ES2068586T5 - Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa. - Google Patents

Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.

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Abstract

SE PUEDE EMPLEAR UNA PREPARACION DE CELULASA FORMADA ESENCIALMENTE POR UN COMPONENTE DE ENDOGLUCANASA HOMOGENEO QUE ES INMUNORREACTIVO CON UN ANTICUERPO CRIADO CONTRA UNA SIMILAR43KD ENDOGLUCANASA ALTAMENTE PURIFICADA DERIVADA DEL HUMICOLA INSOLENS, DSM 1800, O QUE ES HOMOGENEO RESPECTO A DICHA SIMILAR43KD ENDOGLUCANASA, EN EL TRATAMIENTO DE TEJIDOS QUE CONTIENEN CELULOSA PARA LA REDUCCION DE LA ASPEREZA O LA CLARIFICACION DEL COLOR O PARA PROPORCIONAR UNA VARIACION LOCALIZADA EN EL COLOR DE DICHOS TEJIDOS, O SE PUEDE EMPLEAR EN EL TRATAMIENTO DE PASTA DE PAPEL.

Description

Una preparación de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.
La presente invención se refiere a una preparación de celulasa que comprende una endoglucanasa de un solo componente, a un aditivo detergente que comprende la preparación de celulasa, a una composición detergente que contiene la preparación de celulasa, así como a métodos para tratar telas que contienen celulosa con la preparación de celulasa.
Fundamento del invento
Es bien conocido en la técnica que el lavado repetido de telas que contienen algodón causa generalmente una acusada aspereza desagradable en la tela, y se han sugerido previamente en la técnica diversos métodos para superar este problema. Por ejemplo, el Documento GB 1.368.599 de Unilever Ltd. enseña el uso de enzimas celulolíticas para reducir la aspereza de telas que contienen algodón. Además, el Documento US 4.435.307 (de Novo Industri A/S) enseña el uso de una enzima celulolítica procedente de Humicola insolens así como una fracción de la misma, denominada AC_{x}I, como un aditivo detergente que reduce la aspereza. Otros usos de las enzimas celulolíticas mencionadas en la técnica implican la eliminación de la suciedad y la clarificación de colores de la tela (véase, por ejemplo, el Documento EP 220.016), proporcionando una absorción creciente de agua (Documento JP-B-52-48236) y proporcionando una variación localizada del color para dar a las telas tratadas un aspecto de "lavado a la piedra" (Documento EP 307.564). Además, las enzimas celulolíticas pueden ser utilizadas en la industria cervecera para la degradación de \beta-glucanos, en la industria panadera para mejorar las propiedades de la harina, en el procesamiento de pasta de papel para eliminar las partes no cristalinas de la celulosa, aumentando de ese modo la proporción de celulosa cristalina en la pasta, y para mejorar las propiedades de drenaje de la pasta, y en los piensos de animales para mejorar la digestibilidad de los glucanos.
La explotación práctica de las enzimas celulolíticas ha sido frenada en cierto grado por la naturaleza de las preparaciones conocidas de celulasa, las cuales son frecuentemente mezclas complejas. Es difícil optimizar la producción de sistemas enzimáticos múltiples y, por consiguiente, llevar a cabo la producción industrial de enzimas celulolíticas de una forma económicamente eficaz, y su uso real ha sido obstaculizado por las dificultades que surgen de la necesidad de aplicar cantidades bastante grandes de las enzimas celulolíticas para conseguir el efecto deseado sobre las telas celulósicas.
Los inconvenientes de las preparaciones de celulasa previamente sugeridas pueden ser remediados utilizando preparaciones que comprendan una mayor cantidad de endoglucanasas. En el Documento WO 89/00069 se describe una preparación de celulasa enriquecida en actividad endoglucanasa.
Sumario del invento
Se ha aislado ahora un único componente de endoglucanasa que muestra unos niveles de actividad favorables con respecto a materiales que contienen celulosa.
En consecuencia, el presente invento se refiere a una preparación de celulasa que consiste esencialmente en una enzima homogénea que exhibe actividad endoglucanasa, enzima que tiene la secuencia de aminoácidos ID nº 2 o ID nº 4 mostrada en la Lista de Secuencias adjunta o que es un derivado de cualquiera de ellas.
El hallazgo de que este particular componente de endoglucanasa de la celulasa es ventajoso para el tratamiento de materiales que contienen celulosa tiene un considerable significado práctico: permite una producción económicamente eficaz de la celulasa, por ejemplo, empleando técnicas de ADN recombinante para producir el componente activo, y hace posible la aplicación real y eficaz de la enzima ya que se solicita una cantidad menor de la preparación de celulasa para producir el efecto deseado sobre los materiales celulósicos.
Descripción detallada del invento
La preparación de celulasa del invento es ventajosamente una en que el componente de endoglucanasa muestra una actividad CMC-endoasa de al menos aproximadamente 50 unidades de CMC-endoasa por mg de proteína total.
En el presente contexto, la expresión "actividad CMC-endoasa" se refiere a la actividad endoglucanasa del componente de endoglucanasa en términos de su capacidad para degradar celulosa a glucosa, celobiosa y triosa, según se determina por una disminución de la viscosidad de una disolución de carboximetilcelulosa (CMC) después de la incubación con la preparación de celulasa del invento, como se describe con detalle más adelante.
Las preparaciones de celulasa preferidas del invento son aquéllas en que el componente de endoglucanasa muestra una actividad CMC-endoasa de al menos aproximadamente 60, en particular de al menos aproximadamente 90, unidades de CMC-endoasa por mg de proteína total. En particular, un componente de endoglucanasa preferido muestra una actividad CMC-endoasa de al menos 100 unidades de CMC-endoasa por mg de proteína total.
La actividad CMC-endoasa (endoglucanasa) puede ser determinada a partir de la disminución de la viscosidad de la CMC, del modo siguiente:
Se prepara una disolución de sustrato que contiene 35 g/l de CMC (Hercules 7 LFD) en tampón Tris 0,1 M a pH 9,0. La muestra de enzima que se va a analizar se disuelve en el mismo tampón.
10 ml de la disolución de sustrato y 0,5 ml de la disolución de enzima son mezclados y transferidos a un viscosímetro (por ejemplo, Haake VT 181, sensor NV, 181 rpm) termostatizado a 40ºC.
Se toman lecturas de viscosidad lo más pronto posible después del mezclamiento y de nuevo 30 minutos más tarde. La cantidad de enzima que reduce la viscosidad a la mitad bajo estas condiciones es definida como 1 unidad de actividad CMC-endoasa.
Se utilizaron la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE; del inglés, SDS polyacrylamide gel electrophoresis) y el enfoque isoeléctrico con proteínas marcadoras, de un modo conocido por las personas expertas en la técnica, para determinar el peso molecular y el punto isoeléctrico (pI), respectivamente, del componente de endoglucanasa de la preparación de celulasa del invento. De este modo, se determinó que el peso molecular de un componente de endoglucanasa específico era 43 kD. Se determinó que el punto isoeléctrico de esta endoglucanasa era aproximadamente 5,1. La caracterización inmunoquímica de la endoglucanasa fue llevada sustancialmente a cabo del modo descrito en el Documento WO 89/00069, estableciéndose que la endoglucanasa es inmunorreactiva con un anticuerpo producido frente a una endoglucanasa sumamente purificada de \sim 43 kD, procedente de Humicola insolens DSM 1800. La actividad celobiohidrolasa puede ser definida como la actividad hacia p-nitrofenil-celobiosa. La actividad es determinada como \mumoles de nitrofenilo liberados por minuto a 37ºC y pH 7,0. Se halló que el componente de endoglucanasa presente no tenía esencialmente ninguna actividad celobiohidrolasa.
El componente de endoglucanasa de la preparación de celulasa del invento ha sido inicialmente aislado mediante extensos procedimientos de purificación que incluyen, entre otros, la purificación de una mezcla cruda de celulasa de H. insolens mediante HPLC en fase inversa, de acuerdo con el Documento US 4.435.307 (véase el Ejemplo 1 posterior). Este procedimiento ha dado sorprendentemente lugar al aislamiento de una endoglucanasa de \sim 43 kD como un único componente con una propiedades inesperadamente favorables a causa de una actividad endoglucanasa sorprendentemente elevada.
En otro aspecto, el presente invento se refiere a una enzima que muestra actividad endoglucanasa (denominado a continuación un "enzima endoglucanasa"), enzima que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la ID nº 2 de la Lista de Secuencias adjunta, o a un compuesto homólogo de la misma que muestra actividad endoglucanasa. En el contexto presente, con la expresión "compuesto homólogo" se quiere indicar un polipéptido codificado por un ADN que hibrida a la misma sonda que el ADN que codifica para la enzima endoglucanasa con esta secuencia de aminoácidos, bajo ciertas condiciones específicas (tales como prerremojo en SSC 5x y prehibrización durante 1 hora a \sim 40ºC en una disolución de formamida al 20%, disolución de Denhardt 5x, fosfato sódico 50 mM, pH 6,8, y 50 \mug de ADN desnaturalizado y sonicado de timo de ternera, seguido de hibridación durante 18 h a \sim 40ºC en la misma disolución, complementada con ATP 100 \muM). Con la expresión se quiere incluir derivados de la susodicha secuencia obtenidos por adición de uno o más restos de aminoácido al C-terminal o al N-terminal, o a ambos, de la secuencia nativa, por sustitución de uno o más restos de aminoácido en uno o más puntos de la secuencia nativa, por deleción de uno o más restos de aminoácido en cualquier extremo, o en ambos extremos, de la secuencia de aminoácidos nativa o en uno o más puntos dentro de la secuencia nativa, o por inserción de uno o más restos de aminoácido en uno o más puntos de la secuencia nativa.
La enzima endoglucanasa del invento puede ser una producible por especies de Humicola tales como Humicola insolens; por ejemplo: la cepa DSM 1800, depositada el 1 de octubre de 1.981 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, República Federal Alemana, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Fines del Procedimiento de Patentes (el Tratado de Budapest).
