BRPI0511793B1 - proteínas quiméricas isoladas de lumazina sintase modificada - Google Patents

Abstract

proteínas quiméricas isoladas de lumazina sintase modificada. a presente invenção refere-se a proteínas quiméricas isoladas incluindo até dez cópias de peptídeos, polipeptídeos ou domínios de proteína inseridas no termina amino de brucella spp. à enzima lumazina sintase. a seqüências de nucleotídeos que codificam as proteínas quiméricas. a vetores, plasmídeos e células transformadas utilizados para a expressão de proteínas. a anticorpos monoclonais e policlonais induzidos pelas proteínas quiméricas. a hibridomas que produzem os anticorpos monoclonais. a vacinas e compostos farmacêuticos incluindo as proteínas quiméricas, seqüências de nucleotídeos e anticorpos. a um método para induzir uma resposta imune em organismos superiores incluindo a administração de quantidade efetivas das vacinas e compostos farmacêuticos. a biossensores incluindo as proteínas quiméricas. a conjugados de proteína formados pelas proteínas quiméricas e um ligante ligados por meio de ligações covalentes e não covalentes. aos usos das proteínas quiméricas, seqüências de nucleotídeos, vetores, plasmídeos, células transformadas, anticorpos, hibridomas, conjugados, biossensores, vacinas e compostos farmacêuticos. à estrutura quaternária das proteínas quiméricas.

Description

(54) Título: PROTEÍNAS QUIMÉRICAS ISOLADAS DE LUMAZINA SINTASE MODIFICADA (51) lnt.CI.: C12N 9/10; C12N 15/54; A61K 38/45; A61K 39/00; C12P 21/00 (30) Prioridade Unionista: 03/06/2004 AR P 04-01-01923 (73) Titular(es): GOLDGENE LLC (72) Inventor(es): GOLDBAUM, FERNANDO, A.

(85) Data do Início da Fase Nacional: 04/12/2006

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PROTEÍNAS QUIMÉRICAS ISOLADAS DE LUMAZINA SINTASE

MODIFICADA

Descrição Técnica da Invenção

Proteínas quiméricas isoladas incluindo até dez cópias de domínios de peptídeos, polipeptídeos ou proteína inseridos no terminal amino da enzima lumazina sintase de

Brucella spp. Seqüências de nucleotídeos isoladas que codificam as proteínas quiméricas. Vetores, plasmídeos e células transformadas utilizadas para expressar as proteínas. Anticorpos monoclonais e policlonais induzidos pelas proteínas quiméricas. Hibridomas produtores de anticorpos monoclonais. Vacinas e compostos farmacêuticos incluindo as proteínas quiméricas, seqüências de nucleotídeos e anticorpos. Um método para induzir uma resposta imune em organismos superiores incluindo a administração de quantidades efetivas das vacinas e compostos farmacêuticos. Biossensores incluindo as proteínas quiméricas. Conjugados de proteína formados pelas proteínas quiméricas e uma ligação a ligante por meio de ligações covalente e não covalente. Utilizações das proteínas quiméricas, seqüências de nucleotídeos, vetores, plasmídeos, células transformadas, anticorpos, hibridomas, conjugados, biossensores, vacinas e compostos farmacêuticos. A estrutura quaternária das proteínas quiméricas.

Campo Técnico da Invenção

A presente invenção refere-se a proteínas quiméricas formadas por proteínas modificadas derivadas da enzima lumazina sintase de Brucella spp., ligadas a domínios de de 20/10/2017, pág. 66/181

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A presente compostos farmacêuticos indutoras da doença. 316: 673-678 (1998).

peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. As proteínas quiméricas são úteis na indução de respostas imunes em animais superiores e para outros propósitos invenção refere-se também a incluindo antígenos ou anticorpos, ou segmentos de antígenos ou anticorpos, ligados às proteínas modificadas. Antecedentes da Invenção

A aplicação intensa de vacinas vivas atenuadas provoca várias inconveniências econômicas e de saúde. Por exemplo, quando vacinas vivas são atenuadas sua capacidade imunogênica é freqüentemente reduzida. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19(7): 300-302, (1998); Nieba, et al.,

Mod. Asp. Immunobiol., 1 (2): 36-39 (2000). Um outro inconveniente é a possibilidade da atenuação ser revertida e do microrganismo assumir novamente suas propriedades Ver Redfield, N., N. Eng. J Med., Desta forma, durante os últimos anos, a tendência tem sido a de formular vacinas não celulares, baseadas em compostos individuais isolados das bactérias ou vírus. Em geral, estes compostos individuais, tais como proteínas típicas de um microrganismo, apresentam baixa imunogenicidade. Esta limitação foi superada pela utilização de substâncias adjuvantes. Entretanto, existem proteínas que mesmo na presença das substâncias adjuvantes continuam demonstrando baixa imunogenicidade. Várias estratégias de engenharia de proteínas foram propostas para a superação destes dificuldades. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19(7): 300-302 (1998).

Proteínas de capsídeo viral são capazes de formar partículas ordenadas tridimensionalmente, chamadas de de 20/10/2017, pág. 67/181

3/63 partículas semelhantes a vírus. Estas partículas apresentam o mesmo tamanho e formato dos vírus completos. No entanto, são vazias e sem material genético as tornando incapazes de produzir infecções. Seu grande tamanho e ordem as conferem uma imunogenicidade marcada. Ver

Bachmann, et al., Science, 262: 1448-1451 (1993) . A vacina recombinante contra hepatite B, amplamente aceita no mercado, é baseada neste conceito. As partículas semelhantes a vírus têm sido utilizadas como veículo para a inserção de características de peptídeos de certos patógenos com o objetivo de se produzir vacinas contra tais microrganismos patogênicos. Ver WO 00/32227 (Renner, et al.}; WO 01/85208 (Bachmann, et al.). Uma estratégia preferida foi a de se inserir múltiplas cópias de um peptídeo em um veículo altamente imunogênico para prover o peptídeo com a propriedade adjuvante do veículo. No entanto, esta abordagem encontrou muitas dificuldades: devido ao grande tamanho destas partículas, qualquer inserção de um peptídeo na proteína que o compõe, obstrui seu dobramento apropriado e, em muitos casos, reduz sua estabilidade. Além disto, existem poucos sítios de proteína capazes de aceitar inserções de peptídeo sem alteração de sua estrutura geral. Ver Nieba, et al., Mod. Asp. Immunobiol., 1 (2): 36-39 (2000).

Algumas proteínas bacterianas foram postuladas como veículos para o desenvolvimento de vacinas quiméricas. Ver Leclerc, et al., Immunol. Today, 19(7): 300-302 (1998). A sub-unidade B da toxina de clorela é uma proteína pentamérica estável que tem sido utilizada para se obter uma resposta imune de mucosa contra peptídeos inseridos.

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Esta estratégia foi bem sucedida devido à capacidade desta toxina em penetrar na mucosa gástrica. Ver Arakawa, et al., Nature Biotech., 16: 934-938 (1998). A enzima dihidrolipoil desidrogenase do Bacillus steearothermophilus foi também postulada como um veículo protéico tendo em vista que forma uma polimérica estrutura complexa e muito estável. Ver Domingo, et al., J. Mol. Biol., 305: 259-267 (2001); W0 01/42439 (Domingo, et al.).

A enzima lumazina sintase catalisa a penúltima etapa da rota biossintética da riboflavina. Ver Goldbaum, et al., J. Med. Microbiol., 48: 833-839 (1999). Seu sítio ativo está localizado na interface entre monômeros, fazendo com que esta proteína apresente uma ordem polimérica muito estável. Ver Ritsert, et al., J. Mol. Biol., 253: 151-167 (1995). Estas ordens variam entre proteínas que formam partículas pentaméricas e icosaédricas. Ver Braden, et al., J. Mol. Biol., 297: 1031-1036 (2000). A estrutura icosaédrica da lumazina sintase de B. subtilis foi postulada como um veículo para a inserção de peptídeos e desenvolvimento de vacinas. Ver W0 00/53229 (Bacher, et al.) .

A lumazina sintase de Brucella spp. é uma proteína altamente estável. Foi demonstrado que esta proteína de 18-kDa é um marcador útil para o diagnóstico sorológico de brucelose humana e animal. Ver Goldbaum, et al

Microbiol., 30: 604-607 (1992); Goldbaum, et al,

Microbiol., 31: 2141-2145 (1993); Baldi,

Clin. Diag. Lab. Inmunol., 3 (4): 472-476 (1996)

et	al.,	J.	Clin.
et	al.,	J.	Clin.
Baldi,	et	al.,
(1996).	De	acordo
e	a	estrutura
if ia	por	raio-X, a

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5/63 proteína não modificada original mostra o mesmo dobramento quando expressa recombinantemente como a proteína nativa. Ver Braden, et al., J. Mol. Biol., 297: 1031-1036 (2000);

Goldbaum, et al., J. Med. Microbiol., 48: 833-839 (1999);

Goldbaum, et al. , J. Struct. Biol., 123: 175-178 (1998) .

A estrutura mostra que esta proteína de 18-kDa se comporta como um decâmero de 180-kDa em solução, vindo a ser um novo tipo de disposição quaternária da lumazina sintase. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem., 279(9): 8093-8101 (2004) .

Foi postulado que a imunogenicidade da lumazina sintase de Brucella spp. é derivada principalmente de seu caráter polimérico. Ver Baldi, et al., Braz. J. Med. Biol. Res., 33: 741-747 (2000) . A estrutura mostra também que o terminal amino de 10 aminoácidos não está envolvida nem no dobramento geral nem no contato entre monômeros. Ver Braden, et al., J. Mol. Biol., 297: 1031-1036 (2000). A lumazina sintase de Brucella spp. é um imunógeno potente capaz de produzir uma alta resposta imune humoral e celular no modelo murino. Esta capacidade foi verificada quando é induzida a imunização com a proteína recombinante não modificada e com um plasmídeo que codifica para a proteína (terapia genética, vacinação por DNA) . Ver Velikovsky, et al., J. Immunol. Meth., 244 (1-2): 1-7 (2000). É possível se modular a resposta alterando-se a rota de imunização e o adjuvante uso. Ver Velikovsky, et al., Infec. Immun., 70(5): 2507-11 (2002). Particularmente, é possível se criar uma resposta forte do tipo T_H1, a qual seria a resposta com a capacidade de proteção mais elevada em de 20/10/2017, pág. 70/181

6/63 brucelose. Ver Velikovsky, et al., Infec. Immun., 70(5):

2507-11 (2002).

Entretanto, ainda existe uma necessidade na técnica por novos veículos com estruturas estáveis menores úteis para a utilização de peptídeos, polipeptídeos e proteínas, em geral, e antígenos e agentes indutores de resposta imune, em particular. O desenvolvimento e utilização da estrutura decamérica da lumazina sintase como um vetor deste tipo, não foi descrito na técnica.

Depósito de Microrganismos

O plasmídeo pBLS-OMP31 foi depositado em l² de abril de 2004, sob o número de acesso DSM 15546 no DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Alemanha.

Diagramas

A Figura 1 mostra a seqüência de nucleotídeos e aminoácidos da extremidade 5' do gene de BLS clonado no vetor de expressão pETlla (Novagen, EUA) e o cassete gerado. A seção em negrito mostra a região de codificação. A seção em vermelho mostra as bases mutadas no cassete. A seção realçada em amarelo mostra os novos sítios de restrição.

A Figura 2 mostra os oligonucleotídeos utilizados para gerar a quimera BLS-OMP31. Seus anelamentos produzem o aparecimento de sítios coesivos correspondendo às enzimas de restrição Nsil (extremidade 5' ) e AflII (extremidade 3' ) , a seqüência de 27 aminoácidos inserida na quimera (abaixo, em negrito) sendo localizada entre elas. O peso molecular teórico do monômero protéico resultante (19.977,5 de 20/10/2017, pág. 71/181

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Daltons) e o ponto isoelétrico teórico (pl = 6,00) do peptídeo inserido são também mostrados.

A Figura 3 mostra: a) o esquema do plasmídeo pETlla incluindo a seqüência quimérica BLS-OMP31, mostrando os sítios de restrição utilizados quando da clonagem, b) a seqüência de nucleotídeos completa do plasmídeo pETlla incluindo a quimera BLS-OMP31 e c) a estrutura aberta da quimera BLS-OMP31.

suspendida em uréia 8M. correspondendo ao BLS-OMP31.

A Figura 4 descreve a expressão de BLS-OMP31 analisada por SDS-PAGE em acrilamida a 17%. MW: marcadores de peso molecular em quilodaltons, 1: BLS purificado, 2 e 3: alíquotas das culturas de expressão de dois clones de BLS-OMP31. A proteína migra como um monômero de 20 Kda porque o gel é desnaturante.

A Figura 5 descreve a expressão de BLS-OMP31 analisada por SDS-PAGE em acrilamida a 17%. 1: cultura sem indução, 2: cultura induzida com IPTG lmM, 3: fração citoplasmática, 4: fração de corpos de inclusão reAs setas mostram as bandas (LMWM = marcadores de baixo peso molecular, peso indicado em quilodaltons).

A Figura 6 mostra o cromatograma correspondendo à eluição do BLS-OMP31 na coluna Superdex 200 (Pharmacia, EUA) . Os picos foram analisados posteriormente por gel e são numerados. Ver Fig.7.

