BRPI0513504B1 - variantes de phl p 1, seu processo de preparação, vetor, moléculas de dna, seus usos, composições farmacêuticas, e organismo procariótico - Google Patents
variantes de phl p 1, seu processo de preparação, vetor, moléculas de dna, seus usos, composições farmacêuticas, e organismo procariótico Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0513504B1 BRPI0513504B1 BRPI0513504A BRPI0513504A BRPI0513504B1 BR PI0513504 B1 BRPI0513504 B1 BR PI0513504B1 BR PI0513504 A BRPI0513504 A BR PI0513504A BR PI0513504 A BRPI0513504 A BR PI0513504A BR PI0513504 B1 BRPI0513504 B1 BR PI0513504B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- phl
- nocys
- variants
- allergen
- allergens
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 2
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims abstract description 107
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims abstract description 24
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 45
- 230000007815 allergy Effects 0.000 claims description 42
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 34
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 32
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims description 28
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 8
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 4
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 claims description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims 1
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 abstract description 45
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 abstract description 21
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 abstract description 19
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 abstract description 17
- 201000004338 pollen allergy Diseases 0.000 abstract description 17
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 abstract description 13
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 abstract description 7
- 241000825107 Hierochloe Species 0.000 abstract description 3
- 235000015466 Hierochloe odorata Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 32
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 16
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 16
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 14
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 12
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 12
- 102200080794 rs104894872 Human genes 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 102220511926 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim9_C57S_mutation Human genes 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 102200074806 rs121908869 Human genes 0.000 description 7
- 102220551520 E3 ubiquitin-protein ligase SIAH1_C72S_mutation Human genes 0.000 description 6
- 241000746983 Phleum pratense Species 0.000 description 6
- 241000209048 Poa Species 0.000 description 6
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 102220248354 rs121917768 Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 102200088234 rs786200925 Human genes 0.000 description 5
- 244000076686 Queensland pidgeon grass Species 0.000 description 4
- 235000003232 Setaria pumila ssp. pallide fusca Nutrition 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 244000052363 Cynodon dactylon Species 0.000 description 3
- 240000003857 Holcus lanatus Species 0.000 description 3
- 240000004296 Lolium perenne Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 241001136123 Phalaris aquatica Species 0.000 description 3
- 241000209049 Poa pratensis Species 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 3
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000013574 grass pollen allergen Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010010744 Conjunctivitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 1
- 101000897493 Homo sapiens C-C motif chemokine 26 Proteins 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000813258 Paspalum notatum Expansin-B Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 244000082988 Secale cereale Species 0.000 description 1
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 208000005279 Status Asthmaticus Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 102220522612 Uridine phosphorylase 1_C839S_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000013567 aeroallergen Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013572 airborne allergen Substances 0.000 description 1
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 description 1
- 208000002205 allergic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 208000024998 atopic conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000001694 hyposensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000030603 inherited susceptibility to asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- -1 substituted Chemical class 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Botany (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
variantes de alérgenos do grupo 1 de poaceae tendo reduzida alergenicidade e reatividade de células t mantida. a presente invenção refere-se à preparação e aplicação de variantes dos alérgenos do grupo 1 das poaceae (capins-doces) as quais se caracterizam por reduzida reatividade a ige comparados com os alérgenos selvagens conhecidos e ao mesmo tempo por reatividade essencialmente mantida com linfócitos t. estas variantes de alérgenos hipoalergênicas podem ser empregadas para a imunoterapia específica (hipossensibilização) de pacientes tendo alergia a pólen de capim ou para a imunoterapia preventiva de alergias a pólen de capim.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VARIANTES DE Phl P 1, SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO, VETOR, MOLÉCULAS DE DNA, SEUS USOS, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, E ORGANISMO PROCARIÓTICO".
[001] A presente invenção se refere à preparação e uso de variantes dos alérgenos grupo 1 das Poaceae (capins-doces) os quais são caracterizados por reduzida reatividade a IgE comparados com os alérgenos selvagens conhecidos e ao mesmo tempo por reatividade substancial mente mantida com linfócitos T. Estas variantes de alérgenos hipoalergênícas podem ser empregadas para a imunoterapía específica (hipossensibilização) de pacientes tendo alergia a pólen de capim ou para a imunoterapía preventiva de alergias a pólen de capim.
[002] Uma modalidade preferencial da invenção se refere a variantes do principal alérgeno Phl p 1 do pólen de capim-rabo-de-gato (Phteum pratense).
Antecedentes Da invenção [003] As alergias do tipo 1 têm importância mundial. Até 20 % da população em países industrializados sofrem de queixas tais como ri-níte alérgica, conjuntivite ou asma brônquica. Estas alergias são provocadas por alérgenos presentes no ar (aeroalérgenos) os quais são liberados por fontes de várias origens, tais como pólen de plantas, ácaros, gatos ou cachorros. Até 40 % destes pacientes sofrendo de alergia do tipo 1 por sua vez apresentam rteativídade a IgE específica com alérgenos de pólen de capim {Freidhoff et al., 1986, J. Allergy Clin. Immunol. 78: 1190-2002). As substâncias que provocam alergia tipo 1 são proteínas, gllcoproteínas ou polípeptídeos. Depois de captação através das membranas mucosas, estes alérgenos reagem com as moléculas de IgE ligadas à superfície de mastócitos em pessoas sensibiliadas. A reticulação de duas moléculas de IgE uma com a outra por um alérgeno resulta na liberação de mediadores (por exemplo, histamina, prostaglandinas) e citocinas pela célula efetora e deste modo nos sintomas clínicos correspondentes.
[004] Dependendo da freqüência relativa com a qual as moléculas de alérgenos individuais reagem com os anticorpos IgE de pacientes sofrendo de alergia, é feita uma distinção entre alérgenos maiores e menores.
[005] No caso do capim-rabo-de-gato (Phleum pratense), Phl p 1 (Petersen et ai., 1993, J. Allergy Clin. Immunol. 92: 789-796), Phl p 5 (Matthiesen and Lowenstein, 1991, Clin. Exp. Allergy 21: 297-307; Petersen et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 98: 105-109), Phl p 6 (Petersen et al., 1995, Int. Arch. Allergy Immunol. 108, 49-54). Phl p 2/3 (Dolecek et al., 1993, FEBS 335 (3), 299-304), Phl p 4 (Haavik et al., 1985, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 78: 260-268; Valenta et al., 1992, Int. Arch. Allergy Immunol. 97: 287-294, Fischer et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 189-198) e Phl p 13 (Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 324-332; Suck et al., 2000, Clin. Exp. Allergy 30: 1395-1402) foram identificados até o momento como alérgenos maiores.
[006] Os alérgenos maiores dominantes de capim-rabo-de-gato (Phleum pratense) são Phl p 1 e Phl p 5. Como os alérgenos maiores das capins da família Poaceae são altamente homólogos uns com os outros e conseqüentememte têm propriedades bioquímicas e imunológicas muito semelhantes, estas proteínas relacionadas são agrupadas juntas como alérgenos do grupo 1 e grupo 5.
[007] Os alérgenos do grupo 1 reagem com os anticorpos IgE em mais de 95 % dos pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim e portanto são os alérgenos maiores dominantes do pólen de capim.
