BRPI0606389A2

BRPI0606389A2 - método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos

Info

Publication number: BRPI0606389A2
Application number: BRPI0606389-6A
Authority: BR
Inventors: Abo Masanobu; Würtz Christensen Morten; Hu Zhengyu
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2005-01-10
Filing date: 2006-01-10
Publication date: 2011-08-23
Also published as: EP1838860A2; BRPI0606389B1; WO2006072256A2; CA2593282C; CN101103118A; ES2363094T3; CA2593282A1; ATE503019T1; US20080113419A1; US20110201066A1; DE602006020837D1; EP1838860B1; CN101103118B; JP5133701B2; JP2008526217A; WO2006072256A3; US9593352B2

Abstract

<B>MéTODO PARA PRODUZIR ALQUIL éSTERES DE áCIDOS GRAXOS<D>Um método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos, em que uma solução compreendendo triglicerídeo e álcool é colocada em contato com uma primeira enzima lipolitica tendo uma atividade relativamente mais elevada sobre os ácidos graxos livres do que sobre o triglicerídeo, e uma segunda enzima lipolítica tendo uma atividade relativamente mais elevada sobre o triglicerídeo do que sobre os ácidos graxos livres.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR ALQUIL ESTERES DE ÁCIDOSGRAXOS"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método para produziralquil ésteres de ácidos graxos a partir do triglicerídeo, mediante o uso de umaprimeira enzima lipolítica que favorece a conversão dos ácidos graxos livresem alquil ésteres de ácido graxo.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

O biodiesel, geralmente classificado como mono-alquil ésteresde gorduras e óleos, se tornou mais atrativo recentemente por causa dos seusbenefícios ambientais. Não obstante o biodiesel seja no presentequimicamente produzido com sucesso (com o uso por exemplo de NaOH e/oumetóxido de sódio como catalisador), existem vários problemas associadosque restringem seu desenvolvimento, tais como o pré-processamento do óleo,por causa dos altos conteúdos de ácidos graxos livres, da remoção docatalisador químico do éster e da fase de glicerol, e remoção de saisinorgânicos durante a recuperação do glicerol.

As desvantagens causadas pelos catalisadores químicos sãoamplamente impedidas mediante o uso de enzimas lipolíticas como oscatalisadores e, nos anos recentes, o interesse tem se desenvolvido no uso delipases com ou sem imobilização na transesterificação para a produção dobiodiesel.

As esterases fungicas podem ser usadas na produçãoenzimática de ésteres, em que elas podem substituir os catalisadores como oácido mineral (por exemplo, ácido sulfurico, cloreto de hidrogênio e ácidoclorossulfônico), hidróxidos anfotéricos de metais dos grupos I, II, III e IV, eoutros. O uso de enzimas para a síntese de ésteres foi descrito na técnicaanterior, em particular as enzimas classificadas em EC 3.1.1 Hidrolases deésteres carboxílicos de acordo com a Nomenclatura de Enzimas(Recomendações do Comitê de Nomenclaturas da União Internacional deBioquímica e Biologia Molecular, 1992 ou mais tarde.

A WO 88/02775 apresenta lipases A e B de Candidaantarctica. Ela estabelece que a lipase B da C. antarctica (CALB) é maiseficaz para a síntese de ésteres.

As cutinases são enzimas lipolíticas capazes de hidrolisar acutina do substrato. As cutinases são conhecidas de vários fungos (Ρ. E.Kolattukudy em "Lipases", Ed. B. Borgstrõm e H. L. Brockman, Elsevier1984, 471-504). A seqüência de aminoácidos de uma cutinase de Humicolainsolens foi publicada (U.S. 5.827.719).

Muitos pesquisadores têm relatado que uma alta produção dealquil ésteres pode ser alcançada na presença de solventes orgânicos, mas, porcausa da toxicidade e da inflamabilidade dos solventes orgânicos, a alcoólisecatalisada pela lipase em um meio livre de solvente é mais desejável. Ametanólise catalisada pelas lipases foi mostrada ocorrer em um sistemacontendo água livre de solventes orgânicos. Em tais sistemas, as lipases, quesão menos sensíveis ao metanol, são vantajosas (Kaieda et al. J. Biosci.Bioeng. 2001, 91: 12-15). É bem conhecido o fato de que os álcoois deexcessiva cadeia curta, tais como o metanol, podem inativar seriamente alipase. Entretanto, pelo menos três equivalentes molares de metanol sãonecessários para a completa conversão do óleo em seu correspondente metiléter. Du et ai. (Biotechnol. Appl. Bioehem. 2003, 38: 103-106) estudaram oefeito da relação molar do óleo/metanol comparativamente durante a operaçãode batelada não contínua e de batelada contínua.

Para evitar a inativação das lipases, a concentração do metanolfoi mantida baixa pela adição de metanol às etapas na totalidade da reação(Shimada et al. J Mol. Catalysis Enzymatie, 2002, 17: 133-142; Xu et al.2004, Bioeat. Biotransform. 22: 45-48).

