BRPI0519285B1

BRPI0519285B1 - Método para produzir um biomaterial implantável resistente a calcificação, biomaterial implantável resistente a calcificação, dispositivo biológico implantável, implante biocompatível, kit para reparar uma lesão de tecido, curativo de ferimentos

Info

Publication number: BRPI0519285B1
Application number: BRPI0519285-4A
Authority: BR
Inventors: Morris Leonard Neethling William; Julian Hodge Andrew
Original assignee: Admedus Regen Pty Ltd.
Priority date: 2004-12-24
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2018-05-15
Also published as: CN101128225A; ES2569494T3; KR20070106696A; CN101128225B; BRPI0519285A2; NO20073846L; EP1835948A4; SG158172A1; AU2005318938B2; PL1835948T3; EP1835948B1; WO2006066327A1; US20060193885A1; CA2591882C; DK1835948T3; JP5208513B2; ZA200706089B; MX2007007723A; EP1835948B8; NZ556610A

Abstract

biomaterial implantável e método de produzir o mesmo. a presente invenção se refere a um biomaterial implantável e métodos para produzi-lo. em particular, a invenção se refere a um método para produzir um biomaterial implantavel compreendendo (a) expor um biomaterial implantavel a uma solução contendo álcool por pelo menos 24 horas.

Description

MÉTODO PARA PRODUZIR UM BIOMATERIAL IMPLANTÁVEL

RESISTENTE A CALCIFICAÇÃO, BIOMATERIAL IMPLANTÁVEL

RESISTENTE A CALCIFICAÇÃO, DISPOSITIVO BIOLÓGICO IMPLANTÁVEL, IMPLANTE BIOCOMPATÍVEL, KIT PARA REPARAR UMA LESÃO DE TECIDO, CURATIVO DE FERIMENTOS CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere a um biomaterial implantável e métodos para produzi-lo. Em particular, a invenção se refere a um método de tratar um biomaterial contendo colágeno para reduzir ou aliviar a calcificação e melhorar a longevidade do biomaterial, que pode ser utilizado em ou com um dispositivo implantável e métodos de produzir o mesmo.

ANTECENDENTES

[0002] Existem numerosos métodos para quimicamente alterar ou fixar a matriz de colágeno de tecidos biológicos para permitir que esses tecidos sejam implantados no corpo de um mamífero vivo. Exemplos de tecidos biológicos implantáveis alterados e fixados incluem válvulas cardíacas, vasos sanguíneos, pericárdio, pele, dura mater, tendões e ligamentos.

[0003] Esses tecidos biológicos consistem principalmente de colágeno e elastina. A rigidez/elasticidade da maioria dos tecidos biológicos é em grande parte determinada pelo conteúdo relativo de colágeno e elastina nos tecidos e/ou a configuração física da estrutura do tecido conjuntivo.

[0004] Cada molécula de colágeno consiste de três cadeias de polipeptídeos entrelaçadas para formar uma hélice tripla enrolada. Agentes químicos usados para preservar tecidos biológicos geralmente formam reticulações entre grupos amina situados nas cadeias de polipeptídeos no interior de uma molécula de colágeno (intramolecular) bem como entre moléculas de colágeno adjacentes (intermolecular).

[0005] Biomateriais baseados em colágeno, quando utilizados como dispositivos implantáveis em diferentes espécies receptoras, são propensos à rejeição hiperaguda. Essa rejeição hiperaguda é uma resposta imunológica natural, iniciada por antígenos presentes na estrutura do biomaterial baseado em colágeno. A rejeição hiperaguda é um processo degenerativo rápido, que afeta a função e durabilidade desse dispositivo implantável.

[0006] A antigenicidade dos biomateriais baseados em colágeno pode ser suprimida pela reticulação física ou química do colágeno. Métodos de reticulação física como irradiação ultravioleta ou desidratação termal resultam em reticulação de baixa densidade. Agentes químicos como formaldeído, glutaraldeído, amido de dialdeído e certos compostos de poliepóxi tem sido utilizados como agentes químicos de reticulação em biomateriais baseados em colágeno.

[0007] A reticulação do colágeno envolve a reação de um agente de reticulação com grupos amina de resíduos de lisina ou hidróxilisina em diferentes cadeias de polipeptídeos. Outro método conhecido de reticulação do colágeno é o de ativar os resíduos de grupos carboxil de ácido glutâmico e aspártico em uma cadeia de polipeptídeos para reagir com os grupos amina de outra cadeia de polipeptídeos para formar ligações de amido.

[0008] A reticulação também pode ser realizada ligando-se grupos amina de cadeias adjacentes de polipeptídeos com diisocianatos, o que resulta na formação de ligações de uréia. Esse método é menos popular devido à toxidade e baixa solubilidade da maioria dos diisocianatos.

[0009] Recentemente, o glutaraldeído tem sido o agente de reticulação escolhido. O glutaraldeído tornou-se bifuncional devido à presença de um aldeído presente em ambas as extremidades de uma cadeia alifática de cinco carbonos. Além de fixar o tecido, o glutaraldeído é um excelente agente esterilizador para preparar tecidos biológicos para implantação.

[0010] Em particular, biomateriais implantáveis permanentemente, que foram fixados com glutaraldeído, incluem válvulas cardíacas suínas bioprotéticas, válvulas pericardíacas bovinas e emplastros pericardíacos bovinos.

[0011] Um problema associado com a implantação de materiais biológicos, em reticulação com agentes químicos, é que esses materiais, especificamente o colágeno e a elastina nesses materiais, tendem a calcificar. A calcificação desses materiais pode resultar em enrijecimento que pode resultar em degradação e perecimento do material. Sabe-se que tanto a calcificação extrínseca quanto a intrínseca são responsáveis pela calcificação de biomateriais reticulados.

[0012] Infelizmente, o glutaraldeído é conhecido por promover a calcificação em biomateriais. A reação de aldeído e aminas primárias nos biomateriais forma iminas instáveis (base Schiff) que subseqüentemente liberam glutaraldeído do biomaterial. Aldeídos não ligados presentes no tecido podem causar severas irritações no tecido, tais como reações inflamatórias, após a implantação. Existe assim uma necessidade de remover ou inativar os efeitos de promoção de calcificação de agentes em reticulados como o glutaraldeído.

[0013] O mecanismo de calcificação de biomateriais reticulados ainda não foi totalmente compreendido. Dados clínicos mostraram que fatores como a idade do paciente, infecções, química de tecido hospedeiro, desidratação, distorção, fatores dietéticos, e terapia de anticoagulação inicial inadequada podem promover a calcificação de biomateriais implantados.

[0014] Foram realizadas muitas tentativas para descobrir maneiras de mitigar a calcificação de biomateriais em reticulados. A pesquisa sobre a mitigação da calcificação de biomateriais se concentrou primeiramente no tratamento dos biomateriais reticulados e é descrita em, mas não limitada a, US Pat. No. 4.553.974 (Dewanjee et a/.); US Pat. No. 4.120.649 (Schechter); US Pat. No. 4.648.881 (Nashef et a/.); e US Pat. No. 4.976.733 (Girardot) Vyavahare et ai, 1997, Circulation, 95:479-488 e Pathak et al., 2004, J. Biomed. Mater Res., 69A: 140-144. Essas publicações geralmente descrevem métodos de tratar tecidos fixados com álcool antes da implantação. Em outras palavras, o tecido já estava reticulado antes de ser exposto ao álcool. Mesmo em instâncias em que os tecidos são pré-incubados na presença de álcool, o período de exposição é muitas vezes muito curto para ser útil ou a presença de amortecedor e outros agentes afeta adversamente a estabilidade da reticulação (ver, por exemplo, Vyavahare et ai, 1997, supra). Processos alternativos para fixar biomateriais com reagentes não-glutaraldeído também foram descritos e esses incluem, mas não estão limitados a, o uso de éteres de poliglicidal (Inamura et ai, (1988), Jpn. J. Artif. Organs, 17: 1101-1103); foto-oxidação (Moore et ai, (1994), J. Biomed. Mater. Res., 28:611-618).

[0015] O tratamento de biomateriais reticulados com amina-di-fosfato e surfactante demonstrou calcificação reduzida nesses biomateriais após a implantação. Entretanto, esses agentes tendem a lavar o biomaterial após a implantação e apenas adiam o processo de calcificação.

[0016] A utilização de álcool no tratamento de biomateriais é bem conhecida, mas está limitada ao seu uso como solvente e/ou agente esterilizador. Por exemplo, o uso de álcool no tratamento de biomateriais contra a calcificação patológica é limitado ao seu uso em biomateriais de colágeno previamente reticulados; US Pat. No. 5.746.775 (Levy et al.) e International Pat. No. WO84/01894.

[0017] Conseqüentemente, existe ainda necessidade de um método para produzir um biomaterial que tenha uma resistência a longo prazo contra a calcificação.

SUMARIO

[0018] Os inventores desenvolveram métodos que superam ou pelo menos aliviam os problemas de calcificação com biomateriais implantáveis contendo colágeno.

[0019] Da mesma forma, em um primeiro aspecto a presente invenção fornece um método para produzir um biomaterial implantável compreendendo: a) expor um biomaterial a uma solução contendo álcool por pelo menos 24 horas.

[0020] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um biomaterial contendo colágeno para produzir um biomaterial resistente à calcificação compreendendo: (a) expor um biomaterial a uma solução contendo álcool por pelo menos 24 horas.

[0021] Em algumas representações, o método do primeiro e do segundo aspectos compreendem ainda as etapas de: (b) expor o dito material na etapa (a) a um agente de reticulação; e (c) expor o dito material na etapa (b) a uma solução acídica; onde as etapas (b) e (c) são seqüenciais a etapa (a).

[0022] Embora seja preferível que a etapa (a) seja realizada por pelo menos 24 horas, mais preferivelmente por pelo menos 36 horas e mais preferivelmente ainda, pelo menos 48 horas, os especialistas na matéria notarão que em algumas circunstancias a etapa (a) pode ser realizada em um período de tempo mais curto.

[0023] Da mesma forma, em um terceiro aspecto a presente invenção fornece um método para produzir um biomaterial implantável compreendendo: (a) expor um biomaterial a uma solução contendo álcool; (b) expor o dito material na etapa (a) a um agente de reticulação; e (c) expor o dito material na etapa (b) a uma solução acídica; onde as etapas (b) e (c) são seqüenciais à etapa (a).

[0024] Em um quarto aspecto, a presente invenção fornece um método para tratar um biomaterial contendo colágeno para produzir um biomaterial resistente à calcificação compreendendo: (a) expor um biomaterial a uma solução contendo álcool; (b) expor o dito material na etapa (a) a um agente de reticulação; e (c) expor o dito material na etapa (b) a uma solução acídica; onde as etapas (b) e (c) são seqüenciais à etapa (a).

[0025] Em algumas representações, entre as etapas (a) e (b) e/ou entre as etapas (b) e (c) dos métodos da invenção o biomaterial ou material contendo colágeno é enxaguado para remover o álcool residual e/ou o agente de reticulação. Preferivelmente, o biomaterial ou material contendo colágeno é enxaguado ainda após a etapa (c) para remover a solução acídica residual.

[0026] Os especialistas na matéria notarão que os métodos divulgados aqui podem ser úteis para tratar qualquer biomaterial. Preferivelmente, o biomaterial compreende colágeno.

[0027] Em algumas representações, o biomaterial é um tecido cultivado, uma prótese contendo matriz extra-celular obtida de um animal, um tecido reconstituído (ex. matriz de colágeno), ou algo semelhante.

[0028] Também será visto que o biomaterial pode compreender análogos sintéticos formados de polímeros sintéticos, polímeros biológicos, ou ambos, incluindo aqueles geralmente encontrados em matrizes de tecido naturais. Polímeros sintéticos adequados incluem, por exemplo, poliamidas e polisulfonas. Polímeros biológicos podem ocorrer naturalmente ou produzidos in vitro por, por exemplo, fermentação e outros.