Alternativamente, la enzima endoglucanasa puede ser una producible por una especie de Fusarium, tal como Fusarium oxysporum; por ejemplo: la cepa DSM 2672, depositada el 6 de junio de 1.983 en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Mascheroder Weg 1B, D-3300 Braunschweig, República Federal Alemana, de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Además, se prevé que las endoglucanasas homólogas puedan proceder de otros microorganismos que producen enzimas celulolíticas; por ejemplo, especies Trichoderma, Myceliophthora, Phanerochaete, Schizophyllum, Penicillium, Aspergillus y Geotricum.
El presente invento se refiere además a una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima endoglucanasa como la anteriormente descrita, o una forma precursora de la enzima. En particular, la construcción de ADN tiene una secuencia de ADN como la mostrada en la ID nº 1 o ID nº 3 de la Lista de Secuencias adjunta, o una modificación de las mismas. Ejemplos de modificaciones adecuadas de la secuencia de ADN son las sustituciones nucleotídicas que no dan lugar a otra secuencia de aminoácidos de la endoglucanasa pero que corresponden a la utilización de codón del organismo huésped en el que se introduce la construcción de ADN, o las sustituciones nucleotídicas que dan lugar a una secuencia de aminoácidos diferente y, por lo tanto, posiblemente, a una estructura proteínica diferente que podría dar lugar a un mutante de endoglucanasa con propiedades diferentes a las de la enzima nativa. Otros ejemplos de posibles modificaciones son la inserción de uno o más nucleótidos en la secuencia, la adición de uno o más nucleótidos en cualquier extremo de la secuencia, o la deleción de uno o más nucleótidos en cualquier extremo o dentro de la secuencia.
La construcción de ADN del invento que codifica la enzima endoglucanasa puede ser preparada sintéticamente mediante métodos estándares establecidos; por ejemplo, el método de la fosfoamidita descrito por S. L. Beaucage y M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1.981, páginas 1.859-1.869, o el método descrito por Matthes et al., EMBO Journal 3, 1.984, páginas 801-805. De acuerdo con el método de la fosfoamidita, los oligonucleótidos son sintetizados, por ejemplo, en un sintetizador automático de ADN, purificados, sometidos a hibridación de extremos complementarios, ligados y clonados en vectores adecuados.
Una construcción de ADN que codifique la enzima endoglucanasa o un precursor de la misma puede ser aislada, por ejemplo, estableciendo una genoteca de ADNc o genómica de un microorganismo productor de celulasa, tal como Humicola insolens DSM 1800, y explorando clones positivos mediante procedimientos convencionales tales como la hibridación utilizando sondas de oligonucleótidos sintetizadas sobre la base de la secuencia total o parcial de aminoácidos de la endoglucanasa, de acuerdo con técnicas estándares [véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio), 2ª edición, Cold Spring Harbor, 1.989], o seleccionando los clones que expresan la actividad enzimática apropiada (es decir, la actividad CMC-endoasa como se definió anteriormente), o seleccionando los clones que producen una proteína que es reactiva con un anticuerpo contra una celulasa nativa (endoglucanasa).
Finalmente, la construcción de ADN puede ser de origen mixto sintético y genómico, mixto sintético y de ADNc o mixto genómico y de ADNc, preparada ligando fragmentos de origen sintético, genómico o de ADNc (según sea apropiado), correspondiendo los fragmentos a diversas partes de la construcción entera de ADN, de acuerdo con técnicas estándares. La construcción de ADN puede ser también preparada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction) utilizando cebadores específicos, como se describe, por ejemplo, en el Documento US 4.683.202 o como describen R. K. Saiki et al. en Science 239, 1.988, páginas 487-491.
El invento se refiere además a un vector de expresión recombinante en el que se inserta la construcción de ADN del invento. Aquél puede ser cualquier vector que pueda ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente de la célula huésped en la que vaya a ser introducido. Por consiguiente, el vector puede ser un vector que se replique autónomamente, es decir, un vector que exista como una entidad extracromosómica, la replicación del cual sería independiente de la replicación cromosómica; por ejemplo, un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando sea introducido en una célula huésped, se integre en el genoma de la célula huésped y se replique conjuntamente con el(los) cromosoma(s) en que se ha integrado.
En el vector, la secuencia de ADN que codifica la endoglucanasa debería estar funcionalmente conectada a una secuencia de activador y terminador adecuada. El activador puede ser cualquier secuencia de ADN que muestre actividad de transcripción en la célula huésped de elección, y puede proceder de genes que codifiquen proteínas homólogas o heterólogas con respecto a la célula huésped. Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican para la endoglucanasa, el activador y el terminador, respectivamente, y para insertarlas en vectores adecuados son bien conocidos por las personas expertas en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al, op. cit.).
El invento se refiere también a una célula huésped que es transformada con la construcción de ADN o el vector de expresión del invento. La célula huésped puede pertenecer, por ejemplo, a una especie de Aspergillus, muy preferiblemente Aspergillus oryzae o Aspergillus niger. Las células fúngicas pueden ser transformadas mediante un procedimiento que implique formación protoplástica y transformación de los protoplastos seguida de regeneración de la pared celular de un modo per se conocido. El uso de Aspergillus como un microorganismo huésped es descrito en el Documento EP 238.023 (de Novo Industri A/S), el contenido del cual es incorporado aquí por referencia. La célula huésped puede ser también una célula de levadura; por ejemplo, una cepa de Saccharomyces cerevisiae.
Alternativamente, el organismo huésped puede ser una bacteria, en particular cepas de Streptomyces y Bacillus, y E. coli. La transformación de células bacterianas puede ser llevada a cabo de acuerdo con métodos convencionales, como describen, por ejemplo, Sambrook et al. en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1.989.
El presente invento se refiere además a un procedimiento para producir una enzima endoglucanasa del invento, procedimiento que comprende cultivar una célula huésped como la anteriormente descrita en un medio de cultivo adecuado bajo condiciones que permitan la expresión de la enzima endoglucanasa, y recuperar del cultivo la enzima endoglucanasa. El medio utilizado para cultivar las células huésped transformadas puede ser cualquier medio convencional adecuado para hacer crecer las células huésped en cuestión. La endoglucanasa expresada puede ser convenientemente secretada en el medio de cultivo y puede ser recuperada del mismo mediante procedimientos bien conocidos que incluyen separar las células del medio mediante centrifugación o filtración, y precipitar los componentes proteicos del medio mediante una sal tal como el sulfato amónico, seguidos de procedimientos cromatográficos tales como cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad y similares.
Empleando técnicas de ADN recombinante como las anteriormente indicadas, técnicas de purificación de proteínas, técnicas de fermentación y mutación u otras técnicas que son bien conocidas en la técnica, es posible proporcionar endoglucanasas de una elevada pureza.
La preparación de celulasa del invento puede ser convenientemente añadida a telas que contengan celulosa, junto con otros materiales detergentes durante las operaciones de remojo, lavado o aclarado. En consecuencia, en otro aspecto, el invento se refiere a un aditivo detergente que comprende la preparación de celulasa del invento. El aditivo detergente puede estar adecuadamente en forma de un producto granular que no deja polvo, un líquido estabilizado o una enzima protegida. Los productos granulares que no dejan polvo pueden ser producidos, por ejemplo, de acuerdo con los Documentos US 4.106.991 y 4.661.452 (ambos de Novo Industri A/S) y pueden ser opcionalmente revestidos mediante métodos conocidos en la técnica. Las preparaciones enzimáticas líquidas pueden ser estabilizadas, por ejemplo, mediante la adición de un poliol tal como propilenglicol, un azúcar o azúcar-alcohol, ácido láctico o ácido bórico de acuerdo con métodos establecidos. En la técnica se conocen bien otros agentes estabilizadores de enzimas. Pueden prepararse enzimas protegidas, de acuerdo con el método descrito en el Documento EP 238.216.
El aditivo detergente puede contener adecuadamente 1-500, preferiblemente 5-250, y muy preferiblemente 10-100 mg de proteína enzimática por gramo del aditivo. Se entenderá que el aditivo detergente puede incluir además una o más de otras enzimas, tales como una proteasa, lipasa, peroxidasa o amilasa, convencionalmente incluidas en aditivos detergentes.
De acuerdo con el invento, se ha hallado que cuando la proteasa es una que tiene un mayor grado de especificidad que la serina-proteasa de Bacillus lentus, se obtiene una estabilidad aumentada de la enzima endoglucanasa en almacenamiento (para el fin presente, una proteasa con un mayor grado de especificidad que la serina-proteasa de B. lentus es una que degrada la insulina humana hasta menos componentes que lo hace la serina-proteasa de B. lentus bajo las condiciones siguientes: se incuban 0,5 ml de una disolución de 1 mg/ml de insulina humana en tampón B y R, pH 9,5, con 75 \mul de una disolución enzimática de 0,6 CPU [véase Novo Nordisk Analysis Methods (Métodos de análisis de Novo Nordisk) nº AF 228/1] por litro, durante 120 minutos a 37ºC, y se sofoca la reacción con 50 \mul de HCl 1 N). Ejemplos de dichas proteasas son la subtilisina Novo o una variante de la misma (por ejemplo, una variante descrita en el Documento US 4.914.031), una proteasa obtenible de Nocardia dassonvillei NRRL 18133 (descrita en el Documento WO 88/03947), una serina-proteasa específica para el ácido glutámico y el ácido aspártico, producible por Bacillus licheniformis (esta proteasa es descrita con detalle en la solicitud nº PCT/DK91/00067 de patente internacional en tramitación junto con la presente), o una proteasa semejante a tripsina, producible por Fusarium sp. DSM 2672 (esta proteasa es descrita con detalle en el Documento WO 89/06270).
En aún otro aspecto, el invento se refiere a una composición detergente que comprende la preparación de celulasa del invento.