Boutur et al. (,J. Bioteehnol. 1995, 42: 23-33) relataram umalipase de Candida deformans, e os quais foram capazes de catalisar tanto aalcoólise do triglicerídeo (TG) quanto a esterificação dos ácidos graxos livres(FFA), porém não sob as mesmas condições de reação. Sob as condiçõesdescritas por Boutur et al., apenas a esterificação foi catalisada.

De modo a obter uma produção mais econômica de etil ésteres

de ácidos graxos para o biodiesel, existe a necessidade de uma conversãomais rápida das gorduras e óleos em seus correspondentes metil ésteres, e umrendimento mais elevado na referida conversão.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método para produziralquil ésteres de ácidos graxos, tais como os metil ésteres de ácidos graxos(FAME) e os etil ésteres de ácidos graxos. Tais ésteres são tambémdenominados biodiesel, porque eles são usados como um aditivo ao dieselmineral para resultar em um combustível de número elevado de cetano, livrede enxofre, o qual seja parcialmente à base de recursos renováveis.

O método da invenção inclui uma solução compreendendoálcool, triglicerídeo e/ou ácidos graxos livres, cuja solução entra em contatocom uma primeira enzima lipolítica e uma segunda enzima lipolítica dediferente especificidade, em que as enzimas lipolíticas catalisam a conversãodo triglicerídeo ou ácidos graxos livres ou uma mistura de ambos, em alquilésteres de ácidos graxos. A primeira enzima lipolítica é caracterizada no fatode que ela apresenta atividade mais elevada contra o triglicerídeo do que osácidos graxos livres, ao passo que a segunda enzima lipolítica apresentaatividade mais elevada contra os ácidos graxos do que os triglicerídeos.Aatividade da primeira e da segunda enzimas lipolíticas é determinada pelo usodos métodos descritos nos Exemplos 1 e 2 abaixo.

A primeira enzima lipolítica é definida como aquela que temuma relação de atividade sobre TG/atividade sobre FFA abaixo de 0,2. Asegunda enzima lipolítica é definida como aquela que tem uma relação deatividade sobre TG/atividade sobre FFA acima de 0,5.

A combinação de uma primeira enzima lipolítica e umasegunda enzima lipolítica de acordo com a presente invenção resulta em umefeito sinergístico sobre a conversão do triglicerídeo e do triglicerídeo emcombinação com os ácidos graxos livres em alquil ésteres de ácidos graxos,por meio do que um percentual de conversão mais elevado é obtido em umperíodo de tempo mais curto.

Além disso, a invenção diz respeito a um processo de bateladaou um processo contínuo escalonado para produzir ésteres de ácidos graxoscom o uso de uma primeira e uma segunda enzima lipolítica como descritoacima, em que o álcool é acrescentado continuamente ou em etapas, e em queas enzimas são recicladas ou usadas apenas uma vez.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método para produziralquil ésteres de ácidos graxos. O método da invenção inclui uma soluçãocompreendendo álcool e um substrato, o qual compreende triglicerídeo e/ouácidos graxos livres. A solução é colocada em contato com uma primeiraenzima lipolítica e uma segunda enzima lipolítica de diferente especificidade,em que as enzimas lipolíticas catalisam a conversão do triglicerídeo ou dosácidos graxos livres ou uma mistura de ambos, em alquil ésteres de ácidosgraxos.

Substratos Substratos adequados para a produção de alquilésteres de ácidos graxos de acordo com a presente invenção são uma amplavariedade de óleos e gorduras vegetais; os óleos de colza e de soja são os maiscomumente usados, embora os óleos de outras plantas tais como a mostarda, ogirassol, canola, coco, cânhamo, palma e mesmo as algas, sejam promissores.

O substrato pode ser de qualidade bruta ou ainda processado (refinado,branqueado e desodorizado). Igualmente as gorduras animais, incluindo osebo, a gordura, aves domésticas, óleo marinho, bem como gorduras e óleosvegetais e animais usados, comumente conhecidos como graxa amarela emarrom, podem ser usadas. Gorduras e óleos adequados podem sertriglicerídeo puro ou uma mistura de triglicerídeo com ácidos graxos livres,comumente observados no óleo vegetal e nas gorduras animais usadas. Osubstrato podem também ser obtidos de destilados desodorizantes de óleosvegetais. O tipo de ácidos graxos no substrato compreende aqueles deocorrência natural como glicerídeos em gorduras e óleos vegetais e animais.Estes incluem o ácido oléico, o ácido linoleico, o ácido linolênico, o ácidopalmítico e o ácido láurico, para citar uns poucos. Os constituintessecundários nos óleos vegetais brutos são tipicamente os fosfolipídeos, osácidos graxos livres e os glicerídeos parciais, isto é, os mono- e diglicerídeos.Quando aqui usada, a expressão "resíduos de ácidos graxos" refere-se aácidos graxos, ou livres ou esterificados como nos triglicerídeos,diglicerídeos, monoglicerídeos ou alquil ésteres de ácidos graxos.

