heron, Inc. está descrita na Patente U.S. N°s. 6.664.112; 6.623.928; 6.613.508; 6.444.422; 6.312.893; 4.652.639; Pedido de Patentes Publicadas Internacionais (Publicações N°s.) WO03054232A3; WO0194366A1; WO9727331A2 e WO9905322A1, todos incorporados neste caso como referência.

Evidentemente, técnicas tradicionais de biologia molecular, mi-crobiologia e ácido nucléico recombinante também podem ser usadas para produzir os polinucleotídeos da invenção. Estas técnicas são bem-conhecidas e são explicadas, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausebel, ed., Vols. I, II e III (1997); Sambrooke outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edição, Cold Spring Harbor Labo-ratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); DNA Cloning: A Practical Ap-proach, D. N. Glover, ed., Vols. I e II (1985); Oligonucleotide Synthesis, M. L. Gait, ed. (1984); Nucleic Acid Hybridização, Hames e Higgins, eds. (1985); Transcripção and Translação, Hames e Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R. I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Células e Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning”; the series, Methods in Enzymology, Academic Press, Inc. (1984); Gene Transfer Vetores for Mammalian Células, J. H. Miller e Μ. P. Calos, eds., Cold Spring Harbor Laboratory (1987); e Methods in Enzymology, Wu e Grossman e Wu, eds., respectivamente, Vols. 154 e 155, todos aqui incorporados como referência.

Vetores e Células Hospedeiras Cultivadas A presente invenção também refere-se a vetores que incluem as moléculas de ácido nucléico isoladas da presente invenção, células hospedeiras cultivadas que são engenheiradas geneticamente com os vetores re-combinantes e a produção do polipeptídeo delta-plasmin (ogênio) por técnicas recombinantes.

Construções recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras cultivadas usando-se técnicas bem-conhecidas tais como infecção, transdução, transfecção, transvecção, eletroporação e transformação. O vetor pode ser, por exemplo, um fago, um plasmídeo um vetor viral ou re-troviral. Vetores retrovirais podem ser replicação competentes ou replicação defeituosos. Neste último caso, geralmente irá ocorrer propagação viral apenas na complementação de células hospedeiras cultivadas.

Os polinucleotídeos podem ser associados a um vetor que contém um marcador selecionável para a propagação em um hospedeiro cultivado. Geralmente, um vetor de plasmídeo é introduzido em um precipitado, tal como em um precipitado de fosfato de cálcio ou em um complexo com um lipídeo carregado. Se o vetor for um vírus, ele pode ser embalado in vitro usando-se uma linhagem de célula bem apropriada e então transduzida em células hospedeiras cultivadas.

Preferidos são os vetores que compreendem regiões de controle de c/s-ação para o polinucleotídeo de interesse. Os fatores de trans-ação apropriados podem ser fornecidos pelo hospedeiro cultivado, fornecido por um vetor de complementação ou fornecido pelo próprio vetor depois da introdução no hospedeiro cultivado.

Em certas modalidades sob este aspecto, os vetores são responsáveis por expressão específica, que pode ser induzível e/ou tipo de célula específica. Particularmente preferidos entre tais vetores são aqueles induzíveis por fatores ambientais que são fáceis de serem manipulados, tais como a temperatura e os aditivos nutrientes.

Os vetores de expressão úteis na presente invenção incluem vetores cromossomais-, epissomais- e vírus-derivados, por exemplo, vetores derivados de plasmídeo bacterianos, bacteriófago, epissomos de levedura, elementos cromossomais de levedura, vírus tais como báculovírus, papova vírus, vaccinia vírus, adenovírus, vírus pox de aves, vírus da pseudoraiva e retrovírus e vetores derivados de combinações dos mesmos, tais como cos-mídeos e fagomídeos.

As inserções de DNA deviam estar operativamente ligadas a um promotor apropriado, tal como o promotor lambda PL do fago, os promotores E. coii lac, trp e tac, o SV40 precoce e promotores tardios e promotores de LTRs retrovirais, para citar alguns. Outros promotores adequados serão conhecidos do versado na técnica. As construções de expressão irão conter ainda sítios para iniciação de transcrição, terminação e na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomo para tradução. A parte de codificação dos transcritos maduros expressos pelas construções irão de preferência incluir uma iniciação de tradução no códon de início e de terminação (UAA, UGA ou UAG) apropriadamente posicionado na extremidade do polipeptídeo a ser traduzido.

Como indicado, os vetores de expressão irão de preferência incluir pelo menos um marcador selecionável. Tais marcadores incluem dihi-drofolato redutase ou resistência a neomicina para cultura de célula eucarió-tica e genes de resistência a tetraciclína ou ampicilina para cultura em E. coli e outras bactérias. Exemplos representativos de hospedeiros cultivados a-propriados incluem, mas não estão limitados a, células bacterianas, tais como células de E. coli, Streptomyces e Salmonella typhimurium; células fungais, tais como células de leveduras; células de insetos tais como células de Drosophila S2 e Spodoptera Sf9; células de animais tais como CHO, COS e células de melanoma de Bowes e células de vegetais. Meios de cultura a-propriados e condições para as células hospedeiras cultivadas descritas a-cima são conhecidas na técnica.

