BRPI0602496B1 - Use of triatoma infestans isolated protease inhibitors - Google Patents

Abstract

uso de inibidores de proteases isolados do triatoma infestans. a presente invenção se refere ao uso de inibidores seletivos para fator xiia obtidos a partir de uma biblioteca de mutantes de um inibidor de fator xiia isolado do barbeiro triatoma infestans para o tratamento de doenças hemorrágicas e trombolíticas, em métodos diagnósticos ou no recobrimento de tubulações e demais superfícies que compõem um sistema de circulação extracorpóreo.

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para: uUSO DE INIBIDORES DE PROTEASES ISOLADOS DO TRIATOMA INFESTANS".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção se refere ao uso de inibidores de proteases, mais especificamente, do fator Xlla isolados do barbeiro Triatoma infestans para o tratamento de doenças hemorrágicas e trombolíticas, em métodos diagnósticos ou no recobrimento de tubulações e demais superfícies que compõem um sistema de circulação extracorpóreo, bem como um kit para diagnóstico de doenças hemorrágicas e trombolíticas compreendendo os mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO O fator XII é uma das enzimas iniciadoras do processo de coagulação sangüínea e é fracamente ativado (ativação não proteolítica) quando exposto a superfícies negativas (como o colágeno subendotelial). O fator XII ativado ativa o fator XI em fator Xla, a precalicreína em calicreína e o plasminogênio em plasmina através da hidrólise controlada dos mesmos. A calicreína por sua vez é capaz de ativar o fator XII em fator Xlla (ativação hidrolítica) . Assim, o fator Xlla participa não apenas da coagulação através da hidrólise do fator XI como também está presente em outros processos fisiológicos como a inflamação, fibrinólise e sistema complemento LFuhrer e cols., 1990] . O fator Xlla é um iniciador indireto do processo fibrinolitico devido a sua capacidade de ativar precalicreína, e esta ativa o uPA {"urokinase plasminogen activator"). A calicreína também produz a bradicinina, esta induz a liberação de tPA ("tissue plasminogen activator") in vivo que juntamente com o uPA ativam o plasminogênio a plasmina, esta responsável pela degradação dos polímeros de fibrina [Braat e cols., 19 9 9] . Em concentrações plasmãticas o fator Xlla é um importante ativador direto de plasminogênio a plasmina [Schousboe e cols., 1999]. 0 fator Xlla atua não só no sistema hemostático como também no sistema complemento, através da ativação do componente Clr. O fator Xlla também ativa indiretamente o C3 a C3a através da ativação de trombina e plasmina, estes responsáveis pela ativação do C3 [Fuhrer e cols., 1990]. O fator Xlla também participa da inflamação através da ativação de calicreína que desempenha um importante papel na inflamação [Maeda e cols., 1999] liberando cininas e outras moléculas mediadoras do processo inflamatório, bem como produzindo indiretamente fatores quimiotãticos [Muldbjerg e cols., 1993].