Substratos Os alquil ésteres de ácidos graxos, tais como osmetil ésteres de ácidos graxos (FAME) e os etil ésteres de ácidos graxos, sãotambém denominados biodiesel, porque eles são usados como um aditivo aodiesel fóssil. O biodiesel constitui um aditivo crescentemente importante ousubstituto para os combustíveis diesel com base no óleo fóssil, porque ele éproduzido de recursos renováveis.

Álcool O álcool usado no método da invenção é de preferênciaum álcool inferior tendo de 1 a 5 átomos de carbono (C1-C5). Alcooispreferidos são o metanol e o etanol.

Enzima Lipolítica A primeira enzima lipolítica de acordo coma presente invenção é caracterizada no fato de que ela apresenta maioratividade contra o triglicerídeo do que os ácidos graxos livres, ao passo que asegunda enzima lipolítica apresenta atividade maior contra os ácidos graxoslivres do que o triglicerídeo. A atividade das enzimas lipolíticas contra ostriglicerídeos e os ácidos graxos livres é determinada como descrito noExemplo 1 e no Exemplo 2, respectivamente.

Em conformidade com a presente invenção, a primeira enzimalipolitica é definida como aquela que tem uma relação de atividade sobre otriglicerídeo (medida como conversão de alquil ésteres de ácidos graxos) paraa atividade sobre FFA (medida como conversão do FFA em alquil ésteres deácidos graxos) abaixo de 0,2. A segunda enzima lipolitica é definida comoaquela que tem uma relação de atividade sobre o glicerídeo (medida comoconversão do triglicerídeo em alquil ésteres de ácidos graxos) para a atividadesobre FFA (medida como conversão de FFA em alquil ésteres de ácidosgraxos) acima de 0,5.

Conseqüentemente, a presente invenção diz respeito a ummétodo para produzir alquil ésteres de ácidos graxos, caracterizado no fato deque uma solução compreendendo triglicerídeo e álcool é colocada em contatocom uma primeira enzima lipolitica tendo uma relação de atividade sobre otriglicerídeo para a atividade sobre FFA abaixo de 0,2 e uma segunda enzimalipolitica tendo uma relação de atividade sobre o triglicerídeo para a atividadesobre FFA acima de 0,5.

A primeira enzima lipolitica preferivelmente tem uma relaçãode atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFA na faixa de 0,01a 0,2, mais preferível na faixa de 0,01 a 0,1, mais preferível na faixa de0,0125 a 0,05, mais preferível na faixa de 0,015 a 0,025, ainda mais preferívelna faixa de 0,02 a 0,024. A segunda enzima lipolitica preferivelmente temuma relação de atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre o FFA nafaixa de 0,5 a 20, mais preferível na faixa de 0,6 a 10, mais preferível na faixade 0,7 a 5, ainda mais preferível na faixa de 0,8 a 1,5.

Como estabelecido acima, a atividade das enzimas lipolíticascontra os triglicerídeos e o ácido graxo livre é determinada como descrito noExemplo 1 e no Exemplo 2, respectivamente. Abaixo, a relação da atividadesobre o triglicerídeo (abreviado TG) medida como no Exemplo 1 para aatividade sobre os ácidos graxos livres (abreviados FFA) medida como noExemplo 2, foi calculada quanto às enzimas lipoliticas testadas:

CALB: TG/FFA = 0,55/26,41 = 0,021

H. insolens cutinase: TG/FFA = 12,13/10 = 1,213

T. Ianuginosus lipase: TG/FFA = 13,22/16,25 = 0,814.

A combinação de uma primeira enzima lipolítica e umasegunda enzima lipolítica de acordo com a presente invenção, resulta em umefeito sinergístico sobre a conversão do triglicerídeo e/ou dos ácidos graxoslivres em alquil ésteres de ácidos graxos, por meio do que um percentual maiselevado de conversão é obtido em um período de tempo mais curto.

Em uma forma de realização preferida do método da presenteinvenção, uma primeira enzima lipolítica da presente invenção é a lipase B daCandida antarctica (CALB) como apresentado na WO 88/02775, enquanto asegunda enzima lipolítica é uma das variantes da lipase de Thermomyceslanuginosus (anteriormente Humicola lanuginosus) exemplificadas na WO00/60063 e das variantes da cutinase de Humieola insolens apresentadas noExemplo 2 da WO 01/92502, daqui por diante referidas como lipase de T.lanuginosus e cutinase de H. insolens, respectivamente. Em uma segundaforma de realização preferida, uma primeira enzima lipolítica inclui a lipasede Hyphozyma sp. e a lipase de Candida parapsilosis, ao passo que umasegunda enzima lipolítica da presente invenção inclui a lipase A de C.antarctica como apresentado na WO 88/02775 e lipases de Humicolalanuginosus (EP 258 068), Candida rugosa, Pseudomonas cepacia,Geotricum candidum, Thizomucor miehei, Crytococcus spp. S-2 e Candidaparapsilosis.