Entre os vetores preferidos para uso nas bactérias incluem-se pQE70, pQE60 e pQE-9, disponíveis por Qiagen Inc., Valencia, CA; vetores pBS, vetores PHAGESCRIPT, vetores BLUESCRIPT, pNH8A, pNH16a, p-NH18A, pNH46A, disponível por Stratagene, LaJolla, CA; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis por Pharmacia (atualmente Pfizer, Inc., New York, NY). Entre os vetores eucarióticos preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 e pSG disponíveis por Stratagene e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis por Pharmacia. Outros vetores adequados serão facilmente evidentes ao versado na técnica.

Os promotores bacterianos adequados para uso na presente invenção incluem promotores E. coli lacl e lacZ, os promotores T3 e T7, o promotor gpt, os promotores lambda PR e PL e the promotor trp. Os promotores eucarióticos adequados incluem o promotor precoce imediato CMV, o promotor HSV timidina quinase, os promotores SV40 precoce e tardio, os promotores de LTRs retrovirais, tais como aqueles do vírus de sarcoma de Rous (RSV) e promotores de metalotioneína, tal como o promotor metaiotio-neína-f do camundongo. A introdução de uma construção de vetor na célula hospedeira cultivada pode ser efetuada por transfecção com fosfato de cálcio, por trans-fecção mediada com DÈÀÉ-dextrano, por transfecção mediada com lipídto catiônico, eletroporação, transdução, infecção ou outros métodos. Tais métodos são descritos em muitos manuais de laboratório padronizados, tal como Davis etaL, Basic Methods In Molecular Biology, 2nd Edição (1995). A transcrição do DNA que codifica os polipeptídeos da presente invenção por eucariotes superiores pode ser aumentada por introdução de uma seqüência melhoradora no vetor. Os melhoradores são elementos de ação c/s de DNA, habitualmente aproximadamente desde 10 até 300 pb que agem para aumentar a atividade transcricional de um promotor em um dado tipo de célula hospedeira cultivada. Exemplos de melhoradores incluem o melhorador SV40, que está localizado no lado tardio da origem de replicação a pb 100 até 270, o melhorador do promotor precoce do citomegalovírus, o melhorador de polioma no lado tardio da origem de replicação e melhoradores de adenovírus.

Para secreção da proteína traduzida no lúmen do retículo endo-plásmico, para o espaço periplásmico ou para o ambiente extracelular, sinais de secreção apropriados podem ser incorporados ao polipeptídeo expresso. Os sinais podem ser endógenos ao polipeptídeo ou eles podem ser sinais heterólogos. O polipeptídeo pode ser expresso em uma forma modificada, tal como uma proteína de fusão e pode incluir não apenas sinais de secreção, mas também regiões funcionais adicionais heterólogas. Por exemplo, uma região de aminoácidos adicionais, particularmente de aminoácidos carregados, pode ser adicionada ao N-terminus do polipeptídeo para melhorar a estabilidade e a persistência na célula hospedeira cultivada, durante a purificação ou durante a manipulação e a armazenagem subseqüentes. Além disso, podem ser adicionados porções de peptídeo ao polipeptídeo para facilitar a purificação. Tais regiões podem ser removidas antes da preparação final do polipeptídeo. A adição de porções de peptídeo a polipeptídeos para gerar secreção ou excreção, para melhorar a estabilidade e para facilitar a purificação, entre outras, são técnicas familiares e de rotina na técnica. Uma proteína de fusão preferida compreende uma região heteróloga proveniente da imunoglobulina que é útil para g solubilizagão de proteínas. Por, exemplo, a EP 0 464 533 A1 (contraparte Canadense, 2.045.869) descreve proteínas de fusão que compreendem várias partes de região constante de moléculas de imunoglobulina juntamente com uma outra proteína humana ou parte da mesma. Em muitos casos, a parte Fc em uma proteína de fusão é totalmente vantajosa para uso em terapia e em diagnóstico e assim resulta, por exemplo, em propriedades farmacocinéticas melhoradas. Por outro lado, para alguns usos seria desejável que pudéssemos deletar a parte Fc depois que a proteína de fusão tivesse sido expressa, detectada e purificada da maneira vantajosa descrita. Este é o caso em que a parte Fc prova ser um impedimento para uso em terapia e em diagnóstico, por exemplo, quando a proteína de fusão deve ser usada como antígeno para imunizações. Na descoberta de fármaco, por exemplo, proteínas humanas foram fundidas com partes de Fc com a finalidades de ensaios de seleção de alta circulação de material (tal como o hlL5-receptor, para identificar antagonistas de hlL-5). Vide, Ben-nett, D.e outros, J. Molecular Recognition, 8:52-58(1995) e Johanson, K. et aí, J. BioíChem., 270(16): 9459-9471 (1995). A proteína delta-plasminogênio pode ser recuperada e purificada de culturas de célula recombinantes por métodos bem-conhecidos que incluem aqueles especificamente descritos nos exemplos neste caso. Os polipeptídeos da presente invenção incluem produtos purificados naturalmente, produtos de procedimentos sintéticos e produtos obtidos por técnicas partindo de um hospedeiro cultivado procariótico ou eucariótico, que inclui, por exemplo, células bacterianas, de leveduras, de vegetal superior, de insetos e de mamíferos. Além disso, os polipeptídeos da invenção também podem incluir um resíduo de metionina inicial modificado, em alguns casos como um resultado de processos mediados por hospedeiro.