Las composiciones detergentes del invento comprenden adicionalmente agentes tensioactivos que pueden ser del tipo aniónico, no iónico, catiónico, anfótero o iónico dipolar, así como mezclas de estas clases de agentes tensioactivos. Los alquil lineal-bencenosulfonatos (LAS; del inglés, linear alkyl benzene sulfonates), los alfa-olefinasulfonatos (AOS), los alcohol-etoxisulfatos (AES) y las sales alcalinas de ácidos grasos naturales son ejemplos típicos de agentes tensioactivos aniónicos. Sin embargo, se ha observado que la endoglucanasa es menos estable en presencia de detergentes aniónicos y que, por otra parte, es más estable en presencia de detergentes no iónicos o de ciertos compuestos polímeros tales como polivinilpirrolidona, polietilenglicol o poli(alcohol vinílico). En consecuencia, la composición detergente puede contener una baja concentración de detergente aniónico y/o una cierta cantidad de detergente no iónico o polímero estabilizador como los anteriormente indicados.
Las composiciones detergentes del invento pueden contener otros ingredientes detergentes conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, agentes mejoradores de la detergencia, agentes blanqueadores, agentes activadores del blanqueo, agentes anticorrosión, agentes secuestradores, agentes antirredepósito de la suciedad, perfumes, agentes estabilizadores de enzimas, etc.
La composición detergente del invento puede ser formulada de cualquier forma conveniente; por ejemplo, como un polvo o un líquido. La enzima puede ser estabilizada en un detergente líquido mediante la inclusión de agentes estabilizadores de enzimas como los anteriormente indicados. Normalmente, el pH de una disolución de la composición detergente del invento será 7-12 y, en algunos casos, 7,0-10,5. En las composiciones detergentes del invento pueden incluirse otras enzimas detergentes tales como proteasas, lipasas o amilasas, ya sea separadamente o ya sea en un aditivo combinado como se describió anteriormente.
Los efectos de suavización, eliminación de suciedad y clarificación de colores, obtenibles por medio de la preparación de celulasa del invento, requieren generalmente una concentración de la preparación de celulasa en la disolución de lavado de 0,0001-100, preferiblemente de 0,0005-60, y muy preferiblemente de 0,01-20 mg de proteína enzimática por litro. La composición detergente del invento es típicamente empleada en concentraciones de 0,5-20 g/l en la disolución de lavado. En general, es muy conveniente añadir el aditivo detergente en cantidades del 0,1-5% en peso/peso o, preferiblemente, en cantidades del 0,2-2% de la composición detergente.
En aún un aspecto más, el presente invento se refiere a un método para reducir la velocidad a la que se vuelven ásperas las telas que contienen celulosa, o para reducir la aspereza de las telas que contienen celulosa, método que comprende tratar las telas que contienen celulosa con una preparación de celulasa como las anteriormente descritas. El presente invento se refiere además a un método que proporciona clarificación de colores a las telas que contienen celulosa coloreada, método que comprende tratar las telas que contienen celulosa coloreada, con una preparación de celulasa, y a un método para proporcionar una variación localizada en el color de las telas que contienen celulosa coloreada, método que comprende tratar las telas que contienen celulosa coloreada con una preparación de celulasa del invento. Los métodos del invento pueden ser llevados a cabo tratando durante el lavado las telas que contienen celulosa. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de las telas puede ser llevado también a cabo durante el remojo o el aclarado, o simplemente añadiendo la preparación de celulasa al agua en la cual se sumergen o sumergirán las telas.
De acuerdo con el invento, se ha hallado que las propiedades de drenaje de la pasta de papel pueden ser significativamente mejoradas mediante el tratamiento con la preparación de endoglucanasa del invento sin ninguna significativa pérdida concurrente de resistencia. En consecuencia, el presente invento se refiere además a un método para mejorar las propiedades de drenaje de la pasta, método que comprende tratar la pasta de papel con una preparación de celulasa de acuerdo con el invento. La pasta de papel de desecho, la pasta de cartón reciclado, la pasta kraft, la pasta al sulfito, la pasta termomecánica y otras pastas de alto rendimiento son ejemplos de pastas que pueden ser tratadas mediante este método.
El presente invento es descrito con mayor detalle en los ejemplos siguientes con referencia a las realizaciones actualmente preferidas, ejemplos con los que no se pretende limitar en modo alguno el alcance del invento.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento de una endoglucanasa de \sim 43 kD, procedente de Humicola insolens 1. Preparación de un anticuerpo de conejo, reactivo con una endoglucanasa de \sim 43 kD purificada a partir de una mezcla de celulasa de Humicola insolens
Se produjo celulasa cultivando Humicola insolens DSM 1800 como se describe en el Documento US 4.435.307, Ejemplo 6. La celulasa cruda fue recuperada del caldo de cultivo por filtración a través de tierra de diatomeas, ultrafiltración y liofilización del producto retenido; véanse los Ejemplos 1 y 6 del Documento US 4.435.307.
La celulasa cruda fue purificada del modo descrito en el Documento WO 89/09259, obteniéndose la fracción F1P1C2 que fue utilizada para la inmunización de ratones. La inmunización fue llevada a cabo 5 veces en intervalos bisemanales, utilizándose cada vez 25 \mug de proteína que incluían Adyuvante de Freund.
Se establecieron líneas celulares de hibridoma del modo descrito por Ed Harlow y David Lane en Antibodies. A Laboratory Manual (Anticuerpos. Un manual de laboratorio), Cold Spring Harbor Laboratory 1.988. El procedimiento puede ser brevemente descrito del modo siguiente:
Después de sangrar al ratón y mostrar que el suero del mismo reacciona con proteínas presentes en la fracción F1P1C2, el bazo fue extraído y homogeneizado y luego mezclado con PEG y células de mieloma Fox-river, de Hyclone, Utah, EE.UU.
Los hibridomas fueron seleccionados de acuerdo con el procedimiento establecido de exploración HAT.
Se estabilizaron las líneas celulares de hibridoma reclonadas. Los anticuerpos producidos por estas líneas celulares fueron explorados y seleccionados por su pertenencia a la subclase IgG1 utilizando un sistema monoclonal de ratón para determinar el tipo, de Serotec, Oxford, Inglaterra. Los anticuerpos positivos fueron luego explorados en cuanto a su reactividad con F1P1C2 en un ELISA convencional, lo que dio lugar a la selección de las fracciones F4, F15 y F41 ya que todas eran muy buenas en la respuesta en ELISA, pero se halló que tenían una respuesta diferente en inmunotransferencia utilizando celulasa cruda de H. insolens DSM 1800, en SDS-PAGE seguida de transferencia Western, lo que indicaba que reconocían diferentes epítopes.
Los tres anticuerpos fueron producidos en grandes cantidades en el fluido ascítico de ratones CRBF_{1}. La gamma-globulina de ratón fue purificada del fluido ascítico mediante purificación con proteína A, utilizando proteína A copulada a Sefarosa (Kem. En. Tek., Copenhague, Dinamarca).
Las diferentes gammaglobulinas monoclonales fueron probadas en cuanto a su respuesta en un ELISA sándwich utilizando cada anticuerpo monoclonal como anticuerpo de retención, diversas fracciones de Celluzyme por HPLC como antígeno, y un anticuerpo de conejo, producido frente a endoglucanasa B de Celluzyme, como anticuerpo de detección.
Para visualizar la fijación en el ELISA, se empleó un anticuerpo porcino contra IgG de ratón, covalentemente copulado a peroxidasa, de Dakopatts (Copenhague, Dinamarca), y se realizó la visualización con dihidrocloruro de 1,2-fenilendiamina/H_{2}O_{2} (OPD/H_{2}O_{2}; del inglés, 1,2-phenylenediamine, dihydrochloride/H_{2}O_{2}).
La mayor respuesta en ELISA fue obtenida con el anticuerpo monoclonal F41, el cual, por lo tanto, fue utilizado en las operaciones de purificación por inmunoafinidad.
La gammaglobulina F41 de ratón purificada fue copulada a 43 g de Sefarosa 4B activada con CNBr, como es descrito por el fabricante (Pharmacia, Suecia), lo que fue seguido de lavado.
2. Purificación por inmunoafinidad, de la endoglucanasa de \sim 43 kD procedente de una mezcla de celulasa de H. insolens
Se diluyó una mezcla de celulasa de H. insolens (como la anteriormente descrita) hasta un 3% de materia seca, y se ajustó el pH a 3,5 en 15 minutos a 4ºC. El precipitado fue separado por filtración después de ser ajustado el pH a 7,5. Luego se añadió sulfato sódico para precipitar la enzima activa y esto se hizo a 40ºC (260 gramos por kg a pH 5,5). El precipitado fue solubilizado con agua y filtrado. Se repitió el tratamiento ácido. Finalmente, el producto fue filtrado y concentrado por ultrafiltración utilizando una membrana de poli(sulfonato de vinilo) con un corte de exclusión de peso molecular 10.000.
Luego se diluyó el producto de celulasa hasta un 3% de materia seca, se ajustó el pH a 9,0, y se sometió el producto a cromatografía de interccambio aniónico en una column de DEAE-Sefarosa, del modo recomendado por el fabricante (Pharmacia, Suecia).
El producto de celulasa exento de proteasa fue aplicado a la columna anteriormente descrita de gammaglobulina F41 copulada a Sefarosa, a pH 8,0 en tampón de fosfato sódico.
Después de la aplicación, la columna fue lavada con el mismo tampón, que contenía cloruro sódico 0,5 M. La columna fue luego lavada con tampón de acetato sódico 0,1 M que contenía cloruro sódico 0,5 M, pH 4,5, después de lo cual la columna fue lavada en tampón de acetato sódico 5 mM, pH 4,5. Finalmente, la endoglucanasa de \sim 43 kD fue eluida con ácido cítrico 0,1 M.
Producción total: 25 mg con una actividad endoglucanasa de 1.563 unidades de CMC-endoasa.
La proteína eluida migra como una sola banda en SDS-PAGE, con un peso molecular aparente de \sim 43 kD y un pI de aproximadamente 5,0 a 5,2 después de enfoque isoeléctrico.