Em uma terceira forma de realização, a primeira enzimalipolítica é homóloga com CALB, lipase de Hyphozyma sp. e a lipase deCandida parapsilosis, ao passo que uma segunda enzima lipolítica éhomóloga com a lipase de T. lanuginosus, cutinase de H. insolens ou qualqueruma das lipases de Humicola lanuginosus (EP 258 068), Candida rugosa,Pseudomonas eepaeia, Geotricum candidum, Rhizomueor miehei,Cryíococeus spp. S-2 e Candida parapsilosis.

Preferivelmente, a primeira enzima lipolítica de acordo com ométodo da presente invenção é 60% idêntica a CALB, enquanto a segundaenzima lipolítica é 60% idêntica à lipase de T. lanuginosus, a cutinase de H.insolens. Mais preferível a primeira enzima lipolítica é 70% idêntica a CALB,ainda mais preferível a primeira enzima lipolítica é 75%, 80%, 85%, 88%,90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou ainda 99% idêntica a CALB. Deforma semelhante, a segunda enzima lipolítica é preferivelmente 70% idênticaà lipase de T. lanuginosus e à cutinase de H. insolens, mais preferivelmente asegunda enzima lipolítica é 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%,96%, 97%, 98% ou ainda 99% idêntica à lipase de T. lanuginosus ou àcutinase de H. insolens.

As enzimas podem ser aplicadas como pó liofilizado,imobilizado ou em solução aquosa.

Para os fins da presente invenção, o grau de identidade podeser adequadamente determinado de acordo com o método descrito emNeedleman, S. B. e Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48,443-445, com os seguintes ajustes para comparação da seqüência depolipeptídeos: penalidade de criação de GAP de 3,0 e penalidade da extensãode GAP de 0,1. A determinação pode ser feita por meio de um programa decomputador conhecido como GAP fornecido no pacote de programas GCG(Manual de Programas para o Pacote Wisconsin, versão 8, agosto de 1994,Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711).

Duas dadas seqüências podem ser alinhadas de acordo com ométodo descrito em Needleman (acima) com o uso dos mesmos parâmetros.Isto pode ser feito por meio do programa GAP (supra).Além disso, a invenção diz respeito a um processo de bateladae/ou contínuo, processo escalonado para produzir alquil ésteres de ácidosgraxos com o uso de uma primeira e uma segunda enzima lipolítica conformeacima descrito, em que o álcool é adicionado continuamente ou em etapas, e em que as enzimas são recicladas ou usadas apenas uma vez. Se as enzimasestiverem em uma fase aquosa, esta fase pode ser separada da fase graxamediante um decantador, um sedimentador, ou por centrifugação. Noprocesso contínuo, as duas fases, oleosa e aquosa, respectivamente, podem serprocessadas em contra-corrente. Kosugi5 Y.; Tanaka, H. e Tomizuka, (1990),Biotechnology and Bioengineering, vol. 36, 617-622, descrevem um processoem contra-corrente contínuo para hidrolisar o óleo vegetal por lipaseimobilizada.

Descrição Geral da Preparação de Alquil ésteres de ácidos graxos

O substrato compreendendo triglicerídeo é misturado com álcool, preferivelmente metanol ou etanol, e aquecido até 30 a 60 0C, depreferência 50 °C, em um banho em agitação de água recíproco (200 rpm).Preferivelmente, água é acrescentada e a solução é misturada e ainda aquecidaaté a temperatura desejada. As enzimas são adicionadas e a solução émisturada vigorosamente e deixada no banho em agitação de água recíproco na temperatura desejada, preferivelmente a 50 0C e 200 rpm, até reagir. Asfases da mistura de reação podem ser misturadas pelo uso de misturadores dealto cisalhamento, tais como os tipos da Silverson ou da IKA Labortechnik,como usados na desengomagem enzimática do óleo vegetal (Clausen, K.(2001), European Journal of Lipid Science and Technology, vol. 103, 333- 340).

A relação molar de metanol/resíduo de ácidos graxos deve serde pelo menos 0,1 e no máximo de 10, preferivelmente na faixa de 0,3 a 5,mais preferível de 0,4 a 2. O álcool pode ser adicionado em etapas à reação nodecorrer do tempo. A água pode ser adicionada separadamente ou dentro deuma solução enzimática aquosa. A concentração final da água na mistura dereação pode ser de 0 a 50% (p/p), preferivelmente de 5 a 40%, mais preferívelde 5 a 30%. O substrato compreende de 1 a 99% (p/p) de triglicerídeo,preferivelmente na faixa de 70 a 95%. Além disso, o substrato podecompreender ácidos graxos livres na quantidade de 0,01 a 95% (p/p),preferivelmente na faixa de 0,01 a 30%. Igualmente, os mono- e diglicerídeose os fosfolipídeos podem estar presentes.

