BRPI0604811B1 - Micro-organismo do gênero corynebacterium e método de produção de l-lisina - Google Patents

Micro-organismo do gênero corynebacterium e método de produção de l-lisina Download PDF

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Abstract

Microorganismo do gênero Corynebacterium e método de produção de L-lisina. São providos um microorganismo do gênero de Corynebacterium capaz de produzir L-lisina e resistente à canamicina e um método de produção da L-lisina que usa o mesmo.

Description

Referência Remissiva a Pedido de Patente Correlato
[001] Este Pedido reivindica o benefício do Pedido Patente Coreano 10-2005-0115905, depositado em 30 de novembro de 2005, no Escritório de Propriedade Intelectual Coreana, cuja revelação é aqui incorporada na sua totalidade por referência.
Antecedentes da Invenção 1 - Campo da Invenção
[002] A presente invenção relaciona-se com um micro-organismo do gênero de Corynebacterium tendo resistência à canamicina e capaz de produzir L-lisina e um método de produção de L-lisina que usa o mesmo.
2 - Descrição da Técnica Relacionada
[003] As bactérias Coryneform são micro-organismos que pertencem ao gênero Corynebacterium e Brevibacterium.
[004] A L-lisina é um aminoácido essencial extensamente usado para alimento animal, suprimentos médicos e alimentos. Em particular, a quantidade de L-lisina usada em 2004 foi reportada ser de cerca de 0,8 milhões de toneladas e a demanda pela L-lisina é esperada aumentar continuamente de uma média de cerca de 10 % ao ano no futuro.
[005] A L-lisina é produzida por fermentação direta usando um micro-organismo tal como E. coli, Corynebacteria ou similar e, deste modo, o desenvolvimento de micro-organismos produtores tendo rendimento aumentado ou produtividade de L-lisina aumentada por melhoria de um processo de fermentação tem um efeito econômico grande.
[006] A L-lisina é produzida por métodos conhecidos usando bactérias tais como vários tipos de mutante auxotrófico, vários tipos de bactérias resistentes a drogas, vários tipos de bactérias sensíveis a drogas e vários tipos de bactérias resistentes a antibióticos. Destes métodos, é sabido que um método que usa bactérias resistentes a antibióticos inclui um método que usa várias bactérias resistentes a vários antibióticos tais como rifampicina e estreptomicina etc. (ver, por exemplo, a Patente US 4.623.623).
[007] Todavia, não têm sido reportadas bactérias que tenham resistência a canamicina, um tipo de antibiótico baseado em aminoglicosídeo, e produzem L-lisina.
[008] Os inventores da presente invenção conduziram pesquisas extensas sobre um método de produzir L-lisina usando um microorganismo do gênero de Corynebacterium por fermentação direta para reduzir os custos de produção da L-lisina e aumentar o rendimento da L-lisina e constataram que a produtividade da L-lisina pode ser aumentada dando o micro-organismo de resistência do gênero de Corynebacterium à canamicina, completando, deste modo, a presente invenção.
Sumário da Invenção
[009] A presente invenção proporciona um micro-organismo do gênero de Corynebacterium tendo resistência a canamicina e capaz de produzir L-lisina.
[0010] A presente invenção provê também um método de produzir L-lisina com elevado rendimento usando o micro-organismo.
Descrição Detalhada da Invenção
[0011] De acordo com um aspecto da presente invenção, é provido um micro-organismo do gênero de Corynebacterium capaz de produzir L-lisina e resistente a canamicina.
[0012] O micro-organismo pode ser qualquer micro-organismo do gênero Corynebacterium capaz de produzir L-lisina e resistente à canamicina. Por exemplo, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium glutamicum KFCC 10881 e Corynebacterium glutamicum KFCC 11001, que são resistentes à canamicina, mas, não se limita a eles.
[0013] Um micro-organismo do gênero de Corynebacterium de acordo com uma modalidade da presente invenção é uma variante de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 que é resistente a S-(2-amino etil)cisteína, ácido α-amino-β-hidroxil valérico, metil lisina e azida de sódio e tem exigência para leucina e uma exigência imperfeita para homosserina e a variante é resistente à canamicina. Na modalidade atual da presente invenção, a variante é Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 (N° de Acesso KCCM-10707P).
[0014] O micro-organismo do gênero de Corynebacterium pode ser obtido induzindo mutação num micro-organismo do gênero de Corynebacterium capaz de produzir L-lisina usando um método conhecido de mutagênese e, depois, cultivando o produto resultante na presença de canamicina. A mutação pode ser induzida expondo o micro-organismo do gênero de Corynebacterium capaz de produzir L- lisina a um agente mutagênico, por exemplo, radiação radioativa ou composto mutagênico. Além disso, pode ser usada mutagênese direcionada ao sítio, mas, a mutagênese não é limitada a esses métodos.