A Figura 7 mostra os dados de purificação do BLSOMP31 analisado por SDS-PAGE em acrilamida a 17%. 1 e 2:

picos obtidos por um gradiente de uma eluição de BLS-OMP31 através de uma coluna Q-Sepharose (Pharmacia, EUA), 4 e 5:

a numeração dos picos está relacionada com os picos da de 20/10/2017, pág. 72/181

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Figura 6. (LMWM = marcadores de baixo peso molecular, peso indicado em quilodaltons).

A Figura 8 mostra o espectro de dicroísmo circular de BLS e da quimera BLS-OMP31. A elipticidade molar de uma solução 1,0 μΜ de proteína entre 190 e 260 nm foi monitorada em um espectropolarímetro (Jasco, UK).

A Figura 9 descreve uma análise comparativa da estabilidade da quimera BLS-OMP31 em relação à proteína nativa. As curvas mostram a sensibilidade ao desdobramento na presença de concentrações crescentes do agente hidrocloreto de guanidina desnaturante, avaliada pela elipticidade desenvolvida pela proteína em um espectropolarímetro a 222 nm.

A Figura 10 mostra a antigenicidade do BLS-OMP32 por ELISA. 1 gg, 0,25 gg, 0,1 gg e 20 ng de BLS-OMP31 e BLS foram utilizados como antígenos. Anti-BLS Mab (1/1000) e Anti-OMP31 Mab (1/1000) foram utilizados como anticorpos.

A Figura 11 mostra a imunogenicidade de BLS-OMP31 analisada por ELISA. É mostrada a reatividade de diluições 1/100 de soro de camundongos imunizados com BLS-OMP31 com adjuvante (AF) ou sem adjuvante (PBS) contra OMP31. Os soros de cada grupo foram ordenados por reatividade decrescente. A reatividade de um soro pré-imune (controle negativo) é ilustrada por uma linha pontilhada. Um camundongo do grupo AF morreu antes da extração.

A Figura 12 mostra os resultados da titulação de um teste ELISA dos soros de coelhos anti BLS-OMP31. As reatividades dos três soros contra OMP31 foram ensaiadas.

Uma diluição 1/100 de um soro de coelho anti BLS nativo foi de 20/10/2017, pág. 73/181

9/63 utilizada como soro negativo. A reatividade deste soro é ilustrada por uma linha pontilhada.

A Figura 13 descreve a reatividade de um soro de coelho anti BLS-OMP31 (4^â dose) contra bactérias intactas lias ou rugosas B. melitensis H38. A reatividade correspondente ao soro de coelho anti BLS nativo, titulada simultaneamente contra ambos os antígenos, foi subtraída dos valores mostrados. Os erros correspondem à soma dos erros padrão médios.

A Figura 14 mostra a cinética de anticorpos totais anti-OMP31 IgG em lotes de camundongos BALB/c (8 por grupo) imunizados em 4 ocasiões por rota intramuscular e intradérmica com 100 gg de pCI-BLS-OMP31. Os níveis de anticorpos foram analisados por ELISA a cada 15 dias. Os valores representam o valor médio dos 8 animais ± D.P. As setas mostram o tempo de imunização. Os soros de camundongos pCI (controle) mostraram valores n DO similares ou mais baixos que os critérios de corte.

A Figura 15 descreve: a) a seqüência de oligonucleotídeos utilizada para se obter a quimera BLSKETcl, b) as seqüências completas de nucleotídeos do plasmídeo pETlla incluindo a quimera BLS-KETcl e c) a estrutura aberta da quimera BLS-KETcl e sua seqüência de aminoácidos.

A Figura 16 mostra o esquema estratégico geral para se produzir quimeras mistas.

A Figura 17 mostra os resultados da purificação e análise das quimeras mistas criadas entre as quimeras BLSOMP31 e BLS-KETcl. A: análise por cromatografia de troca aniônica em coluna MonoQ das quimeras BLS-OMP31 (pico 3) e de 20/10/2017, pág. 74/181

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BLS-KETcl (pico 1) redobradas e a mistura estequiométrica de ambas (pico 2), BI: análise através de SDS-PAGE dos picos 1, 2 e 3 obtidos na cromatografia por troca aniônica,

B2: análise através de PAGE nativo de BLS-OMP31 puro e quimeras BLS-KETcl e do pico 2 correspondendo às quimeras mistas.

A Figura 18 mostra a imunogenicidade da quimera mista BLS-OMP31-KETcl analisada por ELISA. Reatividade de diluições 1/100 dos soros de camundongos imunizados com BLS-OMP31-KETcl (barras vazias) contra BLS e contra OMP31 e peptídeos sintéticos KETcl. A reatividade de um soro préimune (controle negativo) contra os mesmos antígenos está indicada nas barras cinzas.

A Figura 19 mostra a proliferação in vitro de esplenócitos induzida pela imunização com BLS-KETcl. Indica a média mais 1 desvio padrão da incorporação de timidina titulada (em cpm) após os estímulos in vitro dos esplenócitos de camundongos previamente imunizados com peptídeo KETcl ou BLS-KETcl emulsifiçados em saponina. *0 aumento significativo em cpm em relação aos esplenócitos incubados com um meio de cultura (P < 0,05).

A Figura 20 descreve a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de aminoácidos da quimera BLS-RBD3. A seqüência de codificação do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen-1 é mostrada em vermelho. A seqüência de codificação do BLS truncado nos primeiros 8 resíduos de seu terminal amino é mostrada em preto.

A Figura 21 mostra a estrutura da quimera BLS-RBD3 (painel A: vista lateral, painel B: vista superior). A estrutura foi desenhada com o programa MacroModel de 20/10/2017, pág. 75/181

11/63 misturando a extremidade terminal C com a estrutura teórica do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen-1 (mostrada em uma faixa cores azuis) com a extremidade terminal N da estrutura cristalográfica de BLS (arquivo pdb do Protein DataBank: 1DIO) (mostrada em uma faixa de cores vermelhas). A estrutura teórica do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen-1 foi construída por meio de modelagem por homologia com a estrutura do domínio RBD3 da proteína Staufen de Drosophila melaganoster (pdb: 1EKZ). A figura foi construída com o programa CHIMERA.

A Figura 22 mostra: A: a separação da quimera BLSRBD3 por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida 15% (p/v) , vários marcadores de peso molecular foram corridos na pista direita. B: espectro de dicroísmo circular no UV extremo de BLS-RBD3. A figura mostra comparativamente o espectro da quimera medido experimentalmente (em uma linha contínua) e seu espectro teórico (em uma linha pontilhada), calculado a partir da combinação dos espectros correspondentes à proteína BLS e o domínio RBD3 da proteína de murino Staufen-1 em isolamento. A determinação foi realizada em um tampão Tris/HCl 50mM, NaCI 1,2 M, pH 8, a 4²C. C: a obtenção do peso molecular da quimera BLS-RBD3 foi realizada utilizando-se um detector de dispersão luminosa conectado em série com a saída da coluna de filtro molecular e um detector de índice de refração (IR). O BLSRBD3 foi corrido em uma coluna Superdex-200 e eluído com um tampão Tris/HCl 50mM, uréia 3M, NaCI 1M, pH 8, a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/minuto. A eluição foi monitorada determinado-se seu sinal de dispersão luminosa a 90 graus e refração de luz (RL) . O peso molecular da amostra foi de 20/10/2017, pág. 76/181

12/63 calculado por comparação da relação de seus sinais de dispersão luminosa e de refração com os de uma amostra de albumina de soro bovino como padrão de referência (peso molecular do BSA: 66,5 kDa).

A Figura 23 mostra a densidade ótica obtida a 492 nm de uma diluição 1/100 dos soros analisados para cada camundongo de cada grupo investigado. O resultado em 30 dias de intervalo após a segunda imunização é mostrado como exemplo representativo. A linha horizontal representa o valor médio para cada grupo.

A Figura 24 mostra os resultados de um teste ELISA de anti-OMP31 Mab.

A Figura 25 mostra a detecção de anti-OMP31, anticorpo monoclonal AcMo37F7, utilizando-se um biossensor formado pela derivatização com a proteína guimérica BLSOMP31.

A Figura 26 mostra a expressão de moléculas coestimulantes em células dendríticas estimuladas com BLS.

As células dendríticas, derivadas de medula óssea, foram incubadas durante 18 horas com BLS (BLS 10μΜ) ou com meio apenas (controle) . É mostrada a expressão de CD40 em células CD11⁺ (A) e de I-A^d em células CDllc⁺ (B) . Os controles dos isotipos são mostrados à esguerda de cada gráfico.

A Figura 27 mostra a estratégia seguida para a formação de montagens moleculares com peptídeos heterodiméricos complementares incorporados na proteína BLS modificada e um antígeno X teórico alvo. Ver Braden, et al., supra. Um programa de modelagem Swisspdbviewer foi utilizado.

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A Figura 28 mostra a seqüência de nucleotídeos do gene inserido BLS-RR12EE345L clonado no vetor de expressão pETlla (Novagen, EUA). A seção em vermelho mostra a região de codificação do peptídeo inserido BLS-RR12EE345L. A seção em preto mostra a região de codificação para a proteína BLS modificada.

A Figura 29 descreve as seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da proteína de fusão BLS-RR12EE345L. A seção em vermelho mostra a região de codificação do peptídeo BLSRR12EE345L. A seção em preto mostra a região de codificação para a proteína BLS modificada. A seção em verde mostra a posição do resíduo K29 substituído com serina.

A Figura 30 mostra a separação da proteína de fusão BLS-RR12EE345L por SDS-PAGE em um gel de poliacrilamida 17%. 1: marcadores de peso molecular, 2: amostra irrelevante, 3: proteína de fusão BLS-RR12EE345L.

A Figura 31 mostra a obtenção do peso molecular da quimera BLS-RR12EE345L pela utilização do detector de dispersão luminosa conectado em série com a saída de uma coluna de filtro molecular e um detector de índice de refração (IR) . O BLS-RR12EE345L foi corrido em uma coluna Superdex-200 e eluído com um tampão de Tris/HCl 50mM, uréia 3M, NaCl 0,1 M, pH 8, a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/minuto. A eluição foi monitorada medindo-se o sinal da dispersão luminosa a 90 graus e refração de luz (RL) . O peso molecular da amostra foi calculado comparando-se a relação de seu sinal de dispersão luminosa e seu sinal de refração com as de uma amostra de albumina de soro bovino utilizada como padrão de referência (peso molecular do BSA: 66,5 kDa) .

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A Figura 32 mostra a seqüência de nucleotídeos do gene inserido do peptídeo EE12RR345L no vetor de expressão pGEX-4Tl (Novagen, EUA) . A seqüência é inserida entre os sítios de restrição para BamHl e EcoRl do vetor. A seção em preto mostra a região de codificação para a proteína GST. A seção em vermelho mostra a região de codificação para o peptídeo EE12RR345L.

Descrição da Invenção

A presente invenção descreve proteínas quiméricas úteis, em geral, para a exibição de polipeptídeos e proteínas.

peptídeos,

Os peptídeos, polipeptídeos e proteínas mostrados aqui podem induzir uma resposta imune ou serem adequados para outros propósitos úteis.

A presente invenção descreve também compostos farmacêuticos e vacinas de alto valor imunogênico e eficácia. Estes compostos e vacinas incluem proteínas quiméricas geradas pela utilização da enzima lumazina sintase de Brucella spp. (BLS) como veículo imunogênico.

As proteínas quiméricas descritas neste pedido podem exibir peptídeos, polipeptídeos, proteínas e moléculas de outros tipos de patógenos e de não patógenos distintos.

Mais especificamente, as proteínas quiméricas descritas neste pedido podem ser úteis para o tratamento de prevenção de doenças humanas. Estas entidades podem ser utilizadas para a inoculação de antígenos, toxinas e domínios protéicos com baixa ou nenhuma atividade imunogênica. Exemplos destas indicações seriam vacinação contra sarampo comum, sarampo alemão (rubéola), hepatite, tétano, coqueluche, poliomielite, difteria, caxumba, meningite e hidrofobia em crianças. Outros exemplos destas de 20/10/2017, pág. 79/181

15/63 indicações são vacinação contra hepatite A, B e C, influenza, encefalite, hidrofobia, febre tifóide, febre amarela, herpes simples, varicela zoster, dengue, papilomavírus humano, cólera, malária, tuberculose e caxumba em adultos. Outros exemplos destas indicações são vacinas úteis para neutralizar bioterrorismo, para os seguintes patógenos: Botulinum toxin, Bacillus anthracis, Clostridium perfringens, Bacillus subtilus, Bacillus thuringiensis, vírus da conjuntivite hemorrágica (Enterovirus 70) e rotavírus.

Estas entidades poderiam ser utilizadas também para o tratamento de condições crônicas, tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e artrite rematóide ou outras condições, tais como alergias e tumores. Um exemplo deste último consiste em uma proteína quimérica incluindo simultaneamente anticorpos ou fragmentos de anticorpos contra marcadores tumorais ou elementos radioativos para radioterapia. As proteínas quiméricas desenvolvidas de acordo com a presente invenção, e os anticorpos derivados destas, poderiam ser utilizadas também para o diagnóstico de fertilidade e gravidez, ou de doenças tais como câncer de cólon, pulmão, mama e próstata. Estas entidades poderiam também ser utilizadas para monitorar e controlar o abuso de drogas ou o progresso de tratamentos terapêuticos.