Naturalmente, a reação pode ser seguida pela retirada deamostras da mistura de reação após um certo período de tempo de reação. Asamostras são centrifugadas por 14 minutos em 14.000 rpm. A camadasuperior consiste de material graxo não solúvel na fase de água e esta éanalisada por 1H RMN (usando-se CDCl3 como solvente). Após a reação terterminado, a fase glicerol é removido ou por decantação ou por centrifugação.Clonagem de Uma Seqüência de DNA Codificando Uma Enzima Lipolítica

A seqüência de DNA codificando uma enzima lipolíticaprecursora pode ser isolada de qualquer célula ou microorganismo queproduzam a enzima lipolítica em questão, com o uso de vários métodos bemconhecidos na técnica. Primeiro, uma biblioteca genômica de DNA e/ou decDNA deve ser construída com o uso do DNA cromossômico ou RNAmensageiro do organismo que produza a enzima lipolítica a ser estudada.Depois, se a seqüência de aminoácidos da enzima lipolítica for conhecida,sondas de oligonucleotídeos rotuladas podem ser sintetizadas e usadas paraidentificar os clones codificando a enzima lipolítica de uma bibliotecagenômica preparada do organismo em questão. Alternativamente uma sondarotulada de oligonucleotídeo contendo seqüências homólogas a outro gene deenzima lipolítica conhecido pode ser usada como uma sonda para identificaros clones codificando a enzima lipolítica, com o uso de hibridização econdições de lavagem de menor estringência.

Outro método ainda para identificar clones codificando aenzima lipolítica deve envolver a inserção de fragmentos de DNA genômicoem um vetor de expressão, tal como um plasmídeo, transformando asbactérias negativas quanto à cutinase com a biblioteca de DNA genômicoresultante, e depois plaqueando-se as bactérias transformadas sobre ágarcontendo um substrato para a enzima lipolítica (isto é, triglicerídeo), dessemodo possibilitando que os clones que expressam a enzima lipolítica sejamidentificados.

Alternativamente, a seqüência de DNA codificando a enzimapode ser preparada sinteticamente por métodos padrão estabelecidos, porexemplo o método de fosforoamidita descrito por S. L. Beaucage e Μ. H.Caruthers, (1981), Tetrahedron Letters 22, pp. 1859-1869, ou o métododescrito por Matthes et ai., (1984), EMBO J. 3, pp. 801-805. No método dafosforoamidita, os oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em umsintetizador automático de DNA, purificados, recozidos, ligados e clonadosem vetores apropriados.

Finalmente, a seqüência de DNA pode ser de origem genômicamista e sintética, de origem mista sintética e de cDNA, ou de origemgenômica mista e cDNA, preparada por fragmentos de ligação de origemsintética, genômica ou de cDNA (quando apropriado, os fragmentoscorrespondentes às várias partes da seqüência de DNA inteira), de acordo comtécnicas padrão. A seqüência de DNA também pode ser preparada por reaçãoem cadeia da polimerase (PCR) com o uso de iniciadores específicos, porexemplo como descrito na U.S. 4.683.202 ou R. K. Saiki et al., (1988),Science 239, 1988, pp. 487-491.

Vetor de Expressão

O vetor de expressão recombinante carregando a seqüência deDNA codificando uma enzima lipolítica da invenção pode ser qualquer vetorque possa convenientemente ser submetido a procedimentos recombinantesdo DNA, e a escolha do vetor freqüentemente dependerá da célula hospedeiradentro da qual ele deva ser introduzido. O vetor pode ser aquele que, quandointroduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célulahospedeira e replicado junto com o(s) cromossoma(s) dentro do qual ele tenhasido integrado. Exemplos de vetores de expressão adequados incluem o pMT838.

O vetor de expressão da invenção pode também compreenderum terminador de transcrição adequado e, nos eucariotas, as seqüências depoliadenilação operavelmente conectadas à seqüência de DNA que codifica aenzima lipolítica da invenção. As seqüências de terminação e depoliadenilação podem adequadamente ser derivadas das mesmas fontes comoo promotor.

O vetor pode ainda compreender uma seqüência de DNA quepossibilita que o vetor se replique na célula hospedeira em questão. Exemplosde tais seqüências são as origens de replicação dos plasmídeos pUC19,ρACYC177, pUB 110, pE 194, pAMB 1 epIJ702.

O vetor pode também compreender um marcador selecionável,por exemplo um gene cujo produto complemente um defeito na célulahospedeira, tal como os genes dal de B. subtilis ou B. licheniformis, ou umque confira resistência a antibióticos, tal como resistência à ampicilina, àcanamicina, ao cloranfenicol ou à tetraciclina. Além disso, o vetor podecompreender marcadores de seleção de Aspergillus, tais como amdS, argB,niaD e sC, um marcador dando origem à resistência à higromicina, ou aseleção pode ser realizada por co-transformação, por exemplo como descritona WO 91/17243.