Em casos de infarto agudo do miocárdio, dentre os tratamentos utilizados, encontra-se a administração de agentes trombolíticos (em geral, ativadores de plasminogênio) que têm como função dissolver os trombos de fibrina formados [Gulba 1991]. No entanto, a plasmina gerada desencadeia, posteriormente, o processo de coagulação sangüínea através da ativação do sistema de contato o que pode levar, não raramente, a uma falha na dissolução do trombo ou mesmo na reoclusão da artéria recém desobstruída [Ewald 1995]. Latacha e colaboradores [Latacha 2 004] mostraram que a ativação paradoxal da coagulação está diretamente ligada à ativação do fator XII pela plasmina. Para contornar tais efeitos, geralmente é utilizada a administração de heparina, mas o uso desta também traz efeitos colaterais complicadores como episódios de hemorragia [Szabo 2002] . Szabo [Szabo 2002] propõe que o uso de fibrinolíticos mais específicos deve levar a uma menor ativação da fase de contato o que levaria a uma diminuição dos efeitos indesejados desse tratamento que, em conjunto com a administração de outros fãrmacos, poderia levar a uma diminuição na dose de uso de heparina, o que acarretaria numa redução de riscos e complicações. Nesse cenário, o uso de inibidores específicos da via de contato mostrou-se interessante como ferramenta e essa estratégia vem sendo testada como no caso da aprotinina mutada [Braufreton 1997; Bierlein 2005], um mutante do BPTI. Desta mesma forma, o uso dos mutantes de infestina 4 em combinação com a heparina, permite que a quantidade de heparina por dose seja menor, sem que o efeito seja diminuído. Uma menor quantidade de heparina por dose leva a uma diminuição nos riscos e efeitos colaterais da mesma. A transmissão de doenças contagiosas como AIDS, hepatite B e C associadas à transfusão sangüínea tem sido motivo de preocupação para pacientes e médico-cirurgiões [Duchow 2001] . Em vista disso, a autotransfusão vem sendo utilizada em cirurgias ortopédicas, a fim de diminuir as perdas sanguíneas e conseqüentemente diminuir a necessidade de sangue heterólogo. Atualmente, vem sendo utilizada a doação pré-operatória e a re-infusão de sangue drenado na cirurgia para tais fins. Diversos trabalhos vêm descrevendo os prós e contras de cada técnica, mas seu uso ainda é muito controverso. Especificamente no caso da re-infusão, a ativação do sistema do complemento vem sendo um dos possíveis fatores que levam às complicações [Palatianos 2003] . Neste caso, inibidores específicos de enzimas do sistema de contato {em especial os mutantes de infestina 4) podem ser utilizados durante essas cirurgias a fim de diminuir as chances de episódios de trombose pôs-cirúrgicos, impedindo a ação do fator Xlla, a enzima proteolítica iniciadora da fase de contato.

Da mesma forma que as ínfestinas mutantes podem ser utilizadas em cirurgias na autotransfusão e re-infusão sanguíneas, as mesmas podem vir a ser utilizadas em cirurgias cardíacas onde hã a realização do "bypass" (desvio) cardio-pulmonar (BCP) . Para a realização do BCP, são injetadas sistemicamente grandes doses de heparina a fim de reduzir o risco de trombose no paciente, e tal procedimento acarreta riscos e efeitos colaterais já descritos antes [Wagner 1994]. Neste caso, os inibidores aqui apresentados, se utilizados, poderiam vir a diminuir a dose de heparina necessária, diminuindo-se assim os riscos aos pacientes. Nos casos de BCP, a inibição do fator Xlla pode vir ainda a ser benéfica no controle do processo inflamatório uma vez que a ativação deste através do sistema de contato, é um dos fatores pós-operatórios que aumenta o tempo de permanência do paciente na UTI [Taylor 1996; Cremer 1996] .

Ainda no caso da BCP, as infestinas mutantes podem vir a serem utilizadas como um dos componentes do "coating" (cobertura em forma de uma fina camada) das membranas e tubulações da maquinaria do BCP. Diversos tipos de cobertura vêem sendo desenvolvidos e testados, no entanto, não há uma solução definitiva para tal [Palatianos 2 003] , pois mesmo utilizando-se uma cobertura com heparina ou derivados, hã a geração de fator XIIa bem como de trombina, esta resultante em parte da ação do fator Xlla. Assim, o inibidor poderia eventualmente ser utilizado no desenvolvimento ou mesmo como um dos componentes de cobertura de superfícies.

