BRPI0512109B1

BRPI0512109B1 - meios de teste para identificação e diferenciação de coliformes em geral, escherichia coli, aeromonas spp e salmonella spp., compreendendo diferentes substratos se combinam para formar cores diferentes

Info

Publication number: BRPI0512109B1
Application number: BRPI0512109A
Authority: BR
Inventors: Geoffrey N Roth; Jonathan N Roth
Original assignee: Micrology Lab Llc
Priority date: 2004-06-14
Filing date: 2005-06-08
Publication date: 2016-08-16
Also published as: CA2570206C; JP5011104B2; EP1776465A2; ES2375329T3; CA2570206A1; US20040235087A1; WO2005123939A2; EP2316964B1; EP1776465B1; DK1776465T3; MXPA06014593A; EP2316964A1; WO2005123939A3; ATE500341T1; AU2005254973A1; BRPI0512109A; IL180056A0; US7273719B2; AU2005254973B2; JP2008502350A

Abstract

método qualitativo ou quantitativo de meios de teste para identificação e diferenciação de materiais biológicos em uma amostra de teste. um meio de teste e um método para detectar, quantificar, identificar e diferenciar até quatro (4) materiais biológicos separados em uma amostra em teste. um meio de teste é divulgado que permite quantificar e diferenciar sob luz ambiente agregados de entidades biológicas que produzem enzimas especificas, que devem incluir coliformes gerais, e. coli, aeromonas, e salmonella, em um único meio de teste. uma nova classe de substratos não-cromogênicos é divulgada que produzem um precipitada substancialmente preto, não-difusível. esse precipitado não é objeto de interferência de outros substratos cromogênicos presentes em um meio deteste. em uma modalidade, os substratos são selecionados tal que colônias de e. coli presentes no meio de teste se mostram como substancialmente pretas, colônias de coliformes gerais se mostram no meio de teste como uma cor azul-violeta, colônias de aeromonas presentes no meio de teste se mostram como uma cor geralmente vermelho-rosa, e colônias de salmoneila se mostram como geralmente uma cor teal-verde. outros microorganismos e possibilidades de cor para detecção e quantificação desses também são descritos. um inibidor e um método para fazer um meio de teste incorporando o inibidor são descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MEIOS DE TESTE PARA IDENTIFICAÇÃO E DIFERENCIAÇÃO DE COLIFORMES EM GERAL, ESCHERICHIA COLI, AEROMONAS SPP E SALMONELLA SPP„ COMPREENDENDO DIFERENTES SUBSTRATOS SE COMBINAM PARA FORMAR CORES DIFERENTES".

Antecedentes da Invenção A presente invenção refere-se a um meio de teste e método para a detecção, quantificação, identificação e/ou diferenciação de materiais biológicos em uma amostra que pode conter vários materiais biológicos diferentes.

Bactérias são o fator causai de muitas doenças de seres humanos, animais superiores e plantas e são comumente transmitidas por veículos tais como água, bebidas, alimento e outros organismos. A análise desses veículos em potencial de bactérias é de importância crítica e geral mente conta com "organismos indicadores". Borrego et al., Microbioi. Sem. 13:413-426, (1998). Por exemplo, Escherichia coli (E. coii) é um gram negativo membro da família Enterobacteriaceae que é parte da flora intestinal normal de animais de sangue quente e sua presença indica contaminação fecal (p.ex., esgoto sem tratamento). Mesmo que a maioria das cepas de E. coli não sejam a causa real de doença, sua presença é um forte indício da possível presença de patógenos associados com doença intestinal, tais como cólera, disenteria e hepatite entre outros. Consequentemente, E. coii tornou-se um organismo indicador fundamental para contaminação fecal, e como um resultado, qualquer método que diferencie e identifique E. coii de outras bactérias é muito útil.

Outros membros da família Enterobacteriaceae, comumente referidos como "coliformes em geral", especialmente dos gênero Citrobacter, Enterobacter e Kiebsielia, também são considerados organismos indicadores significativos para a qualidade da água, bebidas e alimentos. Portanto, testes para identificar e diferenciar coliformes em geral de £. coii são também muito úteis. Ainda, várias espécies do gênero Aeromonas mostraram não apenas ser patogênicos em potencial mas terem uma correlação com outros organismos indicadores (Pettibone et al., J. Appl. Microbioi. 85: 723-730 (1998)). Métodos de teste atuais para identificar, separar e contar Aeromonas spp. das Enterobacteriaceae muito semelhantes não são disponíveis e a maioria dos métodos atuais que utilizam substratos enzimáticos não separam Aeromonas spp de Enterobacteriaceae devido aos seus perfis bioquímicos quase idênticos. Qualquer método que dependa da identificação de coli-formes em geral por meios de um substrato de β-galactosidase tanto não diferencia Aeromonas spp, dos coliformes em geral quanto elimina Aeromonas da amostra pelo uso de inibidores específicos (antibióticos tal como cef-sulodina). Brenner et al., Appl. Envir. Microbio. 59: 3534-44 (1993). Eles não diferenciam, identificam e contam Aeromonas junto com E. coli e coliformes em geral. Landre et al., Letters Appl. Microbiol. 26:352-354 (1998). Métodos de teste aprimorados para identificar, separar e contar eficazmente tais tipos bacterianos são necessários e há uma busca contínua por métodos de teste e equipamentos mais rápidos, mais acurados, fáceis de usar e mais versáteis nessa área. Vários métodos de teste foram utilizados para determinar, identificar e contar um ou mais organismos indicadores. Alguns desses métodos de teste apenas indicam a presença ou ausência do microrganismo, enquanto outros também tentam quantificar um ou mais dos organismos em particular na amostra de teste. Por exemplo, um teste qualitativo referido como o teste de Presença/Ausência (ou P/A), pode ser utilizado para determinar a presença ou ausência de coliformes e E. coli em uma amostra de teste. Um meio de teste incluindo o substrato de β-galactosidase O-nitrofenil-p-D-galactopiranosídeo (ONPG) e o substrato de β-glicuronidase 4-metil-umbre-liferil-p-D-glicuronídeo (MUG) é inoculado com a amostra de teste. Para diferenciar os coliformes em geral da E. coli, esse teste conta com o fato de que geralmente todos os coliformes produzem β-galactosidase, enquanto que apenas E. coli produz β-glicuronidase além de β-galactosidase. Se quaisquer coliformes estão presentes (incluindo E. coli), o caldo de cultura se torna de cor amarela devido à atividade da enzima galactosidase sobre o material ONPG, causando a liberação de um pigmento amarelo difusível. Se E. coli está presente, o caldo de cultura demonstrará uma fluorescência azul quan- do irradiado com raios ultravioleta, devido à quebra do reagente MUG com liberação do corante fluorogênico causado pela produção da enzima glicuro-nidase. Essas reações são muito específicas e permitem a presença de ambos os coliformes em geral, assim como E. coli ser identificada em uma única amostra. Uma desvantagem desse teste é que ele não é diretamente quantitativo para nenhum dos tipos de bactéria, já que ambos os reagentes produzem pigmentos difusíveis. Uma segunda desvantagem é que pode haver uma reação falso positiva para coliformes se Aeromonas spp. estiverem presentes na amostra de teste. Isso foi mostrado ser possível até quando há inibidores presentes para supostamente prevenir que isso ocorra (Landre et al., Letters Appl. Microbiol. 26:352-354 (1998)). Esse teste também requer equipamento específico para produção de raios ultravioleta. Adicionalmente, esse teste pode ser usado apenas para detectar coliformes e E. coli. Outros microrganismos importantes, tais como cepa 0157 de E. coli que é glicuroni-dase negativa, não são detectados, nem outros microrganismos não produtores de galactosidase-glicuronidase. O método Violet Red Bile Agar (VRBA) foi usado para determinar a quantidade de ambos coliformes e E. coli em uma amostra de teste. O meio de teste usado nesse método inclui sais biliares (para inibir não-coliformes), lactose e o indicador de pH vermelho neutro, Como coliformes (incluindo E. colí) crescem no meio, a lactose é fermentada com a produção de ácido e o vermelho neutro na área das colônias bacterianas se torna cor vermelho-tijolo. Os resultados desse teste nem sempre são fáceis de interpretar e a fim de determinar a presença de E. coli, testes de acompanhamento para confirmação, tais como fermentação de caldo de lactose verde brilhante, crescimento em caldo EC em 44,5°C e formação de listras em Eo-sin Methylene Blue Agar (EMBA), devem ser realizados. O método do Filtro de Membrana (MF) utiliza filtros com micro-poros através dos quais amostras são passadas de maneira que as bactérias são retidas sobre a superfície do filtro. Esse método é usado mais fre-qüentemente quando populações bacterianas são muito pequenas e uma grande amostra é necessária para se obter números adequados. O filtro é então colocado sobre a superfície de um meio escolhido, incubado, e as colônias de bactérias que crescerem sobre a superfície do filtro são contadas e avaliadas. Esse método é amplamente usado e fornece bons resultados quando combinado com meios e reagentes apropriados. Uma desvantagem desse método é que este é muito caro e demorado. Ele também pode não funcionar bem com amostras sólidas ou amostras com grande número de partículas. O método MF pode ser usado junto com o método da invenção descrito nesse pedido. O método m-Endo também é usado para determinar a quantidade de E. coli e coliformes em geral e é um método oficial aprovado pela U-SEPA para testar a qualidade da água. O meio é comumente usado com um filtro de membrana e as unidades formadoras de colônia (CFU) de E. coli e coliformes em geral crescem como colônias escuras com um brilho metálico verde dourado. Devido a uma alta taxa provada de erro falso positivo, colônias típicas devem ser confirmadas por teste adicional. Standard Methods for the Examination ofwarere Wastewater, 20aEdição, 9-10 & 9-60 (1998).

Outros testes, tais como o Most Probabie Number (MPN) utilizam caldos que contêm lactose (LST, BGLB, EC) para estimar o número de coliformes em geral e E. coli, mas também mostraram ter altas taxas ou erros assim como são trabalhosos e lentos para produzir resultados. Evans et al.,ΑρρΙ. Envir. Microbiol. 41:130-138(1981). O reagente 5-bromo~4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo (X-gal) é um conhecido composto de teste para identificar coliformes. Quando a enzima β-galactosidase produzida pelos coliformes atua sobre ele, X-gal forma um precipitado insolúvel azul índigo. X-gal pode ser incorporado a um meio nutriente tal como uma placa de ágar, e se uma amostra contendo coliformes está presente, os coliformes crescerão como colônias azul índigo. X-gal tem a vantagem sobre o composto ONPG, descrito acima, em que ele forma um precipitado insolúvel em água ao invés de um composto difusível, dessa forma possibilitando que uma determinação quantitativa de coliformes seja feita quando a amostra de teste é incorporada em ou sobre um meio solidificado, ou quando colônias de coliformes crescem sobre a superfície de um filtro de membrana repousando sobre uma almofada saturada com um meio líquido ou sobre um filtro de membrana repousando sobre um meio sólido. AdÍcionalmente, não requer o uso de luz ultravioleta.

Um composto similar, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo (X-gluc) é um conhecido composto de teste para identificar E. coli. Quando a enzima β-glicuronidase produzida pela maioria das £ coli atua sobre ele, X-gluc forma um precipitado insolúvel azul índigo. X-gluc tem a vantagem sobre o composto MUG, descrito acima, em que ele forma um precipitado insolúvel em água, ao invés de um composto difusível, dessa maneira possibilitando que uma determinação quantitativa de E. coli seja feita quando a a-mostra de teste é incorporada em ou sobre um meio solidificado. X-gluc e sua habilidade para identificar £. coli são descritos em Watkins et al., Appl. Envir, Microbiol. 54:1874-1875 (1998). Um composto similar, indoxil-[3-D-glicuronídeo, que também produz colônias azuis estreitas de £. coli, foi descrito em Ley et al., Can. J. Microbiol. 34:690-693 (1987).

