PL106406B1

PL106406B1 - Sposob wytwarzania l-lizyny na drodze fermentacji

Info

Publication number: PL106406B1
Application number: PL1977199507A
Authority: PL
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1976-07-09
Filing date: 1977-07-09
Publication date: 1979-12-31
Also published as: DE2730964A1; FR2357644A1; DE2730964C3; AU520674B2; GB1577975A; US4169763A; DE2730964B2; FR2357644B1; JPS539394A; CA1085328A; JPS579798B2; AU2687477A; MX4943E; PL199507A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia L-lizyny na drodze fermentacji.L-lizyna jest jednym z podstawowych, dobrze znanych aminokwasów, na który jest duze zapo¬ trzebowanie, poniewaz stosuje sie ja jako lek, dodatek do pasz zwierzecych i zywnosci.Dotychczas znane sa nastepujace sposoby wy¬ twarzania L-lizyny na drodze fermentacji. Z opi¬ su patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2 979 439 znany jest sposób polegajacy na uzy¬ ciu homoseryny lub metioniny i treoniny, wyma¬ gajacy stosowania mutantów.' Z opisu pantentowe- go Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 700 557 znany jest sposób, w którym stosuje sie mutanty, wymagajace uzycia jako pozywki treoniny, metio¬ niny, argininy, histydyny, leucyny, izoleucyny, fe- nyloalaniny, cystyny lub cysteiny. Z opisu paten¬ towego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 707 441 znany jest sposób, polegajacy na uzyciu mutanta odpornego na analog lizyny. Z opisu pa¬ tentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 687 810 znany jest sposób, polegajacy na uzyciu mutanta, który wykazuje, zarówno zdolnosc do wytwarzania L-lizyny jak i odpornosc na bacitra- cyne, penicyline G lub polimyksyne. Z opi¬ su patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 708 395 znany jest sposób, polegajacy na uzy¬ ciu mutantów, wymagajacych zastosowania jako pozywki homoseryny, treoniny, treoniny i metio¬ niny, leucyny, izoleucyny lufo ich mieszanin od- pornych na lizyne, treonine, izoleucyne lub ich analogi. Z opisu patentowego Stanów Zjednoczo¬ nych Ameryki nr 3 825 472 znany jest sposób, w którym stasuje sie mutant odporny na analog lizyny, a wymagajacy jako pozywki seryny, pro- liny, alaniny, amidu kwasu nikotynowego, kwasu nikotynowego, kwasu pentotenowego, tioaminy, guaniny, adeniny, hypoksantyny i witaminy Bi2.W wyniku róznych badan, zmierzajacych do otrzymania szczepów, zapewniajacych uzyskanie lepszej wydajnosci L-lizyny, które prowadzono na skutek rosnacego ostatnio zapotrzebowania na L-lizyne, stwierdzono, ze znacznie wieksza zdol¬ nosc do wytwarzania L-lizyny ma szczep wytwa¬ rzajacy L-lizyne, który nalezy do rodzaju Cory- nebacterium, wykazujacy odpornosc na co naj¬ mniej jeden z takich czynników, jak analogi kwa¬ su asparaginowego i leki sulfamidowe.W pierwszym rzedzie stwierdzono, ze podczas produkcji L-lizyny na drodze fermentacji uzysku¬ je sie lepsza wydajnosc* L-lizyny, stosujac szczep odporny na co najmniej jeden z takich czynni¬ ków, jak analogi