Embora altos níveis de fator Xlla plasmáticos não sejam causadores da doença coronariana, os mesmos apresentam uma correlação linear com a calcificação da artéria coronariana [Colhoun 2002]. O grau de calcificação da artéria coronariana pode ser utilizado como marcador da arteriosclerose coronariana, que é um fator de risco para doenças coronarianas [Colhoun 2002; Colhoun 2000]. Assim, inibidores específicos de fator Xlla podem ser utilizados no desenvolvimento de métodos alternativos para a quantificação desta protease dada a sua importância clinica na determinação de grupos de risco para arteriosclerose coronariana. Recentemente, Lo e Diamond [Lo 2004] desenvolveram um método de "high-throughput" (grande quantidade de resultados em um pequeno período de tempo) para monitoramento em tempo real da coagulação sanguínea que tem como característica a utilização de um inibidor de fator Xlla. Tal metodologia, inviável na ausência do inibidor, permite mapeamento automático do sangue, utilizando baixíssimas quantidades do mesmo, gerando rapidamente grandes quantidades de dados para testes cinéticos, rastreamento de interações de medicamentos bem como permitindo o monitoramento do fenótipo funcional de uma amostra de sangue de um paciente.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a TTPA da infestina 4 nativa e dos mutantes selecionados. No ensaio foram utilizados uma mistura de plasma de doadores normais e os inibidores nas quantidades indicadas. Cada barra indica a média dos experimentos realizados e os valores são correspondentes ao aumento do tempo de TTPA com relação ao controle (30.4 segundos) em vezes.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção se refere ao uso de inibidores seletivos para fator Xlla obtidos a partir de uma biblioteca de mutantes de um inibidor de fator Xlla isolado do barbeiro Triatoma infestans para o tratamento de doenças hemorrágicas e trombolíticas, em métodos diagnósticos como na dosagem de fator Xlla, em intervenções cirúrgicas como anticoagulante ou mesmo no recobrimento de tubulações e demais superfícies que compõem um sistema de circulação extracorpóreo.

Em um outro aspecto da presente invenção, os referidos mutantes de inibidor de fator Xlla de Triatoma infestans podem ser utilizados em um kit para diagnóstico de doenças hemorrágicas e trombolíticas através da quantificação de fator Xlla circulante de pacientes. A seguir, a presente invenção será explicada de maneira mais pormenorizada com o auxílio da descrição de sua modalidade preferida.

Construção dos fragmentos de infestina 4 contendo as mutações Utilizaram-se os oligonucleotídeos MUT4PCAN (GCGGCCCAGC CGGCCGAGGT CAGAAACCCT TGCGCCTGTN NBNNBNNBNN BGTTNNBGTG TGTGGTTCAG ATGGG) e INF4PCANR {GGGAAGAAGT

CCAAGCGGCC GCAAACTGTT CAAC) e o plasmídio pIC 13.1.4 (Infestina 4 em pCANTAB 5E) em reações de PCR. Os produtos das reações foram aplicados em eletroforese em gel de agarose 2 % e a banda correspondente as infestinas mutantes foi recortada do gel, o DNA extraído e digerido com a enzima de restrição Sfi I (60 U) . O produto da reação foi precipitado com acetato de sódio e etanol e digerido com a enzima de restrição Not I (40 U) . O produto de digestão foi novamente aplicado em gel de agarose e as bandas correspondentes as infestinas mutantes foram purificadas. Ligação dos fragmentos ao vetor pCANTAB 5E O vetor pCANTAB 5E foi previamente digerido com as enzimas de restrição Sfi I e Not I. A reação de digestão foi precipitada e o DNA defosforilado utilizando-se a enzima CIAP 4 U (MBI Fermentas) durante 2 h a 37 °C. O produto de defosforilação foi aplicado em um gel de agarose e a banda correspondente ao plasmídio foi recortada do gel e o DNA purificado utilizando se o kit "QIAEX II" (Qiagen). O vetor (353,5 fmols) e os fragmentos (15,9 pmols) foram ligados utilizando-se a enzima T4 DNA ligase (1,5 U) durante 15 h à 18 °C (5 reações). Os produtos de ligação foram precipitados e utilizados em transformações por eletroporação de bactérias E. coli cepa TG1 competentes recém preparadas. Às células eletroporadas foi adicionado 1 ml de meio SOC e as mesmas foram incubadas por 1 hora à 37°C sob agitação a 200 rpm. Em seguida, as transformações foram unidas, o material foi inoculado em 300 ml de meio SOBAG contendo ampicilina e agitado a 22 0 rpm à 3 0oC durante a noite. Na manhã seguinte, o material foi estocado a 4°C.