Embora X-gal e X-gluc sejam cada um separadamente úteis na determinação quantitativa tanto de coiiformes (X-gal) quanto de E. coli (X-gluc), esses compostos indicadores tem a desvantagem de que cada um contém o mesmo componente cromogênico. Portanto, eles não podem ser usados juntos para identificar e distinguir tanto E. coli como coiiformes em geral em um único teste com uma única amostra, já que ambos geram colônias com a mesma tonalidade azul índigo. Uma pessoa usando ambos os reagentes juntos poderá ser capaz de quantitativamente identificar o número total de coiiformes, o mesmo que se X-gal fosse usado sozinho, mas não será capaz de indicar quais das colônias são de E. coli e quais são de outros coiiformes além de E. coli.

Um método de teste recentemente desenvolvido e altamente bem sucedido comercialmente e um meio de teste para identificar quantitativamente e diferenciar coiiformes em geral e E. coli em uma amostra é descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.210.022 e 5.393.662, ambas as quais compartilham inventividade comum com o presente pedido e que estão por meio deste incorporadas por referência. Esse método e o meio de teste aprímo- ram métodos da técnica anterior por permitir a identificação quantitativa de coliformes em geral e £ coli em uma única amostra. Testes confírmatórios adicionais não são necessários. A amostra de teste é adicionada a um meio contendo um substrato de β-galactosidase, tal como 6-cloroindolil~P-D-galactosidase, e um substrato de β-glicuronidase, tal como 5-bromo-4-cloro-3-indolil'p-D-glicuronidase (X-gluc). O substrato de β-galactosidase é capaz de formar um precipitado insolúvel em água de uma primeira cor ao reagir com β-galactosidase e o substrato de β-glicuronidase é capaz de formar um precipitado insolúvel em água de uma segunda cor, contrastando com a cor inicial, ao reagir com β-glicuronidase. Como um resultado, coliformes em geral podem ser quantificados pela contagem de colônias da primeira cor (que tem atividade de β-galactosidase), e £ coli pode ser quantificada pela contagem de colônias da segunda cor (que tem ambas as atividades de β-galactosidase e β-glicuronidase). Essa tecnologia foi amplamente copiada.

Outro método de teste e equipamento recentemente desenvolvido fornece excelentes resultados para a diferenciação e identificação de coliformes em geral, £ coli e cepas 0157 de E. coli e Enterobacteríaceae não-coliformes. O método e o meio de teste são descritos na Patente U.S. No. 5.726.031, que compartilha inventividade comum com o presente pedido e que está por meio deste incorporado por referência.

Uma certa classe de substratos, referidos aqui como "não-cro-mogênicos" foram usados para detectar vários mícrorganísmos. Um dipslide para detectar E. coli usando hidróxi-quinolina^-D-glicuronídeo é descrito por Dalet et al., J. Clin. Microbiol., 33(5):1395-8 (1995). Similarmente, uma técnica para detecção de E. coli em meio à base de ágar usando 8-hidro-xiquinoiina^-D-glicuronídeo é descrita por James et al., Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg [A], 267(3): 316-21 (1998). É desejável melhorar adicionalmente as cores de distinção geradas no meio de teste. Isso significa dizer que, os meios de teste da técnica anterior que detectam e distinguem duas entidades biológicas, pode surgir confusão entre as duas cores que aparecem no meio.

Adicionalmente, é desejável ser capaz de identificar e diferenciar outros organismos intimamente relacionados, tais como os membros das famílias Aeromonaceae, Vibrionaceae e Salmonella. Por exemplo, o gênero Aeromonas está intimamente relacionado com coliformes e fornece um padrão bioquímico quase idêntico. Adicionaimente, o gênero Vibrio também é um importante tipo de bactéria que cresce sob as mesmas condições gerais que os coliformes. Sabe-se distinguir colônias de Aeromonas de coliformes em geral testando todas as colônias em uma dada amostra para a presença de citocromo oxidase. Indesejavelmente, entretanto, isso requer outro grupo de testes. Adicionalmente, Aeromonas é comum na água e alimentos e é comumente indicada em amostras de teste como coliformes em geral, o que resulta em um grande erro falso positivo para coliformes em geral peia maioria dos métodos de teste atuais. Pode ser evitado que os Aeromonas interferiram com os resultados para coliformes pela adição de determinados antibióticos ao meio. Entretanto, as quantidades de antibióticos adicionadas devem ser cuidadosamente controladas. Adicionalmente, os antibióticos que tem sido convencionalmente usados têm tempo de vida curto no meio de forma que eles perdem rapidamente sua potência em outra condição que não o congelamento. Frequentemente é desejável ser capaz de cultivar, i-dentificar e contar Aeromonas spp. o que não pode ser feito se elas estão inibidas.

Adicionalmente, naqueles casos onde é desejável inibir a Aeromonas, é desejável um método melhor de fazê-lo, um no qual a vida útil do meio não seja apreciavelmente reduzida pela inclusão de um inibidor.

Adicionalmente, é desejável distinguir cepas de Salmonella de E. coli, coliformes em geral e Aeromonas.

Sumário da Invenção A presente invenção supera as desvantagens dos métodos da técnica anterior pelo fornecimento de um método de teste e um meio para identificar e diferenciar quantitativamente ou qualitativamente entidades biológicas em uma amostra de teste que pode incluir várias entidades biológicas diferentes.

Em uma modalidade, a presente invenção introduz o uso de substratos "não-cromogênicos" para aumentar a distinção entre as múltiplas cores produzidas por entidades biológicas distintas presentes no meio de teste da invenção. Inesperadamente, foi descoberto que outros substratos ”cromogênicos" presentes no meio de teste da invenção não interferem com a cor substancialmente preta obtida com o substrato não-cromogênico. Isso quer dizer que, contanto que uma determinada entidade biológica seja res-ponsiva ao substrato não-cromogênico, agregados presentes dessa no meio de teste mostrarão uma cor substancialmente negra - independente de tal entidade biológica ser responsiva a um, dois ou mais substratos cromogêni-cos que também estão presentes no meio. A presente invenção explora essa propriedade até agora inexplorada de substratos não-cromogênicos.

Em uma forma dessa, a presente invenção fornece um meio de teste para detectar, identificar e qualificar ou quantificar uma primeira e uma segunda entidade biológica. O meio de teste inclui um meio de base nutriente incluindo íons de um sal, um substrato cromogênico e um substrato não-cromogênico, A primeira entidade biológica é responsiva ao substrato não-cromogênico enquanto que a segunda entidade biológica é responsiva ao substrato cromogênico. Nesse meio de teste, agregados da primeira entidade biológica presente no meio de teste são substancialmente pretos e agregados da segunda entidade biológica presente no meio de teste são de uma segunda cor, a segunda cor sendo distinta do substanciai mente preto.

Em uma forma, o meio de teste da invenção é responsável pela primeira entidade biológica ser responsiva ao substrato cromogênico além do substrato não-cromogênico. Em tal eventualidade, agregados da primeira entidade biológica presente no meio de teste se irão entretanto se mostrar como substancialmente pretos.

Significativamente, mesmo que os agregados da primeira entidade biológica sejam responsíveis tanto ao primeiro quanto ao segundo substrato nessa forma, esses agregados ainda se mostrarão como substancialmente pretos no meio de teste. Ou seja, o substrato cromogênico não-interfere com a cor substancialmente preta. Vantajosamente, essa propriedade de substratos não-cromogênicos permite que diversas entidades bioló- gicas diferentes sejam identificadas e diferenciadas em um único meio, a-gregados de cada entidade biológica tendo uma cor visualmente distinguível.

Em outra forma do meio da invenção descrito acima, o meio inclui adicionalmente o antibiótico ácido nalidíxico para inibir o crescimento de Aeromonas spp. Vantajosamente, foi descoberto que o ácido nalidíxico, quando comparado com cefsuiodina, não reduz significativamente a vida útil do meio de teste que o incorpora.

Nesse contexto, outra forma da presente invenção fornece um método de fazer um meio de teste para detectar pelo menos um primeiro tipo de entidade biológica e inibir um segundo tipo de entidade biológica de crescer no meio. O método inclui as etapas de combinar os substratos desejados com um meio de base nutriente; adicionar um inibidor ao meio; e então esterilizar o meio submetendo o meio a pelo menos 100°C. Como o inibidor é adicionado como uma etapa inicial, a adição estéril subseqüente de inibidor é desnecessária.

Em outra forma dessa, a presente invenção fornece um meio de teste para detectar, identificar e qualificar ou quantificar uma primeira, uma segunda e uma terceira entidade biológica. O meio de teste inclui um meio de base nutriente incluindo íons de um sal. Um primeiro e um segundo substrato cromogênico e um substrato não-cromogênico são fornecidos no meio de teste. A primeira e a segunda entidade biológica são responsivas ao primeiro e ao segundo substrato cromogênico e a terceira entidade biológica é responsiva ao substrato não-cromogênico. Agregados da primeira entidade biológica presente no meio de teste são de uma primeira cor, agregados da segunda entidade biológica presente no meio de teste são de uma segunda cor e agregados da terceira entidade biológica presente no meio de teste são substancialmente pretos.

Em uma forma, o meio de teste da invenção é responsável pela terceira entidade biológica ser responsiva ao primeiro e/ou segundo substrato cromogênico além do substrato não-cromogênico. Em tal eventualidade, agregados da terceira entidade biológica irão entretanto se mostrar como substancialmente pretos.

Deve ser apreciado que o uso de um substrato não-cromogênico junto com um ou mais substratos não-cromogênicos aumenta sinergicamen-te o número de entidades biológicas que podem ser detectadas e distingui-das em um único meio e aumenta sinergicamente as combinações de cores possíveis para um dado grupo de entidades biológicas a serem detectadas. Dito de outra maneira, incluir um componente não-cromogênico como um dos substratos aumenta sinergicamente os graus de liberdade de selecionar outros substratos e cores correspondentes para um meio de teste. Isso ocorre por que um agregado da entidade biológica que é responsivo ao substrato não-cromogênico se mostrará certamente como substancialmente preto. Nenhum efeito de cores combinadas precisam ser levados em consideração com substratos não-cromogênicos. Por exemplo, em um meio de teste incluindo três substratos cromogênicos e um substrato não-cromogênico, pelo menos três efeitos de combinação de combinação de cores são evitados pelo uso de um componente não-cromogênico, como comparado com o uso de quatro componentes cromogênicos. A presente invenção, em outra forma dessa, fornece um meio de teste capaz de detectar, quantificar e diferenciar coliformes em geral e/ou E. coli spp. sob luz ambiente. O meio de teste compreende um meio de base nutriente incluindo um sal. Um primeiro substrato capaz de formar um primeiro componente insolúvel em água de uma primeira cor na presença de E. coli e dos íons do sal é fornecido no meio. A primeira cor é substancialmente preta. Um segundo substrato capaz de formar um segundo componente insolúvel em água de uma segunda cor na presença de coliformes em geral é fornecido. A segunda cor é visualmente distinguível da primeira cor. Dessa forma, colônias de E. coli presentes no meio de teste são indicadas pela primeira cor substancialmente negra e colônias de coliformes em geral são indicadas pela segunda cor.

Em uma forma da invenção acima, o meio de teste inclui adicionalmente um terceiro substrato capaz de formar um terceiro componente insolúvel em água de uma terceira cor na presença de Salmonella. A terceira cor é distinguível da primeira e segunda cores, por meio do que o meio de teste é capaz de quantificar e/ou diferenciar E. coli, coliformes em geral e Salmonelia. Adicionalmente, os substratos são selecionados tal que coliformes em geral presentes no meio de teste também reagirão com o terceiro substrato para formar um componente insolúvel em água que inclui a terceira cor. Conseqüentemente, colônias de coliformes em geral são indicadas no meio de teste como uma quarta cor, a quarta cor sendo uma combinação da segunda cor e da terceira cor. A quarta cor é visualmente distinguível da primeira e terceira cores. Ainda adicionalmente, os substratos podem ser selecionados tal que Aeromonas spp. forma um componente insolúvel da segunda cor pela reação com o segundo substrato, mas não com o primeiro e terceiro substratos. Dessa forma, no meio de teste da invenção, colônias de E. coli serão geralmente pretas, colônias de coliformes em geral serão da quarta cor, colônias de Aeromonas serão da segunda cor e colônias de Sal-monella serão da terceira cor.

