BRPI0510115B1 - Método para produzir um isoprenóide ou precursor de isoprenóide através de uma via de mevalonato em escherichia coli e célula hospedeira geneticamente modificada que os produz - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA INTENSIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS DE ISOPRENÓIDE. A presente invenção refere-se a métodos de produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide em uma célula hospedeira geneticamente modificada. Os métodos geralmente envolvem modulação do nível de hidróximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) na célula, de modo que o nível de HMG-CoA não é tóxico para a célula e/ou não inibe substancialmente o crescimento celular, mas é mantido em um nível que proporciona produção em alto nível de mevalonato, IPP e outros produtos a jusante de um isoprenóide ou via de isoprenóide (por exemplo, poliprenila) difosfatos e compostos de isoprenóide. A presente invenção ainda proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas que são adequadas para uso no método em questão. A presente invenção ainda proporciona estruturas de ácido nucléico recombinantes para uso na geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão, incluindo estruturas de ácido nucléico recombinantes compreendendo seqüências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas da via de mevalonato e vetores recombinantes (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) compreendendo as mesmas. A presente invenção ainda proporciona métodos para a identificação de ácidos nucléicos que codificam variantes de reductase de HMG-CoA (HMGR) que proporcionam alívio da toxicidade (...).

Description

Referência Cruzada

[0001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 60/573,492, depositado em 21 de Maio de 2004, pedido o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.

Estabelecimento com relação à pesquisa federalmente subsidiada

[0002] O governo dos Estados Unidos tem determinados direitos sobre a presente invenção, em conformidade com o subsídio n° BES- 9911463 concedido pela National Science Foundation e subsídio n° FDNOOO 14-99-0182 concedido pelo Office of Naval Research.

Campo da Invenção

[0003] A presente invenção se refere à produção de compostos de isoprenóide e, em particular, células hospedeiras que são geneticamente modificadas para produzir compostos de isoprenóide.

Antecedentes da Invenção

[0004] Isoprenóides constituem um grupo extremamente grande e diverso de produtos naturais que têm uma origem biossintética comum, isto é, um único precursor metabólico, difosfato de isopentenila (IPP). Pelo menos 20.000 isoprenóides foram descritos. Por definição, isoprenóides são compostos das assim denominadas unidades de isopreno (C5). O número de átomos de C presentes nos isoprenóides é, tipicamente, divisível por cinco (C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40), embora isoprenóides e politerpenos irregulares tenham sido reportados. Compostos de isoprenóide são também referidos como "terpenos" ou "terpenóides." Membros importantes dos isoprenóides incluem os carotenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides e hemiterpenos. Carotenóides incluem, por exemplo, licopeno, [beta]-caroteno e similares, muitos dos quais funcionam como antioxidantes. Sesquiterpenóides incluem, por exemplo, artemisinina, um composto tendo atividade antimalária. Diterpenóides incluem, por exemplo, taxol, um agente quimioterapêutico para o câncer.

[0005] Isoprenóides compreendem a família mais numerosa e estruturalmente diversa de produtos naturais. Nessa família, terpenóides isolados de plantas e outras fontes naturais são usados como compostos de sabor e fragrância comerciais, bem como fármacos antimalária e anticâncer. A maioria dos compostos de terpenóide em uso hoje são produtos naturais ou seus derivados. Os organismos fonte (por exemplo, árvores, invertebrados marinhos) de muitos desses produtos naturais não são passíveis de cultivo em larga-escala necessário para produzir quantidades comercialmente viáveis nem manipulação genética para produção ou derivatização aumentada desses compostos. Portanto, os produtos naturais devem ser produzidos semi-sinteticamente a partir de análogos ou sinteticamente usando sínteses químicas convencionais. Além disso, muitos produtos naturais têm estruturas complexas e, como um resultado, são atualmente não econômicos ou impossíveis de sintetizar. Tais produtos naturais devem ser extraídos de suas fontes nativas, tais como árvores, esponjas, corais e micróbios marinhos; ou produzidos sinteticamente ou semi-sinteticamente a partir de precursores mais abundantes. A extração de um produto natural de uma fonte nativa é limitada pela disponibilidade da fonte nativa; e a produção sintética ou semi-sintética de produtos naturais pode sofrer de baixo rendimento e/ou custo elevado. Tais problemas de produção e a disponibilidade aumentada da fonte natural podem restringir o desenvolvimento clínico e comercial de tais produtos.

[0006] A biossíntese de produtos naturais de isoprenóide em micróbios manipulados poderia expor o potencial comercial e terapêutico não concretizado desses recursos naturais e proporcionar produtos químicos e farmacêuticos refinados mais baratos e mais amplamente disponíveis. Um grande obstáculo à biossíntese de terpenóide em alto nível é a produção de precursores de terpeno. Estudos anteriores mostraram que, quando expressa em E. coli, a via de mevalonato proporciona a produção de pirofosfato de isopentenila (IPP), o qual pode ser isomerizado e polimerizado em isoprenóides e terpenos de valor comercial. O redirecionamento ótimo do metabolismo microbiano com relação à produção de isoprenóide requer que a via biossintética introduzida seja apropriadamente manipulada para filtrar eficazmente carbono e IPP e não permitir o surgimento de intermediários, os quais podem ser tóxicos. Na verdade, foi mostrado que a expressão de enzimas que produzem mevalonato pode inibir o crescimento celular e limitar a produtividade de culturas microbianas. Foi sugerido que a inibição de crescimento previamente reportada quando de expressão da via de mevalonato na ausência de uma isomerase de IPP, sintase de FPP e sintase de terpeno levou ao acúmulo de níveis tóxicos de IPP.

[0007] Existe uma necessidade na técnica por células hospedeiras que produzem precursores de isoprenóide ou produzem isoprenóide que proporcionam crescimento robusto da célula hospedeira e produção em alto nível de compostos de isoprenóide, bem como os precursores de difosfato de poliprenila de tais compostos. A presente invenção se dirige a essa necessidade e proporciona vantagens relacionadas. Literatura Publicação de Patente US 2004/005678; Publicação de Patente US 2003/0148479; Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7): 796-802; Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67-71; Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15): 4319-27; Publicação de Patente US 2004/0194162; Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63: 3341-3344; Jackson et al. (2003) Organ. Lett. 5: 1629-1632; Publicação de Patente US 2004/0072323; Publicação de Patente US 2004/0029239; Publicação de Patente US 2004/0110259; Publicação de Patente US 2004/0063182; Patente US 5.460.949; Publicação de Patente US 2004/0077039; Patente US 6.531.303; Patente US 6.689.593; Hamano et al. (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 1627-1635; T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934; T. Kazuhiko. (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487-1491; Brock et al. (2004) Eur J. Biochem. 271: 3227-3241; Choi et al. (1999) Appl. Environ. Microbio. 65 4363-4368; Parke et al., (2004) Appl. Environ. Microbio. 70: 2974-2983; Subrahmanyam et al. (1998) J. Bact. 180: 4596-4602; Murli et al. (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500-509.

Sumário da Invenção

[0008] A presente invenção proporciona métodos de produção de um isoprenóide ou um precursor de isoprenóide em uma célula hospedeira geneticamente modificada. Os métodos geralmente envolvem modulação do nível de hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) na célula, de modo que o nível de HMG-CoA não é tóxico para a célula e/ou não inibe substancialmente o crescimento celular, mas é mantido em um nível que proporciona produção em alto nível de mevalonato, IPP e outros produtos a jusante de um isoprenóide ou da via de isoprenóide, por exemplo, difosfatos de poliprenila e compostos de isoprenóide. A presente invenção ainda proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas que são adequadas para uso no método em questão. A presente invenção ainda proporciona estruturas de ácido nucléico recombinantes para uso na geração da célula hospedeira geneticamente modificada em questão, incluindo estruturas de ácido nucléico recombinantes compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas da via de mevalonato e vetores recombinantes (por exemplo, vetores de expressão recombinantes) compreendendo as mesmas. A presente invenção ainda proporciona métodos para a identificação de ácidos nucléicos que codificam variantes de reductase de HMG-CoA (HMGR) que proporcionam alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG- CoA. A presente invenção ainda proporciona métodos para a identificação de agentes que reduzem o acúmulo intracelular de HMG- CoA.

Breve Descrição dos Desenhos

[0009] A Figura 1 é uma representação esquemática de vias metabólicas de isoprenóide que resultam na produção dos intermediários da via biossintética de isoprenóide difosfatos de poliprenila, difosfato de geranila (GPP), difosfato de farnesila (FPP) e difosfato de geranilgeranila (GGPPP), a partir de difosfato de isopentenila (IPP) e difosfato de dimetilalila (DMAPP).

[00010] A Figura 2 é uma representação esquemática da via de mevalonato (MEV) para a produção de IPP.

[00011] A Figura 3 é uma representação esquemática da via de DXP para a produção de IPP e pirofosfato de dimetilalila (DMAPP).

[00012] A Figura 4 representa a produção de amorfadieno em um cepa de E. coli geneticamente modificado para produzir IPP através da via de mevalonato, cultivado em meio suplementado com nenhum mevalonato, mevalonato a 10 mM ou mevalonato a 20 mM.

[00013] A Figura 5 representa o efeito inibitório de expressão aumentada do óperon MevT sobre o crescimento celular de E. coli geneticamente modificado com o óperon MevT.

[00014] A Figura 6 representa o efeito de expressão aumentada de cada um dos genes individuais contidos no óperon MevT e combinações dos mesmos sobre o crescimento celular.

[00015] A Figura 7 representa o efeito de HMGS cataliticamente inativo sobre o crescimento celular de E. coli.

[00016] A Figura 8 representa o acúmulo intracelular de HMG-CoA em cepas de E. coli que expressam estruturas tóxicas da via de mevalonato.

[00017] A Figura 9 representa o efeito de acúmulo de HMG-CoA sobre o crescimento celular.

[00018] A Figura 10 representa o efeito de expressão aumentada de tHMGR sobre o crescimento celular.

[00019] A Figura 11 representa o efeito de expressão aumentada de tHMGR sobre o acúmulo de HMG-CoA.

[00020] A Figura 12 representa o efeito de expressão aumentada de tHMGR sobre a produção de mevalonato.

[00021] As Figuras 13 A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pBAD24MevT (SEQ ID NO: 1).

[00022] As Figuras 14A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pBAD33MevT (SEQ ID NO: 2).

[00023] As Figuras 15A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pMevT (SEQ ID NO: 3).

[00024] As Figuras 16A-D representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pMBIS (SEQ ID NO: 4).

[00025] As Figuras 17A-B representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pADS (SEQ ID NO: 5).

[00026] As Figuras 18A-B representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pAtoB (SEQ ID NO: 6).

[00027] As Figuras 19A-B representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pHMGS (SEQ ID NO: 7).

[00028] As Figuras 20 A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pHMGR (SEQ ID NO : 8) .

[00029] As Figuras 21 A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pBAD18HMGR (SEQ ID NO: 9).

[00030] As Figuras 22A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pHMGSR (SEQ ID NO: 10).

[00031] As Figuras 23A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pBAD33MevT(C159A) (SEQ ID NO: 11).

[00032] As Figuras 24A-C representam a sequência de nucleotídeos do plasmídeo pHMGS(C159A) (SEQ ID NO: 12).

Definições

[00033] Os termos "isoprenóide," "composto de isoprenóide," "terpeno," "composto de terpeno, "terpenóide" e "composto de terpenóide" são usados permutavelmente aqui. Compostos de isoprenóide são compostos de vários números das assim denominadas unidades de isopreno (C5). O número de átomos de C presentes nos isoprenóides é, tipicamente, uniformemente divisível por cinco (por exemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40). Isoprenóides e politerpenos irregulares foram reportados e também estão incluídos na definição de "isoprenóide." Compostos de isoprenóide incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, politerpenos e diterpenos.

[00034] Conforme usado aqui, o termo "difosfato de prenila" é usado permutavelmente com "pirofosfato de prenila" e inclui monodifosfatos de prenila tendo um único grupo prenila (por exemplo, IPP e DMAPP), bem como difosfatos de poliprenila que incluem 2 ou mais grupos prenila. Monodifosfatos de prenila incluem pirofosfato de isopentenila (IPP) e seu isômero pirofosfato de dimetilalila (DMAPP). Conforme usado aqui, o termo "terpeno sintase" se refere a qualquer enzima que modifica enzimaticamente um IPP, DMAPP ou polipirofosfato de prenila, de modo que um composto de terpenóide é produzido. O termo "terpeno sintase " inclui enzimas que catalisam a conversão de um difosfato de prenila em um isoprenóide.

[00035] A palavra "pirofosfato" é usada permutavelmente aqui com "difosfato". Assim, por exemplo, os termos "difosfato de prenila" e "pirofosfato de prenila" são permutáveis; o termos "pirofosfato de isopentenila" e "difosfato de isopentenila" são permutáveis; o termos difosfato de farnesila" e "pirofosfato de farnesila" são permutáveis; etc.

[00036] O termo "via de mevalonato" ou "via de MEV" é usado aqui para se referir à via biossintética que converte acetil-CoA em IPP. A via de mevalonato compreende enzimas que catalisam as seguintes etapas: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato em 5-fosfato de mevalonato; (e) conversão de 5-fosfato de mevalonato em 5-pirofosfato de mevalonato; e (f) conversão de 5-pirofosfato de mevalonato em pirofosfato de isopentenila. A via de mevalonato é ilustrada esquematicamente na Figura 2. A "metade superior" da via de mevalonato se refere às enzimas responsáveis pela conversão de acetil-CoA em mevalonato através da via de intermediários de MEV.

[00037] O termo "via de 5-difosfato de 1desóxi-D-xilulose" ou "via de DXP" é usado aqui para se referir à via que converte gliceraldeído-3- fosfato e piruvato em IPP e DMAPP através da via de intermediários de DXP, onde a via de DXP compreende enzimas que catalisam as reações representadas esquematicamente na Figura 3.

[00038] Conforme usado aqui, o termo "prenil transferase" é usado permutavelmente com os termos "difosfato de prenil sintase" e "poliprenila sintase" (por exemplo, "GPP sintase", "FPP sintase", "OPP sintase", etc.) para se referir a uma enzima que catalisa a condensação 1'-4 consecutiva de difosfato de isopentenila com substratos de iniciador alílicos, resultando na formação de difosfatos de prenila de vários comprimentos de cadeia.

[00039] Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico," usados permutavelmente aqui, se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos ou deoxinucleotídeos. Assim, esse termo inclui, mas não está limitado a, DNA ou RNA fita simples, dupla ou múltipla, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polímero compreendendo bases de nucleotídeo purina e pirimidina ou outras bases naturais, química ou bioquimicamente modificadas, não-naturais ou derivatizadas.

[00040] Conforme usado aqui, o termos "óperon" e "unidade de transcrição simples" são usados permutavelmente para se referir a duas ou mais regiões de codificação contínuas (sequências de nucleotídeo que codificam um produto genético, tal como um RNA ou uma proteína) que são coordenadamente reguladas por um ou mais elementos de controle (por exemplo, um promotor). Conforme usado aqui, o termo "produto genético" se refere ao RNA codificado por DNA (ou vice versa) ou proteína que é codificada por um RNA ou DNA, onde um gene compreenderá, tipicamente, uma ou mais sequências de nucleotídeo que codificam uma proteína e pode incluir também íntrons e outras sequências de nucleotídeo de não-codificação.

[00041] Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usados permutavelmente aqui e se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, a qual pode incluir aminoácidos codificados e não-codificados, aminoácidos química ou bioquimicamente modificados ou derivatizados e polipeptídeos tendo partes principais peptídicas modificadas.

[00042] O termo "que ocorre naturalmente", conforme usado aqui quando aplicado a um ácido nucléico, uma célula ou um organismo, se refere a um ácido nucléico, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por exemplo, um polipeptídeo ou sequência de polinucleotídeos que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e a qual não tenha sido intencionalmente modificada pelo homem no laboratório ocorre naturalmente.

[00043] O termo "ácido nucléico heterólogo," conforme usado aqui, se refere a um ácido nucléico em que pelo menos um dos seguintes é verdadeiro: (a) o ácido nucléico é estranho ("exógeno") a (isto é, não encontrado naturalmente em) um determinado microorganismo hospedeiro ou célula hospedeira; (b) o ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeos que é encontrada naturalmente em (por exemplo, é "endógena a") um determinado microorganismo hospedeiro ou célula hospedeira (por exemplo, o ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeos endógena ao microorganismo hospedeiro ou célula hospedeira); contudo, no contexto de um ácido nucléico heterólogo, a mesma sequência de nucleotídeos conforme encontrado endogenamente é produzida em uma quantidade não natural (por exemplo, maior do que esperado ou maior do que encontrado naturalmente) na célula ou um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que difere quanto à sequência da sequência de nucleotídeos endógena, mas codifica a mesma proteína (tendo a mesma ou substancialmente a mesma sequência de aminoácido) conforme encontrado endogenamente é produzida em uma não natural (por exemplo, maior do que esperado ou maior do que encontrado naturalmente) na célula; (c) o ácido nucléico compreende duas ou mais sequências de nucleotídeo que não são encontradas na mesma relação uma com a outra na natureza, por exemplo, o ácido nucléico é recombinante. Um exemplo de um ácido nucléico heterólogo é uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR operacionalmente ligado a um elemento de controle de transcrição (por exemplo, um promotor) ao qual uma sequência de codificação de HMGR endógena (que ocorre naturalmente) não está normalmente operacionalmente ligada. Outro exemplo de um ácido nucléico heterólogo é um plasmídeo com elevado número de cópias compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR. Outro exemplo de um ácido nucléico heterólogo é um ácido nucléico que codifica HMGR, onde a célula hospedeira que não produz normalmente HMGR é geneticamente modificada com o ácido nucléico que codifica HMGR; em virtude do fato de ácidos nucléicos que codificam HMGR não serem encontrados naturalmente na célula hospedeira, o ácido nucléico é heterólogo à célula hospedeira geneticamente modificada.

[00044] "Recombinante," conforme usado aqui, significa que um ácido nucléico (DNA ou RNA) em particular é o produto de vários combinações de etapas de clonagem, restrição e/ou ligação resultando em uma estrutura tendo uma sequência de codificação ou não- codificação estrutural distinguível de ácidos nucléicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Geralmente, sequências de DNA que codificam a sequência de codificação estrutural podem ser montadas a partir fragmentos de cDNA e ligantes de oligonucleotídeo curtos ou a partir de uma série de oligonucleotídeos sintéticos, para proporcionar um ácido nucléico sintético o qual é capaz de ser expresso a partir de uma unidade transcricional recombinante contida em uma célula ou em um sistema de transcrição e tradução isento de células. Tais sequências podem ser proporcionadas na forma de uma rede de leitura aberta não interrompida por sequências ou íntrons internos não- traduzidos, os quais estão, tipicamente, presentes em genes eucariotas. DNA genômico compreendendo as sequências relevantes também podem ser usados na formação de um gene recombinante ou unidade transcricional. Sequências de DNA não-traduzidas podem estar presentes 5' ou 3' a partir da rede de leitura aberta, onde tais sequências não interferem com a manipulação ou expressão das regiões de codificação e podem, na verdade, atuam para modular a produção de um produto desejado através de vários mecanismos (veja "sequências regulatórias de DNA", abaixo).

[00045] Assim, por exemplo, o termo polinucleotídeo ou ácido nucléico "recombinante" se refere a um o qual não ocorre naturalmente, por exemplo, é feito pela combinação artificial de dois outros segmentos de sequência de outro modo distintos através de intervenção humana. Essa combinação artificial é frequentemente realizada por meio de síntese química ou através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Isso é usualmente feito para substituir um códon por um códon redundante que codifica o mesmo ou um aminoácido conservativo, ao mesmo tempo em que, tipicamente, introduz ou remove um sítio de reconhecimento da sequência. Alternativamente, ela é realizada para unir segmentos de ácido nucléico de funções desejadas para gerar uma combinação desejada de funções. Essa combinação artificial é frequentemente realizada por meio de síntese química ou através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética.

[00046] Por "estrutura" entenda-se um ácido nucléico recombinante, geralmente DNA recombinante, o qual tenha sido gerado para fins de expressão de uma sequência de nucleotídeos específica ou tem de ser usado na estruturação de outras sequências de nucleotídeo recombinantes.

[00047] Conforme usado aqui, o termo "ácido nucléico exógeno" se refere a um ácido nucléico que não está normalmente ou é encontrado naturalmente em e/ou produzido por uma determinada bactéria, organismo ou célula na natureza. Conforme usado aqui, o termo "ácido nucléico endógeno" se refere a um ácido nucléico que é normalmente encontrado em e/ou produzido por uma determinada bactéria, organismo ou célula na natureza. Um "ácido nucléico endógeno" é também referido como um "ácido nucléico nativo" ou um ácido nucléico que é "nativo" a uma determinada bactéria, organismo ou célula. Por exemplo, os ácidos nucléicos que codificam HMGS, quinase de mevalonato e fosfoquínase de mevalonato no Exemplo 1 representam ácidos nucléicos exógenos à E. coli. Esses ácidos nucléicos da via de mevalonato foram clonados a partir de Saccharomyces cerevisiae. Em S. cerevisiae, as sequências genéticas que codificam HMGS, MK e PMK sobre o cromossoma seriam ácidos nucléicos "endógenos".

[00048] Os termos "sequências regulatórias de DNA", "elementos de controle" e "elementos regulatórios," usados permutavelmente aqui, se referem à sequências de controle de transcrição e tradução, tais como promotores, intensificadores, sinais de poliadenilação, terminadores, sinais de degradação de proteína e similares, que proporcionam e/ou regulam a expressão da sequência de codificação e/ou produção de um polipeptídeo codificado na célula hospedeira.

[00049] O termo "transformação" é usado permutavelmente aqui com "modificação genética" e se refere a uma alteração genética permanente ou transitória induzida em uma célula após introdução de um novo ácido nucléico (isto é, DNA exógeno à célula). A alteração genética ("modificação") pode ser realizada através de incorporação do novo DNA no genoma da célula hospedeira ou através de manutenção transitória ou estável do novo DNA como um elemento epissômico. Onde a célula é uma célula eucariota, uma alteração genética permanente geralmente é obtida através de introdução do DNA no genoma da célula. Em células procariotas, alterações permanentes podem ser introduzidas no cromossoma ou via elementos extracromossômicos, tais como plasmídeos e vetores de expressão, os quais podem conter um ou mais marcadores selecionáveis para auxiliar em sua manutenção na célula hospedeira recombinante.

[00050] "Operacionalmente ligada" se refere a uma justaposição em que os componentes assim descritos estão em uma relação que permite que os mesmos funcionem de sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se o promotor afeta sua transcrição ou expressão. Conforme usado aqui, os termos "promotor heterólogo" e "regiões de controle heterólogas" se referem a promotores e outras regiões de controle que não são normalmente associadas a uma ácido nucléico em particular na natureza. Por exemplo, uma "região de controle transcricional heteróloga a uma região de codificação" é a região de controle transcricional que não está normalmente associada à região de codificação na natureza.

[00051] Uma "célula hospedeira," conforme usado aqui, denota uma célula eucariota, uma célula procariota ou uma célula de um organismo multicelular (por exemplo, uma linhagem de células) in vitro ou in vivo cultivada como uma entidade unicelular, células eucariotas ou procariotas as quais podem ser ou ter sido usadas como recipientes para um ácido nucléico (por exemplo, um vetor de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica um ou mais produtos genéticos da via biossintética, tais como produtos genéticos da via de mevalonato) e incluem a prole da célula parental a qual tenha sido geneticamente modificada pelo ácido nucléico. Deve ser compreendido que a prole de uma única célula pode não ser, necessariamente, completamente idêntica quanto à morfologia ou complemento de DNA genômico ou total quanto ao parental, em virtude de mutação natural, acidental ou deliberada. Uma "célula hospedeira recombinante" (também referida como uma "célula hospedeira geneticamente modificada") é uma célula hospedeira na qual tenha sido introduzido um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um vetor de expressão. Por exemplo, uma célula hospedeira procariota em questão é uma célula hospedeira procariota geneticamente modificada (por exemplo, uma bactéria), em virtude de introdução, em uma célula hospedeira procariota adequada, de um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é estranho (não normalmente encontrado na natureza) à célula hospedeira procariota ou um ácido nucléico recombinante que não é normalmente encontrado na célula hospedeira procariota; e uma célula hospedeira eucariota em questão é uma célula hospedeira eucariota geneticamente modificada, em virtude de introdução, em uma célula hospedeira eucariota adequada, de um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é estranho à célula hospedeira eucariota ou um ácido nucléico recombinante que não é normalmente encontrado na célula hospedeira eucariota.

[00052] Conforme usado aqui, o termo "isolado" se destina a descrever um polinucleotídeo, um polipeptídeo ou uma célula que está em um ambiente diferente daquele no qual o polinucleotídeo, o polipeptídeo ou a célula ocorre naturalmente. Uma célula hospedeira geneticamente modificada isolada pode estar presente em uma população misturada de células hospedeiras geneticamente modificadas.

[00053] Cassetes de expressão podem ser preparados compreendendo uma região de início de transcrição ou de controle transcricional (por exemplo, um promotor), a região de codificação para a proteína de interesse e uma região de término de transcrição. Regiões de controle transcricional incluem aquelas que proporcionam super- expressão da proteína de interesse em uma célula hospedeira geneticamente modificada; aquelas que proporcionam expressão induzível de modo que, quando um agente de indução é adicionado ao meio de cultura, a transcrição da região de codificação da proteína de interesse é induzida ou aumentada para um nível maior do que antes de indução.

[00054] Um ácido nucléico é "hibridizável" a outro ácido nucléico, tal como um cDNA, DNA genômico ou RNA quando a forma fita simples do ácido nucléico pode se anelar a outro ácido nucléico sob as condições apropriadas de temperatura e resistência iônica da solução. Condições de hibridização e lavagem são bem-conhecidas e exemplificadas em Sambrook, J., Fritsch, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente Capítulo 11 e Tabela 11.1 no mesmo; e Sambrook, J. e Russell, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condições de temperatura e resistência iônica determinam a "estringência" da hibridização. As condições de estringência podem ser ajustadas para selecionar fragmentos moderadamente similares, tais como sequências homólogas de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais a partir de organismos intimamente relacionados. As condições de hibridização e lavagens pós-hibridização são úteis para obter as condições de estringência determinadas desejadas da hibridização. Um conjunto de lavagens pós-hibridização ilustrativo é uma série de lavagens começando com 6 x SSC (onde SSC é NaCl a 0,15 M e tampão de citrato a 15 mM), 0,5% de SDS em temperatura ambiente durante 15 minutos, então, repetida com 2 x SSC, 0,5% de SDS a 45 °C durante 30 minutos e então, repetida duas vezes com 0,2 x SSC, 0,5% de SDS a 50 °C durante 30 minutos. Outras condições estringentes são obtidas através de uso de temperaturas maiores nas quais as lavagens são idênticas àquelas acima, exceto quanto à temperatura das duas lavagens finais de 30 minutos em 0,2 x SSC, 0,5% de SDS, a qual é aumentada para 60 °C. Outro conjunto de condições altamente estringentes usa duas lavagens finais em 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 65 °C. Outro exemplo de condições de hibridização estringente é hibridização a 50 °C ou maior e 0,1 x SSC (cloreto de sódio a 15 mM/citrato de sódio a 1,5 mM). Outro exemplo de condições de hibridização estringente é incubação durante a noite a 42 °C em uma solução: formamida a 50%, 5 x SSC (NaCl a 150 mM, citrato trissódico a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de 7,6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 μg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado cisalhado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1 x SSC em torno de 65 °C. Condições de hibridização estringente e condições de lavagem pós-hibridização são condições de hibridização e condições de lavagem pós-hibridização que são pelo menos tão estringentes quanto as condições representativas acima.

[00055] Hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenham sequências complementares embora, dependendo da estringência da hibridização, equivalências errôneas entre as bases são possíveis. A estringência apropriada para hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e do grau de complementação, variáveis bem-conhecidas na técnica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas sequências de nucleotídeo, maior do valor da temperatura de fusão (Tm) para híbridos de ácidos nucléicos tendo essas sequências. A estabilidade relativa (correspondendo a uma maior Tm) das hibridizações de ácido nucléico diminui na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de mais do que 100 nucleotídeos de comprimento, equações para cálculo da Tm foram derivadas (veja Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridizações com ácidos nucléicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posição de equivalências errôneas se torna mais importante e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (veja Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). Tipicamente, o comprimento para um ácido nucléico hibridizável é de pelo menos cerca de 10 nucleotídeos. Comprimentos mínimos ilustrativos para um ácido nucléico hibridizável são: pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; pelo menos cerca de 20 nucleotídeos; e pelo menos cerca de 30 nucleotídeos. Além disso, aqueles habilitados reconhecerão que a temperatura e concentração de sal na solução de lavagem podem ser ajustadas conforme necessário de acordo com fatores tal como comprimento da sonda.