Determinação do título da biblioteca Uma fração do conjunto de células incubadas em meio SOC a 37°C por uma hora foi diluída (ΙΟ2, 103 e 104) em meio LB, parte das diluições foi plaqueada em SOBAG/Amp-ãgar e esta foi incubada durante a noite à 30°c. No dia seguinte, o número de colônias em cada placa foi determinado e a quantidade total de transformantes da biblioteca foi calculada .

Seleção da biblioteca de mutantes de infestina 4 em "Phage-Display" (exposição em fagos) A seleção de mutantes de infestina 4 expostos em fagos de fusão foi realizada como em Tanaka e cols [1999].

Preparo dos fagos de fusão A 1,8 ml de meio 2YT contendo glicose (2 %) foram adicionados 200 μΐ da biblioteca de mutantes de infestina previamente preparada e a mesma foi incubada por 1 hora a 37°C sob agitação a 200 rpm a 37°C. Em seguida, adicionou-se 2 0 μΐ de ampicilina (20 mg/ml) e 1 ml da solução de fagos M13K07 (título: 3,7 x 109 pfu/ml) , e as células foram incubadas por mais 1 hora a 37°C, sob agitação a 200 rpm. A cultura foi centrifugada a 1000 g, por 10 min para sedimentação das células e o meio foi cuidadosamente descartado. As células foram ressuspensas gentilmente em 2 ml de meio 2YT/Amp e canamicina (50 μg/ml) (sem glicose) e incubadas durante a noite a 3 7°C sob agitação 220 rpm. No dia seguinte, a cultura foi centrifugada a 1000 g por 20 min, as bactérias foram descartadas e o sobrenadante contendo os fagos foi filtrado em membrana de 0,22 μπι estéril e estocado a 4°C.

Seleção da biblioteca de infestina 4 mutante para g-fator Xlla Inicialmente, o oí-fator Xlla foi diluído em tampão de ligação (tampão acetato de sódio 0,1 M pH 5,5, contendo NaCl 0,1 M) a uma concentração de 40 μg/ml. Em seguida, 100 μΐ da solução de enzima foram colocados em uma microplaca de 96 poços para ELISA (Maxisorp, Nunc) e esta foi incubada durante a noite a 4°C em câmara úmida. No dia seguinte, a solução da placa foi descartada e o poço foi bloqueado com 200 μΐ de tampão de bloqueamento (tampão PBS pH 7,4 contendo Tween 20 0,005 % e albumina 2 %) por 2 h à temperatura ambiente. Novamente, a solução da placa foi descartada e o poço foi incubado com 100 μΐ da solução de fagos (diluída 1:1 no tampão de bloqueamento e pré-incubada por 3 0 min à temperatura ambiente) por 90 min a 30°C. O poço foi lavado exaustivamente com solução de lavagem (10 ml de PBS pH 7,4 contendo Tween 20 0,1 %) e o mesmo foi incubado por 15 min a temperatura ambiente com 200 μΐ de solução de pré-eluição (solução KC1 0,2 M pH 5,0). Finalmente, os fagos foram eluídos com 200 μΐ (10 min) da solução de eluição (solução KCl 0,2 M pH 2,0) . Os fagos eluídos foram transferidos para um tubo contendo 4 μΐ de tampão Tris-HCl 1 M, pH 8,0.

Titulação dos fagos obtidos na Ia seleção Parte da solução de fagos (2 5 μΐ) foi utilizada no preparo de soluções diluídas (102, 10J e 104) para determinação do número de fagos ligantes. 100 μΐ de uma cultura de bactérias E.coli TG1 (em fase logarítmica, OD60o = 0,5) foram incubados com 100 μΐ de cada diluição do fago por 3 0 min a 3 7°C e destes, 100 μΐ foram plaqueados em placas SOBAG/Amp-ãgar. 0 restante do material eluído (-175 μΐ) foi incubado com 400 μΐ de bactérias E.coli TG1 (em fase logarítmica) durante 30 min a 37°C, centrifugado a 1000 g por 5 min e o sobrenadante foi descartado. As células foram ressuspensas em 3 ml de 2YT contendo glicose 2 % e ampicilina, e foram incubadas durante a noite à 30°C para amplificação das células contendo os fagomídios selecionados.