Em outra forma dessa, a presente invenção fornece um método para detectar, quantificar e diferenciar sob luz ambiente coliformes em geral, E. coli e pelo menos um dos gêneros Aeromonas ou Salmonelia em uma amostra de teste. O método compreende as etapas de fornecer um meio de base nutriente incluindo um primeiro, segundo e terceiro substratos. Cada um dos substratos é capaz de formar um componente insolúvel em água na presença de pelo menos um de coliformes em geral, E. coli, Aeromonas e Salmonelia. Os substratos são selecionados tal que colônias de £. coli produzidas no meio de teste são de uma primeira cor, colônias de coliformes em geral produzidas no meio de teste são de uma segunda cor e colônias de Aeromonas ou Salmonelia produzidas no meio de teste são de uma terceira cor. Cada uma das cores são visualmente distinguíveis. O meio de teste é inoculado com a amostra de teste e então incubado. O meio de teste é então examinado quanto à presença de primeiras colônias tendo a primeira cor, segundas colônias tendo a segunda cor e terceiras colônias tendo a terceira cor. As primeiras colônias são de £. coli, as segundas são de coliformes em geral e as terceiras são de Aeromonas ou Salmonelia.

Em uma forma dessa, o método da invenção inclui adicional- mente adicionar íons de um sal ao meio de teste para reagir com um ou mais substratos. Ao fazer isso, um precipitado é produzido que se mostra como uma cor substancialmente preta na presença da enzima específica para aquele substrato. Um composto preferido para formar a cor substancialmente preta na presença de íons de sal consiste em um β-D-glicuronídeo. Esses compostos liberam uma aglicona quando hidrolisados que forma um complexo insolúvel substancialmente preto na presença de íons.

Em outra forma do método da invenção, o método adicionalmente compreende examinar o meio de teste quanto à presença de quartas colônias tendo uma quarta cor, em que os substratos são selecionados tal que colônias de Aeromonas são da terceira cor e colônias de Salmonella são da quarta cor, a quarta cor sendo visualmente distinta da primeira, segunda e terceira cores. Os substratos podem ser selecionados tal que a primeira cor é substancialmente preta, a segunda cor é substancialmente azul-violeta, a terceira cor é substancialmente vermelho-rosa e a quarta cor é substancialmente verde cerceta.

Em outra forma do método da invenção, os substratos são selecionados tal que colônias de Aeromonas assim como colônias de Plesiomo-nas e Vibrios são indicadas como a terceira cor.

Uma modalidade da presente invenção usa um substrato não-cromogênico junto com um ou mais substratos cromogênicos e assim aumenta sinergicamente os graus de liberdade de criação na seleção de cores para o meio de teste da invenção. Isso ocorre por que os substratos cromogênicos não interferem com o precipitado substancialmente preto formado pelo substrato não-cromogênico.

Outra vantagem de uma modalidade da presente invenção é que ela possibilita a quantificação, identificação e diferenciação de quatro (4) cepas bacterianas diferentes simultaneamente em um único meio de teste u-sando uma única amostra de teste, sob iluminação ambiente. Testes subse-qüentes com seus concomitantes gastos extras de tempo e custos extras são evitados. É claro, o meio de teste da invenção da presente invenção podería ser usado meramente para propósitos qualitativos, como um mero tes- te de presença/ausência (P/A).

Em uma modalidade, os substratos são selecionados tal que as cores são fáceis de ser visualmente distinguíveis uma da outra sem a necessidade de luz UV ou outros auxílios visuais, a não ser, talvez meios de magnificação. Por exemplo, em uma modalidade, colônias de E. coli estão claramente indicadas por um precipitado que tem uma cor substancial mente preta, colônias de coliformes em geral são indicadas por uma cor azul-violeta, colônias de Aeromonas são indicadas por uma cor vermelho-rosa e colônias de Salmonella são indicadas por uma cor verde-cerceta. Como essas cores são visualmente bem distintas, a confusão entre as cores é bastante reduzida quando comparada com os meios da técnica anterior. Em outra modalidade, MUGIuc (ácido 4-metilumbeliferil-Beta-D-glicurônico) é usado em lugar de um substrato não-cromogênico. Nesse meio de teste, coliformes em geral ainda são indicados por uma cor azul-violeta ou acinzentada. Colônias de Aeromonas indicadas por uma cor vermelho-rosa e colônias de Salmonella indicadas por uma cor verde cerceta; entretanto, colônias de E. coli poderão parecer iguais em luz visível aos coliformes em geral, mas também poderão fluorescer com um cor azulada brilhante sob luz UV de onda longa e isso pode ser distinguido das outras colônias. Embora, o produto fluorescente possa se difundir mais rapidamente do que os substratos cro-mogênicos ou não-cromogênicos e tornar a quantificação das colônias de £. coli mais difícil, as colônias de £. coli podem ser detectadas por volta de 14 horas de tempo de incubação e em qualquer caso bastará como um teste de presença/ausência para £. coli.

Em ainda outra modalidade da invenção, foi descoberto que três substratos cromogênicos podem ser usados se apropriadamente combinados. Por exemplo, um β-glicuronídeo tal como X-gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicurônico) ou lodo-Gluc (ácido 5-iodo-3-indolil-p-D-glicurônico) pode ser usado com substratos a- e β-D-galactosídeo cromogênicos. Exemplos de substratos a- e β-D-galactosídeo que podem ser adequados são 6-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactosídeo. Nessa modalidade, os substratos β-D-glicuronídeo e α-D-galactosídeo for- mam a mesma coloração comum na presença de colônias que produzem as respectivas enzimas; entretanto, as cores podem serdistinguidas pelo fornecimento dos substratos em quantidades diferentes de maneira que a cor resultante produzida por um é mais escura que a produzida pelo outro. Além disso, mesmo se os substratos são fornecidos em aproximadamente as mesmas quantidades, colônias que reagem a ambos β-D-glicuronídeo e a-D-galactosídeo, tal como E. coli devem ser mais escuras que as colônias tal como de coliformes em geral, que reagem apenas a α-D-galactosídeo. Deve ser observado que não seria necessário adicionar íons de sal se um substrato não-cromogênico não é usado.

Em um aspecto adicional da presente invenção. MUGIuc ou outro substrato de glicuronídeo fluorescente pode ser combinado em um meio de teste com um substrato de glicuronídeo cromogênico ou não-cromogênico. Nesse caso, o substrato MUGIuc pode ser usado para detectar E. coli sob luz fluorescente com menos tempo de incubação do que é necessário para detectar colônias com um glicuronídeo cromogênico ou não-cromogênico. Adicionalmente, o substrato MUGIuc pode servir como uma confirmação da presença/ausência de E. coli, se por qualquer razão há alguma dúvida sobre as cores visíveis em luz ambiente produzidas pelas colônias na presença dos substratos.

Outra vantagem do meio de teste da presente invenção é sua flexibilidade e facilidade de uso. A temperatura de incubação não é crítica já que o crescimento e a diferenciação dos organismos mencionados pode o-correr dentro de uma faixa ótima. Por conseguinte, etapas de ressuscitação são evitadas e inibição de cepas sensíveis a temperatura não ocorre. Ainda, equipamento de baixo custo pode ser usado.

Em uma modalidade da presente invenção, a distinção de cor obtida em um meio de teste pode ser intensificada para identificar e diferenciar £ coli dos coliformes em geral. Em um meio de teste, colônias £ coli apresentam um cor substancialmente preta, enquanto coliformes em geral apresentam uma cor vermelho-rosa, a distinção entre elas sendo muito mais aparente do que no meio de teste da técnica anterior. A confusão entre as duas cores é portanto grandemente reduzida.

Ainda outra vantagem da presente invenção é que ela permite a identificação e diferenciação de Aeromonas spp. de coliformes em gerai. Meios de teste da técnica anterior requerem indesejavelmente usar um inibidor de cefsulodina para impedir que Aeromonas spp. cresçam ali. Entretanto, o uso de cefsulodina como um inibidor requer uma etapa extra no processo, viz., adição estéril de antibiótico esterilizado em filtro, e é difícil de controlar. Adicionalmente, a presença de cefsulodina reduz significativamente a vida útil eficaz do meio. Adicionalmente, o uso de um inibidor, obviamente, impede a detecção e quantificação de Aeromonas spp. Vantajosamente, com a presente invenção, Aeromonas spp. pode ser detectada, quantificada e diferenciada de coliformes em geral em um único meio.

Como uma vantagem relacionada, se todavia é desejado inibir colônias de Aeromonas spp. de crescer no meio de teste, a presente invenção fornece um meio superior para fazê-lo. Especificamente, formas preferidas da presente invenção empregam ácido nalidíxico como um inibidor, que mostrou ter um efeito menos deletério a vida de prateleira do meio que o incorpora. Adicionalmente, ácido nalidíxico pode ser adicionado como parte da formulação do meio inicial antes da esterilização, evitando dessa forma uma etapa do processo dispendiosa e difícil que é necessária com cefsulodina. Finalmente, ácido nalidíxico é muito mais barato que cefsulodina.

Outra vantagem da presente invenção é que ela pode fornecer um meio de teste para teste qualitativo ou quantitativo. Ou seja, o meio de teste de acordo com a presente invenção pode ser usado com mero instrumento de teste de presença/ausência, ou pode ser usado para quantificar várias entidades biológicas que mostram colônias de colorações diferentes no meio de teste da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção O método e o meio da presente invenção permite a detecção simultânea, quantificação, identificação e diferenciação de uma variedade de entidades biológicas selecionadas em uma amostra de populações misturadas de entidades biológicas. O método e meio da invençãos são particular- mente úteis para detecção, quantificação, identificação e diferenciação de E. coli e coliformes em geral e identificação quantitativa adicional e diferenciação de outras entidades biológicas selecionadas, incluindo espécies bacteri-anas Aeromonas, Salmonella e Vibrio. O método e meio de teste que incorporam a presente invenção utilizam o fato de que a atividade enzimática de entidades biológicas e especificamente de bactérias varia com o gênero e/ou família da bactéria de interesse. O método e meio de teste que incorpora a presente invenção utiliza adicionalmente o fato de que várias enzimas que identificam complexos de substratos podem ser usadas para identificar enzimas específicas com a produção de colorações distintas. Significativamente, em uma modalidade da presente invenção, o método e meios de teste que incorporam a presente invenção exploram o fato de que substratos cromogênicos presentes em um meio de teste não interferem com a cor substancialmente preta produzida por substratos não-cromogênicos.

Embora substratos não-cromogênicos são conhecidos na técnica, per se, suas propriedades distintas vis-a-vis substratos cromogênicos não foram reconhecidas. Entretanto, o comportamento de um substrato não-cromogênico em um meio incluindo a combinação de substratos cromogênicos é único. Para ilustrar, agregados de uma entidade biológica que são responsivos a dois substratos cromogênicos se mostrarão tipicamente em um meio de teste como uma combinação das duas cores produzidas após a divagem dos dois respectivos substratos. Quando três substratos cromogênicos estão envolvidos, como em outra modalidade da invenção, o efeito de combinação de cor não é óbvio de ser previsto e levado em consideração. Adicionalmente, variações inerentes na quantidade de enzimas produzidas por cepas particulares de entidades biológicas em particular pode resultar em tonalidades ou nuances de cor diferentes após a divagem dos substratos cromogênicos. Conseqüentemente, as cores podem ser difíceis de distinguir pela pessoa leiga examinando o meio de teste. Substratos cromogênicos devem portanto ser escolhidos e usados em uma concentração considerando os outros substratos cromogênicos planejados para inclusão em um dado meio de teste.

Esse não é o caso com os substratos não-cromogênicos. Embora agregados de entidades biológicas que são responsivos a substratos cromogênicos além dos substratos não-cromogênicos possam se mostrar no meio de teste como tendo um "halo” colorido ou fluorescente, tais agregados contudo aparecem substancialmente pretos e são portanto fáceis de identificar. Múltiplos "graus de liberdade" são alcançados com os componentes não-cromogênicos.

Usar um substrato não-cromogênico é um meio para permitir que um único meio de teste diferencie quatro (4) cepas bacterianas diferentes com quatro (4) cores visualmente distinguíveis. A cor preta é difícil de confundir. Adicionalmente, a pigmentação substancialmente preta não se difunde de maneira que a localização das colônias é precisamente conhecida e as colônias podem ser precisamente contadas. Os substratos não-cromogênicos produzem um composto quelado insolúvel que é diferente do dímero que é produzido pelos substratos cromogênicos. O meio de teste e o método da invençãos permitem não apenas a detecção quantificação ou identificação e diferenciação qualitativa de coli-formes em geral e E. coli, mas também de Salmonella e Aeromonas, assim como de Plesiomonas e Vibrío. Espécies de Plesiomonas e Vibrios são determinadas mas não diferenciadas das espécies de Aeromonas com as quais elas estão intimamente correlacionados.