[008] Os alérgenos do grupo 1 são glicoproteínas tendo um peso molecular de cerca de 32 kDa e estão localizados no citoplasma dos grãos de pólen. Tanto o contato dos grãos de pólen com a membrana mucosa do trato respiratório superior como também a umidificação dos grãos de pólen pela chuva levam a rápida liberação destes alérgenos. A rápida liberação dos alérgenos do grupo 1, também sob a forma de micropartículas subcelulares, permite penetração no trato respiratório inferior, o que pode resultar no início do processo de ataques de asma graves.
[009] Foram identificados os cDNAs de alérgenos do grupo 1 de Phleum pratense (Laffer et al., 1994, J. Allergy Clin. Immunol. 94: 689-698), Lolium perenne (Perez et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 1621 ΟΙ 6250), Holcus lanatus (Schramm et al., 1997, J. Allergy Clin. Immunol. 1999:781-787), Poa pratensis (Sturaro u. Viotti, 1998, NCBI GenBank, Acc. No. AJ 131850), Cynodon dactylon (Smith et al., 1996, J. Allergy Clin. Immunol. 98: 331-343), Phalaris aquatica (Suphioglu et al., 1995, Clin. Exp. Allergy 25: 853-865) e Oryza sativa (Xu et al., 1995, Gene 164:255-259).
[0010] Além destas primeiras descrições da seqüência, seqüências de alérgenos do grupo 1 adicionais as quais diferem das seqüências originais em posições individuais foram publicadas em bancos de dados. As isoformas referidas também são conhecidas para outros alérgenos de pólen de capim.
[0011] Devido a sua homologia, os alérgenos do grupo 1 dos capins-doces (Poaceae) têm alta reatividade cruzada com anticorpos de IgE humana (Laffer et al., 1996, Mol. Immunology 33: 417-426). Esta reatividade cruzada imunológica e baseia em uma seqüência de aminoácidos muito semelhante, conforme mostrado por uma comparação de seqüências de Phl p 1, o alérgeno do grupo 1 de capim-rabo-de-gato (Phleum pratense), com moléculas do grupo 1 de espécies selecionadas na figura 1.
[0012] Regiões de seqüências homólogas nos outros alérgenos do grupo 1 das Poaceae existem tanto para as regiões de seqüências da seqüência de aminoácidos Phl p 1 descritas aqui na construção de va-variantes hipoalergênicas e também para as regiões de seqüências flanqueantes das mesmas. Além disso, tanto o número como também as regiões de seqüências circundantes das cisteínas dos alérgenos do grupo 1 das Poaceae são preservadas. Devido às homologias das seqüências, os alérgenos do grupo 1 das Poaceae são classificados na família de proteínas das β-expansinas (Cosgrove D.J., 2000 Nature 407: 321-6).
[0013] Uma abordagem clássica para tratamento terapêutico eficaz de alergias é imunoterapia ou hipossensibilização específicas (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (6): 336-339: Bousquet et al., 1998, J. Allergy Clin. Immunol. 102 (4): 558-562), onde extratos de alérgenos naturais são injetados por via subcutânea no paciente em doses crescentes. No entanto, há um risco neste método de reações alérgicas ou mesmo choque anafilático. De modo a minimizar estes riscos, são empregadas preparações inovadoras sob a forma de alergóides. Estas são extratos de alérgenos quimicamente modificados os quais têm reatividade a IgE significativamente reduzida, mas reatividade de células T idêntica comparada com o extrato não tratado. Estes epitopos de células T são de crucial importância para a ação terapêutica das preparações de alérgenos em hipossensibilização (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7): 377-382).
[0014] Um maior grau de otimização da terapia seria possível com alérgenos preparados por métodos recombinantes. Coquetéis definidos de alérgenos de alta pureza preparados por métodos recombinantes, caso desejado combinados aos padrões de sensibilização individuais dos pacientes, podem substituir extratos de fontes de alérgeno naturais uma vez que o último, além dos vários alérgenos, contêm um número relativamente grande de proteínas anexas imunogênicas, mas não alergênicas.
[0015] Perspectivas realistas as quais podem resultar em hipos-sensibilização segura com produtos de expressão recombinantes são oferecidas por alérgenos recombinantes especificamente mutados nos quais epitopos de IgE são especificamente eliminados sem prejudicar os epitopos de células T os quais são essenciais para a terapia (Schramm et al., 1999, J. Immunol. 162: 2406-2414).
[0016] Um conceito diferente para hipossensibilização se baseia no fato de que uma reação imune protetora é induzida, em particular, por anticorpos lgG4 com uma ação de bloqueio. De acordo com esta hipótese, foram descritos fragmentos de Phl p 1 recombinantes os quais se diz que são adequados para indução de uma reação de lgG4 protetora (Bali et al., 1999, FASEB J. 13:1277-1290).
[0017] Este conceito é completamente diferente do conceito de variantes de alérgenos hipoalergênicos tendo reduzida reatividade a IgE e reatividade de células T mantida.
[0018] Outra possibilidade para influenciar o equilíbrio de células T auxiliares alterado em pacientes sofrendo de alergia por métodos terapêuticos é tratamento com DNA exprimível o qual codifica para os alérgenos relevantes (vacinação com DNA imunoterápico). FOi obtida confirmação experimental do efeito alérgeno-específico sobre a reação imune em roedores por injeção de DNA codificando alérgenos (Hsu et al., 1996, Nature Medicine 2 (5): 540-544).
[0019] O objeto no qual a presente invenção se baseia consistiu na provisão de novas variantes dos alérgenos do grupo 1 das Poaceae no nível de proteína e DNA os quais são diferenciados por reduzida atividade de IgE com substancial manutenção da reatividade de céluas T e são portanto adequados para imunoterapia curativa e preventiva específicas e vacinação com DNA imunoterápico.