[00056] O termo "substituição conservativa de aminoácido" se refere à capacidade de permutação em proteínas de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas de hidroxila consiste em serina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais de amida consiste em asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas consiste em lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendo enxofre consiste em cisteína e metionina. Grupos exemplificativos de substituição conservativa de aminoácidos são: valina-leucina- isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

[00057] "Ácidos nucléicos sintéticos" podem ser montados a partir de blocos de construção de oligonucleotídeo que são quimicamente sintetizados usando procedimentos conhecidos por aqueles versados na técnica. Esses blocos de construção são ligados e anelados para formar segmentos de gene os quais são, então, enzimaticamente montado para estruturar o gene inteiro. "Quimicamente sintetizados," quando relacionado a uma sequência de DNA, significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. A síntese química manual de DNA pode ser realizada usando procedimentos bem- estabelecidos ou síntese química automática pode ser realizada usando uma de uma série de máquinas comercialmente disponíveis. A sequência de nucleotídeos dos ácidos nucléicos pode ser modificada para expressão ótima baseado em otimização da sequência de nucleotídeos para refletir a tendência de códon da célula hospedeira. O versado na técnica aprecia a probabilidade de expressão com sucesso se o uso de códon tende àqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. Determinação dos códons preferidos pode ser baseada em uma inspeção de genes derivados de uma célula hospedeira onde informação de sequência está disponível.

[00058] Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma determinada "identidade de sequência" percentual a outro polinucleotídeo ou polipeptídeo, significando que, quando alinhados, esse percentual de bases ou aminoácidos é o mesmo e na mesma posição relativa, quando de comparação das duas sequências. A similaridade de sequência pode ser determinada através de uma serie de diferentes maneiras. Para determinar a identidade de sequência, as sequências podem ser alinhadas usando métodos e programas de computados, incluindo BLAST, disponível na world wide web em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Veja, por exemplo, Altschul et al. (1990), J Mol. Biol. 215: 403-10. Outro algoritmo de alinhamento é FASTA, disponível no pacote Genetics Computing Group (GCG), da Madison, Wisconsin, EUA, uma subsidiária totalmente proprietária do Oxford Molecular Group, Inc. Outras técnicas para alinhamento são descritos em Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., uma divisão da Harcourt Brace & Co., San Diego, Califórnia, EUA. De interesse particular são programas de alinhamento que permitem intervalos na sequência. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permite intervalos em alinhamentos de sequência. Veja Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Também, o programa intervalo que usa o método de alinhamento de Needleman e Wunsch pode ser utilizado para alinhar sequências. Veja J Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

[00059] Antes que a presente invenção seja ainda descrita, deve ser compreendido que a presente invenção não está limitada às modalidades descritas em particular, uma vez que as mesmas podem, naturalmente, variar. Também deve ser compreendido que a terminologia usada aqui é para fins de descrição de modalidades em particular apenas e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção estará limitado apenas pelas reivindicações em anexo.

[00060] Onde uma faixa de valores é proporcionada, deve ser compreendido que cada valor interveniente, ao décimo da unidade do limite mínimo, a menos que o contexto indique claramente de outro modo, entre os limites máximo e mínimo dessa faixa e qualquer outro valor estabelecido ou interveniente nessa faixa estabelecida está abrangido pela invenção. Os limites máximo e mínimo dessas faixas menores podem, independentemente, ser incluídos nas faixas menores e também estão abrangidos pela invenção, com relação a qualquer limite especificamente excluído na faixa estabelecida. Onde a faixa estabelecida inclui um ou ambos os limites, faixas excluindo um ou ambos desses limites incluídos também são incluídas na invenção.

[00061] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui têm o mesmo significado conforme comumente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a presente invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui também possam ser usados na prática ou testagem da presente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos. Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui por referência para divulgar e descrever os métodos e/ou materiais junto com os quais as publicações são citadas.

[00062] Deve ser observado que, conforme usado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "a", "o", "e" e "um", "uma" incluem os referentes no plural, a menos que o contexto indique claramente de outro modo. Assim, por exemplo, referência a "uma célula hospedeira geneticamente modificada" inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras e referência à "HMG-CoA reductase " inclui referência a uma ou mais HMG-CoA reductases e equivalentes dos mesmos conhecidos por aqueles versados na técnica e assim por diante. Deve ser ainda observado que as reivindicações podem ser conFiguradas para excluir qualquer elemento opcional. Como tal, essa afirmação se destina a servir como uma base antecedente para o uso de tal terminologia exclusiva, tal como "unicamente", "apenas" e similares com relação à menção de elementos reivindicatórios ou o uso de uma limitação "negativa".

[00063] As publicações discutidas aqui são fornecidas unicamente para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser construído como uma admissão de que a presente invenção não é intitulada para antecipar tal publicação em virtude da invenção anterior. Ainda, as datas de publicação fornecidas podem ser diferentes das datas reais de publicação, as quais pode ser necessário que sejam confirmadas independentemente.

Descrição Detalhada da Invenção

[00064] A presente invenção proporciona métodos de redução do acúmulo inibitório de HMG-CoA em células hospedeiras geneticamente modificadas úteis na produção de isoprenóides ou precursor de isoprenóide e métodos para aumento de produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide nessas células hospedeiras através da eliminação dessa toxicidade. Os métodos geralmente envolvem modulação do nível de hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) em uma célula hospedeira, de modo que o nível de HMG-CoA não é tóxico para uma célula hospedeira e/ou não inibe substancialmente o crescimento celular de uma célula hospedeira. A presente invenção ainda proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas que são adequadas para uso no método em questão. A presente invenção ainda proporciona estruturas de ácido nucléico recombinantes para uso na geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão. A presente invenção ainda proporciona métodos para a identificação de polipeptídeos variantes de HMGR que proporcionam alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA. Os métodos geralmente envolvem determinação do efeito, se houver, de uma variante de HGMR de teste sobre o acúmulo de toxicidade HMG-CoA- induzível em uma célula. A presente invenção ainda proporciona métodos para a identificação de inibidores de HMGS. Os métodos geralmente envolvem determinação do efeito, se houver, de um composto de teste sobre o acúmulo de toxicidade HMG-CoA-induzível em uma célula.

[00065] A presente invenção é baseada, em parte, sobre a observação inesperada de que a HMG-CoA, um intermediário na via de mevalonato, é tóxico quando ela se acumula em um hospedeiro microbiano geneticamente modificado para produzir isopirofosfato de prenila (IPP) ou um precursor de IPP através da via de mevalonato. Essa observação foi feita através de estudo da produção aumentada de compostos de isoprenóide (e/ou precursores, tais como mevalonato, IPP e difosfatos de poliprenila) em células hospedeiras (por exemplo, um microorganismo hospedeiro) que foram transformados ("geneticamente modificados") com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas da via de mevalonato. Enzimas da via de mevalonato são representadas na Figura 2. A via de mevalonato compreende as seguintes reações enzimáticas: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato em 5- fosfato de mevalonato; (e) conversão de 5-fosfato de mevalonato em 5- pirofosfato de mevalonato; e (f) conversão de 5-pirofosfato de mevalonato em pirofosfato de isopentenila. A observação de que aumento do nível de expressão da via de mevalonato resultou em inibição de crescimento celular foi inesperada.

[00066] Pode-se gerar compostos de isoprenóide (para estruturas e métodos adequados, veja Publicações de Patente US Nos. 20030148479 e 20040005678; e Martin et al. (2003) Nature Biotech. 21(7): 796-802) através de expressão da via de mevalonato em uma bactéria. As enzimas da via de mevalonato requeridas para a produção de IPP variam, dependendo das condições de cultura. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira que produz isoprenóide ou compostos precursores de isoprenóide é uma que foi geneticamente modificada com dois ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam quinase de mevalonato (MK), mevalonato fosfoquínase (PMK) e pirofosfato de mevalonato descarboxilase (MPD) (e opcionalmente também pirofosfato de isopentenil isomerase); e uma célula hospedeira é cultivada em meio que inclui mevalonato. Em outras modalidades, uma célula hospedeira que produz isoprenóide ou compostos precursores de isoprenóide é uma que tenha sido geneticamente modificada com dois ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, hidroximetilglutaril- CoA sintase (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductase (HMGR), MK, PMK e MPD (e opcionalmente também IPP isomerase).

[00067] Em um esforço para aumentar os níveis de produção de isoprenóide em hospedeiros geneticamente alterados para conter uma via de mevalonato exógena ou em hospedeiros que já contêm uma via de mevalonato nativa (endógena), pode-se aumentar o nível de atividade das enzimas individuais na via dentro de uma célula. Uma ferramenta comum usada para modular os níveis de atividade de enzimas manipuladas dentro uma célula é modular a taxa na qual um mRNA que codifica a enzima é transcrito. Pode-se tentar obter esse objetivo trocando o promotor (sequência de controle de início de transcrição ou de controle de transcrição) por um promotor mais forte.

[00068] Em células hospedeiras que expressam a via de mevalonato, geralmente se poderia esperar que alteração da resistência do promotor controle a expressão da via de mevalonato inteira alterasse os níveis de produção de isoprenóides. Por exemplo, quando de troca de um promotor lactose-induzível modificado, tal como aquele encontrado em pBluescript e nos plasmídeos pBBR1MCS, por um promotor mais forte, tal como um promotor arabinose- ou lactose-induzível de consenso, geralmente se poderia esperar que a expressão de cada uma das enzimas aumentasse, assim, aumentando os níveis de produção de isoprenóide. Em virtude do fato de a via de mevalonato se alimentar do precursor celular abundante acetil-CoA, não se espera que a produção de IPP seja limitada pela produção de precursor. Contrário àquilo que seria esperado, foi observado que aumento do nível de expressão da primeira metade da via de mevalonato (isto é, aumento do nível de expressão de acetoacetil CoA tiolase, HMGS e HMGR) resultou em inibição de crescimento celular, ainda que a quantidade do produto isoprenóide desejado não tenha sido aumentada.

[00069] Quando de introdução de uma molécula de DNA recombinante em um organismo para a produção de uma enzima, quer a enzima tenha de ser usada cataliticamente dentro uma célula ou purificada de uma célula, efeitos tóxicos podem ser observados (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247-261). Esses efeitos podem ser em virtude de utilização dos recursos celulares do hospedeiro, de uma atividade enzimática inesperada ou do acúmulo de um intermediário tóxico. O último caso pode ser causado por níveis aumentados do produto final da via ou ser específico a uma única enzima para a qual a atividade está em desequilíbrio com aquela das outras enzimas na via, levando ao acúmulo de um intermediário em níveis que são tóxicos para uma célula. Ainda, é difícil prever a priori em qual nível metabolitos de uma via introduzida serão tóxicos ou os níveis nos quais eles começarão a mostrar efeitos tóxicos, uma vez que intermediários quimicamente similares podem ter efeitos intracelulares drasticamente diferentes.

[00070] Por exemplo, os níveis de acetil-CoA podem ser muito altos dentro da célula, sem quaisquer efeitos tóxicos. Foi mostrado que a propionil-CoA é tóxica para Aspergillus nidulans crescida sobre glicose (Brock et al. Eur J. Biochem. 271. 3227-3241 (2004)). E. coli manipulada para acúmulo de PHA usando uma propionil-CoA sintetase não mostra inibição evidente de crescimento propinoil-CoA-induzida e pode ser crescida em altas densidades de células (Choi et al. Appl. Environ. Microbio. 65 4363-4368 (1999)). A sensibilidade ao cafeato, p-cumarato e ferulato foi observada em cepas de Acinetobacter com um ausência de hidroxicinamoil-CoA hidratase/liase potencialmente em virtude de acúmulo de hidroxicinamoil-CoA (Parke et al., Appl. Environ. Microbio. 70, 2974-2983 (2004)). A mesma referência demonstrou sensibilidade aos mesmos três substratos em E. coli quando de superexpressão de hcaC, potencialmente em virtude de acúmulo de hidróxicinamoil- CoA. Superprodução de uma sintetase II da proteína veículo β-cetoacila (KAS II) em E. coli levou ao acúmulo de malonil-CoA em níveis que inibiram o crescimento. Expressão de malonil-CoA:ACP transacilase, a enzima que catalisa a conversão de malonil-CoA em malonil-ACP, junto com KAS II aliviou parcialmente essa toxicidade (Subrahmanyam et al. J. Bact. 180 4596-4602 (1998)). A expressão de ligase de malonil/metilmalonil-CoA em E. coli, combinado com alimentação de metilmalonato, levou a acúmulos de metilmalonil-CoA em tanto quanto 90% do reservatório de acil-CoA. Inibição de crescimento nesse cepa não foi reportada (Murli et al., J Ind. Microbiol. Biotechnol. 30 500-509 (2003)).

[00071] A maioria dos organismos contendo a via de mevalonato, Homo sapiens por exemplo, utiliza HMGR como um ponto regulatório na produção de isoprenóides. Para limitar a produção de isoprenóide, esses organismos reduzem a atividade de HMGR, o que naturalmente promoveria um aumento de seu precursor HMG-CoA. Esse aumento de HMG-CoA presumivelmente também ocorreria em pacientes que estão tomando fármacos para diminuição de colesterol [(tais como as estatinas Atorvastatina (Lipitor), Fluvastatina (Lescol), Lovastatina (Altocor, Mevacor), Pravastatina (Pravachol), Rosuvastatina (Crestor) e Simvastatin (Zocor))], as quais inibem a atividade de HMGR. O uso difundido de fármacos de estatina sem toxicidade sistêmica em virtude de acúmulo de HMG-CoA indicaria que a HMG-CoA é um metabolito não-tóxico para Homo sapiens.

[00072] No caso de toxicidade em virtude de expressarão de enzimas da via de mevalonato, análise de metabolito usando cromatografia de líquido - espectrometria de massa relacionou o fenotipo de inibição de crescimento ao acúmulo do intermediário da via, 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA). Essa constatação demonstra que em células hospedeiras microbianas manipuladas ("geneticamente modificadas"), o intermediário HMG-CoA pode se acumular e causar morte celular ou impedir que uma célula cresça e, portanto, impede a produção de IPP através de limitação do crescimento celular e/ou indicação de um afunilamento no fluxo de carbono aos isoprenóides desejados.

[00073] O acúmulo de HMG-CoA implica que existe um desequilíbrio entre a produção de HMG-CoA e a conversão de sub-sequência de HMG-CoA em mevalonato na via de mevalonato manipulada. Através de aumento da atividade total de reductase de HMG-CoA (HMGR), a qual é a enzima que converte HMG-CoA em mevalonato, essa toxicidade é superada, resultando em um aumento na produção de mevalonato e isoprenóides sintetizados a partir de mevalonato. Outra forma de diminuir o acúmulo de HMG-CoA é limitar a produção de HMG- CoA através de diminuição da atividade total de HMG-CoA (HMGS) sintase, a qual é a enzima que converte acetoacetil-CoA em HMG-CoA. Ainda outra forma de diminuir o acúmulo de HMG-CoA é diminuir o nível e/ou atividade de uma enzima, tal como acetoacetil-CoA tiolase, que afeta a produção de acetoacetil-CoA, a qual é um precursor direto de HMG-CoA.

[00074] De acordo com os métodos da invenção, pode-se sincronizar os níveis de HMG-CoA com aqueles que eliminam a toxicidade e permitem crescimento apropriado de células microbianas, assim, permitindo aumentos significativos na produção de isoprenóide ou precursor de isoprenóide. É importante observar que embora a sincronização dos níveis de HMG-COA possa não levar a um aumento no isoprenóide produzido por uma célula e pode mesmo levar a uma diminuição, um aumento no crescimento celular pode mais do que compensar tais perdas, resultando na produção de mais isoprenóide em uma cultura. Por exemplo e ilustrativamente, se as atividades de HMGS são modificadas de modo que os níveis de HMG-CoA são diminuídos dentro de uma célula e o nível de isoprenóide por célula é diminuído em 10%, mas o crescimento celular é duplicado, a produtividade total da cultura (a atividade por célula multiplicado pelo número de células na cultura) na verdade aumentará. Assim, a produção de IPP ou um composto de isoprenóide pode ser aumentada através de redução do nível de atividade de sintase de HMG-CoA e/ou através de aumento do nível de atividade de reductase de HMG-CoA em uma célula.

[00075] Modulação (aumento ou diminuição) do nível de HMGS ativa e/ou atividade de HMGR em uma célula é obtenível através de: 1) modulação (aumento ou diminuição) da transcrição de um ácido nucléico que codifica a enzima; 2) modulação (aumento ou diminuição) da tradução de um mRNA que codifica a enzima; 3) modulação (aumento ou diminuição) da estabilidade do mRNA que codifica a enzima; 4) modulação (aumento ou diminuição) da estabilidade da enzima em si; e 5) modulação (aumento ou diminuição) da atividade enzimática da enzima. Para reduzir ou eliminar o efeito tóxico de HMG- CoA e aumentar a produção de isoprenóide e/ou precursor de isoprenóide, a presente invenção também proporciona células e ácidos nucléicos e vetores de expressão úteis no preparo de tais células, nos quais a via de mevalonato tenha sido re-projetada de modo que os níveis de HMG-CoA não se tornem tóxicos.

[00076] Esforços para obter maior produção de IPP estão focalizados sobre a super-expressão de enzimas que limitam putativamente a taxa, incluindo HMGR, em células contendo uma via de mevalonato endógena. Veja, por exemplo, Polakowski et al. (1998) Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 67- 71 (produção do isoprenóide esqualeno); Donald et al. (1997) Appl. Env. Microbiol. 63: 3341- 3344 (produção do isoprenóide esqualeno); e Jackson et al. (2003) Org. Letters 5: 1629-1632 (produção do isoprenóide epi-cedrol). Esses relatos não discutem o alívio de toxicidade HMG-CoA-induzida via expressão de HMGR mas, ao contrário, são dirigidos à observação de que, em muitos organismos, a HMGR é o ponto de regulação envolvido para a produção de isoprenóides em organismos que utilizam naturalmente a via de mevalonato para produzir isoprenóides. Nesses casos, a produção do respectivo isoprenóide aumentou três a dez vezes quando de superexpressão da HMGR.

[00077] Os seguintes estudos observaram enzimas da via de mevalonato em E coli. Hamano et al. ((2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65: 1627-1635) reportaram que tentativas de transformar o cepa de E. coli DYM1 com uma estrutura com elevado número de cópias pGEM-MEV, contendo o agrupamento da via de mevalonato de Streptomyces, não obtiveram sucesso. Tentativas de transformar o mesmo cepa com pMW-MEV, uma estrutura com baixo número de cópias contendo o mesmo agrupamento da via de mevalonato, obtiveram sucesso. Os autores sugeriram que a expressão elevada dos genes da via de mevalonato de Streptomyces em E. coli poderia ser letal. Wilding et al. (2000) J Bacteriol 182(15): 4319-27) reportaram que, na presença de mevalonato, as bactérias gram-positivas S. pneumoniae, mutantes carecendo de HMG-CoA sintase e HMG-CoA reductase, eram viáveis, enquanto que mutantes carecendo apenas da HMG-CoA sintase eram não-viáveis.

[00078] Adicionalmente, a presente invenção proporciona métodos de triagem para a identificação de um produto genético tendo atividade de desentoxicação de HMG-CoA. Os métodos geralmente envolvem a) produção de uma célula de teste através de introdução, em uma célula hospedeira geneticamente modificada, de um ácido nucléico exógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto genético candidato, em que uma célula hospedeira geneticamente modificada produz, na ausência de tal ácido nucléico exógeno, HMG-CoA em níveis eficazes para inibir o crescimento da célula hospedeira geneticamente modificada; e b) determinação do efeito, se houver, de expressão do produto genético candidato sobre o crescimento da célula de teste. A redução na inibição de crescimento indica que o ácido nucléico exógeno codifica um produto genético tendo atividade suficiente para aliviar a toxicidade por HMG-CoA.

[00079] Adicionalmente, a presente invenção proporciona métodos de triagem para a identificação de compostos que inibem o acúmulo de HMG-CoA. Os métodos geralmente envolvem a) contato de uma célula de teste que produz HMG-CoA em níveis eficazes para inibir seu crescimento com o composto de teste; e b) determinação do efeito sobre o crescimento celular, se houver, de contato do composto de teste com a célula. A redução na inibição de crescimento indica que o composto exógeno tem atividade suficiente para aliviar a toxicidade por HMG-CoA.

[00080] Conforme mencionado acima, a maioria dos organismos contendo a via de mevalonato, Homo sapiens por exemplo, utiliza HMGR como um ponto regulatório na produção de isoprenóides. Para limitar a produção de isoprenóide, esses organismos reduzem a atividade de HMGR, o que poderia causar um aumento de seu precursor HMG-CoA. Esse aumento de HMG-CoA também ocorreria em pacientes que estão tomando fármacos para diminuição de colesterol, os quais inibem a atividade de HMGR.

[00081] Para auxiliar na compreensão da presente invenção, as Figuras 1-3 são proporcionadas, Figuras as quais ilustram esquematicamente vias biossintéticas que levam à produção de isoprenóide ou precursor de isoprenóide.

[00082] A Figura 1 representa vias de isoprenóide envolvendo modificação de difosfato de isopentenila (IPP) e/ou seu isômero difosfato de dimetilalila (DMAPP) por prenil transferases para gerar os difosfatos de poliprenila difosfato de geranila (GPP), difosfato de farnesila (FPP) e difosfato de geranilgeranila (GGPP). GPP e FPP são ainda modificados pelas terpeno sintases para gerar monoterpenos e sesquiterpenos, respectivamente; e GGPP é ainda modificada pelas terpeno sintases para gerar diterpenos e carotenóides. IPP e DMAPP são gerados por uma de duas vias: a via de mevalonato (MEV) e a via de 1desóxi-D-xilulose-5-fosfato (DXP).

[00083] A Figura 2 representa esquematicamente a via de MEV, onde acetil CoA é convertida, via uma série de reações, em IPP.

[00084] A Figura 3 representa esquematicamente a via de DXP, na qual piruvato e D- gliceraldeído-3-fosfato são convertidos, via uma série de reações, em IPP e DMAPP. Outras células eucariotas que não células de planta usam a via de isoprenóide MEV exclusivamente para converter a acetil-coenzima A (acetil-CoA) em IPP, o qual é subseqüentemente isomerizado em DMAPP. Plantas usam as vias de MEV e a via mevalonato-independente ou de DXP para a síntese de isoprenóide. Procariotas, com algumas exceções, usam a via de DXP para produzir IPP e DMAPP separadamente através de um ponto de ramificação.

MÉTODOS DE ALÍVIO DE TOXICIDADE POR HMG-COA E INTENSIFICAÇÃO DA PRODUÇÃO ISOPRENÓIDES E PRECURSORES DE ISOPRENÓIDE

[00085] A presente invenção proporciona métodos de produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide em uma célula hospedeira que compreende ou é geneticamente modificada para compreender, ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato. Os métodos geralmente envolvem modulação do nível de HMG-CoA em uma célula, de modo que o nível de HMG-CoA não é tóxico para uma célula e/ou não inibe substancialmente o crescimento celular, ainda que o nível de HMG-CoA proporcione produção intensificada de isoprenóide ou precursores de isoprenóide por uma célula. Os métodos geralmente envolvem cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificada em um meio adequado, onde uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma que é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos à célula hospedeira, onde o um ou mais ácidos nucléicos compreendem sequências de nucleotídeo que codificam um ou mais polipeptídeos que proporcionam alívio ou redução de inibição de crescimento celular induzido por acúmulo ou toxicidade por HMG-CoA.

[00086] Polipeptídeos que proporcionam alívio ou redução de inibição de crescimento celular induzido por acúmulo ou toxicidade por HMG-CoA incluem, mas não estão limitados a, HMG-CoA reductase (HMGR), HMG-CoA sintase (HMGS) e uma enzima que afeta o nível de acetoacetil-CoA (o precursor de HMG-CoA) ou mevalonato. O nível de um composto de isoprenóide (e/ou um precursor de isoprenóide a jusante de HMG-CoA, tal como mevalonato, isopirofosfato de prenila (IPP) ou um difosfato de poliprenila) produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada é maior do que o nível do composto de isoprenóide (e/ou um precursor de isoprenóide a jusante de HMG-CoA, tal como mevalonato, IPP ou um difosfato de poliprenila) produzido em uma célula hospedeira de controle ("parental") que não é geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos que codificam HMGS e/ou HMGR. A presente invenção ainda proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas que são adequadas para uso no método em questão. A presente invenção ainda proporciona estruturas de ácido nucléico recombinantes para uso na geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão.

[00087] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método para a redução de toxicidade por HMG-CoA e intensificação da produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide através da via de mevalonato em uma célula hospedeira, onde a célula hospedeira produz o isoprenóide ou precursor de isoprenóide através da via de mevalonato. O método geralmente envolve: (a) modificação genética uma célula hospedeira para conter um ou mais ácidos nucléicos heterólogos que codificam uma ou mais enzimas que, quando produzidas em uma célula, reduzem a inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA, quando comparado com uma célula hospedeira de controle parental que não é geneticamente modificada com os referidos ácidos nucléicos heterólogos; e (b) cultura da célula hospedeira geneticamente modificada sob condições de modo que o nível de isoprenóide ou precursor de isoprenóide produzido em uma célula hospedeira geneticamente modificada seja maior do que o nível de isoprenóide ou precursor de isoprenóide produzido na célula hospedeira de controle parental.

[00088] O nível de HMG-CoA na célula hospedeira parental é modulado através de diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou através de aumento do nível de atividade de HMGR na célula e/ou através de equilíbrio do nível de atividade de HMGS e atividade de HMGR de modo que a toxicidade acúmulo de HMG-CoA-induzível na célula seja aliviada. O nível de HMG-CoA na célula hospedeira parental é também modulado através de modificações genéticas que promovem fluxo equilibrado de metabolitos através da via de mevalonato, conforme descrito em maiores detalhes abaixo.

[00089] A presente invenção é aplicável à células hospedeiras que produzem IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato. Tais células hospedeiras são referidas aqui como células hospedeiras "originais" e compreendem ou são geneticamente modificadas para compreender, ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato (e, portanto, produzir IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato). Células hospedeiras originais exibem toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, onde o nível de HMG-CoA intracelular inibe o crescimento celular, na ausência de uma modificação genética adicional, conforme descrito aqui; assim, por exemplo, a célula hospedeira parental é uma que, quando de uma modificação genética conforme descrito aqui, acumularia HMG-CoA intracelularmente e exibiria toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA. Células hospedeiras originais são geneticamente modificadas para incluir um ou mais ácidos nucléicos heterólogos à célula hospedeira, onde o um ou mais ácidos nucléicos compreendem sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS e que proporcionam um nível aumentado de atividade de HMGR e/ou um nível diminuído de atividade de HMGS em uma célula. A inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA em uma célula hospedeira geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS é reduzida, comparado com a célula hospedeira parental não geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS. Modificação genética da célula hospedeira com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS resulta em: a) um nível diminuído de atividade de HMGS na célula; b) um nível aumentado de atividade de HMGR na célula; c) um nível diminuído de atividade de HMGS e um nível aumentado de atividade de HMGR na célula; ou d) um equilíbrio entre o nível de atividade de HMGS e atividade de HMGR, de modo que a toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA na célula seja aliviada.

[00090] Assim, por exemplo, uma célula hospedeira "parental" (ou "parental") é geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos heterólogos à célula hospedeira, onde o um ou mais ácidos nucléicos compreendem sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS. A célula hospedeira parental é uma que produz IPP através da via de mevalonato e/ou que produz mevalonato através da via de mevalonato. A célula parental compreende ou é geneticamente modificada para compreender, ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato (e produzem IPP através da via de mevalonato e/ou produzem mevalonato através da via de mevalonato). A célula parental exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA.

[00091] A célula parental que tenha sido geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos heterólogos à célula hospedeira, onde o um ou mais ácidos nucléicos compreendem sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS, é referida como a "célula hospedeira geneticamente modificada." A inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA na célula hospedeira geneticamente modificada parental é reduzida, comparado com a célula hospedeira parental não geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS. Além disso, a produção de um isoprenóide ou um precursor de isoprenóide é aumentado na célula hospedeira geneticamente modificada, comparado com a célula hospedeira parental. Assim, por exemplo, a produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide é aumentada em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5- vezes, pelo menos cerca de 10-vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30-vezes, pelo menos cerca de 40-vezes, pelo menos cerca de 50-vezes, pelo menos cerca de 75-vezes, pelo menos cerca de 100-vezes, pelo menos cerca de 200-vezes, pelo menos cerca de 300-vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500-vezes ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, comparado com a célula hospedeira parental.

Diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR

[00092] Em algumas modalidades, o método em questão de diminuição da toxicidade acúmulo de HMG-CoA-induzível uma célula na célula hospedeira compreende diminuição do nível de atividade de HMGS na célula e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula. Diminuição do nível de atividade de HMGS na célula inclui diminuição da quantidade total de polipeptídeo de HMGS dentro da célula; e diminuição da atividade específica de polipeptídeo de HMGS dentro da célula. Assim, em algumas modalidades, o nível de atividade de HMGS na célula é diminuído através de diminuição da quantidade total de HMGS na célula. Em outras modalidades, o nível de atividade de HMGS na célula é diminuído através de diminuição da atividade específica de HMGS na célula. Similarmente, aumento do nível de atividade de HMGR na célula inclui aumento da quantidade total de polipeptídeo de HMGR dentro da célula; e aumento da atividade específica de polipeptídeo de HMGR dentro da célula. Assim, em algumas modalidades, o nível de atividade de HMGR na célula é aumentado através de aumento da quantidade total de HMGR na célula. Em outras modalidades, o nível de atividade de HMGR na célula é aumento através de aumento da atividade específica de HMGR na célula.

[00093] Diminuição do nível de atividade de HMGS na célula é obtida através de uma série de formas incluindo, mas não limitado a: 1) diminuição da transcrição de um ácido nucléico que codifica HMGS; 2) diminuição da tradução de um mRNA que codifica HMGS; 3) diminuição da estabilidade do mRNA que codifica HMGS; 4) diminuição da estabilidade do polipeptídeo de HMGS; e 5) diminuição da atividade enzimática da enzima HMGS. Aumento do nível de atividade de HMGR na célula é obtido através de uma série de formas incluindo, mas não limitado a: 1) aumento da transcrição de um ácido nucléico que codifica HMGR; 2) aumento da tradução de um mRNA que codifica HMGR; 3) aumento da estabilidade do mRNA que codifica HMGR; 4) aumento da estabilidade da enzima HMGR; e 5) aumento da atividade enzimática da enzima HMGR.

[00094] Assim, em algumas modalidades da invenção, o nível não- tóxico desejado de HMG-CoA é obtido através de modulação de atividade de sintase de HMG-CoA e reductase de HMG-CoA na célula. Em uma modalidade, a célula hospedeira parental é uma célula hospedeira de levedo ou uma célula de E. coli que ocorre naturalmente, que é geneticamente modificada com um vetor ou vetores que contêm sequências de codificação de HMGS e HMGR. As enzimas HMGS e HMGR codificadas são produzidas na célula de modo que níveis tóxicos de HMG-CoA não são atingidos e fluxo ótimo através da via é obtido, proporcionando altos rendimentos dos produtos desejados (isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide). Em uma modalidade, as regiões de codificação de HMGS e HMGR são controladas por diferentes promotores. Em outra modalidade, as sequências de codificação de HMGS e HMGR estão sobre diferentes vetores, com a sequência de codificação de HMGS opcionalmente localizada sobre um vetor com menor número de cópias. Em uma modalidade, as sequências de codificação de HMGS e HMGR estão sobre o mesmo óperon, mas a sequência de codificação de HMGR está localizada a montante da sequência de codificação HMGS e essa disposição é diferente de um óperon que ocorre naturalmente contendo sequências de codificação de HMGS e HMGR.

[00095] Em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula reduz o nível de HMG-CoA na célula de modo que a toxicidade e/ou inibição de crescimento pelo nível de HMG-CoA é reduzida. Assim, em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula reduz o nível de HMG-CoA em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90%, comparado com uma célula parental de controle que exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA. O nível de HMG-CoA na célula é prontamente determinado usando cromatografia de líquido- espectrometria de massa e similares.

[00096] Em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento o nível de atividade de HMGR na célula reduz a inibição de crescimento através de acúmulo de HMG-CoA na célula. Assim, em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula reduz a inibição de crescimento acúmulo de HMG-CoA-mediada em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90%, comparado com a célula de controle que exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA. Crescimento de células hospedeiras geneticamente modificadas é prontamente determinado usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, medição da densidade óptica (OD) em torno 600 nm (OD600) de culturas líquidas de bactérias; tamanho de colônia; taxa de crescimento; e similares.

[00097] Em uma modalidade exemplificativa, uma célula parental de controle é uma célula hospedeira procariota que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil- CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde HMG-CoA é produzida e se acumula intracelularmente em níveis que inibem o crescimento ou são tóxicos para a célula. Como um exemplo não-limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR em um único óperon policistrônico na ordem mencionada sobre um plasmídeo ou no cromossoma; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo as sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGR e HMGS em um único óperon policistrônico na ordem mencionada sobre um plasmídeo ou no cromossoma. Como um exemplo não-limitativo adicional, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR em um único óperon policistrônico na ordem mencionada sobre um plasmídeo com número médio de cópias; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica acetoacetil-CoA tiolase e HMGS na ordem mencionada sobre um plasmídeo com baixo número de cópias e uma sequência de nucleotídeos de HMGR sobre um plasmídeo com elevado número de cópias distinto. Como um exemplo não-limitativo adicional, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR em um único óperon policistrônico na ordem mencionada em um plasmídeo com médio número de cópias; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica acetoacetil-CoA tiolase e HMGS na ordem mencionada sobre um plasmídeo com médio número de cópias no qual o sítio de ligação ribossômica tenha sido alterado para reduzir a tradução e uma sequência de nucleotídeos de HMGR sobre um plasmídeo com médio número de cópias distinto para o qual o promotor tenha sido trocado por uma versão mais forte. Como um exemplo não-limitativo adicional, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica tiolase de acetoacetil-CoA, HMGS e HMGR em um único óperon policistrônico na ordem mencionada sobre um plasmídeo com médio número de cópias; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica acetoacetil-CoA tiolase, HMGS com um sítio de protease manipulado e HMGR ao qual uma proteína altamente solúvel, tal como glutationa transferase, tenha sido fundida na ordem mencionada sobre um plasmídeo com médio número de cópias.

[00098] Alteração genética que resulta em alterações na sequência de aminoácido de proteínas, tais como aquelas mencionadas acima, resultarão em alterações na atividade catalítica relativa (conforme medido pela Vmax ou Vmax/Km) de HMGS e HMGR. Assim, em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR resulta em um aumento da proporção de atividade catalítica de HMGR para atividade catalítica de HMGS em uma base por célula de HMGR de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5-vezes, pelo menos cerca de 10-vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30-vezes, pelo menos cerca de 40-vezes, pelo menos cerca de 50-vezes, pelo menos cerca de 75-vezes, pelo menos cerca de 100- vezes, pelo menos cerca de 200-vezes, pelo menos cerca de 300- vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500- vezes ou mais, do que a HMGS na célula hospedeira geneticamente modificada, comparado com a célula hospedeira parental. O crescimento de células hospedeiras geneticamente modificadas é prontamente determinados usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, medição da densidade óptica (OD) em torno 600 nm (OD600) de culturas líquidas de bactérias; tamanho de colônia; taxa de crescimento; e similares.

[00099] Em outra modalidade, a célula de controle parental é uma célula eucariota, por exemplo, a célula de levedo, tal como Saccharomyces cerevisiae. Em algumas dessas modalidades, a célula de controle parental eucariota compreende uma ou mais mutações no gene endógeno da piruvato descarboxilase, de modo que o gene de piruvato descarboxilase está funcionalmente desabilitado e de modo que HMG-CoA se acumula intracelularmente em um nível que inibe o crescimento ou é tóxico para a célula.

[000100] Na prática da invenção, a célula de controle parental é ainda modificada com modificações no ácido nucléico que codifica HMGR ou seus elementos de controle os quais aumentam a transcrição, tradução ou níveis de atividade específica, criando uma célula hospedeira geneticamente modificada. Em uma modalidade, a célula de controle parental é ainda modificada através da introdução de HMGR sobre um plasmídeo sob o controle de um promotor induzível.

[000101] Modificações que reduzem o acúmulo de HMG-CoA através de diminuição do nível de atividade de sintase de HMG-CoA

[000102] Aqueles versados na técnica apreciarão, quando de consideração da presente descrição, que o nível de HMG-CoA depende, pelo menos em parte, do nível de atividade de HMGS na célula. A diminuição antes mencionada na inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA e/ou diminuição nos níveis de HMG- CoA intracelular são, em algumas modalidades, obtidas através de modulação de atividade dos níveis de HMGS na célula. Assim, em algumas modalidades, alívio de toxicidade acúmulo de HMG-CoA- induzida e/ou um nível não-tóxico de HMG-CoA é obtido via modulação do nível de atividade de sintase de HMG-CoA na célula. Nessas modalidades, a célula hospedeira parental que compreende ou é geneticamente modificada para compreender, ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato (e produzem IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato) é geneticamente modificada para incluir um ácido nucléico heterólogo à célula hospedeira, onde o ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS, onde inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA na célula hospedeira geneticamente modificada com o ácido nucléico heterólogo compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGS é reduzida, comparado com a célula hospedeira parental não geneticamente modificada com o ácido nucléico heterólogo compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGS.

[000103] Em uma modalidade, o ácido nucléico heterólogo que codifica HMGS é usado para substituir todo ou parte de um gene de HMGS endógeno. Em outra modalidade, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada para conter um gene de HMGS exógeno; e o gene de HMGS exógeno da célula hospedeira parental é substituído pelo gene de HMGS modificado que proporciona um menor nível de atividade de HMGS, por exemplo, a quantidade de HMGS e/ou a atividade da HMGS é menor do que na célula hospedeira parental. Em outra modalidade, o ácido nucléico heterólogo que reduz o nível de atividade de HMGS codifica um inibidor de HMGS ou um RNA anti-sentido que reduz ta tradução do transcrito de HMGS. Em ambos os casos, embora a taxa de produção de isoprenóide específico ou precursor de isoprenóide da célula hospedeira modificada possa diminuir quando comparado com o cepa parental, o alívio resultante na inibição de crescimento associada à HMG-CoA levaria a maiores densidades celulares, resultando em um aumento global na produção.

[000104] Em algumas modalidades, um ácido nucléico heterólogo é introduzido na célula hospedeira parental e o ácido nucléico heterólogo recombina com um ácido nucléico endógeno que codifica HMGS, desse modo, modificando geneticamente a célula hospedeira parental. Em algumas modalidades, o ácido nucléico heterólogo compreende um promotor que tem resistência reduzida do promotor comparado com o promotor endógeno que controla a transcrição de HMGS endógena e o evento de recombinação resulta em substituição do promotor endógeno pelo promotor heterólogo. Em outras modalidades, o ácido nucléico heterólogo compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HMGS que exibe atividade enzimática reduzida comparado com a HMGS endógena e o evento de recombinação resulta em substituição da sequência de codificação de HMGS endógena pela sequência de codificação de HMGS heteróloga.

[000105] Uma célula hospedeira geneticamente modificada adequada para uso no método em questão é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos, incluindo um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS, de modo que o nível de atividade de HMGS na célula é diminuído. O nível de atividade de HMGS é diminuído na célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90%, comparado com a célula hospedeira parental não geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS. A célula hospedeira parental exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA.

[000106] Em uma modalidade exemplificativa, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira procariota que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil- CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde HMG-CoA é produzida e se acumula intracelularmente em níveis que inibem o crescimento ou são tóxicos para a célula. Como um exemplo não-limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificadas com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo uma versão modificada das sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO: 1 na qual o sítio de ligação a montante HMGS no ribossomo tem sido alterado de tal forma a diminuir a tradução, como um exemplo não limitante, uma célula parental controle é a célula hospedeira E coli, que geneticamente modificada com uma construção de expressão que compreende a sequência de nucleotídeo relativa à SEQ ID N° 1; e a célula hospedeira genéticamente modificada é uma E. Coli genéticamente modificada com construção(ões) de expressão compreendendo uma versão modificada da sequência de nucleotídeo relativo à SEQ ID N° 1 nas quais o sítio de ligação ribossômica a montante da HMGS tenha sido alterado de modo que a tradução é reduzida. Como um exemplo não-limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo uma versão modificada das sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO: 1 nas quais um sítio de RNase tenha sido introduzido na região de codificação de HMGS. Como um exemplo não- limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1 ; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo as sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO: 2. Veja, por exemplo, Figura 5 e Exemplo 2. Como um exemplo não-limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com estrutura(s) de expressão compreendendo as sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 8.

[000107] Em outra modalidade, a célula de controle parental é uma célula eucariota, por exemplo, uma célula de levedo, tal como Saccharomyces cerevisiae.

[000108] Em algumas dessas modalidades, a célula de controle parental eucariota compreende uma ou mais mutações no gene endógeno de descarboxilase de piruvato, de modo que o gene da piruvato descarboxilase está funcionalmente inabilitado e de modo que HMG-CoA se acumula intracelularmente em um nível que inibe o crescimento ou é tóxico para a célula.

[000109] O nível de atividade de HMGS na célula hospedeira geneticamente modificada pode ser diminuído através de uma série de formas incluindo, mas não limitado a, 1) diminuição da resistência de promotor do promotor ao qual a região de codificação de HMGS está operacionalmente ligada; 2) diminuição do número de cópias do plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS; 3) diminuição da estabilidade de um mRNA de HMGS (onde um "mRNA de HMGS" é um mRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS); 4) modificação da sequência do sítio de ligação ribossômica de um mRNA de HMGS, de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGS seja diminuído; 5) modificação da distância e/ou sequência entre o sítio de ligação ribossômica do mRNA de HMGS e o códon inicial da sequência de codificação de HMGS, de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGS seja diminuído; 6) modificação da região intercistrônica 5' inteira do códon inicial da sequência de codificação de HMGS, de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGS seja diminuído; 7) modificação do uso de códon de HMGS, de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGS seja diminuído; 8) diminuição da estabilidade enzimática de HMGS; 9) diminuição da atividade específica (atividade unitária por proteína unitária) de HMGS; e 10) onde HMGS é codificada sobre um óperon, alteração da ordem das regiões de codificação sobre o mRNA policistrônico. Duas ou mais das modificações antes mencionadas podem ser feitas, de forma a diminuir o nível de atividade de HMGS na célula hospedeira geneticamente modificada.

[000110] Em algumas modalidades, o nível de atividade de HMGS é diminuído com relação à atividade de HMGS em uma célula de controle parental através de uso de um plasmídeo com baixo número de cópias, plasmídeo o qual compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS. Diminuição do número de cópias do plasmídeo de um vetor compreende que uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS é obtida através de triagem de uma parte principal de plasmídeo que é conhecida por ser um plasmídeo com um baixo número de cópias. Plasmídeos com um baixo número de cópias geralmente proporcionam menos do que cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula, por exemplo, de cerca de 5 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula. Plasmídeos com baixo número de cópias adequados incluem, mas não estão limitados a, pACYC184, pBR332, pBAD33, pBBRIMCS e pSC101. Por exemplo, pSC101 geralmente está presente na célula em torno 5 cópias por célula. Em uma modalidade da invenção, os níveis de HMGS e HMGR são modulados colocando os dois genes sobre dois vetores de expressão diferentes, de modo que a sequência de codificação de HMGS está sobre um vetor com baixo número de cópias e a sequência de codificação de HMGR está sobre um vetor com elevado número de cópias. Em outra modalidade da invenção, os genes estão sobre o mesmo vetor, mas sob o controle de diferentes promotores, com a sequência de codificação de HMGS estando sob o controle do mais fraco dos dois promotores.

Modificações que reduzem o acúmulo intracelular de HMG-CoA através de aumento do nível de reductase de atividade de HMG-CoA

[000111] Aqueles versados na técnica apreciarão, quando de consideração da presente descrição, que o nível de HMG-CoA depende, pelo menos em parte, do nível de atividade de HMGR na célula. A diminuição antes mencionada na inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA e/ou diminuição dos níveis de HMG- CoA intracelular pode ser obtida de acordo com os métodos da invenção através de modulação dos níveis de atividade de HMGR na célula. Assim, em uma modalidade da invenção, um nível não-tóxico de HMG- CoA e/ou alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA é obtido através de modulação do nível de atividade de reductase de HMG-CoA na célula. Nessas modalidades, a célula hospedeira parental que compreende ou é geneticamente modificada para compreender, ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato e produzem IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato, é geneticamente modificada para incluir um ácido nucléico heterólogo à célula hospedeira, onde o ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR, onde inibição de crescimento acúmulo de HMG-CoA-induzida na célula hospedeira geneticamente modificada com o ácido nucléico heterólogo compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR é reduzida, comparado com uma célula de controle hospedeira parental não geneticamente modificada com o ácido nucléico heterólogo compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR.

[000112] Uma célula hospedeira geneticamente modificada adequada para uso no método em questão é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos, incluindo um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR, de modo que o nível de atividade de HMGR na célula é aumentado. O nível de atividade de HMGR é aumentado na célula em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90%, comparado com uma célula de controle parental não geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR.

[000113] Em uma modalidade exemplificativa, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira procariota que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil- CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde HMG-CoA é produzida e se acumula intracelularmente em níveis que inibem o crescimento ou são tóxicos para a célula. Em uma modalidade, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira procariota que não contém naturalmente a via de mevalonato e que tenha sido geneticamente modificada para produzir mevalonato; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é ainda manipulada para alterar a atividade de HMGR, de modo que os níveis intracelulares de HMG-CoA não são inibitórios ou tóxicos para a célula. Em uma modalidade exemplificativa, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada para produzir mevalonato; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma versão de E. coli geneticamente modificada da célula de controle parental aumentada com outras estruturas que não aquelas listadas nas seguintes referências: Kato-Emori et al., Mol. Genet Genomics (2001) 265: 13542, Learned RM, et al., PNAS (1989) 86: 2779-83, T. Dairi et al., Mol Gen Genet (2000) 262: 957 - 964, Allen et al., Appl Environ. Microbio. (1997). 63: 3341-3344, Hedl et al., J Bacteriol, (2002), 184: 2116-2122; Jackson et al., Org. Lett. (2003) 5: 1629- 1632; J La Mol Y. Hampton et al. (1994) Cell, 125: 299-312; J Varkus Veen et al., FEMS Yeast Res (2003) 4: 87-95; J Beach MJ et al., J Bacteriol (1989) 171: 2994-3001; Bischoff KM et al., Protein Sci (1997) 6: 156-161; Friesen JA et al., Biochemistry. (1997) 36: 2173-7; J Frimpong et al., J Biol Chem. (1994) 269: 11478-83; J Manda et al., Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 143152.

[000114] Como um exemplo não-limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 1; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com a expressão estrutura compreendendo as sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 8. Veja, por exemplo, Figuras 6 e 7 e Exemplos 3 e 4. Como um exemplo não-limitativo, uma célula de controle parental é uma célula hospedeira de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura de expressão compreendendo uma sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 2; e uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma de E. coli geneticamente modificada com a expressão estrutura compreendendo as sequências de nucleotídeo apresentadas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 9. Veja, por exemplo, Figuras 10 e Exemplo 6.

[000115] Em outra modalidade, a célula de controle parental é uma célula eucariota, por exemplo, uma célula de levedo, tal como Saccharomyces cerevisiae. Em algumas dessas modalidades, a célula de controle parental eucariota compreende uma ou mais mutações no gene endógeno de piruvato descarboxilase, de modo que o gene de piruvato descarboxilase está funcionalmente desabilitado e de modo que a HMG-CoA se acumula intracelularmente em um nível que inibe o crescimento ou é tóxico para uma célula.

[000116] O nível de atividade de HMGR na célula hospedeira geneticamente modificada pode ser aumentado através de uma série de formas incluindo, mas não limitado a, 1) aumento da resistência de promotor do promotor ao qual a região de codificação de HMGR está operacionalmente ligada; 2) aumento do número de cópias do plasmídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR; 3) aumento da estabilidade de um mRNA de HMGR (onde um "mRNA de HMGR" é um mRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR); 4) modificação das sequência do sítio de ligação ribossômica de um mRNA de HMGR, de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGR é aumentado; 5) modificação das sequência entre o sítio de ligação ribossômica de um mRNA de HMGR e do códon inicial da sequência de codificação de HMGR, de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGR é aumentado; 6) modificação da região intercistrônica 5' inteira do códon inicial da região de codificação de HMGR, de modo que tradução do mRNA de HMGR é aumentada; 7) modificação do uso de códon de HMGR de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGR é aumentado, 8) expressão de códons raros de tRNAs usados em HMGR de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGR é aumentado; 9) aumento de estabilidade da enzima de HMGR; ou 10) aumento da atividade específica (atividade unitária por proteína unitária) de HMGR. Duas ou mais das modificações precedentes podem ser feitas para proporcionar um nível aumentado de atividade de HMGR.

[000117] Na sequência de nucleotídeos apresentada em SEQ ID NO: 2, a região de codificação de HMGR está sob o controle transcricional do promotor pBAD. Em algumas modalidades, o promotor ao qual a região de codificação de HMGR está operacionalmente ligada é um promotor mais forte do que o promotor pBAD, por exemplo, o nível de transcrito de mRNA é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 5-vezes, pelo menos cerca de 10-vezes ou mais maior do que o nível de transcrito de mRNA usando o promotor pBAD. Promotores adequados incluem, mas não estão limitados a, um promotor lac de consenso, um promotor trp, um promotor tac, um promotor trc, um promotor lambda e um promotor T7.

[000118] Aumento do número de cópias do plasmídeo é obtido selecionando uma parte principal de plasmídeo que é conhecida por ser um plasmídeo com médio ou elevado número de cópias. Plasmídeos com baixo número de cópias geralmente proporcionam menos do que cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula. Plasmídeos com número médio de cópias geralmente proporcionam de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 50 cópias de plasmídeo por célula ou de cerca de 20 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula. Plasmídeos com elevado número de cópias geralmente proporcionam de cerca de 80 cópias de plasmídeo por célula a cerca de 200 cópias de plasmídeo por célula ou mais. Em muitas modalidades, um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR é um vetor de plasmídeo com elevado número de cópias compreendendo um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR. Plasmídeos com elevado número de cópias adequados incluem, mas não estão limitados a, vetores pUC (por exemplo, pUC8, pUC18, pUC19 e similares), vetores pBluescript, vetores pGEM e vetores pTZ.

[000119] Aqueles versados na técnica apreciarão, quando de consideração da presente descrição, que o nível de HMG-CoA na célula pode ser modificado através de modulação dos níveis relativos de atividades de HMGS e HMGR na célula. Assim, em uma modalidade da invenção, o nível não-tóxico desejado de HMG-CoA é obtido através de modulação de atividade da HMG-CoA sintase e HMG-CoA reductase na célula. Em uma modalidade, a célula hospedeira parental é uma célula hospedeira de levedo ou E. coli que ocorre naturalmente que é geneticamente modificada com um vetor ou vetores que contêm sequências de codificação de HMGS e HMGR. As enzimas HMGS e HMGR codificadas são produzidas na célula de modo que níveis tóxicos de HMG-CoA não são atingidos e fluxo ótimo através da via é obtida, proporcionando altos rendimentos dos produtos desejados (isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide). Em uma modalidade, as regiões de codificação de HMGS e HMGR são controladas por diferentes promotores. Em outra modalidade, as sequências de codificação de HMGS e HMGR estão sobre diferentes vetores, com a sequência de codificação de HMGS opcionalmente localizada sobre um vetor com menor número de cópias. Em uma modalidade, as sequências de codificação de HMGS e HMGR estão sobre o mesmo óperon, mas a sequência de codificação de HMGR está localizada a montante da sequência de codificação de HMGS e essa disposição é diferente de um óperon que ocorre naturalmente contendo sequências de codificação de HMGS e HMGR.

Modificações que reduzem o acúmulo de HMG-CoA através de equilíbrio do fluxo através da via de mevalonato

[000120] Em algumas modalidades, inibição de crescimento ou toxicidade induzida por acúmulo de HMG-CoA é reduzida através de equilíbrio do fluxo de metabolitos através da via. O fluxo de metabolitos pode ser equilibrado através de uma série de formas incluindo, mas não limitado a 1) mutações em enzimas a montante (isto é, AtoB, AtoC, AtoA, AtoD) da HMGS que limitam o substrato (AcetoAcetil-CoA) disponível para a enzima; 2) alterações na expressão de enzimas a montante (por exemplo, AtoC, AtoA, AtoD e enzimas envolvidas na biossíntese de ácido graxo) da HMGS que limitam o substrato (acetoacetil-CoA) disponível para a enzima; 3) alterações na expressão de enzimas a jusante (isto é, MK, PMK, MVD) da HMGR que eliminam o suprimento de mevalonato e, assim, promovem a conversão de HMG- CoA em mevalonato; 4) mutações que alteram as características catalíticas de enzimas a jusante (isto é, MK, PMK, MVD) da HMGR que eliminam o suprimento de mevalonato e, assim, promovem a conversão de HMG-CoA em mevalonato; 5) fusões de proteína de HMGR com uma enzima a montante (isto é, tiolase de acetoacetil-CoA, HMGS) para combinar a expressão de uma enzima que produz HMG-CoA em HMGR; 6) fusões de proteína de HMGS com uma enzima a jusante (isto é, MK) para combinar a expressão de uma enzima que produz HMG- CoA com uma enzima responsável pelo movimento de metabolitos da HMG-CoA.

Aumento da produção de isoprenóide ou precursor de isoprenóide

[000121] Os métodos acima descritos resultam em alívio da toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA e/ou inibição do crescimento celular na célula; e proporcionam produção aumentada de um composto de isoprenóide e/ou um composto precursor de isoprenóide na célula. Assim, a presente invenção proporciona métodos para aumento da produção de um composto de isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide na célula, onde os métodos geralmente envolvem modulação dos níveis de HMG-CoA na célula, de modo que os níveis de HMG-CoA permanecem abaixo de um nível tóxico ou inibitório de crescimento e ainda estão em um nível que é alto o bastante para proporcionar produção aumentada de um composto de isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide.

[000122] A presente invenção proporciona métodos para aumento da produção de um composto de isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide (por exemplo, mevalonato, IPP, um difosfato de poliprenila, etc.) por uma célula ou culturas de células. Os métodos geralmente envolvem aumento do nível de atividade de HMGR e/ou diminuição do nível de atividade de HMGS na célula que exibe inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA. Uma célula que exibe inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA é, em algumas modalidades, uma célula hospedeira parental que normalmente não sintetiza IPP ou mevalonato através da via de mevalonato e que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam enzima(s) da via de mevalonato, enzimas as quais são produzidas em níveis que resultam em acúmulo tóxico ou inibitório de crescimento de HMG-CoA na célula. Uma célula que exibe inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA é, em algumas modalidades, uma célula hospedeira parental que normalmente sintetiza IPP ou mevalonato através da via de mevalonato, mas que é geneticamente modificada de modo que a HMG-CoA intracelular se acumula em níveis tóxicos ou inibitórios de crescimento. Em uma modalidade, o composto é o composto precursor de isoprenóide IPP. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma célula de E. coli. Em outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de levedo.

[000123] Em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula aumenta a produção de mevalonato por uma célula hospedeira geneticamente modificada ou por uma cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificada. Assim, em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula aumenta a produção de mevalonato em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5-vezes, pelo menos cerca de 10- vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30-vezes, pelo menos cerca de 40-vezes, pelo menos cerca de 50-vezes, pelo menos cerca de 75- vezes, pelo menos cerca de 100-vezes, pelo menos cerca de 200- vezes, pelo menos cerca de 300-vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500-vezes ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, comparado com a célula hospedeira parental. A produção de mevalonato é prontamente determinada usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, cromatografia gasosa- espectrometria de massa, cromatografia de líquido-espectrometria de massa, cromatografia de íons-espectrometria de massa, cromatografia em camada fina, detecção amperométrica pulsada, espectrometria por uv vis e similares.

[000124] Em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula aumenta a produção de IPP por uma célula hospedeira geneticamente modificada ou por uma cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificada. Assim, em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula aumenta a produção de IPP em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5 -vezes, pelo menos cerca de 5 -vezes, pelo menos cerca de 10-vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30-vezes, pelo menos cerca de 40-vezes, pelo menos cerca de 50- vezes, pelo menos cerca de 75-vezes, pelo menos cerca de 100-vezes, pelo menos cerca de 200-vezes, pelo menos cerca de 300-vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500-vezes ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, comparado com a célula hospedeira parental. A produção de IPP prontamente determinada usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, cromatografia de líquido-espectrometria de massa, cromatografia em camada fina, cromatografia de íons-espectrometria de massa, detecção amperométrica pulsada, espectrometria por uv vis e similares.