kwasu asparaginowego i sulfa¬ midy.Sposób wytwarzania L-lizyny na drodze fer¬ mentacji wedlug wynalazku polega na tym, ze w pozywce hoduje sie szczep Corynebacterium glutamicum FERM-P 3633 albo szczep Coryne¬ bacterium gluitamicum FERM-P 3634, a nastepnie 106 406106 406 3 odzyskuje sie wytwarzana L-lizyne i nagromadzo¬ na w plynnej pozywce.Szczep FERM-P 3633 jest mutanteim, któyy otrzymuje sie przez suspendowanie komórek Co- rynebacterium glutamicum ATCC 21543, posiada¬ jacych zdolnosc do wytwarzania L-lizyny (wyma¬ gajacych homoseryny, wymagajacych leucyny i majacych odpornosc wobec S-/fl-aiminoetylo/-ey- steiny, wedlug kanadyjskiego opisu patentowego nr 939 518) w 0,1 n roztworze buforu kwasu tris- -maleinowego (wartosc pH = 6,0), w stezeniu 108 komórek/ml, dodanie do tego roztworu N-mety- lo-N'-nitro-N-nitrozoguanidyny w celu uzyska¬ nia koncowego stezenia 0,2 mg/ml, pozostawienie zawiesiny w temperaturze pokojowej na okres minut, a nastepnie namiesienie^zawiesiny na plytke z agarem i minimalna pozywka, zlozona z nas-tepujacej kompozycji, zawierajacej 1 mg/ml estru hydroksamowego kwasu asparaginowego, jednego z analogów kwasu asparaginowego, i wy¬ braniu szczepu z rosnacych kolonii, który wyraz¬ nie rózni sie od glównego szczepu ATCC 21543 odpornoscia na ester hydroksamowy kwasu aspa¬ raginowego. Szczep FERM-P 3634 jest mutantem, wybranym w ten sam sposób jak opisany powy¬ zej, z tym, ze do otrzymania go stosuje sie plytki z agarem i minimalna pozywka, zawierajaca 1 mg/ml sulfametazyny, jednego z leków sulfami¬ dowych, zamiast estru hydroksa/mowego kwasu asparaginowego, przy czym szczep ten odróznia sie od glównego szczepu odpornoscia na sulfame- tazyne i sulfadiazyne.Sklad plytki z agarem, zawierajacej minimalna pozywke: glukoza siarczan amonu KH2P04 K2HP04 MgS04 • 7H20 FeS04 • 7H20 MnSo4 • nH20 NaCl biotyna chlorowodorek witaminy Bi metionina treonina leucyna agar 0,5 g/dl 0,3 g/dl 0,15 g/dl 0,05 g/dl 0,05 g/dl 0,001 g/dl 0,001 g/dl 0,01 g/dl 100 p.g/1 1 mg/l 50 mg/l mg/l 200 mg/l 2 g/l (pH = 7,2) Wlasciwosci mikrobiologiczne Corynebacterium glutamicum opisane sa w The Journal of General and Applied Microbiology, 18, str. 279—301 (1967).Jako pozywke w sposobie wedlug wynalazku mozna stosowac dowolna pozywke syntetyczna lub naturalna, o ile zawiera ona odpowiednie zródlo wegla, zródlo azotu, skladniki nieorganiczne i in¬ ne potrzebne skladniki odzywcze. Jako zródlo we¬ gla mozna stosowac rózne weglowodany, takie jak glukoza, fruktoza, sorbit, mannit, glicerol, skrobia, hydrolizat skrobiowy, melasy, melasy od¬ padowe itp., weglowodory, takie jak n-parafiny, nafta itp. kwasy organiczne, takie jak kwas octo¬ wy, fumarowy, mlekowy, pirogronowy7^uirsztyno- wy itp. i alkohole, takie jak metanol, etanol itp.Jako zródlo azotu mozna stosowac amoniak, organiczne i nieorganiczne sole amonowe, takie jo » 40 46 60 jak chlorek amonu, siarczan amonu, fosforan amonu, octan amonu itp., mocznik, aminy, inne zwiazki zawierajace azot