As proteínas quiméricas descritas na presente invenção apresentam também múltiplos usos para a criação de animais domésticos, animais e peixes de criação em fazenda. Estas entidades podem ser utilizadas na preparação de vacinas contra Brucella spp., um agente bacteriano que provoca muitos problemas em gado, ou contra Piscirickettsia de 20/10/2017, pág. 80/181

16/63 salmonis, que afeta principalmente a criação comercial de salmão. Além disto, estas entidades podem ser úteis na administração de agentes antibacterianos, tais como penicilina, amoxicilina ou outros sub-produtos de penicilina, separadamente ou em combinação com anticorpos específicos para animais domesticados, tais como gatos e cães, ou animais de fazenda, como gado.

Outros possíveis usos das proteínas quiméricas descritas no pedido são a preparação de vacinas contra Mycoplasma hyopneumoniae, um agente pulmonar que produz grandes perdas em suínos, e a administração de parasiticidas, como albendazol, fenbendazol e ivermectina contra Ostertagia ostertagi, a bezerros e gado em gral. Seria também possível a utilização destas novas entidades na administração de parasiticidas, como abamectina e praziquantel, a eqüinos, e na vacinação com epitopos de antígenos ou domínios de proteína viral, como gripe aviaria, em passaros

Em todos os casos, a proteína quimérica pode conter simultaneamente o agente parasiticida e os anticorpos específicos contra o parasita envolvido. Uma utilização terapêutica adicional das novas entidades podería ser a administração de agentes antiinflamatórios, como caprofeno a animais domesticados, como cães e gatos.

As proteínas quiméricas de acordo com a presente invenção poderíam ter também diferentes indicações para o controle de patógenos. Estas entidades poderíam ser utilizadas para modificar a expressão de certos hormônios para acelerar a taxa de crescimento e aumento da produção de leite, na criação de animais, ou tornar sua carne mais magra. Um exemplo destas indicações não convencionais de 20/10/2017, pág. 81/181

17/63 seria a utilização destas entidades para a castração imunológica de animais de fazenda, tais como suínos.

As proteínas quiméricas descritas neste pedido podem ser também utilizadas para a produção em larga escala de vacinas e anticorpos em fazendas moleculares. Sob esta abordagem, a vacina ou anticorpo é expresso primeiramente em uma planta adequada. A vacina ou anticorpo é então extraído da planta e purificado para se preparar uma formulação farmacêutica. Uma outra possibilidade seria a alimentação de animais com plantas transformadas com as entidades descritas aqui de maneira a imunizá-los por meio da ingestão de alimento (vacinas comestíveis).

Uma vantagem particular da presente invenção é que os veículos descritos aqui são capazes de portar peptídeos maiores que outros veículos conhecidos na técnica, tais como partículas semelhantes a vírus. Esta vantagem é devida ao seu tamanho pequeno e maior estabilidade. Este sistema de exibição de antígeno dos veículos descritos aqui apresenta a vantagem adicional de exibir peptídeos, polipeptídeos, e proteínas inseridos repetidamente e ordenados espacialmente, aumentando sua estabilidade e meia vida. A proteína veículo (BLS) apresenta também um efeito adjuvante considerável sobre peptídeos, polipeptídeos e proteínas inseridos, aumentando, desta forma, a efetividade da reposta imune.

Uma outra vantagem da presente invenção é que a proteína veículo BLS induz uma resposta imune por si só sem a presença de adjuvantes adicionais. Esta característica facilita a administração de vacinas preparadas de acordo com a presente invenção por várias rotas de administração de 20/10/2017, pág. 82/181

18/63 (por exemplo, intravenosa, nasal, oral, sem agulha) com ou sem adjuvantes.

Os compostos farmacêuticos e vacinas descritos neste pedido são caracterizados por sua alta estabilidade na temperatura ambiente. Esta característica provavelmente preservaria o composto ou vacina ser a manutenção de uma cadeia fria de armazenamento.

A criação de guimeras mistas com peptídeos múltiplos inseridos em diferentes extremidades da proteína veículo BLS é também útil para se desenhar vacinas polivalentes ou vacinas direcionadas para rotas diferentes de resposta imune. A opinião prevalecente na técnica é gue uma vacina não deve conter mais de 10 agentes indutores de resposta imune. É também opinião prevalecente na técnica gue uma vacina deve conter 5 ou menos agentes indutores para se alcançar resultados ideais.

As proteínas guiméricas descritas neste pedido são úteis para a produção de anticorpos. Estes anticorpos e suas entidades associadas podem ser utilizados em diagnóstico. É também possível se desenvolver kits para o diagnóstico de doenças utilizando-se os anticorpos e entidades mencionados acima.

Várias destas entidades desenvolvidas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para exibir peptídeos e construir bibliotecas de proteínas e suas aplicações associadas (por exemplo, biologia combinatória aplicada à identificação de moléculas para o desenvolvimento de drogas ou à identificação de següências de polipeptídeo ligantes preferivelmente a compostos inorgânicos, para aplicações em nano-biologia). Algumas de 20/10/2017, pág. 83/181

19/63 destas novas entidades podem ser também utilizadas para a produção e montagem de dispositivos nanotecnológicos ou para a condução de processos nanotecnológicos.

As proteínas quiméricas de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas na construção e desenvolvimento de biossensores aplicados na detecção analítica de várias substâncias e moléculas (por exemplo, detecção de contaminantes e toxinas em água, solo ou ar, detecção de resíduos de drogas, herbicidas e pesticidas em alimentos).

Uma outra vantagem das entidades descritas neste pedido é a facilidade e baixo custo de produção. As proteínas quiméricas descritas neste pedido são obtidas em altas quantidades a partir de um modelo de cepas transformadas de E. coli, um microrganismo de manipulação e cultura bem conhecidas. Os produtos de interesse obtidos de acordo com este método são facilmente purificados a partir do meio de cultura.

Em uma versão da presente invenção, as proteínas quiméricas isoladas reivindicadas aqui são formadas por um peptídeo, polipeptídeo ou proteína ligados a uma proteína mutada a partir de lumazina sintase de Brucella spp., cuja seqüência de nucleotídeos de codificação foi modificada em seus 8 primeiros resíduos em seu terminal N para possibilitar sua divagem por enzimas de restrição que não clivam naturalmente a seqüência de nucleotídeos de codificação da proteína lumazina sintase de Brucella spp. Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos de codificação da proteína lumazina sintase mutada de Brucella spp. foi modificada em seus 8 primeiros resíduos em seu terminal N de 20/10/2017, pág. 84/181

20/63 de maneira a possibilitar sua divagem com as enzimas de restrição Nsil e AflII. Mais preferivelmente, a proteína lumazina sintase mutada utilizada de acordo com a presente invenção apresenta as seqüências de aminoácidos SEQ ID No.: Ia, SEQ ID No.: 2a, SEQ ID No.: 3a, SEQ ID No.: 4a, SEQ ID No.: 5a, SEQ ID No.: 6a ou SEQ ID No.: 7a. O peptídeo, polipeptídeo ou proteína ligados podem ser homólogos ou heterólogos. Em uma versão da presente invenção, o peptídeo ligado à proteína mutada é um domínio de heterodimerização. Preferivelmente, este domínio de heterodimerização é um domínio de zíper de leucina. As proteínas quiméricas assim obtidas incluem, mas não se limitam a, a seqüência de aminoácidos SEQ ID No.: 8a e são utilizadas preferivelmente para o acoplamento de domínios protéicos, proteínas completas ou outras entidades não protéicas. Em uma outra realização desta invenção, as combinações de proteínas quiméricas isoladas descritas neste pedido são também reivindicadas. Os usos destas proteínas quiméricas isoladas e de suas combinações são também reivindicados.

Em uma outra realização da presente invenção, as seqüências de nucleotídeos isoladas que codificam para as proteínas quiméricas descritas neste pedido são reivindicadas. Estas seqüências podem ser de RNA, DNA genômico ou DNA de cópia. Em uma outra realização da presente invenção, a seqüência de codificação para o peptídeo, polipeptídeo ou proteína ligados está localizada na região 5' da seqüência de nucleotídeos que codifica para a proteína lumazina sintase mutada de Brucella spp. Em uma outra realização da presente invenção, a seqüência de de 20/10/2017, pág. 85/181

21/63 codificação para o peptídeo, polipeptídeo ou proteína ligados é ligada operativamente à região 5' da seqüência de nucleotídeos de codificação para a proteína lumazina sintase mutada de Brucella spp. Preferivelmente, as seguintes seqüências de DNA são utilizadas: SEQ ID No.: lb, SEQ ID No.: 2b, SEQ ID No.: 3b, SEQ ID No.: 4b, SEQ ID No.: 5b, SEQ ID No.: 6b, SEQ ID No.: 7b ou SEQ ID No.: 8b. Exemplos específicos de seqüências de proteínas mutadas utilizadas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, as seqüências de nucleotídeos estruturais: a) BLS-OMP31 b) BLS-KETcl e c) BLS-RBD3, utilizadas nos Exemplos 1, 5 e 8, respectivamente. Em uma outra realização desta invenção, as combinações de seqüências de nucleotídeos isoladas descritas neste pedido são reivindicadas. As utilizações destas seqüências de nucleotídeos isoladas e suas combinações são também reivindicadas.

Em uma outra realização da presente invenção, as combinações de proteínas quiméricas isoladas e as seqüências de nucleotídeos isoladas descritas na presente invenção são reivindicadas.

Em uma outra realização da presente invenção, os vetores incluindo as seqüências de codificação para as proteínas quiméricas descritas aqui são reivindicados. Estes vetores podem ser bacterianos, virais ou de outra origem, e são capazes de expressar as, ou facilitar a expressão das, proteínas quiméricas descritas no presente pedido. Exemplos específicos destes vetores são os plasmídeos pBLS-OMP31, pBLS-KETcl e pBLS-RBD3, utilizados nos Exemplos 1, 5 e 8, respectivamente. Preferivelmente, o plasmídeo pBLS-OMP31, DSM 15546, é uso como vetor e como de 20/10/2017, pág. 86/181

22/63 precursor para a geração de plasmídeos que expressam as proteínas quiméricas descritas no presente pedido. As utilizações destes vetores são também reivindicadas.

Em uma outra realização da presente invenção, as células ou microrganismos com os vetores descritos neste pedido são reivindicados. Estes microrganismos podem ser procarióticos ou eucarióticos ou de outra origem. Exemplos específicos das células que podem ser transformadas com os vetores descritos na presente invenção incluem, mas não se limitam a, células de insetos, bactérias, tais como Escherichia coli, e células de mamíferos tais como CHO, COS, BHK, Namalwa e HeLa. Mais preferivelmente, cepas competentes de Escherichia coli são utilizadas para tais transformações. As utilizações destas células são também reivindicadas.

Em uma versão deste pedido, as proteínas quiméricas isoladas descritas aqui são capazes de induzir uma resposta imune em um organismo eucariótico. Estas proteínas quiméricas podem induzir respostas celulares ou humorais no organismo tratado. Nestes casos, a resposta pode ser contra o mesmo antígeno, toxina ou domínio de proteína ou agente indutor ou contra antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou agentes indutores diferentes. Os antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou agentes utilizados de acordo com a presente invenção podem ser bacterianos, de parasitas, virais ou de outra origem, e podem ser capazes de induzir uma resposta imune. Exemplos específicos destes agentes indutores incluem, mas não se limitam a: a) à seqüência de 27 aminoácidos da proteína OMP31 de Brucella spp., b) à seqüência de 14 aminoácidos da proteína KETcl de de 20/10/2017, pág. 87/181

23/63

Tenia solium e c) a seqüência de 75 aminoácidos do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen, utilizadas nos Exemplos 1, 5 e 8, respectivamente. Em geral, os organismos eucarióticos tratados são pássaros, peixes ou mamíferos. Preferivelmente, estes organismos são de origem murina, de coelho ou humana. Mais preferivelmente, o organismo é de origem humana. As utilizações destas proteínas guiméricas capazes de induzir uma resposta imune são também reivindicadas.

Em uma versão da presente invenção, as següências de nucleotídeos de codificação para as proteínas guiméricas isoladas descritas agui são capazes de induzir uma resposta imune em um organismo eucariótico. Estas següências de nucleotídeos podem induzir respostas celulares ou humorais no organismo tratado. Nestes casos, a resposta pode ser contra o mesmo antígeno, toxina, domínio de proteína ou agente indutor ou contra antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou agentes indutores diferentes. Os antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou agentes indutores utilizados de acordo com a presente invenção podem ser bacterianos, de parasitas, virais ou de outra origem, e são capazes de induzir uma resposta imune. Exemplos específicos destes agentes indutores incluem, mas não se limitam a, as següências de nucleotídeos de codificação para: a) os 27 aminoácidos da proteína OPM31 de Brucella spp., b) os 14 aminoácidos da proteína KETcl de Tenia solium e c) os 75 aminoácidos do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen, utilizados nos Exemplos 1, 5 e 8, respectivamente. Em geral, os organismos eucarióticos tratados são pássaros, peixes ou mamíferos.

de 20/10/2017, pág. 88/181

24/63

Preferivelmente, estes organismos são de origem murina, de coelho ou humana. Mais preferivelmente, o organismo é de origem humana. As utilizações destas seqüências de nucleotídeos capazes de induzir uma resposta imune são também reivindicadas.