Polipeptídeos Os polínucleotídeos da invenção incluem aqueles que codificam variações e exemplos especiais dos polipeptídeos da invenção. Por exemplo, orientação referente a com obter substituições em aminoácidos fenotipi-camente silenciosas é fornecida em Bowie, J. U. et aí, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990), em que os autores indicam que as proteínas são surpreendente mente tolerantes quanto a substituições dè ãmihoâcídõ. Embora qualquer número de substituições dentro do escopo da invenção possa ser obtida pela aplicação de tais princípios gerais, para orientação específica referente a substituições, as referências aqui citadas em relação à estrutura e a função de domínios de kringle 1 podem ser consultadas por um versado na técnica.

Será ainda melhor considerado que, dependendo dos critérios usados, a "posição" exata do kringle 1, do sítio de ativação e dos domínios de serina protease do polipeptídeo delta-plasminogênio pode diferir ligeiramente em variações especiais dentro do escopo da presente invenção. Por exemplo, a localização exata do domínio de kringle 1 em relação ao sítio de ativação pode variar ligeiramente e/ou a seqüência N-terminal ao domínio de kringle 1 pode variar em comprimento. Assim, a invenção inclui tais variações do polipeptídeo delta-plasminogênio que exibem a atividade do polipeptídeo delta-plasminogênio como aqui divulgado. Tais variantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições e substituições. Como indicado acima, as orientações referentes a quais mudanças de aminoácido são prováveis de serem fenotipicamente silenciosas podem ser encontradas em Bowie, J. U.e outros, "Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions," Science 247:1306-1310 (1990).

Assim, fragmentos, derivados ou análogos do polipeptídeo da ID SEQ N°: 2 podem ser (i) uns em que um ou mais dos resíduos de aminoácido (por exemplo, 3, 5, 8, 10, 15 ou 20) são substituídos com um resíduo de aminoácido conservado ou não conservado (de preferência um resíduo de aminoácido conservado). Tais resíduos de aminoácido substituídos podem ou não ser codificados pelo código genético ou (ii) uns em que um ou mais dos resíduos de aminoácido inclui um grupo substituinte (por exemplo, 3, 5, 8, 10, 15 ou 20) ou (iii) uns em que o polipeptídeo maduro é fundido com um outro composto, tal como um composto para aumentar a meia vida do polipeptídeo (por exemplo, polietileno glicol) ou (iv) uns em que os aminoácidos adicionais estão fundidos ao polipeptídeo maduro, tal como um peptídeo da região de fusão de IgG Fc ou seqüência líder ou de secreção ou uma se-qüência que é empregada para purificação do polipeptídeo maduro ou uma seqüência de pró-proteína. Tais fragmentos, derivados e análogos são considerados como estando dentro do escopo daqueles versados na técnica pelos versados na técnica.

Como indicado, as mudanças são de preferência de uma natureza de mínima importância, tais como substituições conservadoras de aminoácido que não afetam significativamente a dobra ou a atividade da proteína. Evidentemente, o número de substituições de aminoácido que um versado na técnica faria depende de muitos fatores, inclusive aqueles descritos acima. De modo geral, o número de substituições para qualquer dado polipeptídeo delta-plasminogênio não será mais do que 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 5 ou 3.

Os aminoácidos no polipeptídeo delta-plasminogênio da presente invenção que são essenciais para a função podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mu-tagênese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Este último procedimento introduz mutações simples de alanina em cada resíduo na molécula. As moléculas de mutante resultantes são então testadas para atividade biológica, por exemplo, como apresenta nos exemplos aqui fornecidos. Os sítios que são críticos para ligação com ligando também podem ser determinados por análise estrutural tal como cristalização, ressonância nuclear magnética ou marcação por fotoafinidade (Smith e outros, J. Mol. Biol. 224: 399-904 (1992) e de Vos e outros, Science 255:306-312 (1992)). Até mesmo se a deleção de um ou mais aminoácidos do N-terminus de uma proteína resultar na modificação ou na perda de uma ou mais funções biológicas da proteína, outras atividades biológicas ainda podem ser mantidas. É também considerado que os polipeptídeos úteis na produção dos "polipeptídeos isolados" da invenção podem ser produzidos por métodos sintéticos em fase sólida. Vide Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sei, USA 82 :5131-5135 (1985); e Patente U.S. N°. 4.631.211 de Houghten e outros, (1986).

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser fornecidos em uma forma isolada, .Por "polipeptídeo isolado” entendo se um -poftpeptfdeo removido de seu ambiente nativo. Assim, um polipeptídeo produzido e/ou contido em uma célula hospedeira cultivada recombinante é considerado isolado para fins da presente invenção. Também pretendidos como um "polipeptídeo isolado" são os polipeptídeos que foram purificados, parcial ou substancialmente de um hospedeiro cultivado recombinante.