[000125] Em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula aumenta a produção de isoprenóide por uma célula hospedeira geneticamente modificada. Assim, em algumas modalidades, diminuição do nível de atividade de HMGS e/ou aumento do nível de atividade de HMGR na célula aumenta a produção de mevalonato em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5-vezes, pelo menos cerca de 10-vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30- vezes, pelo menos cerca de 40-vezes, pelo menos cerca de 50-vezes, pelo menos cerca de 75- vezes, pelo menos cerca de 100-vezes, pelo menos cerca de 200- vezes, pelo menos cerca de 300-vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500-vezes ou mais, na célula hospedeira geneticamente modificada, comparado com a célula hospedeira parental. A produção de isoprenóide é prontamente determinada usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, cromatografia gasosa- espectrometria de massa, cromatografia de líquido-espectrometria de massa, cromatografia de íons-espectrometria de massa, cromatografia em camada fina, detecção amperométrica pulsada, espectrometria por uv vis e similares.

[000126] Em algumas modalidades, o método em questão proporciona produção intensificada de isoprenóide ou precursor de isoprenóide por célula, por exemplo, a quantidade de isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide produzida usando o método em questão é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5-vezes, pelo menos cerca de 10-vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30-vezes, pelo menos cerca de 40- vezes, pelo menos cerca de 50-vezes, pelo menos cerca de 75-vezes, pelo menos cerca de 100-vezes, pelo menos cerca de 200- vezes, pelo menos cerca de 300-vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500-vezes ou mais, maior do que a quantidade do isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide produzida por uma célula de controle parental, em uma base por célula. A quantidade de célula é medida através de medição do peso seco da célula ou medição da densidade óptica de uma cultura de célula.

[000127] Em outras modalidades, o método em questão proporciona produção intensificada de isoprenóide ou precursor de isoprenóide por volume unitário de cultura de célula, por exemplo, a quantidade de isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide produzida usando o método em questão é de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5 -vezes, pelo menos cerca de 10-vezes, pelo menos cerca de 20-vezes, pelo menos cerca de 30- vezes, pelo menos cerca de 40-vezes, pelo menos cerca de 50-vezes, pelo menos cerca de 75-vezes, pelo menos cerca de 100-vezes, pelo menos cerca de 200-vezes, pelo menos cerca de 300-vezes, pelo menos cerca de 400-vezes ou pelo menos cerca de 500-vezes ou mais, maior do que a quantidade do isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide produzida por uma célula de controle parental, em uma base por volume unitário de cultura de célula.

[000128] Em algumas modalidades, o método em questão para aumento da produção de um composto de isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide compreende modulação da composição do meio no qual uma célula hospedeira é cultivada, de modo que o nível de intermediários da via de mevalonato (por exemplo, acetil-CoA) é aumentado. Em algumas modalidades, o meio de cultura compreende acetato, o qual aumenta o nível de acetil-CoA e a qual, por sua vez, aumenta o nível de HMG-CoA na célula.

[000129] Isoprenóides que podem ser produzidos usando o método da invenção incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos incluindo, mas não limitado a, limoneno, citranelol, geraniol, mentol, álcool perilílico, linalool, thujone; sesquiterpenos incluindo, mas não limitado a, periplanona B, gingcolídeo B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootkatona, epi-cedrol, epi- aristolocheno, farnesol, gossipol, sanonina, periplanona e forskolina; diterpenos incluindo, mas não limitado a, casbeno, eleuterobina, paclitaxel, prostratina e pseudopterosina; triterpenos incluindo, mas não limitado a, arbrusida E, bruceantina, testosterona, progesterona, cortisona, digitoxina. Isoprenóides também incluem, mas não estão limitados a, carotenóides, tais como licopeno, «- e β-caroteno, «- e β- criptoxantina, bixina, zeaxantina, astaxantina e luteína. Isoprenóides também incluem, mas não estão limitados a, triterpenos, compostos esteroidais e compostos que são feitos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tais como terpeno-alcalóides misturados e coenzima Q-10.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADA

[000130] A presente invenção proporciona células hospedeiras geneticamente modificadas; e composições compreendendo uma células hospedeiras geneticamente modificadas. Células hospedeiras geneticamente modificada são úteis para a produção de um composto de isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide, conforme discutido acima.

[000131] Conforme discutido acima, o método em questão para produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide geralmente envolve cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificada em um meio adequado. Uma célula hospedeira geneticamente modificada é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas que, quando produzidas na célula, aliviam a inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA (toxicidade) na célula. A célula parental (por exemplo, uma célula não geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas que, quando produzidas na célula, aliviam a inibição de crescimento e/ou toxicidade induzida por acúmulo de HMG- CoA na célula) é uma célula que produz ou é geneticamente modificada para produzir IPP através da via de mevalonato.

[000132] Assim, por exemplo, uma célula hospedeira "parental" (ou "parental") é geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos heterólogos à célula hospedeira, onde o um ou mais ácidos nucléicos compreendem sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS. A célula hospedeira parental produz IPP através da via de mevalonato e/ou produz mevalonato através da via de mevalonato. A célula parental compreende ou é geneticamente modificada para compreender ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato (e produzem IPP através da via de mevalonato e/ou produzem mevalonato através da via de mevalonato). A célula parental que tenha sido geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos heterólogos à célula hospedeira, onde o um ou mais ácidos nucléicos compreendem sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS, é referida como a "célula hospedeira geneticamente modificada." Inibição de crescimento acúmulo de HMG-CoA- induzida na célula hospedeira parental geneticamente modificada é reduzida, comparado com a célula hospedeira parental não geneticamente modificada com o um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGR e/ou HMGS. Ainda, uma célula hospedeira geneticamente modificada exibe níveis aumentados de mevalonato ou produtos de isoprenóide derivados da combinação de aumento, por célula, da produção de mevalonato e/ou viabilidade celular aumentada. Deve ser compreendido que a presente invenção pode ser iterativamente aplicada à produção crescente de compostos de isoprenóide de modo que, em um contexto, uma linhagem de células em particular pode ser uma célula hospedeira geneticamente modificada e, então, em um contexto posterior, ela pode ser a célula hospedeira parental utilizada como um ponto inicial para aperfeiçoamento adicional. Alternativamente, a presente invenção ensina a toxicidade por acúmulo de HMG-CoA e permite a construção de novos sistemas genéticos e células hospedeiras associadas que evitam a toxicidade por HMG-CoA de outro modo associada à produção de isoprenóide em alto nível. Assim, se uma célula hospedeira geneticamente modificada pode ser ainda geneticamente modificada para produzir uma célula que exibe viabilidade celular diminuída em virtude de acúmulo de HMG-CoA, a célula ainda geneticamente modificada na verdade será a célula hospedeira parental com relação à célula hospedeira inicial geneticamente modificada.

[000133] Em algumas modalidades, a célula parental é uma célula que não produz normalmente IPP ou mevalonato através da via de mevalonato; por exemplo, a célula parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato. Como um exemplo, a célula parental é uma célula procariota que não produz normalmente IPP ou mevalonato através da via de mevalonato e que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil- CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde os níveis de acetoacetil-CoA tiolase e atividade de HMGS são de modo que HMG-CoA se acumula intracelularmente em um nível que inibe o crescimento ou é tóxico. Um exemplo é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 1. Um segundo exemplo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 2.

[000134] Em outras modalidades, a célula parental é uma célula que normalmente produz IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato, por exemplo, a célula parental é uma célula que compreende ácidos nucléicos endógenos que codificam uma ou mais enzimas na via de mevalonato. Nessas modalidades, a célula parental é geneticamente modificada de modo que o nível de HMG-CoA que se acumula intracelularmente é tóxico ou inibe o crescimento em uma célula. Como um exemplo, uma ou mais mutações são introduzidas em um gene de piruvato descarboxilase de uma célula hospedeira que normalmente produz IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato, de modo que o gene de piruvato descarboxilase está funcionalmente desabilitado e de modo que a HMG-CoA se acumula intracelularmente em um nível que é tóxico para a célula. A célula parental, nesse caso, é uma célula hospedeira que normalmente produz IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato e que tenha sido geneticamente modificada para introduzir uma ou mais mutações no gene endógeno de piruvato descarboxilase, de modo que o gene de piruvato descarboxilase está funcionalmente desabilitado.

[000135] Para gerar a célula hospedeira geneticamente modificada em questão, um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma enzima que alivia a inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA é introduzida estável ou transitoriamente na célula hospedeira parental usando técnicas estabelecidas incluindo, mas não limitado a, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção lipossoma-mediada e similares. Para transformação estável, um ácido nucléico geralmente ainda incluirá um marcador selecionável, por exemplo, qualquer um de vários marcadores selecionáveis bem-conhecidos, tais como resistência à neomicina, resistência à ampicilina, resistência à tetraciclina, resistência ao cloranfenicol, resistência à canamicina e similares.

Enzimas da via de mevalonato

[000136] Conforme observado acima, a célula parental é uma célula hospedeira que produz ou é geneticamente modificada para produzir IPP através da via de mevalonato e/ou mevalonato através da via de mevalonato e que exibe toxicidade ou inibição de crescimento induzida pelo acúmulo de HMG-CoA. A via de mevalonato compreende: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA com acetoacetil-CoA; (b) condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG- CoA; (c) conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato em 5-fosfato de mevalonato; (e) conversão de 5-fosfato de mevalonato em 5-pirofosfato de mevalonato; e (f) conversão de 5- pirofosfato de mevalonato em pirofosfato de isopentenila. As enzimas da via de mevalonato requeridas para a produção de IPP variam, dependendo das condições de cultura.

[000137] Em algumas modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR e a célula hospedeira parental é uma que produz mevalonato. Um exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 1 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificada em SEQ ID NO: 1. Um outro exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificada em SEQ ID NO: 2. Um outro exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de levedo que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificada em SEQ ID NO: 7. Um outro exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma ou mais estruturas compreendendo sequências de nucleotídeo conforme apresentado em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6 ou sequências de nucleotídeo que codificam enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificada em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 6. Um outro exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma ou mais estruturas compreendendo as sequências de nucleotídeo conforme apresentado em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7 ou sequências de nucleotídeo que codificam enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificada em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 7. Um outro exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma ou mais estruturas compreendendo sequências de nucleotídeo conforme apresentado em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 11 ou sequências de nucleotídeo que codificam enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificadas em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 11. Um outro exemplo não-limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de levedo que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos compreendendo genes da via de mevalonato codificados em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7 ou uma sequência de nucleotídeos que codificam enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas da via de mevalonato codificadas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7. Um outro exemplo não- limitativo da célula hospedeira parental é uma célula de levedo que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos compreendendo enzimas da via de mevalonato codificadas em SEQ ID NO: 11 ou uma sequência de nucleotídeos que codifica enzimas funcionalmente análogas àquelas enzimas codificadas em SEQ ID NO: 11.

[000138] Em outras modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam de acetoacetil-CoA tiolase, HMGS, HMGR, mevalonato quinase (MK), mevalonato fosfoquínase (PMK) e pirofosfato de mevalonato descarboxilase (MPD) (e opcionalmente também IPP isomerase). Um exemplo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4. Um outro exemplo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4.

[000139] Em algumas modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam de quinase mevalonato (MK), fosfoquínase mevalonato (PMK) e de pirofosfato de mevalonato descarboxilase (MPD) (e opcionalmente também de pirofosfato de isopentenil isomerase); e a célula hospedeira parental é cultivada em um meio que inclui mevalonato.

[000140] Em outras modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, hidróximetilglutaril-CoA sintase (HMGS), hidroximetilglutaril-CoA reductase (HMGR), MK, PMK e MPD (e opcionalmente também IPP isomerase).

[000141] Em outras modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam MK, PMK, MPD, isomerase de IPP e prenil transferase. Em outras modalidades, a célula hospedeira parental é uma que é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam tiolase de acetoacetil-CoA, HMGS, HMGR, MK, PMK, MPD, IPP isomerase e prenil transferase. Um exemplo da célula hospedeira parental é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 25 SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5. Um outro exemplo é uma célula de E. coli que tenha sido geneticamente modificada com uma estrutura compreendendo uma sequência de nucleotídeos conforme apresentado em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 5.

[000142] Em outras modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tem uma via de mevalonato nativa (endógena) e tenha sido geneticamente modificada de modo que o nível de HMG-CoA é aumentado com relação a uma célula hospedeira não modificada e de modo que o acúmulo de HMG-CoA causa inibição de crescimento. Em uma modalidade exemplificativa, a cepa parental é Saccharomyces cerevisiae que tenha sido geneticamente modificado para produção aumentada de acetil-CoA, através de introdução de uma ou mais modificações genéticas, de modo que uma ou mais de uma fosfotransacetilase, lactato desidrogenase e piruvato descarboxilase esteja funcionalmente desabilitada (por exemplo, via ausência).

[000143] Células hospedeiras (incluindo células hospedeiras originais e células hospedeiras geneticamente modificada) são, em muitas modalidades, organismos unicelulares ou são crescidas em cultura como células únicas. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é uma célula eucariota. Células eucariotas hospedeiras adequadas incluem, mas não estão limitadas a, células de levedo, células de inseto, células de planta, células fúngicas e células de algas. Célula eucariotas hospedeiras adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polimorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii e similares. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma outra célula eucariota que não uma célula de planta.

[000144] Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula procariota. Células procariotas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, qualquer uma de variedade de cepas para laboratório de Escherichia coli, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp. e similares. Veja, por exemplo, Carrier et al. (1992) J Immunol. 148: 11761181; Patente US 6.447.784; e Sizemore et al. (1995) Science 270: 299302. Exemplos de cepas de Salmonella as quais podem ser empregadas na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, Salmonella typhi e S. typhimurium. Cepas de Shigella adequados incluem, mas não estão limitados a, Shigella flexneri, Shigella sonnei e Shigella disenteriae. Tipicamente, a cepa para laboratório é um que é não-patogênica. Exemplos não-limitativos de outras bactérias adequadas incluem, mas não estão limitados a, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp. e similares. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é Escherichia coli.

[000145] Conforme observado acima, em algumas modalidades, a célula hospedeira parental é uma que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos heterólogos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam enzima(s) da via de mevalonato. Para modificar geneticamente a célula hospedeira parental de modo que ela produza IPP através da via de mevalonato e/ou produza mevalonato através da via de mevalonato, um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas da via de mevalonato são introduzidos estável ou transitoriamente na célula hospedeira usando técnicas estabelecidas incluindo, mas não limitado a, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrana, transfecção mediada por lipossoma e similares. Para transformação estável, um ácido nucléico geralmente ainda incluirá um marcador selecionável, por exemplo, qualquer um de vários marcadores selecionáveis bem-conhecidos, tais como resistência à neomicina, resistência à ampicilina, resistência à tetraciclina, resistência ao cloranfenicol, resistência à canamicina e similares.

[000146] Em muitas modalidades, o ácido nucléico com o qual uma célula hospedeira é geneticamente modificada de modo que ela produza IPP e/ou mevalonato através da via de mevalonato é um vetor de expressão que inclui um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica enzima(s) da via de mevalonato. Similarmente, em muitas modalidades, o ácido nucléico com o qual a célula hospedeira parental é geneticamente modificada, de modo que toxicidade e/ou inibição de crescimento celular induzida pelo acúmulo de HMG-CoA seja reduzida, é um vetor de expressão que inclui um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais enzimas que proporcionam alívio de toxicidade e/ou inibição de crescimento celular induzida pelo acúmulo de HMG- CoA. Vetores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, vetores de baculovírus, vetores de bacteriófago, plasmídeos, fagemídeos, cosmídeos, fosmídeos, cromossomas bacterianos artificiais, vetores virais (por exemplo, vetores virais baseados no vírus da vaccinia, poliovírus, adenovírus, vírus adeno- associado, SV40, vírus do herpes simplex similares), cromossomas artificiais P1-baseados, plasmídeos de levedo, cromossomas artificiais de levedo e quaisquer outros vetores específicos para hospedeiros de interesse específicos (tais como E. coli e levedo). Assim, por exemplo, um ácido nucléico que codifica um produto genético da via de mevalonato é incluído em qualquer um de uma variedade de vetores de expressão que expressa o produto genético da via de mevalonato. Tais vetores incluem sequências de DNA cromossômicas, não cromossômicas e sintéticas.

[000147] Numerosos vetores de expressão adequados são conhecidos por aqueles versados na técnica e muitos estão comercialmente disponíveis. Os seguintes vetores são proporcionados à guisa de exemplo; para células hospedeiras bacterianas: vetores pQE (Qiagen), plasmídeos pBluescript, vetores pNH, vetores lambda-ZAP (Stratagene); pTrc99a, pKK223-3, [rho]DR540 e pRIT2T (Pharmacia); para células hospedeiras eucariotas: pXTl, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG e pSVLSV40 (Pharmacia). Contudo, qualquer outro plasmídeo ou outro vetor pode ser usado, na medida em que ele seja compatível com a célula hospedeira.

[000148] Para geração da célula hospedeira parental compreendendo um ou mais ácidos nucléicos heterólogos que codificam sequências de nucleotídeo que codificam enzimas da via de mevalonato, a sequência de nucleotídeos que codifica enzima da via de mevalonato é inserida em um vetor de expressão. A sequência de nucleotídeos que codifica enzima da via de mevalonato no vetor de expressão é operacionalmente ligada a uma sequência de controle de expressão apropriada (por exemplo, um promotor) para direcionar a síntese do produto genético codificado. Similarmente, para a geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada a partir de uma célula hospedeira parental, um vetor de expressão compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam, por exemplo, HMGS e/ou HMGR, será usado. As sequências de codificação de HMGS e/ou HMGR são operacionalmente ligadas à sequência(s) de controle de expressão apropriada(s) para direcionar a síntese do produto genético codificado. Dependendo do sistema de hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de uma série de elementos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e induzíveis, elementos intensificadores de transcrição, terminadores de transcrição, etc., podem ser usados no vetor de expressão (veja, por exemplo, Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153: 516-544).

[000149] Promotores adequados para uso em células hospedeiras procariotas incluem, mas não estão limitados a, um promotor de RNA polimerase T7 de bacteriófago; um promotor trp; um promotor do óperon lac; um promotor híbrido, por exemplo, um promotor híbrido lac/tac, um promotor híbrido tac/trc, um promotor trp/lac, um promotor T7/lac; um promotor trc; um promotor tac e similares; um promotor araBAD; promotor regulados in vivo, tal como um promotor ssaG ou um promotor relacionado (veja, por exemplo, Publicação de Patente US 20040131637), um promotor pagC (Pulkkinen e Miller, J Bacteriol, 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), um promotor nirB (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6: 2805-2813) e similares (veja, por exemplo, Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67: 5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22: 3243-3255; e Chatfield et al. (1992) Biotechnol. 10: 888-892); um promotor sigma70, por exemplo, um promotor sigma70 de consenso (veja, por exemplo, Nos. de Acesso ao GenBank AX798980, AX798961 e AX798183); um promotor de fase estacionária, por exemplo, um promotor dps, um promotor spv e similares; um promotor derivado da ilha de patogenicidade SPI-2 (veja, por exemplo, WO96/17951); um promotor actA (veja, por exemplo, Shetron- Rama et al. (2002) Infect. Immun. 70: 1087-1096); um promotor rpsM (veja, por exemplo, Valdivia e Falkow (1996). Mol. Microbiol. 22: 367-378); um promotor tet (veja, por exemplo, Hillen,W. e Wissmann, A. (1989) em Saenger, W. e Heinemann, U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, Londres, Reino Unido, Vol. 10, páginas 143162); um promotor SP6 (veja, por exemplo, Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 7035-7056); e similares.

[000150] Exemplos não-limitativos de promotores eucariotas adequados incluem o promotor precoce imediato de CMV, timidina de HSV quinase, SV40 tardio e precoce, LTRs de retrovírus e metalotioneína-I de camundongo. Triagem do vetor e promotor apropriados está bem dentro do nível aqueles versados na técnica. O vetor de expressão também pode conter um sítio de ligação ribossômica para início de tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão pode incluir também sequências apropriadas para amplificação de expressão.

[000151] Além disso, os vetores de expressão conterão, em muitas modalidades, um ou mais genes marcadores selecionáveis para proporcionar uma característica fenotípica para triagem de células hospedeiras transformadas, tais como dihidrofolato reductase ou resistência à neomicina para cultura de células eucariotas ou tal como resistência à tetraciclina ou ampicilina em células hospedeiras procariotas, tal como E. coli.

[000152] Geralmente, vetores de expressão recombinantes incluirão origens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem a transformação de uma célula hospedeira, por exemplo, o gene de resistência à ampicilina de E. coli, o gene TRP1 de S. cerevisiae, etc.; e um promotor derivado de um gene altamente expresso para direcionar a transcrição das sequências de codificação. Tais promotores podem ser derivados de óperons que codificam enzimas glicolíticas, tais como 3-fosfoglicerato quinase (PGK), «-fator, fosfatase ácida ou proteínas de choque térmico, dentre outros.

[000153] Em muitas modalidades, a célula hospedeira parental compreende sequências de nucleotídeos que codificam enzimas da via de mevalonato operacionalmente ligadas a um promotor induzível. Similarmente, em muitas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificada compreenderá uma sequência de nucleotídeo que codifica HMGR e/ou HMGS operacionalmente ligada a um promotor induzível. Promotores induzíveis são bem-conhecidos na técnica. Promotores induzíveis adequados incluem, mas não estão limitados, ao promotor de bacteriófago X; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); um promotor induzível por isopropil-beta-D- tiogalactopiranosídeo (IPTG), por exemplo, um promotor lacZ; um promotor induzível por tetraciclina; um promotor induzível por arabinose, por exemplo, pBAD (veja, por exemplo, Guzman et al. (1995) J Bacteriol. 177: 4121-4130); um promotor induzível por xilose, por exemplo, Pxil (veja, por exemplo, Kim et al. (1996) Gene 181: 71-76); um promotor GAL1; um promotor de triptofano; um promotor lac; um promotor induzível por álcool, por exemplo, um promotor induzível por metanol, um promotor induzível por etanol; um promotor induzível por rafinose; um promotor induzível pelo calor, por exemplo, o promotor induzível pelo calor lambda PL, um promotor controlado por um repressor sensível ao calor (por exemplo, vetores de expressão baseados no lambda C1857-reprimido; veja, por exemplo, Hoffmann et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 177(2): 327-34); e similares.

[000154] Em muitas modalidades, a célula hospedeira parental é gerada através de modificação genética de uma célula hospedeira com um ácido nucléico que inclui uma sequência de nucleotídeos que codificam um produto genético da via de mevalonato, onde uma sequência de nucleotídeos que codificam um produto genético da via de mevalonato é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Similarmente, em algumas modalidades, uma sequência de codificação de HMGS e/ou HMGR é operacionalmente ligada a um promotor constitutivo. Promotores constitutivos adequados para uso em células procariotas são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, um promotor sigma70, por exemplo, um promotor sigma70 de consenso.

[000155] Em levedo, uma série de vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis podem ser usados. Para uma revisão veja Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Capítulo 13; Grant, et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeast, em Methods in Enzymology, Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N. Y., Vol. 153, páginas 516-544; Glover, 1986. DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C, Capítulo 3; e Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y., Vol. 152, páginas 673-684; e The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I e II. Um promotor constitutivo de levedo, tal como ADH ou LEU2, ou um promotor induzível, tal como GAL, pode ser usado (Cloning in Yeast, Capítulo 3, R. Rothstein em: DNA Cloning Vol. 11. A Practical Approach, Ed. DM Glover, 1986. IRL Press, Wash., D.C.). Alternativamente, vetores podem ser usados os quais promovem a integração de sequências de DNA estranhas no cromossoma do levedo.

[000156] Onde a célula hospedeira parental foi geneticamente modificada para produzir duas ou mais enzimas da via de mevalonato, sequências de nucleotídeo que codificam as duas ou mais enzimas poderão estar, em algumas modalidades, cada uma contida em vetores de expressão distintos. Onde uma célula hospedeira é geneticamente modificada para expressar uma ou mais enzimas da via de mevalonato, sequências de nucleotídeo que codificam as uma ou mais enzimas da via de mevalonato estarão, em algumas modalidades, contidas em um único vetor de expressão. Onde sequências de nucleotídeo que codificam as uma ou mais enzimas da via de mevalonato estão contidas em um único vetor de expressão, em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeo serão operacionalmente ligadas a um elemento de controle em comum (por exemplo, um promotor), por exemplo, o elemento de controle em comum controla a expressão de todas as sequências de nucleotídeo que codificam enzimas da via de mevalonato sobre um único vetor de expressão.

[000157] Onde sequências de nucleotídeo que codificam enzima(s) da via de mevalonato estão contidas em um único vetor de expressão, em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeos serão operacionalmente ligadas a elementos de controle diferentes (por exemplo, um promotor), por exemplo, os diferentes elementos de controle de expressão de cada sequência de nucleotídeo que codifica enzima(s) da via de mevalonato separadamente sobre um único vetor de expressão.

[000158] Onde a célula hospedeira parental é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam enzima(s) que proporcionam alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, em algumas modalidades, as enzimas serão codificadas sobre duas estruturas de expressão diferentes (distintas). Por exemplo, em algumas modalidades, HMGR será expressa a partir de um plasmídeo com elevado número de cópias, enquanto que HMGS será expressa a partir de um plasmídeo com baixo número de cópias, sob o controle de um promotor idêntico. Em outras modalidades, HMGR e HMGS serão expressas a partir de plasmídeos com número de cópias similar, com HMGR sendo expressa por um promotor mais forte do que a HMGS. Onde a célula hospedeira parental é geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam enzima(s) que proporcionam alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, em algumas modalidades, as enzimas serão codificadas sobre uma única estrutura de expressão. Por exemplo, em algumas modalidades, HMGR e HMGS serão expressas a partir de um único plasmídeo sob o controle de um único promotor, de modo que a estabilidade do transcrito de HMGR manipulado seja maior do que aquela da HMGS.

[000159] Onde sequências de nucleotídeo que codificam a(s) enzima(s) que proporcionam alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA estão contidas em uma única estrutura de expressão, em algumas modalidades, as sequências de nucleotídeo serão operacionalmente ligadas a diferentes elementos de controle (por exemplo, promotores), por exemplo, os diferentes elementos de controle controlam a expressão de cada enzima que proporciona alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA separadamente sobre uma única estrutura de expressão. Por exemplo, em algumas modalidades, HMGR e HMGS serão expressas a partir de um único plasmídeo, com HMGR sendo expressa por um promotor mais forte do que a HMGS.

Sequências de nucleotídeo que codificam enzimas da via de mevalonato

[000160] Sequências de nucleotídeo que codificam produtos genéticos da via de MEV são conhecidas na técnica e qualquer sequência de nucleotídeo que codifica produto genético da via de MEV conhecida pode ser usada para gerar a célula hospedeira geneticamente modificada em questão. Por exemplo, sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS5 HMGR, MK, PMK, MPD e IDI são conhecidas na técnica. O seguinte são exemplos não-limitativos de sequências de nucleotídeo conhecidas que codificam produtos genéticos da via de MEV, com números de Acesso ao GenBank e organismo após cada enzima da via de MEV entre parêntesis: acetoacetil-CoA tiolase: (NC_000913 REGIÃO: 232413 1.2325315; E. coli), (D49362; Paracoccus denitrificans) e (L20428; Saccharomyces cerevisiae); HMGS: (NC_001145. complemento 19061..20536; Saccharomyces cerevisiae), (X96617; Saccharomyces cerevisiae), (X83882; Arabidopsis thaliana), (AB037907; Kitasatospora griseola) e (BT007302; Homo sapiens); HMGR: (NM_206548; Drosophila melanogaster), (NM_204485; Gallus gallus), (AB015627; Streptomyces sp. KO- 3988), (AF542543; Nicotiana attenuata), (AB037907; Kitasatospora griseola), (AX128213, que proporciona a sequência que codifica a HMGR truncada; Saccharomyces cerevisiae) e (NCJ)O1145: complemento (115734..118898; Saccharomyces cerevisiae)); MK: (L77688; Arabidopsis thaliana) e (X55875; Saccharomyces cerevisiae); PMK: (AF429385; Hevea brasiliensis), (NM_006556; Homo sapiens), (NCJ)Ol 145. complemento 712315..713670; Saccharomyces cerevisiae); MPD: (X97557; Saccharomyces cerevisiae), (AF290095; Enterococcus faecium) e (U49260; Homo sapiens); e IDI: (NC_000913, 3031087..3031635; E. coli) e (AF082326; Haematococcus pluvialis).