[0029] Em algumas representações, o biomaterial ocorre naturalmente e foi isolado de um animal. O biomaterial pode ser isolado de qualquer animal, seja ele da mesma espécie do receptor ou de um animal de uma espécie diferente do receptor. Preferivelmente, o animal é de uma das ordens mamíferas, i.e., Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnívora e Marsupialia. Mais preferivelmente, o animal é selecionado do grupo consistindo de um ovino, um bovino, um caprino, um eqüino, um suíno, um marsupial e um humano.

[0030] O biomaterial pode ser qualquer tipo de tecido celular. Preferivelmente, o tecido celular é selecionado do grupo consistindo de tecido cardiovascular, tecido cardíaco, válvula cardíaca, ramificações da aorta, parede aórtica, folículos aórticos, tecido pericardial, tecido conjuntivo, dura mater, tecido dérmico, um tecido vascular, cartilagem, pericárdio, ligamento, tendão, vasos sangüíneos, tecido umbilical, tecido ósseo, fáscia, e tecido submucosal e pele.

[0031] Em algumas representações, o biomaterial é e/ou compreende um discreto i.e. colágeno isolado em vez de um tecido contendo colágeno ocorrendo naturalmente. O colágeno discreto pode ser usado no seu estado isolado ou formado em um dispositivo médico ou artigo conhecido pela ciência.

[0032] O biomaterial utilizado na etapa (a) não passou previamente por reticulação.

[0033] A solução contendo álcool usada na etapa (a) é preferivelmente um líquido, e com base em água, i.e. é uma solução aquosa de mais de 50%, e preferivelmente entre 60% a 80% de álcool por volume. Pode-se usar tanto a solução tamponada contendo álcool quanto a não tamponada; entretanto, é preferível que seja usada uma solução não tamponada contendo álcool já que se descobriu que soluções tamponadas contendo álcool afetam adversamente os procedimentos subseqüentes de reticulação produzindo um biomaterial amarelado.

[0034] Os métodos da invenção podem utilizar qualquer álcool conhecido na solução contendo álcool. Preferivelmente, o álcool é um C1-C6 inferior em uma solução livre de tampão. Mais preferivelmente ainda, o álcool é selecionado do grupo consistindo de metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol e t-butanol.

[0035] Em algumas representações, a solução contendo álcool compreende uma mistura de dois ou mais álcoois contanto que o volume combinado do álcool seja maior que 50%. Por exemplo, uma mistura de cerca de 70% de etanol e cerca de 10% de isobutanol é efetiva.

[0036] O biomaterial na etapa (a) pode ser exposto para a solução contendo álcool por qualquer duração de tempo tanto quanto seja suficiente para tornar o biomaterial resistente à calcificação patogênica in vivo. Preferivelmente, o biomaterial permanece em contato com a solução contendo álcool por tempo suficiente para permitir que o álcool se difunda e permeie o biomaterial. Mais preferivelmente, o biomaterial é exposto à solução contendo álcool por pelo menos 24 horas, mais preferivelmente ainda pelo menos 36 horas e mais preferivelmente, pelo menos 48 horas.

[0037] Em algumas representações, ex. aquelas nas quais o biomaterial tenha sido exposto à solução contendo álcool por mais de 24 horas, o biomaterial pode ser utilizado diretamente nos métodos de tratamento da invenção divulgada infra.

[0038] Em alguma representação, o biomaterial, após a exposição à solução contendo álcool, é removido e exposto a um ou mais agentes de reticulação. Qualquer forma de agente de reticulação conhecido na ciência ou sua combinação pode ser usado contanto que seja capaz de efetuar a reticulação do colágeno. Da mesma forma, será observado que agentes de reticulação, incluem mas não estão limitados a, divinil sulfona (DVS), polietileno glicol divinil sulfona (VS-PEG-VS), hidroxietil metacrilato divinil sulfona (HEMA-DIS-HEMA), formaldeído, glutaraldeído, aldeídos, isocianatos, alquila e aril alóides, imidoesters, maleimidas N-substituídas, compostos de acilato, carbodiimida, hidroxiclorida, N-hidroxisuccinimida, luz (ex. luz azul e luz UV), pH, temperatura, e suas combinações. Preferivelmente, o agente de reticulação é um agente de reticulação químico selecionado de um grupo consistindo de carbodiimida, éteres poliepoxi, divinil sulfona (DVS), polialdeído e difenilfosforil azida (DPPA).

[0039] Em algumas representações, o polialdeído é um bi-, tri-, ou di-aldeído. Glutaraldeído é especialmente preferido.

[0040] Em algumas representações, a etapa de reticulação (b) é seguida pela etapa (c), com ou sem uma etapa intermediária de lavagem. A solução acídica usada na etapa (c) contém qualquer ácido capaz de desativar e/ou modificar as metades fixadas e/ou não fixadas do agente de reticulação presente no biomaterial após a etapa (b) para remover ou reduzir os locais de ligação de cálcio disponíveis. Alternativamente, ou em adição a, a solução acídica usada na etapa (c) contem qualquer ácido capaz de ainda reticular os grupos carboxílicos ativados com os grupos amina ativados no colágeno para formar ligações de amido. Preferivelmente, o ácido na solução acídica compreende um ácido aminocarboxílico. Preferivelmente, o ácido aminocarboxílico é um ácido com pelo menos um grupo amina e pelo menos um ácido carboxílico substituinte. Mais preferivelmente, o ácido aminocarboxílico é selecionado do grupo consistindo de L-arginina, L-lisina, L-histidina, L-glutamato ou L-aspartato.

[0041] Em algumas representações, a etapa (c) dos métodos divulgados é substituída ou suplementada por um método para inibir a formação de metaloproteinase em moléculas de elastina presentes no biomaterial. Especificamente, em tecidos como o tecido aórtico há a presença de uma maior porcentagem de elastina do que em outro tecido. Essas moléculas de elastina podem fornecer locais para a formação de metaloproteinase e como tal esses locais precisam ser reduzidos, removidos ou desativados. Como é mostrado no Exemplo 1 infra, uma solução livre de tampão, contendo um cátion multi-valente como magnésio, sais ferrosos ou alumínio pode ser usada para reduzir a formação de metaloproteinase.

[0042] A etapa de enxaguar o biomaterial é conduzida utilizando-se uma solução salina livre de fosfato de 0,9%.

[0043] Em uma representação preferida, o biomaterial após a etapa (c) é ainda esterilizado. Mais preferivelmente, o biomaterial é esterilizado após ser enxaguado.

[0044] Ao mesmo tempo em que os especialistas no assunto perceberão que a temperatura na qual cada uma das etapas da presente invenção é realizada não é crítica, ficará entendido que preferivelmente a temperatura é entre 2°C e 40°C, mais preferivelmente entre 4°C e 30°C e mais preferivelmente entre 5°C e 25°C.

[0045] Em uma representação, o álcool, o agente de reticulação e solução acídica, a solução de enxágüe e a solução esterilizadora são todos livres de tampão.

[0046] Será observado pelos especialistas que os métodos aqui divulgados são capazes de produzir um material resistente à calcificação, que retém menos de 50ug de cálcio por mg de tecido por mais de 200 dias pós implantação in vivo. Em outras palavras, o biomaterial resistente à calcificação da presente invenção é capaz de ser implantado por mais de 200 dias sem que o biomaterial aumente o seu conteúdo de cálcio acima de 50ug/mg de tecido.

[0047] Da mesma forma, em um quinto aspecto a presente invenção fornece um biomaterial resistente à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito biomaterial possui um conteúdo de cálcio de menos de cerca de 50ug por mg de biomaterial e no qual o dito biomaterial é capaz de ser implantado por pelo menos 200 dias sem que o biomaterial aumente o seu conteúdo de cálcio acima de 50ug/mg de biomaterial.

[0048] Sem desejar estar preso a qualquer teoria ou hipótese, considera-se que a resistência à calcificação é ocasionada em parte pela presença de aminas secundárias no colágeno ocasionado pelos métodos de produzir o biomaterial como divulgado aqui.

[0049] Da mesma forma, em um sexto aspecto, a presente invenção fornece um dispositivo biológico implantável compreendendo um biomaterial resistente à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito colágeno compreende aminas secundárias.

[0050] Em algumas representações, o biomaterial resistente à calcificação é revestido sobre uma superfície de um dispositivo medico. Em uma outra representação, o dispositivo compreende ainda pelo menos um segundo revestimento.

[0051] Será observado pelos especialistas que pelo menos o segundo revestimento pode compreender agentes tais como agente anti-microbial, agentes anti-virais, fatores de crescimento, agentes anti-desidratação ou agentes anti-sépticos.

[0052] Preferivelmente, o agente anti-microbial é selecionado do grupo consistindo de isoniazida, ethambutol, pirazinamida, estreptomicina, clofazimina, rifabutina, fluoroquinolonas, ofloxacina, sparfloxacina, rifampina, azitromicina, claritromicina, dapsona, tetraciclina, eritromicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina, amphotericina B, ketoconazola, fluconazola, pirimetamina, sulfadiazina, clindamicina, lincomicina, pentamidina, atovaquona, paromomicina, diclazarila, aciclovir, trifluorouridina, foscarnet, penicilina, gentamicina, ganciclovir, iatroconazole, miconazole, Zn-piritiona, metais pesados incluindo, mas não limitado a, ouro, platina, prata, zinco e cobre, e suas formas combinadas incluindo sais, como cloreto, brometo, iodeto, e periodato, e complexos com catalisadores, e outras formas.

[0053] Preferivelmente, o agente de fator de crescimento é selecionado do grupo consistindo de hidroxiapatita, fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblasto acídico (aFGF), fator de crescimento de nervo (NGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores de crescimento tipo insulina 1 e 2, (IGF-1 e IGF-2), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de angiogenese de tumor (TAF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de liberação de corticotropina (CRF), fatores de transformação de crescimento α e β (TGF-α e TGF-β) interleukin-8 (IL-8); fator de estimulação de colônia granulócito-macrophage (GM-CSF), interleucinas e interferons.

[0054] Em algumas representações, o dispositivo da presente invenção compreende ainda um material bioabsorvível selecionado do grupo consistindo de ácido poliláctico, ácido poiliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, polidioxanona, policaprolactona, polipeptídeos, policarbonatos, polihidroxibutiratos, poli (alquilene oxalato), copolímeros de vinil acetatos com ácidos carboxílicos não saturados, derivados de celulose solúveis ou dispersáveis em água, polímeros de óxido de etileno, poliacrilamida, colágeno, gelatina, poli (ortoester), poliamidas de aminoácidos, álcool polivinil, pirrolidona polivinil, poleteretercetona, fosfato tricalcium, e suas misturas.

[0055] Pode-se notar que os dispositivos da presente invenção podem ser quaisquer dispositivos para os quais a resistência à calcificação seja desejável. Preferivelmente, o dispositivo é selecionado do grupo consistindo de um coração artificial, um dispositivo de compressão extra-cardíaca, uma prótese de válvula cardíaca, um anel anuloplasty, um enxerto dérmico, um enxerto vascular, um stent vascular, um stent estrutural, um desvio vascular, um desvio cardiovascular, um enxerto dura mater, um enxerto de cartilagem, um implante de cartilagem, um enxerto de pericárdio, uma prótese de ligamento, uma prótese de tendão, uma prótese de bexiga urinária, uma compressa, uma sutura, um dispositivo subcutâneo permanente, um curativo cirúrgico, um stent cardiovascular, um stent revestido e um cateter revestido. Mais preferivelmente, o dispositivo é uma prótese de válvula cardíaca.

[0056] Em algumas representações, o dispositivo compreenderá ainda um fragmento de tecido colhido de um animal ou um análogo sintético de um tecido.

[0057] Preferivelmente, o fragmento de tecido incluirá uma pluralidade de células, que, com a implantação em um local cirúrgico, proliferará e se integrará ao tecido circundante.

[0058] Em um sétimo aspecto, a presente invenção fornece um implante biocompatível, compreendendo um substrato biocompatível compreendendo um biomaterial resistente à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito biomaterial possui um conteúdo de cálcio de menos de cerca de 50ug por mg de biomaterial e no qual o dito biomaterial é capaz de ser implantado por pelo menos 200 dias sem que o biomaterial aumente o seu conteúdo de cálcio acima de 50ug/mg de biomaterial.