Os polipeptídeos que têm uma seqüência de aminoácido de uma identidade percentual indicada a uma seqüência de aminoácido de referência de um polipeptídeo delta-plasminogênio polipeptídeo podem ser determinados usando-se os métodos, inclusive métodos auxiliados por computador, indicados acima em relação aos polinucleotídeos. As seqüências de aminoácido de polipeptídeo são examinadas e comparadas da mesma forma que as seqüências de nucleotídeo da discussão anterior. Um versado na técnica irá reconhecer que tais conceitos como os pontos finais moleculares discutidos para polinucleotídeos terão análogos diretos quando se considera o uso correspondente de tais métodos e programas para análise de polipeptídeos. Por exemplo, as correções manuais discutidas referentes aos polinucleotídeos referem-se aos pontos finais de 5’ e 3’ de ácidos nucléicos, porém a mesma discussão será reconhecida como aplicável a N-termini e C-termini de polipeptídeos. A invenção abrange polipeptídeos delta-plasminogênio que são modificados diferencialmente durante ou depois da tradução, por exemplo, por giicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, divagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular etc.. Qualquer uma de numerosas modificações químicas pode ser realizada por técnicas conhecidas, incluindo porém não limitada a divagem química específica por brometo de cianogênio, tripsina, quimiotripsina, papatna, S. aureus V8 protease, NaBH4; acetilação, formilação, oxidação, redução; síntese metabólica na presença de tunícamicina etc..

As modificações pós-tradução adicionais abrangidas pela invenção incluem, por exemplo, cadeias de carboidrato ligadas a N ou ligadas a O, processamento de extremidades de N-terminal ou de C-terminal), ligação de porções químicos à cadeia principal de aminoácido, modificações químicas de cadeias de carboidrato ligadas a N ou ligadas a O e adição de um resíduo de metionina N-terminal como um resultado de vetores e construções adaptados para expressão de polipeptídeos delta-plasminogênio em células hospedeiras cultivadas procarióticas. Os polipeptídeos também podem ser modificados com uma marcação detectável, tal como uma marca enzimática, fluorescente, isotópíca ou de afinidade para permitir a detecção e o isolamento da proteína.

Composições Farmacêuticas e Métodos de Tratamento O delta-plasmin (ogênio) pode ser formulado para uso terapêutico de acordo com os métodos e as composições descritos na US 2003/0012778 A1; e Novokhatny, V.e outros, J. Thromb. Haemost. 1(5) :1034-41 (2003), ambos aqui incorporados como referência. Por exemplo, uma solução tamponadora de baixo pH (de desde aproximadamente 2,5 até aproximadamente 4), de baixa capacidade de tamponamento pode ser para a formulação de delta-plasmina. Adicionalmente, outros métodos e formulações conhecidas dos versados na técnica, como realizados com plasmina, miniplasmina e/ou microplasmina, podem ser usados para formular a delta-plasmina da invenção para administração terapêutica. O delta-plasmin (ogênio) pode ser usado para tratar uma variedade de doenças ou de condições trombóticas, por exemplo, de acordo com os métodos como descritos na Patente U.S. N° 6.355.243 e Pedidos de Patente U.S. publicados N°s.US 2003/0026798 A1; US 2003/0175264 A1, todos aqui incorporados como referência. Novamente, como com as formulações farmacêuticas possíveis aplicáveis a delta-plasmina, a delta-plasmina também pode ser administrada terapeuticamente por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles que podem ser realizados normalmente com plasmina, miniplasmina, e/ou microplasmina.

EXEMPLOS

Projeto do Vetor de Expressão A seqüência de aminoácido para delta-plasminogênio é apresentada na ID SEQ N°: 2. Uma seqüência putativa que codifica delta-plasminogênio foi códon-otimizada para a expressão de E. coli e estabilidade de mRNA para produzir a seqüência de DNA como apresentada na ID SEQ N°: 1.

Este DNA foi sintetizado quimicamente (Blue Heron, Inc,) e inserido nos sítios Ndel e BamH1 do vetor de expressão de E. coli pET22b(+) (Novagen; Madison, Wl) para produzir proteína citossólica. Esta construção produz delta-plasminogênio com uma metionina N-terminal não nativa, adicional. (pET-22b(+) = pET Sistema de Expressão 22b (N°. do Cat. 70765), EMD Biosciences, Inc., Novagen Brand, Madison, Wl; Vide http://www.emd-biosciences.com seção de informação sobre o produto referente a pET-22b para detalhes em relação ao vetor).

Expressão e Purificação de Delta-Plasminogênio A seqüência de DNA que codifica delta-plasminogênio foi transformada em uma variedade de células e superexpressão de proteína depois da indução por IPTG (isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo) 1 mM foi analisada por SDS-PAGE. As células do tipo de célula BL21(DE3) RIL (Stratage-ne, La Jolla, CA) engenheiradas para expressar E. coli tRNAs raro que codifica Arg, lie e Leu, foram usadas para a produção de delta-plasminogênio. A produção de delta-plasminogênio foi confirmada em maior escala de expressão em que as células foram lisadas e foram examinados por SDS-PAGE tanto a proteína solúvel como os corpos de inclusão purificados. As células de BL21(DE3) RIL produziram a proteína significativa de delta-plasminogênio na forma de corpos de inclusão. As estimativas de expressão foram 50-80 mg/L de cultura de célula. O protocolo típico a seguir foi usado para expressão de delta-plasminogênio: Foi usada uma colônia simples de células de BL21(DE3) RIL que contêm o vetor delta-plasminogênio para inocular 5 ml de LB/ampicilina (100 pg/ml) /cloranfenicol (50 pg/ml) e foi incubada durante 8 horas a 37°C em um agitador. Depois disso, fot retirada uma alíquota de 50 μΙ da suspensão de bacteriana cultivadas para crescimento adicional em meio novo. O procedimento foi repetido depois de 16 horas com 6 ml de cultura bacteriana e 250 ml do meio. As culturas foram deixadas crescer a 37°C com agitação a um OD600 nm de aproximadamente 1,0 e foi adicionado IPTG a uma concentração final de 1 mM. As culturas foram deixadas crescer durante umas 5 horas adicionais. As células foram colhidas por centrifugação a 5.000 x g e os péletes de célula foram dissolvidas em 20 mM de Tris a pH 8,0 contendo 20 mM de EDTA e congelados a -80 °C.