La proteína inactiva fue eliminada mediante purificación en fase inversa.
Las proteínas inactiva y activa fueron separadas por HPLC utilizando un gradiente de 2-propanol. La proteína inactiva es eluida con 2-propanol a aproximadamente el 25% y la endoglucanasa activa de \sim 43 kD es eluida con 2-propanol al 30%, siendo detectable la endoglucanasa activa por una zona de aclaramiento en CMC-Rojo Congo.
De este modo, se recuperó un total de 0,78 mg de proteína activa con 122 unidades de CMC-endoasa. Este procedimiento se repitió 30 veces.
La endoglucanasa de \sim 43 kD fue recuperada liofilizando primero para eliminar el TFA y el propanol y solubilizando después en tampón de fosfato.
La actividad endoglucanasa del material purificado fue 156 unidades de CMC-endoasa por mg de proteína, y el rendimiento total incluyendo la liofilización fue el 65% de la actividad endoglucanasa.
La enzima de \sim 43 kD así obtenido fue utilizada para inmunizar conejos de acuerdo con el procedimiento descrito por N. Axelsen et al. en A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis (Un manual de inmunoelectroforesis cuantitativa), Blackwell Scientific Publications, 1.973, capítulo 23. Las inmunoglobulinas purificadas fueron recuperadas del antisuero mediante precipitación con sulfato amónico seguida de diálisis y cromatografía de intercambio iónico en DEAE-Sephadex de un modo per se conocido. Se determinó la fijación de inmunoglobulina purificada a la endoglucanasa, y se seleccionó la inmunoglobulina AS 169 de conejo para posteriores estudios.
3. Caracterización de la endoglucanasa de \sim 43 kD
Composición en aminoácidos: utilizando hidrólisis total, se obtuvo la composición siguiente después del análisis de aminoácidos:
Asp 17
Asn 15
Thr 25
Ser 29
Glu 6
Gln 13
Pro 21
Gly 32
Ala 23
Cys 20
Val 14
Met 1
Ile 7
Leu 8
Tyr 6
Phe 15
Lys 9
His 2
Trp 9
Arg 12
Basándose en la composición en aminoácidos, se estimó que el peso molecular de la proteína no glicosilada era 30.069. Se midió la glicosilación, que era:
Galactosa 10
Manosa 28
lo que correspondía a un peso molecular de 6.840, lo que daba lugar a un peso molecular total de la endoglucanasa de 36.900 (+/- 2.400). Se estimó que el coeficiente de extinción por mol era el siguiente:
Triptófano 9 veces 5.690
Tirosina 6 veces 1.280
Cisteínas 20 veces 120
Total 61.290 por mol
El coeficiente de extinción correspondiente a 1 mg de proteína por ml es 1,66 a 280 nm [Referencia: S. C. Gill y P. Hippel, Anal. Biochemistry 182, 312-326 (1.989)].
La secuencia de aminoácidos fue determinada en un secuenciador de proteínas, 475A de Applied Biosystems, utilizando la degradación de Edman. Sólo una secuencia indicó la pureza de la proteína. La secuencia de aminoácidos se muestra en la ID nº 2 de la Lista de Secuencias adjunta.
Propiedades de la enzima
La enzima es estable a un pH de entre 3 y 9,5.
La enzima no degrada la celulosa sumamente cristalina ni el sustrato \beta-p-nitrofenil-celobiosa (sustrato de la celobiohidrolasa), pero degrada la celulosa amorfa principalmente en celobiosa, celotriosa y celotetraosa, lo que indica que la enzima puede ser utilizada para producir celodextrinas a partir de celulosa amorfa insoluble.
La enzima es activa a un pH de entre 6,0 y 10,0, con una actividad máxima a aproximadamente 50ºC.
Ejemplo 2 Clonación y expresión de la endoglucanasa de \sim 43 kD en Aspergillus oryzae ADNc parcial
Se preparó una genoteca de ADNc a partir del ARNm de la cepa DSM 1800 de Humicola insolens [Kaplan et al. (1.979), Biochem. J. 183, 181-184] de acuerdo con el método de Okayama y Berg (1.982), Mol. Cell. Biol. 2, 161-170. Esta genoteca fue explorada por hibridación con oligonucleótidos radioactivamente marcados, a filtros con ADN inmovilizado procedente de los recombinantes [Gergen et al. (1.979), Nucleic Acids Res. 7, 2.115-2.136]. Las sondas de oligonucleótidos fueron preparadas sobre la base de las secuencias de aminoácidos de fragmentos trípsicos de la endoglucanasa purificada de \sim 43 kD. Se halló que una colonia se hibridaba a tres sondas diferentes (NOR 1251, 2048 y 2050), y la misma fue aislada. La secuencia mostró que el ADNc insertado de 680 pb codificaba para los 181 aminoácidos C-terminales de la proteína de \sim 43 kD y el ARNm 3' no traducido. Se utilizó un fragmento Pvu I -Xho I de 237 pb de largo, procedente de este clon, para sondear una transferencia Northern (como describe Sambrook et al., op. cit., páginas 7.40-7.42 y páginas 7.46-7.48) con ARNm de H. insolens, y se mostró que el ARNm entero de \sim 43 kD tenía una longitud de aproximadamente 1.100 pb. El mismo fragmento de 237 pb fue utilizado para sondear una genoteca genómica a partir de la misma cepa.
Clon genómico
Se preparó una genoteca genómica de la cepa DSM 1800 de Humicola insolens a partir del ADN total preparado mediante el método de Yelton [M. M. Yelton et al. (1.984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1.470-1.474] y parcialmente digerido con Sau 3A. Los fragmentos mayores de 4 kb fueron aislados de un gel de agarosa y fueron ligados a pBR 322 digerido con BAM H1 y desfosforilado. Los productos de ligación fueron transformados en E. coli MC1000 [Casadaban y Cohen (1.980), J. Mol. Biol., 138, 179-207] hecha r^{-}m^{+} mediante métodos convencionales. Se exploraron 40.000 recombinantes con el fragmento Pvu I -Xho I de ADNc parcial, de 237 pb, descrito en el párrafo "ADNc parcial". Se seleccionaron 2 colonias que contenían la secuencia entera de la endoglucanasa de \sim 43 kD y se secuenció el gen por el método didesoxi utilizando el sistema Sequenase^{R} (United States Biochemical Corporation) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuencia era idéntica a la secuencia del gen del ADNc de longitud total (véase más adelante el párrafo "ADNc de longitud total") excepto por un intrón en el gen genómico.
El gen genómico fue multiplicado mediante el método PCR utilizando un sistema de multiplicación de ADN (DNA Amplification System), Perkin-Elmer/Cetus, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el extremo 5' del gen se utilizó el cebador NOR 2378. Este cebador tiene 25 unidades monómeras que se corresponden con el extremo 5' no traducido del gen excepto por una sustitución C a T que genera un sitio Bcl I. En el extremo 3' del gen se utilizó el cebador NOR 2389. Este cebador tiene 26 unidades monómeras, de las cuales 21 bases se corresponden con la parte 3' no traducida del gen y las 5 bases del extremo 5' del cebador completan un sitio Sal I.
El vector de expresión de Aspergillus, pToC 68, fue construido a partir del plásmido p775 (la construcción del cual se describe en el Documento EP 238 023) por inserción de los siguientes enlazadores
1
La construcción del pToC se muestra en la Figura I adjunta.
El fragmento de PCR anteriormente obtenido fue digerido con Bcl I y Sal I e insertado en pToC 68 digerido con Bam HI y Xho I. Se secuenció la inserción del plásmido resultante (pCaHj 109) y se mostró que era idéntica al clon original.
ADNc de longitud total
Se sintetizó el ADNc de primera cadena a partir de un cebador específico dentro de la secuencia conocida (NOR 2153), y se hizo una síntesis de la segunda cadena mediante el método descrito por Gubler y Hoffman (1.983), GENE 25, 263-269. La secuencia del gen genómico hizo posible diseñar un cebador de PCR para tomar la parte 5' del ARNm y, al mismo tiempo, introducir un sitio Bam HI justo delante del codón ATG de inicio (NOR 2334). Utilizando este cebador en el extremo 5' y NOR 2153 de nuevo en el extremo 3', se llevó a cabo una PCR en el producto de ADNc de doble cadena. Luego se construyó la parte del PCR-ADNc que codifica la longitud total, clonando el fragmento 5' Bam HI-Pvu I de la reacción PCR junto con el 3' Pvu I-Eco 0109, completada con polimerasa Klenow para hacerla de extremos romos, en el vector de expresión pToC 68 de Aspergillus, cortado con Bam HI-Nru I, y se comprobó la secuencia del ADN insertado (pSX 320) (véase la Figura 2). La secuencia del ADNc de longitud total se muestra en la ID nº 1 de la Lista de Secuencias adjunta.
Cebadores oligonucleotídicos utilizados
2
Nomenclatura
Y: Pirimidina (C+T).
R: Purina (A+G).
N: Las cuatro bases.
Realzado: Cambios o inserciones con respecto a la secuencia original.
Subrayado: Sitio de restricción introducido por PCR
Expresión de la endoglucanasa de \sim 43 kD
El plásmido pSX 320 fue transformado en Aspergillus oryzae A1560-T40, un derivado de A. oryzae IFO 4177 deficiente en proteasa, utilizando selección en acetamida mediante cotransformación con pToC 90 que contenía el gen amdS de A. nidulans como un fragmento Xba I de 2,7 kb [Corrick et al. (1.987), GENE 53, 63-71] en un vector pUC 19 [Yannisch-Perron et al. (1.985), GENE 33, 103-119]. La transformación fue llevada a cabo del modo descrito en la solicitud publicada nº 238.023 de patente EP. Un número de productos de transformación fueron explorados en cuanto a la coexpresión de la endoglucanasa de \sim 43 kD. Los productos de transformación fueron evaluados mediante SDS-PAGE (página 4) y actividad CMC-endoglucanasa.