[000161] Em algumas modalidades, a região de codificação de HMGR é apresentada em SEQ ID NO: 13, a qual codifica uma forma truncada de HMGR ("tHMGR") que carece do domínio transmembrana da HMGR do tipo silvestre. O domínio transmembrana da HMGR contém as porções regulatórias da enzima e não tem atividade catalítica.

[000162] A sequência de codificação de qualquer enzima conhecida da via de MEV pode ser alterada de vários formas conhecidas na técnica para gerar alterações alvo na sequência de aminoácido da enzima codificada. O aminoácido de uma enzima variante da via de MEV usualmente será substancialmente similar à sequência de aminoácido de qualquer enzima conhecida da via de MEV, isto é, diferirá em pelo menos um aminoácido e pode diferir em pelo menos dois, pelo menos 5, pelo menos 10 ou pelo menos 20 aminoácidos mas, tipicamente, não mais do que cerca de quinze aminoácidos. As alterações de sequência podem ser substituições, inserções ou deleções. Por exemplo, conforme descrito abaixo, uma sequência de nucleotídeos pode ser alterada com relação à tendência de códon de uma célula hospedeira em particular. Além disso, uma ou mais diferenças na sequência de nucleotídeo podem ser introduzidas as quais resultam em alterações conservativas de aminoácido na proteína codificada. Em uma modalidade, os níveis relativos desejados de HMGS e HMGR e os níveis não-tóxicos de HMG-CoA são obtidos através de expressão de uma proteína alterada de HMGS ou HMGR ou ambos.

Prenil transferases

[000163] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada em questão é geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais enzimas da via de mevalonato, conforme descrito acima; e um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma prenil transferase.

[000164] Prenil transferases constituem um amplo grupo de enzimas que catalisam a condensação consecutiva de IPP, resultando na formação de difosfatos de prenila de vários comprimentos de cadeia. Prenil transferases adequadas incluem enzimas que catalisam a condensação de IPP com substratos de iniciador alílicos para formar compostos de isoprenóide com de cerca de 2 unidades de isopreno a cerca de 6000 unidades de isopreno ou mais, por exemplo, 2 unidades de isopreno (pirofosfato de geranil sintase), 3 unidades de isopreno (pirofosfato de farnesil sintase), 4 unidades de isopreno (pirofosfato de geranilgeranil sintase), 5 unidades de isopreno, 6 unidades de isopreno (hexadecilpirofosfato sintase), 7 unidades de isopreno, 8 unidades de isopreno (fitoeno sintase, octapirofosfato de prenil sintase), 9 unidades de isopreno (nonapirofosfato de prenil sintase), 10 unidades de isopreno (decapirofosfato de prenil sintase), de cerca de 10 unidades de isopreno a cerca de 15 unidades de isopreno, de cerca de 15 unidades de isopreno a cerca de 20 unidades de isopreno, de cerca de 20 unidades de isopreno a cerca de 25 unidades de isopreno, de cerca de 25 unidades de isopreno a cerca de 30 unidades de isopreno, de cerca de 30 unidades de isopreno a cerca de 40 unidades de isopreno, de cerca de 40 unidades de isopreno a cerca de 50 unidades de isopreno, de cerca de 50 unidades de isopreno a cerca de 100 unidades de isopreno, de cerca de 100 unidades de isopreno a cerca de 250 unidades de isopreno, de cerca de 250 unidades de isopreno a cerca de 500 unidades de isopreno, de cerca de 500 unidades de isopreno a cerca de 1000 unidades de isopreno, de cerca de 1000 unidades de isopreno a cerca de 2000 unidades de isopreno, de cerca de 2000 unidades de isopreno a cerca de 3000 unidades de isopreno, de cerca de 3000 unidades de isopreno a cerca de 4000 unidades de isopreno, de cerca de 4000 unidades de isopreno a cerca de 5000 unidades de isopreno ou de cerca de 5000 unidades de isopreno a cerca de 6000 unidades de isopreno ou mais.

[000165] Prenil transferases adequadas incluem, mas não estão limitados a, uma E-isodifosfato de prenil sintase incluindo, mas não limitado a, difosfato de geranil sintase (GPP), difosfato de farnesil sintase (FPP), difosfato de geranilgeranil sintase (GGPP), hexadifosfato de prenil sintase (HexPP), heptadifosfato de prenila sintase (HepPP), difosfato de octaprenil sintase (OPP), difosfato de solanesil sintase (SPP), decadifosfato de prenil sintase (DPP), chicle sintase e guttapercha sintase; e uma Z-isodifosfato de prenil sintase incluindo, mas não limitado a, nonadifosfato de prenila sintase (NPP), undecadifosfato de prenil sintase (UPP), difosfato de dehidrodolicila sintase, eicosadifosfato de prenil sintase, borracha natural sintase e outras Z-isodifosfato de prenil sintase.

[000166] As sequências de nucleotídeo de numerosas prenil transferases de uma variedade de espécies são conhecidas e podem ser usadas ou modificadas para uso na geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada em questão. Sequências de nucleotídeo que codificam prenil transferases são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, mRNA de pirofosfato de farnesil sintase humana (N° de Acesso ao GenBank J05262; Homo sapiens); gene da difosfato de farnesil sintase (FPP) (N° de Acesso ao GenBank J05091; Saccharomyces cerevisiae); gene de difosfato de isopentenila isomerase:difosfato de dimetilalila (J05090; Saccharomyces cerevisiae); Wang e Ohema (2000) Biochim. Biofis. Acta 1529: 33-48; Patente US 6.645.747; mRNA de sintetase 2 de pirofosfato de farnesila (FPS2)/sintetase 2 de FPP/sintase 2 de difosfato de farnesila de Arabidopsis thaliana (At4gl7190) (N° de Acesso ao GenBank NM_202836); mRNA de difosfato de geranilgeranil sintase de Ginkgo biloba (ggpps) (N° de Acesso ao GenBank AY371321); mRNA de pirofosfato de geranilgeranil sintase (GGPSl)/GGPP/transferase de farnesil sintase de Arabidopsis thaliana (At4g36810) (N° de Acesso ao GenBank NM_119845); gene de Synechococcus elongatus para farnesil sintase, geranilgeranila, geranilfarnesila, hexaprenila, heptadifosfato de prenila (SelF-HepPS) (N° de Acesso ao GenBank AB016095); etc.

Uso de Códon

[000167] Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima da via de mevalonato é modificada de modo que a sequência de nucleotídeos reflita a preferência de códon para a célula hospedeira em particular. Por exemplo, a sequência de nucleotídeos, em algumas modalidades, será modificada para preferência de códon em levedo. Veja, por exemplo, Bennetzen e Hall (1982) J. Biol. Chem. 257(6): 3026-3031. Como outro exemplo não- limitativo, a sequência de nucleotídeos, em outras modalidades, será modificada para preferência de códon em E. coli. Veja, por exemplo, Gouy e Gautier (1982) Nucleic Acids Res. 10(22): 7055-7074; Eyre-Walker (1996) Mol. Biol. Evol. 13(6): 864-872. Veja também Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 292.

[000168] Conforme observado acima, em algumas modalidades, o uso de códon de uma sequência de codificação de HMGS é modificada de modo que o nível de tradução do mRNA de HMGS é diminuído. Redução do nível de tradução de mRNA de HMGS através de modificação do uso de códon é obtida através de modificação da sequência para incluir códons que são raros ou não comumente usados pela célula hospedeira. Tabelas de uso de códon para muitos organismos estão disponíveis as quais resumem o percentual de tempo que um organismo específico usa um códon específico para codificar um aminoácido. Determinados códons são usados mais frequentemente do que outros códons "raros". O uso de códons "raros" em uma sequência geralmente diminui sua taxa de tradução. Assim, por exemplo, a sequência de codificação é modificada através de introdução de um ou mais códons raros, os quais afetam a taxa de tradução, mas não a sequência de aminoácido da enzima traduzida. Por exemplo, existem 6 códons que codificam arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG. Em E. coli, os códons CGT e CGC são usados mais frequentemente (que codificam aproximadamente 40% das argininas em E. coli) do que o códon AGG (que codifica aproximadamente 2% das argininas em E. coli ). Modificação de um códon CGT dentro da sequência de um gene para um códon AGG não alterará a sequência da enzima, mas provavelmente diminuirá a taxa de tradução do gene.

Modificações genéticas adicionais

[000169] Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada em questão é uma que é geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica enzimas que aliviam a toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA; e que é ainda geneticamente modificada para obter produção intensificada de um intermediário da via biossintética de terpeno e/ou que é ainda geneticamente modificada para intensificar a produção de um isoprenóide ou precursor de isoprenóide e/ou que é ainda geneticamente modificada de modo que um gene biossintético da via de terpeno endógena está funcionalmente desabilitado. O termo "funcionalmente desabilitado", conforme usado aqui, se refere a uma modificação genética de um ácido nucléico, modificação a qual resulta em produção de um produto genético codificado pelo ácido nucléico que é produzido em níveis abaixo do normal e/ou é não-funcional. Tal(is) modificação(ões) genética(s) pode(m) diminuir a produtividade específica de IPP ou mevalonato de uma cepa (produção por célula) quando comparado com uma cepa parental, mas o alívio na toxicidade induzida por HMG-CoA aumentaria a densidade celular, de modo que a produtividade total da cultura (produtividade específica multiplicada pela densidade de células da cultura) aumentaria.

[000170] Modificações genéticas que intensificam a produção de um intermediário biossintético da via de terpeno endógena incluem, mas não estão limitadas a, modificações genéticas que resultam em um nível e/ou atividade reduzida de uma fosfotransacetilase na célula hospedeira. A concentração intracelular de um intermediário da via biossintética de isoprenóide é intensificada através de aumento da concentração intracelular de acetil-CoA. E. coli secreta uma fração significativa de acetil-CoA intracelular na forma de acetato no meio. Deleção do gene que codifica fosfotransacetilase, pta, a primeira enzima responsável pela transformação de acetil-CoA em acetato, reduz a secreção de acetato. Modificações genéticas que reduzem o nível e/ou atividade de fosfotransacetilase na célula hospedeira procariota são particularmente úteis onde a célula hospedeira parental é uma que é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam um ou mais produtos genéticos da via de MEV.

[000171] Uma vez que a acetil-CoA é um reagente usado pela acetoacetil-CoA tiolase e HMGS na síntese de HMG-CoA e em algumas células hospedeiras, aumentos no reservatório intracelular de acetil- CoA levariam a aumentos no reservatório intracelular de HMG-CoA o que, por sua vez, poderia levar ao efeito de toxicidade. Portanto, modificações genéticas que reduzem a atividade total de fosfotransacetilase levariam a uma redução na taxa de crescimento ou densidade celular final em virtude de acúmulo de HMG-CoA, gerando uma cepa parental que poderia ser modificado usando o método da invenção. Alternativamente, modificações genéticas que aumentam a atividade total de fosfotransacetilase poderiam ser usadas para superar o efeito de toxicidade causado pelo acúmulo de HMG-CoA.

[000172] Em algumas modalidades, uma modificação genética que resulta em um nível reduzido de fosfotransacetilase na célula hospedeira procariota é uma mutação genética que desabilita funcionalmente o gene pta endógeno da célula hospedeira procariota que codifica a fosfotransacetilase. O gene pta pode ser funcionalmente desabilitado através de qualquer uma de uma variedade de formas, incluindo inserção de um elemento genético móvel (por exemplo, um transposon, etc.); deleção de todo ou parte do gene, de modo que o produto genético não é feito ou é truncado e é não-funcional na conversão de acetil-CoA em acetato; mutação do gene de modo que o produto genético não é feito ou é truncado e é não-funcional na conversão de acetil-CoA em acetato; deleção ou mutação de um ou mais elementos de controle que controlam a expressão do gene pta, de modo que o produto genético não é feito; e similares.

[000173] Em algumas modalidades, o gene pta endógeno de uma célula hospedeira geneticamente modificada é deletado. Qualquer método para deleção de um gene pode ser usado. Um exemplo não- limitativo de um método para deleção de um gene pta é através de uso do sistema de recombinação A. Red. Datsenko e Wanner (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(12): páginas 6640-5. O gene será, em algumas modalidades, deletado de uma célula hospedeira (por exemplo, E. coli) que é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam MK, PMK, MPD e IDI. O gene pta será, em algumas modalidades, deletado de uma célula hospedeira (por exemplo, E. coli) que é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam MK, PMK, MPD e IPP. O gene pta será, em algumas modalidades, deletado de uma célula hospedeira (por exemplo, E. coli) que é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam MK, PMK, MPD, IPP e uma prenil transferase.

[000174] Outras modificações que aumentariam os níveis de acetil- CoA intracelular incluem, mas não estão limitadas a, modificações que diminuiriam a atividade total de lactato desidrogenase dentro de uma célula, modificações que diminuiriam atividade total de acetato quinase dentro de uma célula, modificações que diminuiriam a atividade total de álcool desidrogenase dentro de uma célula, modificações que interromperiam o ciclo de ácido tricarboxílico, tais como aquelas que diminuiriam a atividade total de desidrogenase de 2-cetoglutarato ou modificações que interromperiam a fosforilação oxidativa, tais como aquelas que diminuiriam a atividade total de (F1F0)H+-ATP sintase ou combinações dos mesmos.

[000175] Outras modificações que diminuiriam os níveis de acetil-CoA intracelular incluem, mas não estão limitadas a, modificações que aumentariam a atividade total de lactato desidrogenase dentro de uma célula, modificações que aumentariam a atividade total de quinase de acetato dentro de uma célula e modificações que aumentariam a atividade total de álcool desidrogenase dentro de uma célula ou combinações dos mesmos.

[000176] Em algumas modalidades, a célula hospedeira parental é uma que é geneticamente modificada, conforme descrito acima para aumentar os níveis de HMG-CoA; e é ainda geneticamente modificada de modo que um gene biossintético da via de DXP endógena é funcionalmente desabilitado. Tal célula hospedeira geneticamente modificada é útil na triagem de enzimas que convertem HMG-CoA em mevalonato, conforme descrito em maiores detalhes abaixo, uma vez que a toxicidade por HMG-CoA seria exacerbada pela liberação de uma célula sobre a via de mevalonato para a produção dos isoprenóides requeridos.

[000177] Em outras modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada em questão é uma que é geneticamente modificada para incluir um ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica produtos genéticos biossintéticos da via de DXP; e que é ainda geneticamente modificada de modo que um gene biossintético da via de MEV endógena é funcionalmente desabilitado. Tal célula hospedeira seria útil no caso onde, por razoes técnicas, a triagem de enzimas associadas à toxicidade por HMG-CoA foi facilmente realizada em um organismo que utilizou naturalmente a via de mevalonato para a produção de isoprenóides.

[000178] Em algumas modalidades, onde a célula hospedeira geneticamente modificada em questão é uma célula hospedeira procariota que tenha sido geneticamente modificada com ácido(s) nucléico(s) compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam um ou mais produtos genéticos da via de MEV, uma célula hospedeira será ainda geneticamente modificada de modo que um ou mais genes da via de DXP endógena são funcionalmente desabilitados. Genes da via de DXP que podem ser funcionalmente desabilitados incluem um ou mais dos genes que codificam qualquer um dos seguintes produtos genéticos de DXP: sintase 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato, reductoisomerase 1-desóxi-D-xilulose-5-fosfato, 4-difosfocitidil-2-C- metil-D-eritritol sintase, 4-difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol quinase, 2,4- ciclodifosfato de 2C-metil-D-eritritol sintase e 4-difosfato de 1-hidróxi-2- metil-2-(ii)-butenil sintase.

[000179] Um gene da via de DXP endógena pode ser funcionalmente desabilitado através de qualquer uma de uma variedade de formas, incluindo inserção de um elemento genético móvel (por exemplo, um transposon, etc.); deleção de todo ou parte do gene, de modo que o produto genético não é feito ou é truncado e é enzimaticamente inativo; mutação do gene de modo que o produto genético não é feito ou é truncado e é enzimaticamente não-funcional; deleção ou mutação de um ou mais elementos de controle que controlam a expressão do gene de modo que o produto genético não é feito; e similares.

Composições compreendendo a célula hospedeira geneticamente modificada em questão

[000180] A presente invenção ainda proporciona composições compreendendo a célula hospedeira geneticamente modificada em questão. A composição em questão compreende a célula hospedeira geneticamente modificada em questão; e, em algumas modalidades, compreenderá um ou mais de outros componentes, componentes os quais são selecionados baseado, em parte, sobre o uso pretendido da célula hospedeira geneticamente modificada. Componentes adequados incluem, mas não estão limitados a, sais; tampões; estabilizantes; agentes inibitórios de protease; compostos que preservam a membrana celular e/ou parede celular, por exemplo, glicerol, sulfóxido de dimetila, etc.; meios nutricionais adequados para a célula; e similares.

Ácidos Nucléicos

[000181] A presente invenção proporciona ácido(s) nucléico(s) compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam HMGS e/ou HMGR, em que o(s) ácido(s) nucléico(s), quando introduzido(s) na célula hospedeira parental que inclui ou é geneticamente modificada para incluir, aliviam a toxicidade ou inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA. Assim, um ácido nucléico em questão, quando introduzido na célula hospedeira que exibe toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, alivia a toxicidade ou inibição de crescimento induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR operacionalmente ligada um promotor forte.

[000182] Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão é uma estrutura de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR. Em algumas modalidades, a estrutura de expressão é uma que proporciona a síntese da HMGR codificada na célula procariota. Em algumas modalidades, a estrutura de expressão é uma que proporciona a síntese da HMGR codificada na célula eucariota. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR, onde o ácido nucléico é um plasmídeo com número médio de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR, onde o ácido nucléico é um plasmídeo com elevado número de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR operacionalmente ligada a um promotor forte, onde o ácido nucléico é um plasmídeo com elevado número de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR operacionalmente ligada a um promotor forte, onde o ácido nucléico é um plasmídeo com médio número de cópias. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR operacionalmente ligada a um promotor fraco sobre um plasmídeo com número médio de cópias.

[000183] Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão compreendendo tiolase de acetoacetil-CoA operacionalmente ligada à HMGR. Em algumas modalidades, um ácido nucléico que codifica a proteína de fusão acetoacetil-CoA/HMGR é gerado através de ligação das sequências de codificação de tiolase de acetoacetil-CoA e HMGR. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é uma que é encontrada na natureza. Em outras modalidades, a proteína de fusão é uma que é encontrada na natureza e é outra que não a proteína de fusão discutida em Hedl et al. ((2002) J. Bacteriol. 184: 2116-2122). Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão compreendendo acetoacetil-CoA e HMGS tiolase. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão compreendendo tiolase de acetoacetil-CoA, HMGS e HMGR. Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína de fusão compreendendo HMGS e HMGR.

[000184] Em algumas modalidades, o ácido nucléico em questão é uma estrutura de expressão que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR, onde a estrutura de expressão é outra que não a estrutura de expressão descrita em qualquer uma das seguintes referências: Kato-Emori et al., Mol. Genet Genomics (2001) 265: 135-42, Learned RM et al., PNAS (1989) 86: 2779-83, T. Dairi et al., Mol Gen Genet (2000) 262: 957 - 964, Allen et al., Appl Environ. Microbio. (1997). 63: 3341- 3344, Hedl et al., J Bacteriol, (2002), 184: 2116-2122, Jackson et al., Org. Lett. (2003) 5: 1629- 1632, J Randolph Y. Hampton et al. (1994) Cell, 125: 299-312, J Vlarkus Veen et al., FEMS Yeast Res (2003) 4: 87-95, J Reach MJ et al., J Bacteriol (1989) 171: 2994-30011, Bischoff KM et al., Protein Sci (1997) 6: 156-161, Friesen JA et al., Biochemistry. (1997) 36: 2173-7; J Frimpong et al., J Biol Chem. (1994) 269: 11478-83, J Panda et al., Appl Microbiol Biotechnol (2004) 66: 143-152.

Métodos de Triagem

[000185] A presente invenção proporciona métodos de triagem para a identificação de um produto genético tendo atividade de desentoxicação de HMG-CoA; e métodos para a identificação de um agente que inibe o acúmulo de HMG-CoA. Em uma modalidade, o produto genético identificado é um que codifica uma HMGR, por exemplo, uma HMGR variante. Em uma modalidade, o produto genético identificado é um que codifica uma HMGR variante, onde a HMGR variante proporciona um aumento na atividade total de HMGR na célula. Em outra modalidade, o produto genético identificado produz um produto que diminui a atividade de HMGS. Em outra modalidade, o produto genético identificado produz um produto que utiliza mevalonato como um substrato. Em outra modalidade, o gene identificado produz um produto que codifica uma MK. Em outro exemplo, o produto genético identificado proporciona transporte de mevalonato de uma célula. Em outra modalidade, o produto genético identificado é uma liase de HMG-CoA ou codifica uma HMG-CoA liase. Em outra modalidade, o produto genético identificado codifica uma succinato-hidroximetilglutarato CoA-transferase ou é uma succinato-hidroximetilglutarato CoA-transferase.

[000186] Para a identificação de um produto genético que reduz a toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, os métodos geralmente envolvem produção de uma célula de teste através de introdução, na célula hospedeira, de um ácido nucléico exógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto genético candidato, onde a célula hospedeira produz HMG-CoA em níveis eficazes para inibir o crescimento da célula hospedeira; e b) determinação do efeito, se houver, de expressão do produto genético candidato sobre o crescimento da célula de teste. Para a identificação de um agente que reduz o acúmulo de HMG-CoA intracelular e/ou que reduz o nível de atividade de HMGS na célula, os métodos geralmente envolvem a) contato de uma célula de teste com um agente de teste, onde a célula de teste sintetiza mevalonato através da via de mevalonato e onde a célula de teste exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA; e b) determinação do efeito, se houver, do agente de teste sobre a inibição de crescimento acúmulo de HMG-CoA-induzida. Conforme usado aqui, o termo "determinação" se refere à determinações quantitativas e qualitativas e como tal, o termo "determinação" é usado permutavelmente aqui com "ensaio", "medição" e similares.

[000187] Os métodos de triagem em questão são ensaios baseados em célula in vitro. Qualquer uma de uma variedade de células pode ser usada. Células usadas no ensaio são, em algumas modalidades, célula eucariotas, conforme descrito acima. Em outras modalidades, células usadas no ensaio são células procariotas, conforme descrito acima.

Métodos de identificação de um produto genético tendo atividade de desentoxicação de HMG-CoA

[000188] A presente invenção proporciona métodos de triagem in vitro para a identificação de um produto genético tendo atividade de desentoxicação de HMG-CoA. Os produtos genéticos assim identificados são úteis para alívio de toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA e são, portanto, úteis em métodos de produção de isoprenóides ou compostos precursores de isoprenóide. Os métodos geralmente envolvem a) produção de uma célula de teste através de introdução, na célula hospedeira, de um ácido nucléico exógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica um produto genético candidato, onde a célula hospedeira produz HMG- CoA em níveis eficazes para inibir o crescimento de uma célula hospedeira; e b) determinação do efeito, se houver, de expressão do produto genético candidato sobre o crescimento da célula de teste, comparado com uma célula hospedeira. A capacidade do produto genético candidato de reduzir o acúmulo de HMG-CoA e aliviar a toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA é determinada pela capacidade do produto genético candidato de reduzir a inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA. A redução na inibição de crescimento na célula de teste, comparado com uma célula hospedeira, indica que o ácido nucléico exógeno codifica um produto genético tendo atividade suficiente para aliviar a toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA. Uma célula hospedeira é uma que produz uma ou mais enzimas da via de mevalonato, de modo que HMG-CoA é produzida. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma que não produz normalmente mevalonato através da via de mevalonato e tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam uma ou mais enzimas da via de mevalonato, de modo que HMG-CoA é produzida e se acumula intracelularmente em níveis que inibem o crescimento. Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma que produz naturalmente HMG-CoA em níveis que inibem o crescimento ou que tenha sido geneticamente modificada, de outra forma que não via introdução de um ou mais genes da via de MEV exógena, para assim fazê-lo.

[000189] HMG-CoA é produzida na célula hospedeira em uma quantidade que inibe o crescimento de uma célula hospedeira, por exemplo, a concentração intracelular de HMG-CoA inibe o crescimento de uma célula hospedeira. Tipicamente, HMG-CoA se acumula na célula hospedeira em uma quantidade que inibe o crescimento de uma célula hospedeira em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% ou mais, comparado com a taxa de crescimento de uma célula de controle hospedeira que não produz HMG-CoA ou comparado com a taxa de crescimento de uma célula hospedeira que é cultivada sob condições que não são condutivas à síntese de quantidade inibitórias de crescimento de HMG-CoA. Em algumas modalidades, HMG-CoA se acumula intracelularmente na célula hospedeira em uma quantidade que é letal para a célula hospedeira, por exemplo, induz à morte de uma célula hospedeira.

[000190] Em algumas modalidades, uma célula hospedeira que exibe inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA é uma célula que não sintetiza normalmente mevalonato ou IPP através da via de mevalonato e tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam enzima(s) da via de mevalonato. Por exemplo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira que exibe inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA é uma célula procariota que tenha sido geneticamente modificada com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam acetoacetil-CoA tiolase, HMGS e HMGR, onde a acetoacetil- CoA tiolase, HMGS e HMGR são produzidas na célula em quantidades que resultam em inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA.

[000191] Em outras modalidades, uma célula hospedeira que exibe inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA é uma célula que normalmente produz mevalonato ou IPP através da via de mevalonato e que tenha sido geneticamente modificada de modo que os níveis de HMG-CoA intracelular são aumentados, resultando em inibição de crescimento celular induzido por acúmulo de HMG-CoA.

[000192] A célula de teste é cultivada sob condições in vitro de modo que HMG-CoA se acumula intracelularmente em uma quantidade que inibe o crescimento e/ou induz à morte. Em algumas modalidades, a célula de teste é cultivada na presença de um indutor que induz à expressão de uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGS ou HMGR, onde a sequência de nucleotídeos está sob o controle de promotor induzível. Se a HMG-CoA está presente na célula de teste em uma quantidade que inibe o crescimento da célula de teste pode ser determinado usando qualquer método padrão para detecção de inibição de crescimento de uma célula. Por exemplo, o crescimento é frequentemente medido como um aumento na densidade óptica quando as células são crescidos em cultura líquida; e a inibição de crescimento pode ser detectada através de comparação da densidade óptica (por exemplo, a 600 nm) de uma cultura líquida de células hospedeiras que produzem uma quantidade inibitória de crescimento de HMG-CoA com a densidade óptica de uma cultura líquida das mesmas células hospedeiras que produzem uma quantidade inibitória de crescimento do intermediário. A inibição de crescimento também pode ser detectada através de inspeção visual do tamanho de colônia de células colocadas sobre ágar contendo meio de crescimento adequado.

[000193] O método de triagem em questão envolve introdução de um ácido nucléico exógeno na célula hospedeira, produção de uma célula de teste, onde uma célula hospedeira é uma que exibe inibição de crescimento quando HMG-CoA é produzida em uma quantidade inibitória de crescimento. Quando um ácido nucléico exógeno compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR é introduzido na célula hospedeira, inibição de crescimento da célula de teste é aliviada. Assim, a redução na inibição de crescimento indica que o ácido nucléico exógeno codifica HMGR, onde a HMGR codificada é produzida em um nível e/ou tem uma atividade que alivia a inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA. Uma redução na inibição de crescimento inclui uma redução na inibição de crescimento de pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais. Em algumas modalidades, a HMGR codificada pelo ácido nucléico exógeno reduz a inibição de crescimento de modo que a taxa de crescimento celular é restaurada para a taxa de crescimento celular de uma célula hospedeira quando crescida sob condições de modo que HMG-CoA não é produzida em quantidades inibitórias de crescimento.

[000194] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o ácido nucléico exógeno é uma pluralidade de ácidos nucléicos exógenos (por exemplo, uma biblioteca de cDNA, uma biblioteca genômica, uma população de ácidos nucléicos, cada um codificando uma HMGR com uma sequência de aminoácido diferente, etc.), o ácido nucléico exógeno é introduzido em uma pluralidade de células hospedeiras, formando uma pluralidade de células de teste. As células de teste são, em algumas modalidades, crescidas em cultura líquida sob condições de modo que HMG- CoA é acumulada intracelularmente em uma quantidade inibitória de crescimento e/ou que induz à morte; aquelas células de teste compreendendo um ácido nucléico exógeno que compreende sequências de nucleotídeo que codificam HMGR crescerão mais rápido do que células de teste que do não compreendem um ácido nucléico exógeno que compreende sequências de nucleotídeo que codificam HMGR ou aquelas células de teste compreendendo um ácido nucléico exógeno que compreende sequências de nucleotídeo que codificam HMGR viverão, enquanto que células de teste que não compreendem um ácido nucléico exógeno que compreende sequências de nucleotídeo que codificam HMGR morrerão.