Em uma versão da presente invenção, são reivindicados compostos farmacêuticos ou vacinas incluindo os seguintes: 1) pelo menos um tipo das proteínas quiméricas descritas neste pedido, 2) pelo menos um tipo das seqüências de nucleotídeos de codificação para as proteínas quiméricas descritas neste pedido ou 3) uma combinação de 1) e 2).

As formulações farmacêuticas ou vacinas reivindicadas no presente pedido podem estar em estado líquido ou em qualquer outra forma farmacêutica conhecida na técnica, tal como emulsões injetáveis. Os compostos farmacêuticos ou vacinas descritos na presente invenção podem ser também tabletes, soluções líquidas, suspensões ou elixires para administração oral, ou em líquidos estéreis tais como soluções e suspensões. Preferivelmente, é uso um meio inerte, tal como um meio salino, tampões fosfato salinos e qualquer outro meio em que as proteínas quiméricas, seqüências de nucleotídeos ou segmentos destas apresentem uma solubilidade apropriada.

Os agentes ativos dos compostos farmacêuticos ou vacinas reivindicados nesta invenção, estão presentes em doses fisiologicamente efetivas. Estes agentes ativos podem ser administrados separadamente ou em combinação com excipientes farmacêuticos aceitáveis, tais como adjuvantes, de maneira a aumentar a produção de anticorpos.

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25/63

Os compostos farmacêuticos ou vacinas utilizados de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a, várias formulações oleosas tais como adjuvante de Freund, estearato de tirosina, dipeptídeo MDP, saponina, hidróxido de alumínio (alumina), citocinas linfáticas, a proteína nativa da lumazina sintase de Brucella spp. e proteínas mutadas a partir da lumazina sintase de Brucella spp. descritas aqui. Ver US 4.258.029 (Moloney. et al.)·, US 5.057.540 (Kensil, et al.). Preferivelmente, estearato de tirosina, hidróxido de alumínio, a proteína nativa da lumazina sintase de Brucella spp. e as proteínas mutadas descritas aqui são utilizados no caso e seres humanos. O composto farmacêutico ou vacina pode também ser administrado utilizando-se mecanismos de liberação lenta, tais como lipossomas. Ver US 4.235.877 (Fullerton, W.). A preparação de vacinas e compostos farmacêuticos para utilização em organismos superiores é conhecida na técnica. Ver Remington, et al., Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, 1980; Voller, et al., Eds., New Trends and Developments in Vaccines, University Park Press, Baltimore, Maryland, 1978.

Em uma versão da presente invenção, é reivindicado um método para induzir uma resposta imune em um organismo eucariótico. O método engloba a administração a tal organismo de uma quantidade efetiva de um composto farmacêutico ou vacina incluindo: 1) pelo menos um tipo das proteínas quiméricas descritas neste pedido, 2) pelo menos um tipo das seqüências de nucleotídeos de codificação para as proteínas quiméricas descritas neste pedido ou 3) uma combinação de 1) e 2) . Em uma versão desta invenção, é de 20/10/2017, pág. 90/181

26/63 induzida uma resposta humoral. Em uma outra realização desta invenção, é induzida uma resposta celular. Em uma outra realização desta invenção, são induzidas respostas humorais e celulares simultaneamente ou seqüencialmente. Nestes casos, as respostas podem ser contra o mesmo antígeno, toxina ou domínio de proteína ou agente indutor ou contra antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou agentes indutores diferentes. Os antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou agentes utilizados de acordo com a presente invenção podem ser bacterianos, de parasitas, virais ou de outra origem, e são capazes de induzir uma resposta imune. Exemplos específicos destes agentes indutores incluem, mas não se limitam a, as seqüências de nucleotídeos de codificação para os as seqüências de aminoácidos de: a) os 27 aminoácidos da proteína OPM31 de Brucella spp., b) os 14 aminoácidos da proteína KETcl de Tenia solium e c) os 75 aminoácidos do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen, utilizados nos Exemplos 1, 5 e

8, respectivamente. Preferivelmente, estes organismos são de origem murina, de coelho ou humana. Mais preferivelmente, o organismo é de origem humana. As vacinas e compostos farmacêuticos descritos na presente invenção podem ser administrados em uma ou várias doses. Preferivelmente, a administração é realizada em uma dose única. A administração pode ser também realizada por rota subcutânea, intravenosa, intramuscular, oral, nasal ou sem agulha. Preferivelmente, é realizada por rota subcutânea ou intramuscular.

Em uma outra realização da presente invenção, são reivindicados os anticorpos monoclonais e policlonais de 20/10/2017, pág. 91/181

27/63 produzidos em resposta à imunização com proteínas quiméricas e seqüências de nucleotídeos descritas aqui. São também reivindicados os hibridomas desenvolvidos para a expressão e produção dos anticorpos descritos neste pedido. As utilizações destes anticorpos para propósitos preventivos, terapêuticos e outros, são reivindicadas. São também reivindicados os compostos farmacêuticos incluindo os anticorpos descritos aqui e suas utilizações.

Em uma outra realização da presente invenção, os conjugados protéicos formados entre as proteínas quiméricas descritas aqui e pelo menos um ligante são reivindicados. Em uma versão desta invenção, a ligação entre a proteína quimérica e o ligante é covalente. Nestes casos, a ligação é preferivelmente peptídica. Em uma outra realização desta invenção, a ligação entre a proteína quimérica e o ligante é não covalente. São também reivindicadas as utilizações destes conjugados protéicos.

Em uma outra realização da presente invenção, a estrutura quaternária típica das proteínas quiméricas descritas aqui é reivindicada.

Conforme utilizado aqui, o termo agente ativo é definido como: 1) DNA genômico, DNA cópia, RNA mensageiro ou segmento destes, que codificam para as proteínas quiméricas, ou segmentos destas, descritos no presente pedido e 2) as proteínas quiméricas, ou segmentos destas, descritas no presente pedido, 3) as combinações de 1) e 2) ou 4) os conjugados protéicos formados entre as proteínas quiméricas descritas aqui e outras entidades, segmentos destes.

de 20/10/2017, pág. 92/181

28/63

Conforme utilizado aqui, o termo quantidade efetiva é definido como uma quantidade suficiente para produzir um ou mais dos seguintes resultados: 1) indução de uma resposta imune apropriada, humoral ou celular, incluindo a produção de anticorpos contra o agente indutor; 2) inibição do crescimento, tamanho ou mobilidade da célula ou microrganismo associado com o agente indutor. Quando o agente indutor é um tumor, a quantidade efetiva será a quantidade suficiente para reduzir o tamanho, para prevenir o crescimento, para inibir metástase ou crescimento tumoral, ou para aliviar o desconforto provocado por tal tumor ou para prolongar a vida de um indivíduo sofrendo de tal tumor.

Conforme utilizado aqui, o termo mamífero é definido como um animal vertebrado de sangue quente cujos descendentes são alimentados com leite secretado por suas glândulas mamíferas. O termo mamífero inclui, mas não se limita a, ratos, camundongos, coelhos, cães, gatos, cabras, vacas, ovelhas, suínos, primatas e seres humanos.

Conforme utilizado aqui, o termo compostos farmacêutico ou vacina é definido como um diluente, adjuvante ou excipiente com o qual o agente ativo é administrado conjuntamente. Inclui qualquer solvente, meio de dispersão, soluções aquosas e gasosas, revestimentos, agentes anti-bacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos, retardadores ou catalisadores de absorção, ou substâncias semelhantes. A utilização de tais meios e agentes na administração de substâncias farmacêuticas ativas é conhecida na técnica. A utilização de tais meios convencionais com o agente ativo é indicada a não ser que o de 20/10/2017, pág. 93/181

29/63 agente ativo seja tornado ineficaz por tais meios. Princípios ativos suplementares podem ser também incorporados aos agentes ativos descritos na presente invenção. O termo compostos farmacêuticos ou vacinas inclui, mas não se limita a, solventes ou excipientes inertes, soluções aguosas estéreis e vários solventes orgânicos não tóxicos. Os compostos farmacêuticos ou vacinas não devem reagir com, nem de gualguer outra forma reduzir a eficácia ou estabilidade do agente ativo. Os veículos farmacêuticos aceitáveis incluem, mas não se limitam a, água, etanol, polietilenoglicol, óleo mineral, petróleo, propilenoglicol, lanolina, e agentes semelhantes. Os compostos farmacêuticos ou vacinas para utilização injetável incluem soluções aguosas estéreis (guando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação de dispersões ou soluções estéreis injetáveis. Em todos os casos, a formulação deve ser estéril e preferivelmente fluida de maneira a possibilitar sua aplicação através de uma seringa. Deve também ser estável nas condições de fabricação e armazenamento e deve ser protegida de efeitos contaminantes de microrganismos tais como bactérias e fungos.

Conforme utilizado agui, o termo utilização preventiva é definido como a capacidade em induzir e gerar uma resposta imune contra um ou mais antígenos, toxinas, domínios de proteínas ou outros agentes indutores, ou segmentos destes.

Conforme utilizado agui, o termo administração següencial significa gue: 1) o mesmo agente ativo é administrado em mais de uma ocasião em períodos de tempo de 20/10/2017, pág. 94/181

30/63 consecutivos ou 2) dois ou mais agentes ativos são administrados altemadamente em mais de uma ocasião em períodos de tempo consecutivos. Quando a administração é seqüencial, a diferença de tempo entre as administrações dos agentes ativos pode ser de minutos, horas, dias, semanas ou meses dependendo de ser a utilização é preventiva ou terapêutica e da natureza do organismos tratado.

Conforme utilizado aqui, o termo administração única ou simultânea significa que um ou mais agentes ativos são administrados na mesma ocasião de uma só vez.

Conforme utilizado aqui, o termo utilização terapêutica é definido como referindo-se a qualquer processo, aplicação, terapia ou ação semelhante, no qual um organismo superior, incluindo um ser humano, é submetido a cuidado médico com o objetivo de melhorar a condição de tal organismo ou resistência a doenças, seja diretamente ou indiretamente.

Exemplo 1

Construção do Gene Quimérico BLS-OMP31

Este exemplo descreve a estratégia utilizada para inserir a seqüência correspondendo aos aminoácidos 48 a 72 da seqüência de polipeptídeo da proteína OMP31 de Brucella melitensis no terminal amino 10 do decâmero que forma a lumazina sintase de Brucella spp.

1. Mutação e Clonagem

O plasmídeo pBLS-OMP31, SEQ ID No.: 9c, foi construído através do seguinte protocolo:

a) De maneira a clonar o gene que codifica para a lumazina sintase de Brucella spp. (BLS), a de 20/10/2017, pág. 95/181

31/63 seqüência BLS foi obtida por amplificação com PCR com iniciadores específicos do DNA genômico de B.

abortus e clonada no vetor pETlla (Novagen, EUA).

O plasmídeo pETll-BLS incluindo o quadro de leitura aberta da lumazina sintase de Brucella spp. foi digerido adicionalmente com as enzimas de restrição Bam HI e Xbal. A inserção obtida foi sub-clonada em um vetor pALter-Exl (Progen, EUA) .

b) Uma mutagênese direcionada foi realizada na seqüência que codifica para o quadro de leitura aberta da lumazina sintase de Brucella spp. (BLS) . Esta seqüência foi clonada em um vetor pALter-Exl (Promega, EUA) utilizando-se um kit ALTERED sitesll (Promega, EUA) . De maneira a se desenvolver o cassete, dois novos sítios de restrição foram inseridos na região 5' do gene BLS: um sítio Nsi nos primeiros dois códons da

extremidade 5' e	um sítio AFL II nos dois códons
compreendendo	os	resíduos	8 e 9 da	seqüência de
aminoácidos	nativa do	BLS.	Levou-se em
consideração	que	estes sítios de	restrição não
ocorrem nem	no	gene BLS	nativo	nem no vetor

pETlla. Ver Figura 1.

c) A mutação foi verificada posteriormente por seqüenciamento. O cassete incluindo a seqüência

BLS mutada (SEQ ID No.: lb) foi sub-clonado no vetor pETlla (Novagen, EUA) para se obter o plasmídeo chamado doravante de pBLSm.

de 20/10/2017, pág. 96/181

32/63

d) De maneira a inserir a seqüência correspondendo ao plasmídeo OMP31, foram desenhados dois oligonucleotídeos, de tal forma que formassem um DNA de fita dupla e incluíssem a seqüência de codificação para os aminoácidos 48-74 da proteína OMP31 de Brucella melitensis protegida pelas extremidades coesivas típicas das enzimas de restrição Nsil e Aftll quando do anelamento. A Figura 2 mostra os oligonucleotídeos desenhados para a construção do pBLS-OMP31 e a inserção sintética formada por estes.

e) O plasmídeo pBLSm foi digerido com as enzimas de restrição Nsil e Aftll. A seqüência de codificação correspondendo aos 8 primeiros resíduos do BLS foi removida. A seqüência BLS original foi alterada para a seqüência de nucleotídeos do peptídeo OMP31 inserido neste caso.

f) A inserção sintética da etapa d) acima foi ligada ao cassete pBLSm aberto obtido na etapa e) por incubação durante uma noite com a enzima DNA T4 ligase a 16²C. A inserção foi confirmada por seqüenciamento. Desta forma, um gene com a seqüência SEQ ID No.: 9b foi obtido. A análise de seqüenciamento mostrou que os primeiros 8 aminoácidos da lumazina sintase de Brucella spp. foram substituídos pelos 27 aminoácidos da seqüência 48-74 da proteína OPM31 de Brucella melitensis. Este quadro de leitura aberta foi chamado de quimera BLS-OMP31, de SEQ ID No.: 9b.