El plásmido que contenía el gen genómico (pCaHj 109) fue transformado en Aspergillus oryzae A1560-T40 mediante el mismo procedimiento. La evaluación de los productos de transformación mostró que el nivel de expresión era similar al de los productos de transformación de ADNc.
La endoglucanasa de \sim 43 kD purificada fue analizada en cuanto a su secuencia N-terminal y su contenido de carbohidratos. Se mostró que la secuencia de aminoácidos N-terminales era idéntica a la de la endoglucanasa de \sim 43 kD purificada por HPLC. El contenido de carbohidratos difiere del de la enzima de \sim 43 kD purificada por HPLC, ya que la enzima recombinante contiene 10 +/- 8 azúcares galactosa por mol en lugar de glucosa.
Ejemplo 3 Aislamiento de ADN genómico de Fusarium oxysporum
Un cultivo liofilizado de Fusarium oxysporum fue reconstituido con tampón de fosfato, sembrado en botón 5 veces en cada una de 5 placas con medio FOX (extracto de levadura al 6%, K_{2}HPO_{4} al 1,5%, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O al 0,75%, glucosa al 22,5%, agar al 1,5%, pH 5,6) e incubado a 37ºC. Después de 6 días de incubación, las colonias fueron separadas de las placas por raspamiento y fueron puestas en 15 ml de Tween-80 al 0,001%, lo que dio lugar a una suspensión espesa y turbia.
Cuatro matraces de 1 litro de capacidad, que contenían cada uno 300 ml de medio FOX líquido, fueron inoculados con 2 ml de la suspensión de esporas y fueron incubados a 30ºC y 240 rpm. Al 4º día de incubación, los cultivos fueron filtrados a través de 4 capas de gasa estéril y lavados con agua estéril. Los micelios fueron secados sobre papel de filtro Whatman, congelados en nitrógeno líquido, triturados hasta un polvo fino en un mortero frío y añadidos a 75 ml de tampón fresco para lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, SDS al 1%, EDTA 50 mM, 100 \mul de DEPC). La suspensión mezclada a fondo fue incubada en un baño de agua a 65ºC durante 1 hora y luego fue centrifugada durante 10 minutos a 4.000 rpm y 5ºC en un centrifugadora de mesa. El sobrenadante fue separado por decantación y sometido a precipitación con EtOH. Después de 1 hora en hielo, la disolución fue centrifugada a 19.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante fue separado por decantación y sometido a precipitación con isopropanol. Después de centrifugación a 10.000 rpm durante 10 minutos, se separó el sobrenadante por decantación y se dejó secar el sedimento.
Se añadió un mililitro de disolución TER (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 2000 1 mM, 100 \mug de RNAsaA) a cada tubo, y se guardaron los tubos a 4ºC durante dos días. Se mezcló el contenido de los tubos y se puso la mezcla en un baño de agua a 65ºC durante 30 minutos para suspender el ADN no disuelto. La disolución fue extraída dos veces con fenol/CHCl_{3}/alcohol isoamílico y dos veces con CHCl_{3}/alcohol isoamílico, y luego fue sometida a precipitación con etanol. Se dejó que el residuo sedimentara y se eliminó el EtOH. Se añadió EtOH al 70% y se guardó el ADN durante la noche a -20ºC. Después de decantación y secado, se añadió 1 ml de TER y se disolvió el ADN incubando los tubos a 65ºC durante 1 hora. La preparación produjo 1,5 mg de ADN genómico.
Clonación de la endoglucanasa de \sim 43 kD de Fusarium oxysporum
Para aislar el compuesto homólogo de Fusarium, la celulasa de \sim 43 kD de Humicola fue sometida a PCR (como se describe en los Documentos US 4.683.195 y US 4.683.202) y clonada. Luego se secuenció este producto y se construyeron cebadores para ser utilizados como sondas de genoteca y para multiplicación por PCR. Estos oligonucleótidos fueron utilizados para aislar el clon correspondiente a partir de una librería de ADNc.
Se utilizó la PCR para aislar el ADNc de longitud parcial y fragmentos genómicos del compuesto homólogo de 43 kD. Se utilizaron siete combinaciones diferentes de oligonucleótidos sumamente degenerados (véase la tabla posterior) en las reacciones de PCR, con ADNc o ADN genómico como molde. Sólo una combinación produjo clones parciales del compuesto homólogo de \sim 43 kD de Fusarium. Se utilizaron dos grupos separados de condiciones de PCR para cada pareja de oligonucleótidos; el primer grupo fue ideado para preparar muy poco producto pero con una especificidad muy elevada. Varios factores aseguraron la especificidad en este grupo de 28 ciclos: la temperatura de la hibridación de extremos complementarios, de 65ºC, fue muy elevada para estos oligonucleótidos; el tiempo a la temperatura de hibridación de extremos complementarios fue fijado durante sólo 30 segundos; se utilizaron 20 picomoles de cada mezcla de cebadores degenerados por 100 \mul de mezcla de reacción. Los oligonucleótidos utilizados contenían sólo la región degenerada sin un "elemento de clonación"; se utilizó 1 unidad de polimerasa Amplitaq^{TM} (Perkin-Elmer Cetus) por 100 \mul de mezcla de reacción; y se añadió EDTA a los tubos de reacción al término de la incubación final de 10 minutos a 72ºC para evitar la extensión a partir de cebadores mal emparejados, a las temperaturas del refrigerador, después de los ciclos de PCR. Se supuso que los productos del primer grupo de ciclos no serían visibles mediante tinción con bromuro de etidio en electroforesis en gel de agarosa debido a la baja eficacia de la multiplicación requerida para asegurar una especificidad elevada. Sin embargo, el segundo grupo de multiplicaciones fue ideado para multiplicar eficazmente los productos procedentes del primer grupo. Los factores que aseguran esto incluyen: reducir a 55ºC la temperatura de hibridación de extremos complementarios; prolongar a 1 minuto el tiempo de hibridación de extremos complementarios; aumentar la cantidad de oligonucleótidos a 100 picomoles de cada mezcla por 100 \mul de mezcla de reacción; utilizar un grupo diferente de oligonucleótidos que incluyen un elemento de clonación de "Cebado" junto con la porción degenerada (lo que aumenta drásticamente la temperatura de fusión) y utilizar 2,5 unidades de polimerasa Amplitaq por 100 \mul de mezcla de reacción.
Las reacciones de PCR fueron establecidas del modo recomendado por Perkin-Elmer Cetus. Se preparó una mezcla maestra para cada una de las 2 fuentes de ADN, genómica y de ADNc. Aquélla estaba compuesta de tampón 1X para PCR (Tris/HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%, Perkin-Elmer Cetus), desoxinucleótidos 0,2 mM (disolución 100 mM de dNTP Ultrapure^{TM}, Pharmacia), 1 unidad de polimerasa Amplitaq^{TM} (Perkin-Elmer Cetus) y 0,5 \mug de ADN genómico o 50 ng de ADNc por 100 \mul de volumen de mezcla de reacción, y agua desionizada para completar el volumen hasta 98 \mul por 100 \mul de mezcla de reacción. A tubos marcados de 0,5 ml (Eppendorf) se añadieron 20 picomoles (1 \mul de una concentración de 20 picomoles/\mul) de cada mezcla de oligonucleótidos (véase la tabla posterior). Aquellos fueron puestos en un sistema termocíclico Perkin-Elmer Cetus, a 75ºC, junto con las mezclas maestras y aceite de parafina ligero también en tubos de 0,5 ml. Se añadieron noventa y ocho microlitros de la mezcla maestra apropiada y 55 \mul de aceite de parafina ligero a cada tubo con oligonucleótidos. Las reacciones fueron luego iniciadas en una disposición de ciclos progresivos (véase la tabla inferior en cuanto a los parámetros). Al término de la incubación final a 72ºC, se añadieron 50 \mul de una disolución 10 mM de EDTA, pH 8,0, a cada tubo y se llevó a cabo una incubación durante otros 5 minutos a 72ºC.
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Después del primer grupo de ciclos de PCR, el ADN de las mezclas de reacción fue purificado mediante precipitación con alcohol isopropílico para uso en el segundo grupo de ciclos. La mayor parte del aceite de parafina ligero fue eliminada de la parte superior de cada muestra antes de transferir la muestra a un nuevo tubo marcado. Cada tubo fue luego sometido a extracción con un volumen igual de PCI [fenol (en inglés, phenol) al 49%, cloroformo al 49%, alcohol isoamílico al 2%] y luego con un volumen igual de cloroformo. Luego se hizo precipitar el ADN de las mezclas de reacción añadiendo: 75 \mul de acetato amónico 7,5 M, 1 \mul de glucógeno y 226 \mul de alcohol isopropílico. Los sedimentos fueron resuspendidos en 20 \mul de agua desionizada. Se pusieron dos microlitros de cada resuspensión en tubos marcados para la segunda serie de multiplicaciones por PCR, junto con 100 picomoles (5 \mul de una concentración de 20 picomoles/\mul) de cada nueva mezcla de cebadores (véase la tabla anterior). Se preparó una mezcla maestra del modo anteriormente descrito excepto por excluirse los moldes Alegenómicos y de ADNc y por compensarse los volúmenes aumentados de oligonucleótidos y de ADN en los tubos de reacción disminuyendo el volumen de agua añadida. Las reacciones y los ciclos fueron establecidos del modo anteriormente descrito (véase la tabla anterior).