Definições Entidades biológicas, tais como coliformes em geral, E. coli, etc., são aqui referidas como sendo "responsivas” a determinados substratos cromogênicos e não-cromogênicos. Mais especificamente, um entidade biológica previsivelmente produzirá enzimas específicas quando a entidade está presente em um meio de teste tal como um descrito aqui abaixo. Essas enzimas irão clivar seletivamente substratos cromogênicos e não-cromogênicos. Na divagem, esses substratos produzem uma cor no meio de teste. O mecanismo de produção de cor é diferente para os substratos cromogênicos e não-cromogênicos, como descrito aqui abaixo.

Microrganismos que tem atividade de β-galactosidase incluem aqueles comumente conhecidos pela designação de "coliformes". Há várias definições para "coliforme", mas as comumente aceitas incluem bactérias que são membros da família das Enterobacteriacea e que tem a habilidade de fermentar o açúcar lactose com a liberação de gás e ácido. A maioria dos coliformes são positivos para ambas a- e β-galactosidase. Ou seja, elas produzem ambas a- e β-galactosidases.

Microrganismos que tem atividade de β-glicuronidase além de atividade de galactosidase incluem primariamente a maioria das cepas de Escherichia coli. Ou seja, E. coli é positiva para ambas a- e β-galactosidase assim como β-glicuronidase. O termo "coliformes em geral" como usado nesse pedido se refere a outros coliformes que não as várias cepas de E. coli. Esses "coliformes em geral" são microrganismos gram-negativos, que não formam esporos que geralmente tem atividade de a- e β-galactosidase (isto é, fermenta-dores de lactose), mas não tem atividade de β-glicuronidase, e tem a habilidade de fermentar o açúcar sorbitol.

Para os propósitos desse relatório descritivo, um "substrato cro-mogênico" é um substrato que não necessita de químicos adicionais presentes no meio de teste na hidrólise para produção de cor. Ou seja, um substrato cromogênico é clivado pela enzima específica correspondente àquele substrato para formar um dímero com a cor sendo concentrada na área de divagem do substrato. Muitos substratos cromogênicos são conhecidos na técnica. Para os propósitos desse pedido, "cromogênico" inclui substratos fluorogênicos. Os produtos de substratos fluorogênicos requerem luz ultravioleta (UV) para serem detectados e são mais solúveis em água do que outros substratos cromogênicos.

Certos substratos, referidos aqui como "não-cromogênicos", produzem um precipitado escuro, substancialmente preto na presença de íons de um sal e atividade enzimática. Por exemplo, 8-hidroxÍquinolina^-D-glicuronídeo, quando incluído em um meio junto com um sal que produz íons, tais como citrato de amônio férrico, produzirá um precipitado substan- cialmente preto na presença de β-glicuronidase produzida por E, coli ou outras entidades biológicas. Mais especificamente, na divagem do substrato não-cromogênico pela enzima em particular, um complexo substancialmente preto insolúvel em água se forma no meio. O precipitado substanciaimente preto consiste nos íons férricos e aglicona liberados quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase da E. coli. Esse precipitado é um composto quelado que não se difunde. Nem a cor substancialmente preta é suscetível a interferência dos compostos cromogênicos presentes no meio de teste.

Para os propósitos desse relatório descritivo um "substrato não-cromogênico" significa que um químico além daqueles usados com componentes cromogênicos deve estar presente no meio de teste quando o substrato é clivado por sua enzima correspondente. O precipitado substancialmente preto formado por meio disso é uma combinação do substrato - complexo de sal e não é um dímero como é formado pelos "compostos cromo-gênicos".

Para os propósitos desse pedido, a expressão "sob luz ambiente" se refere ao espectro visível, i.e., cores que podem ser vistas e distíngui-das a olho nu. Uma colônia presente no meio de teste que requer luz ultravioleta para ser vista, por exemplo, não podería cair sob a definição de "sob luz ambiente". Entretanto, deve ser entendido que o termo "sob luz ambiente" inclui o uso de um equipamento de magnificação, se necessário. Magnifi-cação pode ser especialmente útil quando contar várias colônias. O termo "visualmente distinguível" se refere a duas ou mais cores que podem ser diferenciadas sob luz ambiente.

Para os propósitos desse relatório descritivo, o termo "substancialmente preto" inclui de marrom escuro a preto, e também inclui preto com vários halos coloridos, tais como vermelho-violeta, verde, fluorescente, etc.

Para os propósitos desse pedido, os nomes das cores citadas aqui são dadas como guia, mas deve ser entendido que os nomes das cores devem ser lidos de maneira geral. Ou seja, pode haver superposição entre as cores citadas. Isso por que, como discutido, entidades biológicas produzem quantidades variáveis de enzimas, o que por sua vez afeta a tonalidade ou nuance da cor resultante. O termo "substrato de β-galactosidase" como usado aqui se refere a um β-galactosídeo compreendendo galactose ligada por uma ligação β a um substituinte que forma um composto detectável quando liberado pela ação de β-gaíactosidase sobre o substrato. Similarmente, o termo “substrato de α-galactosidase'1 como usado aqui se refere a α-galactosídeo compreendendo galactose ligada por uma ligação α a um substituinte que forma um composto detectável quando liberado pela ação de α-galactosidase sobre o substrato. O termo "substrato de β-glicuronidase" como usado aqui se refere a um β-glicuronídeo compreendendo ácido glicurônico ligado por ligação β a um substituinte que forma um precipitado detectável quando liberado pela ação de β-glicuronidase sobre o substrato.

Os substratos e compostos de a- e β-galactosidase e quaisquer outros substratos descritos aqui assim como substratos e compostos de β-glicuronidase e quaisquer outros substratos descritos aqui podem compreender sais de carboxilato formados pela reação de uma base adequada com o grupo carboxil glicurônico ou galactosídeo apropriado. Bases adequadas incluem hidróxidos ou carbonatos de metal alcalino ou metal alcalino terroso, por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, e carbonatos correspondentes; e bases nitrogenadas tais como amônia, e alquilaminas tais como trimetilamina, tritilamina e cíclo-hexilamina.

Planejando um meio de teste para entidades biológicas específicas Certos membros da família Enterobacteriaceae podem ser dis-tinguidos pela presença de atividade de α-galactosidase na ausência de atividade de β-galactosidase ou vice-versa. Por exemplo, a maioria das Salmo-nella e Shigella spp. são positivas para α-galactosidase, mas negativas para β-galactosidase. Similarmente, Aeromonas spp. podem ser distinguidas de outros membros da família das Enterobacteriaceae pela presença de atividade de β-galactosidase na ausência de atividade de α-galactosidase. O método e meio que incorporam a presente invenção são planejados para tirar vantagem dessas características distintivas. Por exemplo, a especifici- dade de atividade enzimática para Salmonella e Aeromonas spp., em oposição aos coliformes em geral, pode ser explorada, como ilustrado abaixo. O método descrito aqui é particularmente adequado para detecção, quantificação ou identificação qualitativa e diferenciação das diferentes classes de microrganismos descritos previamente, viz., coliformes em geral, E. coli, Aeromonas e Salmonella. Embora o método da invenção seja particularmente adequado para esses microrganismos em particular, não é limitado a eles. Por exemplo, as técnicas descritas aqui têm aplicação para identificação e diferenciação de uma grande variedade de entidades biológicas.

Isto é, entidades biológicas específicas são "responsivas" a vários substratos, Mais particularmente, essas entidades biológicas produzem previsivelmente ou contêm enzimas conhecidas. Substratos, tanto cromogê-nicos quanto não-cromogênicos, podem ser selecionados que, na presença de uma enzima(s) em particular, formarão um produto de cor previsível e distinguível. Múltiplos substratos podem ser selecionados para identificar simultaneamente várias entidades biológicas distintas em um único meio de teste, agregados de cada entidade distinta sendo identificáveis por uma cor separada, distinguível. Adicionaimente, enquanto certas modalidades descritos aqui distinguem todos dos vários agregados presentes em um meio de teste sob luz ambiente, como este termo é definido aqui, isso não é necessário. Por exemplo, diversos substratos descritos aqui requerem o uso de luz ultravioleta para que os agregados presentes no meio sejam vistos. A Tabela I lista várias enzimas cuja presença pode ser detectada usando determinados substratos listados na Tabela II.

TABELA I

Enzimas e Abreviações TABELA II Vários Substratos e Cores na Clivaqem Compostos de substratos específicos aplicáveis para uso com o meio de teste da presente invenção estão disponíveis como se segue: 5- bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-gatactopiranosídeo (X-gal) é um substrato de β-galactosidase comercialmente disponível que produz um precipitado insolúvel que tem uma cor aproximadamente cerceta quando reagido pela β-galactosidase e está disponível por Biosynth International, Naper-ville, IL. 6- cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo é um composto que produz um precipitado insolúvel que tem uma cor magenta, a preparação do qual está descrita na Patente U.S. N° 5.210.022 antes mencionada incorporada por referência e está disponível por Research Organics, Cleveland, OH. O composto 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-glicuronídeo (X-gluc) é um β-glicuronídeo comercialmente disponível que produz um precipitado insolúvel que tem uma cor aproximadamente cerceta quando reagido pela β~ glicuronidase. Similarmente, indoxil-p-glicuronídeo é um composto similar, a preparação do qual está descrita no artigo antes mencionado por Ley et al., em Can. J. Microbiol., a descrição do qual está incorporada por referência. Outro β-galactosídeo adequado é o composto 6-cloro-3-indolil-p-D-galac-tosídeo que produz um precipitado insolúvel que tem uma cor rosa/magenta, a preparação do qual é descrita na Patente U.S. N° 5.210.022 antes mencionada.

Outros compostos adequados aplicáveis como substratos na prática da presente invenção são especificados na Patente U.S. N° 5.210.022, todos os quais estão incorporados aqui por referência. O substrato 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo é um β-glicuronídeo comercialmente disponível que, na presença de íons metálicos tais como de ferro, produz um precipitado insolúvel que tem uma cor substancialmente preta quando reagido pela β-glicuronidase e na presença de outros substratos de a- ou β-galactosídeo. 8- hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo está disponível porBiosynth International, Naperville, IL.

Adicionalmente, um sal que fornece íons adequados para uso com a presente invenção é o citrato de amônio férrico, disponível pela Sigma Chemical, St.Louis, MO. Os substratos de ciclohexenoesculetina são descritos em James et al., Appl. & Envir. Micro. 62:3868-3870 (1996) e na presença de íons férricos, produz um precipitado insolúvel substancialmente preto.

Substratos de N-metil-indolila tal como N-metilidróxi-p-D-galacto-piranosídeo são comercialmente disponibilizados por Biosynth International, Naperville, IL.

Substratos de nitrofenila, tal como 2-nÍtrofenil^-D-galactopira-nosídeo, são comercialmente disponibilizados por Biosynth International, Naperville, IL. Similarmente, compostos de nitroanilina estão disponíveis para síntese através de Sigma Chemical, St. Louis, MO.

Outros substratos que produzem uma cor substancialmente preta incluem substratos de esculetina tais como ciclohexenoesculetina^-D-galactosídeo, que é descrito em James et ai., Appl. & Envir. Microbioi. 62:3868-3870 (1996). Substratos de quinolina, tais como 8-hidroxiquinolina-β-D-galactopiranosídeo e 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo são disponibilizados através de Biosynth International, Naperville, IL.

Substratos de iodo-indolil, tais como 5-iodo-3-indolil-p-D-galac-topiranosídeo são disponibilizados através de Biosynth International, Naperville, IL.

Diversos substratos fluorescentes são adequados para uso com a presente invenção. Substratos de cumarina tais como substratos de 4-metilumbeliferila e substratos de 5-trifluorometilumbeliferila são disponibilizados comercialmente através de Biosynth International, Naperville, IL. Também adequados são substratos de fluoresceína, substratos de rodamina, e substratos de resorufina. Nenhuma fonte comercial é conhecida para esses três substratos mas os componentes são disponibilizados por Sigma Chemical, St.Louis, MO.