[0059] Em um oitavo aspecto, a presente invenção fornece um implante biocompatível, compreendendo um substrato biocompatível compreendendo um biomaterial resistente à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito colágeno compreende aminas secundárias.

[0060] Preferivelmente, os implantes da presente invenção compreenderão ainda um polímero sintético, um polímero natural, um gel injetável, um material cerâmico, tecido autogeneico, tecido alogeneico, tecido xenogeneico e suas combinações.

[0061] Em um nono aspecto, a presente invenção fornece um kit para reparar uma injuria de tecido, compreendendo: (a) um recipiente estéril com um ou mais biomateriais resistentes à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito colágeno compreende aminas secundárias; e (b) instruções para uso em um indivíduo injuriado.

Em um décimo aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de tecido vivo, compreendendo: (a) fornecer um biomaterial resistente à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito colágeno compreende aminas secundárias; e, (b) implantar o biomaterial em um indivíduo que necessite de tratamento.

[0062] O método de tratamento pode ser qualquer tratamento, inclui tratamentos profiláticos e terapêuticos. Preferivelmente, o método de tratamento é selecionado do grupo consistindo de reparação de tecido, proteção de tecido profundo, maior volume de tecido, tratamento cosmético, tratamento terapêutico, aumento de tecido, e selagem de tecido.

[0063] Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção fornece um curativo para ferimento compreendendo um biomaterial resistente à calcificação compreendendo colágeno reticulado, no qual o dito colágeno compreende aminas secundárias.

[0064] Preferivelmente, o colágeno no biomaterial é selecionado do grupo consistindo de colágeno ovino, colágeno bovino, colágeno caprino, colágeno eqüino, colágeno suíno, colágeno marsupial e colágeno humano.

[0065] Em algumas representações, o curativo para ferimento compreende ainda um polisacarídeo sulfatado selecionado do grupo consistindo de heparina, sulfato de condroitina, sulfato dextran, sulfato dermatan, sulfato heparan, sulfato keratan, sulfato hexosaminoglican hexuronyl, hexasulfato inositol, e octasulfato de sacarina. Preferivelmente, o curativo para ferimento compreende também um agente anti-microbial, um agente anti-viral, um fator de crescimento, um agente anti-desidratação ou um agente anti-séptico.

[0066] Preferivelmente, o biomaterial compreende pelo menos 50% de colágeno, mais preferivelmente, pelo menos 70% de colágeno, mais preferivelmente ainda, pelo menos 90% de colágeno e mais preferivelmente ainda, consiste essencialmente de colágeno.

BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS a Figura 1 mostra um tecido de pericárdio de canguru que foi pré-tratado com álcool e então fixado com glutaraldeído comparado com tecido fixado com glutaraldeído i.e. sem pré-tratamento com álcool e tecido “fresco”. a Figura 2 mostra um tecido aórtico de canguru que foi pré-tratado com álcool e então fixado com glutaraldeído comparado com tecido fixado com glutaraldeído i.e. sem pré-tratamento com álcool e tecido “fresco”. a Figura 3 mostra a resistência à degradação enzimática de (A) cúspide suíno e (B) tecidos da parede da aorta. a Figura 4 mostra os níveis quantitativos de cálcio de (A) cúspides de válvula suína explantada e (B) tecido de parede aórtica suína após oito dias em um modelo subcutâneo de rato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REPRESENTAÇÕES PREFERIDAS

[0067] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve-se compreender que esta invenção não está limitada a métodos de produção particularmente exemplificados, que podem, naturalmente, variar. Deve-se compreender também que a terminologia usada aqui tem o objetivo de descrever determinadas representações da invenção apenas, e não pretende ser limitadora sendo limitada apenas pelas reivindicações em anexo.

[0068] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes citados aqui, seja supra ou infra, estão aqui incorporados a título de referencia em sua inteireza. Entretanto, as publicações mencionadas aqui são citadas com o objetivo de descrever e divulgar os protocolos e reagentes que são relatados nas publicações e que podem ser utilizados em conexão com a invenção. Nada aqui deve ser interpretado como um reconhecimento de que a invenção não tem o direito de antecipar tal divulgação em virtude de invenção anterior.

[0069] Além disso, a prática da presente invenção emprega, salvo indicação em contrário, técnicas imunológicas convencionais, química e farmacologia dentro do âmbito da ciência. Tais técnicas são bastante conhecidas dos trabalhadores especializados, e são inteiramente explicadas na literatura. Ver, ex., Coligan, Dunn, Ploegh, Speicher e Wingfield “Current protocols in Protein Science” (1999) volume I e II (John Wiley & Sons Inc.) e Bailey, J. E. E Ollis, D. F., Biochemical Engineering Fundamentais, McGraw-FlilI Book Company, NY, 1986; Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer e Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook of Experimental Immunology, volumes I - IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986).

[0070] Deve-se notar que como utilizado aqui e nas reivindicações em anexo, as formas singulares “um”, “uma”, e “o” incluem a referencia plural a não ser que o contexto claramente disponha de outra forma. Assim, por exemplo, uma referencia a “um agente de reticulação” inclui uma pluralidade de tais agentes, e uma referencia a “um álcool” é uma referencia a um ou mais álcoois, e assim por diante, salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui tem os mesmos significados comumente entendidos pelos especialistas no ramo a que essa invenção pertence. Embora quaisquer materiais e métodos similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados para praticar ou testar a presente invenção, os materiais e métodos preferidos são agora descritos.

[0071] Em um dos aspectos mais amplos, a presente invenção se refere a um método para produzir um biomaterial implantável.

[0072] Como utilizado aqui, o termo “biomaterial” se refere a qualquer material que tenha potencialmente um uso biológico, no qual o material compreende algum colágeno. O colágeno pode ser qualquer tipo de colágeno de qualquer fonte e pode estar presente sozinho ou em combinação com outros materiais. Da mesma forma, o colágeno pode representar de 1 % w/w a 100% do peso total do biomaterial.

[0073] O termo “colágeno” como usado aqui se refere à família extracelular de proteínas fibrosas que são caracterizadas pela sua estrutura rígida helicoidal de filamento triplo. Três cadeias de polipeptídeos de colágeno (“cadeias-x”) são enroladas ao redor de cada uma para formar essa molécula helicoidal. O termo também pretende abranger os vários tipos de colágeno.

[0074] A principal parte da porção helicoidal do colágeno varia pouco entre as espécies mamíferas. Na verdade, uma quantidade de tipos de colágeno possui altos graus de homologias de seqüências de nucleotídeos e aminoácidos. Por exemplo, a homologia de seqüência de nucleotídeos para colágeno alpha I tipo II é pelo menos de 88% quando comparando humanos, eqüinos e murinos. Humanos e eqüinos 93% de homologia de seqüência no nível nucleotídeo, enquanto que camundongos e eqüinos tem 89% de homologia de seqüência. A homologia de seqüência de nucleotídeo para humanos e camundongos é de 88% (ver, NCBI números de acessão U62528 (eqüinos), NM033150 (humanos) e NM031163 (camundongos) http://www.ncbi.nih.gov). Outros tipos de colágeno tem níveis similares de homologia de aminoácidos. Por exemplo, a homologia de seqüência de nucleotídeos entre colágeno suíno alpha I tipo I e colágeno ovino alpha I tipo I é de 90% (ver, NCBI números de acessão AF29287 (ovinos) e AF201723 (suínos) http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

[0075] Dado o nível de linhagem e biologia comuns a vários dos animais acima, o alto grau de homologia de seqüência de aminoácidos e nucleotídeos para colágeno através de um número de espécies tais como gado, ovelhas, camundongos e porcos, um especialista notaria que os métodos para produzir o biomaterial como divulgado aqui são aplicáveis ao material de colágeno isolado de todos os animais mamíferos.

[0076] Da mesma forma, em algumas representações, o biomaterial é isolado ou colhido de um animal de uma das ordens mamíferas i.e. Artiodactyla, Lagomorpha, Rodentia, Perissodactyla, Carnívora e Marsupialia. O animal é preferivelmente um ovino, um bovino, um caprino, um eqüino, um suíno, um marsupial ou um humano. Ao mesmo tempo em que o biomaterial é preferivelmente isolado da mesma espécie de animal que o receptor, considera-se que o biomaterial poderia ser isolado de uma espécie diferente do receptor.

[0077] Alternativamente, em algumas representações, o biomaterial compreende um tecido cultivado, um tecido reconstituído ou semelhante.

[0078] O biomaterial poderia ser qualquer tipo de tecido celular. Por exemplo, o tecido celular poderia ser tecido cardiovascular, tecido pélvico, tecido cardíaco, válvula cardíaca, ramificações da aorta, parede aórtica, folículos da aorta, tecido do pericárdio, tecido conectivo, a matriz de órgãos macios ou sólidos, dura mater, tecido dérmico, um tecido vascular, dura mater, cartilagem, pericárdio, ligamento, veias sangüíneas de tendão, tecido umbilical, tecido ósseo, fáscias, e tecido submucosal ou pele já que todos esses compreendem algum colágeno.

[0079] Também será notado que o biomaterial pode ainda compreender análogos sintéticos formados de polímeros sintéticos, polímeros biológicos purificados, ou ambos, incluindo aqueles geralmente encontrados em matrizes de tecido natural. Polímeros sintéticos adequados incluem, por exemplo, poliamidas e polisulfonas. Polímeros biológicos podem se encontrar naturalmente ou produzidos in vitro por, por exemplo, fermentação ou algo semelhante.

[0080] Polímeros biológicos purificados podem ser apropriadamente formados em um substrato por técnicas como tecelagem, tricô, fundição, moldagem, extrusão, alinhamento celular e alinhamento magnético. Polímeros biológicos adequados incluem, sem limitação, colágeno, elastina, seda, queratina, gelatina, poliaminoácidos, polissacarídeos (ex. celulose e amido), e copolímeros de qualquer um desses. Por exemplo, polímeros de colágeno e elastina podem ser formados em um material implantável sintético por qualquer uma de várias técnicas, tais como tecelagem e moldagem. Análogos de tecido sintético imitam uma matriz de tecido natural. Alternativamente, substratos sintéticos podem ser utilizados para formar um análogo de tecido, seja sozinho ou junto com substratos encontrados naturalmente. Exemplos não limitadores incluem polipropileno, ácido poliláctico, poliéster, nylon, silicone e outros.

[0081] Deve-se notar que enquanto os métodos divulgados aqui podem ter algum efeito sobre biomaterial previamente reticulado, os métodos divulgados aqui tem o objetivo de serem utilizados em material não-reticulado, i.e. “nativo” ou “puro”.

[0082] Uma vez que o biomaterial tenha sido adquirido, ele é preparado para implantação. Os termos “implantação”, “implantável” e “implante” são usados aqui de maneira intercambiável e todos se referem à capacidade do biomaterial, dispositivos e etc. da presente invenção de serem colocados dentro ou sobre tecido vivo de um animal sem levar a rejeição, infecção ou problemas tóxicos. Deve-se entender que o termo “implantável” pode incluir uma parcialidade de biomateriais ou dispositivos e também inclui dispositivos parcialmente implantados etc. como lentes de contato e outros.

[0083] Em uma etapa inicial dos métodos da presente invenção o biomaterial é exposto a uma solução contendo álcool. Como utilizado aqui, o termo “exposto” ou “expondo” se refere à etapa ativa de contatar o biomaterial ou um material contendo colágeno com uma solução contendo álcool como descrito aqui, ou como descrito infra, subsequentemente contatando o biomaterial com agente de reticulação, solução acídica ou outra matéria por um período de tempo suficiente para obter um resultado desejado. Métodos para expor o biomaterial a, por exemplo, a solução contendo álcool, são bastante conhecidos. Por exemplo, e em geral, o biomaterial pode ser “exposto” a álcool, ao se borrifar, mergulhar ou imergir o biomaterial em uma solução compreendendo um álcool.