Os procedimentos usados para ligar a construção de DNA dainvenção codificando uma variante da cutinase, o promotor, o terminador eoutros elementos, respectivamente, e introduzi-la nos vetores adequadoscontendo a informação necessária para replicação, são bem conhecidos daspessoas habilitadas na técnica (conforme, por exemplo, Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição., Cold Spring Harbor,1989).

Promotor

No vetor, a seqüência de DNA deve ser operavelmenteconectada a uma seqüência promotora adequada. O promotor pode serqualquer seqüência de DNA que apresente atividade transcricional na célulahospedeira de escolha e possa ser derivada dos genes codificando proteínas ouhomólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

Exemplos de promotores adequados para dirigir a transcriçãoda seqüência de DNA codificando uma enzima lipolitica da invenção,especialmente em um hospedeiro bacteriano, são o promotor do operon Iac deE. coli, os promotores dagA do gene de agarase de Streptomyces eoelieolor,os promotores do gene de alfa-amilase (amyL) de Bacillus lieheniformis, ospromotores do gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillusstearothermophilus, os promotores da alfa-amilase (amyQ) de Bacillusamyloliquefaeiens, os promotores dos genes xylA e xylB de Bacillus subtillis,etc. Para a transcrição em um hospedeiro fungico, exemplos de promotoresúteis são aqueles derivados do gene codificando a amilase de A. oryzaeTAKA, o promotor TPI (triose fosfato isomerase) de S. cerevisiae [Alber etai. (1982), J. Mol Appl. Genet 1, pp. 419-434, proteinase aspártica deRhizomueor miehei, alfa-amilase neutra de A. niger, alfa amilase estável aácido de A. niger, glicoamilase de A. niger, lipase de Rhizomueor miehei,protease alcalina de A. oryzae, triose fosfato isomerase de A. oryzae, ouacetamidase de A. nidulans.Células Hospedeiras

A célula da invenção, ou compreendendo uma construção deDNA ou um vetor de expressão da invenção, como definido acima, évantajosamente usada como uma célula hospedeira na produção recombinantede uma enzima lipolitica da invenção. A célula pode ser transformada com aconstrução de DNA da invenção codificando a enzima lipolítica,convenientemente pela integração da construção de DNA (em uma ou maiscópias) no cromossoma hospedeiro. Esta integração é geralmente consideradacomo sendo uma vantagem já que a seqüência de DNA é mais provável de serestavelmente mantida na célula. A integração das construções de DNA nocromossoma hospedeiro pode ser realizada de acordo com métodosconvencionais, por exemplo por recombinação homóloga ou heteróloga.Alternativamente, a célula pode ser transformada com um vetor de expressãocomo descrito acima, em combinação com os diferentes tipos de célulashospedeiras.

A célula da invenção pode ser uma célula de um organismosuperior, tal como um mamífero ou um inseto, particularmente uma célulamicrobiana, por exemplo uma célula bacteriana ou fungica (inclusive alevedura).

Exemplos de bactérias adequadas são as bactérias Gram-positivas, tais como Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus,Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillusamyloliquefaeiens, Bacillus coagulans, Bacillus eireulans, Bacillus lautus,Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis ou Streptomyees lividans ouStreptomyees murinus, ou bactérias Gram-negativas tais como E. eoli. Atransformação das bactérias pode, por exemplo, ser efetuada portransformação de protoplastos ou pelo uso de células competentes de umamaneira por si conhecida.

O organismo da levedura pode favoravelmente ser selecionadode uma espécie de Saccharomyees ou Scizosaccharomyces, por exemploSaccharomyees eerevisiae.

A célula hospedeira pode também ser um fungo filamentoso,por exemplo uma cepa pertencente a uma espécie de Aspergillus, emparticular Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger, ou uma cepa de Fusarium,tal como uma cepa de Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum (noestado perfeito denominada Gibberella zeae, anteriormente Sphaeria zeae,sinônimo de Gibberella roseum e Gibberella roseum f. sp. cerealis), ouFusarium sulphureum (no estado perfeito denominada Gibberella puricaris,sinônimo de Fusarium trichothecioides, Fusarium bactridioides, Fusariumsambucinum, Fusarium roseum e Fusarium roseum var. graminearum),Fusarium cerealis (sinônimo de Fusarium crokkwellense), ou Fusariumvenenatum.

Em uma forma de realização particular da invenção, a célulahospedeira é uma protease deficiente ou uma cepa secundária de protease.Esta pode, por exemplo, ser a cepa deficiente de protease de Aspergillusoryzae JaL 125 tendo o gene da protease alcalina denominado "alp" deletado.Esta cepa é descrita na WO 97/35956 (Novo Nordisk).

As células de fungos filamentosos podem ser transformadaspor um processo envolvendo a formação de protoplastos e a transformaçãodos protoplastos seguida pela regeneração da parede celular de uma forma porsi conhecida. O uso do Aspergillus como um microorganismo hospedeiro édescrito na EP 238 023 (Novo Nordisk A/S), cujo conteúdo é por este meioincorporado como referência.Produção da Enzima Lipolitica Mediante Cultivo do Transformante

A invenção diz respeito, inter alia, a um método de produziruma enzima lipolítica da invenção, método este que compreende cultivar umacélula hospedeira sob condições conducentes à produção da enzima lipolíticae recuperação da enzima lipolítica das células e/ou meio de cultura.