Figuras [0020] figura 1: Alinhamento de seqüências de aminoácidos homólogas a Phl p 1 (seqüências de proteínas maduras deduzidas de seqüências de cDNA) da espécie Poaceae: Poa pratensis (Poa p), Holcus lanatus (Hol I), Lolium perenne (Lol p), Cynodon dactylon (Cyn d), Oryza sativa (Ory s) e Phalaris aquatica (Pha a), seqüências de proteínas deduzidas de seqüências de cDNA do banco de dados "Gen-Bank" do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, EUA), numeração: posições de aminoácidos de proteínas maduras, salientadas por sublinhado: aminoácidos os quais são diferentes da seqüência Phl p 1, caixa preta: cisteínas [0021] figura 2: Alinhamento de seqüências de aminoácidos de proteína selvagem Phl p1 processada e a variante Phl p1 NoCys, Phl p1 Wt (selvagem): seqüência de proteína deduzida da seqüência de cDNA (banco de dados "GenBank" inscrição Z27090 do National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, EUA), numeração: posições dos aminoácidos da proteína madura, contornadas em preto: substituições de aminoácidos de cisteína por serina na proteína Phl p 1 NoCys [0022] figura 3: Alinhamento de seqüências de aminoácidos das variantes hipoalergênicas Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys Δ213-220 e Phl p 1 NoCys δ 1-6, 115-119, 213-220, representadas a título de exemplo, numeração: posições de aminoácidos, salientada por sublinhado: eliminações [0023] figura 4: SDS-PAGE e verificação da identidade das variantes recombinantes Phl [0024] p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys Δ213-220 and Phl p 1 NoCys δ1-6, 115-119, 213-220 A: SDS-PAGE B: Western blot com anticorpos aPhl p 1 (Allergopharma) 1. Proteínas marcadoras 2. nPhl p 1* 3. rPhl p 1 Wt (- His-tag)* 4. Proteínas marcadoras 5. Phl p 1 NoCys (+ His-tag) 6. Phl p 1 NoCys D213-220 (+ His-tag) 7. Phl p 1 NoCys D1-6, 115-119, 213-220 (+ His-tag) 8. Proteínas marcadoras [0025] «Amostras reduzidas (ditiotreitol) [0026] figura 5: Teste de fita para verificação da capacidade de ligação de IgE de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys δ21 3-220 e Phl p 1 NoCys A1-6, 115-119, 213-220 sob condições não desnaturantes 1) rPhl p 1 Wt 2) Phl p 1 NoCys 3) Phl p 1 NoCys D213-220 4) Phl p 1 NoCys D1-6, 115-119, 213-220 5) rPhl p 1 Wt [0027] TP: coloração de proteína total [0028] P: soros de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim clinicamente definida [0029] figura 6: Determinação da reduzida reatividade a IgE de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys Δ213-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 por meio do teste de inibição EAST com quatro soros típicos dos pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim (P) [0030] figura 7: Determinação da hipoalergenicidade de Phl p 1 NoCys por meio do teste de ativação de basófilos com basófilos de quatro pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim (P) [0031] figura 8: Determinação da hipoalergenicidade de Phl p 1 NoCys δ21 3-220 por meio do teste de ativação de basófilos com basófilos de quatro pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim (P) [0032] figura 9: Determinação da hipoalergenicidade de Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 por meio do teste de ativação de basófilos com basófilos de quatro pacientes sofrendo de alergia a pó-pólen de capim (P) [0033] O estudo que levou às variantes encontradas foi realizado usando Phl p 1 como alérgeno modelo. Tornou-se claro a partir dos alinhamentos de seqüências mostrados na figura 1 que, devido à alta homologia dentro do grupo 1, os mesmos resultados teriam sido obtidos se o ponto de partida tiver sido outro alérgeno do grupo 1.
[0034] Portanto, também deve ser presumido que os resultados dados acima e abaixo também podem ser aplicados a Sec c 1 de Secale cereale ou teriam sido obtidos usando Sec c 1, embora a seqüência ainda seja desconhecida por este alérgeno do grupo 1.
[0035] A presente invenção portanto se refere a variantes dos alérgenos do grupo 1 das Poaceae os quais se caracterizam por reduzida reatividade a IgE comparados com os alérgenos selvagens conhecidos e por reatividade com linfócitos T mantida. Estes alérgenos do grupo 1 são preferencialmente Phl p 1, Poa p 1, Hol p 1, Lol p 1, Cyn d 1, Ory s 1 e Pha a 1 de Phleum pratense, Lolium perenne, Poa pratensis, Holcus lanatus, Cynodon dactylon, Oryza sativa e Phalaris aquatica. É dada maior preferência a Phl p 1, Poa p 1, Hol p 1, Lol p 1 ou Pha a 1 e é dada preferência muito particular a Phl p 1.
[0036] O ponto de partida para a construção das variantes hipoalergênicas dos alérgenos do grupo 1 é o cDNA da Phl p 1 selvagem, a qual foi isolada com o auxílio de iniciadores específicos por reação de cadeia polimerase (PCR) do cDNA total do pólen de Phleum pratense ("GenBank" inscrição Z27090; NCBI, Bethesda, EUA) (SEQ ID NO 1).
[0037] A seqüência de aminoácidos SEQ ID NO 2 foi deduzida da seqüência de cDNA de Phl p 1 selvagem.
[0038] Phl p 1, a qual consiste em 240 aminoácidos e é glicosilado na forma natural, é - como todos os alérgenos do grupo 1 (veja a figura 1) - caracterizado pela existência de sete cisteínas na molécula madu-madura. Com a exceção de Cyn d 1 e Ory s 1, estas posições de aminoácidos têm os números 41,57, 69s 72, 77, 83 e 139 em todos os alérgenos do grupo 1 (Petersen et al., 1995, J. Allergy Clin. Immunol 95: 987-994).
[0039] Phl p 1 foi expressada em E. coli como proteína não glicosilada. A proteína selvagem recombinante (rPhl p 1 wt) reage com anticorpos IgE de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim os quais têm reatividade com Phl p 1 purificada natural (nPhl p 1) (Petersen et al., 1998, Clin. Exp. Allergy 28: 315-321).
Descrição Detalhada da Invenção [0040] Preparação e caracterização das variantes de Phi p 1 hipoaíergênicas [0041] Iniciando a partir do cDNA de rPhl p 1 wt descrito, foram preparadas variantes recombinantes de Phl p 1 modificadas por engenharia genética.
[0042] A seqüência de aminoácidos da variante recombinante Phl p 1 NoCys (SEQ ID NO 4) tem sete resíduos serina ao invés das sete cisteínas ocorrendo na selvagem (figura 2). A variante Phl p 1 NoCys serviu como ponto de partida para a construção de vários mutantes de eliminação. Nestes, em cada caso seções individuais tendo uma extensão de 15 a 90 bp ou combinações destas seções do cDNA codificando para Phl p 1 NoCys foram eliminadas, resultando em eliminações correspondentes dos aminoácidos 1-6, 1-30, 92-104, 115-119, 175-185 e 213-220 nas cadeias de polipeptídeos das proteínas expressas em E, coü: Phl p 1 NoCys δ1-6 (SEQ ID NO 5 e 6), Phl p 1 NoCys Δ1-30 (SEQ ID NO 7 e 8), Phl p 1 NoCys Δ92-104 (SEQ ID NO 9 e 10), Phl p 1 NoCys δ1 15-119 (SEQ ID NO 11 e 12), Phl p 1 NoCys Δ175-185 (SEQ ID NO 13 e 14), Phl p 1 NoCys δ21 3-220 (SEQ ID NO 15 e 16), bem como Phl p 1 NoCys a1-6, 115-119, 213-220 (SEQ ID NO 17 e 18).
[0043] As proteínas recombinantes foram expressadas como proteínas de fusão de histidina em Escherichia coli. A caracterização imunológica foi realizada com proteínas de fusão deste tipo.
[0044] Em primeiro lugar, depois de imobilização sobre uma membrana de nitrocelulose, as variantes recombinantes foram investigadas para a capacidade de serem ligadas por anticorpos IgE de um grupo de soros típicos e por anticorpos IgE de soros individuais de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim (teste de fita). Neste método, foi observado surpreendentemente reduzida ligação de anticorpos IgE a Phl p 1 NoCys. Este resultado foi confirmado por um teste de inibição de IgE (EAST), no qual é investigada a capacidade de ligação de IgE de uma proteína não imobilizada a anticorpos IgE em solução.
[0045] A presente invenção portanto se refere, em particular, a variantes de alérgenos do grupo 1 nas quais as cisteínas nas posições dos aminoácido 41, 57, 69, 72, 77, 83 e 139 correspondentes à proteína Phl p 1 madura são removidas ou substituídas por outro aminoácido. É dada preferência particular aqui a variantes correspondentes de Phl p 1, Poa p 1, Hol p 1, Lol p 1 ou Pha a 1, em particular de Phl p 1.