[0084] O termo “álcool” como utilizado aqui se refere a qualquer álcool conhecido que seja capaz de remover ou reduzir a quantidade de triglicerídios e pelo menos parcialmente esterificar os grupos carboxi encontrados no colágeno. Preferivelmente, o álcool é um álcool solúvel em água. Mais preferivelmente, o álcool é um álcool C1-C6 inferior em uma solução livre de tampão. Mais preferivelmente ainda, o álcool é selecionado de um grupo consistindo de metanol, etanol, ciclohexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, séc-butanol e t-butanol.

[0085] Sem querer se prender a qualquer teoria ou hipótese em particular os inventores consideram que a solução contendo álcool ajuda a soltar a hélice tripla de colágeno e assim expor locais hidrofóbicos (ver, Karube & Nishida, 1979, Biochim Biophys Acta., 23;581 (1): 106-13). Eles também consideram que os grupos carboxi e amina encontrados no colágeno são esterificados na presença da solução contendo álcool de modo que eles se tornem disponíveis para reticulação em etapas posteriores. Assim, uma solução contendo álcool preferida é uma compreendendo pelo menos cerca de 50% v/v, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% v/v e mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 80% v/v de álcool para uma solução aquosa livre de tampão. Em uma representação, a solução de álcool é 70% de etanol v/v em 0,9% de solução salina (contendo 0,5mM PMSF).

[0086] Em uma representação o método da presente invenção fornece um método para produzir um biomaterial implantável compreendendo expor um biomaterial a uma solução livre de tampão contendo álcool compreendendo menos de 100% de álcool por pelo menos 24 horas.

[0087] Em algumas representações a solução contendo álcool, bem como outras soluções e reagentes são “livres de tampão” já que há a hipótese de que os agentes de reticulação contendo aldeído reagem com o tampão durante a fixação causando a polimerização do aldeído.

[0088] A etapa de expor o biomaterial à solução contendo álcool pode ser realizada por qualquer período de tempo contanto que ele seja suficiente para tornar o material resistente à calcificação patogênica in vivo e que a maioria (i.e. uma alta porcentagem) dos grupos carboxi e amina encontrados no colágeno sejam esterificados. Preferivelmente, o biomaterial permanece em contato com a solução contendo álcool por tempo suficiente para permitir que o álcool se difunda e permeie o biomaterial. Mais preferivelmente, o biomaterial é exposto à solução contendo álcool por pelo menos 24 horas, mais preferivelmente ainda por pelo menos 36 horas e mais preferivelmente por 48 horas.

[0089] Uma vez que o biomaterial tenha sido exposto ao álcool ele é removido. Em algumas representações, o biomaterial é enxaguado após a exposição ao álcool em uma solução de enxágüe compreendendo uma solução livre de fosfato de 0,9% de solução salina. Entretanto, qualquer solução aceitável fisiologicamente não tamponada pode ser usada como uma solução de enxágüe. O objetivo da solução de enxágüe é principalmente o de remover o excesso de álcool e assim não é crítica.

[0090] Após o biomaterial ou o material contendo colágeno ter sido exposto ao álcool por mais de 24 horas, ele pode ser usado diretamente para implantação. Embora o álcool pré-fixação tenha sido usado previamente por outros, ele tem sido tradicionalmente usado mais para esterilizar o tecido do que para a esterificação dos grupos carbóxi e amina encontrados no colágeno. Assim, o tempo de exposição ao álcool tem sido relativamente curto, ex. menos de 24 horas e não suficiente para permitir a total penetração do tecido pelo álcool. Como resultado não houve avaliação, anterior à presente invenção, de que um biomaterial resistente à calcificação (ver definição infra) poderia ser produzido por uma exposição prolongada, i.e. mais de 24 horas, de um biomaterial a uma solução contendo álcool. Isso significa que o biomaterial, após a exposição à solução contendo álcool por mais de 24 horas, poderia ser implantado diretamente (descrito infra) como um biomaterial resistente à calcificação. No entanto, poderá ser notado pelos especialistas na área que uma forma superior de biomaterial resistente à calcificação pode ser produzido pela reticulação do biomaterial após a etapa (a).

[0091] Da mesma forma, em algumas representações da presente invenção o biomaterial ou material contendo colágeno após a exposição ao álcool é então exposto a um ou mais agentes de reticulação bifuncionais. O termo “bifuncional” como usado aqui se refere aos dois grupos aldeído funcionais, presentes em ambas as extremidades da cadeia de cinco carbonos. A reticulação pode ser efetuada por qualquer técnica conhecida, com qualquer forma de agente de reticulação contanto que seja capaz de reticular o colágeno. Agentes de reticulação incluem, mas não estão limitados a, compostos de acilação, adipil cloreto, aldeídos, halóides de alquila e arila, bisimidatos, carbodiimidas, divinil sulfona (DVS), formaldeído, glutaraldeído, glicoxal, diisocianato de hexametileno, hidroxicloreto, hidroxietil, metacrilato divinil sulfona (HEMA-DIS-HEMA), imidoesteres, isocianatos, luz (ex. luz azul e luz UV), N-hidroxisuccinimida, malemidas N-substituídas, pH, polialdeído, difenilfosforil azida (DPPA), compostos de poliepoxi compreendendo espinha dorsal de 17-25 carbonos e 4-5 grupos epóxi, éteres poliepoxi, polietileno glicol divinil sulfona (VS-PEG-VS), poliglicerol poliglicidil éter e temperatura e combinações dos mesmos.

[0092] Em algumas representações, o agente de reticulação é um agente de reticulação químico como carbodiimida, éteres poliepoxi, divinil sulfona (DVS), genipina, glutaraldeído, formaldeído e difenilfosforil azida (DPPA).

[0093] Também foi demonstrado que compostos de poliepoxi compreendendo espinha dorsal de 17-25 carbonos e 4-5 grupos epóxi mostram uma alta eficiência para o colágeno reticulado. (ver, por exemplo, Pedido de Patente US No. 20040059430 (número de serie 10/618,447). Também foi demonstrado que a toxidade dos compostos poliepoxi é mais baixa do que a do glutaraldeído, e e a antigenicidade ou indução imune-resposta dos tecidos diminui na proporção do tempo de reação, no caso de reagir com moléculas de polipeptídeos helicoidais como o colágeno. Naturalmente, ele mostra uma relativamente boa biocompatibilidade (ver, por exemplo, Lohre et al., (1992), Artif. Organs, 16:630-633; Uematsu et al., (1998), Artif. Organs, 22:909-913). Conseqüentemente, os compostos poliepoxi como descritos são um agente de reticulação preferido.

[0094] Em algumas representações, o agente de reticulação compreende cerca de 1 % de glutaraldeído e o tempo de exposição é de pelo menos cerca de 24 horas. Será visto que o tempo de exposição do biomaterial ao agente de reticulação depende do agente utilizado, da concentração e da temperatura. Tipicamente, o tempo de exposição é entre 24 horas e 28 dias. A determinação da quantidade precisa de tempo de exposição para o biomaterial ao agente de reticulação está bem dentro do âmbito de conhecimento de um especialista na área.

[0095] Mais uma vez, sem o desejo de se limitar a qualquer teoria ou hipótese em particular, os inventores consideram que expondo-se o biomaterial que foi exposto ao álcool a um agente de reticulação, os grupos carbóxi esterificados e grupos amina no colágeno presente no biomaterial são reticulados.

[0096] Embora seja visto pelos especialistas que a temperatura na qual cada uma das etapas da presente invenção é realizada não é crítica, deve-se entender que preferivelmente a temperatura é de entre 2°C e 40°C, mais preferivelmente entre 4°C e 30°C e mais preferivelmente ainda entre 5°C e 25°C.

[0097] Mais uma vez, após a etapa de reticulação, o biomaterial é preferivelmente enxaguado em solução de enxágüe como usada após a etapa (a) de exposição ao álcool. No entanto, será ainda avaliado que a etapa de enxágüe é meramente uma preferência.

[0098] Seguindo a etapa de reticulação, ou se utiizado a etapa de enxágüe após a etapa de reticulação, o biomaterial pode ser então exposto a uma solução acídica contendo qualquer ácido capaz de inativar e/ou modificar as metades de agentes de reticulação fixados e/ou não fixados presentes no biomaterial após a etapa (b) para remover ou reduzir locais de ligação de cálcio disponíveis. Alternativamente, ou em adição a, a solução acídica utilizada na etapa (c) contém qualquer ácido capaz de ainda reticular os grupos carbóxi ativados com os grupos amina ativados no colágeno para formar ligações de amido.

[0099] Preferivelmente, a solução acídica compreende pelo menos um ácido aminocarboxílico. O termo “ácido aminocarboxílico” como utilizado aqui é qualquer ácido com pelo menos um grupo amina e pelo menos um ácido carboxílico substituinte. Exemplos representativos de ácidos carboxílicos que são úteis na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, L-glutamato, L-aspartato, L-lisina, L-arginina, L-histidina. O objetivo da solução acídica é duplo: em primeiro lugar, o ácido aminocarboxílico auxilia na inativação e/ou modificação das metades de agentes de reticulação fixados e não fixados, dessa forma reduzindo ou aliviando quaisquer efeitos biológicos adversos. Em segundo lugar, o ácido aminocarboxílico também reticula os grupos carbóxi ativados com os grupos amina ativados no colágeno para formar ligações de amido.

[0100] A concentração do ácido aminocarboxílico dependerá do ácido real utilizado e outros parâmetros tais como a massa total do biomaterial usado e outros. Além disso, um índice mínimo de peso impregnado de ácido aminocarboxílico seria de cerca de 1:4. O aspecto mais importante da solução acídica é o pH. O pH deve ser abaixo de pH7, preferivelmente abaixo de pH6, mais preferivelmente abaixo de pH5 e mais preferivelmente abaixo de pH4.6.

[0101] Em uma representação, a solução acídica é de 8mg de ácido aminocarboxílico por milímetro de água deionizada, que é livre de fosfato e cerca de pH4.

[0102] O biomaterial é exposto ao ácido aminocarboxílico por pelo menos 6 horas, mais preferivelmente pelo menos 24 horas, mais preferivelmente ainda mais de 48 horas. Embora a temperatura de incubação não seja crítica, ela é preferivelmente entre 5°C e 55°C, mais preferivelmente entre 10°C e 45°C, mais preferivelmente cerca de 45°C.

[0103] Em algumas representações, a etapa (c) dos métodos divulgados é substituída ou suplementada por um método de inibir a formação de metaloproteinase nas moléculas de elastina presentes no biomaterial. Especificamente, em tecidos como o tecido da aorta está presente uma porcentagem mais alta de elastina do que em outro tecido. Essas moléculas de elastina podem fornecer locais para a formação de metaloproteinase assim esses locais precisam ser reduzidos, removidos ou inativados. Como mostrado no Exemplo 1 infra, uma solução livre de tampão, contendo um cátion multi-valente como o magnésio, sais férricos e alumínio pode ser utilizada para reduzir a formação de metaloproteinase.

[0104] O biomaterial, após a etapa de expor o biomaterial ou material contendo colágeno à solução acídica e/ou solução livre de tampão contendo um cátion multi-valente, é mais uma vez preferivelmente enxaguado em solução de enxágüe. Em algumas representações, o biomaterial é também esterilizado.

[0105] A etapa de esterilizar o biomaterial é por qualquer método de esterilização conhecida para material contendo colágeno. Por exemplo, o biomaterial pode ser sujeito a um agente esterilizante (ex. um liquido esterilizante como 0.2-2.0% por peso de solução de glutaraldeído) para um período de tempo de esterilização. Uma solução de 0.625% de glutaraldeído pode ser utilizada em combinação com calor (i.e. aquecimento acima da temperatura ambiente, mas abaixo de uma temperatura que causaria dano ao biomaterial), como o esterilizante. Alternativamente, uma solução esterilizante adequada pode compreender uma solução aquosa osmoticamente balanceada sozinha ou em combinação com uma fonte não-contatante de esterilização (ex., radiação, raio de elétron, UV, ou outro expediente similar), ou incluir uma solução aquosa de glutaraldeído em combinação com fosfato tamponado salino. Em instâncias onde uma solução de 0.625% de glutaraldeído é utilizada como o esterilizante, o período de tempo de esterilização pode ser de 1 -6 dias a 37°C ou 1-2 dias a 50°C). Essa etapa terminal de esterilização pode ser realizada após a embalagem do biomaterial no seu recipiente final, eliminando assim a necessidade de qualquer manuseio subseqüente do biomaterial até o tempo de implantação.

