BRPI0511026B1 - uso de um los neisserial, e, composição - Google Patents
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Abstract
uso de um los neisserial, e, composição a presente invenção refere-se a lipo-oligo-sacarídeos (los) neisseriais, que compreendem um núcleo externo de tri-sacarídeo, que apresenta aumentada ligação ao receptor dc-sign das células dendríticas, como resultado do que os los<39>s neisseriais da invenção têm aumentada atividade imunoestimuladora. o núcleo externo de tri-sacarídeo dos los<39>s neisseriais, combinados com uma porção de lipídeo a com reduzida toxicidade, é útil como um adjuvante em preparações de vacina.
Description
USO DE UM LOS NEISSERIAL, E, COMPOSIÇÃO”
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a Lipo-Oligo-Sacarídeos (LOS) Neisseriais, que têm aumentada atividade imunoestimuladora. Os LOS’s Neisseriais da invenção compreendem um núcleo externo de tri-sacar ideo, que apresenta aumentada ligação a um receptor das células dendríticas. O núcleo externo de tri-sacarídeos dos LOS’s Neisseriais, combinados com uma porção de Lipídeo A, com reduzida toxicidade, é útil como um adjuvante em preparações de vacina.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Os LPS de Neisseria meningitidis tem recebido atenção como um candidato a vacina potencial, devido a sua capacidade de induzir respostas imunes específicas-LPS, bem como sendo um potente adjuvante. Entretanto, a atividade endotóxica de LPS tem limitado seu uso em vacinas até agora.
O LPS meningocócico é composto de uma parte de lipídeo A hidrofóbica, que o ancora na membrana externa bacteriana, e de um núcleo oligossacarídeo hidrofílico, que é exposto à superfície bacteriana (Figura 1). A inclusão da cadeia oligossacarídea nativa em preparações de vacina é desaconselhável devido a sua similaridade estrutural com antígenos de glicolipídeo hospedeiros. A engenharia genética dos trajetos de biossíntese do oligossacarídeo LPS tem possibilitado a produção de séries de mutantes de N. meningitidis expressando cadeias de oligossacarídeos truncadas (Figura 1). As propriedades endotóxicas e adjuvantes do LPS parece ser determinada pela parte do lipídeo A da molécula. Geramos previamente um único conjunto de mutantes de lipídeo A de N. meningitidis, com propriedades farmacológicas altamente aperfeiçoadas. Em particular, a inativaçao do gene IpxLl fhtrBl), envolvido a aciloxiacilação do lipídeo A, resultou no isolamento de um mutante de lipídeo A expressando lipídeo A penta-acilado em vez de hexaacilado, com reduzida atividade adjuvante endotóxica porém retida. Além disso, um mutante de A meningitidis, faltando completamente LPS à inativação do gene IpxA meningocócico, foi isolado. Assim, a modificação da parte de lipídeo A, bem como da parte de oligossacarídeo do LPS 5 meningocócico, abriu novas possibilidades para desenvolvimento de vacinas meningocócicas.
As células dendríticas (DC) tomaram-se de interesse principal por causa de seu papel na iniciação de uma resposta imune, tanto durante infecção natural como em resposta a vacinação. As respostas imunes a 10 bactérias são iniciadas por DC, que fagocitam e processam os antígenos bacterianos para apresentação às células T. Mostramos recentemente que o LPS de N. meningitidis representa um papel principal durante as interações com as DC humanas. Além disso, o LPS é necessário para intemalização das bactérias e ativação completa das DC.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Definições
Os adjuvantes são aqui definidos incluírem qualquer substância ou composto que, quando usado em combinação com um antígeno, para imunizar um mamífero, preferivelmente um humano, estimula o sistema 20 imune, desse modo provocando, aumentando ou facilitando a resposta imune contra o antígeno, preferivelmente sem gerar uma resposta imune específica para o próprio adjuvante. Os adjuvantes preferidos aumentam a resposta imune contra um dado antígeno em pelo menos um fator de 1,5, 2, 2,5, 5, 10 ou 20, em comparação com a resposta imune gerada contra o antígeno sob as 25 mesmas condições, porém na ausência do adjuvante. Testes para determinar o aumento médio estatístico da resposta imune contra um dado antígeno, como produzido por um adjuvante de um grupo de animais ou humanos através de um correspondente grupo de controle, são disponíveis na arte. O adjuvante preferivelmente é capaz de aumentar a resposta imune contra pelo menos dois
diferentes antígenos. O adjuvante da invenção usualmente será um composto que é estranho a um mamífero, desse modo excluindo compostos imunoestimulatórios que são endógenos para os mamíferos, tais como, p. ex., interleucinas, interferons e outros hormônios.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção é baseada na surpreendente descoberta de que um LPS Neisserial com uma estrutura de núcleo externa trissacarídea particular, mostra aumentada ligação e intemalização pelas células dendríticas (DC’s) humanas. A ligação e intemalização do LPS contendo trissacarídeo, 10 ou preferivelmente LOS (lipo-oligossacarídeo) contendo trissacarídeo, é mediada pelo DC-SIGN da lectina tipo C, que é expresso nas DC’s humanas e resulta em ativação e maturação das DC’s em taxa aumentada. A atividade imunoestimuladora melhorada deste novo LOS contendo trissacarídeo Neisserial permite seu uso como um potente adjuvante na imunização e 15 vacinação.
Assim, em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a um método para imunização ou vacinação de um mamífero com um antígeno, o método compreendendo a administração (a um mamífero) do antígeno, e um LOS Neisserial é representado pela fórmula (I):
KDO • 2*4
GlcNAc ·1·3 Gal ·1·4 Glc ·1·4 Hep ·1·5 KDO - LA • 1*3
Hep*PEA (3 ou 6) ♦ 1*2
GlcNAc, por meio da qual LA é uma porção de Lipídeo A tipo selvagem, preferivelmente de uma cepa Neisseria, ou mais preferivelmente uma porção de Lipídeo A com toxicidade reduzida.