O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meioconvencional adequado ao cultivo da célula hospedeira em questão, e obter aexpressão da enzima lipolítica da invenção. Meios adequados acham-sedisponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordocom receitas publicadas (por exemplo, como descrito nos catálogos daAmerican Type Culture Collection).

A enzima lipolítica secretada das células hospedeiras podeconvenientemente ser recuperada do meio de cultura por procedimentos bemconhecidos, incluindo a separação das células do meio mediante centrifugaçãoou filtração, e precipitando-se os componentes proteináceos do meio porintermédio de um sal, tal como o sulfato de amônio, seguido pelo uso deprocedimentos cromatográficos tais como a cromatografia de troca de íons, acromatografia de afinidade, ou coisa parecida.

MATERIAIS E MÉTODOS

Atividade de Lipase sobre tributirina (LU)

Um substrato para as enzimas lipolíticas é preparado pelaemulsificação da tributirina (tributirato de glicerina) com o uso da gomaarábica como emulsificante. A hidrólise da tributirina a 30 0C em pH 7 éseguida em uma experiência de titulação de pH-stato. Uma unidade daatividade da lipase (1 LU) é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1μηιοί de ácido butírico/minuto nas condições padrão.Preparação do alquil éster de ácido graxo

8,00 gramas de substrato são misturados com metanol (0,500ml 0,395 grama). Os seguintes tipos de substratos foram usados:

Exemplo 1) 100% de óleo de salada (óleo de soja refinado,branqueado e desodorizado, RDB SBO);

Exemplo 2) 100% de ácido oléico;

Exemplo 3) mistura de 20% p/pde ácido oléico em RBD SBOA mistura de substrato-metanol é aquecida a 50 0C em umbanho em agitação de água recíproco (200 rpm). Água desmineralizada éadicionada (volume dependendo do volume de enzimas adicionadas;quantidade total de água: 4,00 ml, incluindo a água de adição de enzimas)correspondente a 32% p/p da mistura total. A mistura é aquecida a 50 0C.Depois, a enzima é adicionada à mistura e vigorosamente misturada por 10segundos e deixada no banho em agitação de água recíproco em 50 0C e 200rpm. As fases da mistura de reação podem ser misturadas pelo uso demisturadores de alto cisalhamento, tais como os tipos da Silverson Ltd. ReinoUnido ou IKA Kunkel.

Amostras são retiradas da mistura de reação após o tempo dereação de 3 horas, e centrifugadas por 14 minutos a 14000 rpm. A camadasuperior consiste de material graxo não solúvel na fase de água e este éanalisado por 1H RMN (com o uso de CDCl3 como solvente) espectrômetroVarian 400 MHz (Varian Inc. CA, USA). A conversão dos resíduos de ácidosgraxos em metil ésteres de ácidos graxos é determinada pela relação dossinais de metila dos metil ésteres de ácidos graxos, -COOCH3 (3,70 ppm) eCH3CH2- (1,0 - 0,9 ppm) dos resíduos de ácidos graxos.

A dose de enzimas baseia-se em um total de 0,4 mg deproteína/8,00 gramas de substrato. Para testar um efeito sinergístico de duasenzimas combinadas, 0,2 mg de cada enzima foi adicionado a 8 grama desubstrato. Com referência à quantidade de proteína a uma atividadeenzimática, um ensaio padrão de atividade enzimática pode ser aplicado, nestecaso o ensaio de LU como descrito acima (atividade da lipase sobre atributirina). As seguintes preparações enzimáticas foram testadas:

1. Lipase de T. Ianuginosus (TLL, atividade específica 7000 LU/mgde proteína)

2. Lipase B de C. antarctica (CALB, atividade específica 500 LU/mgde proteína)

3. Cutinase de H. insolens (cutinase, atividade específica 1800 LU/mgde proteína)

Dose de enzima e volumes adicionais de água paraexperiências com enzimas únicas:

1. TLL: 0,700 ml de uma solução de enzimas de 4000 LU/ml + 3,30ml de água2. CALB: 1,680 de uma solução de enzima de 119 LU/ml + 2,32 mlde água

3. Cutinase: 0,450 ml de uma solução de enzima de 1600 LU/ml +-3,55 ml de água

Dose de enzima e volumes adicionais de água paraexperiências com combinação de enzimas:

1. TLL + CALB: (0,350 ml de uma solução de 4000 LU/ml de TLL +0,840 ml de uma solução de 119 LU/ml de CALB + 2,810 ml deágua)

2. Cutinase + CALB: (0,225 ml de uma solução de 1600 LU/ml decutinase + 0,840 ml de uma solução de 119 LU/ml de CALB +2,935 ml de água).