[0106] Em uma representação preferida, o biomaterial é esterilizado pela exposição do biomaterial a 0.25% de glutaraldeído em água deionizada contendo 9.07 g/1 de potássio di-hidrogenio fosfato tamponado.

[0107] A etapa de esterilização pode ser realizada por qualquer período de tempo e pode incluir armazenamento. A temperatura de esterilização é preferivelmente realizada entre 40-50°C por mais de 60 minutos.

[0108] O biomaterial, após o tratamento com os métodos divulgados aqui, possui um alto nível de resistência à calcificação i.e. ele é um “biomaterial resistente à calcificação”. O termo “calcificação” como usado aqui se refere a um dos principais problemas patológicos associados com biomaterial produzido tradicionalmente compreendendo proteínas do tecido conjuntivo (i.e., colágeno e elastina). Foi previamente mostrado que esses materiais podem se tornar calcificados seguindo a implantação no interior do corpo. Tal calcificação pode resultar em endurecimento indesejável ou degradação do biomaterial. Dois (2) tipos de calcificação: intrínseca e extrínseca são conhecidas por ocorrer em biomaterial de colágeno fixado, embora o exato mecanismo(s) pelo qual tal calcificação ocorra seja desconhecido. A calcificação intrínseca é caracterizada pela precipitação de íons de cálcio e fosfato no tecido bioprotético fixado, incluindo a matriz de colágeno e células remanescentes. A calcificação extrínseca é caracterizada pela precipitação de íons de cálcio e fosfato em trombo aderente, incluindo células aderentes (ex., plaquetas) para o biomaterial e o desenvolvimento de placas de superfície de cálcio contendo fosfato no biomaterial.

[0109] Conseqüentemente, a frase “alto nível de resistência à calcificação” ou “resistente à calcificação” quando aplicada ao biomaterial da presente invenção significa que o biomaterial, após implantação in vivo por pelo menos 200 dias, mostra menos de 50ug, preferivelmente menos de 20ug, e ainda mais preferivelmente menos de 10ug de cálcio por mg de tecido seco após a sua remoção.

[0110] Preferivelmente, o biomaterial da presente invenção é também resistente à degradação enzimática. O termo “resistente à degradação enzimática” como usado aqui se refere à capacidade do biomaterial da presente invenção para suportar a degradação enzimática a um nível comparável com o tecido fixado tradicional.

[0111] Uma vez formado, o biomaterial implantável ou material contendo colágeno da presente invenção pode então ser utilizado para tratar um número de problemas de saúde ou desordens.

[0112] Geralmente, os termos “tratando”, “tratamento” e outros são usados aqui significando agir sobre um indivíduo ou animal, seus tecidos ou células para obter um efeito farmacológico ou fisiológico desejado. O efeito é especialmente terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de um problema de saúde e/ou desordem. “Tratar” como é usado aqui engloba qualquer tratamento de um problema de saúde e/ou desordem em um vertebrado, um mamífero, particularmente um humano, e inclui: (a) inibir o problema de saúde e/ou desordem, i.e., deter o seu desenvolvimento; ou (b) atenuar ou melhorar os sintomas do problema de saúde e/ou desordem, i.e., causar a regressão dos sintomas da enzimática degradação/problema de saúde e/ou desordem.

[0113] Os termos “problema de saúde” e/ou “desordem” são usados aqui de maneira intercambiável e se referem a problemas de saúde anormais afetando animais, incluindo humanos, que podem ser tratados utilizando o biomaterial da presente invenção. Da mesma forma, o tratamento de um ferimento, uma lesão, degeneração de tecido, infecção microbiana, uma queimadura, uma úlcera, problema dermatológico estão incluídos na presente invenção. Além disso, a substituição de válvulas cardíacas, ramificações da aorta, parede da aorta, folículos da aorta, tecido do pericárdio, tecido conjuntivo, dura mater, tecido da derme, um tecido vascular, cartilagem, pericárdio, ligamentos, vasos sanguíneos do tendão, tecido umbilical, tecido ósseo, fáscias, e tecido subcutâneo também são abrangidos.

[0114] O biomaterial resistente à calcificação da presente invenção também pode ser aplicado a qualquer uma de uma ampla variedade de superfícies de contato de dispositivos médicos. Superfícies de contato incluem, mas não estão limitadas a, superfícies que tem a finalidade de contatar sangue, células ou outros fluidos ou tecidos corporais de um animal, incluindo especificamente um humano. Superfícies de contato adequadas incluem uma ou mais superfícies de dispositivos médicos que tem o objetivo de contatar sangue ou outros tecidos. Os dispositivos médicos incluem espirais de aneurisma, vasos sanguíneos artificiais, corações artificiais, válvulas artificiais, rins artificiais, tendões e ligamentos artificiais, bolsas de sangue, oxigenadores de sangue, substitutivos ósseos e cardiovasculares, próteses ósseas, ceras ósseas, enxertos cardiovasculares, dispositivos de substituição de cartilagem, cateteres, lentes de contato, recipientes para cultura e regeneração de células e tecidos, partículas de embolização, sistemas de filtração, enxertos, canais de guia, cateteres definitivos, instrumentos de laboratório, microglóbulos, guias de crescimento de nervo, implantes oftálmicos, implantes ortopédicos, guias de marca-passo, sondas, próteses, desvios, stents, apoios para peptídeos, instrumentos cirúrgicos, suturas, seringas, substitutivos do trato urinário, coberturas de ferimentos, curativos para ferimentos, dispositivos de cura de ferimentos e outros dispositivos médicos conhecidos.

[0115] Outros exemplos de dispositivos médicos que se beneficiariam da aplicação da presente invenção devem ser logo percebidos pelos especialistas na área de procedimentos médicos e cirúrgicos e são conseqüentemente contemplados pela atual invenção. A superfície de contato pode incluir uma malha, espiral, fio, balão inflável, ou qualquer outra estrutura que seja capaz de ser implantada em uma locação alvo, incluindo locações intravasculares, locações intralumenais, locações dentro de tecido sólido, e outros. O dispositivo implantável pode ter como objetivo uma implantação permanente ou temporária. Tais dispositivos podem ser distribuídos ou incorporados em cateteres intravasculares ou outros cateteres médicos.

[0116] O processo de revestir as superfícies desses dispositivos pode ser realizado pela técnica de revestimento de plasma, como descrito no pedido de patente internacional N°. W096/24392.

[0117] Em uma representação preferida, os biomateriais da presente invenção são utilizados diretamente como curativos de ferimentos. Por exemplo, como descrito supra, os biomateriais podem ser secados e usados como um curativo de ferimento diretamente.

[0118] Os curativos de ferimento da presente invenção são preferivelmente na forma de uma placa contínua, similar aos curativos de ferimentos conhecidos. No entanto a invenção também ter outras conformações em particular. Por exemplo, os curativos de ferimentos da presente invenção podem ser produzidos cortando-se um desejado padrão de traçado de placas de matéria prima do biomaterial descrito acima. Por exemplo, a placa pode ser cortada a cunho das placas de biomaterial.

[0119] Em serviço, os curativos de ferimento da presente invenção são preferivelmente utilizados como o curativo primário colocado em contato direto com a base do ferimento ou tão perto quanto prático contra a base do ferimento. Os curativos podem servir como material de acondicionamento, e, se for preciso, pode ser firmado em posição por qualquer curativo ou dispositivo secundário adequado, como um envoltório, fita, gaze, tampão, sutura ou presilha. Os curativos podem ser temporários ou permanentes, e podem ser permanentemente incorporados aos tecidos curados. Quando necessário, os curativos são trocados primeiramente removendo-se qualquer material de sobre-curativo e então removendo o curativo, pelo qual qualquer tecido necrosado acumulado é retirado. O curativo temporário da presente invenção pode ser substituído por um novo curativo ou qualquer outra cobertura de ferimento adequada.

[0120] Os curativos podem ser colocados na sua inteireza em um ferimento. Os curativos da presente invenção podem ser cortados, moldados e modificados para acomodar numerosos usos e aplicações.

[0121] Uma outra utilização para os biomateriais da presente invenção está na distribuição de agentes terapeuticamente ativos incluindo em qualquer das aplicações anteriormente mencionadas. Agentes terapeuticamente ativos podem participar em, e melhorar, o processo de cura de ferimentos, e podem incluir agentes antimicrobianos, incluindo mas não limitado a agentes antifúngicos, agentes antibacterianos, agentes antivirais e agentes antiparasitários, fatores de crescimento, fatores angiogênicos, agentes antiinflamatórios, agentes antitrombóticos, anestésicos, mucopolissacarídeos, metais e outros agentes de cura de ferimentos.

[0122] Exemplos de agentes antimicrobianos que podem ser usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, isoniazida, etambutol, pirazinamida, estreptomicina, clofazimina, rifabutin, fluoroquinolonas, ofloxacin, sparfloxacin, rifampin, azitromicina, claritromicina, dapsona, tetraciclina, eritromicina, ciprofloxacin, doxiciclina, ampicilina, anfotericin B, cetoconazole, fluconazole, pirimetamina, sulfadiazina, clindamicina, lincomicina, pentamidina, atovaquona, paromomicina, diclazaril, aciclovir, trifluororidina, foscarnet, penicilina, gentamicina, ganciclovir, iatroconazole, miconazole, Zn-piritiona, metais pesados incluindo, mas não limitado a, ouro, platina, prata, zinco e cobre, e suas formas combinadas incluindo sais, tais como cloreto, brometo, iodeto e periodato, e complexos com catalisadores, e outras formas.

[0123] Agentes de fator de crescimento que podem ser incorporados aos dispositivos de curativos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblasto acídico (aFGF), fator de crescimento de nervo (NGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fatores de crescimento tipo insulina fatores 1 e 2, (IGF-1 e IGF-2), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF), fatores de angiogênese de tumor (TAF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de liberação de corticotropina (CRF), fatores de crescimento de transformação a e b (TGF-a e TGF-b) interleukin-8 (IL-8); fator de estimulação de colônia granulócito-macrophage (GM-CSF); os interleukins e os interferons.

[0124] Outros agentes que podem ser incorporados aos curativos da presente invenção são mucopolissacarídeos ácidos incluindo, mas não limitado a, heparin, heparin sulfato, heparinoides, dermatan sulfato, pentosan polisulfato, celulose, agarose, quitina, dextran, carrageenin, ácido linoléico e alantoína.

[0125] Exemplos de agentes antiinflamatórios e antitrombóticos incluem endometicina, heparin, indometacina, ibuprofeno, aspirina, salicilato de colina, diflunisal, salicilato de magnésio, salicilato de colina magnésio, salsalato, flurbiprofeno, fenoprofeno, quetoprofeno, naprosin, naproxen sódio, oxaprozin, diclofenaco de sódio, diclofenaco de misoprostol, etodolac, indocid, ketorolac, natumetona, sulindac, tolmetin, sulfinpirazona, dipiridamole, ticlopidina, valdecoxib, rofecoxib, piroxicam, meloxicam, meclofenamato de sódio, ácido mefenâmico, ciclofosfamida, ciclosporine, micromulsão, clorambucil, anagrelide, clopidogrel, e cilostazol; o agente antitrombose pode ser um anticoagulante selecionado do grupo consistindo de heparin, ardeparin, e enoxaparin, tinzaparin, danaparoide, elpiruden e hirudin.

[0126] Os agentes terapeuticamente ativos podem ser ligados, seja física ou quimicamente, aos biomateriais da presente invenção por métodos bastante conhecidos na área.