Na fórmula (I), GlcNAc define D-glicosamina; Gal define Dgalactose; Glc define D-glicose; Hep define D-heptose; KDO define o ácido
3-deóxi-D-manooctulosôníco; PEA define fosfo-etanolamina; βΐ defme í uma ligação β-glicosídica entre as primeira e quarta posições; β1~> 3 define f uma ligação β-glicosídica entre a primeira e terceira posições; ctl -> 5 define i uma ligação oc-glicosídica entre a primeira e quinta posições; ai -> 3 define ; 5 uma ligação α-glicosídica entre a primeira e terceira posições; cd~> 2 define $
j uma ligação oc-glicosídica entre a primeira e segunda posições; ct2->4 define uma ligação ot-glicosídica entre a segunda e quarta posições; PEA(3 ou 6) indica que a fosfo-etanolamina pode ser ligada na terceira ou sexta posição da ΐ ? heptose ou pode estar completamente ausente.
A invenção assim refere-se ao uso de um LOS Neisserial, como definido acima, na manufatura de um medicamento para imunização ou vacinação de um mamífero. Preferivelmente, o LOS Neisserial da invenção é usado como um adjuvante. Mais preferivelmente, o LOS Neisserial é usado em combinação com um antígeno na manufatura de um medicamento para elevar uma resposta imune contra (ou vacinação com) o antígeno do mamífero.
Nos métodos e usos da invenção, o mamífero preferivelmente é um humano. O antígeno preferivelmente é um antígeno de um produzido k por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula de câncer ou um alérgeno, como ainda definido abaixo. O antígeno e o LOS Neisserial são preferivelmente usados no tratamento e/ou prevenção de uma doença infecciosa causada pela bactéria, vírus, fungo ou parasita, ou o tumor causado pela célula de câncer, ou da alergia causada pelo alérgeno.
Nas formas de realização preferidas da invenção, o LOS
Neisserial da invenção tem uma porção de Lipídeo A (LA) modificado com reduzida toxicidade. A toxicidade do LA modificado preferivelmente é menor do que a toxicidade de um LA tipo selvagem correspondente, mais preferivelmente o LA modificado é menor do que 90, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2, 1, 0,5 ou 0,2% da toxicidade do LA tipo selvagem. As toxicidades dos LA’s i Z/
........
í
í tipo selvagem e vários modificados, com reduzida toxicidade, podem ser determinadas em qualquer ensaio adequado conhecido na arte. Um ensaio preferido para determinar a toxicidade, isto é, a atividade biológica do LA’s ou dos LOS’s Neisseriais da invenção é o teste WEHI para indução de TNF5 alfa na linhagem de célula macrófaga MM6 (Epevik e Niessen, 1986, J.
Immunol. Methods 95:99-105; Ziegler-Heitbrock et al., 1988, Int. J. Câncer 41:456-461).
Por outro lado, o LOS Neisserial da invenção, tendo um LA com reduzida toxicidade, deve ainda ter suficiente atividade 10 imunoestimuladora, isto é, atividade adjuvante. O LOS Neisserial da invenção, com reduzida toxicidade, preferivelmente tem pelo menos 10, 20, 40, 80, 90 ou 100% da atividade imunoestimuladora do correspondente LOS Neisserial com um LA tipo selvagem, por meio do que a atividade imunoestimuladora é determinada medindo-se a produção de pelo menos uma citocina ou da expressão de pelo menos uma molécula coestimuladora, como descrito no Exemplo 3 aqui.
Os LOS’s Neisseriais, tendo reduzida toxicidade da porção de lipídeo A, porém retendo (parte da) a atividade adjuvante, podem, p. ex., ser obtidos de patógenos Gram-negativos geneticamente modificados e como 20 recapitulado no WO 02/09746. Em particular, LOS’s Neisserial preferidos, com LA’s com reduzida toxicidade, incluem: (a) LOS’s com uma porção de Lipídeo A como obtenível de uma cepa Neis seria com uma mutação que causa uma redução ou inativação da expressão de um ou mais dos genes IpxLl e lpxL2 (anteriormente conhecidos como htrB e msbB) ou seus 25 homólogos (vide, p. ex., EP 1 127 137; US 5.997.881); (b) LOS’s com uma porção de Lipídeo A, como obtenível por remoção de um ou mais ácidos graxos esterificados O-ligados secundários de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem, por tratamento com uma aciloxi-hidrolase ou hidrólie alcalina (US
5.103.661; Erwin et al., 1991, Infect. Immun. 59: 1881-87); (c) LOS’s com
uma porção de Lipídeo A como obtenível por tratamento com hidrazina de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem (Gu et al., 1996, Infect. Immun. 64: 4047-53; Polotsky et al., Infect. Immun. 62: 210-14; Gu et al., 1998, Infect. Immun. 66:191-97, 1998); (d) LOS’s com uma porção de Lipídeo A, como obtenível por desfosforilação de uma porção de Lipídeo A com uma fosfatase alcalina (US 6.290.952); e (e) LOS’s obtenível por desfosforilação ou desacilaçao enzimática de LOS produzido em hospedeiro Neisserial, em que um gene IpxE ou pagL é expresso. Expressão reduzida é aqui entendido significar aumentada ou reduzida, quando comparado com uma correspondente cepa tipo selvagem, por meio do que o nível de expressão preferivelmente pelo menos difere por um fator 2, 5 ou 10 da correspondente cepa tipo selvagem.