Apesar de exemplos específicos de substratos adequados para uso com a presente invenção terem sido enumerados aqui acima, tais não devem ser considerados como limitantes da invenção de nenhuma maneira. Ao contrário, um perito na técnica pode usar a Tabela IV e V aqui abaixo para identificar um número virtualmente ilimitado de substratos.

Preparação do Meio de Teste O meto de teste é formado pela combinação dos substratos desejados com um meio de base nutriente. O meio de base nutriente pode ser qualquer meio de cultura conhecido na técnica por fornecer a manutenção e reprodução de células vivas. Geralmente, tais meios incluem nutrientes, tampões, água e às vezes um agente gelificante. Agentes gelificantes possíveis incluem ágar, pectinas, carragenanas, alginatos, alfarrobas e xantinas, entre outros. 0 seguinte é um exemplo da preparação de um meio de teste adequado para uso nessa invenção. Esse exemplo coincide com o Exemplo I abaixo.

Os substratos 8-hidroxiquinolina~p-D-glicuronídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo e 6-cloro-3-indolil-f3-D-galactopiranosí-deo são adicionados em quantidades de 250 mg/L de meio; 70 mg/L de mei-o; e 175 mg/L de meio, respectivamente. Os substratos são adicionados diretamente ao meio quente (75° - 85°C) (fórmula abaixo) em um misturador antes da esterilização.

Meio de ágar padrão pode ser feito pela adição de 15 gm de goma de ágar de qualidade bacteriológica à seguinte fórmula nutriente Condensado Pancreático de Caseína 5,0 gm Extrato de levedura 3,0 gm Fosfato de dipotássio ,3 gm Água desionizada ,990 ml Citrato de Amônio Férrico 800 mg em 10 mi de água deionizada (esterilizado separadamente dos outros componentes) e então esterilizado em 121°C por 15 minutos. O meio deve ser ajustado para resultar em pH de 7.0. O meio de ágar esterilizado e deixado cair para uma temperatura de 45°C em um banho de água e então a solução estéril contendo os substratos preparada como descrito acima é adicionada. O meio é completamente misturado e derramado em placas de petri estéreis em um volume de 20 ml/placa.

Um meio de teste à base de pectina pode ser preparado usando as mesmas etapas descritas acima exceto que 25 gm de pectina com pouco metoxila é usada como agente solidificante e o meio é derramado em temperatura ambiente em placas de petri contendo uma fina camada de gel contendo íons de cálcio que se combina com a pectina para formar um gel sólido. Um meio de cultura de pectina adequado é descrito na Patente U.S. N° 4.241.186 e Patente U.S. N° 4.282.317, as descrições das quais estão incorporadas aqui por referência. Um meio à base de pectina é preferido sobre um meio de ágar padrão porque ele tem as vantagens de conveniência e independência de temperatura para o usuário. O uso de meios de pectina está bem descrito e aceito como um resultado de estudos colaborativos de AOAC e outras investigações publicadas e internas.

Um meio de pectina adequado é comercialmente disponibilizado por Micrology Laboratories, LLC sob a marca registrada Easygel®. Meio de base aquosa sem agente gelificante é disponibilizado por Micrology Labs, Goshen IN., para uso com filtros de membrana.

Inoculação do Meio de Teste com a Amostra O meio de teste pode ser inoculado com uma amostra a ser testada para a presença de microrganismos por qualquer método conhecido na técnica para inoculação de um meio com uma amostra contendo microrganismos. Por exemplo, a amostra a ser testada pode ser adicionada às placas de petri antes da adição do meio de base nutriente (técnica "pour plate") ou espalhadas sobre a superfície das placas após elas terem sido congeladas e solidificadas (swab ou técnica de estriar a placa). Amostras líquidas também podem ser filtradas através de um filtro de membrana de microporo (,45 mi-crometros de tamanho) que é então colocado sobre a superfície de um meio sólido ou sobre uma almofada saturada com o meio.

Incubação do Meio de Teste O meio de teste inoculado é incubado por um tempo suficiente e em uma tal temperatura para que os microrganismos individuais presentes na amostra cresçam em colônias detectáveis. Condições adequadas de incubação para o crescimento de microrganismos em um meio são conhecidas na técnica. Comumente, o meio de teste é incubado por cerca de 24-48 horas em uma temperatura de cerca de 30°-40°C. Menos tempo de incubação pode ser necessário, tal como cerca de 14 horas, para se obter resultados para um substrato fluorescente. A menos que inibidores da população microbiana em geral sejam usados, a popuiação microbiana em geral assim como coliformes em geral, E. coli, Aeromonas spp., Salmonelía spp. e Shigella spp. crescerão no meio de teste incubado. Como os precipitados formados são insolúveis (ex- ceto para os substratos fluorogênicos) no meio de teste, eles permanecem na vizinhança imediata dos microrganismos produtores das várias enzimas. Conforme os microrganismos se reproduzem para formar colônias, as colônias se mostram como unidades formadoras de colônias que tem a cor produzida pelo substrato em particular.

Por exemplo, E. coli produz β-galactosidase e a-galactosidase mas, diferente dos coliformes em geral e Aeromonas spp., também produzem β-glicuronidase. Portanto, precipitados insolúveis de cada substrato de β-galactosidase, substrato de a-galactosidase e substrato não-cromogênico de β-glicuronídeo são formados pela ação das respectivas enzimas tal que as colônias de E. coli se mostram como uma cor substancial mente preta, às vezes tendo um halo violeta azulado em torno delas.

Coliformes em geral produzem β-galactosidase e a-galactosidase e consequentemente clivam ambos os substratos de β-galactosidase e α-galactosidase. No presente exemplo, o substrato de 5-bromo-4-doro-3-indolil- α-D-galactosídeo produz uma cor azul esverdeada ou cor cerceta, enquanto que 6-cloro-3-indolí(- β-D-galactosídeo produz um cor rosa ou vermelho-rosa. Dessa forma, colônias de coliformes em geral se mostrarão com uma coloração azul-violeta, que é a combinação das cores produzidas por cada um dos a- e β-galactosídeos respectivamente.

Significativamente, entretanto, foi descoberto que Aeromonas spp., que são intimamente relacionadas aos coliformes e dão um padrão de teste bioquímico quase idêntico, são β-galactosidase positivas e a-galactosidase negativas, isto é, Aeromonas spp. não hidrolisarão o substrato de α-gaíactosídeo. Portanto, colônias de Aeromonas no meio de teste se mostrarão como colônias que tem a cor rosa-avermelhada produzida pelo substrato de β-galactosídeo.

Adicionalmente, foi descoberto que membros do gênero Salmo-nella são positivos para α-galactosidase, mas negativos para β-galactosidase. Isto é, Salmonella não hidrolisará o substrato de β-galactosidase. Portanto, colônias de Salmonella presentes no meio de teste aparecerão com uma coloração cerceta ou azul-esverdeada produzida pelo substrato de α-galactosídeo.

Exame do Meio de Teste e Contagem de Microrganismos Os substratos selecionados para o exemplo acima produzem três cores distintas e coliformes em geral são indicados por uma quarta cor que é a combinação de duas das três cores. Isto é, colônias de E. coli se mostram substancialmente pretas, colônias de coliformes em geral se mostram como violeta-azuladas, colônias de Aeromonas se mostram vermelho-rosa e colônias de Salmonella se mostram verde cerceta. Embora as tonalidades dessas cores possam variar de alguma forma no meio de teste devido a fatores tais como variação de produção enzimática das entidades biológicas, foi descoberto que essas quatro cores são distintas o suficiente para que a confusão entre elas seja improvável.

As colônias de cada tipo de microrganismo podem ser contadas pela contagem de colônias ou por outros métodos conhecidos na técnica para contagem de microrganismos em uma placa de teste. O número de colônias de cada tipo geralmente indica o número de microrganismos de cada tipo originalmente presentes na amostra antes da incubação.

Ingredientes Opcionais Inibidores O método da presente invenção não requer inibidores. Entretanto, o meio pode ser feito mais seletivo para coliformes em geral e E. coli se desejado pela adição de vários compostos que são inibitórios para a população microbíana em geral, mas tem pouco efeito sobre coliformes. A seguir estão alguns compostos que podem ser usados: a) sais biliares, cerca de 0,3 g/litro; b} lauril sulfato de sódio, cerca de 0,2 g/litro; c) desoxicolato de sódio, cerca de 0,2 g/litro; d) Tergitol 7, cerca de 0,1 ml/litro. O uso de um ou mais desses compostos reduz a presença dos microrganismos de fundo (não coliformes) e torna a placa menos confusa e elimina a possibilidade de inibição ou interferência pelos organismos não-coliformes na amostra. O uso de certos antibióticos pode alcançar o mesmo resultado.

Cefsulodina é comumente usada em meios de teste disponíveis atualmente para inibir Aeromonas spp. Entretanto, o uso de cefsulodina co- mo um inibidor requer uma etapa extra no processo, vii., adição estéril de antibiótico esterilizado em filtro. Essa etapa é difícil de controlar. Adicionalmente, a presença de cefsulodina reduz significativamente a vida útil efetiva do meio. Foi descoberto que o ácido nalidíxico pode ser usado ao invés de Cefsulodina para inibir Aeromonas spp. com quase a mesma eficácia. O ácido Nalidíxico é preferível porque pode resistir a aproximadamente 120°C de temperatura atingida pela autoclavação do meio de teste. Portanto, diferente da cefsulodina, o ácido nalidíxico pode ser adicionado ao meio de teste como parte da formulação inicial dos meios antes da esterilização (veja, preparação do meio de teste, acima). Também segue que a resistência do ácido nalidíxico a condições ambientais desfavoráveis resultará em uma vida útil mais prolongada para um meio que o contem quando comparado com cefsulodina.

Indutores É possível que a produção enzimática dos coliformes em geral seja aumentada pela adição às formulações de meio de quantidades muito pequenas de substâncias conhecidas como indutores de enzimas. Um indutor específico para β-galacíosidase está disponível e é conhecido quimica-mente como isopropil-p-tiogalactopiranosídeo. A adição de aproximadamente 100 mg/litro de meio tem um efeito positivo e notável sobre a velocidade de produção de enzima para algumas espécies de coliformes. Outros indutores enzimáticos estão disponíveis e podem ser adicionados às formulações de meios se o aumento da produção de enzima é julgado útil.

EXEMPLOS

Listados abaixo estão exemplos amplos de combinações de substrato enzimático de meios de teste a serem usadas em combinação com a fórmula nutriente discutida acima ou outras fórmulas nutrientes adequadas que podem ser preparadas na prática da presente invenção. A Tabela III ilustra a flexibilidade das modalidades preferidas que incorporam a presente invenção. A Tabela III é uma matriz de algumas das possíveis combinações de quatro cores disponíveis para as entidades biológicas preferidas E. coli, coliformes em geral e pelo menos um dos gêneros Aeromonas ou Salmonella a serem detectadas pelo uso dos ensinamentos dessa descrição. Outras combinações de cores são possíveis. Em muitos casos, vários substratos diferentes obterão um resultado desejado, a única diferença sendo as cores detectadas para uma enzima específica. A escolha da cor preferida para detecção de E. coli está assinalada com um asterisco na Tabela III, dependendo das cores escolhidas para detectar outros micror-ganismos. Como discutido acima, outros substratos cromogênicos não interferem com a cor substancialmente preta e a cor substancialmente preta é fácil de distinguir das outras cores.

Como discutido acima, o uso da Tabela III requer levar em consideração o efeito da cor combinada discutido acima que é produzido pela inclusão de múltiplos substratos cromogênicos em um único meio. Por e-xemplo, com referência a primeira entrada na Tabela III, deve ser entendido que coliformes em geral aparecerão como uma combinação de (1) vermelho-rosa (magenta) e (2) cerceta, a cor resultante sendo azul-violeta. Esse é o caso porque coliformes em geral são responsivos a dois substratos cromogênicos. Similarmente, coliformes em geral se mostrarão em um meio de teste de acordo com a segunda entrada da Tabela III como uma combinação de (1 )vermelho-rosa (magenta) e (2) amarelo.