Para a purificação do delta-plasminogênio, os péletes de célula foram descongeladas e foi adicionada a solução tamponadora até que o volume da solução se tomasse aproximadamente 1/20 do volume da cultura de célula original. Depois disso, foi adicionada lisozima a uma concentração final de 0,5 mg/ml e as células foram agitadas rapidamente a 4 °C durante 10-15 minutos. Então, foi adicionado Triton X-100 a uma concentração final de 1% e continuou a agitação por mais uns 10 minutos. Foram adicionados DNAse I (0,05 mg/ml) e MgCI2 (2,5 mM) e a agitação continuou a 4°C durante 30 minutos ou até que a solução não estivesse mais viscosa. A solução final foi centrifugada a 4°C durante 30 minutos a 15.000 x g e o sobrenadan-te foi descartado. O pélete da célula foi lavada três vezes com uma solução de lavagem (Tris-HCI 50 mM, pH 7,4 contendo EDTA 10 mM, Triton-X-1001% e uréia 0,5 M) e o pélete final foi dissolvido em 40 ml de solução tamponadora de extração (PBS, pH 7,4 contendo 10 mM de EDTA, 20 mM de DTT e gua-nidina-HCI 6 M) e armazenada a 4°C durante toda a noite. Depois de 16 horas, a solução foi centrifugada durante 30 minutos a 15.000 x g para remover os sólidos e o sobrenadante foi adicionado lentamente à solução de redo-bramento (Tris-HCI 50 mM, pH 8,3, guanidina HCI 3,5 M, arginina HCI 0,5 M, EDTA 10 mM, GSH 3 mM, GSSG 0,3 mM) mantendo-se agitação a 4 °C. O procedimento de redobramento foi realizado à concentração de proteína de 0,03 mg/ml ou menor.

A solução de redobramento foi mantida durante 2 dias a 4°C em repouso e então dialisada contra um volume de 8 vezes de Tris-HCI 0,1 M ρΗ 8,0 que contém EDTA 10 mM, NaCI 0,15 M, arginina-HCI 0,15 M, durante um período de tempo de 8-10 horas com freqüentes mudanças da solução tamponadora. A solução de proteína foi então removida de diálise e concentrada usando-se filtros de AMICON com uma faixa de separação em membrana de 10 kDa até aproximadamente 10 -20 ml e dialisada durante toda a noite versus um volume de 100 vezes de Tris 0,1 M pH 8,0 contendo EDTA 10 mM, NaCI 0,15 M. Este material foi centrifugado para a remoção de particu-lados, então passado sobre resina de afinidade de lisina (Lisina -SEPHAROSE 4B; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). O delta-plasmi-nogênio foi eluído da resina usando-se soro fisiológico Tris-tamponado, pH 8,0 contendo ácido ε-aminocapróico acid (cACA) 0,2 M.

Tipicamente, podiam ser isolados 80 mg de corpos de inclusão de 1 litro de cultura de célula e 40 mg podiam ser eluídos na etapa de cromatografia em lisina-SEPHAROSE.

Propriedades do Delta-Plasminogênio O delta-plasminogênio purificado apareceu como uma faixa simples na região de 35-40 kDa por análise SDS-PAGE de proteína reduzida (tratada com ditiotreitol) e não reduzida (Ver figura 5). A sua massa molecular exata, determinada por espectrometria de massa de MALDI, era de 37.089 Da, muito próxima do valor esperado de 37.198 Da.

Para testar se o delta-plasminogênio (APg) podia ser ativado em delta-plasmina, o delta-plasminogênio foi incubado com uroquinase (razão molar de 1:1000) e o aumento da atividade da serina protease foi monitorado pela medida do aumento na taxa de hidrólise de S-2251 (S-2251 = D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida, DiaPharma Group, Inc., West Chester, OH). Como observado na figura 6, um aumento parabólico na atividade típica para a reação de ativação acoplada (o zimogênio é convertido em enzima ativa (1); e é observado que a enzima cliva o substrato cromogênico (2)). A ativação de delta-plasminogênio a delta-plasmina estava completa dentro de 3 minutos sob estas condições. Foram obtidos resultados muito similares com tPA e estreptoquinase. A cinética para a ativação de uroquinase de delta-plasminogênio foi comparada com aquela para o plasminogênio de comprimento total usan-do-se o método de Wohl e outros, (Wohl, R.C., Summaria, L., Arzadon, L. e Robbins, K.C.; J. Bioi. Chem. 253: 1402-1407 (1978), totalmente aqui incorporado como referência). Para esta finalidade, foi adicionada uroquinase 5,8 nM a soluções que contêm várias concentrações de espécies de plasmina na presença de substituído S-2251 1 mM a 37 °C, pH 7,5. O aumento na absorbância a 405 nm foi monitorado e a taxa de aceleração da formação de produto S-2251 foi calculado usando-se uma equação parabólica na qual = k«t2. Os dados foram adaptados a um modelo cinético de Michaelis-Menten que usa a análise de Lineweaver-Burk, resultando nos valores abaixo: Tabela 1. Cinética para a ativação pela uroquinase do delta-plasminogênio. O plasminogênio de comprimento total foi bem ativado pela uroquinase, com valores de Km similares àqueles encontrados na literatura (1,7 UM; Wohl, R.C., Summaria, L., e Robbins, K.C.; J. Biol. Chem 255(5): 2005-2013 (1980)) e valores equivalentes de kcat.