LA’s preferidos com reduzida toxicidade incluem, assim, LA com uma Ci2-acila secundária somente na glicosamina redutora, LA com uma
Ci2-acila secundária somente na glicosamina não redutora, LA sem ambos os grupos Ci2-acila secundários, LA’s sem um ou mais grupos fosfato da posição 1 ou 4’ e combinações das desacilações e desfosforilações supracitadas.[
Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um LOS Neisserial, que é representado pela fórmula (I):
KDO • 2*4
GlcNAc ·1·3 Gal ·1·4 Glc *1*4 Hep *1*5 KDO - LA ·1·3
Hep»PBA {3 ou 6) • 1*2
GlaNAa, por meio da qual o LA é uma porção de Lipídeo A com reduzida toxicidade, como definido acima.
Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição compreendendo um LOS Neisserial como aqui definido acima, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a composição compreende ainda um antígeno que é de ou produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula de câncer ou um alérgeno. As composições farmacêuticas podem ainda compreender agentes estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis, agentes osmóticos, agentes tamponaníes, agentes dispersantes e similares. A forma preferida da composição farmacêutica depende do modo pretendido de administração e aplicação terapêutica. O veículo farmacêutico pode ser qualquer substância compatível, não-tóxica, adequada para suprir os ingredientes ativos, isto é, o LOS Neisserial e o antígeno, ao paciente. Veículos farmaceuticamente aceitáveis para suprimento intranasal são exemplificados por água, soluções salinas tamponadas, glicerina, polissorbato 20, cremophor EL, e uma mistura aquosa de glicerídeo caprílico/cáprico e podem ser tamponados para fornecer um meio-ambiente de pH neutro. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para suprimento parenteral são exemplificados por 0,9% NaCl ou 5% glicose tamponado estéril, opcionalmente suplementados com 20% albumina. As preparações para administração parenteral devem ser estéreis. A via parenteral para administração dos ingredientes ativos é de acordo com os métodos conhecidos, p. ex., injeção ou infusão por vias subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intraarterial ou intralesional. As composições da invenção são preferivelmente administradas por injeção de bolo. Uma composição farmacêutica típica para injeção intramuscular seria preparada para conter, por exemplo, 1 - 10 ml de solução salina tamponada com fosfato e 1 a 100 pg, preferivelmente 15 - 45 pg de antígeno e 1 a 100 pg, preferivelmente 15 - 45 pg do LOS Neisserial da invenção. Para administração oral, o ingrediente ativo pode ser administrado em formas de dosagem líquida, tais como elixires, xaropes e suspensões. As formas de dosagem líquida para administração oral podem conter colorante e aromatizante, para aumentar a aceitação do paciente. Métodos para preparar composições parenteral, oral ou intranasalmente administráveis são bem
η | conhecidos na arte e descritos com mais detalhes em várias fontes, incluindo,| por exemplo, Remington5s Pharmaceutical Science (15a. ed., Mack|
Publishing, Easton, PA, 1980) (incorporado por referência em sua totalidade| para todas as finalidades).|
O antígeno da composição da invenção preferivelmente é umI antígeno que é de ou produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um| parasita, uma célula de câncer ou um alérgeno. Antígenos virais que podem| ser combinados com o LOS Neisserial da invenção podem ser derivados de| todas as espécies de vírus, exemplos não-limitativos de tais vírus sendo:/
Retroviridae, tal como Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV); umí rubelavírus; paramixoviridae, tal como vírus da parainfluenza, sarampo,| caxumba, vírus sincial respiratório, metapneumovírus humano; flaviviridae,I tal como o vírus da febre amarela, o vírus da dengue, Vírus da Hepatite CI (HCV), Vírus da Encefalite Japonesa (JEV), encefalite inata no carrapato,I encefalite de St. Louis ou vírus West Nile; Herpesviridae, tal como vírus doI herpes simples, citomegalo vírus, vírus Epstein-Barr; Bunyaviridae;I
Aemaviridae; Hantaviridae tal como Hataan; Coronaviridae; PapovaviridaeI tal como papilomavírus humano; Rhabdoviridae, tal como vírus da raiva.
Coronaviridae, tal como coronavírus humano; Alphavirídae, Arteriviridae, filoviridae tal como Ebolavírus, Arenaviridae, poxiviridae, tal como vírus da varíola e vírus da febre suína africana. Igualmente, os LOS’s Neisseriais da invenção podem ser combinados com antígenos derivados de bactérias I patogênicas, fungos (incluindo leveduras) ou parasitas. Tais antígenos incluem antígenos bacterianos de, p. ex., Helicobacter, tais como H. pylori,
Neisseria, tais como N, meningitidis, Hciemophilus, tais como H. influenza,
Bordetella, tais como B. pertussis, Chlamydia, Streptococcus, tais como|
Streptococcus sp., sorotipo A, Vibrio, tal como V. cholera, patógenosI entéricos gram-negativos, incluindo, p. ex., Salmonella, Shigella,|
Campylobacter e Escerichia, bem como antígeno de bactéiras causandoj antraz, lepra, tuberculose, difteria, doença de Lyme, sífdis, febre tifóide e gonorréia. Antígenos de parasitas, p. ex., incluem antígenos de protozoarios, tais como Babesis bovis, Plasmodium, Leishmania spp, Toxoplasma gondii e Trypanosoma, tais como T. cruzi. Os antígenos fungicos podem incluir antígenos de fungos tais como Aspergillus sp., Candida albicans. Cryptococcus, tais como, p. ex., C. neoformans, e Histoplasma capsulatum.