[0015] A Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 (N° de Acesso KCCM-10707P), de acordo com uma modalidade da presente invenção, pode ser produzida dando uma resistência à canamicina a uma cepa pai, Corynebacterium glutamicum KFCC10881, usando um agente mutagênico químico, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina.
[0016] Em particular, 107-108/ml da cepa pai são tratados com N- metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, que é um mutágeno a 30°C durante 30 minutos para alcançar uma concentração final de 500 μg/ml, e as bactérias que crescem num meio mínimo de placa de agar contendo canamicina tendo uma concentração de 5 mg/l são separadas para obter o mutante tendo resistência à canamicina. Além disso, o mutante, de acordo com a modalidade atual da presente invenção, pode ser obtido cultivando o mutante tendo resistência a canamicina, comparando a produtividade de L-lisina das bactérias umas com as outras e selecionando as bactérias com produtividade melhorada de L- lisina.
[0017] A cepa pai, Corynebacterium glutamicum KFCC10881, e o mutante obtido da mesma tendo resistência a canamicina têm características descritas como se segue.
[0018] Cepa pai, Corynebacterium glutamicum KFCC10881: tem resistência a S-(2-amino etil)cisteína, resistência a ácido α-amino-β- hidroxil valérico, resistência a metil lisina e resistência a azida de sódio e tem exigência imperfeita para homosserina e tem exigência para leucina.
[0019] Mutante, Corynebacterium glutamicum KFCC10881 -CJP5103: tem resistência a S-(2-amino etil)cisteína, ácido α-amino-β- hidroxil valérico, metil lisina e azida de sódio e tem exigência imperfeita para homosserina e tem exigência para leucina e resistência a canamicina.
[0020] Na modalidade atual da presente invenção, a canamicina é um tipo de antibiótico baseado em aminoglicosídio e interfere com a síntese da proteína por ligação com o ribossoma que participa na biossíntese da proteína, tendo, assim, capacidade antibiótica.
[0021] Como descrito acima, o micro-organismo da presente invenção tem resistência a canamicina e produtividade melhorada de L- lisina. No processo de conferir resistência a canamicina para a cepa pai, é considerado que um gene que participa na biossíntese da menaquinona é inativado e, como resultado, é obtida uma cepa mutante cuja atividade de transporte de elétrons é reduzida. Devido à atividade reduzida de transporte de elétrons, considera-se que é também reduzida uma exigência de oxigênio da bactéria e o rendimento da produção de L- aminoácido aumenta, consequentemente. Contudo, um mecanismo do micro-organismo de acordo com a modalidade atual da presente invenção não fica limitado a estes mecanismos específicos.
[0022] A presente invenção proporciona também um método de produção de L-lisina incluindo cultivar o micro-organismo de acordo com uma modalidade da presente invenção; e coletar a L-lisina a partir da cultura.
[0023] No método de acordo com a modalidade atual da presente invenção, o micro-organismo do gênero Corynebacterium pode ser cultivado usando quaisquer condições de cultura e método conhecidos na técnica. Um exemplo de um meio de cultura para cultivar a cepa de Corynebacterium é o meio de cultura descrito no Manual of Methods for General Bacteriology pela American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981). Podem ser usadas fontes de carboidratos que incluem o seguinte: açúcares e carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose; óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de rícino e óleo de coco; ácidos graxos tais como ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolênico; álcoois tais como glicerol, etanol; e ácidos orgânicos tais como ácido acético. Os exemplos de fontes de açúcar acima mencionados podem ser usados só ou em combinação. Os exemplos de fontes de nitrogênio incluem o seguinte: peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, licor de milho, refeições de soja e ureia ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. Os exemplos de fontes de fósforo incluem o seguinte: fosfato diácido de potássio, fosfato ácido dipotássico ou sais de sódio correspondentes dos mesmos. Também o meio de cultura pode incluir sais de metal, tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento.Além disso, podem ser usados materiais essenciais para o crescimento, tais como aminoácidos e vitaminas, além dos ingredientes acima. Além disso, podem ser usados propriamente precursores no meio de cultura. Os ingredientes acima podem ser adicionados ao meio de cultura durante o cultivo de um modo em batelada ou de maneira contínua.
[0024] O pH do meio de cultura pode ser controlado usando um composto básico, tal como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia, ou um composto ácido tal como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico. Também o uso de um agente antiespumante tal como éster poliglicólico de ácido graxo pode suprimir a geração de espuma. O oxigênio ou um gás contendo oxigênio tal como ar pode ser injetado no meio, a fim de manter a condição aeróbia. A temperatura do meio de cultura pode ser de 20°C a 45°C, preferentemente de 25°C a 40°C. O cultivo pode ser realizado até que uma quantidade pretendida de L- lisina seja produzida, mas, o cultivo é desejavelmente realizado durante 10 a 160 horas.