Petição 870170080222, de 20/10/2017, pág. 97/181

33/63 seu plasmídeo correspondente foi chamado de pBLSOMP31, de SEQ ID No.: 9c. Ver as Figuras 3b e c.

Este experimento foi repetido utilizando-se as seqüências de DNA das SEQ ID No. : 2b, SEQ ID No. : 3b, SEQ ID No.: 4b, SEQ ID No.: 5b, SEQ ID No.: 6b e SEQ ID No.: 7b de BLS mutadas. Resultados similares foram obtidos.

2. Transformação

Uma cepa competente da bactéria E. coli BL21 (DE3) foi transformada por choque térmico com o plasmídeo pBLSOPM31 obtido de acordo com o protocolo acima. Após isto, as bactérias foram cultivadas em placas de agar incluindo LB-agar/ampicilina para selecionar as transformadas com o plasmídeo. 2 ml de um meio LB/ampicilina foram inoculados para uma colônia extraída das placas de agar para testes de expressão de escala pequena. A colônia foi agitada e incubada a 37²C. A cultura saturada foi incubada com 2 μΐ de IPTG 1M. Três horas depois, 100 μΐ de cultura foram removidos e centrifugados. O pélete resultante foi resuspendido em 25 μΐ de tampão de amostra IX para sua análise por SDS-PAGE 17%. Ver Figura 4.

3. Expressão e Purificação da Proteína Quimérica BLS0MP31

Uma pré-cultura de 5 ml das cepas transformadas foi cultivada à saturação de acordo com a etapa acima com 500 ml de LB/ampicilina. A cultura foi incubada e agitada a 37²C. Foi incubada com 0,5 ml de IPTG (1M) para se alcançar uma densidade ótica de 0,6-0,8 a 600 nm. A cultura foi removida três horas mais tarde e foi centrifugada a 4000 g por 20 minutos. O pélete foi rede 20/10/2017, pág. 98/181

34/63 suspendido em 15 ml de solução em suspensão (Tris 50mM, EDTA 5mM, Triton X-100 1%, pH 8,0).

A suspensão foi sonicada a intervalos de 1 minuto a cada minuto por 5 minutos e foi centrifugada a 20000 g por 30 minutos. O pélete foi re-suspendido em 15 ml da solução em suspensão sem Triton X-100 e o processo de sonicação foi repetido. O procedimento foi repetido uma terceira vez. A quimera expressa no citoplasma estava contida em três sobrenadantes sonicados enquanto que os corpos de inclusão estavam contidos no pélete. Ver, Figura 5.

Os corpos de inclusão foram re-suspendidos em tampão PBS com uréia 8M e foram deixados por uma noite a temperatura ambiente. A re-suspensão foi dialisada contra PBS por dois dias com troca de tampão. A amostra foi centrifugada e o sobrenadante foi dialisado contra tampão A (50mM Tris/HCl, pH 8,5) . A primeira etapa de purificação foi realizada por cromatografia de troca aniônica em uma coluna MonoQ ou uma coluna Q-Sepharose (Pharmacia, EUA) em um equipamento FPLC (Pharmacia, EUA). A amostra foi injetada na coluna balanceada com tampão A e foi eluída por gradiente linear até 50% de tampão B (tampão A + NaCl 1M).

A segunda etapa de purificação foi realizada por cromatografia em coluna de exclusão molecular Superdex 200 (Amersham, UK) . Ver Figuras 6 e 7. Para isto, o pico da quimera foi concentrado em um tubo Centriprep (Millipore, EUA) e injetado na coluna para eluição com PBS. A presença da proteína quimérica nos picos foi avaliada por SDS-PAGE.

A construção do gene quimérico BLS-OMP31 foi realizada pela utilização de técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica. Ver Sambrook, et al., Molecular de 20/10/2017, pág. 99/181

35/63

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Exemplo 2

Estabilidade da Quimera BLS-OMP31

A primeira prova de que a proteína quimérica BLSOMP31 adotou um dobramento decamérico foi obtida através da técnica de dispersão luminosa. Este procedimento foi utilizado para calcular o tamanho molecular das proteínas em solução. De maneira a conduzir estes ensaios, uma coluna de exclusão molecular foi conectada a um detector de dispersão luminosa. Na medida em que a proteína é eluída da coluna seu peso molecular era determinado.

De acordo com este método, o peso molecular do BLS calculado foi de 163 kDa, enquanto que o da quimera BLSOMP31 foi de 215 kDa. Os pesos moleculares teóricos do BLS nativo e decâmeros BLS-OMP31 foram de 174,4 e 197,8 kDa, respectivamente. Levando-se em conta que este método tem precisão de 90%, este resultado sugere que a quimera BLSOMP31 forma um decâmero muito parecido com a proteína BLS nativa.

O dobramento das proteínas quiméricas foi estudado por dicroísmo circular. As determinações de dicroísmo circular foram realizadas no espectropolarímetro J-810 de 20/10/2017, pág. 100/181

36/63 dobraram estrutura confirmado que apropriadamente quiméricas com uma (Jasco, UK), ajustado para uma velocidade de leitura de 100 nm/minuto, um tempo de resposta de 4 s e uma largura de banda de 1 nm. Foram utilizadas bandejas de quartzo e 1, 2 ou 5 mm (Hellma). As amostras foram ensaiadas em tampão fosfato 50mM pH 7. A superposição dos espectros de dicroísmo circular da quimera BLS-OMP31 3 BLS nativo mostrou que o dobramento geral de ambas as proteínas era muito semelhante. Ver Figura 8. Desta forma, foi as proteínas como decâmeros, secundária comparável à da proteína nativa.

A seguir foi estudado se as substituições no terminal N das proteínas quiméricas afetaram suas estabilidades. Para este objetivo, a desnaturação induzida das quimeras por hidrocloreto de guanidina (Gdm-HCl) e temperatura foi estudada por dicroísmo circular.

A partir das curvas desnaturação-balanço, foi possível se obter vários parâmetros termodinâmicos, tais como a alteração da energia livre associada com o desdobramento. Com este parâmetro, a estabilidade conformacional típica de uma proteína foi avaliada. Ver Pace, et al., Methods Enzymol., 131: 266-80 (1986). De maneira a se obter a alteração na energia livre associada com o desdobramento de cada proteína, os dados da pesquisa foram ajustados para uma curva descritiva teórica. Este diagrama mostra a correlação da constante de equilíbrio entre os estágios dobrado e desdobrado da proteína quimérica e concentrações variáveis do agente desnaturante.

De maneira a conduzir estes experimentos, a mesma quantidade de proteína (0,1 μΜ do decâmero) foi incubada de 20/10/2017, pág. 101/181

37/63 com concentrações crescentes do agente desnaturante. As soluções para cada ponto da curva foram preparadas a partir de uma solução matriz de guanidina-HCl 6M (ICN, ultra pura), fosfato 50mM, pH 7. As amostras foram incubadas por três horas a temperatura ambiente e foram centrifugadas antes da determinação. As determinações do dicroísmo circular foram realizadas em bandejas de 5 mm a 25²C. A reversibilidade da desnaturação por guanidina da proteína BLS nativa e da proteína quimérica BLS-OMP31 foi, desta forma, demonstrada.

As curvas desnaturação-balanço foram ajustadas para um modelo de dissociação em duas etapas. De acordo com este modelo, o decâmero se separa primeiramente em dois pentâmeros iguais. Na segunda etapa da desnaturação, cada um destes pentâmeros se dissocia adicionalmente em cinco monômeros desdobrados. As fórmulas que descrevem estas transições foram derivadas a partir das já propostas para as proteínas monoméricas. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem., 279(9): 8093-8101 (2004).

Os valores termodinâmicos obtidos para o BLS nativo e a BLS-OMP31 mostram que a substituição da extremidade terminal N do BLS não afetou a estabilidade do decâmero.

Ver Figura 9. Desta forma, foi confirmado que as quimeras de BLS formam decâmeros apropriadamente dobrados e que sua estabilidade é semelhante à do BLS nativo.

Exemplo 3

Antigenicidade e Imunogenicidade da Quimera BLS-OMP31

A antigenicidade da BLS-OMP31 foi estudada determinando-se sua capacidade em se ligar a um anticorpo monoclonal específico contra o peptídeo inserido (anticorpo de 20/10/2017, pág. 102/181

38/63 monoclonal BI24).

69(11): 7020-28, et al., J. Clin. Este procedimento monoclonal A59/10F09/G10) e a um anticorpo monoclonal específico contra a proteína BLS nativa (anticorpo Ver Vizcaino, et al., Infect. Immun., (2001); Goldbaum,

Microbiol., 31: 2141-2145 (1993).

permite o ensaio da antigenicidade tanto da inserção quanto da proteína núcleo. A antigenicidade foi ensaiada por ELISA. Ver Figura 10.

A BLS-OMP31 foi identificada tanto pelo anticorpo monoclonal contra o BLS nativo quanto pelo anticorpo monoclonal contra o peptídeo inserido. O BLS nativo foi identificado apenas pelo primeiro anticorpo, como esperado. Este resultado indica que o peptídeo inserido preservou sua propriedade antigênica quando apresentado pela quimera. Adicionalmente, foi também mostrado que o dobramento da quimera não afetou a afinidade do anticorpo anti-BLS para a proteína núcleo. Ambos os anticorpos detectaram até 20 ng de quimera por poço.

Desta forma, a capacidade da BLS-OMP31 em induzir uma resposta imune humoral específica contra o peptídeo inserido foi avaliada. Esta capacidade foi analisada em camundongos com e sem o auxílio de adjuvantes. O experimento foi realizado com dois grupos de cinco camundongos cada. O grupo AF recebeu três doses, por rota intraperitoneal, de 25 gg de proteína em emulsão com um adjuvante de Freund em intervalos de 0, 20 e 40 dias. A primeira dose foi administrada com um adjuvante de Freund completo. As doses remanescentes foram administradas com um adjuvante de Freund incompleto. O grupo PBS teve o mesmo tratamento, no entanto a proteína quimérica foi de 20/10/2017, pág. 103/181

39/63 injetada sem adjuvante. O sangue foi retirado 7 dias após a terceira imunização e foi ensaiada por ELISA a reatividade dos soros contra a proteína de membrana do OMP31. Ver Figura 11.

Um forte resposta contra OMP31 foi encontrada nos camundongos imunizados com a quimera e adjuvante. A resposta sorológica obtida a partir dos camundongos imunizados com a proteína quimérica com e sem adjuvante foi também relevante. Estes resultados mostram que os camundongos imunizados com a quimera BLS-OMP31 com ou sem adjuvante apresentam respostas imunes específicas contra o peptídeo inserido.

Um coelho foi injetado com a quimera BLS-OMP31 com adjuvante de acordo com a seguinte protocolo:

Primeira dose, dia 0: 200 gg de BLS-OMP31 em 1 ml de PBS + 1 ml de adjuvante de Freund completo, por injeção intramuscular.

Segunda dose, dia 22: 200 gg de BLS-OMP31 em 1 ml de PBS + 1 ml de adjuvante de Freund incompleto (IFA) , por injeção subcutânea.

Terceira dose, dia 45: 200 gg de BLS-OMP31 em 1 ml de PBS + 1 ml de IFA, por injeção intramuscular.

Quarta dose, dia 55: 200 gg de BLS-OMP31 em 1 ml de PBS + 1 ml de adjuvante de IFA, por injeção subcutânea.

Foram coletadas amostras de sangue nos dias 31, 52 e 180. As amostras foram centrifugadas e o soro foi congelado.

Os anti-soros coletados após as 2^â, 3^â e 4^â doses do antígeno foram titulados por ELISA contra a proteína de membrana de OMP31. Ver Figura 12. O título dos anti-soros de 20/10/2017, pág. 104/181

40/63 ensaiados foi de 3.200, 12.800 e 25.600 para os soros correspondendo às 2^â, 3^â e 4^â doses, respectivamente. A linha de base foi definida como a diluição máxima capaz de identificar o antígeno em relação ao soro negativo. O coelho imunizado mostrou uma forte resposta imune específica contra ο OMP31. Uma vez que o soro anti BLS nativo não identificou ο OMP31, esta alta reatividade era devida a uma resposta dos anticorpos específicos contra o peptídeo inserido na quimera. Ver Figura 13, controle negativo.

A proteína OMP31 utilizada nos ensaios ELISA foi produzida de forma recombinante em E. coli. Uma vez que esta molécula é uma proteína de membrana, não pôde ser mantida em uma solução aquosa e foi, desta forma, obtida sob condições de desnaturação. Nos ensaios realizados, não foi demonstrado que os anti-soros eram capazes de identificar a quimera de OMP31 em sua conformação nativa como uma proteína de membrana bacteriana. Esta propriedade é importante para se avaliar a efetividade potencial da quimera como um imunógeno capaz de prover imunidade humoral contra Brucella. De maneira a se acessar esta propriedade, ensaios ELISA foram realizados utilizando-se uma cepa lisa e uma rugosa de B. melitensis H38, como antígenos. Ver Figura 13. A reatividade de um soro contra a bactéria total é difícil de avaliar em geral devido à complexidade do antígeno utilizado. Entretanto, o ensaio mostrou que o soro anti BLS-OMP31 identificou especificamente a inserção de OMP31 na membrana da cepa rugosa. A reatividade deste soro contra a cepa lisa não foi diferente da mostrada pelo soro anti BLS nativo. Este resultado é completamente de 20/10/2017, pág. 105/181

41/63 consistente com os dados publicados para o anticorpo monoclonal A59/10F09/G10. Ver Vizcaino, et al., supra.