Embora a vacinação seja geralmente aplicada para a proteção profilática contra patógenos ou para o tratamento de doenças em seguida à infecção patogênica, uma pessoa hábil na arte está ciente da aplicação de vacinas para tratamento de tumor. Além disso, um número crescente de proteínas específicas de tumores é constatado serrem entidades apropriadas, que podem ser alvejadas por anticorpos humanos ou humanizados. Tais proteínas específicas de tumor estão também dentro do escopo da presente invenção. Muitos antígenos específicos de tumor são conhecidos na arte. Portanto, em uma forma de realização preferida, a invenção fornece composições compreendendo um antígeno específico de tumor e um LOS Neisserial, como definido acima. Antígenos de tumor adequados incluem, p. ex., antígeno carcinoembriônico, antígeno de membrana específico de próstata, antígeno específico de próstata, proteína MZ2-E, mucina epitelial polimórfica (PEM), proteína de ligação de folato LK26, receptor do fator de crescimento epidérmico (truncado) (EGRF), HER2, antígeno ThomsenFriedenreich (T), gangliosídeos GM-2 e GD-2, Ep-CAM, mucina-I, glicoproteina-2 epitelial e antígeno específico de cólon.
Além disso, os antígenos podem ser alvejados em DC’s, a fim de induzir tolerância na prevenção de doença auto-imune. Tais alérgenos estão também dentro do escopo da presente invenção.
Em outro aspecto, a invenção refere-se a métodos para produzir um LOS Neisserial, como definido acima. Um método preferido compreende as etapas de: (a) cultivar uma cepa A. meningitidis, por meio do que a cepa expressa um LOS Neisserial de imunotipo L2, L3 ou L4 e nào tem um gene IgtB ativo, ou expressa um LOS Neisserial de imunotipo L6 e por meio do que contém uma mutação que mativa ou reduz a expressão de um ou mais dos genes IpxLl e lpxL2\ e (b) recuperação do LOS Neisserial.
Altemativamente, o método compreendendo as etapas de: (a) cultivar uma cepa ΛΓ. meningitidis, por meio do que a cepa expressa um LOS Neisserial do imunotipo L2, L3 ou L4 e não tem o gene IgtB ativo ou expressa um LOS Neisserial do imunotipo L6; (b) recuperação do LOS Neisserial; e (c) tratamento do LOS Neisserial com pelo menos um de hidrazina, fosfatase 10 alcalina ou aciloxiidrolase, para reduzir a toxicidade da porção de lipídeo A.
No método, a ordem de etapas (b) e (c) pode ser trocada. Em um método preferido, na etapa c), a toxicidade é reduzida ate menos do que 80% da toxicidade do LOS Neisserial tipo selvagem, como determinado em um ensaio WEHI, como descrito acima.
Em ainda outro aspecto, a invenção refere-s a OMV’s Gramnegativas (Vesículas Membranosas Externas) ou vesículas compreendendo os LOS’s Neisseriais, como definido acima. Meios e métodos para produzir OMV’s ou vesículas Gram-negativas são descritos em WO 02/09746. As vesículas Gram-negativas assim obtidas podem ser combinadas com o LOS 20 Neisserial da invenção, para produzir vesículas Gram-negativas compreendendo os LOS’s Neisseriais. Aitemativamente, as vesículas podem ser produzidas de uma cepa Neisserial, como definido acima, que é capaz de produzir um LOS Neisserial da invenção. As vesículas Gram-negativas podem ainda ser combinadas com um antígeno como descrito acima e/ou com 25 veículos farmaceuticamente aceitáveis, como descrito acima.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:
Figura 1: Representação esquemática de N. meningitidis WT L3 LPS e seus mutantes oligossacarídeos, que podem ser gerados por inativação insercional dos genes (indicados em itálico) codificando as glicosiltransferases.
Figura 2: Células dendríticas (DC) foram cultivadas com bactérias rotuladas FITC em uma relação de 1:50 por 24 h. Nos pontos de tempo indicados, amostras foram tiradas para medir a associação das bactérias 5 com as DCs por FACS. Um representante de três experimentos separados de três diferentes doadores é mostrado.
Figura 3: As DCs foram estimuladas com bactérias rotuladas FITC em uma relação de 1:50 por 18 h, na presença de brefeldina A e então tingidas para TNF-α e IL-12 intracelulares. As plotagens de pontos mostram 10 percentagens de DC associadas com as bactérias não produzindo (quadrante direito mais inferior) ou produzindo (quadrante direito superior) citocinas intracelulares.
Figura 4: A produção de TNF-α, IL-12, IL-Ιβ, IL-10 e IL-6 pelas DC, em resposta a A. meningitidis WT e mutantes foi medida em 15 sobrenadantes de cultura por ELISA, após 18 h de co-cultura. A média e SEM de três experimentos separados são mostrados.
Figura 5: Expressão de CD40 e CD86, após 18 h de cocultura do N. meningitidis WT e mutantes com DCs como indicado por Intensidade de Fluorescência Média (MFI).
Figura 6: Ligação das moléculas C-tipo-lectina-Fc em N.
meningitidis WT e mutantes em um ensaio de adesão solúvel.
Figura 7: Associação DC de N. meningitidis WT e mutante IgtB, na presença e ausência de 20 microgramas de AZN-D1 de anticorpo anti-DC-SIGN por ml.
Figura 8: Proliferação das células Thl/Th2 acionada por DC:
DCs foram incubadas com N. meningitidis tipo selvagem H44/76, o mutante IgtB, LPS de E. coli, poli I:C ou PGE2 por 48 h, lavadas e (A) analisadas quanto aos marcadores de maturação (a média e SEM de três experimentos separados) ou (B) co-cultivadas com células CD45RA+CD4^T.
Células T quiescentes foram reestimuladas com PMA e ionomicina e 1L-4 intracelular e IFN-γ (preto) foi analisado em uma base de célula única por citometria de fluxo. Dados de três diferentes doadores são mostrados.
Figura 9: Associação de DC e indução de citona de bactérias vivas. Células dendríticas (DC) foram cultivadas com N. meningitidis tipo selvagem rotulado-FITC e mutantes LPS em uma relação de 1:100. Nos pontos de tempo indicados, amostras foram tiradas para mediar a associação das bactérias com DCs por FACS. Os resultados são mostrados com células de dois diferentes doadores.