Demais ciclos de seleção As células amplificadas foram utilizadas na preparação de fagos e os mesmos foram selecionados, realizando-se assim mais um ciclo de seleção. Realizou-se ainda um terceiro ciclo de seleção, ao final do qual, bactérias utilizadas na titulação foram aleatoriamente escolhidas e tiveram seus plasmídios seqüenciados.

Clonagem e expressão das infestinas mutantes em P. pastoris O DNA codante para os clones selecionados foi amplificado (PCR) utilizando-se os oligonucleotídeos INF4PICF (GCTCTCGAGA AAAGGGAGGT CAGAAACCC) e INF4PICR {GAAGTCGCGG CCGCTCAAAA CTGTTC) e o produto desta reação foi sub-clonado no vetor pPIC9 para expressão em P, pastoris. Leveduras P. pastoris foram transformadas com os plasmídios contendo os genes das infestinas mutadas e utilizadas na expressão dos mutantes como descrito em Campos e cols [2004] . Após fermentação de 96 h em meio BMMY, o sobrenadante da cultura foi utilizado em ensaios de inibição frente a diferentes proteases.

Purificação e determinação das atividades inibitórias dos mutantes expressos As infestinas 4 mutantes 3 e 15 expressas foram purificadas através de cromatografia de troca-iônica utilizando-se uma coluna Hitrap SP (5 ml) (Amersham Biosciences). Na caracterização cinética dos inibidores (realizadas como em Campos e cols 2 004) utilizaram-se as enzimas e os substratos presentes na tabela 1.

Tabela 1. Serinoproteases e substratos utilizados em ensaios de inibição.

Os números em parênteses indicam a quantidade utilizada em cada ensaio. 1U - quantidade de enzima que produz AA405/min = 60 Tempo de Tromboplasmina Parcial Ativada (TTPA) Foi realizado como em Campos e cols [2004] . 5 0 μΐ da solução do inibidor a ser testado foi pré-incubada com 50 μΐ de plasma deficiente em fator XII (Stago) , 50 μΐ de plasma humano normal e 50 μΐ de reagente de cefaloplastina ativa (Dade) por 3 min a 37°C. Uma solução de cloreto de cálcio pré-aquecida (37°C) foi então adicionada e o tempo de coagulação medido. O experimento foi realizado em duplicata.

Os inibidores mutantes foram caracterizados cineticamente e apresentaram alta afinidade e especificidade para o fator Xlla conforme tabela 2.

Tabela 2. Constantes de inibição (Ki) dos mutantes de infestina 4 para diferentes serinoproteases.

Ki (nM) n.i. - não inibe Diferentemente da infestina 4 nativa, que inibe fator Xlla, fator Xa, plasmina e tripsina, os mutantes inibem apenas tripsina e fator Xlla sendo que o mutante 15 apresenta uma afinidade aproximadamente 750 vezes maior para fator Xlla do que para tripsina. Ambos inibidores não apresentaram inibição para trombina, fator Xa, calicreína plasmática humana, plasmina, t-PA, u-PA, elastase de neutrófilos humanos, quimotripsina, calicreína plasmática de porco e demais proteases testadas (tabela l) , demonstrando a sua alta especificidade.

Quando avaliados em ensaios de TTPA (Tempo de Tromboplasmina Parcial Ativada) , que mede a intervenção dos inibidores na via extrinseca da coagulação, ambos apresentaram potência similar ao inibidor nativo {figura 1) , sendo capazes de prolongar o tempo de coagulação a baixas concentrações.

Assim, até o presente momento, não hã inibidores de fator Xlla tão potentes ou específicos como os mutantes de infestina 4 (inf 4 mut 3 e 15) da presente invenção. A seletividade destes inibidores ao fator Xlla reduz a possibilidade de reações adversas indesejadas ocasionadas por uma interação inespecífica dos mesmos com outras proteases. Uma vez que a infestina 4 selvagem não apresentou imunogenicidade quando injetada com adjuvantes em camundongos Balb-C para a produção de anticorpos, acreditamos que os mutantes apresentem também baixos potenciais imunogênicos o que possibilitaria o seu uso em mamíferos superiores. Os inibidores são pertencentes à família Kazal sendo compostos por 56 aminoácidos cada.