Este anticorpo, específico para a inserção incluída na quimera BLS-OMP31, apresenta uma forte reatividade com a cepa rugosa, mas não com a cepa lisa de B. melitensis H38.

Exemplo 4

Vacina de DNA de BLS-OMP31

A seqüência de codificação para a BLS-OMP31 foi subclonada no vetor pCI-neo (Promega, EUA), incluindo os sítios de restrição nas extremidades 5' (enquadradas) dos iniciadores e a seqüência consenso de Kozak (sublinhada). Assim, foram construídos os seguintes oligonucleotídeos:

BLS-OMP31 senso: (SEQ ID NO:35)

5'TAAGAA GAATCC ACCACCATG CAT ACC GCC GGT TA 3'.

BLS-OMP31 anti-senso: (SEQ ID NO:36)

5'TGT CCA CCA GTC AT GCTAGCT CAG ACA AGC GCG ATG C

Tal seqüência foi amplificada por PCR utilizando-se o plasmídeo pET-BLS-OMP31 como molde. O produto PCR e o vetor foram digeridos com as correspondentes enzimas de restrição e então foi realizada uma reação de ligação. A construção obtida foi verificada por seqüenciamento. O plasmídeo pCI-BLS-OMP31 foi amplificado em células de E. coli JM109 e adicionalmente purificado por colunas mega prep (Quiagen, UK) . A pureza do DNA e concentração foram acessadas por espectrofotometria a 260/280nm. A preparação de plasmídeo continha menos de 0,05 unidades de endotoxina por 100 gg de DNA, determinado por um kit de limulus amebocyte lysate (Sigma, EUA).

de 20/10/2017, pág. 106/181

42/63

Grupos de camundongos Balb/c foram inoculados com 100 gg do plasmídeo pCI-BLS-OMP31 e plasmídeo de controle sem inserção (pCI) em solução fisiológica por rotas intramuscular (im) e intradérmica (id) nas semanas 0, 2, 4 e 6. O sangue dos animais foi extraído por rota retroorbital nos dias 0, 15, 30, 45, 60 e 75 após a primeira imunização. Os soros foram mantidos a -20²C para a detecção de anticorpos específicos.

A resposta humoral anti-OMP31 induzida pela imunização com a vacina de DNA de BLS-OMP31 (pCI-BLS-OMP31) foi analisada por ELISA indireta utilizando-se a proteína OMP31 recombinante como antígeno. Após a imunização, todos os animais desenvolveram uma resposta imune humoral. Um alto nível do isotipo IgG produzido especificamente contra a proteína OMP31 foi observado. Ver Figura 14.

A preparação, amplificação, purificação e utilização do plasmídeo pCI-BLS-OMP31 como uma vacina de DNA foram realizadas utilizando-se técnicas de biologia molecular e métodos para a preparação e administração de compostos farmacêuticos conhecidos na técnica. Ver Schleef, M., Ed., Plasmids for Therapy and Vaccination, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, Alemanha, 2001.

Exemplo 5

Quimeras Mistas de BLS

O fato da lumazina sintase de Brucella spp. se dissociar de forma reversível quando tratada com altas concentrações de cloreto de guanidina foi utilizado para a construção de quimeras mistas. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem. 279(9): 8093-8101. Duas quimeras com diferenças remarcáveis quanto ao tamanho de suas inserções de 20/10/2017, pág. 107/181

43/63 e pontos isoelétricos foram construídas. Esta estratégia foi seguida de maneira a se distinguir mais facilmente os decâmeros formados pelas guimeras mistas.

Para este objetivo, o peptídeo KETcl mostrado na Figura 15 foi utilizado em adição ao peptídeo OMP31 já descrito. O peptídeo KETcl deriva de uma proteína de Tênia solium e foi descrito como sendo altamente protetor contra neurocisticercose de murino e suíno. Ver Huerta, et al., Vaccine 20: 62-266 (2001); Toledo, et al., Infect. Immun.,

69: 1766-1773 (2001) .

A proteína guimérica BLS-KETcl foi obtida de acordo com o protocolo a seguir:

1. Clonagem

a) O plasmídeo pBLS-OMP31 foi digerido com as enzimas de restrição Nsil e AflII para remover a següência de codificação correspondente aos 27 aminoácidos da següência 48-74 da proteína OMP31. A següência de codificação da proteína OMP31 foi extraída.

b) A següência de codificação para os 14 aminoácidos do peptídeo KETcl foi ligada ao cassete aberto em a) por incubação durante a noite do cassete aberto do plasmídeo pBLS-OMP31^_OMP31 com a enzima DNA T4 ligase a 16²C. O guadro de leitura do BLS-KETcl foi assim obtido. A inserção foi confirmada pelo següenciamento do guadro de leitura. O guadro de leitura foi chamado de guimera BLS-KETcl, de SEQ ID No.: 10b, e o plasmídeo de expressão, pBLS-KETcl.

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44/63

Este procedimento pode também ser realizado seguindose o protocolo indicado na etapa 1) do Exemplo 1, por meio da divagem do cassete BLSm (SEQ ID No.: lb) com as enzimas de restrição Nsi e Afll e sua ligação posterior com a inserção KETcl. Desta forma, o quadro de leitura do BLSKETcl e o plasmídeo pBLS-KETcl foram também obtidos.

Este experimento foi repetido utilizando-se as seqüências de DNA SEQ ID No.: 2b, SEQ ID No.: 3b, SEQ ID No.: 4b, SEQ ID No.: 5b, SEQ ID No.: 6b e SEQ ID No.: 7b do

BLS mutado. Resultados semelhantes foram obtidos.

2. Transformação

Uma cepa competente da bactéria E. coli BL21 (DE3) foi transformada com o plasmídeo pBLS-KETcl obtido de acordo com o protocolo acima. Posteriormente, as bactérias foram cultivadas em placas de agar incluindo LBagar/ampicilina para se selecionar as transformadas com o plasmídeo.

3. Expressão e Purificação da Proteína Quimérica BLSKETcl ml de um meio LB/ampicilina foi inoculado a uma colônia extraída de placas de agar para testes em pequena escala. A colônia foi agitada e incubada a 37 ²C. A cultura saturada foi induzida com 2 μΐ de IPTG 1M. Três horas depois, foram removidos 100 μΐ de cultura e centrifugados. O pélete resultante foi re-suspenso em 25 μΐ de tampão de amostra IX para sua análise por SDS-PAGE

17%.

Uma pré-cultura de 5 ml das cepas transformadas foi cultivada à saturação de acordo com a etapa acima com 500 ml de LB/ampicilina. A cultura foi incubada e agitada a de 20/10/2017, pág. 109/181

45/63 ²C. Foi induzida com 0,5 ml de IPTG 1M para se obter uma densidade ótica de 0,6-0,8 a 600 nm. A cultura foi removida três horas mais tarde e foi centrifugada a 4000 g por 20 minutos. O pélete foi re-suspenso em 15 ml de solução em suspensão (Tris 50mM, EDTA 5mM, Triton X-100 1%, pH 8,0).

A suspensão foi sonicada a intervalos de 1 minutos a cada minuto por 5 minutos e foi centrifugada a 20000 g por 30 minutos. O pélete foi re-suspenso em 15 ml de solução em suspensão sem Triton X-100 e o processo de sonicação foi repetido. O procedimento foi repetido uma terceira vez. A quimera expressa no citoplasma estava contida em três sobrenadantes sonicados, enquanto que os corpos de inclusão

estavam	contidos	no	pélete.
Os	corpos	de	inclusão
PBS com	uréia	8M	e foram

foram deixados durante a noite a temperatura ambiente. A re-suspensão foi dialisada contra PBS por dois dias com troca de tampão. A amostra foi centrifugada e o sobrenadante foi dialisado contra o tampão A (50mM Tris/HCl, pH 8,5). A primeira etapa de purificação foi realizada por cromatografia de troca aniônica em uma coluna MonoQ ou coluna Q-Sepharose (Pharmacia, EUA) em um equipamento FPLC (Pharmacia, EUA) . A amostra foi injetada na coluna balanceada com tampão A e foi eluída por gradiente linear até 50% de tampão B (tampão A + NaCI 1M).

A segunda etapa de purificação foi realizada por cromatografia em uma coluna de exclusão molecular Superdex

200 (Amersham, UK) . Para isto, o pico de quimera foi concentrado em um tubo Centriprep (Millipore, EUA) e de 20/10/2017, pág. 110/181

46/63 injetado na coluna para eluição com PBS. A presença da proteína quimérica nos picos foi avaliada por SDS-PAGE.

A construção do gene quimérico BLS-KETcl foi realizada utilizando-se técnicas de biologia molecular conhecidas. Ver Sambrook, et al., supra·, Brown, supra·, Watson, et al., supra·, Davis et al., supra, Alberts, et al., supra.

As quimeras BLS-OMP31 e BLS-KETcl foram desdobradas em cloreto de guanidina 2M, misturadas em concentrações equimolares e re-associadas por meio de diálise. Pela adição de guanidina 2M, os decâmeros foram separados, gerando pentâmeros que preservaram suas estruturas secundárias. Quando a guanidina foi removida pela diálise, os pentâmeros foram re-associados formando decâmeros novamente. Ver Zylberman, et al., J. Biol. Chem., 279(9): 8093-8101 (2004) . Desta maneira, uma mistura de quimeras de BLS foi produzida. Ver Figura 16.

O produto da re-associação foi purificado por cromatografia de troca aniônica em uma coluna de troca aniônica MonoQ (Amersham, UK) . Os resultados foram comparados com o perfil de eluição de cada quimera em separado (uma amostra sem dissociação) de acordo com o protocolo a seguir: a quimera BLS-KETcl foi eluída a 16,8% de tampão B (esta partícula foi estimada como a mais básica em vista do ponto isoelétrico teórico da inserção) e a quimera BLS-OMP31 foi eluída a 35,8% do mesmo tampão. A amostra re-associada foi separada produzindo três diferentes picos, o segundo e maior pico correspondia à quimera mista e o último pico correspondia à quimera BLSOMP31 pura. Ver Figura 17 A.

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47/63

A amostra correspondendo ao segundo pico foi analisada por SDS-PAGE e PAGE nativo. Os resultados demonstraram gue a amostra correspondia a uma guimera mista formada pelo peptídeo KETcl apresentado no terminal amino cinco de um pentâmero e pelo peptídeo OMP31 apresentado no terminal amino 5 do outro pentâmero. Ver Figuras 17 BI e

B2 .

O resultado mostrou gue a estratégia proposta para separação, mistura e re-associação das proteínas modificadas foi efetiva para produzir uma guimera mista onde cinco cópias de dois peptídeos diferentes foram apresentadas pela estrutura decamérica do BLS. Ver Figura

16. As misturas podem apresentar características diferentes dependendo da natureza das inserções (por exemplo, uma inserção pode ser direcionada para um tráfico celular específico enguanto gue a outra pode induzir uma resposta imune particular).

Exemplo 6

Imunização com Quimeras Mistas de BLS

As guimeras mistas BLS-OMP31-KETcl foram administradas com adjuvantes a camundongos para se avaliar sua capacidade em induzir uma resposta imune humoral específica. 0 experimento foi realizado com um grupo de cinco camundongos. 0 grupo recebeu três doses de 25 pg de proteína em emulsão com um adjuvante de Freund por rota intraperitoneal nos dias 0, 20 e 40. A primeira dose foi aplicada com adjuvante completo. As segunda e terceira doses foram aplicadas com adjuvante incompleto. Sangue foi coletado 7 dias após a terceira imunização e a reatividade de 20/10/2017, pág. 112/181

48/63 dos soros foi ensaiada contra os peptídeos sintéticos OMP31 e KETcl por ELISA. Ver Figura 18.

Uma forte resposta contra ambos os peptídeos foi obtida em camundongos imunizados com as quimeras mistas com adjuvante. Isto demonstrou que os camundongos imunizados com as quimeras mistas BLS-OMP31-KETcl desenvolveram simultaneamente uma resposta imune contra ambas as inserções.

Exemplo 7

Resposta Imune Celular Contra Quimeras de BLS

Grupos de cinco camundongos Balb/c foram imunizados com 50 pg/camundongo da quimera BLS-KETcl emulsificada em saponina e com 10 pg/camundongo do peptídeo sintético KETcl emulsificado em saponina para se acessar a resposta imune celular específica induzida pela quimera BLS-KETcl contra o peptídeo inserido. Os camundongos foram imunizados duas vezes em um intervalo de 10 dias por rota subcutânea.