Una vez que se hubieron completado los 28 ciclos, se separó el aceite de parafina ligero de las partes superiores de las muestras y se llevaron las mezclas de PCR a nuevos tubos. Diez microlitros de cada muestra fueron sembrados en botón sobre Parafilm e incubados a 45ºC durante aproximadamente 5 minutos para permitir que la muestra disminuyera de volumen y para permitir que el Parafilm absorbiera todo el aceite de parafina ligero residual. Las gotas fueron luego combinadas con 2 \mul de colorante de carga 6X y sometidas a electroforesis en gel de agarosa al 1% (Seakem GTG^{TM}, FMC, Rockland, Maine, EE.UU.). Se halló una sola banda de aproximadamente 550 pares de bases en el número 2 de reacción, en el que el molde era ADNc. Se halló una banda de aproximadamente 620 pares de bases en el número 12 de reacción, en el que el molde era ADN genómico. Estas reacciones fueron cebadas con los oligonucleótidos ZC3486 y ZC3561 (Tabla 1). Esto estaba muy próximo al producto de PCR de 510 pares de bases, predicho a partir de la comparación con la secuencia de 43 kD de Humicola. La síntesis de un producto más grande en la reacción con molde genómico es debida a la presencia de un intrón dentro de esta región. Se escindió la agarosa que contenía estas 2 bandas y se extrajo el ADN utilizando un sistema Prep-A-Gene^{TM} (Bio-Rad), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN fue eluido con 50 \mul de agua desionizada y fue hecho precipitar con 5 \mul de acetato sódico 3M, 1 \mul de glucógeno y 140 \mul de etanol. El sedimento de ADN fue secado y fue resuspendido en un volumen de 7 \mul de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM).
Los fragmentos de PCR fueron clonados en vector PBS sk-', el cual fue construido sometiendo primero pBluescript II sk- (Stratagene, La Jolla, California, EE.UU.) a digestión con Eco RI y purificando en gel el plásmido cortado procedente de agarosa "seaplaque" GTG^{TM} (FMC) al 0,8%, con un sistema Pre-A-Gene^{TM} (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos ZC1773 y ZC1774 (Tabla 1) fueron sometidos a hibridación de extremos complementarios mezclando 2 picomoles de cada oligonucleótido, llevando el volumen de reacción a 4 \mul con agua desionizada, añadiendo luego 0,5 \mul de tampón para hibridación de extremos complementarios (Tris-HCl 200 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 50 mM), y llevando la temperatura hasta 65ºC durante 30 segundos y enfriando lentamente hasta 20ºC en 20 minutos en un sistema termocíclico de PCR, Perkin-Elmer Cetus. Los oligonucleótidos fueron luego ligados al vector pBluescript digerido con Eco RI, mezclando: 5,5 \mul de agua desionizada, 2 \mul de oligonucleótidos sometidos a hibridación de extremos complementarios, 1 \mul de una dilución 1:3, en agua desionizada, del vector digerido, 1 \mul de tampón 10X para ADN-ligasa de T4 (Boehringer-Mannheim Biochemicals, Indianapolis, Indiana, EE.UU.) y 0,5 \mul de ADN-ligasa de T4 (Gibco-BRL), e incubando la mezcla a 16ºC durante 2,5 horas. La mezcla de ligación fue luego llevada hasta un volumen de 100 \mul con agua desionizada y fue extraída con PCI y cloroformo. Para aumentar la eficacia de la electroporación, el ADN fue luego hecho precipitar con 50 \mul de acetato amónico, 1 \mul de glucógeno y 151 \mul de isopropanol. Un microlitro de una resuspensión de 10 \mul en agua desionizada fue sometido a electroporación en células "electromax" DH10-B de E. coli (Gibco-BRL) siguiendo las instrucciones del fabricante, en un aparato Bio-Rad para electroporación. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió 1 ml de caldo 2XYT (por litro: 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl) a la cubeta y se mezcló. Diversas diluciones fueron sembradas en placas LB de 100 mm (por litro: 10 g de triptona, 8 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl, 14,5 g de agar) con 100 \mug/ml de ampicilina y fueron cubiertas con 100 \mul de una disolución de 20 mg/ml de X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido; Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU) en dimetilformamida y 20 \mul de IPTG 1 M (Sigma). Después de crecimiento durante la noche, se analizaron varias colonias azules y blancas por PCR en cuanto a pequeñas inserciones utilizando los oligonucleótidos ZC3424 (cebador inverso de Bluescript) y ZC3425 (cebador del activador de T7) (Tabla 1), siguiendo las condiciones bosquejadas anteriormente para explorar inserciones bacterianas. Después de una desnaturalización inicial de 1 minuto y 45 segundos a 94ºC, se llevaron a cabo 30 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, de 40ºC durante 30 segundos y de 72ºC durante 1 minuto. Tras electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa, una colonia azul que daba una banda de PCR coherente con una pequeña inserción en la región de clonación de pBluescript fue elegida para purificación del ADN y fue hecha crecer durante la noche en un cultivo líquido de 100 ml en TB (por litro: 12 g de triptona, 24 g de extracto de levadura, 4 ml de glicerol; tratamiento en autoclave; luego se añaden 100 ml de KH_{2}PO_{4} 0,17 M, K_{2}HPO_{4} 0,72 M; Sambrook et al., Molecular Cloning, 2ª edición, 1.989, A.2) con 150 \mug/ml de ampicilina. El ADN fue aislado mediante lisis alcalina y precipitación con PEG (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2ª edición, 1.38-1.41, 1.989). El análisis de la secuencia mostró que se había insertado el oligonucleótido correcto mientras se mantenía el gen de \beta-galactosidasa presente en vectores pBluescript en fase con el activador. Cincuenta microgramos de la preparación de ADN fueron sometidos a digestión con Eco RI, extracción con PCI y cloroformo, y precipitación con acetato sódico y etanol. El sedimento de ADN fue resuspendido en 50 \mul de agua desionizada. El vector PBS sk-' digerido fue subsanado con ADN-polimerasa de T4 (Gibco-BRL) añadiendo 40 \mul de tampón 10X para ADN-polimerasa de T4 (Tris-acetato 0,33 M, pH 8,0, acetato potásico 0,66 M, acetato magnésico 0,1 M, ditiotreitol 5 mM, BSA 5 mM (New England Biolabs), 260 \mul de agua desionizada, 40 \mul de dTTP 1 mM (Ultrapure^{TM}, Pharmacia) y 40 \mul de ADN-polimerasa de T4 (1 U/\mul; Gibco-BRL) a 20 \mul de 1 mg/ml de ADN vector. La mezcla fue incubada a 12ºC durante 15 minutos y luego a 75ºC durante 10 minutos. Para preparar el ADN para uso en ligación, fue sometido a extracción con PCI y cloroformo y a precipitación con acetato sódico y etanol. El sedimento fue resuspendido en 200 \mul de agua desionizada, lo que produjo una concentración de 0,1 \mug/\mul.
Para preparar los productos de PCR del compuesto homólogo de 43 kD, para inserción en el vector PBS sk-' subsanado, fueron subsanados con ADN-polimerasa de T4 (Gibco-BRL) en volúmenes de reacción de 10 \mul con la inclusión de dATP en lugar de dTTP. Las disoluciones de ADN resultantes fueron sometidas a extracción con PCI y cloroformo y a precipitación con acetato sódico, glucógeno y etanol. Los sedimentos de ADN fueron resuspendidos en 15 \mul de agua desionizada. Muestras de ADN de 7,5 \mul fueron ligadas a 0,1 \mug de PBS sk-' subsanado (0,1 \mug/\mul), con 1 \mul de tampón 10X para ligasa (Boehringer-Mannheim) y 0,5 \mul de ADN-ligasa de T4 (Boehringer-Mannheim). Las mezclas de ligación fueron luego llevadas a un volumen de 150 \mul con agua desionizada y fueron extraídas con PCI y cloroformo. Para aumentar la eficacia de la electroporación, el ADN fue luego hecho precipitar con 15 \mul de acetato sódico, 1 \mul de glucógeno y 166 \mul de isopropanol. Un microlitro de una resuspensión de 10 \mul en agua desionizada fue sometido a electroporación en células "electromax" DH10-B (BRL) de E. coli utilizando un aparato Bio-Rad para electroporación, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inmediatamente después de la electroporación, se añadió 1 ml de caldo SOB (por litro: 20 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 ml de NaCl 1 M, 2,5 ml de KCl 1 M; tratamiento en autoclave; luego se añaden 10 ml de MgCl_{2} 1 M y 10 ml de MgSO_{4} 1 M) a la cubeta, y la mezcla de células fue transferida a un tubo de 100 mm e incubada a 37ºC durante 1 hora con aireación. Diversas diluciones fueron sembradas en placas LB de 100 mm que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y fueron cubiertas con 100 \mul de una disolución de 20 mg/ml de X-Gal (Sigma) en dimetilformamida y 20 \mul de IPTG 1 M (Sigma). Para secuenciar se escogieron tres colonias blancas de cada una de las 2 transformaciones, de ADNc y genómica. El análisis de las secuencias mostró que las inserciones eran sumamente homólogas con respecto a la celulasa de 43 kD de Humicola. La inserción genómica era idéntica a la de ADNc excepto por la presencia de un intrón. Se destinaron dos oligonucleótidos de 42 unidades monómeras de la secuencia, ZC3709 y ZC3710 (Tabla 1), para uso como sondas de genoteca y cebadores para PCR. Los oligonucleótidos procedían de extremos opuestos del producto de PCR y fueron destinados a hibridar cadenas opuestas del ADN de modo que pudieran ser utilizados como cebadores en una reacción de PCR para probar clones potenciales en la exploración de la genoteca.
Construcción de una genoteca de ADNc de Fusarium oxysporum
Se hizo crecer Fusarium oxysporum mediante fermentación, y en diversos momentos se sacaron muestras para extracción de ARN y análisis de actividad celulasa. El análisis de actividad incluía un ensayo para actividad celulasa total así como uno para clarificación de colores. Las muestras de Fusarium oxysporum que demostraron una máxima clarificación de colores fueron sometidas a extracción en cuanto al ARN total, del cual se aisló poli(A)+ARN.