Inf 4 mut 3 -EVRNPCACSRRLVHVCGSDG KTYGNPCMLNCAAQTKVPGLKLVHEGRCQR S N V E Q F

Inf 4 mut 15 - EVRNPCACTRRFVAVCGSDG ktygnpcmlncaaqtkvpglklvhegrcqr S N V E Q F

Terapeuticamente, os inibidores da presente invenção podem ser utilizados em medicamentos compreendendo heparina e agentes trombolíticos para o tratamento de infarto do miocárdio. Nestes medicamentos, os inibidores teriam como função a diminuição da dose de heparina e o controle da ativação paradoxal da coagulação através da inibição do fator Xlla gerado pela plasmina ativada pelos agentes trombolíticos. Acarretando efeitos colaterais e riscos menores que os obtidos atualmente.

De maneira semelhante â utilização no tratamento do infarto do miocárdio, estes inibidores podem ser aplicados em caso de cirurgias ortopédicas que se utilizam de autotransfusão ou re-infusão sangüinea objetivando-se a diminuição de episódios de trombose pós-cirúrgica.

Outra forma terapêutica potencial destes inibidores é a sua aplicação em cirurgias cardíacas onde se utiliza a BCP. 0 uso desses inibidores da BCP permitiría o uso de menores dosagens de heparina levando a menores chances de efeitos colaterais da cirurgia {como episódios trombóticos) ou efeitos danosos da heparina (como hemorragias pós-cirúrgicas).

Estes inibidores podem ainda ser utilizados não apenas na terapêutica, mas ainda como componente da camada que recobre tubulações e maquinarias de BCP, impedindo ativação da coagulação sangüínea e seqüestrando moléculas de fator Xlla circulantes. Outra aplicação potencial é a imobilização desses inibidores em resinas para utilização destas na purificação de fator Xlla humano ou recombinante utilizado no tratamento de alguns tipos de hemofilia.

Finalmente, os presentes inibidores podem ser utilizados no desenvolvimento de métodos de diagnóstico para a quantificação de fator Xlla circulante de pacientes, uma vez que níveis elevados desta protease estão relacionados à arteriosclerose coronariana, que é um fator de risco para doenças coronarianas.

Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo apresentado acima são aqui incorporadas por referência. Várias modificações e variações da presente invenção vão ser evidentes para aqueles versados na técnica, sem que se afaste do âmbito e do espírito da invenção. Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a modalidade preferida específica, deve-se entender que a invenção, como reivindicada, não deve ser indevidamente limitada a essa modalidade específica.

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REIVINDICAÇÕES

Claims (5)

1. Uso de inibidores mutantes de proteases isolados do Triatoma infestans, em que os referidos inibidores mutantes estão indicados nas SEQ. IDs. 1 e 2, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças hemorrágicas e tromboliticas.

2. Uso de inibidores mutantes de proteases isolados do Triatoma infestans, em que os referidos inibidores mutantes estão indicados nas SEQ. IDs. 1 e 2, caracterizado por ser em um kit para diagnóstico de doenças hemorrágicas e tromboliticas por quantificação de fator Xlla circulante de pacientes.

3. Uso de inibidores mutantes de proteases isolados do Triatoma infestans, em que os referidos inibidores mutantes estão indicados nas SEQ. IDs. 1 e 2, caracterizado por ser no recobrimento de tubulações e demais superfícies que compõem um sistema de circulação extracorpóreo.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os referidos inibidores mutantes são obtidos a partir de uma biblioteca de mutantes de um inibidor de fator XI Ia isolado do barbeiro Triatoma infestans.

5. Kit para diagóstico de doenças hemorrágicas e tromboliticas caracterizado por fato de que compreende mutantes de um inibidor de serinoproteases isolado do barbeiro Triatoma infestans altamente seletivos ao fator Xlla, os referidos inibidores mutantes indicados nas SEQ. IDs. 1 e 2.