TABELA III

Possibilidades de cor para detecção dos microrganismos preferidos Continuação "Shigella também pode se mostrar com essa cor. A Tabela IV é uma lista parcial de padrões enzimáticos para as entidades biológicas preferidas para serem detectadas de acordo com os ensinamentos dessa descrição. Deve ser compreendido que um perito na técnica poderá reconhecer prontamente que outras enzimas que são conhecidas e que foram produzidas, e enzimas que são conhecidas apenas em um nível teórico, também poderão funcionar satisfatoriamente.

TABELA IV

Tabela V é uma matriz que ensina uma grande variedade de substratos e suas cores associadas para uso em meios de teste de acordo com os ensinamentos dessa descrição. O lado esquerdo da Tabela V indica a cor que resultará quando o componente cromogênico listado é clivado a partir de seu substrato correspondente pela enzima específica para esse substrato. No caso de componentes não-cromogênicos, a cor é substancialmente preta e o mecanismo de reação depende da presença de íons de um sal na divagem do substrato, como explicado acima.

Enzimas de teste que são produzidas por certas entidades biológicas (veja Tabela IV) são encontradas no lado direito da tabela V. "Componentes de substrato" são mostrados à esquerda das enzimas de teste específicas. Cada um dos componentes do substrato listado no lado direito da tabela V pode ser combinado com quaisquer dos componentes cromogênico ou não-cromogênico listados no lado esquerdo da Tabela V para identificar um substrato específico para uso em um meio de teste. Deve ser entendido portanto, que a Tabela V ensina uma grande quantidade de substratos possíveis para uso de acordo com a presente invenção. Muitos dos substratos identificados peio uso descrito acima da tabela V estão comercialmente disponíveis, enquanto o método para produzir outros substratos identificados é descrito na literatura. Ainda outros substratos identificados peio uso da tabela V são apenas teoricamente possíveis.

Componentes não-cromogênicos estão incluídos na parte inferior esquerda da Tabela V, e são diferentes dos componentes cromogênicos por que eles não formam cores específicas na divagem. Ou seja, componentes de quinolina ou esculetina se combinam Gom íons de um sal (por e-xemplo, sal férrico) que devem estar presentes no meio quando o substrato é clivado pela enzima específica. O precipitado substancialmente preto formado pelos componentes não-cromogênicos é uma combinação do complexo de quinolina ou esculetina- ferro ao invés do dímero que ê formado pelos componentes cromogênicos.

Diferentemente dos componentes não-cromogênicos, os componentes cromogênicos devem ser selecionados em vista de todos os outros componentes cromogênicos selecionados para o meio e em vista dos padrões enzimáticos das entidades a serem detectadas. A seleção e a concentração de componentes cromogênicos devem maximizar a distinção entre as respectivas cores produzidas.

Embora muitas possibilidades de componentes cromogênicos e componente de substrato/enzíma sejam ensinadas pela Tabela V, outras possibilidades dentro do escopo das reivindicações anexas serão possíveis para um versado na técnica. Por exemplo, como mostrado na Tabela V, um versado na técnica podería combinar um grupo N-acetila com vários dos a-çúcares dos componentes de substrato listados na Tabela V. Por exemplo, um grupo N-acetila podería ser combinado com β-D-manopiranosídeo para formar N-acetila- β-D-manosaminida, a enzima correspondente sendo N-acetil- β-D-manosaminidase. Qualquer um dos componentes cromogênicos ou componentes não-cromogênicos listados no lado esquerdo da Tabela V poderíam então ser combinados com o componente de substrato para identificar um substrato. Se o substrato é comerciaímente disponível ou se o método de produzi-lo é conhecido, o substrato podería ser usado em um meio de teste. Na cíivagem do substrato pela enzima correspondente no meio de teste, a cor listada aparecerá.

Geralmente, os ensinamentos dessa descrição podem ser usados como se segue para fazer um meio de teste para detecção de vários microrganismos ou tipos celulares. Primeiro, os microrganísmos que se deseja detectar e diferenciar são seíecíonados. Os organismos preferidos para serem detectados são E. coli, coliformes em geral, e pelo menos um dos gêneros Aeromonas ou Salmonella. Enzimas produzidas pelos organismos selecionados podem ser identificadas com referência à Tabela IV. Equipado com o conhecimento das enzimas específicas produzidas por cada micror-ganismo, pode-se então identificar os componentes do substrato correspondentes a partir do lado direito da Tabela V. Dependendo da cor desejada, pode-se selecionar um componente cromogênico ou não-cromogênico a partir da Tabela V para ser combinado com o componente de substrato para identificar um substrato para inclusão no meio de teste. Se o substrato identificado dessa maneira está comercialmente disponível ou se o método de sua síntese é conhecido, o substrato pode ser usado no meio de teste.

TABELA V

Matriz de Componente de Cor e Componente de Substrato Continuação Tabela VI é um número conciso dos exemplos específicos. TABELA VI Sumário dos Exemplos Continuação Continuação Continuação *Shigelle também pode ser indicada com essa cor EXEMPLO I

Os microrganismos escolhidos para serem identificados, quantificados e diferenciados são E. coli, coliformes em geral, Aeromonas e/ou Salmonetta.

Com referência à Tabela IV, E. coli produz a enzima Bgluc e B-gluc não é produzida por nenhum dos outros microrganismos que se deseja detectar. Com referência ao lado direito da Tabela V, pode ser visto que a enzima de teste Bgluc tem um componente de substrato correspondente de β-D-glicuronídeo. Dessa forma, um componente cromogênico ou não-cromogênico que produz uma cor distinta na clívagem de Bgluc deve ser escolhido a partir do lado esquerdo da Tabela V. 8-hidroxiquinolina é escolhido por sua cor substancialmente preta preferida. O primeiro substrato i-dentífícado é portanto 8-hídroxiquinolina- β-D-glicuronídeo, a disponibilidade do quai é descrita acima. Um sal metálico tal como citrato de amônio férrico também é necessário e é adicionado ao meio de teste de maneira que, na divagem do substrato por Bgluc, um complexo substancialmente preto insolúvel em água se forma no meio. O precipitado substancialmente preto consiste nos íons férricos e de aglicona liberada quando o substrato é hidrolisa-do pela glicuronidase da E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu são comuns a Aeromonas e coliformes em geral. Entretanto, como indicado na Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu não são produzidas geralmente por Salmonella. Portanto, um componente de substrato que corresponde a uma de Bgal, Bfuc e Bglu pode ser selecionado a partir do lado direito da Tabela V. Bgal e o componente de substrato associado β-D-galactopiranosídeo são escolhidos. O componente cromogênico 6-cJoro-3-indoJil- produz um cor vermelho-rosa na divagem de seu substrato na presença de Bgal e é selecionado como o componente cromogênico. O segundo substrato é portanto 6-cloro-3-indolil- β-D-galactopiranosídeo.

Novamente se referindo a Tabela IV, Bman, Aara e Agal são comuns a Salmonella e coliformes em geral. Entretanto, como indicado na Tabela IV, Bman, Aara e Agal não são produzidas por Aeromonas. Dessa forma, uma de Bman, Aara e Agal podem ser escolhidas e seu componente de substrato associado identificado com referência à Tabela V. A enzima de teste Agal e o respectivo componente de substrato a-D-galactopiranosídeo são escolhidos. A seguir, um componente cromogênico deve ser selecionado a partir da Tabela V. Como mostrado no lado esquerdo da Tabela V, o componente cromogênico 5-bromo-4-doro-3-indo)i! produz uma cor cerceta na clivagem a partir de seu substrato associado e é portanto selecionado.O terceiro substrato é portanto 5-bromo-4-cloro-3-indo!i)-a-D-ga!actopiranosí-deo.

Coliformes em geral tem um amplo padrão enzimático que é res-ponsivo a tanto ao substratos 6-cloro-3-indolil- β-D-galactopiranosídeo como ao substrato de 5-bromo-4-c!oro-3-indolil-a-D-ga!actopiranosídeo. Portanto, coliformes em geral se mostrarão como uma quarta cor distinta que é uma combinação das cores produzidas peios dois substratos acima mencionados, respectivamente. Nesse caso a quarta cor poderá ser violeta-azulado, que é uma combinação de vermelho-rosa e cerceta.

Finalmente, como visto na Tabela IV, E. coli também exibe um amplo padrão enzimático e responsivo a todos os três substratos escolhidos nesse exemplo, viz., 8-hidroxiquinolina- β-D-glicuronídeo, 6-cloro-3-indolil- β-D-galactopiranosídeo e 5-bromo-4-c!oro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo. Contudo, colônias de E. coli presentes no meio de teste se mostrarão com uma cor substancialmente preta porque, como discutido acima, os substratos cromogênicos não interferem com a cor substancialmente preta. Vantajosamente, essa cor substancialmente preta fornece um meio superior para distinguir E. coli, assim como permite que quatro microrganismos separados sejam identificados, quantificados, diferenciados e identificados em um único meio de teste. Veja Tabela VI.

EXEMPLO II

Os microrganismos para serem detectados, quantificados, diferenciados e identificados são E. coli como uma primeira cor; coliformes em geral e Salmonella como uma segunda cor; e Aeromonas com uma terceira cor.

Com referência a Tabela IV, E. coii produz a enzima Bgluc e B-gluc não é produzida por qualquer outro microrganismo desejável de ser detectado. Com referência ao lado direito da Tabela V, pode ser visto que a enzima de teste Bgluc tem um componente de substrato correspondente de β-D-glicuronídeo. Assim, um componente cromogênico ou não-cromogênico que produz uma cor distinta após divagem de Bgluc deve ser escolhido a partir do lado esquerdo da Tabela V. 8-hidroxiquinolina é escolhida por sua cor substancial mente negra preferida. O primeiro substrato identificado é portanto 8-hidroquinolina- β-D-glicuronídeo, cuja disponibilidade está descrita acima. Um sal metálico tal como citrato de amônio férrico também é necessário e é adicionado ao meio de teste tal que, após a divagem pro Bgluc, um complexo substancialmente negro insolúvel em água se forma no meio. O precipitado substancialmente negro de íons férricos e aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV. Bgal, Bfuc e Bglu são comuns a Aeromonas e coliformes em geral. Entretanto, como indicado na Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu não são produzidas por Salmonella. Usando a Tabela V no aspecto descrito acima, 6-cloro 3-indolil- β-D-galactopiranosídeo é selecionado como o segundo substrato, o qual produzirá uma cor vermelho-rosada após a divagem como indicado pelo componente cromogênico listado na Tabela V.

Como visto na Tabela IV, a enzima Bman é comum a Salmonella mas não a Aeromonas. A partir da Tabela V, o componente de substrato associado com Bman é β-D-manopiranosídeo. Nesse exemplo, é desejável produzir também a segunda cor distinta (vermelho-rosada) com Salmonella, tal que, em última análise, colônias de Salmonella presentes no meio mostrarão a mesma cor que coliformes em geral presentes no meio. Assim, o componente cromogênico é 6-cloro-3-indolil- e o terceiro substrato é portanto 6-cloro-3-indolil- β-D-manopiranosídeo.

Nesse exemplo, usando novamente a Tabela V, um quarto substrato é identificado que irá ser clívado por uma das enzimas Bman, Aara e Agal comuns a Salmonella para produzir uma terceira cor distinta. Usando a Tabela V no aspecto descrito acima, o quarto substrato selecionado é 5-bromo-4-c!oro-3-indolil-a-D-galactopiranosrdeo, que produz: uma cor cerceta-verde na presença de Agal comum a Salmonella.

As cores resultantes das colônias presentes no meio de teste podem ser preditas como se segue. E. coli exibe um amplo padrão enzimáti-co que é positivo para todos os quatro substratos escolhidos nesse exemplo, incluindo o substrato 8-hídróxí-giícuronídeo que produz uma cor substancí-almente negra após divagem na presença de íons de sal férrico. As colônias de E. coli se mostram como substancialmente negras. Aeromonas tem um padrão enzimático que reage apenas com o substrato 6-cloro-3-indolíl- β-D-galactopiranosídeo escolhido nesse exemplo e portanto colônias de Aeromonas se mostram vermelho-rosadas. Salmonella tem um padrão enzimátí-co que cliva ambos o terceiro e quarto substratos selecionados nesse exemplo e portanto colônias de Salmonella se mostram púrpuro-azuladas (uma combinação de cerceta e vermelho-rosado). Frnalmente, coliformes em geral são positivos para cada um dos segundo, terceiro e quarto substratos selecionados e as colônias desses se mostram púrpuro-azuladas, indistinguíveis das colônias de Salmonella. Como discutido acima, cepas diferentes de todas as espécies dos vários gêneros não produzirão todas as mesmas quantidades das várias enzimas, assim aqui pode haver discretas variações de tonalidades de púrpuro-azulado, por exemplo.