[000195] Em algumas modalidades, o método ainda envolve isolamento de um ácido nucléico exógeno de uma célula de teste, onde the ácido nucléico exógeno é um que alivia a inibição de crescimento no método de triagem em questão. Métodos de isolamento do ácido nucléico exógeno de uma célula de teste são bem-conhecidos na técnica. Métodos adequados incluem, mas não estão limitados a, qualquer um de uma série de métodos de lise alcalina que são padrões na técnica.

[000196] Em algumas modalidades, o método de triagem em questão ainda compreenderá caracterização de um produto genético candidato. Nessas modalidades, o ácido nucléico exógeno compreendendo sequência(s) de nucleotídeos que codifica(m) HMGR é isolado de uma célula de teste; o(s) produto(s) genético(s) é (são) expresso(s) na célula e/ou em um sistema de transcrição/tradução in vitro. Em algumas modalidades, o ácido nucléico exógeno é submetido à análise da sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácido do produto genético deduzida de uma sequência de nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do produto genético é comparada com outra sequência de aminoácidos em um banco de dados público de sequências de aminoácidos para determinar se qualquer identidade significativa de sequência de aminoácido com uma sequência de aminoácido de uma proteína conhecida existe. Além disso, o(s) produto(s) genético(s) é(são) expresso(s) na célula e/ou em um sistema de transcrição/tradução isento de células in vitro; e o efeito do(s) produto(s) genético(s) sobre um intermediário da via metabólica ou outro metabolito é analisado.

[000197] Ácidos nucléicos exógenos que são adequados para introdução na célula hospedeira, para produzir uma célula de teste incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente isolados de uma célula; ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente que foram modificados (por exemplo, através de mutação) antes ou subseqüentemente ao isolamento de uma célula; ácidos nucléicos sintéticos, por exemplo, ácidos nucléicos sintetizados em laboratório usando métodos padrões de síntese química de ácidos nucléicos ou gerados através de métodos recombinantes; ácidos nucléicos sintéticos ou que ocorrem naturalmente que tenham sido amplificados in vitro, quer dentro de uma célula ou em um sistema isento de células; e similares.

[000198] Ácidos nucléicos exógenos que são adequados para introdução na célula hospedeira incluem, mas não estão limitados a, DNA genômico; RNA; cópias de DNA complementar (cDNA) de mRNA isolado de uma célula; DNA recombinante; e DNA sintetizado in vitro, por exemplo, usando métodos in vitro isentos de células para síntese de DNA. Em algumas modalidades, ácidos nucléicos exógenos são uma biblioteca de cDNA feita a partir de células, quer células procariotas ou células eucariotas. Em algumas modalidades, ácidos nucléicos exógenos são uma biblioteca de DNA genômico feita a partir de células, quer células procariotas ou células eucariotas.

[000199] Ácidos nucléicos terão, em algumas modalidades, mutação antes de serem introduzidos na célula hospedeira. Métodos de mutação de um ácido nucléico são bem-conhecidos na técnica e incluem métodos de mutação bem-estabelecidos, mutagênese induzida por radiação e métodos de mutação de um ácido nucléico durante síntese. Métodos químicos de mutação de DNA incluem exposição do DNA a um agente de mutação química, por exemplo, metano-sulfonato de etila (EMS), metano-sulfonato de metila (MMS), N- nitrosouréia (ENU), N- metil-N-nitro-N'-nitrosoguanidina, N-óxido de 4-nitroquinolina, sulfato de dietila, benzopireno, ciclofosfamida, bleomicina, trietilmelamina, monômero de acrilamida, mostarda de nitrogênio, vincristina, diepoxialcanos (por exemplo, diepoxibutano), ICR-170, formaldeído, hidrocloreto de procarbazina, óxido de etileno, dimetilnitrosamina, 7,12 dimetilbenz(a)antraceno, clorambucil, hexametilfosforamida, bisulfan e similares. Agentes de indução de mutação por radiação incluem radiação ultravioleta, y-irradiação, raios X e bombardeamento rápido de nêutrons. Mutações também podem ser introduzidas em um ácido nucléico usando, por exemplo, trimetilpsoraleno com luz ultravioleta. Inserção aleatória ou objetivada de um elemento de DNA móvel, por exemplo, um elemento transportável, é outro método adequado para a geração de mutações. Mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico durante amplificação em um sistema in vitro isento de células, por exemplo, usando uma técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR), tal como PCR propensa a erro. Mutações podem ser introduzidas em um ácido nucléico in vitro usando técnicas de embaralhamento de DNA (por exemplo, embaralhamento de éxon, troca de domínio e similares). Mutações podem também ser introduzidas em um ácido nucléico como um resultado de uma deficiência em uma enzima de reparo de DNA na célula, por exemplo, espera-se que a presença, na célula, de um gene mutante que codifica uma enzima de reparo de DNA mutante gere uma elevada freqüência de mutações (isto é, cerca de 1 mutação/100 genes-1 mutação/10.000 genes) no genoma de uma célula. Exemplos de genes que codificam enzimas de reparo de DNA incluem, mas não estão limitados a, Mut H, Mut S, Mut L e Mut U e os homólogos dos mesmos em outras espécies (por exemplo, MSH 16, PMS 1-2, MLH1, GTBP, ERCC-1 e similares). Métodos de mutação de ácidos nucléicos são bem-conhecidos na técnica e qualquer método conhecido é adequado para uso. Veja, por exemplo, Stemple (2004) Nature 5: 1-6; Chiang et al. (1993) PCR Methods Appl 2(3): 210-217; Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91: 10747-51; e Patentes U.S. Nos. 6.033.861 e 6.773.900.

[000200] Em muitas modalidades, o ácido nucléico exógeno é inserido em um vetor de expressão.

[000201] Vetores de expressão que são adequados para uso em células hospedeiras procariotas e eucariotas são conhecidos na técnica e qualquer vetor de expressão adequado pode ser usado. Vetores de expressão adequados são conforme descrito acima.

[000202] Conforme observado acima, um ácido nucléico exógeno será, em algumas modalidades, isolado de uma célula ou um organismo em seu ambiente natural. Em algumas modalidades, o ácido nucléico de uma célula ou organismo sofrerá mutação antes que o ácido nucléico seja isolado de uma célula ou organismo. Em outras modalidades, o ácido nucléico exógeno é sintetizado em um sistema in vitro isento de células.

[000203] Ácidos nucléicos exógenos que são adequados para introdução na célula hospedeira incluem ácidos nucléicos isolados de células ou organismos de uma espécie diferente da célula hospedeira. Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos incluem, mas não estão limitadas a, uma célula ou organismo de qualquer um dos seis reinos, por exemplo, Bacteria (por exemplo, Eubactérias); Archaebacteria; Protista; Fungi; Plantae; e Animalia. Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos incluem membros similares à planta do reino Protista incluindo, mas não limitado a, algas (por exemplo, alga verde, alga vermelha, glaucofitas, cianobactérias); membros similares a fungo do reino Protista, por exemplo, mofos de lama, mofos de água, etc.; membros similares a animal do reino Protista, por exemplo, flagelados (por exemplo, Euglena), amebóides (por exemplo, ameba), esporozoários (por exemplo, Apicomplexa, Myxozoa, Microsporidia) e ciliados (por exemplo, Paramecium). Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos incluem membros do reino Fungi incluindo, mas não limitado a, membros de qualquer um dos filos: Basidiomicota (fungo club; por exemplo, membros de Agaricus, Amanita, Boletus, Cantherellus, etc.); Ascomicota (fungo sac incluindo, por exemplo, Saccharomyces); Micoficofita (lichens); Zigomicota (fungos de conjugação); e Deuteromicota. Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos incluem membros do reino Plantae incluindo, mas não limitado a, membros de qualquer uma das seguintes divisões: Briofita (por exemplo, musgos), Antocerotofita (por exemplo, ceratófilos), Hepaticofita (por exemplo, hepáticas), Lycofita (por exemplo, licopódios), Esfenofita (por exemplo, cavalinha), Psilofita (por exemplo, fenos whisk), Ophioglossofita, Pterofita (por exemplo, fenos), Cicadofita, Gingkofita, Pinofita, Gnetofita e Magnoliofita (por exemplo, plantas de floresta). Fontes adequadas de ácidos nucléicos exógenos incluem membros do reino Animalia incluindo, mas não limitado a, membros de qualquer um dos seguintes filos: Porifera (esponjas); Placozoa; Orthonectida (parasitas de inveterados marinhos); Rhombozoa; Cnidaria (corais, anêmonas, águas-vivas, caneta do mars, amor-perfeito marinho, vespas marinhas); Ctenophora (comb jellies); Platyhelminthes (vermes planos); Nemertina (vermes com fita); Ngathostomulida (vermes com dentes), Gastrotricha; Rotifera; Priapulida; Kinorhyncha; Loricifera; Acanthocephala; Entoprocta; Nemotoda; Nematomorpha; Cycliophora; Mollusca (moluscos); Sipuncula (vermes de amendoim); Annelida (vermes segmentados); Tardigrada (ursos de água); Onychophora (vermes aveludados); Arthropoda (incluindo os subfilos: Chelicerata, Myriapoda, Hexapoda e Crustacea, onde a Chelicerata inclui, por exemplo, aracnídeos, Merostomata e Pycnogonida, onde a Myriapoda inclui, por exemplo, Chilopoda (centípedes), Diplopoda (milípedes), Paropoda e Symfila, onde a Hexapoda inclui insetos e onde a Crustacea inclui camarões, krill, bernacas, etc.; Phoronida; Ectoprocta (animais de musgo); Brachiopoda; Echinodermata (por exemplo estrela- do-mar, margaridas do mar, penas do mar, ouriço do mar, pepino do mar, estrelas quebradiças, ofiúrio, etc.); Chaetognatha (vermes arrow); Hemichordata (vermes acornes); e Chordata. Membros adequados de Chordata incluem qualquer membro dos seguintes subfilos: Urochordata (sea squirts; incluindo Ascidiacea, Thaliacea e Larvacea); Cephalochordata (lancelets); Myxini (hagfish); e Vertebrata, onde membros de Vertebrata incluem, por exemplo, membros de Petromyzontida (lampreys), Chondrichthyces (peixes cartilaginosos), Actinopterygii (peixe ray-finned), Actinista (coelocanths), Dipnoi (lungfish), Reptilia (répteis, por exemplo, cobras, aligatores, crocodilos, lizards, etc.), Aves (pássaros); e Mammalian (mamíferos). Plantas adequadas incluem qualquer monocotiledônea e qualquer dicotiledônea.

[000204] Assim, por exemplo, células adequadas incluem células de organismos que incluem, mas não estão limitados a, um protozoário, uma planta, um fungo, uma célula de alga, um levedo, um réptil, um anfíbio, um mamífero, um microorganismo marinho, um invertebrado marinho, um artrópode, um isópode, um inseto, um aracnídeo, uma archaebactéria e uma eubactéria.

[000205] Em algumas modalidades, o ácido nucléico exógeno será isolado de um tecido tomado de um organismo; de uma célula ou grupo de células em particular isolado de um organismo; etc. Por exemplo, onde o organismo é uma planta, o ácido nucléico exógeno será, em algumas modalidades, isolado do xilema, floema, da camada de cambio, folhas, raízes, etc. Onde o organismo é um animal, o ácido nucléico exógeno será, em algumas modalidades, isolado de um tecido em particular (por exemplo, pulmão, fígado, coração, rim, baço, pele, tecido fetal, etc.) ou um tipo de célula em particular (por exemplo, células neuronais, células epiteliais, células endoteliais, astrócitos, macrófagos, células gliais, células da ilhota, linfócitos T, linfócitos B, etc.).

[000206] Em algumas modalidades, o ácido nucléico exógeno é um ácido nucléico sintético. Em algumas modalidades, um ácido nucléico sintético compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HMGR variante, por exemplo, uma HMGR que difere, quanto à sequência de aminoácido, em um ou mais aminoácidos da HMGR que ocorre naturalmente ou outra HMGR parental. Em algumas modalidades, uma HMGR variante difere, quanto à sequência de aminoácidos, em um aminoácido, dois aminoácidos, três aminoácidos, quatro aminoácidos, cinco aminoácidos, seis aminoácidos, sete aminoácidos, oito aminoácidos, nove aminoácidos ou dez aminoácidos ou mais, comparado com a sequência de aminoácidos da HMGR parental que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, uma HMGR variante difere, quanto à sequência de aminoácidos, em de cerca de 10 aminoácidos a cerca de 15 aminoácidos, de cerca de 15 aminoácidos a cerca de 20 aminoácidos, de cerca de 20 aminoácidos a cerca de 25 aminoácidos, de cerca de 25 aminoácidos a cerca de 30 aminoácidos, de cerca de 30 aminoácidos a cerca de 35 aminoácidos, de cerca de 35 aminoácidos a cerca de 40 aminoácidos, de cerca de 40 aminoácidos a cerca de 50 aminoácidos ou de cerca de 50 aminoácidos a cerca de 60 aminoácidos ou mais, comparado com a sequência de aminoácido da HMGR parental que ocorre naturalmente.

[000207] Em algumas modalidades, uma HMGR variante é codificada por um ácido nucléico que se hibridiza, sob condições estringentes de hibridização, a um ácido nucléico que codifica uma HMGR conhecida. Em outras modalidades, uma HMGR variante é codificada por um ácido nucléico que se hibridiza, sob condições de hibridização moderada, a um ácido nucléico que codifica uma HMGR conhecida. Em outras modalidades, uma HMGR variante é codificada por um ácido nucléico que se hibridiza, sob condições de hibridização de baixa estringência, a um ácido nucléico que codifica uma HMGR conhecida.

[000208] Em algumas modalidades, um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codificam uma HMGR que ocorre naturalmente sofre mutação usando qualquer um de uma variedade de métodos bem estabelecidos, dando origem a um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HMGR variante. Métodos adequados de mutagênese incluem, mas não estão limitados a, métodos de mutação química, mutagênese radiação-induzida e métodos de mutação de um ácido nucléico durante síntese, conforme descrito supra. Assim, por exemplo, um ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HMGR que ocorre naturalmente é exposta a um agente de mutação químico, conforme descrito acima ou submetido à mutação por radiação ou submetido a uma PCR propensa a erro e o ácido nucléico com mutação introduzido na célula hospedeira geneticamente modificada, conforme descrito acima. Métodos para mutagênese aleatória usando um cepa de bactéria "que provoca mutação" também são bem-conhecidos na técnica e podem ser usados para gerar uma HMGR variante. Veja, por exemplo, Greener et al., "An Efficient Random Mutagenesis Technique Using an E. coli Mutator Strain", Methods in Molecular Biology, 57: 375-385 (1995). Técnicas de mutagênese por saturação empregando reação em cadeia de polimerase (PCR) também são bem-conhecidos e podem ser usados. Veja, por exemplo, Patente US 6.171.820. Ácidos nucléicos compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica uma HMGR variante são identificados pela capacidade de aliviar a inibição de crescimento causada pelo acúmulo de HMG-CoA.

[000209] Sequências de nucleotídeo que codificam HMGR são conhecidas na técnica e qualquer sequência de nucleotídeo que codifica HMGR conhecida pode ser alterada para gerar um ácido nucléico sintético para uso no método em questão.

[000210] De interesse particular em algumas modalidades é identificação de HMGR variante que exibe atividade enzimática aumentada e que, portanto, reduz a inibição de crescimento celular acúmulo de HMG-CoA-induzida. Uma HMGR variante que exibe atividade enzimática aumentada exibe atividade enzimática pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2-vezes, pelo menos cerca de 2,5-vezes, pelo menos cerca de 5-vezes, pelo menos cerca de 10- vezes ou pelo menos cerca de 25 -vezes ou mais comparado com a HMGR parental.

Métodos de identificação de um agente que reduz o acúmulo de HMG- CoA

[000211] A presente invenção ainda proporciona métodos de triagem in vitro para a identificação de um agente que inibe ou reduz o acúmulo de HMG-CoA; métodos de identificação de agentes que reduzem o nível de atividade de HMGS na célula; métodos de identificação de um agente que inibe a produção de HMG-CoA; e métodos de identificação de um agente que converte ou acelera a conversão de HMG-CoA em outro composto. Os métodos geralmente envolvem a) contato de uma célula de teste com um agente de teste, onde a célula de teste sintetiza mevalonato através da via de mevalonato e onde a célula de teste exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA; e b) determinação do efeito, se houver, do agente de teste sobre a inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA. Uma redução na inibição de crescimento indica que o agente reduz o acúmulo intracelular de níveis de HMG-CoA que inibem o crescimento.

[000212] Agentes que inibem ou reduzem o acúmulo de HMG-CoA na célula e promovem o crescimento celular são úteis para aumento da produção de um composto de isoprenóide, conforme descrito aqui. Agentes que inibem ou reduzem o acúmulo de HMG-CoA na célula e que reduzem o nível de atividade de HMGS na célula também são úteis na redução da biossíntese de colesterol e, assim, são úteis para tratamento de uma variedade de distúrbios associados a níveis elevados de colesterol no sangue.

[000213] Os termos "agente candidato", "agente de teste", "agente", "substância" e "composto" são usados permutavelmente aqui. Agentes candidatos abrangem numerosas classes químicas, tipicamente moléculas orgânicas ou inorgânicas sintéticas, semi-sintéticas ou que ocorrem naturalmente. Agentes candidatos incluem aqueles encontrados em grandes bibliotecas de compostos sintéticos ou naturais. Por exemplo, bibliotecas de composto sintético estão comercialmente disponíveis da Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, Reino Unido), ComGenex (South San Francisco, CA) e MicroSource (New Milford, CT). Uma biblioteca química rara está disponível da Aldrich (Milwaukee, Wis.) e também pode ser usada. Alternativamente, bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, fúngicos, vegetais e animais estão disponíveis da Pan Labs (Bothell, WA) ou são prontamente produzidas.

[000214] Agentes candidatos podem ser pequenos compostos orgânicos ou inorgânicos tendo um peso molecular de mais do que 50 e menos do que cerca de 2,500 daltons. Agentes candidatos podem compreender grupos funcionais necessários para interação estrutural com proteínas, particularmente ligação a hidrogênio, e podem incluir pelo menos um grupo amina, carbonila, hidroxila ou carboxila e podem conter pelo menos dois dos grupos químicos funcionais. Os agentes candidatos podem compreender estruturas cíclicas ou heterocíclicas de carbono e/ou estruturas aromáticas ou poliaromáticas substituídas por um ou mais dos grupos funcionais acima. Agentes candidatos também são encontrados dentre biomoléculas, incluindo peptídeos, sacarídeos, ácidos graxos, esteróides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estruturais ou combinações dos mesmos.

[000215] Os ensaios da invenção incluem controles, onde controles adequados incluem uma célula que exibe inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA na ausência do agente de teste. Geralmente, uma pluralidade de misturas de ensaio é passada em paralelo com diferentes concentrações de agente para obter uma resposta diferencial às várias concentrações. Tipicamente, uma dessas concentrações serve como um controle negativo, isto é, em uma concentração zero ou abaixo do nível de detecção.

[000216] Um período de tempo adequado para contato do agente com uma célula pode ser determinado empiricamente e geralmente é um tempo suficiente para permitir entrada do agente na célula e permitir que o agente tenha um efeito mensurável sobre a inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA. Geralmente, um tempo adequado está entre 10 minutos e 24 horas ou de cerca de 1 hora a cerca de 8 horas.

[000217] Os métodos de triagem podem ser projetados através de uma série de diferentes formas, onde uma variedade de conFigurações e protocolos de ensaio pode ser empregada, conforme conhecido na técnica. Por exemplo, células de teste (células que exibem inibição de crescimento induzida por acúmulo de HMG-CoA) podem ser colocadas em cavidade de uma placa com cavidades múltiplas (por exemplo, uma placa com 96 cavidades, uma placa com 384 cavidades, etc.) e vários agentes de teste adicionados individualmente às cavidades da placa. O método de triagem pode ser automatizado.

[000218] Um agente candidato é analisado com relação à qualquer atividade citotóxica que ele possa exibir com relação a uma célula usada no ensaio usando ensaios bem-conhecidos, tais como exclusão com corante azul de tripano, um ensaio com MTT (brometo de 3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio) e similares. Agentes que não exibem atividade citotóxica são considerados agentes candidatos.

[000219] Um agente de teste de interesse é um que reduz a inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais, quando comparado com um controle na ausência do agente de teste. Se o agente de teste tem um efeito sobre a inibição do crescimento celular é prontamente determinado usando métodos padrões, conforme descrito acima.

[000220] Em algumas modalidades, o agente de teste é um que reduz o nível de atividade de HMGS na célula. Um agente de teste de interesse é um que reduz o nível de atividade de HMGS em pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou mais, quando comparado com um controle na ausência do agente de teste.

[000221] Se um agente de teste reduz o nível de atividade de HMGS na célula é prontamente determinado usando uma variedade de métodos de ensaio. Como um exemplo não-limitativo, a atividade enzimática de HMGS é medida no lisato de célula de amostras de células nos quais um agente de teste reduz a inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA. HMGS pode ser analisada adicionando-se um excesso de acetil-CoA e acetoacetil-CoA a uma solução tamponada (por exemplo, Tris-HCl a 100 mM) contendo extrato de células ou enzima purificada. Após cinco minutos, a reação pode ser cessada (por exemplo, através de congelamento da amostra) e a HMG- CoA criada pode ser medida através de LC-MS.

[000222] Como outro exemplo, os níveis de mRNA de HMGS na célula são medidos. Uma série de métodos estão disponíveis para analisar ácidos nucléicos com relação à presença e/ou nível de mRNA específico na célula. O mRNA podem ser analisado diretamente ou transcrito invertido em cDNA para análise. O ácido nucléico pode ser amplificado através de técnicas convencionais, tal como reação em cadeia de polimerase (PCR), para proporcionar quantidades suficientes para análise. O uso de reação em cadeia de polimerase é descrito em Saiki, et al. (1985), Science 239: 487; uma revisão de técnicas pode ser encontrada em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989. páginas 14.2-14.33; e vários protocolos de PCR são descritos amplamente em uma série de livros teste incluindo, por exemplo, PCR Protocols J. Bartlett e D. Stirling, eds. (2003) Humana Press.

[000223] Um rótulo detectável pode ser incluído em uma reação de amplificação. Rótulos adequados incluem fluorocromas, por exemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, Texas Red,ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetóxi-4',5'- dicloro-6-carboxifluo-resceína (JOE), 6-carbóxi-X-rodamina (ROX), 6- carbóxi-2',4',7',4,7- hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carbóxifluoresceína (5-FAM) ou N,N,N',N'-tetrametil-6- carbóxi-rodamina (TAMRA), rótulos radioativos, por exemplo 32P, 35S, 3H; etc. O rótulo pode ser um sistema com dois estágios, onde o DNA amplificado é conjugado à biotina, haptenos, etc., tendo um parceiro de ligação de alta afinidade, por exemplo, avidina, anticorpos específicos, etc., onde o parceiro de ligação é conjugado a um rótulo detectável. O rótulo pode ser conjugado a um ou ambos os iniciadores. Alternativamente, o reservatório de nucleotídeos usados na amplificação é rotulado, de modo a incorporar o rótulo no produto da amplificação.

[000224] Uma variedade de diferentes métodos para determinação da abundancia de ácido nucléico em uma amostra são conhecidos por aqueles versados na técnica, onde métodos de interesse em particular incluem aqueles descritos em: Pietu et al., Genome Res. (Junho de 1996) 6: 492-503; Zhao et al., Gene (24 de Abril de 1995) 156: 207-213; Soares, Curr. Opin. Biotechnol. (Outubro de 1997) 8: 542-546; Raval, J. Pharmacol Toxicol Methods (Novembro de 1994) 32: 125-127; Chalifour et al., Anal. Biochem (1 de Fevereiro de 1994) 216: 299-304; Stolz & Tuan, Mol. Biotechnol. (Dezembro de 1996) 6: 225- 230; Hong et al., Bioscience Reports (1982) 2: 907; e McGraw, Anal. Biochem. (1984) 143: 298. Também de interesse são os métodos descritos no WO 97/27317, a descrição do qual é aqui incorporada por referência.

[000225] Uma série de métodos estão disponíveis para determinação do nível de uma proteína em uma amostra em particular. Por exemplo, detecção pode utilizar coloração de células ou seções histológicas com anticorpos rotulados específicos para a proteína, realizados de acordo com métodos convencionais. As células são permeabilizadas para corar moléculas citoplásmicas. Os anticorpos de interesse são adicionados a uma amostra de células e incubados durante um período de tempo suficiente para permitir ligação ao epítopo, usualmente pelo menos cerca de 10 minutos. Os anticorpos podem ser rotulados com radioisótopos, enzimas, fluorescentes, quimioluminescentes ou outros rótulos para detecção direta. Alternativamente, um anticorpo ou reagente de segundo estágio é usado para amplificar o sinal. Tais reagentes são bem-conhecidos na técnica. Por exemplo, o anticorpo primário pode ser conjugado à biotina, com avidina peroxidase de armoracia-conjugada adicionada como um reagente de segundo estágio. A detecção final usa um substrato que sofre uma alteração de cor na presença de peroxidase. Alternativamente, o anticorpo secundário é conjugado a um composto fluorescente, por exemplo, fluoresceína, rodamina, Texas Red, etc. A ausência ou presença de ligação do anticorpo pode ser determinada através de vários métodos, incluindo citometria de fluxo das células dissociadas, microscopia, radiografia, contagem de cintilação, etc.

Exemplos

[000226] Os exemplos a seguir são apresentados de modo a fornecer àqueles aqueles versados na técnica uma descrição e descrição completa de como fazer e usar a presente invenção e não se destinam a limitar o escopo daquilo que os inventores consideram como sua invenção, nem se destinam a representar que os experimentos abaixo foram todos ou apenas alguns realizados. Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.), mas alguns erros experimental e desvios deverão ser levados em conta. A menos que de outro modo indicado, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular gravimétrico médio, a temperatura está em graus Celsius e a pressão está em ou próxima da atmosférica. Abreviações padrões podem ser usadas, por exemplo, bp, par(es) de base; kb, quilobase(s); pi, picolitro(s); s, segundo(s); min, minuto(s); h, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, quilobase(s); bp, par(es) de base; nt, nucleotídeo(s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente); s.c, subcutânea(mente); e similares.

Exemplo 1: Produção in vivo de mevalonato limita a produção de amorfadieno

[000227] Os seguintes cepas, vetores, condições de crescimento e métodos analíticos foram usados nos exemplos a seguir.

Cepas, construção de plasmídeo e meios de crescimento Cepas

[000228] As cepas de E. coli TOP10 e DH10B, ambos da Invitrogen, foram usados para clonagem e construção do plasmídeo. E. coli DH10B foi usado para a produção de isoprenóide, crescimento e ensaios de metabolito.

Meios de Crescimento

[000229] Para clonagem e propagação de cepas de E. coli abrigando os vários vetores recombinantes descritos aqui, caldo de Luria com modificação de Miller (Sigma-Aldrich) foi usado com antibióticos apropriados para triagem de plasmídeo. Para produção, crescimento e ensaios de metabolito, cepas manipulados ("geneticamente modificados" ou "recombinantes") de E. coli foram crescidos em caldo de Luria com modificação de Miller (LB), 1% (peso/vol) de glicerol e antibióticos apropriados. DL-mevalonato usado para suplementação dos meios foi preparado através de mistura de 1 volume de DL-lactona de ácido mevalônico a 2M (Sigma-Aldrich) com 1,02 volumes de KOH a 2M e incubação a 37 °C durante 30 minutos (Campos et al. (2001) Biochem. J. 353: 59-67). Para manter os plasmídeos, antibióticos requeridos, conforme apropriado, foram adicionados aos meios de crescimento. Isopropil-Beta-D- tiogalactosídeo (IPTG), da Roche, e L- Arabinose, da Sigma-Aldrich, foram usados para indução dos sistemas promotores.