[0127] Com o termo “compreendendo” queremos dizer incluindo, mas não limitado a, o que quer que venha após a palavra “compreendendo”. Assim, o uso do termo “compreendendo” indica que os elementos listados são exigidos ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem estar ou não presentes. Com o termo “consistindo de” queremos dizer incluindo, e limitado a, o que quer que venha após a frase “consistindo de”. Dessa forma, a frase “consistindo de” indica que os elementos listados são exigidos ou obrigatórios, e que nenhum outro elemento pode estar presente. “Consistindo essencialmente de” significa incluindo quaisquer elementos listados após a frase, e limitado a outros elementos que não interferem com ou contribuem para a atividade ou ação especificada na divulgação dos elementos listados. Assim, a frase “consistindo essencialmente de” indica que os elementos listados são exigidos ou obrigatórios, mas que outros elementos são opcionais e podem ou não estar presentes dependendo de se eles afetam ou não a atividade ou ação dos elementos listados.

[0128] A invenção será agora descrita também a título de referencia apenas para os seguintes exemplos não limitadores. Deve-se compreender, no entanto, que os exemplos seguintes são apenas ilustrativos, e não devem ser vistos de forma alguma como uma restrição à generalidade da invenção descrita acima. Em particular, embora a invenção seja descrita em detalhe em relação ao tratamento do pericárdio, ramificações aórticas valvuladas, folículos de válvulas e tecidos da parede aórtica de fontes de bovinos, suínos e marsupiais, ficará claro que as descobertas aqui não estão limitadas a esses tecidos específicos ou fontes animais.

EXEMPLO 1 - PROCESSAMENTO BÁSICO DO BIOMATERIAL

[0129] Corações de cangurus adultos cinza ocidentais foram colhidos por um caçador de cangurus profissional na Austrália Ocidental e transportados para o laboratório em pacotes de gelo dentro de 4-6 horas após a morte. Os corações foram lavados duas vezes em solução salina gelada a 0.9%. O pericárdio foi removido e cuidadosamente limpo da gordura aderente e tecido conjuntivo solto. As ramificações da aorta com as válvulas aórticas foram dissecadas dos corações e colocadas em solução salina gelada a 0.9% contendo 0.5mM fenil-metil-sulfonil-fluoreto (PMSF). O pericárdio foi armazenado durante a noite a 4°C em solução salina gelada a 0.9% contendo O.õmM PMSF e as ramificações da aorta valvuladas foram lavadas por 20 minutos na solução salina a 0.9% contendo PMSF.

[0130] Uma solução contendo álcool e solúvel em água de 60-80% v/v por volume de álcool etanol foi preparada. O pericárdio foi imerso na solução alcoólica após o armazenamento durante a noite a 4°C. As ramificações aórticas valvuladas foram imersas na mesma solução alcoólica imediatamente após a lavagem final em salina gelada a 0.9% (contendo 0.5%mM PMSF). O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram mantidos na solução alcoólica a cerca de 5°C por um mínimo de 24 horas.

[0131] O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram removidos da solução alcoólica e enxaguados por cerca de 10 minutos com 0.9% de solução salina. Durante o período de enxágüe, a temperatura da solução de enxágüe foi mantida a aproximadamente 10°C.

[0132] O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram imersos em uma solução a 0.625% de glutaraldeído contendo 9.07g/1 de potássio di-hidrogênio fosfato tampão em água estéril deionizada, o pH da solução de glutaraldeído foi ajustada para 7.4 com hidróxido de sódio. O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram fixados na solução de glutaraldeído a 1-5°C por um período mínimo de 24 horas para reticular as proteínas presentes no colágeno dos tecidos.

[0133] O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram removidos da solução de glutaraldeído e enxaguados em um cloreto de sódio estéril a 0.9% por cerca de 15 minutos. Durante o período de enxágüe, a temperatura da solução de enxágüe foi mantida a aproximadamente 10°C.

[0134] O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram então tratados por dois procedimentos alternativos. No primeiro procedimento, o pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram imersos em uma solução livre de tampão contendo 8mg de ácido dicarboxílico por 1ml de volume de água deionizada. O pH da solução foi ajustado para um pH de 4.5 com um volume de ácido clorídrico diluído. O pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram imersas na solução a uma temperatura de cerca de 45°C por cerca de 48 horas.

[0135] No segundo procedimento o pericárdio e as ramificações aórticas valvuladas foram imersos em uma solução livre de tampão, contendo um cátion multi-valente como magnésio, sais férricos e alumínio, dissolvido em água deionizada, a um pH de 3.5 por cerca de 60 minutos.

[0136] O biomaterial foi então esterilizado pela imersão do tecido em uma solução a 0.25% de glutaraldeído contendo 9.07g/1 de potássio di-hidrogênio fosfato tampão em água estéril deionizada. O pH da solução de aldeído foi ajustado para 7.4 com hidróxido de sódio. O processo de esterilização foi realizado a uma temperatura de cerca de 45°C por cerca de 120 minutos.

[0137] Alternativamente, o biomaterial foi esterilizado em uma solução aquosa compreendendo 2% de Epoxipropano combinado com 20% de álcool etílico por peso a 37°C por cerca de 24 horas. O tecido esterilizado foi então armazenado em 0.2% de glutaraldeído tamponado mais 15% de isopropanol. EXEMPLO 2 - EFEITO DA TEMPERATURA NO BIOMATERIAL

[0138] A temperatura de desnaturação é uma importante medida da estabilidade de reticulação e reflete a força, durabilidade e integridade do material.

[0139] Foi obtido um pericárdio bovino de um abatedouro na Austrália Ocidental e transportado para o laboratório em gelo. O pericárdio foi limpo como descrito no Exemplo 1.

[0140] O grau de reticulação do pericárdio bovino como preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1, foi comparado com o pericárdio bovino fixado em 0.625% de glutaraldeído tamponado (Pericárdio Controle).

[0141] Tiras de amostras de pericárdio representativas (5x10 mm) em cada grupo foram ligadas a um transformador de energia isométrica (MLT0500, AD Instruments, Austrália), em contato com um sistema de aquisição de dados PowerLab e um computador. Amostras foram mantidas em constante extensão com uma carga de 90 + 5g e imersas em um banho de água aberto de temperatura controlada cheio de 0.9% de solução salina. A temperatura do banho de água foi gradualmente aumentada a aproximadamente 1.5°C/min. de 25°C a 95°C. A temperatura de encolhimento foi indicada em um ponto agudo de deflexão de extensão constante quando o material de colágeno foi desnaturado. Os resultados (temperatura de encolhimento expressa como graus Celsius) estão resumidos na Tabela I.

Tabela I

EXEMPLO 3 - DEGRADAÇÃO ENZIMÁTICA DO BIOMATERIAL

[0142] O nível de resistência à degradação enzimática do pericárdio bovino, preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplol (pericárdio tratado), foi comparado com pericárdio bovino fixado em 0,625% de glutaraldeído tamponado (pericárdio controle).

[0143] Uma solução de pronase foi preparada dissolvendo-se 100mg de pronase (Streptomyces griseus) e 100mg de cloreto de cálcio, em em 200ml de solução tamponada de HEPES (0,01 M, pH7,4), contendo 0,1M de glicina. Amostras de tecidos fixados foram enxaguadas em água deionizada por 3 minutos, secas com mata borrão, secas durante a noite a 70°C e pesadas. Essas amostras foram incubadas na solução de pronase a 50°C por 24 horas. Amostras de tecido remanescentes foram enxaguadas em água deionizada, secas durante a noite a 70°C e pesadas. A resistência à digestão de pronase foi determinada pela massa do tecido remanescente, expressa como uma porcentagem de massa de tecido pré-digerida. Os resultados estão resumidos na Tabela II.

Tabela II

EXEMPLO 4 - FORCA TÊNSIL DO BIOMATERIAL

[0144] A força tênsil é uma medida importante da força do material e reflete a durabilidade dos tecidos reticulados.

[0145] A força tênsil do pericárdio bovino, preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 1 (pericárdio tratado), foi comparada com o pericárdio bovino fixado em 0.625% de glutaraldeído tamponado (pericárdio controle).

[0146] A força tênsil das tiras de pericárdio representativas (8 x 80 mm) de ambos os grupos de tecidos foi medida com uma maquina hidráulica de teste tênsil Zwick/Roell (Modelo 2010), adaptada a uma célula de carga 10 kNewton a um índice de extensão constante de 50mm/min. A força tênsil e o alongamento na interrupção foram avaliados a partir das curvas carga/alongamento registradas. Os resultados estão resumidos na Tabela III.

Tabela III

EXEMPLO 5 - PERFIL DE CALCIFICACÃO DO BIOMATERIAL

[0147] Estudos experimentais em modelos de animais pequenos e grandes foram realizados para avaliar a efetividade do processo acima descrito em mitigar a calcificação dos biomateriais contendo colágeno tratado.

[0148] No primeiro estudo animal, folículos de válvulas de canguru e tecidos da parede aórtica de canguru, preparados por fixação padrão em apenas 0.625% de glutaraldeído (tecido não-tratado), foram comparados com folículos de válvulas de canguru e tecidos da parede aórtica de canguru tratados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1 (tecido tratado).

[0149] Amostras de tecido da parede aórtica (10 x 5mm de tamanho) e folículos de válvula aórtica de ambos os grupos foram enxaguados em 0.9% de solução salina por 5 minutos. Os tecidos enxaguados foram cirurgicamente implantados em cavidades subcutâneas (uma amostra de cada grupo por rato), criadas na área da parede central dorsal de ratos machos Wistar em crescimento (6 semanas de idade). Após 60 dias, os tecidos explantados foram dissecados do tecido hospedeiro circunvizinho e secos em uma incubadora Biotherm (Selby Scientific, Perth, WA) a 90°C por 48 horas. As amostras secas foram pesadas, e o conteúdo de cálcio extraído em 5.0ml 6 N de ácido clorídrico ultrapuro (Merck, Perth, WA) a 75°C por 24 horas. O conteúdo de cálcio extraível foi então medido utilizando-se um espectrômetro de absorção atômica (Varian AA1275) e expresso como ug cálcio por mg tecido (peso seco). Esses dados foram resumidos na Tabela IV.

Tabela IV

[0150] A efetividade do novo processo em mitigar a calcificação é logo aparente na Tabela IV. Os níveis de cálcio nos tecidos tratados foram comparados com níveis normais presentes em tecidos não-fixados e conseqüentemente demonstram a superioridade do novo processo comparado à fixação padrão de glutaraldeído somente.

EXEMPLO 6 - OUTROS ESTUDOS DE CALCIFICACÃO EM OVELHAS

[0151] Em um outro estudo animal, condutos aórticos valvulados de canguru, fixados em 0.625% de glutaraldeído tamponado como descrito no Exemplo 1 (tecido tratado) foram comparados com ramificações aórticas valvuladas extraídas como no Exemplo 1 (tecido não-tratado). As ramificações aórticas foram enxaguadas em 0.9% de solução salina por 5 minutos e implantadas cirurgicamente na posição arterial pulmonária de ovelhas mestiças Merino-Dorset jovens (4 meses de idade). Esses implantes valvulados foram removidos após 200 dias e o conteúdo de cálcio dos folículos valvulares e tecidos da parede aórtica determinados por espectrometria de absorção atômica como descrito acima.

[0152] Os resultados (ug de Cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela V.

Tabela V

EXEMPLO 7 - OUTROS ESTUDOS DE CALCIFICACÃO COM TECIDO DERIVADO DE PORCOS

[0153] Em outro estudo animal, condutos valvulados aórticos de suíno não-tratado, fixados em 0.625% de glutaraldeído tamponado (tecido não-tratado) foram comparados com condutos valvulados de suínos preparados de acordo com o método descrito no Exemplo 1 (tecido tratado). Os condutos valvulados de suínos foram enxaguados em 0.9% de solução salina por 5 minutos e implantados cirurgicamente na posição arterial pulmonária de ovelhas mestiças Merino-Dorset jovens (4 meses de idade). Esses implantes valvulados foram removidos após 200 dias e o conteúdo de cálcio dos folículos de válvula e tecidos da parede aórtica determinados pelo espectrômetro de absorção atômica descrito supra.

[0154] Os resultados (ug de Cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela VI.