[0046] Reduzida ligação de anticorpos IgE já é obtida se no mínimo duas das 7 cisteínas são removidas sem substituição ou substituídas por outro aminoácido. Preferencialmente, no entanto, todas as 7 cisteínas são substituídas por serina.
[0047] Os efeitos da reduzida capacidade de ligação de IgE de Phl p 1 NoCys sobre a ação funcional durante a reticulação de IgE ligada à membrana das células efetoras e ativação das mesmas in vitro foram investigados por meio de um teste de ativação de granulócitos basofílicos de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim. Phl p 1 NoCys apresentou ativação significativamente menor de granulócitos basofílicos aqui comparado com rPhl p 1 wt e portanto alergenicidade funcionalmente reduzida.
[0048] Os vários mutantes de eliminação preparados com base em Phl p 1 NoCys foram investigados com respeito à capacidade de ligação de IgE (teste de fita, EAST) e ação funcional (ativação de basófilos) pelo mesmo método. Surpreendentemente, os mutantes de eliminação apresentaram propriedades hipoalergênicas particularmente fortes.
[0049] A presente invenção portanto se refere além disso a variantes de alérgenos do grupo 1 nas quais - opcionalmente além das variantes descritas acima com Cys removida ou substituída - no mínimo uma região ou uma combinação de regiões as quais correspondem aos aminoácidos 1-6, 1-30, 92-104, 115-119, 175-185 e 213-220 da seqüência primária da proteína Phl p 1 madura estão faltando comparadas com o alérgeno selvagem. É dada preferência particular aqui aos mutantes de eliminação correspondentes dos alérgenos do grupo 1 Phl p 1, Poa p 1, Hol p 1, Lol p 1 e Pha a 1. É dada preferência muito particular às variantes Phl p 1 correspondentes.
[0050] É dada preferência particular, e a invenção portanto se refere do mesmo modo, às variantes de alérgenos do grupo 1 nas quais estão faltando exclusivamente os aminoácidos 213-220 ou simultaneamente os aminoácidos 1-6 e 115-119 correspondentes à seqüência Phl p 1 madura. É dada preferência ainda maior aquia aos alérgenos Phl p 1, Poa p 1, Hol p 1, Lol p 1 e Pha a 1, onde Phl p 1 é muito particularmente preferencial.
[0051] A reatividade de células T das variantes de Phl p 1 hipoalergênicas as quais formam a base para a eficácie de imunoterapia específica foi verificada in vitro por um teste de proliferação com linfócitos T específicos para Phl p 1 de pacientes so-sofrendo de alergia a pólen de capim. Os alérgenos modificados apresentaram reatividade de células T substancialmente mantida, o que permite a aplicação imunoterápica das variantes de Phl p 1 hipoalergênicas.
[0052] As variantes de alérgenos de acordo com a invenção podem ser preparadas iniciando a partir da seqüência de DNA clonada com o auxílio de métodos de engenharia genética. Em princípio, no entanto, também podem estar envolvidas modificações químicas do extrato de alérgenos nativos (Fiebig, 1995, Allergo J. 4 (7), 377-382). Modificações adicionais em diferentes positções - por exemplo de modo a aumentar a hipoalergenicidade - logicamente também são possíveis além das variações de alérgenos do grupo 1 descritas no presente requerimento de patente. Estas modificações podem ser, por exemplo, inserções de aminoácidos, eliminações e permutas, divagem da proteína em fragmentos e fusão da proteína ou fragmentos da mesma com outras proteínas ou peptídeos. A invenção se refere além disso a uma molécula de DNA, codificando para uma variante de alérgeno descrita acima, um vetor de expressão recombinante contendo esta molécula de DNA e um organismo hospedeiro transformado com a referida molécula de DNA ou o referido vetor de expressão. Organismos hospedeiros adequados podem ser organismos pró- ou eucarióticos, de célula única ou multicelulares, tais como bactérias ou leveduras. Um organismo hospedeiro o qual é preferencial de acordo com a invenção é E. coli.
[0053] A invenção se refere além disso a um processo para a preparação de uma variante de alérgeno de acordo com a invenção por cultura do referido organismo hospedeiro e isolamento da variante de alérgeno correspondente da cultura.
[0054] A presente invenção se refere adicionalmente às variantes de alérgenos, moléculas de DNA e vetores de expressão descritos acima em sua propriedade como medicamentos.
[0055] A presente invenção se refere além disso a composições farmacêuticas compreendendo no mínimo uma destas variantes de alérgenos ou uma molécula de DNA correspondente ou um vetor de expressão correspondente e opcional mente compostos ativos adicionais e/ou adjuvantes para o tratamento de alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 das Poaceae, ou para a vacinação imunoterápica de pacientes tendo alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 das Poaceae, e/ou para a prevenção de semelhantes allergias.
[0056] Se as composições farmacêuticas são do segundo tipo (compreendendo no mínimo uma molécula de DNA ou um vetor de expressão), estas composições preferencialmente compreendem além disso hidróxido de alumínio, um oligonucleotídeo contendo CpG imunoestimulador -ou uma combinação dos dois como adjuvantes.
[0057] Para os fins desta invenção, composições farmacêuticas podem ser usadas como agentes terapêuticos em medicina humana ou veterinária. Excipientes adequados são substâncias orgânicas ou inorgânicas as quais são adequadas para administração parenteral e não reagem com variantes de alérgenos do grupo 1 de acordo com a invenção. Adequadas para aplicação parenteral são, em particular, soluções, preferencialmente soluções oleosas ou aquosas, além disso suspensões, emulsões ou implantes. As variantes de alérgenos de acordo com a invenção também podem ser liofilizadas e os liofilizados resultantes usados, por exemplo, para a preparação de preparações para injeção. As composições indicadas podem ser esterilizadas e/ou compreendem adjuvantes, tais como lubrificantes, conservantes, estabilizantes e/ou agentes umectantes, emulsificantes, sais para modificar a pressão osmótica, substâncias tampão e/ou uma pluralidade de compostos ativos adicionais.
[0058] Além disso, preparações de liberação retardada podem ser obtidas por formulação apropriate das variantes de alérgenos de acordo com a invenção, por exemplo por adsorção sobre hidróxido de alumínio.
[0059] Finalmente, a presente invenção se refere à aplicação de no mínimo uma variante de alérgeno de acordo com a invenção ou de uma molécula de DNA de acordo com a invenção ou de um vetor de expressão de acordo com a invenção para a preparação de um medicamento para o tratamento de alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 das Poaceae ou para a vacinação imunoterápica de pacientes tendo alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 das Poaceae e/ou para a prevenção de semelhantes alergias.
[0060] A preparação das variantes Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys δ213-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 (figura 3) e a caracterização imunológica das mesmas é descrita abaixo a título de exemplo para as variantes de Phl p 1 hipoalergênicas com as modificações de engenharia genética descritas acima.