Construção de Plasmídeos/Óperons

[000230] Óperons de genes múltiplos da via de mevalonato heteróloga foram montados conforme descrito nas publicações de Pedido de Patente US números 20030148479 e 20040005678 e Martin et al. (2003) Nat. Biotech. 21(7): 796-802. O óperon MevT codifica os genes AtoB de E. coli, HMGS de S. cerevisiae e uma forma truncada de HMGR1 de S. cerevisiae denominada "tHMGR". O óperon MevT codifica as enzimas responsáveis pela conversão de acetil-CoA em mevalonato (Figura 2). O óperon montado foi clonado no vetor pCR4TOPO usando o sistema de clonagem Invitrogen TOPO TA (Carlsbad, CA) para fins de seqüenciamento. Ligação no vetor pCR4 TOPO e transformação de células TOP10 de Escherichia coli foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

[000231] Como a expressão de vias bioquímicas é frequentemente ótima em um nível específico de expressão, o óperon MevT foi clonado em uma variedade de vetores de expressão para determinar o efeito do número de cópias do plasmídeo e da resistência ao promotor sobre a expressão das vias clonadas. O óperon MevT foi clonado no sítio SalI do plasmídeo arabinose-induzível, médio número de cópias, pBAD24 (Guzman et al. (1995) J Bacteriology 177: 4121-4130), M. Ehrmann et al., (1997) Proc. Natl. Acad Sci USA 94: 13111-13115), através de digestão do vetor vazio e do óperon MevT no pCR4 TOPO com a enzima de restrição SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado [p]BAD24MevT (SEQ ID NO: 1) (publicações de Pedido de Patente US números 20030148479. 20040005678).

[000232] O óperon MevT foi também clonado nos sítios XmaI-PstI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177: 4121-4130); Hiszczynska- Sawicka (1997) PLASMID 38: 174- 179), através de digestão do vetor vazio e do óperon MevT em pCR4 TOPO com as enzimas de restrição XmaI e PstI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pBAD33MevT (SEQ ID NO: 2), veja Martin et al. (2003) supra.

[000233] Para colocar o óperon MevT sob o controle de um promotor PLAC modificado (promotor mais fraco), o fragmento NsiI-XmaI do araC-pBAD do pBAD33MevT foi substituído pelo fragmento NsiI-XmaI do pBBR1MCS (Kovach et al. (1995) Gene 166: 175-176) contendo o promotor PLAC modificado. Digestão do pBAD33MevT e pBBR1MCS foi conduzida usando as enzimas de restrição NsiI e XmaI e ligados usando DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pMevT (SEQ ID NO: 3), veja publicação de Pedido de Patente US número 20040005678 e Martin et al. (2003) supra.

[000234] Para gerar o controle de plasmídeo vazio para pMevT, o óperon MevT foi excisado do pMevT usando a enzima de restrição SalI. O plasmídeo resultante contendo apenas o promotor PLAC foi denominado pLac33 (Martin et al. (2003) supra).

[000235] Para produzir FPP, IPP e DMAPP a partir de mevalonato, o óperon denominado MBIS foi construído conforme descrito nas publicações de Pedido de Patente números 20030148479, 20040005678 e Martin et al. (2003) supra. O MBIS contém os genes MK, PMK e MPD de S. cerevisiae e idi e ispA de E. coli (Figura 2). Conforme descrito, o óperon do MBIS foi montado no plasmídeo pBBRlMCS-3 (Kovach et al. (1995) supra) sob o controle de um promotor PLAC modificado. O plasmídeo IPTG-induzível foi denominado pMBIS (SEQ ID NO 4).

[000236] Para produzir amorfa-4,11-dieno a partir de FPP, um gene de amorfadina sintase sintético foi criado conforme descrito em na publicação de Pedido de Patente US número 20040005678 e Martin et al. (2003) supra. O gene sintético foi clonado no vetor pTrc99A (Amann et al. (1988) Gene 69: 301-315), conforme descrito e o plasmídeo IPTG- induzível foi denominado pADS (SEQ ID NO 5).

[000237] De forma a determinar a fonte de toxicidade causada pela expressão aumentada do óperon MevT, os genes individuais do óperon MevT e combinações dos mesmos foram amplificados e clonados em vetores de expressão.

[000238] AtoB foi amplificado a partir do pBAD24MevT usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares às extremidades 5' e 3' do gene. AtoB foi clonado nos sítios XmaI-SalI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pAtoB (SEQ ID NO 6).

[000239] HMGS foi amplificada a partir do pBAD24MevT usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares às extremidades 5' e 3' do gene. HMGS foi clonada nos sítios XmaI-SalI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pHMGS (SEQ ID NO 7).

[000240] A HMGR truncada foi amplificada a partir do pBAD24MevT usando protocolos padrões de reação em cadeia de polimerase (PCR) e iniciadores complementares às extremidades 5' e 3' do gene. A HMGR truncada (tHMGR) foi clonada nos sítios XmaI-SalI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33, e do plasmídeo arabinose-induzível, médio número de cópias, pBAD18 (Guzman et al. (1995) J. Bacteriology 177: 4121- 4130), através de digestão dos vetores vazios e do produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo com baixo número de cópias resultante foi denominado pHMGR (SEQ ID NO 8) e o plasmídeo com médio número de cópias resultante foi denominado pBAD18HMGR (SEQ ID NO 9).

[000241] Um óperon contendo apenas HMGS e a HMGR truncada foi criado através de amplificação dos dois segmentos de gene do pBAD24MevT usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares à extremidade 5' de HMGS e à extremidade 3' de HMGR. O fragmento de HMGS e HMGR foi clonado no sítio SalI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com a enzima de restrição SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pHMGSR (SEQ ID NO 10).

[000242] As sequências de nucleotídeo de estruturas de plasmídeo, conforme discutido nos Exemplos, são representadas na Figura 13A-C a Figura 24A-C; e várias características são realçadas. Sequências de codificação, terminadores e origens são representados pelo texto em negrito ou o texto em negrito e sublinhado. As sequências promotoras então circundadas. A "origem pBR322 modificada" representada nas Figura 13A-C e Figura 21 A-C inclui um gene rop truncado e, assim, proporciona um plasmídeo com maior número de cópias do que a origem pBR322 (não modificada); o número de cópias de plasmídeo dos plasmídeos contendo a origem pBR322 modificado é estimado como sendo de cerca de 30 cópias por célula a cerca de 50 cópias por célula. Veja, por exemplo, Guzman et al. ((1995) J. Bacteriol. 177: 4121-4130; e Ehrmann et al. ((1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94: 13111-13115).

Medição de crescimento celular

[000243] O crescimento celular de culturas de E. coli foi medidos analisando a densidade óptica das culturas a 600 nm (OD600). A OD600 de amostras tomadas de culturas em frascos com defletor foi medida usando um UV-Spectrophotometer (Beckman), enquanto que a OD600 de culturas em placas de microtitulação com 96 cavidades foi medida usando um leitor para placa de microtitulação (SpectraMax, Molecular Devices).

Medição de Amorfa-4,11-dieno

[000244] A concentração de amorfa-4,11-dieno foi determinada através de extração de amostras de 0,7 mL com 0,7 mL de acetato de etila (Sigma-Aldrich) em frascos de vidro para cromatografia gasosa (GC). As amostras foram, então, agitadas na velocidade máxima sobre um misturador Fisher Vortex Genie 2 (Fischer Scientific) durante três minutos. As amostras foram deixadas assentar de forma a separar as emulsões de acetato de etila-agua.

[000245] Extratos de cultura de acetato de etila foram analisados sobre um cromatógrafo a gás/espectrômetro de massa (GC/MS) Hewlett-Packard 6890. A tecnologia LEAP de auto-injetor foi programada para estender a agulha de amostragem na camada de acetato de etila da mistura com duas fases. Uma amostra de 1 μL foi separada sobre o GC usando uma coluna DB-5 (disponível, por exemplo, da Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) e gás transportador de hélio. O ciclo de forno de cada amostra foi 80 °C durante dois minutos, aumentando a temperatura a 30 °C/minuto para uma temperatura a 160 °C/minuto, aumentando a temperatura a 3 °C/minuto para 170 °C, aumentando a temperatura a 50 °C/minuto para 300 °C e mantendo a 300 °C durante dois minutos. As amostras decompostas foram analisadas através do detector seletivo de massa Hewlett-Packard modelo 5973 que monitorava íons a 189 e 204 m/z. Espectros de massa anteriores demonstraram que o produto amorfa- 4,11-dieno sintase era amorfadieno e que o amorfadieno tinha um tempo de retenção de 7,9 minutos usando esse protocolo de GC. Em virtude do fato de padrões puros de amorfa-4,11-dieno não estarem disponíveis, as concentrações devem ser quantificadas em termos de equivalência de cariofileno. Uma curva padrão para cariofileno foi determinada anteriormente, baseado em um padrão puro da Sigma (St. Louis, Mo.). A concentração de amorfa-4,11-dieno é baseada na abundância relativa de íons a 189 e 204 m/z para a abundância dos íons totais nos espectros de massa dos dois compostos.

Medição de 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA)

[000246] Os níveis de 3-hidróxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG- CoA) intracelulares foram determinados através de separação de células de E. coli do meio de crescimento, impedindo o metabolismo celular e extraindo HMG-CoA das células com ácido tricloroacético (TCA) e medição das concentrações de HMG-CoA através de Cromatografia de Líquido/Espectrômetro de Massa (LC/MS). De forma a impedir rapidamente o metabolismo celular e separar as células do meio de cultura, extração de TCA em camadas foi empregada. Antes de amostragem da cultura de células, um tubo para amostra de TCA em camadas e óleo de silicone foi preparado. Em um tubo Falcon de 15 mL (Fischer Scientific), 500 μL de ácido tricloroacético a 10% em óxido de deutério (ambos da Sigma- Adrich) foram adicionados ao fundo do tubo, seguido por uma camada de 2 mL de óleo de silicone (AR200 da Fluka). Os tubos para amostra preparados foram colocados em um banho de gelo/agua para permitir que a camada de óleo de silicone se tornasse mais viscosa de forma a evitar inversão da camada quando de amostragem.

[000247] 10 mL de cultura de células foram cuidadosamente adicionados ao tubo para amostra de 15 mL acima da camada de óleo de silicone. Os tubos para amostra foram rapidamente centrifugados a 4 °C na velocidade máxima usando uma centrífuga Alegra durante 3 minutos. Durante esse tempo, a força centrífuga move as células através da camada de óleo de silicone e na camada de TCA, desse modo, separando as células do meio de cultura e sujeitando, simultaneamente, as células à lise e parando o metabolismo.

[000248] Após centrifugação das células, a camada de meio de cultura foi removida através de aspiração. Em seguida, a camada de TCA foi transferida para um tubo para centrífuga de 2 mL e neutralizada com 1 mL de tri-n-octil-amina a 0,5M em 1,1,2-tricloro-1,2,2-trifluoroetano (ambos da Aldrich). A camada aquosa foi removida, filtrada e analisada através de LC/MS.

[000249] O extrato de TCA aquoso foi analisado sobre um Hewlett- Packard 1100 LC/MS. Uma amostra de 50 μL foi separada sobre uma coluna de HPLC de fase invertida C-18 (Varian) usando um sistema de solvente com gradiente de dois componentes. Solvente A era tampão de Acetato de amônio a 100 mM em um pH de 6 e Solvente B era 70% de tampão de acetato de amônio a 100 mM e 30% de Acetonitrila. A coluna de HPLC foi equilibrada a cada operação com 8% de Solvente B (92% de Solvente A) durante 10 minutos. O perfil de gradiente era 8% de Solvente B no tempo 0 minuto a 100% de Solvente B no tempo 15 minutos e isocrático a 100% de Solvente B até 28 minutos.

[000250] As amostras de HMG-CoA decompostas foram analisadas através de um detector seletivo de massa que monitorava íons a 912 m/z. O tempo de retenção e espectro de massa da HMG-CoA foram confirmados usando HMG-CoA comercial (Sigma).

Medição de mevalonato (ácido mevalônico)

[000251] A concentração de mevalonato (ácido mevalônico) em culturas de E. coli manipulada foi determinada através de análise por GC/MS. 560 μL da cultura de E. coli foram misturados com 140 μL de HCl a 300 mM em um frasco de vidro para GC para converter o mevalonato de ácido para a forma de lactona, de ácido mevalônico para lactona de ácido mevalônico. 700 μL de acetato de etila foram adicionados a cada frasco e, então, as amostras foram agitadas em velocidade máxima sobre um misturador Fisher Vortex Genie 2 (Fischer Scientific) durante três minutos.

[000252] Os extratos de acetato de etila da cultura acidificada foram analisados sobre um cromatógrafo a gás/ espectrômetro de massa (GC/MS) Hewlett-Packard 6890. A tecnologia LEAP de auto-injetor foi programada para estender a agulha de amostragem na camada de acetato de etila da mistura com duas fases. Uma amostra de 1 μL foi separada sobre o GC usando uma coluna DB-5 (disponível, por exemplo, da Agilent Technologies, Inc., Palo Alto, Calif.) e gás transportador de hélio. O ciclo de forno de cada amostra era a versão modificada do método de B. H. Woollen et al. (B .H. Woollen et al. J Chromatogr. B. 760 (2001) 179-184). O ciclo de forno para cada amostra foi 75 °C durante dois minutos, aumentando a temperatura a 20 °C/minuto para uma temperatura a 150 °C/minuto, aumentando a temperatura a 15 °C/minuto para 250 °C, aumentando a temperatura a 50 °C/minuto para 300 °C e mantendo a 300 °C durante dois minutos. As amostras decompostas foram analisadas através do detector seletivo de massa Hewlett-Packard modelo 5973 que monitorava íons a 71 m/z. O tempo de retenção e espectro de massa da lactona de ácido mevalônico extraída foram confirmados usando DL-lactona de ácido mevalônico comercial (Sigma).

Resultados

[000253] A produção de isoprenóide em E. coli manipulada para conter uma via de mevalonato exógena é frequentemente limitada pela produção de mevalonato. Aumentos na produção de mevalonato podem levar a aumentos nos isoprenóides que uma célula hospedeira é manipulada para produzir. Alívio de toxicidade por HMG-CoA que leva à produção aumentada de mevalonato, portanto, leva à produção aumentada de isoprenóide.

[000254] Para melhorar a produção de isoprenóide a partir da via de mevalonato em E. coli, as etapas limitativas da via heteróloga tinham de ser determinadas. Para fazer isso, os plasmídeos pMevT, pMBIS e pADS, conforme descrito acima, foram transformados em um único cepa de E. coli DH10B através de métodos padrões. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar com LB contendo 50 μg/mL de carbenicilina, 5 μg/mL de tetraciclina e 25 μg/mL de cloranfenicol. Uma única colônia do cepa foi transferida da placa de ágar com LB para 5 mL de meio líquido LB contendo o mesmo antibiótico. Essa cultura de semente foi incubada através de agitação a 37 °C até que o crescimento atingisse uma fase estacionária.

[000255] Indução da expressão de ambos os óperons e ADS com IPTG permite a produção de amorfadieno a partir de um suprimento de acetil-CoA de E. coli. Para determinar qual óperon era limitativo para a produção de amorfadieno, E. coli contendo todos os três plasmídeos foi incubada em frascos de agitação múltiplos de meio líquido consistindo de meio LB e 1% (peso/vol) de glicerol e antibióticos apropriados. Os frascos de agitação foram inoculados a partir de 5 mL cultura de semente. As culturas foram incubadas a 37 °C com agitação contínua. Duas horas após inoculação, IPTG a 0,5 mM foi adicionado a cada cultura para induzir à expressão dos óperons. Além disso, mevalonato a 10 mM e 20 mM foi adicionado às diferentes culturas duas horas após inoculação. As culturas foram incubadas a 37 °C com agitação contínua. Em pontos múltiplos de tempo, o crescimento celular do cepa e produção de amorfadieno foram analisados.

[000256] Conforme mostrado na Figura 4, aumento da quantidade de mevalonato adicionado às culturas aumentou a produção de amorfadieno a partir das cepas de E. coli que expressam todos os três óperons. Esse resultado demonstra que a produção in vivo de mevalonato pelo óperon MevT limita a produção do sesquiterpeno amorfadieno nesses sistemas de teste.

[000257] Figura 4. Comparação de produção de amorfadieno em cepas de E. coli usando a via de mevalonato manipulada [pMevT, pMBIS, pADS] a partir de culturas com concentrações variadas de mevalonato exógeno. Meio LB com 1% de glicerol foi suplementado com nenhum mevalonato (0 mM), mevalonato a 10 mM ou mevalonato a 20 mM.

Exemplo 2: Expressão aumentada do óperon MevT a partir de sistemas promotores mais fortes e vetores de plasmídeo com maior número de cópias resultam em inibição de crescimento

[000258] O exemplo a seguir demonstras que a superexpressão aumentada da "metade superior" (acetoacetil tiolase, HMGS e HMGR) da via de mevalonato pode levar à inibição de crescimento da célula hospedeira modificada.

[000259] Para aumentar a produção de mevalonato in vivo em E. coli, o óperon MevT foi transferido para sistemas de expressão que proporcionariam expressão aumentada dos genes de MevT. E. coli DH10B foi transformada com os seguintes plasmídeos de MevT, listados na ordem de aumento de expressão: pMevT e pTrc99A (onde pMevT e pTrc99A foram transformados na mesma célula hospedeira), pBAD33MevT e pBAD24MevT. Além disso, os plasmídeos de controle vazio correspondentes foram transformados em E. coli DH10B: pLac33 e pTrc99A (dois plasmídeos no mesmo hospedeiro), pBAD33 e pBAD24. pMevT e pLac33 foram co-transformados com pTrc99A para controlar pMevT e pLac33 modificados com o promotor PLAC com a cópia do LacIQ sobre pTrc99A.

[000260] Transformantes de cepas contendo pMevT & pTrc99A ou pLac33 & pTrc99A foram selecionados sobre placas de ágar com LB contendo 50 μg/mL de carbenicilina e 50 μg/mL de cloranfenicol. Transformantes das cepas restantes foram selecionados sobre placas de ágar com LB contendo 50 μg/mL de cloranfenicol. Uma única colônia de cada cepa foi transferida da placa de ágar com LB para 5 mL de meio líquido LB contendo o mesmo antibiótico. Essa cultura de semente foi incubada através de agitação a 37 °C até que o crescimento atingisse uma fase estacionária. As seis culturas de semente foram usadas para inocular placas de titulação com 96 cavidades contendo meio LB mais 1% (peso/vol) de glicerol com antibióticos. Após 2 horas de agitação contínua a 37 °C em um leitor para placa de microtitulação, os cepas foram induzidos com IPTG a 0,5 mM (para a indução de pMevT e pLac33) ou arabinose a 2 mM (para a indução de pBAD33MevT, pBAD24MevT, [p]BAD33 e pBAD24). Após indução, as culturas continuaram a incubar com agitação contínua a 37 °C. O crescimento celular de cada 0,2 mL de cultura foi medido a cada dez minutos pelo leitor para placa de microtitulação.

[000261] Conforme mostrado na Figura 5, a indução de MevT a partir do promotor fraco PLAC modificado, contido no pMevT, não causa alteração substancial no crescimento celular em comparação com os controles de plasmídeo vazios (pLac33/pTrc99A, pBAD33 e pBAD24). Contudo, a expressão aumentada do óperon MevT a partir do sistema promotor araC-pBAD do pBAD33MevT causa inibição de crescimento. Retenção do sistema promotor araC-pBAD, mas aumento do número de cópias do plasmídeo, desse modo aumentando adicionalmente a expressão total de MevT, conforme ocorre no pBAD24MevT, apenas exacerba o problema de inibição de crescimento. Conforme demonstram esses dados, aumento da expressão do óperon MevT a partir de um plasmídeo com médio número de cópias com um sistema promotor PLAC modificado para um plasmídeo com médio número de cópias com um sistema promotor araC-pBAD e, finalmente, para um plasmídeo com elevado número de cópias com um sistema promotor araC-pBAD causa aumento da toxicidade nas cepas manipuladas.

[000262] Figura 5. Efeito de aumento da expressão do óperon MevT sobre o crescimento de células de E. coli. Comparação de E. coli abrigando os plasmídeos vazios pLac33 + pTrc99A, pBad33 e [rho]BAD24 com E. coli abrigando os óperons de MevT pMevT + pTrc99A, pBAD33MevT e pBAD24MevT (listados na ordem de aumento da expressão).

Exemplo 3: Expressão aumentada de HMGS causa inibição de crescimento, mas expressão aumentada de HMGS e HMGR juntas não

[000263] O exemplo a seguir mostra que a inibição de crescimento causada pela expressão aumentada da metade superior da via de mevalonato, conforme discutido no Exemplo 2, é em virtude da expressão de HMGS, a qual catalisa a produção de HMG-CoA. Expressão de HMGR, a qual catalisa uma reação na qual a HMG-CoA é um reagente, junto com HMGS, conforme proporcionado através dos métodos da presente invenção, evita essa toxicidade.

[000264] De forma a determinar a fonte de toxicidade causada pela expressão aumentada do óperon MevT, os genes individuais do óperon MevT e combinações dos mesmos foram amplificados e clonados em vetores de expressão. AtoB foi amplificado a partir do pBAD24MevT usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares às extremidades 5' e 3' do gene. AtoB foi clonado nos sítios XmaI-SalI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pAtoB (SEQ ID NO 6). HMGS foi amplificada a partir do pBAD24MevT usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares às extremidades 5' e 3' do gene. HMGS foi clonada nos sítios XmaI-SalI do plasmídeo arabinose-induzível, , baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pHMGS (SEQ ID NO 7). A HMGR truncada foi amplificada a partir do pBAD24MevT usando protocolos padrões de reação em cadeia de polimerase (PCR) e iniciadores complementares às extremidade 5' e 3' do gene. A HMGR truncada (tHMGR) foi clonada nos sítios XmaI-SalI do plasmídeo arabinose-induzível, baixo número de cópias, pBAD33, e do plasmídeo arabinose-induzível, médio número de cópias, pBAD18 (Guzman et al. (1995) J Bacteriology 177: 4121-4130), através de digestão dos vetores vazios e produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo com baixo número de cópias resultante foi denominado pHMGR (SEQ ID NO 8) e o plasmídeo com número médio de cópias foi denominado pBAD18HMGR (SEQ ID NO 9).

[000265] Um óperon contendo apenas HMGS e a HMGR truncada foi criado através de amplificação dos dois segmentos de gene do pBAD24MevT usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares à extremidade 5' da HMGS e à extremidade 3' da HMGR. Os fragmentos de HMGS e HMGR foram clonados no sítio SalI do plasmídeo arabinose-induzível com baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com enzima de restrição SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pHMGSR (SEQ ID NO 10).

[000266] Para determinar a causa de inibição de crescimento associada à expressão aumentada do óperon MevT, o óperon foi decomposto em componentes individual. Os plasmídeos pAtoB, pHMGS e pHMGR, que expressam cada um dos genes individuais, e pHMGSR, que expressa a combinação de HMGS e HMGR, foram construídos conforme descrito acima. Esses quatro plasmídeos, junto com pBAD33 (controle de plasmídeo vazio) e pBAD33MevT, foram transformados em E. coli DH10B usando procedimentos padrões. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar com LB contendo 50 μg/mL de cloranfenicol. Uma única colônia de cada cepa foi transferida da placa de ágar com LB para 5 mL de meio líquido LB contendo o mesmo antibiótico. Essa cultura de semente foi incubada através de agitação a 37 °C até que o crescimento atingisse uma fase estacionária.

[000267] As seis culturas de semente foram usadas para inocular placas de microtitulação com 96 cavidades contendo 0,2 mL volumes de meio LB, 1% (peso/vol) de glicerol e antibióticos. As culturas na placa com 96 cavidades foram agitadas continuamente a 37 °C em um leitor para placa de microtitulação e induzidas com arabinose a 2 mM a 2 horas pós-inoculação. O crescimento celular de cada cultura é visualizado na Figura 6.

[000268] Conforme mostrado na Figura 6, em comparação com o controle de plasmídeo vazio, a expressão aumentada de AtoB e HMGR em E. coli (em cepas abrigando os plasmídeos pAtoB e pHMGR, respectivamente), não tem efeito significativo sobre o crescimento celular. Contudo, a expressão aumentada de HMGS (na cepa abrigando pHMGS) causa inibição substancial de crescimento. De modo interessante, com a co-expressão aumentada de HMGS e HMGR (conforme na cepa abrigando pHMGSR), o crescimento celular é restaurado para aquela do controle de plasmídeo vazio. Supõe-se que esse alívio de toxicidade seja em virtude da capacidade da HMGR de conter a HMG-CoA que é produzida pela HMGS (e não degradada por quaisquer enzimas conhecidas em E. coli) em mevalonato. O mevalonato, então, passou através da membrana celular para o meio, conforme descrito em Campos et al. (2001) Biochem. J. 353: 59-67; e Martin et al. (2003) Nature Biotech. 21(7): 796-802). Contudo, a expressão aumentada de todos os três genes no óperon MevT (conforme na cepa abrigando pBAD33MevT), novamente inibe o crescimento celular. Em virtude do fato de dos dados mostrarem que a expressão aumentada de AtoB apenas não causa inibição de crescimento, a toxicidade causada pela co-expressão aumentada de AtoB com HMGS e HMGR é provavelmente em virtude da produção aumentada de acetoacetil-CoA pelo AtoB. Produção aumentada de acetoacetil-CoA através da expressão aumentada da ceto tiolase de E. coli (AtoB) proporciona HMGS com substrato adicional e aumenta dramaticamente a produção de mevalonato (T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934). Contudo, se a atividade total de HMGS é maior do que aquela da HMGR, HMG-CoA se acumulará e provavelmente causará inibição de crescimento. Para verificar essa hipótese, os intermediários da via de Acil-CoA foram medidos nas cepas manipuladas.

[000269] Figura 6. Comparação de crescimento celular de E. coli que expressa genes de MevT individuais e combinações dos mesmos em altos níveis. Crescimento de células de E. coli abrigando plasmídeos pBad33 (controle de plasmídeo vazio), pAtoB, pHMGR, pHMGS, pHMGSR e [p]BAD33MevT.

Exemplo 4: Toxicidade causada pela expressão aumentada de HMGS é em virtude da atividade enzimática aumentada da proteína e não simplesmente produção aumentada da proteína em si

[000270] O exemplo a seguir demonstra que a toxicidade observada na expressão de HMGS não é em virtude de expressão da enzima, mas é em virtude de sua atividade - a produção de HMG-CoA a partir de acetoacetil-CoA e acetil-CoA. Isto é, a inibição de crescimento observada não é em virtude da carga metabólica decorrente da produção de enzima adicional, mas antes pela ação da enzima na célula.

Criando uma HMGS de comprimento total, mas cataliticamente inativa

[000271] A toxicidade causada pela expressão elevada de HMGS de S. cerevisiae apenas em E. coli poderia ter sido em virtude da toxicidade causada pela produção em alto nível de uma proteína heteróloga (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247-261) em oposição à atividade metabólica de HMGS. Para diferenciar entre as duas possibilidades, uma HMGS de comprimento total, mas cataliticamente inativa, foi criada. O sítio ativo da proteína de HMGS de S. cerevisiae do tipo silvestre foi determinado através de comparação da sequência de proteína da HMGS de levedo com as sequências de sítio ativo de várias proteínas de HMGS de mamífero listadas em L.L. Rokosz et al. ((1994) Arch. Biochem. Biophysics. 312(1), 1-13). Os resíduos de sítio ativo de HMGS de S. cerevisiae eram idênticos aos resíduos aminoácido do sítio ativo das sintases de HMG-CoA de mamífero.

[000272] Rokosz et al. ((1994) supra) demonstraram que a alteração do aminoácido cisteína catalítica da HMG-CoA sintase humana por uma alanina criava uma proteína de HMG-CoA sintase de comprimento total que era cataliticamente inativa. Conseqüentemente, o aminoácido cisteína catalítica do sítio ativo de HMGS de S. cerevisiae no pBAD33MevT foi substituído por um aminoácido alanina usando mutagênese sítio-dirigida (kit de Mutagênese Sítio-Dirigida QuickChange, Stratagene). A cisteína na posição de aminoácido 159 para o mutante de alanina da HMGS de levedo, denominado HMGS(C159A), foi verificado pela sequência de DNA do óperon inteiro. O plasmídeo pBad33MevT contendo o mutante HMGS(C159A) foi denominado [p]BAD33MevT(C159A) (SEQ ID NO 11). Expressão elevada de pBAD33MevT(C159A) em E. coli DH10B não produziu mevalonato detectável, conforme medido através de MS aleatória/LC (cromatografia de líquido/espectrometria de massa aleatória) ou MHG- CoA, conforme medido através de cromatografia de líquido- espectrometria de massa. Esse resultado mostra que o mutante HMGS(C159A) é também cataliticamente inativo.