Os valores de Km para ativação da uroquinase e do delta-plasminogênio eram aproximadamente 30 vezes mais altos do que para o plasminogênio, possivelmente indicando uma menor afinidade por este mutante de plasminogênio. Ao mesmo tempo, o valor de k^t para a ativação de delta-plasminogênio era muito mais alta do que para o plasminogênio. Apesar das diferenças mencionadas antes no kcat e em Km, a sua razão ou a eficiência catalítica, é aproximadamente a mesma para a ativação da espécie de plasminogênio natural e recombinantemente modificadas pela uroquinase. Assim, estes dados indicam que a presença de um kringle 1 "estranho" não afeta consideravelmente as propriedades de ativação do domínio da serina protease domínio em delta-plasminogênio.

Em um outro experimento de ativação ainda, o delta-plasminogênio foi incubado com a estreptoquinase, tPA e uroquinase e analisado em SDS-PAGE reduzida para se observar a conversão da molécula de delta- plasminogênio de uma cadeia em delta-plasmina de duas cadeias (Ver a figura 5, Pistas 3-5). Em todos os três casos, duas cadeias (kringie 1 de a-proximadamente 12 kDa e a cadeia de serina protease de aproximadamente 25 kDa) de delta-plasmina podiam ser observadas, sugerindo que o delta-plasminogênio evidentemente podia ser ativado por todos os três ativadores de plasminogênio.

Como é de se esperar, o delta-plasminogênio ligado a lisina -SEPHAROSE por meio do kringie 1 e podia ser eluído da coluna pelo gradiente de eACA como um único pico (Ver figura 7). A capacidade de delta-plasminogênio redobrado de se ligar a lisina -SEPHAROSE indica que o domínio de kringie da molécula é dobrado apropriadamente e o sítio de ligação da lisina é totalmente ativo.

Para confirmar também a funcionalidade de kringie 1, a ligação de eACA a delta-plasminogênio foi medida por monitoroção das mudanças associadas em fluorescência de proteína como descritos por Matsuka e outros (Matsuka, Y.V., Novokhatny, V.V. e Kudinov, S.A., Eur. J. Biochem. 190:93-97 (1990)) e Douglas e outros (Douglas, J.T., von Haller, P.D., Ge-hrmann, M., Llinas, M., e Schaller. J., Biochemistry 41: 3302-3310 (2002), todos aqui incorporados como referência). A ligação de cACA ao kringie 1 de delta-plasminogênio resulta em um decréscimo em fluorescência, provavelmente devido à extinção do triptófano cujos resíduos são parte do sítio de ligação da lisina.

Para monitorar este processo, foram adicionadas alíquotas de 4 μΙ a 16 μΙ de uma solução concentrado de cACA a 2 ml de delta-plasminogênio 5 μΜ em solução tamponadora Tris 50 mM que contém NaCI 20 mM, pH 8,0, 25 °C. A fluorescência foi monitorada a um comprimento de onda de excitação de 298 nm e a um comprimento de onda de emissão de 340 nm em um espectrômetro de fluorescência de FLUOROMAX (Jobin Yvon, Inc., Edison, NJ); depois de cada adição de sACA, a solução foi deixada em equilíbrio até que não fossem observadas outras mudanças na fluorescência.

Os valores de fluorescência resultantes foram corrigidos para a diluição e comparados graficamente versus a concentração de gACA em uma faixa de 0 - 50 μΜ de eACA. Os dados foram adaptados por regressão não linear para se obter um de 11,1 +/- 2,3 ZM, de bom acordo com os valores da literatura para afinidade de kringle 1 por εΑΟΑ de 3,2 μΜ (Matsu-ka e outros) e 13 μΜ (Douglas e outros).

Uma propriedade da plasmina é a sua eapaetdade de se ligar a fibrina. Para determinar se o delta-plasminogênio mantém a capacidade de interagir com a fibrina, as suas propriedades de ligação com a fibrina foram testadas em um ensaio com placa de microtítulo em que a ligação do delta-plasminogênio a fibrina foi avaliada por sua ativação subsequente por tPA e lise do coágulo resultante. Para esta finalidade, 100 μΙ de 5 mg/ml de fibrino-gênio foram polimerizados com trombina em cada cavidade de uma placa de microtítulo. Várias concentrações de delta-plasminogênio foram adicionadas no topo dos coágulos de fibrina e incubadas durante 1 hora a 37°C. A placa foi lavada muito bem com PBS enquanto que os coágulos de fibrina ainda estavam intactos e presos as cavidades. Depois da lavagem, foi adicionada a cada cavidade uma solução de 0,1-mg/ml de tPA e a placa foi incubada durante 2 horas a 37°C. Como resultado, alguns dos coágulos foram completamente dissolvidos e alguns foram parcialmente dissolvidos, enquanto que as cavidades com quantidades muito pequenas de delta-plasminogênio e cavidades de controle permaneceram pratica mente intactas. O grau de fibrinólise foi monitorado pela medida da absorbância a 280nm do restante dos coágulos iniciais reconstituídos em NaOH 1 M. Os valores de absorbân-cia foram comparados graficamente como uma função da concentração de delta-plasminogênio.