EXEMPLOS
Materiais e Métodos
1.1 Cepas bacterianas
O núcleo dos oligossacarídeos e mutantes de lipídeo A foram derivados de N. meningitidis grupo B N (WT) H44/76 e foram descritos anteriormente:
| Cepa ou mutante | Referência |
| H44/76 | Holten, 1979, J.Clin. Microbiol. 9: 186-188 |
| Jennings et al., 1993, Mol. Microbiol. 10: 361 - 369 | |
| IgtB | Jennings et al., 1995, Mol. Microbiol. 18: 729 - 740 |
| IpxLl | van der Ley et al., 2001, Infect. Immun. 69: 5981 - 5990 |
A estrutura dos mutantes de núcleo de oligossacarídeos usada neste estudo é mostrada na Figura 1. Todas as cepas foram cultivadas em ágar gonocócico (Difco, Basingstoke, UK), suplementado com Vitox (Oxoid Ltd., Baingstoke, UK) em uma atmosfera de 6% de CO2 em ar a 36 °C. As bactérias foram usadas na fase estacionária após cultura por 18 horas. Suspensões de bactérias foram preparadas em meio RPMI 1640, sem vermelho de fenol (Gibco, Paisley, UK) e sua densidade óptica medida a 540 nm. A densidade óptica de 1 foi calculada para corresponder a 109 organismos/ml. As bactérias foram fixadas em 0,5% de paraformaldeído (PFA) em Solução Salina Tamponada co Fosfato (PBS) por 15 minutos e lavadas completamente em meio RPMI. Bactérias rotuladas FITC foram preparadas por incubação com 0,5 mg/ml de FÍTC (Sigma, Poole, UK) por 20 min a 37 °C, seguido por extensa lavagem.
1.2 Células
DC’s foram geradas de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC), como descrito anteriormente (F. Sallusto e A. lanzavecchia, 1994, J. Exp. Med. 179: 1109 1118; H. Uronem-Hansson et ah, 2004, Immunology 111: 173 - 178). Em resumo, monócitos foram preparados de PBMC por centrifugação através de gradientes Percoll de multietapas. A fração de monócitos foi de > 95% CD14+/CD3-/CD19-. Para gerar DC’s, monócitos foram incubados por dias em RPMI suplementado com 10% de FCS inativado pelo calor, 2,4 mM L-glutamina, 100 U/ml Penicilina-estreptomicina (todos da GIBCO, Paisley, UK), 100 ng/ml de GMCSF recombinante humano e 50 ng/ml de IL-4 recombinante humano (Schering-Plough, Welwyn Garden City, Herts UK). DC’s imaturos, preparados desta maneira foram CD14baixo, CD83've, CD86baiX0, CD25‘ve. Eles também expressaram HLA DR,HLA DQ, HLA Classe I, CD40 e CDla e foram negativos para tanto CD 19 como CD3.
DC’s em uma concentração de 5 x 105/ml foram cultivadas com bactérias N. meningitidis H44/76 na relação de DC/bactérias de 1:50 e 1:200 (como indicado na legenda da figura) em RPMI 1640 suplementado com 10% FCS. Quando citocinas intracelulares eram para ser medidas, o inibidor do transporte de proteína Brefeldin A (Sigma, Poole, UK) foi adicionado a 10 pg/mL.
A especificidade de ligação do mutante IgtBl nas DCs foi determinada incubando-se DC’s imaturos com 20 pg/ml de AZN-D1 mAb anti-DC-SIGN por 30 min a 37 °C e, subsequentemente, com bactérias tipo selvagem e mutantes por 45 min a 37 °C.
1.3 Ligação de DC e Intemalização
A ligação de DC e a intemalização de bactérias foram |||?|^
IS determinadas por uma combinação de citometria de fluxo e microscopia confocal. Para detecção por citometria de fluxo, as DC’s foram incubadas com bactérias rotuladas FITC por períodos de tempo entre 30 minutos e 20 h, fixadas em FACSFix (BD), lavadas e analisadas em um FACS Calibur. As
DC ’ s associadas com bactérias foram facilmente identificadas por fluorescência dentro da população ativada por DC. Para microscopia confocal, as DC’s estimuladas com N. meningitidis rotulado com FITC foram permitidas aderir por 10 min a uma lâmina de adesão (Bio-Rad Laboratories Ltd., Herts, UK). Para parar a intemalização, as DC’s foram fiadas com 4% 10 PFA por 10 min. As DC’s foram visualizadas por tingimento com 5 pg/ml de anticorpos monoclonais Classe II anti MHC (Dako, Glstrup, Dinamarca).
Após lavagem, o anticorpo ligado foi detectado com 5 pg/ml de anticorpo anti-camundongo de cargra conjugado com Vermelho do Texas (Molecular probes) por 1 h. As lâminas foram lavadas e montadas em Citifluor (Citifluor 15 Ltd., UK). Imagens confocais foram obtidas utilizando-se um sistema de microscópio de varredura a leiser confocal Leica SP2 (Leica, Milton Keynes, UK), equipado com conjuntos apropriados de filtro. Para identificar as bactérias intracelulares, 15-20 seções ópticas (0,2 - 0,5 μηι) cobrindo as inteiras DC’s, foram projetadas e superpostas com software de imageaçao 20 confocal Leica.