[0025] O cultivo pode ser executado de uma maneira continua usando um método de batelada, batelada alimentada, batelada alimentada repetida ou do tipo batelada. Estes métodos são bem conhecidos na técnica e a presente invenção não fica limitada a eles.
[0026] O ácido L-amino pode ser coletado a partir de uma cultura tratando um meio de cultura com ácido sulfúrico ou ácido clorídrico e, depois, usando em combinação com métodos tais como cromatografia de troca aniônica, concentração, salgadura, precipitação pelo ponto isoelétrico etc.
[0027] A presente invenção será, agora, descrita em detalhe adicional com referência aos exemplos seguintes. Estes exemplos são somente para propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o âmbito da presente invenção.
Exemplos Exemplo 1 Produção de um Mutante de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 Tendo Resistência a Canamicina
[0028] Um mutante de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 tendo resistência a canamicina e produtividade melhorada de L-lisina foi selecionado a partir do produto obtido por mutagenese de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 como bactéria pai com um mutágeno químico, N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina.
[0029] Primeiro, 107-108/ml da bactéria pai são tratados com N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina, a 30°C durante 30 minutos para alcançar uma concentração final de 500 μg/ml. A seguir, o microorganismo mutagenizado foi cultivado num meio mínimo de placa de agar contendo canamicina tendo uma concentração de 5 mg/l para separar as bactérias em crescimento. Além disso, os mutantes separados foram cultivados e a produtividade de L-lisina dos mesmos foi medida para selecionar bactérias tendo uma capacidade de produção máxima de L-lisina a partir dos mutantes separados.
[0030] O mutante obtido tendo resistência a canamicina foi designado Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103, depositado em 16 de novembro de 2005 no Korean Culture Center of Microorganism (KCCM) e teve o N° de Acesso KCCM-10707P.
[0031] O mutante obtido no Exemplo 1 e a bactéria pai têm características como se segue.
[0032] Bactéria pai, Corynebacterium glutamicum KFCC10881: resistência a S-(2-amino etil)cisteína, resistência a ácido α-amino-β- hidroxil valérico, resistência a metil lisina e resistência a azida de sódio e exigência imperfeita para homosserina e exigência para leucina.
[0033] Mutante, Corynebacterium glutamicum KFCC10881 -CJP5103: resistência a S-(2-amino etil)cisteína, resistência a ácido α- amino-β-hidroxil valérico, resistência a metil lisina e resistência a azida de sódio e exigência imperfeita para homosserina e exigência para leucina e resistência a canamicina.
[0034] A seguir, foi realizada uma experiência de resistência à canamicina com respeito ao mutante selecionado resistente à canamicina, Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 e a bactéria pai. Primeiros, os dois micro-organismos foram cultivados num meio líquido Luria Bertani (LB) durante 16 horas e, depois, as células foram lavadas duas vezes usando solução salina normal estéril. Então, as células lavadas foram adequadamente diluídas e o produto resultante foi cultivado num meio mínimo de placa de agar contendo canamicina tendo uma concentração de 5 mg/l durante quatro dias para medir a produtividade de cada micro-organismo. Uma composição do meio mínimo de placa de agar é a mesma que se segue: 10 g de glicose, 2 g de (NH4)2SO4, 2 g de ureia, 1,0 g de KH2PO4, 3,0 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4^7H2O, 10 mg de FeSO4^7H2O, 10 mg de MnSO4^7H2O, 100 μg de biotina, 100 μg de tiamina^HCl, 100 μg de CaCl2-2H2O, 80 μg de Na2B4O7-10H2O, 40 μg de (NH4)6Mo27-4H2O, 10 μg de ZnSO47 H2O, 300 μg de CuSO4-7 H2O, 10 μg de MnCl/4H2O, 1 mg de FeCl3^6H2O, 20 g de agar, 0,1 g de L-leucina, se necessário, 0,1 g de L-treonina, se necessário, 0,1 g de L-metionina, se necessário, por 1 L de água destilada (pH 7,0).
[0035] Os resultados da medição da produtividade do mutante e a bactéria pai num meio contendo canamicina são mostrados na Tabela 1.Tabela 1 Resistência à canamicina de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e Corynebacterium glutamicum KFCC10881- CJP5103
Figure img0001
Figure img0002
[0036] +++: crescimento suficiente -: nenhum crescimento
Exemplo 2 Confirmação da Produtividade de L-Lisina de Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103