Como observado na figura 8, a ligação de delta-plasminogênio a fibrina segue uma curva de ligação clássica, sigmoidal. Usando-se este ensaio, foi descoberta que o delta-plasminogênio liga-se à fibrina com afinidade comparável àquela de um plasminogênio de comprimento total e a C50 desta interação (aproximadamente 0,2 μΜ) pode ser comparada ao Kd da ligação de fibrina do plasminogênio de comprimento total (Lucas, M.A., Fretto, L.J. e McKee, P.A.; J. Biol. Chem. 258(7): 4249-4256 (1983)). Estes experimentos indicam que o delta-plasminogênio pode se ligar à fibrina.

Desse modo, a interação de delta-plasminogênio com lisina -SEPHAROSE, a sua capacidade de se ligar ao sACA com o Kd esperado, a sua capacidade de se ligar à fibrina, a sua capacidade de ser ativado por todos os principais ativadores de plasminogênio e a potência de delta-plasmina em relação ao substrato cromogênico de plasmina S-2251 tudo indicava que esta molécula foi produzida no sistema do E. coli em uma forma totalmente funcional.

Purificação e Formulação de Delta-Plasmina O delta-plasminogênio, dialisado com Tris buffer 0,1 M, pH 8,0 que contém EDTA 10 mM e NaCI 0,15 M, foi ativado a delta-plasmina usan-do-se a uroquinase imobilizada em SEPHAROSE 4B essencialmente como descrito anteriormente para a plasmina (Marder, V.J.e outros, Thromb Hae-most., 86(3):739-45 (2001), incorporado como referência). A ativação ocorreu à temperatura ambiente e foi monitorada em tempo real pelo aumento na atividade de S-2251. Dependendo da quantidade de delta-plasminogênio, que variava de batelada para batelada (tipicamente 1-2 mg/ml), o tempo de incubação foi de 30-60 minutos. Depois de completada a ativação, quando a atividade do S-2251 atingiu um patamar, a uroquinase-SEPHAROSE foi separada por filtração e a delta-plasmina ativa foi capturada em benzamidina-SEPHAROSE (Pharmacia). A delta-plasmina foi eluída da resina usando-se solução tamponadora de baixo pH (glicina 0,2 M, pH 3,0, NaCI 0,3 M, cACA 0,2M).

Foram medidas as concentrações de proteína e a atividade de S-2251 em frações de eluição. As frações com alta atividade específica foram reunidas e dialisadas em relação a múltiplas variações de NaCI 0,15 M, pH 3,6 a 4 °C. A análise de SDS-PAGE de amostras não reduzidas de delta-plasmina (Ver figura 9, Pista 3) demonstra que a pureza deste material é habitualmente maior do que 95%. Sob condições reduzidas (Fig. 9, Pista 4), além da serina protease e das cadeias de kringle, há duas faixas descoradas acima e abaixo da faixa de kringle. Estas faixas representam produtos da autodegradação do domínio da serina protease que resultam de clivagens internas de sua cadeia de polipeptídeo; elas são normalmente mantidas juntas por ligações de dissulfeto porém se tornam visíveis com PAGE sob con- dições de redução. A quantidade de produtos de auto-degradação, que tipicamente não excedem 10%, foi bastante reduzida por condução da etapa de purificação de benzamidina-SEPHAROSE em modo de batelada em vez do formato de coluna.

Sendo que a delta-plasmina, similar à plasmina de comprimento total, é propensa a autodegradação no pH fisiológico, o pH 3,6 foi escolhido para a formulação final (acidificada com ácido acético - sõfüçao sãTinã). Cõmo demonstrado anteriormente para a plasmina (Novokhatny, V. e outros, J Thromb Haemost., 1(5): 1034-41 (2003), incorporado como referência) e confirmado em experimentos com delta-plasmina, esta baixa capacidade de tamponamento, a formulação de baixo pH não apenas permite uma armazenagem segura de plasminas ativas durante prolongados períodos de tempo, porém compatível com a administração parenteral destes trombolíticos diretos. Quando misturado com plasma ou soluções tamponadoras de pH neutro, a delta-plasmina é rapidamente re-ativada.