[0061] Expressão e purificação de variantes de Phl p 1 recombinantes [0062] As proteínas recombinantes foram expressadas como proteínas de fusão de histidina (vetor de expressão pProExHT; Invitrogen, Carlsbad, EUA) em Escherichia coli (cepa JM109). rPhl p 1 wt e as variantes foram primeiramente purificadas por ligação específica dos resíduos histidina de N-terminal a uma matriz de quelante Ni2+ (cromatografia por afinidade de íon metálico imobilizado, IMAC) e subseqüentemente por filtração por gel do preparativo (cromatografia de exclusão de tamanho, SEC). A pureza das proteínas elutriadas foi monitorada por SDS-PAGE e SEC analítica (figura 4a). A identidade das proteínas purificadas foi demonstrada por ligação de um anticorpo monoclonal específico para Phl p 1 (figura 4b).
[0063] Demonstração de reduzida ligação de IgE de variantes de Phl p 1 recombinantes [0064] Um método de teste simples para a determinação da reatividade a IgE de IgE específica dos soros de pacientes sofrendo de alergia sobre proteínas de teste ligadas a membrana é o teste de fita.
[0065] Para este fim, as substâncias de teste são ligadas lado a lado umas à outras na mesma concentração e quantidade sobre uma fita de membrana de nitrocelulose sob condições não desnaturantes. Uma série de tiras de membranas semelhantes podem ser incubadas em paralelo com diferentes soros de pacientes sofrendo de alergia. Depois de uma etapa de lavagem, os anticorpos IgE especificamente ligados são tornados visíveis sobre a membrana por meio de uma reação de cor promovida por um conjugado de IgE anti-humana/fosfatase alcalina.
[0066] Os resultados do teste de fita para Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys δ2 13-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 usando soros de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim individuais são representados aqui a título de exemplo para as moléculas de Phl p 1 modificadas descritas (figura 5).
[0067] Somente foram usados soros de pacientes sofrendo de alergia tendo um forte título de IgE contra Phl p 1 natural. Os anticorpos de IgE destes pacientes reagem do mesmo modo com o rPhl p 1 wt. equivalente recombinante.
[0068] Se torna claro que os anticorpos IgE específicos para Phl p 1 de todos os soros dos pacientes ligam a variante recombinante Phl p 1 NoCys em uma extensão reduzida, mas não o alérgeno selvagem Phl p 1.
[0069] Uma redução ainda maior na capacidade de ligação de IgE é obtida pela remoção adicional de algumas seções da seqüência, a qual é representada com referência à variante Phl p 1 NoCys Δ13-220. A variante Phl p 1 NoCys δ21 3-220 mostra uma capacidade de ligação de IgE muito grandemente reduzida com todos os soros testados de pacientes sofrendo de alergia comparada com a proteína selvagem recombinante não modificada. Uma redução adicional na capacidade de ligação de IgE de Phl p 1 a anticorpos de IgE de alguns soros pode ser obtida por combinação de uma série de eliminações, o que é evidente a partir do resultado de teste para a variante Phl p 1 NoCys δ1-6, 115-119, 213-220 com soro de paciente sofrendo de alergia a pólen de capim P14 (figura 5).
[0070] Portanto se torna evidente que tanto a substituição de cisteínas quanto também a eliminação de seções de seqüências específicas reduz a capacidade de ligação de IgE da molécula de Phl P 1- [0071] Em contraste com o teste de fita, o teste de inibição EAST (teste alergossorvente enzimático) permite a investigação de interações entre alérgenos/lgE em solução, permitindo que mascaramento interferente de epitopos da substância de teste seja basicamente excluído por imobilização sobre a membrana.
[0072] O teste de inibição EAST é realizado como se segue. Lâminas de microtítulo são revestidas com alérgenos, aqui nPhl p 1. Depois da remoção das moléculas de alérgenos não ligadas por lavagem, a lâmina é bloqueada usando albumina sérica bovina de modo a prevenir ligação não específica posterior. Anticorpos IgE de pacientes sofrendo de alergia, como um grupo de soros individuais representativos (grupo de soros) ou como soro individual, é incubado em diluição adequada com as lâminas de microtítulo revestidas com alérgenos. A quantidade de anticorpos IgE ligados a alérgenos é quantificada fotometricamente através de um conjugado anti- hlgE/fosfatase alcalina por reação de um substrato para dar um produ-produto final colorido.
[0073] A ligação dos anticorpos IgE é inibida substância-especifi-camente por um alérgeno solúvel ou a substância a ser testada (alérgeno modificado recombinante) em função da concentração.
[0074] Os resultados de teste para Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys Δ213-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 são mostrados aquis a título de exemplo para as moléculas de Phl p 1 modificadas descritas comparadas com a molécula de referência nPhl p 1.
[0075] Os testes de inibição de IgE representativos mostrados na figura 6, com quatro soros individuais de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim, mostram que foi obtida somente cerca de 20 - 50 % da ação inibitória máxima do alérgeno natural não modificado nPhl p1, mesmo com altas concentrações da variante Phl p 1 NoCys (até 5 μg/ml). A menor ação inibitória máxima indica uma perda de epitopos de IgE.
[0076] As curvas para as variantes Phl p 1 NoCys δ21 3-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 demonstram uma capacidade de ligação de IgE ainda menor destas variantes de Phl p 1. Uma ação inibitória pode não ser detectada com variação individual ou somente em uma extensão muito pequena (0 - 20 % da ação inibitória máxima).
[0077] De acordo com o resultado do teste de fita, portanto pode ser confirmado que a inserção de eliminações específicas adicionais reduz adicionalmente a capacidade de ligação de IgE de Phl p 1.
[0078] Determinação da hipoalergenicidade de variantes de Phl p 1 recombinantes pelo teste de ativação de basófilos [0079] A redução funcional na alergenicidade foi determinada in vitro por meio de um teste de ativação de basófilos. Para o teste de ativação de basófilos, sangue total heparinizado de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim é incubado com várias concentrações das substâncias de teste. As substâncias alergênicas são especificamente ligadas peloas anticorpos IgE ligados a FcsRI dos basófilos e resultam em reticulação das moléculas FcsRI.
[0080] Esta reticulação de FcsRI promovida por estimulação por IgE, induzida por alérgenos resulta em ativação dos basófilos. A ativação é aprimeira etapa na reação alérgica destas células efetoras. A transdução de sinal subseqüente resulta em desgranulação das células efetoras e portanto no início do processo das reações alérgicas in vivo.
[0081] In vitro, a ativação, induzida por alérgenos, de granulócitos basofílicos pode ser determinada por quantificação da expressão de uma proteína de superfície (CD203c) a qual é ligada a transdução de sinal da reticulação de receptores de IgE (Kahlert et al., 2003, Cli., Exp. Allergy 33: 1266-72). O número de proteínas CD203c expressadas sobre uma célula e a percentagem de células ativadas de um bolo celular é medida com alta sensibilidade através da ligação de um anticorpo monoclonal marcado por fluorescência ao marcador de superfície e análise subseqüente por citometria de fluxo ativada por fluorescência. As substâncias de referência empregadas aqui foram Phl p 1 natural purificado (nPhl p 1) em paralelo com as substâncias de teste. Os resultados para Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys δ21 3-220 and Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 são apresentados aqui a título de exemplo para as moléculas Phl p 1 modificadas descritas.