EXEMPLOS

EXEMPLO 1. Preparação dos Alquil ésteres de ácidos graxos deTriglicerídeos

Óleo de soja refinado, branqueado e desodorizado (RBD SBO,óleo de salada) foi usado como substrato de acordo com o método geraldescrito acima. As conversões (%) dos resíduos de ácidos graxos em FAMEapós o tempo de reação de 3 horas com o uso de diferentes enzimaslipolíticas, são apresentadas na Tabela 1, enquanto a conversão (%) obtidacom uma combinação de CALB e TLL é mostrada na Tabela 2. O Coeficientede Variação em% (% de CV) de quatro experiências idênticas foi determinadocomo sendo de 2,2%.

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TABELA 1. Enzimas Únicas,% de Conversão dos Resíduos de ÁcidosGraxos em FAME

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TABELA 2. Combinação de Enzimas,% de Conversão Dos Resíduos deÁcidos Graxos em FAMEEXEMPLO 2. Preparação de Alquil ésteres de ácidos graxos do Acido OléicoÁcido oléico foi usado como substrato de acordo com ométodo geral descrito acima. As conversões (%) dos resíduos de ácidosgraxos em FAME, após o tempo de reação de 3 horas com o uso de diferentesenzimas lipolíticas, são apresentadas na Tabela 3.

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TABELA 3. Enzimas Únicas,% de Conversão dos Resíduos de ÁcidosGraxos em FAME

EXEMPLO 3. Preparação dos Alquil ésteres de ácidos graxos deTriglicerídeo Contendo Ácidos Graxos Livres

Uma mistura de 20% p/p de ácido oléico em RBD SBO foiusada como substrato de acordo com o método geral descrito acima. Asconversões (%) de resíduos de ácidos graxos em FAME após o tempo dereação de 3 horas com o uso de diferentes enzimas lipolíticas e combinaçõesdas referidas enzimas, são apresentadas nas Tabelas 4 e 5.

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TABELA 4. Enzimas Únicas,% de Conversão dos Resíduos de ÁcidosGraxos em FAME

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TABELA 5. Combinação de Enzimas,% de Conversão dos Resíduos deÁcidos Graxos em FAME

Claims

1. Método para produzir alquil ésteres de ácidos graxos,caracterizado pelo fato de que uma mistura de reação é produzida mediante ocontato de uma solução compreendendo um substrato e um álcool, substratoeste que compreende triglicerídeo, com uma primeira enzima lipolitica tendouma relação da atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFAabaixo de 0,2, e uma segunda enzima lipolitica tendo uma relação daatividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFA acima de 0,5.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o substrato ainda compreende ácidos Vaxos livres,preferivelmente na faixa de 0,01 a 95% em peso de ácidos graxos livres.

3. Método de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de que o triglicerídeo é derivado de uma ou maiscargas de alimentação de óleos vegetais, óleo de colza, óleo.de soja, óleo demostarda, óleo de girassol, óleo de canola, óleo de coco, óleo de cânhamo,óleo de palma, talóleo, gorduras animais incluindo sebo, gordura, óleo de avesdomésticas e de peixes.

4. Método de acordo com as reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato de que a relação molar entre o álcool e os resíduos deácidos graxos é de no mínimo 0,1 e de no máximo 10, preferivelmente nafaixa de 0,3 a 5, mais preferível de 0,4 a 2.

5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato de que o álcool é metanol ou etanol.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a mistura de reação aindacompreende água, preferível até 50% (p/p).

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira enzima lipolitica temuma relação da atividade sobre o triglicerídeo para a atividade sobre FFA nafaixa de 0,5 a 20.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a primeira enzima lipolítica é 60%idêntica a uma enzima lipolítica selecionada do grupo consistindo de Lipase Bda Candida antarctica, lipase da Hyphozyma sp. e lipase da Candidaparapsilosis.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de que a primeira enzima lipolítica é Lipase B da Candida antarctica,lipase da Hyphozyma sp. e lipase da Candida parapsilosis.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que a segunda enzima lipolítica é 60%idêntica a uma enzima lipolítica selecionada do grupo consistindo de lipase deT. lanuginosus, cutinase de H. insolens, lipase A de C. antarctica, lipases daCandida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotricum candidum, Rhizomucormiehei, Crytococcus spp. S-2, Candidaparapsilosis e Humicola lanuginosus.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a segunda enzima lipolítica é uma dentre a lipase de T.lanuginosus, cutinase de H. insolens, lipase A de C. antarctica, lipases daCandida rugosa, Pseudomonas cepacia, Geotricum candidum, Rhizomucormiehei, Crytococcus spp. S-2, Candidaparapsilosis e Humicola lanuginosus.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o processo ocorre em um modo debatelada.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o processo ocorre em um modocontínuo.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que as fases da solução na mistura dereação são misturadas com o uso de um misturador de alto cisalhamento.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que o processo é conduzido em ummodo de contra-corrente.