EXEMPLO IIIA

Os microorganismos selecionados para serem quantificados e diferenciados nesse exemplo são E. coli como uma primeira cor, coliformes em geral e Aeromonas como uma segunda cor, e Salmonella como uma terceira cor.

Com referência à Tabela IV, E. coli produz a enzima Bgluc, e Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos que se deseja detectar. Com referência ao lado direto da Tabela V, pode ser visto que a enzima teste Bgluc tem um componente de substrato correspondente de β-D-glicuronídeo. Dessa forma, um componente cromogêntco ou não-cromo-gênico que produz uma cor distinta na clivagem de Bgluc deve ser escolhido a partir do lado esquerdo da Tabela V. 8-hidroxiquinolina é escolhida por sua cor substancialmente preta preferida. O primeiro substrato identificado é portanto 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo, a disponibilidade do qual é descrita acima. Um sal metálico tal como citrato de amônio férrico também é necessário e é adicionado ao meio de teste dessa forma, na divagem do substrato por Bgluc, um complexo insolúvel em água subsíancialmente preto se forma no meio. O precipitado substancialmente preto consiste em íons férricos e a aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase da E. coli.

Usando as tabelas IV e V de uma maneira similar àquela descrita acima com relação aos Exemplos I e II, 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactopi-ranosídeo é selecionado como um segundo substrato para combinar com uma das enzimas Bgla. Bfuc e Bglu comuns a colíformes e Aeromonas, mas negativa para Salmonella para produzir uma segunda cor distinta, nesse caso substancialmente vermelho-rosa.

Similarmente, 6-Cloro-3-indolil-a-D-galactopÍranosídeo é selecionado como um terceiro substrato para combinar com Agal, que é comum aos coliformes de Salmonella, mas negativo para Aeromonas. Na reação com a enzima, esse substrato irá produzir a mesma segunda cor distinta, isto é, vermelho-rosa. 5-Bromo-4-Cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo é selecionado como um quarto substrato para combinar com a enzima Bgal, que é comum a coliformes e Aeromonas, mas negativa para Salmonella. Esse quarto substrato produz uma cor verde-cerceta ao reagir com Bgal.

As cores resultantes de colônias presentes no meio de teste podem ser previstas como segue: E. coli exibe um amplo padrão de enzimas e é positiva para todos os quatro substratos escolhidos nesse exemplo. Portanto, colônias de E coli se mostrarão como substancialmente pretas. Colônias de coliformes em geral têm um padrão de enzimas que é positivo para o segundo, terceiro e quarto substratos dessa forma, as colônias de coliformes em geral se mostram como roxo-azulado. Colônias de Aeromonas tem um padrão de enzimas que é positivo para o segundo e quarto substratos esco- Ihidos, desta forma, colônias de Aeromonas também se mostram como roxo-azulado. Finalmente, as enzimas comuns a Safmoneífa são positivas apenas para o terceiro dos quatro substratos, desta forma colônias de Salmonella se mostram como vermelho-rosa.

EXEMPLO IIIB

Como uma variação, o meio de teste do Exemplo fIIA pode ser preparado tal que colônias de Salmonella se mostrarão como cerceta ao invés de vermelho-rosa, todas as outras cores de colônia sendo as mesmas que no Exemplo MIA. Com referência à Tabela VI, isso pode ser realizado pela substituição de 3-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosidase do Exemplo IIIA por 5-bromo-4-Cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo.

EXEMPLO INC

Um segundo método independente para produzir as mesmas três cores que o Exemplo IIIA para os mesmos quatro componentes pode ser alcançado pela adição de ácido nalidíxico ou outros antibióticos ou inibidores de Aeromonas aos componentes listados no Exemplo 1. Ao fazer isso, a cefsulodina ou ácido nalidíxico ou outra substância age como um inibidor para Aeromonas para que colônias de Aeromonas não cresçam. Se Aeromonas é eliminado, então as colônias roxo-azuladas são todas de coliformes verdadeiros. Se não eliminados, qualquer Aeromonas será contado como parte dos coliformes que algumas pessoas podem preferir já que Aeromonas é um importante organismo indicador.

EXEMPLO IV

Nesse exemplo, os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli, coliformes e Salmonei-fa como uma primeira cor distinta e Aeromonas como uma segunda cor distinta. Um meio de teste que alcança esse resultado é o meio de teste descrito no Exemplo II, exceto que o primeiro substrato e sal metálico são omitidos. Dessa forma, devido ao padrão de enzimas de E. coli reagir com os mesmos substratos que o padrão de enzimas para coliformes em geral, E. coli e coliformes em geral terão a mesma cor nesse meio de teste. Especificamente, colônias de E. coli, coliformes e Salmonella se mostrarão como uma cor roxo-azutada, enquanto colônias de Aeromonas se mostrarão como uma cor substancialmente vermelho-rosa.

EXEMPLO V

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli, coliformes e Aeromonas como uma primeira cor distinta, e Saímoneífa como uma segunda cor distinta. Um meio de teste que alcança esse resultado é o meio de teste do Exemplo 3 com o primeiro substrato e sa! metálico sendo omitidos. Nesse meio de teste, colônias de E. coli, coliformes em geral e Aeromonas se mostrarão como uma cor geralmente roxo-azulada, enquanto colônias de Saímoneífa se mostrarão como uma cor geralmente verde-cerceta ou como uma cor vermelho-rosa. Opcionalmente, o 6-Cloro-3-indo!il-a-D-galactosídeo pode ser substituído com 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactosídeo para que colônias de Salmo-nella se mostrem como cerceta, ao invés de rosa.

Uma terceira maneira de aicançar o mesmo resultado é com um antibiótico, preferivelmente ácido nalidíxico, para inibir o crescimento de colônias de Aeromonas, se Aeromonas é eliminado, então as colônias roxo-azuladas são todas de coliformes verdadeiros. Se não eliminado, qualquer Aeromonas será contado com parte de coliformes o que algumas pessoas podem preferir já que Aeromonas é um importante organismo indicador. EXEMPLO VI

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli e coliformes como uma primeira cor distinta, Aeromonas como uma segunda cor distinta e Saímoneífa como uma terceira cor distinta. Um meio de teste que alcança esse resultado é o meio de teste do Exemplo I com o primeiro substrato e sal metálico sendo omitidos. Em tal meio de teste, colônias de E. coli e coliformes em geral se mostrarão como roxo-azulado, colônias de Aeromonas se mostrarão geralmente como vermelho-rosa, e colônias de Salmonella se mostrarão geralmente como verde-cerceta.

EXEMPLO VII

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quan- tíficados e diferenciados são E. coli como uma primeira cor distinta que é substancialmente preta; coliformes em geral como uma segunda cor distinta que é substancialmente roxo-azulada; Aeromonasl Vibrio! Plesiomonas como uma terceira cor distinta que é substancialmente vermelho-rosa, e Sal-monella como uma quarta cor distinta que é substancialmente verde-cerceta.

Com referência à Tabela IV, E. coli produz a enzima Bgfuc, e Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos que se deseja detectar. Portanto, um substrato que produz uma cor distinta na divagem de Bgluc deve ser escolhido a partir da Tabela V. 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo produz uma cor substancialmente preta na presença de B-gluc e seria a cor preferida do substrato, como explicado abaixo, üm sal metálico tal como citrato de amônio férrico também é adicionado para formar um complexo substancialmente preto insolúvel que consiste em íons férricos e a aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase de £ coli.

Com referência adicional à Tabela IV, pode ser visto que a enzima Ngal e Naglu são comuns aos microorganismos Aeromonas, Plesiomonas, e Vibrios. Portanto, um substrato adequado para testar todos esses microorganismos como uma única cor distinta é 6-cloro-3-indolil-N-acetil-p-D-galactosaminida, que produz uma cor substancialmente vermelho-rosa na presença dessas enzimas.

Novamente se referindo à Tabela IV, Bman, Aara e Agal são comuns a Salmonella e coliformes em geral. Entretanto, como indicado na Tabela IV, Bman, Aara e Agal não são produzidas por Aeromonas. Portanto, um substrato pode ser selecionado a partir da Tabela V que reage com um de Bman, Aara e Agal para produzir uma terceira cor distinta. Como mostrado na tabela V, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactosídeo produz uma cor verde-cerceta na presença de Agal e é portanto selecionado como um substrato.

Nesse meio de teste, colônias de £ coli se mostrarão como substancialmente pretas, colônias de coliformes em geral se mostrarão como substancialmente roxo-azuladas, colônias de Aeromonas, Vibrio e Plesi- omonas se mostrarão como substancialmente vermelho-rosa, e colônias de Salmonella se mostrarão como substancialmente cerceta.

EXEMPLO VIII

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados são E. coli como uma primeira cor distinta; colifor-mes e Salmonella como uma segunda cor distinta; e Aeromonas, Vibrio e Plesiomonas como uma terceira cor distinta. Um meio e teste para alcançar esse resultado o meio de teste do Exemplo 2, exceto que o quarto substrato escolhido é 6-Cloro-3-indolil-N-acetil-a-D-galactosaminida, ao qual cada um dos microorganismos Plesiomonas, Vibrios e Aeromonas são responsivos para que cada uma dessas colônias se mostre como uma cor geralmente vermelho-rosa.

EXEMPLO XI

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados nesse exemplo são E. coli e coliformes em geral como uma primeira cor distinta que é roxo-azulada; Aeromonas, Plesiomonas, e Vibrios como uma segunda cor distinta que é vermelho-rosa; e Salmonella como uma terceira cor distinta que é verde-cerceta. Esse resultado pode ser alcançado com o meio de teste como descrito no Exemplo 6 com a adição de 6-Cloro-3-indolil-N-acetil-p-D-galactosaminida, ao qual cada um dos microorganismos Plesiomonas, Vibrio e Aeromonas são responsivos. EXEMPLO X

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados nesse exemplo são E. coli e coliformes em geral como uma primeira cor; Aeromonas, Vibrios e Plesiomonas como uma segunda cor distinta; e Salmonella como uma terceira cor distinta. Um meio de teste adequado que alcança esse resultado é o meio de teste divulgado no Exemplo 7 exceto que o primeiro substrato para detectar colônias de E. coli é omitido. Nesse exemplo, E. coli e coliformes em geral se mostram geralmente como roxo-azuSado, Aeromonas, Vibrio e Plesiomonas se mostram geralmente como vermelho-rosa, e Salmonella se mostra geralmente como verde-cerceta. A adição de 6-Cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo é ne- cessaria para produzir a cor roxo-azulada para as colônias de E. coli. EXEMPLO XI

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados nesse exemplo são E. coli como uma cor substancialmente preta e coliformes em geral como uma cor vermelho-rosa.

Com referência à Tabela IV, E. coli produz a enzima Bgluc, e Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos que se deseja detectar. Portanto, um substrato que produz uma cor distinta na divagem de Bgluc deve ser escolhido a partir da Tabela V. 8-hidroxiquinolina-β-D-glicuronídeo produz uma cor escura na presença de Bgluc e deveria ser a escolha preferida de substrato. Um sal metálico tal como citrato de amônio férrico também é adicionado para formar um complexo insolúvel preto que consiste em íons férricos e a aglicona liberada quando o substrato é hidroli-sado pela glicuronidase de E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu são comuns a Aeromonas e coliformes em geral. Entretanto, como indicado na Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu não são geralmente produzidos por Salmonella. Portanto, um substrato pode ser selecionado a partir da Tabela V que reage com um de Bgal, Bfuc e Bglu para produzir uma segunda cor distinta. 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo produz uma cor rosa na presença de Bgal e é selecionada com o segundo substrato.