Os baços de ambos os grupos foram removidos assepticamente três dias após a última imunização. As células de baço foram re-suspensas em um meio de cultura RPMI 1640 Gibco (InVitrogen Corp., EUA), suplementado com L-glutamina (0,2 mM), 2-mercaptoetanol (0,05 mM) , aminoácidos não essenciais (0,01 mM), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 pg/ml) e soro bovino fetal 10% (FBS) . Em um meio de cultura, o peptídeo KETcl ou a quimera BLS-KETcl (10 pg/ml) foram adicionados a diferentes culturas celulares. As células foram suspensas em microplacas de cultura de fundo plano a uma concentração de 2 χ 10⁵ células por 200 pl de volume final. Foram mantidas em um meio de CO2 5% umedecido a 37²C.

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49/63

Após 72 horas, 1 pCi de [metil-³H] timidina (Amersham Biosciences, UK) foi adicionado a cada cultura. As células foram semeadas e o nível de incorporação de timidina titulado foi determinado em um contador de cintilação líquida 1205 Betaplate™ (Wallac Oy, FI) . Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

O ensaio mostrou que as células de baço de camundongos imunizados com a quimera BLS-KETcl proliferaram em culturas tanto do peptídeo quanto da quimera. Este resultado indicou claramente que a quimera BLS-KETcl era capaz de induzir uma resposta imune celular específica contra o peptídeo KETcl inserido em BLS. Ver Figura 19.

Exemplo 8

Multi-apresentação dos Domínios Protéicos por Quimeras de BLS

O BLS pode ser modificado para apresentar não apenas peptídeos, mas também domínios protéicos completos em seu terminal amino 10. De maneira a se demonstrar este uso alternativo, foi construída uma quimera BLS-RBD3 pela ligação da seqüência de codificação de BLS modificada e da seqüência de codificação do domínio protéico RBD3 da proteína de murino Staufen-1. Ver Figuras 20 e 21.

A proteína quimérica BLS-KETcl foi obtida de acordo com o protocolo a seguir:

1. Clonagem

a) O plasmídeo pBLS-OMP31 foi digerido com as enzimas de restrição Nsil e AflII para a remoção da seqüência de codificação correspondente aos 27 aminoácidos da seqüência 48-74 da proteína de 20/10/2017, pág. 114/181

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ΟΜΡ31. A seqüência de codificação da proteína

OMP31 foi extraída.

b) A seqüência de codificação para os 75 aminoácidos do domínio de RBD3 da proteína de murino Staufen foi ligada ao cassete aberto em a) por incubação por uma noite do cassete aberto do plasmídeo pBLS-OMP31^_OMP31 com a enzima DNA T4 ligase a 16²C. O quadro de leitura do BLS-RBD3 assim foi obtido. A inserção foi confirmada pelo seqüenciamento do quadro de leitura. Este quadro de leitura foi chamado de quimera BLS-RBD3, da SEQ ID No.: 11b, e o plasmídeo de expressão, de pBLS-RBD3.

Este procedimento pode ser também realizado seguindose o protocolo indicado na etapa 1) do Exemplo 1 por meio da divagem do cassete BLSm (SEQ ID No.: lb) com as enzimas de restrição Nsi e Afll e sua ligação posterior com a inserção RBD3. Desta forma, o quadro de leitura do BLSRBD3 e o plasmídeo pBLS-RBD3 são também obtidos.

Este experimento foi repetido utilizando-se as seqüências de DNA das SEQ ID No. : 2b, SEQ ID No. : 3b, SEQ ID No.: 4b, SEQ ID No.: 5b, SEQ ID No.: 6b e SEQ ID No.: 7b de BLS mutado. Resultados semelhantes foram obtidos.

2. Transformação

0 plasmídeo pBLS-RBD3	obtido de	acordo com o
protocolo acima	foi inserido	em bactérias	E.	coli BL21
(DE3) por	transformação	por choque	térmico.
Posteriormente,	as bactérias	foram semeadas	em	um meio LB
na presença de	ampicilina.	A expressão	do	gene foi

induzida com IPTG lmM por 4 horas a 28²C.

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3. Expressão e Purificação da Proteína Quimérica BLSRD3

A proteína foi expressa em corpos de inclusão, lavadas com soluções de uréia 4 e 6 M e solubilizadas em um tampão Tris/HCl 50mM, uréia 8M, EDTA 5mM, β-ΜΕ 5mM, PMSF lmM, pH 8 por agitação magnética por 16 horas a 4²C. A proteína solubilizada foi purificada sob condições de desnaturação em uma coluna de troca iônica Q-Sepharose aplicando-se um gradiente linear entre 0 e 1M de NaCl em um tampão Tris/HCl 50mM, uréia 8M, pH 8,5. A proteína eluída foi desdobrada por diálise contra o tampão PBS e purificada por uma coluna Hyper D de heparina. Para eluição, foi utilizado um tampão Tris/HCl 50mM, NaCl 1,2 M, pH 8.

A Figura 22 mostra as análises SDS-PAGE, de dicroísmo circular e de dispersão luminosa da quimera BLS-RBD3 obtida pelo método descrito acima.

A análise SDS-PAGE mostra um alto grau de pureza da quimera BLS-RBD3 obtida. A pequena anomalia observada na mobilidade eletroforética é atribuída à alta densidade da carga positiva do domínio RBD3. A similaridade do espectro de dicroísmo circular da BLS-RBD3 com seu espectro teórico, calculado pela combinação dos espectros do BLS e do domínio RBD3 da proteína de murino Staufen-1, indicou que a quimera estava dobrada convenientemente. O peso molecular da quimera (257 kDa), calculado a partir de sua corrida na coluna de filtro molecular conectada em série com um detector de dispersão luminosa e um detector de índice de refração, indicou que a quimera BLS-RBD3 apresentava uma estrutura decamérica.

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A construção do gene quimérico de BLS-RBD3 foi realizada utilizando-se técnicas de biologia molecular bem conhecidas. Ver Sambrook, et al., supra·, Brown, supra·,

Watson, et al., supra·, Davis et al., supra, Alberts, et al., supra.

Exemplo 9

Produção de Anticorpos de Espectro Amplo Por Imunização Com As Quimeras de BLS

A quimera BLS-Staufen foi utilizada como imunógeno para se obter anticorpos contra o domínio RBD3 de Staufen. Cindo camundongos Balb/c foram inoculados com 80 gg da quimera BLS-RBD3 em um tampão de 2 0 μΐ de HCI 50mM, NaCl 1,2 M, fosfato 50mM, pH 8 sem adjuvante, duas vezes em um intervalo de 14 dias por rota intraperitoneal. Como controle, 5 camundongos da mesma cepa foram imunizados com uma mistura de proteínas BLS e o domínio RBD3 de Staufen, na mesma massa incluindo a quimera. Os camundongos foram sangrados por punção retroorbital quinze dias após a última imunização. Foi preparado um soro por centrifugação a 1000 xg por 10 minutos. A reatividade dos soros contra RBD3 foi ensaiada por ELISA em uma placa de 96 poços com a proteína de fusão glutadiona S-transferase-RBD3 (GST-RBD3). Antiimunoglobulina de camundongo conjugada com peroxidase de caprino (DakoCytomatin, EUA) foi utilizada como um anticorpo secundário. A reação foi desenvolvida com ortofenildiamina (OPD) e foi interrompida com ácido sulfúrico 4N. A densidade ótica foi determinada por uma leitora ELISA a 492 nm.

A Figura 23 mostra um exemplo representativo da resposta imune humoral desenvolvida por ambos os grupos.

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Conforme observado, a imunização com a quimera BLS-RBD3 provocou uma forte resposta de anticorpo anti-RBD3. Nenhuma reatividade foi observada contra o peptídeo em camundongos com a mistura BLS e RBD3.

Exemplo 10

Produção de Anticorpos Monoclonais por Imunização com as Quimeras de BLS

A capacidade em gerar anticorpos monoclonais específicos contra o peptídeo OMP31 foi acessada a partir de esplenócitos de camundongos imunizados com a quimera BLS-OMP31. 0 experimento foi realizado com um grupo de cinco camundongos. 0 grupo recebeu três doses, por rota intraperitoneal, de 25 gg de proteína em emulsão com o meio com adjuvante de Freund a intervalos de 0, 20 e 40 dias.

NO dia 60, 25 gg de BLS-OMP31 dissolvidos em PBS foram inoculados por rota peritoneal no camundongo que mostrou uma melhor resposta contra o peptídeo OMP31. O baço deste camundongo foi removido e os esplenócitos foram reunidos com as células de mieloma NSO. Os hibridomas resultantes foram selecionados em um meio HAT e os sobrenadantes de suas culturas foram ensaiados para se determinar a reatividade contra o peptídeo OMP31 por ELISA. O hibridoma que mostrou a maior reatividade foi clonado por diluição limite. A Figura 24 mostra a reatividade do AcMo 37F7 contra o peptídeo OMP31 e a proteína OMP31 total. Uma forte resposta contra ambos foi obtida. Isto demonstra que os camundongos imunizados com a quimera BLS-OMP31 desenvolveram uma reposta imune específica contra o peptídeo inserido. Este experimento mostra também que de 20/10/2017, pág. 118/181

54/63 anticorpos monoclonais específicos podem ser produzidos utilizando-se as quimeras de BLS.

Exemplo 11

Utilização das Quimeras de BLS como Biossensores

Biossensores permitem a detecção de uma interação específica entre macromoléculas, que é visualizada pelo aumento de um sinal proporcional ao acúmulo de massa em uma superfície reativa. A proteína BLS-OMP31 modificada foi utilizada para se estudar a aplicação das quimeras de BLS como um peptídeo e veículo de domínio protéico para o desenvolvimento de biossensores. Para este objetivo, a reação entre a BLS-OMP31 e o AcMo 37F7 descrita no exemplo anterior foi adicionalmente analisada.

A quimera BLS-OMP31 foi utilizada para derivatizar uma placa de dextrano-carboximetil (Iasys, Affinity Sensors, Thermo, EUA) . Para este propósito, uma solução incluindo 80 gg/ml de BLS-OMP31, em um tampão de acetato de sódio lOmM pH 5,5, foi incubada em uma placa previamente derivatizada pelo reagente EDC/NHS. Após a imobilização de um sinal correspondendo a 800 arc seg (igual a 5 ng de antígeno), a superfície reativa foi bloqueada com dietilamina. Após a derivatização, a reatividade do AcMo

37F7 anti-OMP31 foi estudada, p	ara	o que	50	μΐ de
sobrenadante de cultura	foram	incubados	na	placa
previamente ativada.
Conforme observado na	Figura	25,	o AcMo	37F7	reagiu

fortemente, provendo um sinal de aproximadamente 300 arc seg. Na fase de separação, o tampão PBS + Tween foi lavado e adicionado, observando uma gota no sinal correspondendo à separação do AcMo da fase sólida. Este exemplo mostra de 20/10/2017, pág. 119/181

55/63 claramente que a quimera é capaz de detectar anticorpos direcionados contra o peptídeo no biossensor.

Exemplo 12

Ativação de Células Dendríticas por BLS

A capacidade do BLS em ativar células dendríticas foi analisada. Para este objetivo, os níveis de ativação de diferentes marcadores foram estudados nestas células, 18 horas após a incubação com BLS. Células de medula de camundongos Balb/c foram cultivadas em placas de Petri com um meio RPMI com L-glutamina 2mM, 100 U/ml de penicilina, 100 gg/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50μΜ e soro bovino fetal 10% (meio R10), suplementado com fator de estímulo de colônia de granulócitos e macrófagos de camundongo (mGM-CSF) em um incubador com um ambiente de CO2 5% a 37²C. O meio de cultura foi substituído nos dias 3, 6 e 8. No dia 9, as células não aderidas foram tomadas e centrifugadas a 300 xg por 8 minutos. As células foram então incubadas a uma concentração de 2 x 10⁶ células/ml em um volume final de 1 ml com BLS (1, 5 ou 10μΜ) ou sem BLS em meio R10 por 18 horas (n = 4). Posteriormente, 4 x 10⁵ células por 200 μΐ de volume final foram centrifugadas e incubadas com os seguintes anticorpos monoclonais (Pharmigen) conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC): anti-CD40, anti-CD80, anti I-A^d ou anti-CD86, e com o anticorpo monoclonal anti-CDllc conjugado com ficoeritrina (PE) . Três lavagens foram realizadas e as células foram extraídas com um citômetro FACScan (Becton Dickinson, EUA) . Os dados obtidos foram analisados com o programa CellQuest (Becton Dickinson, EUA).

de 20/10/2017, pág. 120/181

56/63

Nas células incubadas com BLS, dentro da subpopulação de CDllc⁺ (75-80%), foram observados aumentos significativos nas percentagens e fluorescência média das células expressando CD40, CD80,l-A^d e CD86. O experimento foi realizado três vezes, obtendo-se resultados similares. A Figura 26 mostra histogramas representativos da expressão de CD40 (A) e do I-A^d (B) em células CDllc⁺ tratadas com ou sem BLS.

Uma ativação semelhante por BLS foi observada em células dendríticas de camundongos C3H/HeJ (não responsivos a LPS) ou quando da pré-incubação da proteína BLS com polimixina B, de maneira a se eliminar LPS de E. coli.

Estes resultados demonstram que o BLS é capaz de ativar células dendríticas.