[0082] Resultados de teste representativos para a variante Phl p 1 NoCys com basófilos de quatro pacientes sofrendo de alergia clinicamente definida são apresentados como curvas na figura 7. A redução na eficácia alergênica da variante Phl p 1 NoCys relativa a nPhl p 1 selvagem se torna clara através do deslocamento nas curvas de ativação.
[0083] De acordo com os resultados do teste de fita e o teste de inibição de IgE, os resultados de teste para as variantes Phl p 1 NoCys Δ213-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 indicam uma redução ainda maior na eficácia alergênica relativa, conforme mostrado na figura 8 e 9 com referência a curvas representativas.
[0084] Considerando que uma máxima proporção de basófilos já foi ativada pelo alérgeno natural em uma faixa de concentração das substâncias de teste de 100-1000 μΜ, nenhuma ou somente muito pouca ativação de basófilos foi detecta\da na aplicação dos alérgenos modificados Phl p 1 NoCys Δ213-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220.
[0085] A eficácia alergênica da variante Phl p 1 NoCys δ2 13-220 foi, conforme pode ser calculado pelos valores de A50 das curvas, reduziu - 100-1000 vezes e a da variante Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 foi reduzida mais de 1000 vezes comparada com a referência nPhl p 1 (A50: concentração de alérgeno a 50 % do número máximo de basófilos ativados).
[0086] Reatividade de células T das variantes hipoalergênicas de Phl p 1 [0087] Linfócitos auxiliares T reagem com fragmentos de peptídeos alergênicos (cerca de 12-25 aminoácidos) os quais são formados por degradação enzimática em células apresentando antígeno (APCs) e são apresentados às célujlas T depois de inclusão dos peptídeos adequados nas moléculas de classe II MHC individuais na superfície dos APCs. Esta ativação alérgeno-específica dos linfócitos T auxiliares é o pré-requisito para proliferação e diferenciação funcional (TH1 e TH2). Influenciar os linfócitos T alérgenos-específicos por tratamento com alérgeno ou um derivado de alérgeno durante hiposensibilização é considerada a chave para a eficácia terapêutica.
[0088] De modo a investigar a reatividade de células T, linhagens de células T oligoclonais de pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim são estabelecidas por meio de métodos convencionais com estimulação por moléculas de nPhl p 1 ou rPhl p 1 wt. Em um teste de proliferação» as várias linhagens de células T foram estimuladas com os alérgenos de referência nPhl p 1 e rPhl p 1 wt e as variantes de Phl p 1 recombinante modificado. O índice de proliferação foi determinado pela incorporação de [3H]-timidina por meio de métodos convencionais.
[0089] Os resultados do teste de proliferação de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys δ213-220 e Phl p 1 NoCys δ1-6, 115-119, 213-220 são mostrados aqui a título de exemplo para as moléculas de Phl p 1 modificadas descritas.
[0090] Os resultados com linhagens de células T de oito pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim representados na Tabela 1 mostram que foi possível estimular os linfócitos T para proliferação pelas variantes de alérgenos recombinantes. A reatividade de células T de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys λ2 13-220 e Phl p 1 NoCys δ1-6, 115-119, 213-220 é somente reduzida lígeíramente comparada com os alérgenos selvagens naturais e recombinantes não modificados, o que demonstra a retenção dos epitopos de células T cruciais, [0091] Tabela 1: Determinação da reatividade de células T de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys δ2 13-220 e Phl p 1 NoCys δ1-6, 115-119, 213-220 por meio de testes de proliferação com linhagens de células T (TCLs) reativas a Phl p 1 f Calculado a partir dos valores das medições de [3H]. valores das medições de cpm de culturas celulares estimuladas por alérgenos/valores das medições de cpm de culturas celulares não estimuladas 2 Doador: pacientes sofrendo de alergia a pólen de capim clinicamente definida [0092] Construção de variantes de Phi p 1 hipoallergênicas por engenharia genética Exemplo 1: Phl p 1 NoCvs [0093] Para a construção da variante Phl p 1 NoCys (SEQ ID NO 3 e 4), foram realizadas seis etapas de PCR iniciando a partir do cDNA de rPhl p 1 wt ("Gen-Bank" inscrição Z27090; NCBI, Bethesda, EUA). As mutações de pontos foram introduzidas usando iniciadores de PCR específicos os quais continham códons codificando para serina ao invés dos para cisteína (seqüências de iniciadores veja a Tabela 2).
[0094] Etapa 1 - Preparação de fragmento de DNA de N-terminal "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S] (bp 1-212)": um fragmento de DNA contendo as mutações C41S, C57S, C69S foi gerado por amplificação de oligonucleotídeos de sobreposição longos (P 1-63, P 49-111, P 97-158 e P 144-212) por meio de PCR.
[0095] Etapa 2 - Preparação de fragmento de DNA de C-terminal "Phl p 1 [C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 193-720)": PCR de Phl p 1 wt-cDNA com os iniciadores P 193-261 e P 703-720 Hindill.
[0096] Etapa 3 - Preparação do DNA codificando para "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 1-720)": PCR de fragmentos de sobreposição "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S] (bp 1-212)" e "Phl p 1 [C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 193-720)" com os iniciadores P 1-63 e P 703-720 Hindill.
[0097] Etapa 4 - Preparação de fragmento de DNA de N-terminal "Phl p 1 [C41S, C57Ss C69S, C72S, C77S, C83S, C139S] (bp 1-428)”: PCR do cDNA de "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S] (bp 1-720)" com os iniciadores P 1-63 e P 406-428 as.
[0098] Etapa 5 - Preparação de fragmento de DNA de C-termínal "Phl p 1 [C139S] (bp 406-720)": [0099] PCR do cDNA de rPhl p 1 selvagem com os iniciadores P 406-428s e P 703-720 Hindíll.
[00100] Etapa 6 - Preparação de DNA completo codificando para Phl p 1 NoCys: [00101] PCR de fragmentos de sobreposição "Phl p 1 [C41S, C57S, C69S, C72S, C77S, C83S, C139S] (bp 1-428)" e "Phl p 1 [C139S] (bp 406-720) com os iniciadores P 1-63 e P 703-720 Hindlll", [00102] O DNA codificando para Phl p 1 NoCys foi digerido usando a enzima de restrição Hindlll e ligado no vetor de expressão pProExHT (Invitro-gen, Carlsbad» EUA) através dos sítios de restrição Ehel e Hindlll e subseqüentemente seqüenciado na totalidade.
Tabela 2: Iniciadores de PCR empregados para a preparação de Phl p 1 NoCys, Phl p 1 NoCys Δ213-220 e Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119, 213-220 1 Números indicados: posições dos iníciadores com base na seqüência de nucleotídeos da proteína selvagem Phl p 1 (sem peptídeo de sinal; inscrição no "GenBank" Z27090; NCBI, Bethesda, EUA). Seqüências de iniciador em alguns casos otimizados por códons para E. coli. Exemplo 2: Phl p 1 NoCvs A213-220 [00103] A seqüência de DNA codificando para variante de eliminação Phl p 1 NoCys δ2 13-220 (SEQ ID NO 15 e 16) foi gerado por meio de PCR do DNA de Phl p 1 NoCys usando o 5’-iniciador P 1-18 e o 3’-iniciador P 613-720 (Δ637-660) Hindlli especificamente encurtado pela região da seqüência a ser eliminada.