Para construir una genoteca de ADNc de Fusarium oxysporum, se sintetizó el ADNc de primera cadena en dos reacciones, una con y otra sin dATP radiomarcado. Se preparó una mezcla de reacción 2,5X a temperatura ambiental mezclando los reactivos siguientes en el orden siguiente: 10 \mul de tampón 5X para transcriptasa inversa (Gibco-BRL, Gaithersburg, Maryland, EE.UU.), 2,5 \mul de una disolución 200 mM de ditiotreitol (recién preparada o preparada a partir de una disolución madre almacenada a -70ºC) y 2,5 \mul de una mezcla que contenía 10 milimoles/litro de cada desoxinucleótido-trifosfato (dATP, dGTP, dTTP y 5-metil-dCTP, obtenidos de Pharmacia LKB Biotechnology, Alameda, California, EE.UU.). La mezcla de reacción fue dividida en cada uno de dos tubos de 7,5 \mul de capacidad. Se añadieron 1,3 \mul de ^{32}P-dATP de 10 \muCi/\mul (Amersham, Arlington Heights, Illinois, EE.UU.) a un tubo y 1,3 \mul de agua al otro. Siete microlitros de cada mezcla fueron transferidos a tubos de reacción finales. En un tubo separado, se mezclaron 5 \mug de poli(A)+ARN de Fusarium oxysporum en 14 \mul de Tris-HCl 5 mM, pH 7,4, EDTA 50 \muM, con 2 \mul de una disolución de 1 \mug/\mul de cebador de primera cadena (ZC2938 GACAGAGCACAGAATTCACTAGTGAGCTCT_{15}). La mezcla de ARN-cebadores fue calentada a 65ºC durante 4 minutos, enfriada en agua con hielo, y centrifugada brevemente en una microcentrifugadora. Se añadieron ocho microlitros de la mezcla de ARN-cebadores a los tubos de reacción finales. Se añadieron cinco microlitros de una disolución de 200 U/\mul de transcriptasa inversa Superscript^{TM} (Gibco-BRL) a cada tubo. Después de una agitación suave, los tubos fueron incubados a 45ºC durante 30 minutos. Se añadieron a cada tubo ochenta microlitros de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, y las muestras fueron vortiginosamente mezcladas y brevemente centrifugadas. Se sacaron tres microlitros de cada tubo para determinar las cuentas incorporadas mediante precipitación con TCA y las cuentas totales de la reacción. Una muestra de 2 \mul de cada tubo fue analizada mediante electroforesis en gel. El resto de cada muestra fue sometido a precipitación con etanol en presencia de glucógeno de ostra. Los ácidos nucleicos fueron recogidos como sedimento tras centrifugación y fueron lavados con etanol al 80%. Después del lavado con etanol, las muestras fueron dejadas secar al aire durante 10 minutos. La síntesis de la primera cadena produjo 1,6 \mug de ADNc de Fusarium oxysporum, un 33% de conversión de poli(A)+ARN en ADN.
La síntesis del ADNc de segunda cadena fue llevada a cabo sobre el híbrido de ARN-ADN procedente de las reacciones de primera cadena, bajo condiciones que activaron el cebado de primera cadena de la síntesis de segunda cadena que da lugar al ADN en horquilla. Los productos de primera cadena de cada una de las dos reacciones de primera cadena fueron resuspendidos en 71 \mul de agua. Se añadieron los reactivos siguientes, a temperatura ambiental, a los tubos de reacción: 20 \mul de tampón 5X para la segunda cadena [Tris 100 mM, pH 7,4, KCl 450 mM, MgCl_{2} 23 mM y (NH_{4})_{2}SO_{4} 50 mM], 3 \mul de \beta-NAD 5 mM, y 1 \mul de una mezcla de desoxinucleótidos-trifosfato con cada uno de ellos en una concentración 10 mM. Se añadió un microlitro de \alpha-^{32}P-dATP a la mezcla de reacción que recibió dATP sin marcar para la síntesis de la primera cadena, mientras el tubo que recibió dATP marcado para la síntesis de la primera cadena recibió 1 \mul de agua. Cada tubo recibió luego 0,6 \mul de una disolución de 7 U/\mul de ADN-ligasa de E. coli (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, Indiana, EE.UU.), 3,1 \mul de una disolución de 8 U/\mul de ADN-polimerasa I de E. coli (Amersham) y 1 \mul de una disolución de 2 U/\mul de ARNasa H (Gibco-BRL). Las mezclas de reacción fueron incubadas a 16ºC durante 2 horas. Después de la incubación, se utilizaron 2 \mul de cada mezcla de reacción para determinar las cuentas precipitables mediante TCA y las cuentas totales de la reacción, y se analizaron 2 \mul de cada mezcla de reacción mediante electroforesis en gel. Al resto de cada muestra, se añadieron 2 \mul de una disolución de 2,5 \mug/\mul de glucógeno de ostra, 5 \mul de EDTA 0,5 mM y 200 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM. Las muestras fueron sometidas a extracción con fenol-cloroformo y a precipitación con isopropanol. Después de centrifugación, los sedimentos fueron lavados con 100 \mul de etanol al 80% y fueron dejados secar al aire. La producción de ADNc de doble cadena en cada una de las reacciones fue aproximadamente 2,5 \mug.
Se utilizó un tratamiento con nucleasa de semilla de judía (Phaseolus aureus) para recortar el ADN de una sola cadena de la horquilla. Cada sedimento de ADNc fue resuspendido en 15 \mul de agua y 2,5 \mul de tampón 10X para semilla de judía (NaAc 0,3 M, pH 4,6, NaCl 3 M y ZnSO_{4} 10 mM). Se añadieron 2,5 \mul de DTT 10 mM, 2,5 \mul de glicerol al 50% y 2,5 \mul de una disolución de 10 U/\mul de nucleasa de semilla de judía (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts, EE.UU.) a cada tubo. Se incubaron las mezclas de reacción a 30ºC durante 30 minutos y se añadieron 75 \mul de una disolución 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, y 1 mM de EDTA a cada tubo. Se analizaron partes alícuotas de dos microlitros mediante análisis en gel de agarosa alcalino. Se añadieron cien microlitros de Tris-HCl 1 M, pH 7,4, a cada tubo y se sometieron las muestras dos veces a extracción con fenol-cloroformo. El ADN fue hecho precipitar con isopropanol y fue recogido como sedimento mediante centrifugación. Después de la centrifugación, el sedimento de ADN fue lavado con etanol al 80% y fue dejado secar al aire. La producción fue aproximadamente 2 \mug de ADN en cada una de las dos reacciones.
Los extremos del ADNc fueron dejados romos mediante tratamiento con ADN-polimerasa de T4. Los ADN de las dos muestras fueron combinados después de resuspensión en un volumen total de 24 \mul de agua. Se añadieron cuatro microlitros de tampón 10X para T4 (Tris-acetato 330 mM, pH 7,9, KAc 670 mM, MgAc 100 mM y 1 mg/ml de gelatina), 4 \mul de dNTP 1 mM, 4 \mul de DTT 50 mM, y 4 \mul de una disolución de 1 U/\mul de ADN-polimerasa de T4 (Boehringer-Mannheim) al ADN. Las muestras fueron incubadas a 15ºC durante 1 hora. Después de la incubación, se añadieron 160 \mul de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, y se sometió la muestra a extracción con fenol-cloroformo. El ADN fue hecho precipitar con isopropanol y fue recogido como sedimento mediante centrifugación. Después de la centrifugación, el ADN fue lavado con etanol al 80% y fue dejado secar al aire.
Después de la resuspensión del ADN en 6,5 \mul de agua, se añadieron adaptadores de Eco RI al ADN dejado romo. Se añadieron un microlitro de una disolución de 1 \mug/\mul de adaptador de Eco RI (Invitrogen, San Diego, California, EE.UU.; nº de catálogo N409-20), 1 \mul de tampón 10X para ligasa (Tris 0,5 M, pH 7,8, y MgCl_{2} 50 mM), 0,5 \mul de ATP 10 mM, 0,5 \mul de DTT 100 mM, y 1 \mul de una disolución de 1 U/\mul de ADN-ligasa de T4 (Boehringer-Mannheim) al ADN. Una vez que la muestra fue incubada durante la noche a temperatura ambiental, la ligasa fue térmicamente desnaturalizada a 65ºC durante 15 minutos.
El sitio de clonación Sst I, codificado por el cebador de la primera cadena, fue expuesto mediante digestión con endonucleasa Sst I. Se añadieron treinta y tres microlitros de agua, 5 \mul de tampón 10X para Sst I (Tris 0,5 M, pH 8,0, MgCl_{2} 0,1 M y NaCl 0,5 M) y 2 \mul de una disolución de 5 U/\mul de Sst I al ADN, y se incubaron las muestras a 37ºC durante 2 horas. Se añadieron ciento cincuenta microlitros de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, se sometió la muestra a extracción con fenol-cloroformo y se hizo precipitar el ADN con isopropanol.
El ADNc fue sometido a cromatografía en una columna de Sefarosa CL 2B (Pharmacia LKB Biotechnology) para seleccionar el ADNc por tamaños y para eliminar los adaptadores libres. Se vertió una columna de 1,1 ml de Sefarosa CL 2B en una pipeta desechable de plástico de 1 ml de capacidad y se lavó la columna con 50 volúmenes de columna del tampón (Tris 10 mM, pH 7,4, y EDTA 1 mM). Se aplicó la muestra, se recogieron fracciones de una gota y se reunió el ADN del volumen vacío. El ADN fraccionado fue hecho precipitar con isopropanol. Después de centrifugación, el ADN fue lavado con etanol al 80% y fue dejado secar al aire.