1.4. Medições de Citocina
Para medir a produção intracelular de citocina, as DC’s foram fixadas com 4 % PFA em PBS por 15 minutos, lavadas em PBS contendo 0,1% de azida sódica e 0,5% BSA (todos da Sigmaq) e permeabilizadas em 25 25 μΐ de solução de Permeabilização (Caltag). As células foram então incubadas com anticorpos monoclonais em TNF-α (Becton Dickinson BD, Oxford UK) e IL-12 p40/70 (Pharmingen) ou controles igualados por isótipo por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. As células foram então lavadas duas vezes em PBS, fixadas em CelFix (Becton Dickinson) e analisadas por citometria de fluxo em um FACScalibur, empregando-se software Cell Quest (Becton Dickinson). As DC’s produziram uma população distinta, identificada por dispersão ângulo para diante e reto. Pelo menos 95% das células desta população eram DC’s, como definido por sua expressão de 5 MHC II, CDla, CD25, CD80, CD83 e CD86. Um mínimo de 3000 eventos dentro dos portões correspondendo às DC foi coletado para análise. Para os ensaios ELISA de citocinas solúveis, kits CytoSets™ ELISA (Biosource Europe S.A., Nivelles Belgium) para IL-12, TNF-α e IL-10, IL6 e IL1 β humanos foram usados de acordo com instruções do fabricante.
1-5 Ensaio de Adesão de C-tipo-lectina-Fc Solúvel
As moléculas C-tipo-lectina-Fc consistem da parte extracelular do receptor da lectina tipo-C (DC-SIGN, MGL e Dectina-1B), fundida no término COOH a um fragmento IgGl-Fc humano (T. Geijtenbeek et al., 2003, J. Exp. Med., 197: 7 - 17). O ensaio de adesão de C-tipo-lectina-Fc solúvel 15 foi realizado como segue. Células inteiras (OD540=0,1) foram revestidas sobre placas ELISA (100 μΐ/poço) por 18 h em TA, seguido por bloqueio com 1% BS A por 30 min a 37 °C. O sobrenadante C-tipo-lectina-Fc solúvel foi adicionado por 2 h em TA. C-tipo-lectina-Fc desligada foi retirada por lavagem e a ligação foi determinada por ELISA anti-IgGl.
1.6 Diferenciação Thl/Th2 acionada-DC
As DC’s foram cultivadas de monócitos de doadores saudáveis em Meio da Dulbecco Modificado de Iscove (Gibco), suplementado com 10% FCS (BioWithaker, Verviers, Bélgica), 500 U/ml IL-4 e 800 U/ml GM-CSF (ambos da Shering-Plough). No dia 6, foi induzida maturação de DC com N.
meningitidis tipo selvagem e mutante IgtB em uma multiplicidade de infecções de 10. Os controles positivos a seguir foram incluídos na resposta de Thl/Th2 misturados com o ensaio (i), 10 ng/ml Scherichia coli LPS (Sigma-Aldrich, St, Louis, MO) (ii) diferenciação Thl, 20 pg/ml poli I: (Sigma-Aldrich) e (iii) diferenciação TH2, 10 p.g/ml PGE2 10 ng/ml LPS (Sigma-Aldrich). No dia 2 as DCs foram analisadas quanto aos marcadores de maturação (CD80, CD83, CD86 e HLA-DR) por citometria de fluxo. Para avaliar a diferenciação das células T, DCs maduros foram incubados com células T CD45RA/CD4' (5,103 células TZ 20,103 DC). No dia 12-15, células T quiescentes foram reestimuladas com 10 ng/ml PMA (Sigma-Aldrich) e 1 pg/ml de ionomicina (Sigma-Aldrich) por 6 horas. Após 1 hora, 10 pg/ml de Brefeldina A (Sigma-Aldrich) foram adicionados às células T. A produção de células simples de IL-4 e IFN-γ foi determinada por análise fluxocitométrica intracelular. As células foram fixadas em 2% PFA, permeabilizada com 0,5% de saponina (Sigma-Aldrich) e tingidas com IFN-y-FITC anti-humano e IL-4PE anti-humano (BD Pharmingen, San Diego, CA).
2- Exemplo: Ligação e intemalização de cepas mutantes de núcleo de oligossacarídeo de N. meningitidis por DCs
Uma técnica citométrica de fluxo foi usada para investigar a ligação e intemalização de N. meningitidis WT, os mutantes de oligossacarídeo e o mutante deficiente-LPS por DC’s humanos. DCs imaturas foram co-cultivadas com cepas mutantes rotuladas-FITC, derivadas de N. meningitidis WT H44/76 em uma relação de DC/bactérias de 1:50 (Figura 2) e 1:200 (dados não mostrados) e analisadas por FACS quanto à presença de bactérias rotuladas FITC associadas DC. Aumento dependente de tempo e dose de associação DC foi observado para mutantes tanto WT como de oligossacarídeo. Dificilmente qualquer associação DC foi encontrada para o mutante deficiente LPS nas primeiras seis horas do curso de tempo. O mutante IgtB apresentou associação DC consistentemente mais elevada do que os mutantes WT ou galE em ambas as concentrações.
Para discriminar entre ligação bacteriana e intemalização, em seguida usamos microscopia confocal para estudar a intemalização de TV. meningitidis WT e mutantes (não mostrados). As bactérias FITC foram facilmente detectadas com partículas pequenas verdes em lâminas.
Μ
Tingimento Classe II MHC foi usado para visualizar as DC’s. A maior parte das DC’s tinha internalizado mais IgtB já após 1 h de incubação, em comparação com as bactérias WT ou o mutante galE. Dificilmente qualquer mtemalização foi vista para o mutante deficiente-LPS. Além de alto nível de 5 intemalização, a aderência de superfície permaneceu tipicamente elevada para as bactérias mutantes IgtB por todo o curso do tempo. Estes resultados confirmam os resultados por FACS; associação aumentada de bactérias com DC’s resulta em aumentada intemalização de bactérias.