Tabela V

EXEMPLO 8 - CALCIFICAÇÃO DE PERICÁRDIO BOVINO

[0155] Em outro estudo animal, o potencial de calcificação do pericárdio bovino fixado em 0.625% de glutaraldeído tamponado (pericárdio controle) foi comparado com o potencial de calcificação do pericárdio bovino preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 1 (pericárdio tratado). Amostras representativas de cada grupo foram aparadas para o tamanho de 1 x 1cm e enxaguadas em 0.9% de solução salina por 5 minutos. Essas amostras foram implantadas cirurgicamente em cavidades subcutâneas, criadas na área da parede dorsal central de ratos machos Wistar em crescimento (6 semanas de idade). Esses tecidos foram removidos após 60 dias, tecido hospedeiro removido e o conteúdo de cálcio determinado por espectrometria de absorção atômica. Os resultados (ug de Cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela VII.

Tabela VII

EXEMPLO 10 - CALCIFICAÇÃO DE PERICÁRDIO DE CANGURU

DECELULARIZADO

[0156] Em outro estudo animal, o potencial de calcificação do pericárdio de canguru fixado em 0.625% de glutaraldeído tamponado (pericárdio controle) foi comparado com o potencial de calcificação do pericárdio de canguru, que tinha sido decelularizado e preparado de acordo com os métodos descritos no Exemplo 1 (pericárdio tratado).

[0157] Amostras representadas de cada grupo foram aparadas para o tamanho de 1 x 1cm e enxaguadas em 0.9% de solução salina por 5 minutos. Essas amostras foram então cirurgicamente implantadas em cavidades subcutâneas, criadas na área da parede dorsal mid-abdominal de ratos machos Wistar em crescimento (6 semanas de idade). Esses tecidos foram removidos após 60 dias, tecido hospedeiro removido e o conteúdo de cálcio determinado por espectrometria de absorção atômica por procedimentos padrão. Os resultados (ug de cálcio por mg de tecido seco) estão resumidos na Tabela VIII.

Tabela VIII

EXEMPLO 11 - RECELULARIZACÃO DE PERICÁRDIO DE CANGURU DECELULARIZADO

[0158] No sexto estudo animal, a potencial recelularização de pericárdio de canguru decelularizado fixado em 0.625% de glutaraldeído tamponado (pericárdio controle) foi comparada com a potencial recelularização de pericárdio de canguru decelularizado preparado de acordo com o método descrito no Exemplo 1 (pericárdio tratado). O pericárdio do canguru foi decelularizado por 24 horas em temperatura ambiente em 0.25% de Triton x-100 e 0.25% de sulfato dodecil de Sódio e enxaguado em meio de cultura por 20 minutos. Amostras representadas de cada grupo (n=5) de pericárdios foram aparadas para 2 x 2 cm de tamanho e enxaguadas em 0.9% de solução salina por 5 minutos. Essas amostras foram semeadas sob condições estéreis com 3.0 x10 5 de fibroblastos humanos/cm2, colhidos de veia safena humana. O pericárdio semeado foi incubado a 37°C em condições de cultura de célula estática padrão por 21 dias. O crescimento da célula foi avaliado microscopicamente a cada 7 dias e categorizado de acordo com a seguinte escala visual de: 1) . Sem fibroblastos viáveis presentes na superfície da matriz; 2) . Menos de 50% da superfície da matriz coberta com fibroblastos (+); 3) . Mais de 50% da superfície da matriz coberta com fibroblastos (++); 4) . Matriz completamente coberta por múltiplas camadas de fibroblastos (+++)■ [0159] Um rápido teste colorimétrico, MTT (3- [4,5-dimetiltiazol-2-yl] teste de -2,5 de brometo de difeniltertra-zolium foi empregado no vigésimo primeiro dia para confirmar a ausência de fibroblastos viáveis no pericárdio controle e presença de fibroblastos viáveis no pericárdio tratado (para o método MTT ver, por exemplo, Zund et ai, 1999, Eur J Cardiothorac Surg., 15 (4) :519-24). Os resultados estão resumidos na Tabela IX.

Tabela IX

EXEMPLO 12 - ESTABILIDADE RETICULADA DO TECIDO DE CANGURU

[0160] Dois tipos de tecidos de canguru, tecido da parede aórtica e pericárdio de canguru, foram tratados utilizando o procedimento delineado no Exemplo 1 até um passo incluído (b) i.e. pré-tratamento com solução alcoólica e então reticulação com glutaraldeído. Esses tecidos tratados foram então comparados com tecido fixado com glutaraldeído i.e. sem pré-tratamento com álcool e tecido “fresco”. A Figura 1 e a Figura 2 mostram a estabilidade de reticulação do pericárdio e tecido da parede aórtica (Figura 2). Pode-se ver que o pré-tratamento com etanol tem um efeito significativo sobre a estabilidade da reticulação a ~85°C-86°C. Esses dados também podem ser vistos na Tabela X.

Tabela X

ESTABILIDADE DE RETICULAÇÃO - PERICÁRDIO DE CANGURU ESTABILIDADE DE RETICULAÇÃO - PAREDE AO DESC DE CANGURU p = 0.002 (fix. glut. versus fix. álcool + glut).

EXEMPLO 13 - ESTABILIDADE DE RETICULAÇÃO E COMPORTAMENTO DA CALCIFICACÃO EM UM MODELO SUBCUTANEO DE RATO

[0161] Esse estudo visou comparar a estabilidade de reticulação e comportamento de calcificação de tecido suíno (cúspide e parede), tratado com o método divulgado no Exemplo 1 se comparado com um tecido controle fixado com glutaraldeído e Freestyle comercialmente preparado e tecidos bioprotéticos PrimaPlus.

[0162] Ramificações aórticas valvuladas suínas frescas foram colhidas e transportadas a 4°C em solução salina fosfato-tamponada (PBS; 0.1M, pH7.4). Cúspides de válvula aórtica representativos (n = 30) e amostras de parede aórtica (n = 30; 10mm x 15mm) foram removidos das ramificações aórticas e divididos em dois grupos. O Grupo I incluiu cúspides de válvulas (n = 15) e amostras representativas de parede aórtica (n = 15; 10mm x 15mm) armazenadas em 0.25% de glutaraldeído tamponado. O Grupo II incluiu cúspides de válvulas (n = 15) e amostras representativas de parede aórtica (n = 15; 10mm x 15mm) expostas ao método divulgado no Exemplol e armazenadas em 0.25% de glutaraldeído tamponado. Para comparação, um terceiro grupo (III) consistiu de cúspides de válvula (n = 10) e amostras de parede aórtica (n = 10; 10mm x 15mm) de biopróteses Freestyle, enquanto o grupo IV consistiu de cúspides de válvula (n = 10) e tecido de parede aórtica (n = 10; 10mm x 15mm) de biopróteses Prima Plus.

[0163] A medição da temperatura de encolhimento foi utilizada para avaliar a estabilidade das reticulações de colágeno do tecido (Levy et ai, 1986, Am. J. Pathol., 122 :71-82). Tiras de tecido de amostra de parede aórtica e cúspides (5 x 10mm; n = 10) em cada grupo foram ligadas a um transformador de energia isométrico (MLT0500; AD Instruments, Austrália), em contato com um sistema de aquisição de dados PowerLab e um computador.

[0164] Amostras foram mantidas em constante extensão com uma carga de 90 +- 5g e imersas em um banho de água aberto com temperatura controlada e cheio com 0.9% de solução salina. A temperatura do banho de água foi gradualmente aumentada a aproximadamente 1.5°C de 25°C a 95°C. A temperatura de encolhimento foi indicada como um ponto agudo de deflexão da constante extensão quando o material de colágeno foi desnaturado.

[0165] As temperaturas de encolhimento para cúspides de válvula e tecidos de parede aórtica estão listados na Tabela XI. Não foram identificadas diferenças significativas entre o controle, procedimento teste do Exemplo 1 (“teste”), cúspides Freestyle e Prima Plus. Procedimento teste - tecido de parede aórtica tratado mostrou uma temperatura de encolhimento significativamente mais alta (p < 0.05) comparada com controle, tecidos de parede Freestyle e Prima Plus.

Tabela XI

TEMPERATURAS DE ENCOLHIMENTO (°C) DE CÚSPIDES DE VALVULA E

TECIDO DE PAREDE AÓRTICA (n = 10 por grupo) valores são media + SE. *ρ <0.05 (Teste versus Controle, Freestyle, Prima Plus).

[0166] A resistência à digestão da enzima proteolítica foi baseada no método de Girardot & Girardot (J. Heart Valve Dis., 1996, 122: 71-82). Uma solução de pronase foi preparada dissolvendo-se 10 mg de pronase E (tipo XIV de Streptomyces griseus; Sigma) e 100mg de cloreto de cálcio em 200 ml de solução tamponada HEPES (0.01 M, pH7.4), contendo 0.1M de glicina. Amostras de tecido fixadas foram enxaguadas em água deionizada por 3 minutos, secas com mata borrão, secas durante a noite a 70°C e pesadas. Essas amostras foram então incubadas em solução de pronase a 50°C por 24 horas. Amostras remanescentes de tecido foram enxaguadas em água deionizada, secas durante a noite a 70°C e pesadas. A resistência à digestão de pronase foi determinada pela massa de tecido remanescente, expressa como uma porcentagem da massa de tecido pré-digerida.

[0167] A resistência à degradação enzimática é ilustrada na Figura 3. Tecidos de cúspides de procedimento de teste, Freestyle e Prima Plus mostraram aumentos significativos (p<0.0001) em resistência à digestão proteolítica comparados com controle (Figura 3A). Não foi vista diferença significativa entre tecidos de cúspides de procedimento de teste, Freestyle e Prima Plus.

[0168] O tecido de parede aórtica tratado pelo procedimento de teste mostrou igual resistência (p = NS) à digestão proteolítica que o tecido controle, e uma resistência significativamente maior comparado aos tecidos de parede Freestyle e Prima Plus (Figura 3B).

[0169] Ratos jovens e machos Wistar (peso corporal 150-200g) foram divididos em dois grupos; um grupo (n = 10) recebeu implantes de cúspides e o segundo grupo (n = 10) recebeu implantes de parede aórtica. Cada animal recebeu uma amostra de cada um dos quatro grupos de tecidos, fazendo um total de 80 implantes.

[0170] Os ratos foram anestesiados com pentobarbital (Nembutal; 45mg/kg, intraperitoneal). A area do músculo dorsal foi raspada e desinfetada com 15% diluído gluconato de clorexidina (ICI Pharmaceuticals, Perth, WA) e etanol (Merck Chemicals, Perth, WA) [0171] Os implantes foram completamente enxaguados em água deionizada por 2 minutos para eliminar algum fixador residual, e então implantados em bolsas subcutâneas através de uma incisão de 2.5 cm na parede muscular traseira. A incisão foi fechada com 5-0 de suturas Prolene.

[0172] Os ratos foram sacrificados depois de oito semanas com barbituratos (Euthenase), e a parede do músculo dorsal, contendo os implantes subcutâneos foi removida para analise quantitativa e qualitativa de cálcio no tecido. Cada amostra recuperada foi dividida em duas metades anatomicamente simétricas. Uma metade foi utilizada para espectrometria de absorção atômica, e a outra metade foi fixada em 10% de formaldeído tamponado e processada para histologia.

[0174] Amostras fixadas foram embebidas em cera de parafina, seccionadas em 3um, e tratadas com corante Von Kossa para analise qualitativa de cálcio. Exames histológicos foram realizados com um microscópio de luz Olympus BHS.

[0175] Amostras de tecido explantado de todos os grupos foram dissecados do tecido hospedeiro circundante e secas em um incubador Biotherm (Selby Scientific, Perth, WA) a 90°C por 48 horas. As amostras secas foram pesadas, e o conteúdo de cálcio extraído em 5.0ml 6 N de acido clorídrico ultrapuro (Merck, Perth, WA) a 75°C por 24 horas. O conteúdo de cálcio extraível foi medido com um espectrômetro de absorção atômica (Varian AA1275) e expresso como ug Ca por mg de tecido (peso seco).

[0176] O exame histológico indicou a presença de calcificação intrínseca severa nas amostras de cúspides controle explantadas (dados não mostrados). Não foi notada nenhuma calcificação visível em cúspides de válvula ADAPT, Freestyle ou Prima Plus (dados não mostrados).