[00104] O cDNA foi digerido usando a enzima de restrição Hindlli e ligada no vetor de expressão pProExHT (Invitrogen, Carlsbad, EUA) através dos sítios de restrição Ehel e Hindlli e subseqüentemente seqüenciado na totalidade.
Exemplo 3: Construção de Phl p 1 NoCys A1-6, 115-119, 213-220 por engenharia genética [00105] A seqüência de DNA codificando para variante de eliminação Phl p 1 NoCys a1-6, 115-119, 213-220 (SEQ ID NO 5 e 6) foi gerada nas trêds etapas por meio de PCR usando oligonucleotídeos especificamente encurtados pela região da seqüência a ser eliminada.
Etapa 1 - Preparação de fragmento de DNA de N-terminal "Phl p 1 NoCys Δ1-6 (bp 1-300)": PCR do cDNA de Phl p 1 NoCys com os iniciadores P22-63 (Δ1-18) e P 250-318.
Etapa 2 - Preparação de fragmento de DNA de C-terminal "Phl p 1 NoCys Δ115-119, 213-220 (bp 283-663)": PCR de Phl p 1 NoCys com os iniciadores P 301-384 (Δ343-357) e P 613-720 (Δ637-660) Hindiif. Etapa 3 - Preparação do DNA completo codificando para Phl p 1 NoCys Λ1-6, 115-119, 213-220: PCR de fragmentos de sobreposição "Phl p 1 NoCys Δ1-6 (bp 1-300)" e "Phl p 1 NoCys Δ115-119, 213-220 (bp 283-663)" com os iniciadores P22-63 (Δ1-18) e P 703-720 Hindlll.
[00106] O DNA codificando para Phl p 1 NoCys δ1-6, 115-119, 213-220 foi digerido usando a enzima de restrição Hindlll e ligado no vetor de expressão pProExHT (Invitrogen, Carlsbad, EUA) através dos sítios de restrição Ehel e Hindlll e subsequentemente seqüencíado na totalidade.
[00107] O DNA das variantes Phl p 1 NoCys M-6 (SEQ ID NO 5 e 6), Phl p 1 NoCys Δ1-30 (SEQ ID NO 7 e 8), Phl p 1 NoCys Δ92-104 (SEQ ID NO 9 e 10), Phl p 1 NoCys λ1 15-119 (SEQ ID NO 11 e 12), Phl p 1 NoCys δ1 75-185 (SEQ ID NO 13 e 14) foram preparados, clonados e seqüenciados correspondente mente.
Claims (19)
1. Variantes de Phl p 1, caracterizadas pelo fato de que têm reduzida reatividade a IgE comparados com o alérgeno selvagem e mantêm substancial mente a reatividade dos linfócitos T, e as cisteínas nas posições dos aminoácidos 41, 57, 69, 72, 77, 83 e 139 correspondentes à proteína Phl p 1 madura estão faltando.
2. Variantes de Phl p 1, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que as cisteínas nas posições dos aminoácidos 41, 57, 69, 72, 77, 83 e 139 correspondentes à proteína Phl p 1 madura são substituídas por outro aminoácido.
3. Variantes de Phl p 1, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que as cisteínas nas posições dos aminoácidos 41, 57, 69, 72, 77, 83 e 139 correspondentes à proteína Phl p 1 madura são substituídas por serina (variante Phl p 1 NoCys de acordo com a SEQ ID NO 4).
4. Variantes de Phl p 1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizadas pelo fato de que os aminoácidos 213-220 correspondentes à sequência Phl p 1 madura estão faltando.
5. Variante Phl p 1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que as cisteínas 41, 57, 69, 72, 77, 83 e 139 da proteína madura são substituídas por serina e os aminoácidos 213-220 estão faltando (variante Phl p 1 NoCys Δ213-220 de acordo com a SEQ ID NO 16).
6. Variante Phl p 1 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que os aminoácidos 1-6, 115-119 e 213-220 correspondentes à sequência Phl p 1 madura estão faltando.
7. Variante Phl p 1, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 e 6, caracterizada pelo fato de que as cisteínas 41, 57, 69, 72, 77, 83 e 139 da proteína madura são substituídas por serina e os aminoácidos 1-6, 115-119 e 213-220 estão faltando (variante Phl p 1 NoCys Δ1-6, 115-119 e 213-220 de acordo com a SEQ ID NO 18).
8. Variantes de alérgenos, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizadas pelo fato de que foram obtidas por meio de métodos de engenharia genética recombinante.
9. Moléculas de DNA, caracterizada pelo fato de que codifica para variantes de alérgenos, como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
10. Vetor de expressão recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 9, conectada funcionalmente a uma sequência controle de expressão.
11. Organismo procariótico, caracterizado pelo fato de que é transformado por meio de uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 9, ou um vetor de expressão, como definido na reivindicação 10.
12. Processo para preparação de uma variante de alérgeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser por cultura de um organismo procariótico, como definido na reivindicação 11, e isolamento da variante de alérgeno correspondente da cultura.
13. Variante de alérgeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de ser como medicamento.
14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma variante de alérgeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e opcionalmente compostos ativos e/ou adjuvantes adicionais para o tratamento preventivo e terapêutico de alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 da espécie Poaceae.
15. Uso de pelo menos uma variante de alérgeno, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para prevenção e terapia de alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 da espécie Poaceae.
16. Molécula de DNA, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de ser como medicamento.
17. Vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de ser como medicamento.
18. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 9, ou pelo menos um vetor de expressão, como definido na reivindicação 17, e opcionalmente compostos ativos e/ou adjuvantes adicionais para a vacinação com DNA imunoterápica de pacientes tendo alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 das Poaceae e/ou para a prevenção de semelhantes alergias.