[000273] Para construir um plasmídeo que expressa sintase de HMG- CoA mutante apenas, HMGS(C1 59A) foi amplificada a partir do pBAD33MevT(C159A) usando protocolos padrões de PCR e iniciadores complementares às extremidades 5' e 3' do gene. O gene de HMGS(C159A) foi clonado nos sítios Xmal-Sall do plasmídeo arabinose-induzível de baixo número de cópias, pBAD33, através de digestão do vetor vazio e do produto de PCR com as enzimas de restrição XmaI e SalI e ligação com DNA ligase T4. O plasmídeo resultante foi denominado pHMGS(C159A) (SEQ ID NO 12).

Determinação da causa da inibição de crescimento

[000274] Para determinar porque a expressão elevada de HMGS em E. coli causa inibição de crescimento, o efeito da expressão elevada de HMGS do tipo silvestre foi comparado com o efeito da expressão elevada de HMGS de comprimento total cataliticamente inativa, HMGS(C159A). Plasmídeos [p]BAD33 (o controle de plasmídeo vazio), pHMGS, pHMGS(C159A), pBAD33MevT e pBAD33MevT(C159A) foram transformados em E. coli DH10B usando procedimentos padrões. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar com LB contendo 50 μg/mL de cloranfenicol. Uma única colônia de cada cepa foi transferida da placa de ágar com LB para 5 mL de meio líquido LB contendo o mesmo antibiótico. Essa cultura de semente foi incubada com agitação a 37 °C até que o crescimento atingisse uma fase estacionária.

[000275] As cinco diferentes culturas de semente foram usadas para inocular placas de microtitulação com 96 cavidades contendo volumes de 0,2 mL de meio LB, 1% (peso/vol) de glicerol e antibióticos. As culturas na placa com 96 cavidades foram agitadas continuamente a 37 °C em um leitor para placa de microtitulação e induzidas com arabinose a 2 mM a 2 horas pós-inoculação. O crescimento celular de cada cultura é visualizado na Figura 7.

[000276] Conforme mostrado na Figura 7, em comparação com o controle (cepa abrigando pBAD33), expressão elevada de HMGS em E. coli (na cepa abrigando pHMGS) causa inibição de crescimento, enquanto que expressão elevada do mutante HMGS(C159A) em E. coli (em cepas abrigando pHMGS(C159A)) não. Em virtude do fato de a única diferença entre o pHMGS e pHMGS(C159A) ser a conversão da cisteína catalítica em uma alanina, esse resultado demonstras que a toxicidade causada pela expressão elevada de HMGS do tipo silvestre é em virtude da atividade enzimática da proteína e não meramente a inibição de crescimento que pode ser causada pela expressão elevada de proteínas heterólogas (B.R. Glick. (1995) Biotech Advances. 13(12): 247- 261). Além disso, E. coli que expressa o óperon MevT inativo em altos níveis (na cepa abrigando pBAD33MevT(C159A)) exibe o mesmo perfil de crescimento que o controle, enquanto expressão elevada do óperon MevT funcional (no cepa abrigando pBAD33MevT) inibe o crescimento celular. Esse resultado demonstra que a inibição de crescimento causada pela expressão elevada de todos os genes no óperon MevT não é em virtude de inibição de crescimento causada pela expressão elevada de proteínas heterólogas.

[000277] Além disso, a Figura 7 demonstra que a toxicidade a partir de expressão elevada do óperon MevT, causada pelo acúmulo intercelular de HMG-CoA (veja Exemplos 5 e 6, acima), pode ser aliviada através de redução da atividade de HMGS. Embora a atividade de HMGS seja reduzida para zero nesse exemplo, existem níveis reduzidos de atividade de HMGS que aliviarão a inibição de crescimento, ao mesmo tempo em que ainda permitem a produção de mevalonato. Expressão elevada de uma via equilibrada quanto à atividade enzimática resulta na produção aumentada de mevalonato por volume de cultura de célula.

[000278] Figura 7. Efeito de expressão elevada de HMGS cataliticamente inativo sobre o crescimento de células de E. coli. Comparação do crescimento de células de E. coli abrigando os plasmídeos pBad33 (controle de plasmídeo vazio), pBAD33MevT, pBAD33MevT(C159A) (contém HMGS inativa), pHMGS e pHMGS(C159A) (contém HMGS inativa).

Exemplo 5: Inibição de crescimento de E. coli superexpressando o óperon MevT é em virtude do acúmulo intracelular de HMG-CoA

[000279] Os exemplos a seguir demonstram que a inibição de crescimento observada quando de expressão do óperon MevT é em virtude do acúmulo de HMG-CoA.

[000280] As cepas de E. coli DH10B abrigando plasmídeos pBAD33 (o controle de plasmídeo vazio), pHMGS, pHMGSR e pBAD33MevT foram crescidos durante a noite a 37 °C em 5 mL de meio LB e antibióticos sob condições de não-indução. As culturas noturnas foram usadas para inocular frascos de agitação com defletor contendo 100 mL de meio LB, 1% (peso/vol) de glicerol e antibióticos. As culturas foram agitadas continuamente a 37 °C e induzidas com arabinose a 2 mM a 2 horas pós-inoculação. Os níveis intracelulares de HMG-CoA em cada cepa e o crescimento celular de cada cultura foram medidos e os resultados são visualizados nas Figura 8 e Figura 9, respectivamente.

[000281] Conforme mostrado nas Figuras 8 e 9, em comparação com o controle de vetor vazio (a cepa abrigando pBAD33), expressão elevada de HMGS (na cepa abrigando pHMGS) causa o acúmulo de HMG-CoA e inibição de crescimento. De modo interessante, expressão em alto nível de HMGS e HMGR em conjunto (na cepa abrigando pHMGSR) não causa inibição de crescimento e não se acumula em um nível detectável de HMG-CoA e geralmente é similar ao controle a esse respeito. Contudo, a expressão elevada de AtoB, HMGS e HMGR juntos no óperon MevT em E. coli (na cepa abrigando pBAD33MevT) causa inibição de crescimento e o acúmulo de HMG-CoA em momentos posteriores.

[000282] E. coli produz naturalmente acetoacetil-CoA em um baixo nível a partir da expressão nativa de AtoB e da degradação de ácidos graxos de cadeia curta. Os resultados mostrados na Figuras 8 e 9 demonstram que a expressão elevada de HMGS sozinho em E. coli produz HMG-CoA a partir do suprimento nativo de acetoacetil-CoA. Em virtude do fato de a HMG-CoA não ser nativa à E. coli, ela não é conhecida por ser acionada por qualquer enzima em E. coli e não atravessará a membrana celular; portanto, HMG-CoA se acumula na célula. Em um determinado nível, a HMG-CoA inibe os processos celulares. Contudo, expressão elevada de HMGS e HMGR junto permite que a HMG-CoA que é produzida a partir do suprimento nativo de acetoacetil-CoA pela HMGS seja convertida em mevalonato. O mevalonato atravessará a membrana celular e se acumulará nos meios. Adicionalmente, elevadas concentrações extracelulares de mevalonato parecem não ter efeito significativo sobre o crescimento de E. coli (Martin et al. (2003) supra).

[000283] Figura 8. Níveis de HMG-CoA intracelular de cepas de E. coli que expressam estruturas da via de mevalonato. Acúmulo de HMG-CoA em E. coli abrigando pBad33 (controle de plasmídeo vazio), pHMGS, pHMGSR e pBAD33MevT.

[000284] Figura 9. Crescimento celular de cepas de E. coli que expressam estruturas da via de mevalonato. Comparação de crescimento celular de E. coli abrigando plasmídeos pBad33 (controle de plasmídeo vazio), pHMGS, pHMGSR e pBAD33MevT.

[000285] Expressão elevada de AtoB, junto com HMGS e HMGR, proporciona substrato aumentado para HMGS e aumenta substancialmente a produção de mevalonato (T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934); contudo, se a atividade total de HMGS é maior do que aquela da HMGR, o intermediário HMG- CoA novamente se acumulará e causará inibição de crescimento. Assim, em uma modalidade, a presente invenção proporciona um método para alívio da inibição de crescimento em virtude da toxicidade por acúmulo de HMG CoA em uma célula, método o qual compreende modificação de uma célula para aumentar a expressão de HMGR, com relação à HMGS. Em uma modalidade, a atividade de HMGR é aumentada para um nível cerca de igual à atividade de HMGS. Em outras modalidades, a atividade de HMGR é aumentada para níveis 1,5, 2, 5 e 10 vezes a atividade de HMGS.

Exemplo 6: Expressão aumentada de HMGR alivia a inibição de crescimento causada pela expressão elevada de MevT, diminui o acúmulo de HMG-CoA5 e aumenta a produção de mevalonato

[000286] O exemplo a seguir mostra como se pode aumentar a produção de mevalonato e superar o problema de toxicidade causado pelo acúmulo de HMG-CoA em virtude de super- expressão de HMGR.

[000287] Para demonstrar que o acúmulo intracelular de HMG-CoA era tóxico para E. coli e começar a otimização da via para corrigir esse problema, a atividade de HMGR foi aumentada em cepas que expressam o óperon MevT em altos níveis. E. coli DHlOB foi transformado com as seguintes combinações de dois plasmídeos para criar três sistemas de plasmídeo duplo: pBAD33 & pBAD18 (cepa de controle de plasmídeo vazio), pBAD33MevT & pBAD18 e pBAD33MevT & pBAD18HMGR. Transformantes foram selecionados sobre placas de ágar com LB contendo 50 μg/mL de carbenicilina e 50 μg/mL cloranfenicol. Uma única colônia de cada cepa foi transferida da placa de ágar com LB para 5 mL de meio líquido LB contendo o mesmo antibiótico. Essa cultura de semente foi incubada através de agitação a 37 °C até que o crescimento atingisse uma fase estacionária.

[000288] As três diferentes culturas de semente foram usadas para inocular frascos de agitação com defletor contendo 100 mL de meio LB, 1% (peso/vol) de glicerol e antibióticos. As culturas foram agitadas continuamente a 37 °C e induzidas com arabinose a 2 mM a 2 horas pós-inoculação. O crescimento celular de cada cultura, os níveis intracelulares de HMG-CoA em cada cepa e mevalonato produzido em cada cultura foram medidos através dos métodos descritos no Exemplo 1. Os resultados para os três sistemas de plasmídeo duplo são visualizados nas Figuras 10, 11 e 12, respectivamente.

[000289] Conforme mostrado nas Figuras 10 e 11, em comparação com a cepa de controle (a cepa abrigando pBAD33 e pBAD18), a expressão elevada de MevT na cepa abrigando pBAD33MevT e pBAD18 novamente causa inibição de crescimento e o acúmulo de HMG-CoA. Contudo, expressão aumentada de HMGR em um cepa que expressa MevT em um alto nível (a cepa abrigando pBAD33MevT e pBAD18HMGR), alivia a inibição de crescimento em parte e reduz o acúmulo de HMG-CoA. Adicionalmente, conforme mostrado na Figura 12, a expressão aumentada de HMGR leva à produção aumentada de mevalonato. Aumento da expressão de HMGR é apenas um método ilustrativo da invenção para aumentar a atividade de HMGR em células de E. coli. Outros métodos da invenção para aumento da atividade de HMGR levariam a resultados similares.

[000290] A expressão de MBIS e ADS no cepa com atividade aumentada de HMGR e expressão elevada de MevT pode resultar em produção aumentada de amorfadieno. Além disso, aumento da atividade de HMGR e alívio da toxicidade causada pela expressão elevada de MevT podem aumentar a produção de qualquer isoprenóide, dado que uma via enzimática de mevalonato em isoprenóide de interesse é co-expressa.

[000291] Figura 10. Efeito da expressão aumentada de HMGR sobre o crescimento celular de E. coli que expressa o óperon MevT. Crescimento celular de E. coli abrigando plasmídeos pBad33+pBadl8 (controle de vetor vazio), pBad33MevT+pBadl8 e pBad33MevT+pBadl8HMGR.

[000292] Figura 11. Efeito da expressão aumentada de HMGR sobre os níveis de HMG-CoA de E. coli que expressa o óperon MevT. Níveis intracelulares de HMG-CoA de E. coli abrigando plasmídeos pBad33+pBadl8 (controle de vetor vazio), pBad33MevT+pBad18 e pBad33MevT+pBad18HMGR.

[000293] Figura 12. Efeito da expressão aumentada de HMGR sobre a produção de mevalonato de E. coli que expressa o óperon MevT. Níveis de mevalonato em culturas de E. coli abrigando plasmídeos pBad33+[rho]Bad18 (controle de vetor vazio), pBad33MevT+pBad18 e pBad33MevT+pBad18HMGR.

Exemplo 7: Aplicação do método em questão a uma célula hospedeira que produz mevalonato

[000294] O presente Exemplo ilustra como os métodos da invenção podem ser aplicados a qualquer cepa hospedeira que produz mevalonato no qual os níveis de HMG-CoA se acumulam em níveis tóxicos. Em geral, uma célula hospedeira é modificada de alguma forma em uma tentativa para obter maiores níveis de isoprenóide ou precursor de isoprenóide (por exemplo, mevalonato, IPP, um difosfato de poliprenila e similares), para gerar uma célula "parental". Modificações adequadas incluem, por exemplo, modificações que aumentam o reservatório intracelular de acetil-CoA, modificações que aumentam o nível de atividade de acetoacetil-CoA tiolase e modificações que aumentam o nível de atividade de HMGS. Essas modificações poderiam ser realizadas através de alterações ou tratamentos genéticos ou químicos destinados a modificar os níveis de transcrito, níveis de enzima ou atividade específica de enzimas.

[000295] As características de crescimento da célula hospedeira parental são observadas e comparadas com as características de crescimento da célula hospedeira não modificada. Se as células hospedeiras originais crescem de modo significativamente mais lento do que a célula hospedeira não modificada, então, a inibição de crescimento observada pode ser em virtude de toxicidade por HMG-CoA e os níveis resultantes de mevalonato ou produção de isoprenóide seriam subótimos.

[000296] Os níveis de HMG-CoA na célula hospedeira e na célula parental são determinados através de técnicas estabelecidas de extração e LC-MS (veja Exemplo 1) para verificar a razão prevista para a inibição de crescimento. Se o nível de HMG-CoA por biomassa unitária (biomassa medida como o peso da célula seco ou através de medição da densidade óptica, por exemplo, a 600 nm) é maior na célula hospedeira modificada, então, essas medições sustentam a conclusão de que a toxicidade é em virtude de acúmulo de HMG-CoA e, se assim, diminuição dos níveis dentro da célula servirá para aliviar essa toxicidade e aumentar a produção total de mevalonato, IPP ou de isoprenóide. Embora a medição dos níveis de HMG-CoA em uma célula que produz HMG-CoA que tem o crescimento inibido não seja uma etapa requerida no método em questão para alívio da toxicidade induzida pelo acúmulo de HMG-CoA, tais medições podem ser conduzidas de tempos em tempos em determinadas modalidades.

[000297] A toxicidade por HMG-CoA e produção aperfeiçoada de isoprenóide ou precursor de isoprenóide pode ser aliviada através de prática da presente invenção. Por exemplo, a célula hospedeira parental pode ser geneticamente modificada através de uma série de formas, resultando em uma célula hospedeira geneticamente modificada que produz um nível aumentado de HMGR comparado com a célula hospedeira parental. Por exemplo, o número de cópias de um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR é aumentado dentro da célula hospedeira parental, por exemplo, através de modificação genética da célula hospedeira parental com um plasmídeo com elevado número de cópias que expressa HMGR sob o controle de um promotor. Como outro exemplo, o nível de mRNA de HMGR na célula parental é aumentado, por exemplo, através de modificação genética da célula parental com uma estrutura que compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica HMGR que está sob o controle de um promotor mais forte. Como outro exemplo, o sítio de ligação ribossômica a montante de hmgR na célula hospedeira parental é modificado para gerar uma célula hospedeira geneticamente modificada que produz um nível aumentado de HMGR. Observando as características de crescimento de uma célula hospedeira geneticamente modificada e comparando as mesmas com as características de crescimento da célula hospedeira parental, pode-se determinar qual método terá sucesso quando uma célula hospedeira geneticamente modificada mostra menos ou nenhuma inibição de crescimento do parental. Alívio da toxicidade por HMG-CoA será observado como um aumento na taxa de crescimento e/ou aumento na densidade final de células da cultura.

[000298] Como outro exemplo, a célula hospedeira parental é gerada através de aumento do nível de HMG-CoA em uma célula que tem uma via de mevalonato endógena. Por exemplo, o nível de acetil-CoA intracelular dentro de uma célula de levedo, tal como Saccharomyces cerevisiae, é aumentada através de introdução de mutações (modificação genética) na célula de levedo, criando uma célula hospedeira "parental". Por exemplo, o nível de acetil-CoA intracelular é aumentado através de introdução de uma mutação dentro do gene de descarboxilase de piruvato sobre o cromossoma. Isso é realizado usando ruptura de gene em uma etapa (Rothstein, RJ. (1983) Methods Enzymol. 101: 202-211, One-step gene disruption in yeast) para romper a piruvato descarboxilase. Similarmente, alelos de piruvato descarboxilase inativos ou parcialmente ativos são gerados através de transformação integrativa de DNA em levedo (Rothstein, R. (1991) Methods Enzymol. 194: 281-301). Ruptura de piruvato descarboxilase PCR-baseada é realizada usando um ausência prévio em um cepa diferente de Saccharomyces cerevisiae, tal como o cepa S288C (Reid et al., Yeast. 15 de Março de 2002; 19(4): 319-28., Mehdi, K. Yeast, 30 de Junho de 2002; 19(9): 803). Tais alterações diminuem o fluxo de piruvato em etanol via acetaldeído e aumentam indiretamente os níveis de acetil-CoA.

[000299] O aumento no nível de acetil-CoA intracelular pode, por sua vez, resultar em um aumento nos níveis de acetilacetil-CoA o que pode, por sua vez, levar a um aumento nos níveis de HMG-CoA intracelular. Para obter níveis aumentados de HMG-CoA, uma célula hospedeira pode ser ainda geneticamente modificada para aumentar o nível de atividade de acetoacetil CoA tiolase e/ou o nível de atividade de HMGS dentro da célula para aumentar a conversão de acetil-CoA em HMG- CoA, gerando uma célula hospedeira de levedo parental que exibe elevados níveis intracelulares de HMG-CoA. Qualquer vetor projetado para replicação e triagem em levedo e incorporando um promotor ativo em levedo, tipicamente também incluindo um terminador de levedo a jusante do promotor, será usado para expressar genes em levedo. Exemplos de replicons de levedo incluem os replicons 2μ ou CEN, tal como CEN6/ARSH4; exemplos de marcadores selecionáveis incluem os marcadores HIS3, TRP1, LEU2 ou URA3; exemplos de promotores de levedo incluem os promotores CYCl, ADH, TEF ou GPD; um exemplo de um terminador de levedo é o terminador de levedo CYC1. Exemplos de vetores de expressão são fornecidos em Mumberg D, Muller R, Funk M., Gene., 14 de Abril de 1995; 156(1): 119-22. Uma variedade de vetores de levedo são disponíveis para a expressão controlada de proteínas heterólogas em diferentes bases genéticas. Outro exemplo de um vetor de expressão de levedo é pYES2 (Invitrogen Corporation).

[000300] As características de crescimento da célula hospedeira de levedo parental com relação à célula hospedeira de levedo não modificada são comparadas crescendo cada célula separadamente sob condições padrões em meio de crescimento padrão com triagem pelo plasmídeo que expressa o gene de interesse. Exemplos de meios para levedo incluem extrato de levedo/peptona/dextrose (YPD), meio mínimo com dextrose sintético (SD), meio mínimo suplementado (SMM) e meio completo sintético (SC ou CM) (Sambrook e Russell (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual. ISBN 0-87969-577- 3).

[000301] Se a taxa de crescimento da célula hospedeira parental é significativamente mais lenta do que a taxa de crescimento da célula hospedeira de levedo não modificada, acúmulo de HMG-CoA pode ser a causa dessa toxicidade/inibição de crescimento. Para superar a inibição de crescimento celular induzida por acúmulo de HMG-CoA, a célula de levedo parental é geneticamente modificada, de acordo com os métodos da invenção. Por exemplo, a célula hospedeira de levedo parental é geneticamente modificada através de substituição do gene de HMGR endógeno sobre o cromossoma de S. cerevisiae por um ácido nucléico que codifica HMGR que carece da região regulatória N-terminal da enzima (Donald et al., Appl Environ Microbiol., Setembro de 1997; 63(9): 3341-4; Polakowski et al., Appl Microbiol Biotechnol., Janeiro de 1998; 49(l): 66-71), assim, aumentando o nível de atividade de HMG- CoA dentro da célula. Se uma comparação das características de crescimento da célula hospedeira de levedo geneticamente modificada com aquelas da célula hospedeira de levedo parental mostra um aumento significativo na taxa de crescimento, o aumento na taxa de crescimento pode ser atribuído a uma diminuição nos níveis tóxicos de HMG-CoA intracelular.

[000302] Como um resultado, os níveis totais de isoprenóide ou precursor de isoprenóide produzidos pela cepa hospedeiro geneticamente modificado aumentarão, comparado com os níveis produzidos pela cepa hospedeiro parental.

[000303] Por exemplo, S. cerevisiae parental e geneticamente modificado são manipulados para expressar amorfadieno sintase. Por exemplo, o gene para a sintase de amorfadieno (quer o gene de Artemisia annua nativo, o gene de E.coli códon-otimizado (Martin et al., 2003) ou um gene de levedo códon-otimizado) é clonado no sítio de clonagem múltipla do pYES2, de modo que o gene da amorfadieno sintase é transcrito sob o controle do promotor GAL1. Uma célula hospedeira de levedo é transformada com o plasmídeo recombinante, selecionando auxotrofia em uracila. Após crescimento em um meio carecendo de uracila e glicose, expressão da amorfadieno sintase é induzida através da adição de galactose. O nível de HMG-CoA intracelular é aumentada na célula de levedo que produz sintase de amorfadieno através de introdução de uma ou mais mutações, conforme descrito acima, gerando uma célula hospedeira de levedo parental. A célula hospedeira de levedo parental é geneticamente modificada, conforme descrito acima, por exemplo, para aumentar o nível de HMGR na célula. A produção do amorfadieno em culturas de célula hospedeira de levedo parental e a célula hospedeira de levedo geneticamente modificada são comparadas; o nível de amorfadieno produzido pela célula hospedeira geneticamente modificada é maior do que o nível de amorfadieno produzido pela célula hospedeira parental. Os níveis de amorfadieno são prontamente medidos usando análise por GC-MS.

[000304] Como outro exemplo, toxicidade por HMG-CoA é observada em células de E. coli originais manipuladas para expressar a via de mevalonato. A toxicidade por HMG-CoA é aliviada através de modificação genética da célula parental, por exemplo, para aumentar o nível de HMGR em uma célula. Esse exemplo é esboçado nos Exemplos 1-6. acima. Aqueles versados na técnica apreciarão que o método pode ser realizado com qualquer célula hospedeira ou qualquer estrutura agora à luz da presente descrição.

[000305] Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência à modalidades específicas da mesma, deve ser compreendido por aqueles versados na técnica que várias alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos sem se desviar do verdadeiro espírito e escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação, material, composição de matéria, processo, etapa ou etapas de processo em particular ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção. Todas de tais modificações se destinam a estar dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (16)

1. Método para produzir um isoprenóide ou precursor de isoprenóide através de uma via de mevalonato em Escherichia coli, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar em um meio adequado uma célula de E. coli geneticamente modificada para produzir hidroximetilglutaril-CoA (HMG- CoA) sintase (HMGS) heteróloga codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 16 ou 17, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos e HMG-CoA reductase (HMGR) heteróloga codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13 ou 14, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos, e em que a célula geneticamente modificada de E. coli é geneticamente modificada ainda para produzir um ou mais enzimas heterólogas adicionais da via de mevalonato selecionadas dentre: (a) uma acetoacetil-CoA tiolase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; (b) uma mevalonato quinase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 19 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; (c) uma fosfomevalonato quinase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; e (d) uma pirofosfato de mevalonato decarboxilase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 21 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos, em que, na ausência da referida HMGR heteróloga, os níveis de HMG-CoA produzidos na célula são tóxicos para a célula, e em que o nível da atividade relativa da HMGR produzida na célula geneticamente modificada de E. coli é maior do que o nível da atividade relativa da HMGS produzida na célula geneticamente modificada de E. coli, de modo que o nível de HMG-CoA presente na célula não seja tóxico para a referida célula e/ou não iniba substancialmente o crescimento celular; e (ii) recuperar o isoprenóide ou precursor de isoprenóide produzido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a acetoacetil-CoA tiolase é heteróloga à célula geneticamente modificada de E. coli.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula geneticamente modificada de E. coli compreende duas ou mais cópias de um ácido nucléico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a HMGR.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a célula geneticamente modificada de E. coli compreende duas ou mais cópias de um ácido nucléico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica a HMGS.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida célula de E. coli geneticamente modificada compreende um plasmídeo de baixo número de cópias compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica HMGS.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a referida célula de E. coli geneticamente modificada compreende um ácido nucleico heterólogo que substituiu o gene HMGS endógeno, e em que o referido ácido nucleico heterólogo apresenta um nível de atividade inferior ao gene HMGS endógeno.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o a referida célula de E. coli geneticamente modificada compreende um construto de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 na qual um sítio de RNase foi introduzido no sítio de ligação do ribossomo a montante de HMGS de modo que a tradução seja reduzida em comparação com uma E. coli em que SEQ ID NO: 1 é inalterada.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a E. coli geneticamente modificada compreende vetores que codificam HMGR e HMGS, em que as regiões de codificação de HMGR e HMGS estão sob o controle de diferentes promotores.

9. Célula hospedeira geneticamente modificada que produz um isoprenóide ou precursor de isoprenóide, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira geneticamente modificada é uma célula hospedeira procariótica que normalmente não produz pirofosfato de isopentenila através de uma via de mevalonato, em que a célula hospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada para produzir hidroximetilglutaril-CoA (HMG-CoA) sintase (HMGS) heteróloga codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 15, 16 ou 17, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos e HMG- CoA reductase (HMGR) heteróloga codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 13 ou 14, ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos, e em que a célula hospedeira geneticamente modificada é ainda modificada geneticamente para produzir um ou mais enzimas heterólogas adicionais da via de mevalonato selecionadas dentre: (a) uma acetoacetil-CoA tiolase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; (b) uma mevalonato quinase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 19 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; (c) uma fosfomevalonato quinase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 20 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos; e (d) uma pirofosfato de mevalonato descarboxilase codificada por uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 21 ou sequências de nucleotídeos degeneradas das mesmas que codificam as mesmas sequências de aminoácidos, em que, na ausência da referida HMGR heteróloga, os níveis de HMG-CoA produzidos na célula são tóxicos para a célula, e em que o nível de atividade relativa da referida HMGR heteróloga produzida na célula E. coli geneticamente modificada é maior do que o nível de atividade relativa do HMGS produzido na célula E. coli geneticamente modificada, de modo que o nível de HMG-CoA presente na célula não é tóxico para a referida célula e/ou não inibe substancialmente o crescimento celular.

10. Célula hospedeira geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma cepa de Escherichia coli.

11. Célula hospedeira geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a acetoacetil-CoA tiolase é heteróloga à célula hospedeira geneticamente modificada.

12. Célula hospedeira geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira geneticamente modificada compreende uma ou mais cópias de um ácido nucléico heterólogo compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a HMGR.

13. Célula hospedeira geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira geneticamente modificada compreende um plasmídeo de baixo número de cópias compreendendo uma sequência polinucleotídica que codifica HMGS.

14. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira geneticamente modificada compreende um ácido nucleico heterólogo que substituiu o gene HMGS endógeno, e em que o referido ácido nucleico heterólogo apresenta um nível de atividade inferior ao gene HMGS endógeno.

15. Célula hospedeira geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira geneticamente modificada compreende um construto de expressão que compreende a sequência de nucleotídeos apresentada na SEQ ID NO: 1 na qual um sítio de RNase foi introduzido no sítio de ligação ao ribossomo a montante de HMGS de modo que a tradução seja reduzida em comparação com E. coli na qual SEQ ID NO: 1 é inalterada.

16. Célula hospedeira geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a referida célula hospedeira geneticamente modificada compreende vetores que codificam HMGR e HMGS, em que as regiões de codificação HMGR e HMGS estão sob o controle de diferentes promotores.

Images