i pepton, wyciag miesny, wyciag drozdzowy, plyn z rozmoczonej kukury¬ dzy, hydrolizat kazeinowy, maczke rybna, odtlu¬ szczona soje, wyciag z odtluszczonej soi, kwasny hydrolizat, bialka sojowego, rózne komórki mikro¬ organizmów, strawne komórki drobnoustrojów itp.Jako skladniki nieorganiczne stosuje sie fosforan dwuwodoropotasowy, fosforan wodorodwupotaso- wy, siarczan magnezu, chlorek sodu, siarczan zelazawy, siarczan manganawy, weglan wap¬ niowy itp. Jezeli drobnoustrój, stosowany w sposobie wedlug wynalazku, wymaga specjal¬ nych skladników odzywczych potrzebnych do wzrostu, to oczywiscie do pozywki trzeba dodac odpowiednia ilosc tych skladników W pewnych przypadkach takie skladniki odzyw¬ cze dodaje sie w formie naturalnej, czego przy¬ kladem jest zródlo azotu.W sposobie wedlug wynalazku wydajnosc L-li- zyny wytwarzanej przez drobnoustrój mozna zwiekszyc przez dodanie do pozywki plynu po fermentacji, zawierajacego leucyne, co ilustruje przyklad III. W tym przypadku plyn po fermen¬ tacji z leucyna dodaje sie korzystnie w ilosci 0,2—15% objetosciowych w stosunku do pozywki.Poza tym wydajnosc L-lizyny wytwarzanej przez drobnoustrój mozna równiez poprawic przez wprowadzenie do pozywki róznych innych dodatków, na przyklad róznych antybiotyków kwasu a-aminomaslowego, cysteiny, norleucyny, leucyny, kwasu asparaginowego, kwasu glutami¬ nowego itd.Hodowle prowadzi sie w warunkach beztleno¬ wych, na przyklad na trzesawkach przez miesza¬ nie zanurzonej kultury itp. Temperatura, w której hoduje sie drobnoustrój wynosi zwykle 20—40°C, a wartosc pH pozywki zawiera sie w zakresie 3—9, a korzystnie jest bliska obojetnego, przy czym mozna prowadzic hodowle w warunkach, nie mieszczacych sie w podanym zakresie, jezeli drobnoustrój moze w nich rosnac. Wartosc pH pozywki reguluje sie weglanem wapnia, kwasem organicznym lub nieorganicznym albo amonia¬ kiem, wodorotlenkiem metalu alkalicznego, srod¬ kiem buforujacym pH itp. Zwykle do 1—7 dni prowadzenia hodowli L-lizyna zostaje wytworzo¬ na i nagromadzona w otrzymanej brzeczce.Po zakonczeniu wzrostu z brzeczki usuwa sie osady, takie jak komórki itp., i odzyskuje sie L-lizyne znanymi metodami, takimi jak oddzie¬ lanie na zywicy jonowymiennej, zatezanie, ad¬ sorpcja, wysalanie itd.Praktyczne wykonanie sposobu wedlug wyna¬ lazku ilustruja nastepujace przyklady.Przyklad I. Jako szczep nasienny do za¬ szczepiania stosuje sie Corynebacterium glutami¬ cum FERM-P 3633, NRRL-B-8182 (odporny na ester hydroksamowy kwasu asparaginowego).Szczep inokuluje sie w duzym cylindrze o pojem¬ nosci 50 ml (190 mm X 20 mm), w którym znaj¬ duje sie 7 ml ipozywki do zaszczepienia (pH = 7,2), zawierajacej 4 g/dl glukozy, 0,3 g/dl moczni¬ ka, 0,15 g/dl KH*P04, 0,05 g/dl K2HPC4, 0,05 g/dl5 MgS04*7H20, 50 lAg/1 biotyny, 2 g/dl peptonu i 0,5 g/dl wyciagu drozdzowego i prowadzi sie hodowle w temperaturze 30°C w ciagu 24 godzin.Dwoma ml otrzymanej kultury nasiennej inoku- luje sie 20 ml pozywki fermentacyjnej (pH = 7,2) w kolbie Erlenmeyera o pojemnosci 300 ml, za¬ wierajacej 8,5 g/dl odpadowych melas (blackstrap), (jako glukozy), 2 g/dl kwasnego hydrolizatu ma¬ kuchu sojowego (jako makuchu sojowego) 0,5 g/dl siarczanu amonu, 0,3 g/dl mocznika, 0,05 g/dl MgS04 • 7H20, 0,07 g/dl KH2P04 i 3 g/dl weglanu wapniowego i prowa¬ dzi sie hodowle w temperaturze 30 °C, na trze- sawkach w ciagu 3 dni. Otrzymuje sie 35 mg/ml L-lizyny (w postaci jednochlorowodorku, który bedzie nastepnie stosowany), nagromadzonego w brzeczce fermentacyjnej. W tych samych warun¬ kach hodowli szczepu macierzystego ATCC 21543 otrzymuje sie w wyniku próby kontrolnej, pro¬ wadzonej w takim samym czasie, 25 mg/ml L-li¬ zyny.Po zakonczeniu hodowli odwirowuje sie 1 1 brzeczki z kultura w celu usuniecia komórek i innych czesci stalych. W celu zaadsorbowania L-lizyny supernatant przepuszcza sie przez ko¬ lumne z Diaionem SK-1 (forma H+, zinak handlo¬ wy silnie kwasnej zywicy jonowymiennej pro¬ dukcji firmy Mitsubishi Chemical Industries Ltd).Po przemyciu kolumny woda, eluuje sie ja roz¬ cienczonym, wodnym roztworem amoniaku, a na¬ stepnie zbiera sie i zateza frakcje, zawierajace L-lizyne. Wartosc pH koncentratu doprowadza sie do 2 kwasem solnym, chlodzi sie zobojetnio¬ ny koncentrat, a nastepnie dodaje sie etanol w celu wykrystalizowania L-lizyny. Otrzymuje sie 26,5 g krysztalów chlorowodorku L-lizyny.Przyklad II. Hodowle prowadzi sie w ten sam sposób, jak w przykladzie I z tym, ze jako szczep do zaszczepiania stosuje sie Corynebac¬ terium glutamicum FERM-P 3634, NRRL-B-8183 (odporny na sulfametazyne). W brzeczce fermen¬ tacyjnej wytwarza sie i gromadzi 33 mg/ml L-li¬ zyny. W tych samych warunkach hodowli szcze¬ pu glównego ATCC 21543 otrzymuje sie w wyniku próby kontrolnej 25 mg/ml L-lizyny.Przyklad III. Corynebacterium glutamicum FERM-P 3633 stosuje sie jako szczep do zaszcze¬ piania, podobnie jak w przykladzie I. Szeczepem nasiennym inokuluje sie kolbe Erlenmayera o po¬ jemnosci 300 ml, zawierajaca 20 ml pozywki, uzy¬ wanej w przykladzie I. Hodowle prowadzi sie w temperaturze 28°C na faizesawikaich w ciagu 24 godzin. Jednym litrem kultury nasiennej inoku¬ luje sie kadz fermentacyjna o pojemnosci 30 1, za¬ wierajaca 10 1 pozywki fermentacyjnej (ipH = 7,i2), zlozonej z 14 g/dl melasy odpadowej (jako glu¬ kozy), 0,03 g/dl MgS04*7H20, 0,07 g/dl KH2P04, 0,3 g/dl mocznika, 1,8 g/dl kwasnego hydrolizatu makuchu sojowego (jako makuchu sojowego) i 1,4% objetosciowego brzeczki po fermentacji leucyny, otrzymanej w opisany nastepnie sposób i hoduje sie przy szybkosci napowietrzania l/minute, mieszajac z szybkoscia 400 obro¬ tów/minute w temperaturze 28°C, w ciagu 48 go¬ dzin, a nastepnie wartosc pH plynnej kultury 406 6 doprowadza sie 22% wodnym rozitworem amonia¬ ku do 6,8. Otrzymuje sie 58 mg/ml L-lizyny na¬ gromadzonej w brzeczce poferementacyjnej. W tych samych warunkach hodowli szczepu macie- rzystego ATCC 21543 otrzymuje sie 43 mg/ml L-lizyny.Brzeczke po fermentacji