19. Uso de pelo menos uma molécula de DNA, como definida na reivindicação 9, ou pelo menos um vetor de expressão, como definido na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser para preparação de um medicamento para vacinação com DNA imunoterápica de pacientes tendo alergias em cujo início do processo estão envolvidos alérgenos do grupo 1 das Poaceae e/ou para a prevenção de semelhantes alergias.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102004035337A DE102004035337A1 (de) | 2004-07-21 | 2004-07-21 | Varianten der Gruppe 1-Allergene aus Poaceae mit reduzierter Allergenität und erhaltener T-Zellreaktivität |
| PCT/EP2005/007481 WO2006008018A1 (de) | 2004-07-21 | 2005-07-11 | Varianten der gruppe 1-allergene aus poaceae mit reduzierter allergenität und erhaltener t-zellreaktivität |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0513504A BRPI0513504A (pt) | 2008-05-06 |
| BRPI0513504B1 true BRPI0513504B1 (pt) | 2016-08-16 |
Family
ID=35106807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0513504A BRPI0513504B1 (pt) | 2004-07-21 | 2005-07-11 | variantes de phl p 1, seu processo de preparação, vetor, moléculas de dna, seus usos, composições farmacêuticas, e organismo procariótico |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8263090B2 (pt) |
| EP (2) | EP1768996B1 (pt) |
| JP (1) | JP5149002B2 (pt) |
| CN (2) | CN103467583A (pt) |
| AT (1) | ATE432944T1 (pt) |
| AU (1) | AU2005263477B2 (pt) |
| BR (1) | BRPI0513504B1 (pt) |
| CA (2) | CA2574449C (pt) |
| DE (2) | DE102004035337A1 (pt) |
| ES (1) | ES2328050T3 (pt) |
| PT (1) | PT1768996E (pt) |
| RU (1) | RU2409589C2 (pt) |
| WO (1) | WO2006008018A1 (pt) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT503690A1 (de) * | 2006-06-09 | 2007-12-15 | Biomay Ag | Hypoallergene moleküle |
| HRP20150317T1 (hr) * | 2009-02-05 | 2015-04-24 | Circassia Limited | Peptidi trave za cjepivo |
| WO2011085782A1 (de) * | 2010-01-14 | 2011-07-21 | Merck Patent Gmbh | Varianten der gruppe 6-allergene der süssgräser mit reduzierter allergenität durch mutagenese von prolinresten |
| CN108728450B (zh) * | 2018-06-11 | 2021-06-01 | 中国科学院武汉植物园 | 狗牙根中一个受低温显著诱导的基因CdERF1及其应用 |
| WO2025102125A1 (en) * | 2023-11-17 | 2025-05-22 | Queensland University Of Technology | Modified grass pollen allergens |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1167491A (zh) * | 1994-10-25 | 1997-12-10 | 美国联合生物医学公司 | 用于治疗变态反应的合成IgE膜锚肽免疫原 |
| AR020102A1 (es) * | 1998-07-30 | 2002-04-10 | Ucb Sa | Compuesto para la prevencion y/o tratamiento de la alergia; composicion farmaceutica, composicion cosmetica, composicion en forma de bebida, alimento y/oalimento para animales domesticos que lo comprende y uso de dicho compuesto o dicha composicion farmaceutica para la fabricacion de un alimento |
| DE19918682A1 (de) * | 1999-04-23 | 2000-10-26 | Merck Patent Gmbh | DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung eines Graminaen-Allergens |
| AUPR779201A0 (en) * | 2001-09-20 | 2001-10-11 | University Of Melbourne, The | Immunotherapeutic and immunoprophylactic reagents |
| WO2004022588A1 (de) * | 2002-08-19 | 2004-03-18 | Merck Patent Gmbh | Varianten des majorallergens phl p 1 aus lieschgras |
-
2004
- 2004-07-21 DE DE102004035337A patent/DE102004035337A1/de not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-07-11 AT AT05761824T patent/ATE432944T1/de active
- 2005-07-11 WO PCT/EP2005/007481 patent/WO2006008018A1/de not_active Ceased
- 2005-07-11 EP EP05761824A patent/EP1768996B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-07-11 CA CA2574449A patent/CA2574449C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-11 PT PT05761824T patent/PT1768996E/pt unknown
- 2005-07-11 US US11/572,370 patent/US8263090B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-11 CA CA2903726A patent/CA2903726A1/en not_active Abandoned
- 2005-07-11 RU RU2007106170/10A patent/RU2409589C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2005-07-11 CN CN2013104392657A patent/CN103467583A/zh active Pending
- 2005-07-11 BR BRPI0513504A patent/BRPI0513504B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2005-07-11 JP JP2007521849A patent/JP5149002B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-11 EP EP08014111A patent/EP2028189A3/de not_active Withdrawn
- 2005-07-11 CN CN200580024464.5A patent/CN1989151B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2005-07-11 DE DE502005007428T patent/DE502005007428D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2005-07-11 ES ES05761824T patent/ES2328050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2005-07-11 AU AU2005263477A patent/AU2005263477B2/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2328050T3 (es) | 2009-11-06 |
| JP5149002B2 (ja) | 2013-02-20 |
| US8263090B2 (en) | 2012-09-11 |
| EP1768996B1 (de) | 2009-06-03 |
| ATE432944T1 (de) | 2009-06-15 |
| RU2409589C2 (ru) | 2011-01-20 |
| CA2574449A1 (en) | 2006-01-26 |
| DE502005007428D1 (de) | 2009-07-16 |
| CN1989151A (zh) | 2007-06-27 |
| EP2028189A3 (de) | 2009-07-08 |
| CN1989151B (zh) | 2014-08-27 |
| AU2005263477A1 (en) | 2006-01-26 |
| CA2574449C (en) | 2015-12-01 |
| JP2008507262A (ja) | 2008-03-13 |
| PT1768996E (pt) | 2009-09-07 |
| WO2006008018A1 (de) | 2006-01-26 |
| AU2005263477B2 (en) | 2011-12-08 |
| EP1768996A1 (de) | 2007-04-04 |
| US20080267985A1 (en) | 2008-10-30 |
| RU2007106170A (ru) | 2008-08-27 |
| CN103467583A (zh) | 2013-12-25 |
| BRPI0513504A (pt) | 2008-05-06 |
| EP2028189A2 (de) | 2009-02-25 |
| DE102004035337A1 (de) | 2006-03-16 |
| CA2903726A1 (en) | 2006-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US9789178B2 (en) | DNA sequence, and recombinant preparation of the grass pollen allergen Lol p 4 | |
| US20160207967A1 (en) | Phl p 5a derivatives having reduced allergeneity and retained t-cell reactivity | |
| BRPI0513504B1 (pt) | variantes de phl p 1, seu processo de preparação, vetor, moléculas de dna, seus usos, composições farmacêuticas, e organismo procariótico | |
| RU2327739C2 (ru) | ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК И ПОЛУЧЕНИЕ АЛЛЕРГЕНА ПЫЛЬЦЫ ТРАВ Phl p 4 С ПОМОЩЬЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ СПОСОБОВ | |
| PL201818B1 (pl) | Sekwencja DNA oraz sposób rekombinacyjnego otrzymywania alergenów graminae | |
| JP5871819B2 (ja) | プロリン残基の突然変異誘発により低減したアレルゲン性を有するイネ科のグループ５アレルゲンの変異体 | |
| CN102811735B (zh) | 由于脯氨酸残基突变而具有降低的致敏性的禾本科的第6组过敏原的变异体 | |
| JP4960102B2 (ja) | 穀物からの４群主要アレルゲンのｄｎａ配列および組換え製剤 | |
| JP2007536893A5 (pt) | ||
| AU2012205288A1 (en) | DNA-sequence and recombinant production of group 4 major allergens from cereals |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06H | Technical and formal requirements: requirement cancelled [chapter 6.8 patent gazette] |
Free format text: REF. A RPI NO 2154 DE 17/04/2012. ANULACAO DA EXIGENCIA 6.6 POR TER SIDO INDEVIDA. REQUERENTE NAO APRESENTOU RESPOSTA A EXIGENCIA CONFORME DISPOE A RESOLUCAO 207 DE 24/04/2009, ENTRETANTO, A RESPOSTA CONSTA NO FORMULARIO DE DEPOSITO. |
|
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] |
Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI |
|
| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 16/08/2016, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
|
| B21F | Lapse acc. art. 78, item iv - on non-payment of the annual fees in time |
Free format text: REFERENTE A 14A ANUIDADE. |
|
| B24J | Lapse because of non-payment of annual fees (definitively: art 78 iv lpi, resolution 113/2013 art. 12) |
Free format text: EM VIRTUDE DA EXTINCAO PUBLICADA NA RPI 2522 DE 07-05-2019 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDA A EXTINCAO DA PATENTE E SEUS CERTIFICADOS, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013. |