3. Exemplo: Ativação e maturação de DC’s em resposta a cepas mutantes
V. meningitidis
A fim de estudar a relação entre intemalização das bactérias e produção de citocina, IL12 e TNF-α, produzidos por DC’s em resposta a WT e aos mutantes foram medidos e análise intracelular e simultânea quanto à intemalização (Figura 3). As DC’s foram co-cultivadas com bactérias 15 rotuladas-FITC em uma relação de 1:50 por 18 horas e então tingidas para a produção intracelular de TNF-α, e IL12. Os quadrantes foram colocados para separar as células que tinham-se associado com as bactérias FITC de células que não tinham bactérias FITC fixadas. As percentagens dadas são as percentagens das DC’s produzindo (quadrante direito superior) ou não 20 produzindo (quadrante direito inferior) citocinas intracelulares após intemalização de bactérias. Os mutantes WT, IgtB e galE eram todos indutores potentes de produção de TNF-α e IL-12 por DC’s, enquanto o mutante deficiente de LPS não era. Virtualmente todas as DC’s que tinham internalizado N. meningitidis WT, os mutantes IgtB e galE estavam 25 produzindo altos níveis de TNF-α. No caso de 1L-12, a produção foi constatada para aproximadamente 50% das DC’s que tinham internalizado as bactérias rotuladas FITC.
Além das medições de citocina intracelular, também medidos os níveis de citocina secretada por DC’s, em resposta a N. meningitidis
(Figura 4). As DC’s foram co-cultivadas com as bactérias mutantes e WT em relação de 1:200 por 18 h e os sobrenadantes coletados para análise de IL12, IL10, TNF-α, IL6 e IL-1 β secretados. Os resultados são mostrados como a percentagem de produção de citocina, comparada com WT (WT = 100%).
Tanto o mutante IgtB como galE induziram um tanto menos IL 12, TNF-oc e IL-Ιβ, em comparação com as bactérias WT. A produção de IL-10 e IL-6 de tanto IgtB e galE parece ser similar à da cepa WT. Dificilmente qualquer produção de citocina foi observada para a cepa deficiente-LPS.
Fmalmente, a maturação de DC’s estimulada por WT e bactérias mutantes foi estudada medindo-se a expressão das moléculas coestimuladoras CD40 e CD86 (Figura 5). A expressão de CD40 e, em particular, CD86, foi mais elevada quando DC’s foram estimuladas com o mutante IgtB, em comparação com DC’s estimuladas com WT ou bactérias mutantes galE. Dificilmente qualquer expressão de CD40 e CD86 foi 15 encontrada quando as DCs foram estimuladas com o mutante IpxA.
Em conclusão, estes dados demonstram que a ligação e intemalização do mutante IgtB por DC’s resulta em ativação e maturação das DC’s, comparável com o nível de ativação e maturação DC induzidas com bactérias WT.
4. Exemplo: Identificação da ligação mediando receptor e intemalização do mutante IgtB
A ligação aumentada e a absorção por DC’s do mutante IgtB incitaram-nos a investigar se esta ligação e intemalização era mediada via um receptor DC específico. Portanto, analisamos a capacidade da WT e dos 25 mutantes ligarem-se aos receptores de lecitina tipo-C, que são capazes de reconhecer os oligossacarídeos e são altamente expressos em DC’s imaturas. A ligação de um painel de quimeras C-tipo-lectina-Fc em células integrais de bactérias WT e mutantes foi estudada em um ensaio de adesão solúvel (Figura 6). Enquanto WT, o mutante galE e o mutante deficiente-LPS não se ligaram
Ί ·.
a qualquer das quimeras-C-tipo-lectina Fc, forte ligação de DC-SIGN-Fc foi constatada para o mutante IgtB. A ligação do mutante IgtB em DC-SIGN foi também constatada em células HEK293T, transitoriamente transfectadas com células DC-SIGN ou K562 estavelmente expressando DC-SIGN (dados não mostrados). Além disso, a especificidade de IgtB para DC-SIGN foi demonstrada estudando-se fagocitose DC do mutante IgtB., na presença ou ausência do anticorpo AZN-D1 (Figura 7) bloqueando anti-DC-SIGN. Na presença de AZN-D1, a fagocitose de IgtB por DCs foi reduzida ao nível de ligação observada para WT, claramente demonstrando que DC-SIGN liga e internaliza o mutante IgtB,
5. Exemplo: Alvejamento do mutante IgtB em DC-SIGN inicia uma resposta imune RhI
Para avaliar a relevância funcional, se alguma, da interação de LPS mutante IgtB com DC-SIGN, estudamos as respostas de células T acionadas-DC, após pulsar DC imaturas com bactérias tipo selvagem PFAfixo ou mutante IgtB. Não foram encontradas diferenças de maturação das DC’s pulsadas com bactérias tipo selvagem ou mutante IgtB, como avaliado pela expressão das moléculas co-estimuladoras e marcadores de maturação (Fig. 8a). Entretanto, as diferenças marcadas foram observadas nos perfisTh1/Th2 induzidos com estas cepas (Fig, 8b). As DCs pulsadas com N. meningitidis tipo selvagem predominantemente geraram uma resposta imune tipo TH2, visto que a maior parte das células T estavam produzindo IL-4. As DCs pulsadas com o mutante IgtB predominantemente evocaram as células T produzindo-IFN-γ, assim mudando o equilíbrio TH1 versus TH2 em direção a TH1. Esta mudança de equilíbrio TH1/TH2 foi observada em 3 doadores independentes. Estes dados indicam que o alvejamento específico de LPS IgtB em direção a DC-SIGN gera sinais DC que acionam a resposta imune dentro de ThL o que é um fenômeno altamente desejável para adjuvantes. Vide também P. Moingeon et al. (2001) Vaccine 19:4363-4372.