leucyny, stosowana ja¬ ko skladnik pozywki, otrzymuje sie w nastepu¬ jacy sposób. Wytwarzajacym leucyne szczepem Corynebacterium glutamicum ATCC 21885, inoku¬ luje sie kadz 3 1 pozywki (pH = 7,2), zlozonej z 5 g/dl glukozy, 1 g/dl peptonu, 1 g/dl ekstraktu drozdzy, 0,5 g/dl plynu z rozmoczonej kukurydzy, 0,25 g/dl NaCl, 0,3 g/dl mocznika oraz 50 ng/1 bio- tyny, a umieszczonej w 5 litrowej kadzi fermen¬ tacyjnej i prowadzi sie hodowle z napowietrze¬ niem i mieszaniem, przy czym szybkosc napo¬ wietrzania wynosi 3 l/minute, a szybkosc miesza¬ nia 600 obrotów/minute, w temperaturze 30°C, w ciagu 17 godzin. Jednym litrem kultury nasien¬ nej inokuluje sie umieszczona w 30 1 kadzi fer¬ mentacyjnej 10 1 pozywki (pH = 6,8), w sklad której wchodzi 0,5 g/dl octanu amonu, 0,2 g/dl KH2P04, 0,05 g/dl M@S04«7H20, 0,01 g/dl FeS04-7H20, 0,001 g/dl MnS04 • nH20, 50 \ig/l bio¬ tyny oraz 100 |xg/l chlorowodorku tiaminy i pro¬ wadzi sie hodowle z napowietrzaniem i miesza¬ niem, przy czym szybkosc napowietrzania wynosi l/minute, a szybkosc mieszania 400 obrotów/na minute, w temperaturze 30°C, w ciagu 60 go¬ dzin. Podczas hodowli do brzeczki hodowlanej do¬ daje sie w sposób ciagly zmieszany roztwór, za¬ wierajacy 7% octanu amonu i 30% kwasu octo¬ wego w celu zapewnienia zródla wegla i zacho- M wania wartosci pH na poziomie 6,8, otrzymuje sie pofermentacyjna brzeczke leucyny, zawieraja¬ ca 15,3 mg/ml L-leucyny, która stosuje sie jako czesc pozywki fermentacyjnej do wytwarzania L- -lizyny. PL PL PL PL

Claims

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania L-lizyny na drodze fer¬ mentacji, znamienny tym, ze poddaje sie hodowli 15 szczep Corynebacterium glutamicum FERM-P 3633 w pozywce, nagromadza wytworzona L-lizy- ne w plynnej pozywce i odzyskuje z niej L-lizy¬ ne.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze J0 hodowle prowadzi sie w temperaturze w zakre¬ sie 20—40°C i przy wartosci pH w zakresie 3—9 w czasie 1—7 dni.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej 55 brzeczke fermentacyjna z leucyna w ilosci 0,2—15% obljejtosciowyfch w stosunku do. objetosci pozywki, otrzymana przez hodowanie wytwarza¬ jacego leucyne szczepu Corynebacterium glutami¬ cum ATCC 21885. j!

4. Sposób wytwarzania L-lizyny na drodze fer¬ mentacji, znamienny tym, ze poddaje sie hodowli szczep Corynebacterium glutamicum FERM-P 3634 w pozywce, nagromadza wytworzona L-lizyne w plynnej pozywce i odzyskuje z niej L-lizyne. n

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze7 106 406 8 hodowle prowadzi sie w temperaturze 20—40°C, 0,2—15% objetosciowych w stosunku do objetosci przy wartosci pH = 3—9, w czasie 1—7 dni. pozywki, otrizyinaaia przez hodowanie wytwarzaja-

6. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze cego leucyne szczepu z rodzaju Corynebacterium hodowle prowadzi sie w pozywce, zawierajacej glutamicum ATCC 21885. brzeczke fermentacyjna z leucyna w ilosci 5 ZP Koszalin D-1729 90 egz. A-4 Cena 45 zl PL PL PL PL