Exemplo 13

Produção de Montagens Moleculares com Domínios Protéicos Através de Peptídeos Adaptadores Ligados às Quimeras de BLS

A proteína BLS pode ser modificada em seu terminal amino para apresentar domínios protéicos inteiros. Isto pode ser alcançado pela formação de montagens moleculares. Nestes conjuntos, peptídeos heterodiméricos complementares são incorporados na proteína BLS modificada e no alvo. Posteriormente, a alta afinidade entre os heterodímeros liga a molécula alvo e a proteína BLS modificada. A utilização de heterodímeros de alta afinidade é útil para evitar afetar o dobramento apropriado da proteína carreadora. De maneira a demonstrar esta aplicação das quimeras de BLS, foram utilizados dois peptídeos de heterodimerização conhecidos na técnica RR12EE345L e EE12RR345L, . Ver Moll, et al., M. Protein Sei., 10: 649-655 de 20/10/2017, pág. 121/181

57/63 (2001). Ver Figura 27. Esta estratégia permite a construção de montagens moleculares, incluindo dez cópias do domínio combinadas com a BLS. A montagem foi realizada in vitro, o que possibilitou o controle da estequiometria do processo. Este sistema possibilita também a expressão de antígeno em um sistema recombinante diferente de BLS. Ver Figura 28.

1. Construção da Proteína de Fusão BLS-RR12EE345L

O peptídeo RR12EE345L foi clonado na extremidade terminal N do BLS. Ver Figuras 2 8 e 29. O resíduo K49 localizado na região de ligação do BLS e RR12EE345L foi substituído por serina. O gene quimérico BLS-RR12EE345L foi clonado no vetor pETlla. Uma cepa competente de bactérias E. coli BL21 (DE3) foi transformada com o vetor resultante. Posteriormente, as bactérias foram cultivadas em um meio de cultura LB-agar/ampicilina. A expressão do gene foi induzida com IPTG 1M por 16 horas a 37 ²C. A proteína foi expressa nos corpos de inclusão.

Os corpos de inclusão foram lavados com um tampão Tris/HCL 50mM, EDTA 5mM, β-ΜΕ 5mM, PMSF lmM, pH 8. A proteína dissolvida foi tratada com um tampão Tris/HCl 50mM, uréia 8M, EDTA 5mM, β-ΜΕ 5mM, PMSF lmM, pH 8 e agitada magneticamente por 16 horas a 4²C. A quimera resultante BLS-RR12EE345L foi purificada sob condições de desnaturação por cromatografia de troca aniônica em uma coluna Q-Sepharose (Pharmacia, EUA) . A amostra foi eluída utilizando-se um tampão de Tris/HCl 50mM, 8 M uréia, pH 8,5 sob um gradiente linear de NaCl 0 a 1M. A proteína de fusão obtida foi ensaiada por análises SDS-PAGE e de dispersão luminosa. Ver Figuras 30 e 31.

de 20/10/2017, pág. 122/181

58/63

A análise SDS-PAGE mostrou que a proteína de fusão BLS-RR12EE345L apresentava um alto nível de pureza. 0 peso molecular da proteína, conforme determinado pela técnica de dispersão luminosa, foi de 224 kDa. Adicionalmente, a proteína mostrou um sinal de CD de alta qualidade no espectro UV remoto. Estes resultados sugerem que a proteína de fusão é dobrada convenientemente e observa a estrutura decamérica semelhante à da proteína BLS nativa quando na presença de uréia 8M. A estrutura do BLS é distorcida à temperatura ambiente quando a concentração de uréia é reduzida. Isto de deve provavelmente à ligação do RR12EE345L em si.

2. Construção do Peptídeo EE12RR345L

O peptídeo EE12RR345L foi clonado na extremidade terminal C da proteína glutadiona S-transferase (GST). Este peptídeo é complementar ao peptídeo RR12EE345L apresentado pela proteína de fusão BLS. Ver Figura 32.

O gene do peptídeo EE12RR345L foi clonado no vetor pGEX-4Tl. Uma cepa competente de bactérias E. coli BL21 (DE3) foi transformada com o vetor resultante. Posteriormente, as bactérias foram cultivadas em um meio de cultura LB-agar/ampicilina a 37²C. A expressão do gene foi induzida por IPTG lmM por 16 horas a 37²C. As bactérias foram então sonicadas.

O peptídeo EE12RR345L resultante foi purificado como uma proteína de fusão GST utilizando-se uma matriz de glutadiona/agarose. O complexo acoplado foi colocado em uma coluna e foi lavado com tampão Tris 50mM, pH 8 até que o peptídeo estivesse ausente do eluente. Posteriormente, a matriz foi incubada com trombina por 16 horas a temperatura de 20/10/2017, pág. 123/181

59/63 ambiente para clivar o EE12RR345L da proteína de fusão GST. O peptídeo foi então eluído com um tampão Tris 50mM, pH 8 para purificá-lo adicionalmente. O peptídeo EE12RR345L resultante apresentou um alto nível de pureza.

3. Formação de Montagem Molecular entre A Proteína de Fusão BLS-RR12EE345L e o Peptídeo EE12RR345L

Uma parte da proteína de fusão BLS-RR12EE345L foi préincubada com uréia 8M, Tris 50 mM, NaCI 0,5 M, pH 8 por 15 minutos at 30 ²C. Quatro partes do peptídeo EE12RR345L foram pré-incubadas em um tampão Tris 50mM, NaCI 0,1 M, pH 8 por 15 minutos a 30²C. A proteína de fusão e o peptídeo foram misturados e incubados por 15 minutos a 30²C. A mistura permaneceu solúvel após a incubação.

A montagem molecular resultante foi ensaiada por análise de dispersão luminosa e seu peso molecular teórico foi calculado (PM: 222,1 kDa) . Ver Figura 34. Esta análise mostrou que aproximadamente 10 peptídeos EE12RR345L (PM: 5, 6 kDa se acoplaram ao decâmero BLS-RR12EE345L (PM: 222,1 kDa). Ver Figura 35.

Adicionalmente, a montagem mostrou um sinal de CD de alta qualidade no espectro UV remoto. Estes resultados sugerem que as montagens moleculares formadas com as proteínas BLS modificadas utilizando-se esta técnica são viáveis.

A presente invenção foi descrita em alguns detalhes e exemplificada para facilitar sua compreensão e reprodutibilidade. Certas alterações na forma e detalhe podem ser realizadas por qualquer especialista na técnica sem que se afaste do verdadeiro objeto e escopo das reivindicações da presente invenção. Todas as publicações de 20/10/2017, pág. 124/181

60/63 citadas aqui são incorporadas em sua totalidade como referência à descrição da invenção.

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Petição 870170080222, de 20/10/2017, pág. 128/181

1/6

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Proteínas quiméricas isoladas caracterizadas pelo fato de compreenderem um peptídeo, um polipeptídeo ou um domínio protéico ligado a uma proteína lumazina sintase modificada de Brucella spp, em que os primeiros 8 resíduos de aminoácidos do N-terminal foram deletados e o nono Asn (N) foi substituído por Leu (L) , em que a sequência de aminoácidos da proteína modificada consiste em SEQ ID NO.:

   7 .
2. 2. Sequências de nucleotídeos isoladas caracterizadas pelo fato de compreenderem as sequências que codificam para as proteínas quiméricas e modificadas, conforme definidas na reivindicação 1, em que as sequências de nucleotídeos que codificam para os primeiros 8 resíduos do N-terminal da proteína modificada compreendem os sítios de restrição para enzimas Nsi I e Afl II, a sequência de nucleotídeos isolada consistindo em uma sequência selecionada dentre as SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15, SEQ ID NO.: 16, SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 21 e SEQ ID NO.: 22.
3. 3. Vetores caracterizados pelo fato de serem

   utilizados como um veículo para as sequências de nucleotídeos, conforme definidas na reivindicação 2. 4 . Vetores, de acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo fato de serem vetores virais ou plasmidiais. 5. Vetores, de acordo com a reivindicação 4,

   caracterizados pelo fato do plasmídeo ser de SEQ ID NO. :

   9c.

   de 13/04/2018, pág. 11/16

   2/6

   6. Vetores plasmidiais, de acordo com a reivindicação 5, caracterizados pelo fato do plasmídeo ser pBLS-OMP31, depositado sob o número DSM 15546.

   7. Células procarióticas transformadas caracterizadas pelo fato de serem transformadas com os vetores conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 3 a 6.

   8. Células transformadas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizadas pelo fato de serem células de Escherichia coli.

   9. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato do peptídeo, polipeptídeo ou domínio protéico ligado ser homólogo ou heterólogo.

   10. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato do peptídeo, polipeptídeo ou domínio protéico ligado ser um antígeno, toxina, agente, ou segmento destes, capaz de induzir uma resposta imune em um organismo eucariótico.

   11. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato do peptídeo, polipeptídeo ou domínio protéico ligado ser um antígeno, toxina, agente, ou segmento destes, de origem bacteriana, viral ou parasitária.

   12. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato do antígeno ser o BLS-OMP31 ou segmentos deste.

   13. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato do antígeno ser o BLS-KETcl ou segmentos deste.

   de 13/04/2018, pág. 12/16

   3/6

   14. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato do antígeno ser o BLS-RD3 ou segmentos deste.

   15. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato da resposta imune ser humoral ou celular. 16. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato do organismo

   eucariótico compreender uma espécie de pássaro, de peixe ou mamífera.

   17. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizadas pelo fato do organismo eucariótico ser uma espécie mamífera tal como uma espécie murina, de coelho ou humana.

   18. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 16, caracterizadas pelo fato da espécie mamífera ser humana.

   19. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato do peptídeo, polipeptídeo ou domínio protéico ligado ser um antígeno, toxina, agente, ou segmento destes, que induz uma resposta imune in vitro ou in vivo.

   20. Combinação de duas ou mais proteínas quiméricas isoladas, conforme definidas na reivindicação 1, caracterizada pelo fato dos peptídeos, polipeptídeos ou domínios protéicos ligados a cada proteína modificada serem diferentes.

   21. Combinação de duas ou mais proteínas quiméricas isoladas, conforme definidas na reivindicação 1, caracterizada pelo fato dos peptídeos, polipeptídeos ou de 13/04/2018, pág. 13/16
4. 4/6 domínios protéicos ligados a cada proteína modificada serem idênticos.

   22. Combinação de duas ou mais sequências de nucleotídeos isoladas, conforme definidas na reivindicação 3, caracterizada pelo fato das sequências de nucleotídeos que codificam para os peptídeos, polipeptídeos ou domínios protéicos ligados às proteínas modificadas serem diferentes.

   23. Combinação de duas ou mais sequências de nucleotídeos isoladas, conforme definidas na reivindicação 2, caracterizada pelo fato das sequências de nucleotídeos que codificam para os peptídeos, polipeptídeos ou domínios protéicos ligados às proteínas modificadas serem idênticas.

   24. Combinação caracterizada pelo fato de ser de uma ou mais proteínas quiméricas isoladas, conforme definidas na reivindicação 1, e uma ou mais sequências de nucleotídeos isoladas, conforme definidas na reivindicação

   2 .

   25. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma das proteínas quiméricas isoladas conforme definidas na reivindicação 1.

   26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de compreender um excipiente farmacêutico aceitável.

   27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato do excipiente farmacêutico aceitável ser um adjuvante.

   28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato do adjuvante compreender um adjuvante de Freund, um dipeptídeo MDP, de 13/04/2018, pág. 14/16
5. 5/6 saponina, estearato de tirosina, hidróxido de alumínio, citocinas linfáticas, a proteína nativa de lumazina sintase de Brucella spp ou as proteínas modificadas de lumazina sintase de Brucella spp.

   29. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma das sequências de nucleotídeos isoladas, conforme definidas na reivindicação

   2 .

   30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de compreender um excipiente farmacêutico aceitável.

   31. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato do excipiente farmacêutico aceitável ser um adjuvante.

   32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato do adjuvante compreender um adjuvante de Freund, um dipeptídeo MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de alumínio, citocinas linfáticas, a proteína nativa de lumazina sintase de Brucella spp ou as proteínas modificadas de lumazina sintase de Brucella spp.

   33. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender pelo menos uma das proteínas quiméricas isoladas, conforme definidas na reivindicação 1, e pelo menos uma das sequências de nucleotídeos isoladas, conforme definidas na reivindicação 2.

   34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de compreender um excipiente farmacêutico aceitável.

   de 13/04/2018, pág. 15/16
6. 6/6

   35. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato do excipiente farmacêutico aceitável ser um adjuvante.

   36. Composição farmacêutica, de acordo com a 5 reivindicação 35, caracterizada pelo fato do adjuvante compreender um adjuvante de Freund, um dipeptídeo MDP, saponina, estearato de tirosina, hidróxido de alumínio, citocinas linfáticas, a proteína nativa de lumazina sintase de Brucella spp ou as proteínas modificadas de lumazina
7. 10 sintase de Brucella spp.

   37. Biossensor caracterizado pelo fato de compreender: (a) uma base onde pelo menos uma proteína quimérica isolada, conforme definida na reivindicação 1, é fixada e (b) a dita base sendo conectada a meios de
8. 15 mensuração que são capazes de determinar se um ligante se fixou a, ou reagiu com, a proteína quimérica isolada.

   38. Biossensor, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato do ligante ser um anticorpo.

   39. Proteínas quiméricas isoladas, de acordo com a 20 reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de sua estrutura quaternária ser um decâmero.

   Petição 870180029819, de 13/04/2018, pág. 16/16

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