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6. Exemplo: Ligação e mtemalização de cepas mutantes duplas de oligossacarídeo/lipídeo A de N. meningitidis por DC’s
Uma técnica citométrica de fluxo foi usada para investigar a ligação e mtemalização de A. meningitidis WT, os mutantes de oligossacarídeo IgtA e IgtB e seus mutantes duplos IpxLl e o mutante deficiente-LPS por DC’s humanas. As DC’s imaturas foram co-cultivadas com cepas mutantes rotuladas-FITC, derivadas de H44/76 A meningitidis WT em uma relação de DC/bactérias de 1:100 e analisadas por FACS quanto à presença de bactérias rotuladas FITC associadas com DC (Figura 9). O único mutante IgtB mostrou consistentemente mais elevada associação DC do que WT ou o único mutante IgtA. Além disso, também no segundo plano do mutante IpxLl a mutação IgtB resultou em mais elevada associação do que as estruturas de oligossacarídeos tipo selvagem ou IgtA, indicando que a ligação mediada-Zg/2? em DC-SIGN é também possível com LPS contendo lipídeo A
IpxLl penta-acilado.
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES1. Uso de um lipo-oligossacarídeo (LOS) Neisserial, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para imunização de um mamífero, em que os lipo-oligossacarídeos (LOS) Neisseriais são representados pela fórmula (I):KDO a2^4GlcNAc βΐ->3 Gal β1->4 Glc β1->4 Hep al->5 KDO - LA al—>3Hep—>PEA (3 ou 6) al—>2GlcNAc, em que LA é uma porção de Lipídeo A tipo selvagem ou uma porção de Lipídeo A com reduzida toxicidade e em que os lipo-oligossacarídeos (LOS) Neisseriais são usados como adjuvantes.
- 2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de os lipo-oligossacarídeos (LOS) Neisseriais serem usados em combinação com um antígeno, na manufatura de um medicamento para elevar uma resposta imune contra o antígeno no mamífero.
- 3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de o antígeno ser de ou produzido por uma bactéria, um vírus, um fungo, um parasita, uma célula de câncer ou um alérgeno.
- 4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de LA ser uma porção de Lipídeo A, cuja toxicidade é menor do que 80% da toxicidade de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem, como determinado em um ensaio WEHI.
- 5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de a porção de lipídeo A ser selecionado do grupo consistindo de:Petição 870180135527, de 28/09/2018, pág. 11/14 (a) uma porção de lipídeo A, como obtenível de uma cepa Neisseria com uma mutação que reduz a atividade ou inativa um gene IpxLl ou lpxL2 ou um seu homólogo;(b) uma porção de lipídeo A, como obtenível por remoção de um ou mais ácidos graxos esterificados O-ligados secundários de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem, por tratamento com uma aciloxiidrolase;(c) uma porção de lipídeo A, como obtenível por tratamento com hidrazina de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem;(d) uma porção de Lipídeo A, como obtenível por desfosforilação com uma fosfatase alcalina.
- 6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de a porção de lipídeo A ser selecionada do grupo consistindo de:(a) uma porção de lipídeo A com uma Cn-acila secundária somente na glicosamina redutora;(b) uma porção de lipídeo A com uma Cn-acila secundária somente na glicosamina não-redutora;(c) uma porção de lipídeo A faltando ambos os grupos Ci2-acila secundária;(d) uma porção de lipídeo A faltando um ou mais grupos de fosfato da posição 1 ou 4’; e (e) uma porção de lipídeo A, com uma combinação das desacilações de (a), (b) ou (c) e das desfosforilações de (d).
- 7. Composição, caracterizada pelo fato de compreender um lipo-oligossacarídeo (LOS) Neisserial representado pela fórmula (I):Petição 870180135527, de 28/09/2018, pág. 12/14KDO α2^4GlcNAc βΐ—>3 Gal β1->4 Glc β1->4 Hep al->5 KDO - LA al—>3Hep^PEA (3 ou 6) al—>2GlcNAc, em que LA é uma porção de Lipídeo A tipo selvagem ou uma porção de Lipídeo A com reduzida toxicidade, em que a composição ainda compreendendo um antígeno de ou produzida por um vírus, um fungo, um parasita, uma célula de câncer, um alérgeno ou uma bactéria, e por meio de que a bactéria é selecionado do grupo consistindo de Helicobacter, Haemophilus, Bordetella, Chlamydia, Streptococcus, Vibrio, patógenos entéricos gram-negativos, Salmonella, Shigella, Campylobacter Escerichia, e bactérias causando antraz, lepra, tuberculose, difteria, doença de Lyme, sífilis, ou febre tifoide, e em que a composição compreende um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de a toxicidade da porção de Lipídeo A ser menor do que 80% da toxicidade de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem, como determinado em um ensaio WEHI.
- 9. Composição de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de a porção de lipídeo A ser selecionada do grupo consistindo de:(a) uma porção de lipídeo A, como obtenível de uma cepa Neisseria com uma mutação que reduz a atividade ou inativa um gene IpxLl ou lpxL2 ou um seu homólogo;Petição 870180135527, de 28/09/2018, pág. 13/14 (b) uma porção de lipídeo A, como obtenível por remoção de um ou mais ácidos graxos esterificados O-ligados secundários de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem, por tratamento com uma aciloxiidrolase;(c) uma porção de lipídeo A, como obtenível por tratamento com hidrazina de uma porção de Lipídeo A tipo selvagem;(d) uma porção de Lipídeo A, como obtenível por desfosforilação com uma fosfatase alcalina.
- 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de a porção de lipídeo A ser:(a) uma porção de Lipídeo A com uma Cn-acila secundária somente na glicosamina redutora;(b) uma porção de Lipídeo A com uma Ci2-acila secundária somente na glicosamina não-redutora;(c) uma porção de Lipídeo A faltando ambos os grupos Ci2-acila;(d) uma porção de Lipídeo A faltando um ou mais grupos fosfato da posição 1 ou 4’; e (e) uma porção de Lipídeo A com uma combinação das desacilações de (a), (b) ou (c) e a desfosforilação de (d).
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