Opcionalmente, o 6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo pode ser substituído com 5-bromo-6-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo para que colônias de Aeromonas e coliformes em geral se mostrem como cerceta ao invés de rosa.

Como observado, o segundo substrato selecionado resultará em colônias de Aeromonas também se mostrando geralmente como uma cor vermelho-rosa. Para evitar o crescimento de colônias de Aeromonas, um inibidor, preferivelmente ácido nalidíxico, é adicionado. Dessa forma, colônias de E. coli se mostrarão como uma cor substancialmente preta, enquanto colônias de coliformes em geral se mostrarão como uma cor vermelho-rosa. EXEMPLO Xll Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados nesse exemplo são E. coli, coliformes em geral e Aeromonas spp. como uma cor substancialmente preta e Salmonella spp. como uma segunda cor distinta. O primeiro substrato selecionado é 8-hidroxiquinolina-p-D-galactosídeo, que resulta em colônias de E. coli, coliformes gerais e Aeromonas se mostrando como substancialmente pretas. O segundo substrato escolhido pode ser tanto 5-Bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo ou 6-Cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo. Se o primeiro desses dois substratos é escolhido, colônias de Salmonella se mostrarão como uma cor cerceta, enquanto se o último dos substratos acima mencionados for escolhido, colônias de Salmonella se mostrarão como uma cor vermelho-rosa.

Opcionalmente, nesse exemplo, Aeromonas podem ser eliminadas pela adição de um inibidor, preferivelmente ácido nalidíxico, como discutido em detalhe acima.

EXEMPLO XIII

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados nesse exemplo são os mesmos que no Exemplo 1, exceto que esse exemplo ilustra uma correção para falsos positivos. Isto é, é possível que certos Enterobader e Klebsiella spp incomuns se mostrem como colônias pretas junto com E. coli no meio de teste descrito no Exemplo 1. Dessa forma, a contagem de E. coli poderia ser erroneamente alta.

Nesse exemplo, 4-metil-umbreliferil-p-D-xilopiranosídeo é adicionado ao meio de teste descrito no Exemplo 1. Ao fazer isso, Enterobader e Klebsiella spp. que se mostram como colônias pretas também irão fluores-cer, assim permitindo a redução na contagem falso positiva de E. coli. Esse exemplo ilustra a flexibilidade de modalidades que incorporam a presente invenção. O componente fluorescente não interfere com a cor substancialmente preta para que as colônias pretas sejam facilmente distinguidas a olho nu. Ainda, sob luz ultravioleta, falsos positivos podem ser detectados e substancialmente reduzidos pelo exame das colônias pretas por fluorescência.

EXEMPLO XIV

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados, diferenciados e identificados são E. coli como uma cor substancialmente preta e Salmonella spp. como vermelho-rosa. Coliformes em geral são incolores nesse exemplo.

Com referência ao Exemplo 1, E. coli é responsiva a 8-hidróxi-quinolina- β-D-glicuronídeo. Coliformes em geral, Salmonella e Aeromonas não são responsivas a 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo. Dessa forma, o primeiro substrato escolhido é 8-hidróxi-quinolina-p-D-glicuronídeo.

Com referência à Tabela IV, a enzima esterase é positiva para Salmonella spp. mas não para nenhum dos outros microorganismos preferidos para ser detectados. Com referência à Tabela V, o substrato 6-cloro-3-indolil-caprilato pode ser identificado, e irá produzir um cor vermelho-rosa na divagem, e é portanto escolhido como o segundo substrato.

Nesse meio de teste, colônias de E. coli se mostrarão como substancialmente pretas e colônias de Salmonella se mostrarão como vermelho-rosa.

EXEMPLO XV

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados, diferenciados e identificados são E. coli como uma cor substancialmente preta e Salmonella spp. como azul escuro -roxo, e coliformes em geral como vermelho-rosa.

Com referência ao Exemplo I, E. coli é responsiva a 8-hidróxi-quinolina- β-D-glicuronídeo. Coliformes em geral, Salmonella e Aeromonas não são responsívos a 8-hídróxi-quinolina- β-D-glicuronídeo. Dessa forma, o primeiro substrato escolhido é 8-hidróxi-quinolina- β-D-gticuronídeo.

Com referência às Tabelas IV e V, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-caprilato pode ser identificado como o segundo substrato ao qual Salmonella será responsiva. Com referência adicional à Tabela V, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-caprilato forma uma cor cerceta na divagem. 6-cloro-3-indolil-a-D-galactopiranosídeo, que produz uma cor vermelho-rosa na divagem, é escolhida como o terceiro substrato ao qual £ coli, coliformes em gera! e Salmonella são responsivos.

Nesse exemplo, colônias de E. coli se mostram como substanci-almente pretas, coliformes em geral se mostram como vermelho-rosa, e Salmonella se mostra como azul-violeta (= vermelho-rosa + cerceta). EXEMPLO XVI

Os microorganismos selecionados para serem detectados, quantificados e diferenciados nesse exemplo são E. coli como uma cor substancialmente preta e coliformes em geral como uma segunda cor distinta.

Com referência à Tabela IV, E. coli produz a enzima Bgluc, e Bgluc não é produzida por nenhum dos outros microorganismos desejados para serem detectados. Portanto, um substrato que produz uma cor distinta na divagem de Bgluc deveria ser escolhido a partir da Tabela V. 8-hidroxiquinolina-p-D-glicuronídeo produz uma cor escura na presença de Bgluc e deveria ser a escolha preferida de substrato. Um sal metálico tal como citrato de amônio férrico também é adicionado para formar um complexo preto insolúvel em água que consiste em íons férricos e a aglicona liberada quando o substrato é hidrolisado pela glicuronidase da E. coli.

Com referência adicional à Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu são comuns a Aeromonas e coliformes em geral. Entretanto, como indicado na Tabela IV, Bgal, Bfuc e Bglu não são geralmente produzidos por Salmonella. Portanto, um substrato pode ser selecionado a partir da Tabela V que reage com um de Bgal, Bfuc e Bglu para produzir uma segunda cor distinta. 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranosídeo pode ser escolhido como o segundo substrato e no caso, colônias de E. coli se mostrarão como substancialmente pretas e colônias de coliformes em geral se mostrarão como cerceta. Opcionalmente, 5-bromo-6-cloro-3-indolii-galactopiranosídeo pode ser escolhido como o segundo substrato, e no caso, colônias de E. coli aparecerão como substancialmente pretas e colônias de coliformes em geral aparecerão magenta. Para evitar crescimento de colônias de Aeromonas, um inibidor, preferivelmente ácido nalidíxico, é adicionado. Dessa forma, colônias de £ coli se mostrarão como substancialmente pretas, enquanto colônias de coliformes em geral se mostrarão como uma cor magenta.

Claims

1. Meio de teste para detectar, quantificar ou diferenciar colifor-mes em geral, Escherichia coli, Aeromonas spp e Salmonella spp., compreendendo diferentes substratos se combinam para formar cores diferentes, caracterizado pelo fato de que compreende: um substrato de β-D-glicuronídeo, que forma um primeiro produto na presença de Escherichia coli um substrato cromogênico de α-D-galactosídeo, que forma um segundo produto na presença de Salmonella·, e um substrato cromogênico de β-D-galactosídeo, que forma um terceiro produto na presença de Aeromonas, os ditos produtos dos ditos substratos de α-D-galactosídeo e β-D-galactosídeo se combinando para formar uma cor na presença de coliformes em geral, para que coliformes em geral, Escherichia coli, Aeromonas, e Salmonella sejam distinguíveis umas das outras, e em que o dito substrato de β-D-glicuronídeo e um do dito substrato cromogênico de α-D-galactosídeo ou do dito substrato cromogênico β-D-galactosídeo consistem do mesmo componente de cor, mas em quantidades diferentes.

2. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de β-D-glicuronídeo é 5-bromo-4-cloro-3-indolil^-D-glicuronídeo e o dito substrato de α-D-galactosídeo é 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-D-galactosídeo.

3. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o dito meio tem uma concentração de 125 mg/l de β-D-glicuronídeo e 65 mg/l de a-D-galactosídeo.

4. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de β-D-glicuronídeo é 5-iodo-3-indolil-β-D-glicuronídeo.

5. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de β-D-glicuronídeo é indoxil^-D-glicuronídeo.

6. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracteri- zado pelo fato de que o dito substrato de β-D-glicuronídeo produz um produto na presença de Escherichia coli que fluoresce sob luz ultra violeta, em que o referido substrato é 4-metilumbeliferil-p-D-glicuronídeo.

7. Meio de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3 ou 6, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de β-D-glicuronídeo é 4-metilumbeliferil^-D-glicuronídeo.

8. Meio de teste de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um segundo substrato de β-D-glicuronídeo, o dito segundo substrato de β-D-glicuronídeo formando um produto de cor na presença de Escherichia coli que é detectável sob luz ambiente e distinguível dos ditos outros produtos.

9. Meio de teste de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o dito segundo substrato de β-D-glicuronídeo é selecionado a partir do grupo que consiste em 8-hidroxiquinolina^3-D-glicuronídeo, uma esculetina glicuronídeo, ciclohexenoesculetina^-D-glicuronídeo, 5-bromo-4-cloro-3-indolil^3-D-glicuronídeo, 5-iodo-3-indolil^3-D-glicuronídeo, e indoxil-β-D-glicuronídeo.

10. Meio de teste de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: um meio base nutriente; e um primeiro substrato de β-D-glicuronídeo, que forma um primeiro produto na presença de Escherichia colr, um segundo substrato de α-D-galactosídeo, que forma um segundo produto na presença de Salmonella spp. ou Shigella spp.; e adicionalmente caracterizado por um terceiro substrato de β-D-galactosídeo, que forma um terceiro produto na presença de Aeromonas spp., os ditos primeiro, segundo e terceiro produtos sendo distinguíveis uns dos outros, o dito primeiro produto e o dito segundo produto incluindo o mesmo composto formador de cor, mas em quantidades suficientemente diferentes para permitir que o dito primeiro e segundo produtos sejam distinguíveis um do outro.

11. Meio de teste de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que os ditos substratos de β-D-glicuronídeo e a-D-galactosídeo incluem o componente 5-bromo-4-cloro-3-indolila.

12. Meio de teste de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o dito substrato de β-D glicuronídeo contém duas vezes a quantidade do componente 5-bromo-4-cloro-3-indolil que o substrato de a-D-galactosídeo.

13. Meio de teste de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que compreende ainda 125 mg/l de 5-bromo-4-cloro-indolil^3-D-glucoronide e 65 mg/l de 5-bromo-4-cloro-3-indolil a-D-galactosídeo.

14. Meio de teste de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, caracterizado pelo fato de que compreende um quarto substrato que também é um β-D glicuronídeo.

15. Meio de teste de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dito primeiro produto formado na presença de Escherichia coli é visível sob luz ambiente, e o dito quarto substrato produz um produto que fluoresce sob uma luz ultra-violeta na presença de Escherichia coli.

16. Meio de teste para detectar, quantificar ou diferenciar coli-formes em geral, Escherichia coli, Aeromonas, e Salmonella, o dito meio de teste compreendendo: um meio base nutriente; e um primeiro substrato de β-D-glicuronídeos, que forma um primeiro produto na presença de Escherichia coli; um segundo substrato de α-D-galactosídeo, que forma um segundo produto na presença de Salmonella·, e, adicionalmente, um terceiro substrato de β-D-galactosídeo, que forma um terceiro produto de uma terceira cor na presença de Aeromonas; e um quarto substrato de 4-metilumbeliferil^3-D-glicuronídeo, que forma um quarto produto na presença de Escherichia coli, todos os ditos produtos sendo distinguíveis uns dos outros; os ditos primeiro, segundo, e terceiro produtos sendo distinguíveis sob luz ambiente, e o dito quarto produto fluorescendo sob uma luz ultra violeta.

17. Meio de teste de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os ditos primeiro e quarto substratos são β-D-glicuronídeos, o dito segundo substrato é um α-D-galactosídeo, e o dito terceiro substrato é um β-D-galactosídeo.

18. Meio de teste de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que os ditos segundo e terceiro substratos formam os ditos segundo e terceiro produtos, respectivamente, na presença de coli-formes em geral, os ditos segundo e terceiro produtos combinados sendo distinguíveis dos ditos produtos individuais.