Propriedades Enzimáticas de Delta-Plasmin A atividade amidolítica da delta-plasmina foi examinada utilizando-se o substrato de plasmina D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilida (S-2251) (DiaPharma, West Chester, OH). No pH 7,4, 25°C em solução tamponadora de PBS, foi descoberto que a constante de Michaelis-Menten (Km) para S-2251 é 138 μΜ (Tabela 2). Foi descoberto que o kcat para a preparação é de 510 min'1. Usando-se titulação com cloridrato de 4-nitrofenil-4-guanidi-nobenzoato (pNPGB) (Chase, T. e E. Shaw, Methods Enzymol. 197: 20-27(1970)), foi descoberto que a percentagem de sítios funcionalmente ativos é de 67%. Corrigindo o kcat para por cento de sítios ativos, foi determinado um kcat de 755 +/- 45 min'1. Este valor era muito próximo do valor determinado no mesmo ensaio para a plasmina de comprimento total, 760 +/-23 min-1 e para microplasmina (em que faltam todos os cinco kringles), 795 +/-24 min 1 (Ver figura 9). Estes dados data indicam que a presença ou a ausência de kringles não afeta a atividade catalítica do domínio da serina protease. A taxa de inibição de delta-plasmina por a2-macroglobulina foi medida usando-se o método de Anonick e outros (Anonick, P. e outros, T- hrombosis Res. 59: 449-462 (1990)). Foi descoberto que a taxa de inibição é de 7,6 +/- 0,6 x 105 M1s‘1 a 22°C em solução tamponadora PBS. A taxa de inibição de delta-plasmina por a2-antiplasmina foi determinada como sendo de 1,1 x 107 M'1s'1 usando-se o método de Wiman e Collen (Wiman, B. e D. Collen, Eur. J. Biochem. 84: 573-578 (1978)) em que a plasmina e a a2-antiplasmina são misturadas e então dosadas para atividade de S-2251 em pontos de tempo específicos (Tabela 3). Este valor pode ser comparado aos valores relatados para a plasmina de 2,5 x 107 M'1s'1 (de Anonick e outros, Thrombosis Res. 59: 449 (1990)).

Os mesmos experimentos conduzidos com a microplasmina revelaram taxas de inibição de a2-antiplasmina de 1,8 x 105 M'1 s'1 e 3.1 x 105 M‘1 s‘1 em dois experimentos separados. A taxa de inibição de a2-antiplas-mina de minipiasmina (composição do domínio de minipiasmina, K5-SP) foi determinada como sendo de 2,4 x 105 M‘1 s‘1. Estes dados estão de acordo razoável com os valores da literatura para micro- e minipiasmina e demonstram que a inibição de delta-plasmina pela a2-antiplasmina é 40 vezes mas rápida do que a inibição de microplasmina ou de minipiasmina. Assim, estes resultados indicam que a delta-plasmina devia ser rapidamente inibida pela a2-antiplasmina em virtude da presença de kringle 1 em sua estrutura.

Acima de tudo, os dados apresentados nesta seção demonstram que as propriedades enzimáticas e inibidoras de delta-plasmina são similares à plasmina de comprimento total.

Tabela 2. Parâmetros cinéticos de estado estacionário para várias espécies de plasmina com substrato S-2251, em solução tamponadora de PBS, pH 7,4, 25°C.

Tabela 3. Taxas de inibição para várias espécies de plasmina e inibidores foram determinadas a 22 °C em solução tamponadora de PBS, pH 7,4.

Os valores da literatura são retirados de Anonicke outros, T-hrombosis Res. 59:449(1990). Todas as taxas foram medidas de acordo com os métodos publicados em Anonick e outros.

Eficiência Trombolítica In Vitro A eficiência trombolítica da delta-plasmina foi testada em um modelo in vitro de trombólise auxiliada por cateter (Novokhatny, V. e outros, J Thromb Haemost., 1(5): 1034-41 (2003), incorporado como referência) u-sando o seguinte protocolo experimental.

Sangue integral humano novo foi coletado em tubos de vidro de 20 x 0,95 cm de deixados coagular espontaneamente sem aditivos. Os tubos foram incubados durante 20 horas a 37 °C para permitir retração completa. Os coágulos retraídos foram separados do soro usando-se peneiras para testagem USA Padrão D16 com 14 mesh e seus pesos foram determinados. Os coágulos de sangue foram transferidos para tubos de vidro de diâmetro menor nos quais os coágulos retraídos se adaptam rigidamente (0,8 x 7 cm). O peso médio dos coágulos era de aproximadamente 3,6 g.

Doses simples de 1-ml de solução salina acidificada, plasmina ou delta-plasmina foram injetadas no coágulo usando-se uma seringa. Os coágulos foram incubados durante 1 hora a 37°C em uma estufa de laboratório THELCO (Jouan, Inc., Winchester, VA). Depois da incubação, os coágulos foram colocados de novo na peneira para remover o material liquefeito e o peso dos coágulos digeridos foi medido. A extensão da lise do coágulo foi determinada pela diferença entre o peso inicial do coágulo e o peso do coágulo residual e foi expresso como uma percentagem da redução de peso do coágulo. A figura 10 apresenta os resultados dos experimentos de lise com a delta-plasmina neste modelo. A infusão de uma dose única de 0,44 mg (equivalente a 1 mg/ml de plasmina em uma base molar) de delta-plasmina resultou em 36% de redução de peso do coágulo dentro de 60 minutos. Ao mesmo tempo, o peso dos coágulos infundidos com soro fisiológico diminuiu apenas 4%. A plasmina (1,0 mg) resultou em 50% de redução de peso do coágulo no mesmo período. Desse modo, estes dados demonstram que a delta-plasmina exibe potência trombolítica e pode ser usada como um agente trombolítico direto.

REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:1.

2. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2.

3. Polipeptídeo,, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a lisina imobilizada é lisina ligada a uma matriz de suporte sólida selecionada do grupo que consiste em lisina-agarose, lisina-hidrogel, lisina-agarose reticulada.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a lisina imobilizada é lisina-agarose reticulada.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo tem um resíduo de arginina em uma posição relativa análoga à da posição 76 da sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO:2.

6. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.

7. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é inserido no genoma de uma célula hospedeira.

8. Micro-organismo transgênico cultivado, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 6.