[0177] Tecidos de parede aórtica explantados revelaram varias calcificações do meio (dados não mostrados) em amostras controle. Não foi notada nenhuma calcificação visível no tecido explantado de parede aórtica de teste (dados não mostrados). Foi notada uma calcificação moderada do meio nos tecidos de parede aórtica explantados Freestyle (dados não mostrados) e Prima Plus (dados não mostrados).

[0178] Os níveis quantitativos de cálcio no tecido para cúspides explantados estão ilustrados na Figura 4A. Amostras controle, fixadas apenas em glutaraldeído, mostraram o nível mais alto de cálcio nesse modelo (92.37 + 7.9ug/mg). Os níveis de cálcio do tecido tratado pelo método do Exemplo 1 foram de 2.09 + 0.22 ug/mg tecidos, enquanto que os do Freestyle foram de 2.03 + 0.29 ug/mg e do Prima Plus de 1.54 + 0.17 ug/mg. Isso significa que os cúspides tratados reduziram significativamente os níveis de cálcio (p< 0.001) em comparação com amostras controle. Não foi vista nenhuma diferença significativa entre os níveis de cálcio no tecido dos cúspides do Exemplo 1, Freestyle e Prima Plus após oito semanas.

[0179] Os níveis quantitativos de cálcio no tecido para amostras de parede aórtica explantadas estão ilustrados na Figura 4B. O conteúdo de cálcio das amostras de parede aórtica tratada do Exemplo 1 (4.86 +0.12 ug/mg tecido) foi significativamente (p <0.001) mais baixo por (95.9%) do que aquele das amostras controle (120.11 + 7.48 ug/mg tecido). As amostras de parede aórtica Freestyle e Prima Plus mostraram reduções na calcificação de 47.8% e 51.95%, respectivamente.

[0180] Esses dados sugerem que o método divulgado no Exemplo 1 é eficaz em reduzir a calcificação em cúspides e tecidos de parede suínos em um modelo de rato subcutâneo. Esses dados sugerem ainda que a reticulação acentuada desempenha um papel importante na minimização da calcificação da parede aórtica.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para produzir um biomaterial implantável resistente a calcificação caracterizado por compreender as etapas: (a) expor um biomaterial contendo colágeno a uma solução contendo álcool por ao menos 24 horas; (b) expor o biomaterial da etapa (a) a um agente de reticulação; e, (c) expor o biomaterial da etapa (b) a uma solução ácida contendo ácido aminocarboxílico capaz de inativar e/ou modificar as frações de agente de reticulação fixadas e/ou não-fixadas presentes no biomaterial após a etapa (b); em que a etapa (b) e (c) são sequenciais a etapa (a).

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender ainda uma etapa de lavagem entre as etapas (a) e (b) e/ou entre as etapas (b) e (c).

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 caracterizado por compreender ainda uma etapa de lavagem após a etapa (c).

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3 caracterizado por a etapa de lavagem do biomaterial ser conduzida usando uma solução livre de fosfato de solução salina a 0,9%.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 caracterizado por o biomaterial contendo colágeno ser isolado de um animal.

6. Método de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por o animal ser selecionado do grupo consistindo de um ovino, um bovino, um caprino, um equino, um porcino, um marsupial e um ser humano.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 caracterizado por o biomaterial ser um tecido cultivado, uma prótese contendo matriz extracelular obtida de um animal ou de um tecido reconstituído.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 caracterizado por o biomaterial ser um tecido celular selecionado do grupo consistindo em tecido cardiovascular, tecido pélvico, tecido cardíaco, válvula cardíaca, ramificações da aorta, parede aórtica, folículos da aorta, tecido do pericárdio, tecido conectivo, matriz de órgãos macios ou sólidos, dura-máter, tecido dérmico, tecido vascular, cartilagem, pericárdio, ligamento, tendão, veias sanguíneos, tecido umbilical, tecido ósseo, fáscias e tecido submucosalo ou pele.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8 caracterizado por a solução contendo álcool usada na etapa (a) compreender um ou mais álcoois solúveis em água.

10. Método de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por o álcool solúvel em água ser um álcool inferior C1-C6.

11. Método de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por o álcool inferior C1-C6 consistir de metanol, etanol, ciclo-hexanol, isopropanol, propanol, butanol, pentanol, isobutanol, sec-butanol e t-butanol ou combinação dos mesmos.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 caracterizado por a solução contendo álcool compreender menos de 100% de álcool num solvente aquoso não tamponado.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 caracterizado por a etapa (a) ser realizada por pelo menos 36 horas.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13 caracterizado por a etapa (a) ser realizada por pelo menos 48 horas.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 caracterizado por o agente de reticulação ser selecionado do grupo que consiste em carbodiimida, éteres de poliepoxi, divinilsulfona (DVS), genipina, polialdeído e difenilfosforil azida (DPPA) ou combinação destes.

16. Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado por o polialdeído ser glutaraldeído.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16 caracterizado por compreender ainda uma etapa de esterilização após a etapa (c).

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17 caracterizado por a etapa (a) ser realizada em uma temperatura entre 5°C e 25°C.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 caracterizado por a etapa (c) ser realizada em uma temperatura entre 5°C e 55°C por ao menos 6 horas, mais preferencialmente pelo menos 24 horas, e mais preferencialmente por pelo menos 48 horas.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19 caracterizado por a solução ácida ser capaz de reticular grupos carboxil e amino ativados em colágeno para formar ligações amida.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20 caracterizado por o ácido aminocarboxílico ser selecionado do grupo que consiste em L-histidina, L-arginina, L-lisina, L-glutamato e L-aspartato.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 caracterizado por a solução contendo álcool, o agente de reticulação e a solução ácida serem todas sem tampão.

23. Biomaterial implantável resistente a calcificação caracterizado por ser produzido por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22.

24. Biomaterial implantável resistente a calcificação de acordo com a reivindicação 23 caracterizado por o biomaterial possuir um conteúdo de cálcio menor do que cerca de 50 pg por mg de biomaterial e onde o dito biomaterial é capaz de ser implantado por ao menos 200 dias sem que o biomaterial aumente seu conteúdo de cálcio acima de 50 pg g/mg de biomaterial.

25. Biomaterial implantável resistente a calcificação de acordo com a reivindicação 24 caracterizado por o biomaterial antes da implantação possuir um conteúdo de cálcio de menos do que 20 pg por mg de biomaterial.

26. Biomaterial implantável resistente a calcificação de acordo com a reivindicação 24 caracterizado por o biomaterial antes da implantação possuir um conteúdo de cálcio de menos do que 10 pg por mg de biomaterial.

27. Biomaterial implantável resistente a calcificação de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 26 caracterizado por o biomaterial compreender colágeno reticulado que compreende animas secundárias.

28. Dispositivo biológico implantável caracterizado por compreender um biomaterial implantável resistente a calcificação obtido de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27.

29. Dispositivo de acordo com a reivindicação 28 caracterizado por o biomaterial se estende formando um revestimento sobre uma superfície do dito dispositivo.

30. Dispositivo de acordo com a reivindicação 28 ou 29 caracterizado por compreender ainda ao menos um segundo revestimento.

31. Dispositivo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por pelo menos o segundo revestimento compreender um ou mais de um agente antimicrobiano, um agente antiviral, um agente antifúngico, um fator de crescimento, um agente anti-desidratante ou um agente anti-séptico.

32. Dispositivo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por o agente antimicrobiano ser selecionado do grupo que consiste em isoniazida, etambutol, pirazinamida, estreptomicina, clofazimina, rifabutina, fluoroquinolonas, ofloxacina, sparfloxacina, rifampicina, azitromicina, claritromicina, dapsona, tetraciclina, eritromicina, ciprofloxacina, doxiciclina, ampicilina, anfotericina B, cetoconazol, fluconazol, pirimetamina, sulfadiazina, clindamicina, lincomicina, pentamidina, atovaquona, paromomicina, diclazaril, aciclovir, trifluorouridina, foscarnet, penicilina, gentamicina, ganciclovir, iatroconazol, miconazol, Zn-piritiona, metais pesados incluindo, mas não limitado a, ouro, platina, prata, zinco e cobre e suas formas combinadas, incluindo sais, como cloreto, brometo, iodeto e periodato, e complexos com transportadores e outras formas.

33. Dispositivo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por o agente de fator de crescimento ser selecionado do grupo que consiste em hidroxiapatita, fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento de fibroblastos ácido (aFGF), fator de crescimento nervoso (NGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) , fatores de crescimento semelhantes a insulina 1 e 2 (IGF-I e IGF-2), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de angiogênese tumoral (TAF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de liberação de corticotropina (CRF) fatores de crescimento transformantes [a] e [β] (TGF-a e TGF-β) interleucina-8 (IL-8); fator estimulante das colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF); interleucinas e interferons.

34. Dispositivo de acordo com a reivindicação 30 caracterizado por o pelo menos o segundo revestimento compreender ainda um material bioabsorvível selecionado do grupo que consiste em ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, polidioxanona, policaprolactona, polipeptideos, policarbonatos, polihidroxibutirato, poli (alquileno oxalato), copolímeros de acetatos vinilicos com ácidos carboxílicos insaturados, derivados de celulose solúveis em água ou dispersíveis, polímeros de óxido de etileno, poliacrilamida, colágeno, gelatina, poli (ortoéster), poliamidas de aminoácidos, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polieteretercetona, fosfato tricálcico, e suas misturas.

35. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34 caracterizado por o dito dispositivo ser selecionado a partir do grupo consistindo de um coração artificial, um dispositivo de compressão extra-cardíaca, uma prótese de válvula cardíaca, um anel anuloplastia, um enxerto dérmico, um enxerto vascular, um stent vascular, um stent estrutural, um desvio vascular, um desvio cardiovascular, um enxerto dura mater, um enxerto de cartilagem, um implante de cartilagem, um enxerto de pericárdio, uma prótese de ligamento, uma prótese de tendão, uma prótese de bexiga urinária, uma compressa, uma sutura, um dispositivo subcutâneo permanente, um curativo cirúrgico, um stent cardiovascular, um stent revestido e um cateter revestido.

36. Dispositivo de acordo com a reivindicação 35 caracterizado por o dito dispositivo ser uma prótese de válvula cardíaca.

37. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 36 caracterizado por o dito dispositivo compreender ainda um fragmento de tecido.

38. Dispositivo de acordo com a reivindicação 37 caracterizado por o fragmento de tecido ser obtido a partir de um animal.

39. Dispositivo de acordo com a reivindicação 38 caracterizado por o animal ser selecionado do grupo constituído por um ser humano, uma vaca, um porco, um cão, um veado e um canguru.

40. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 39 caracterizado por o dispositivo compreender ainda um análogo sintético de um tecido.

41. Implante biocompatível caracterizado por compreender um suporte biocompatível que compreende um biomaterial implantável resistente a calcificação conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 24 a 27.

42. Kit para reparar uma lesão de tecido caracterizado por compreender: (a) um recipiente estéril tendo um biomaterial implantável resistente a calcificação conforme descrito em qualquer uma das reivindicações 24 a 27 ou um ou mais dispositivos conforme qualquer uma das reivindicações 28 a 40, onde o biomaterial ou dispositivo compreende colágeno reticulado que compreende aminas secundárias; (b) instruções para uso em um indivíduo lesionado; e, (c) uma ferramenta de extração para coletar ao menos uma amostra viável de tecido do indivíduo lesionado.

43. Kit de acordo com a reivindicação 42 caracterizado por compreender ao menos um reagente para sustentar a viabilidade da ao menos uma amostra de tecido.

44. Kit de acordo com a reivindicação 42 caracterizado por a ferramente de extração compreender ainda uma ferramenta de processamento para dividir a amostra de tecido, sob condições estéreis, em ao menos um fragmento de tecido.

45. Biomaterial implantável resistente a calcificação caracterizado por ser conforme qualquer uma das reivindicações 24 a 27 ou um dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 40 para uso no tratamento de tecido vivo.

46. Curativo de ferimentos caracterizado por compreender um biomaterial implantável resistente a calcificação conforme descrito em qualquer uma ds reivindicações 24 a 27, onde o biomaterial compreende colágeno reticulado que compreende aminas secundárias.