[0037] Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 foram inoculados num frasco de 250 ml arredondado contendo 25 ml do meio de semente abaixo e o produto resultante foi cultivado a 30°C durante 20 horas enquanto era agitado a 220 rpm. A seguir, 1 ml do meio de cultura obtido foi inoculado num frasco de 250 ml arredondado contendo 25 ml do meio de produção abaixo e o produto resultante foi cultivado a 32°C durante 96 horas, enquanto era agitado a 220 rpm.
[0038] Depois do cultivo estar terminado, a produção de L-lisina foi medida por cromatografia líquido de elevada pressão (HPLC). As quantidades de L-lisina na cultura de Corynebacterium glutamicum KFCC10881 e Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 foram representadas como sal de cloreto da L-lisina e eram de 44,5 g/l e 48,1 g/l, respectivamente.
Meio de semente (pH 7,0):
[0039] 20 g de açúcar cru, 10 g de peptona, 5 g de extrato de levedura, 1,5 g de ureia, 4 g de KH2PO4, 8 g de K2HPO4, 0,5 g de MgSO4 7 H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de tiamina HCl, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 2.000 μg de nicotinamida (1 L de base da água destilada)
Meio de Produção (pH 7,0):
[0040] 100 g de açúcar cru, 40 g de (NH4)2SO4, 2,5 g de proteína de soja, 5 g de sólidos de milho, 3 g de ureia, 1 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO4 7 H2O, 100 μg de biotina, 1.000 μg de tiamina HCl, 2.000 μg de pantotenato de cálcio, 3.000 μg de nicotinamida, 30 g de CaCO3 (1 L de base da água destilada)
Exemplo 3 Separação de L-Lisina de um Meio de Cultura de Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103
[0041] Adicionando cloreto a 1 L de um caldo de fermentação de lisina obtido por cultivo de Corynebacterium glutamicum KFCC10881- CJP5103 num meio contendo melado e açúcar cru, o pH do caldo de fermentação foi ajustado para pH 2,0 e íons de Ca foram transformados em CaSO4 e CaCl2. Então, o meio de cultura foi absorvido numa resina de troca catiônica (Diaion SK-L10), que foi reproduzida na forma de amônio, fazendo fluir o meio de cultura na direção superior. Depois da bactéria residual dentro da resina de troca catiônica ser removida lavando com água desmineralizada, a lisina de elevada concentração foi coletada por eluição da resina com hidróxido de amônio 2N. A solução coletada foi concentrada e cristalizada por arrefecimento a 20°C, enquanto se ajustava o pH para 5,0. Foi obtido um primeiro produto por via úmida por separação centrífuga de uma pasta de cristalização completada e um segundo produto por via úmida foi obtido por concentração de batelada e cristalização da solução mãe. Foram obtidos 44 g de um produto de lisina seco com 98,5% de conteúdo de lisina combinando o primeiro e o segundo produtos úmidos e secando o produto combinado.
Exemplo 4 Separação de L-Lisina de um Meio de Cultura de Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103
[0042] Adicionando ácido sulfúrico a 1 L de um caldo de fermentação de lisina obtido por cultivo de Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 num meio contendo melado e açúcar cru, o pH do caldo de fermentação foi ajustado para pH 2,0. Então, o meio de cultura foi absorvido numa resina de troca catiônica (Diaion SK-L10), que foi reproduzida na forma de amônio, por fluxo na direção superior. Depois que as bactérias residuais dentro da resina de troca catiônica foram removidas lavando com água desmineralizada, a lisina de elevada concentração foi coletada por eluição da resina com hidróxido de amônio2N. A solução coletada foi concentrada e cristalizada por arrefecimento a 20°C, enquanto se ajustava o pH para 5,0 usando cloreto. Foi obtido um primeiro produto úmido por separação centrífuga de uma pasta de cristalização completa e foi obtido um segundo produto úmido por concentração de batelada e cristalizando a solução mãe. Foram obtidos 45 g de um produto de lisina seco com 99% de conteúdo de lisina combinando o primeiro e segundo produtos úmidos e secando o produto combinado.
[0043] O micro-organismo de acordo com a presente invenção tem produtividade de L-lisina.
[0044] No método de produção de L-lisina usando o microorganismo de acordo com a presente invenção, a L-lisina pode ser produzida com elevado rendimento.
[0045] Embora a presente invenção tenha sido particularmente mostrada e descrita com referência a modalidades exemplificativas da mesma, ficará entendido por aqueles de capacidade ordinária na técnica que podem ser feitas várias mudanças na forma e detalhes da mesma sem sair do espírito e âmbito da presente invenção conforme definida pelas Reivindicações seguintes.

Claims (2)

1. Micro-organismo do Gênero Corynebacterium, caracterizado por que o microorganismo é Corynebacterium glutamicum KFCC10881- CJP5103 com N° de Acesso KCCM-10707P.
2. Método de Produção de L-lisina, caracterizado por que compreende cultivar o micro-organismo do gênero Corynebacterium glutamicum KFCC10881-CJP5103 com o N° de Acesso KCCM-10707P, de acordo com a Reivindicação 1; e coletar a L-lisina a partir da cultura.
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