Se estableció una genoteca de ADNc de Fusarium oxysporum ligando el ADNc al vector pYcDE8' (véase el Documento WO 90/10698) que había sido digerido con Eco RI y Sst I. Se ligaron trescientos noventa nanogramos de vector a 400 ng de ADNc en una mezcla de reacción de ligación de 80 \mul que contenía 8 \mul de tampón 10X para ligasa, 4 \mul de ATP 10 mM, 4 \mul de DTT 200 mM y 1 unidad de ADN-ligasa de T4 (Boehringer-Mannheim). Después de incubación durante la noche a temperatura ambiental, se añadieron 5 \mug de glucógeno de ostra y 120 \mul de una disolución 10 mM de Tris-HCl y 1 mM de EDTA y se sometió la muestra a extracción con fenol-cloroformo. El ADN fue hecho precipitar con etanol y fue centrifugado, y el sedimento de ADN fue lavado con etanol al 80%. Después de secado al aire, el ADN fue resuspendido en 3 \mul de agua. Se añadieron treinta y siete microlitros de células competentes DH10B para electroporación (Gibco-BRL) al ADN, y se completó la electroporación con una unidad de electroporación (Bio-Rad Laboratories, Richmond, California, EE.UU.) compuesta de Bio-Rad Gene Pulser (modelo nº 1652076) y Bio-Rad Pulse Controller (modelo nº 1652098). Se añadieron cuatro mililitros de SOC [Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1.983), 557-580] a las células sometidas a electroporación, y se pulverizaron 400 \mul de la suspensión celular sobre cada una de las diez placas LB con ampicilina, de 150 mm. Después de una incubación durante la noche, se añadieron 10 ml de medio LB con ampicilina a cada placa y se sembraron las células en forma de rayas en los medios. De cada placa se hicieron reservas en glicerol y preparaciones plasmídicas. Se estableció el fondo de la genoteca (vector sin inserción) en aproximadamente el 1% ligando el vector sin inserción y titulando el número de clones después de la electroporación.
Para aislar clones de ADNc de longitud total del compuesto homólogo de 43 kD, se sembró una genoteca de 1.100.000 clones en placas LB de 150 mm con 100 \mug/ml de ampicilina. Se sembraron cien mil clones, procedentes de las reservas en glicerol, en cada una de 10 placas y se sembraron 20.000 clones en cada una de 5 placas. Se tomaron elevaciones por duplicado, del modo anteriormente descrito. La prehibridación, la hibridación y el lavado fueron llevados a cabo del modo anteriormente descrito. En la hibridación se utilizaron dos oligonucleótidos terminalmente marcados, de 42 unidades monómeras, ZC3709 y ZC3710 (que son específicos para el compuesto homólogo de 43 kD). Los filtros fueron lavados una vez durante 20 minutos con TMACL a 77ºC. Se hallaron veintidós manchas que se ponían de manifiesto en filtros duplicados. Las zonas correspondientes de las placas fueron recogidas con el extremo grande de una pipeta en 1 ml de tampón 1X para PCR. Estos análisis de aislamiento por PCR fueron con dos grupos de oligonucleótidos para cada producto de aislamiento. Un grupo contenía los dos oligonucleótidos específicos de 43 kD utilizados como sondas de hibridación, y el otro contenía un oligonucleótido específico de 43 kD, ZC3709, y un oligonucleótido específico del vector, ZC3634. La PCR fue llevada a cabo del modo anterior siguiendo las instrucciones de Perkin-Elmer Cetus. En cada mezcla de reacción de 50 \mul se utilizaron veinte picomoles de cada cebador y 5 \mul de la suspensión celular. Después de una desnaturalización inicial de 1 minuto y treinta segundos a 94ºC, se emplearon 30 ciclos de 1 minuto a 94ºC y 2 minutos a 72ºC, con un tiempo de prolongación final de 10 minutos a 72ºC. Los resultados mostraron que 17 de las 22 contenían los 2 puntos de reconocimiento de los oligonucleótidos específicos de 43 kD. Los 5 clones restantes contenían uno de los 2 puntos, ZC3709, pero por PCR se mostró que el cebador específico del vector estaba truncado y no era suficientemente largo para contener el otro punto. Los 9 clones más largos fueron escogidos para aislamiento de una sola colonia a través de otro nivel de exploración. Cinco diluciones de 10 veces de cada uno fueron sembradas y procesadas del modo anteriormente descrito para el primer grupo de elevaciones. Los nueve tenían señales en los autorradiogramas del segundo nivel de exploración. Las colonias estaban bastante apelotonadas, por lo que algunas colonias separadas de la zona de la señal radioactiva fueron sometidas a aislamiento de una sola colonia en placas LB de 150 mm con 70 \mug/ml de ampicilina. Estas fueron probadas mediante PCR en cuanto a compuestos homólogos a la endoglucanasa de \sim 43 kD con los oligonucleótidos ZC3709 y ZC3710, del modo descrito para el primer nivel de exploración excepto que las colonias fueron recogidas con un mondadientes en 25 \mul de mezcla maestra. Se obtuvieron bandas del tamaño esperado con 7 de los 9 clones. Se iniciaron cultivos de estos en 20 ml de Caldo Terrífico con 150 \mug/ml de ampicilina. El ADN fue aislado mediante lisis alcalina y precipitación con PEG del modo anteriormente descrito.
Análisis de la secuencia de ADN
Los ADNc fueron secuenciados en el vector de expresión de levadura, pYCDE8'. Para todas las reacciones de secuenciación se utilizó el método de terminación de cadenas didesoxi (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 1.977, páginas 5.463-5.467) utilizando dATP @35-S de New England Nuclear (véase M. D. Biggin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 1.983, páginas 3.963-3.965). Las reacciones fueron catalizadas por ADN-polimerasa modificada de T7, procedente de Pharmacia (véase S. Tabor y C. C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 1.987, páginas 4.767-4.771) y fueron cebadas con un oligonucleótido complementario al activador ADH1 (ZC996: ATT GTT CTC GTT CCC TTT CTT), complementario al terminador CYC1 (ZC3635: TGT ACG CAT GTA ACA TTA), o con oligonucleótidos complementarios al ADN de interés. Los moldes de doble cadena fueron desnaturalizados con NaOH (E. Y. Chen y P. H. Seeburg, DNA 4, 1.985, páginas 165-170) antes de la hibridación con un oligonucleótido de secuenciación. Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador de ADN, modelo 380A de Applied Biosystems. Los oligonucleótidos utilizados para las reacciones de secuenciación se enumeran en la tabla de oligonucleótidos de secuenciación siguiente:
TABLA 1 Oligonucleótidos para la PCR del compuesto homólogo de 43 kD
5
Oligonucleótidos para la clonación del compuesto homólogo de 43 kD
6
Oligonucleótidos del vector pYCDE8'
7
Cebadores específicos de secuenciación del compuesto homólogo de 43 kD
8
Ejemplo 4 Ensayo de clarificación de colores
La endoglucanasa de \sim 43 kD de Humicola (una mezcla de 30 procesos de purificación) fue comparada en un ensayo de clarificación de colores con la preparación de celulasa de H. insolens descrita en el Documento US 4.435.307, Ejemplo 6.
Como material de ensayo se utilizaron muestras de una tela vieja y desgastada de algodón negro. El ensayo de clarificación se hace en un "Terg-O-tometer", haciendo tres lavados repetidos. Entre cada lavado, las muestras de tela son secadas durante la noche.
Condiciones
2 g/l de detergente líquido a 40ºC durante 30 minutos, y una dureza del agua de 9º dH. El tamaño de la muestra de tela es 10 x 15 cm, y hay dos muestras de tela en cada vaso de precipitados.
La composición del detergente fue la siguiente:
10% de tensioactivo aniónico (Nansa 1169/p)
15% de tensioactivo no iónico (Berol 160)
10% de etanol
5% de trietanolamina
60% de agua
pH ajustado a 8,0 con HCl.
Dosificación
Las dos enzimas son dosificadas en 63 y 125 unidades de CMC-endoasa/l.
Resultados
Los resultados fueron evaluados por un panel de 22 personas que calificaron las muestras de tela sobre una escala de 1 a 7 puntos. Cuanto mayor es la puntuación, mayor es la clarificación de colores obtenida.
Enzima CMC-endoasa/l mg/l de proteína UPP*
Sin enzima 1,4 \pm 1,0
Mezcla de celulasa de 63 14 5,8 \pm 1,0
H.insolens 125 28 6,1 \pm 1,0
Invento 63 0,4 4,6 \pm 0,9
125 0,8 6,2 \pm 0,8
* UPP = Unidades de Puntuación del Panel
Se muestra que la endoglucanasa de \sim 43 kD tiene una eficacia aproximadamente 30 veces mejor que la mezcla de celulasa de H. insolens de la técnica anterior, y una eficacia aproximadamente 6 veces mejor que la preparación de celulasa de acuerdo con el Documento WO 89/09259.
Ejemplo 5 Estabilidad de la endoglucanasa de \sim 43 kD de Humicola en presencia de proteasas
La estabilidad en almacenamiento de la endoglucanasa de \sim 43 kD en detergente líquido, en presencia de diferentes proteasas, fue determinada bajo las condiciones siguientes:
Enzimas
Endoglucanasa de \sim 43 kD del invento
Serina-proteasa de B. licheniformis, específica para Glu/Asp
Proteasa de Fusarium sp. DSM 2672, semejante a tripsina
Serina-proteasa de B.lentus
Subtilisina Novo
Detergente
Detergente líquido comercial de EE.UU. que no contiene agente opacificador, perfume ni enzimas (aparte de las añadidas en el experimento). +/- ácido bórico al 1% (en peso/peso) como estabilizador de enzimas.
Dosificación
Endoglucanasa: 12 CMCU/g de detergente
Proteasas: 0,2 mg/g de detergente
Incubación
7 días a 35ºC.
Actividad residual
La actividad residual de la endoglucanasa después de 7 días de incubación con las proteasas respectivas fue determinada en términos de su actividad CMCasa (CMCU).
La actividad CMCasa fue determinada del modo siguiente:
Se preparó una disolución de sustrato de 30 g/l de CMC (Hercules 7 LFD) en agua desionizada. La muestra de enzima que se iba a analizar fue disuelta en tampón de fosfato 0,01 M, pH 7,5. Se mezclaron 1,0 ml de la disolución de enzima y 2,0 ml de un tampón de fosfato 0,1 M, pH 7,5, en un tubo de ensayo, y se inició una reacción enzimática añadiendo 1,0 ml de la disolución de sustrato al tubo de ensayo. La mezcla fue incubada a 40ºC durante 20 minutos, después de los cuales se detuvo la reacción mediante la adición de 2,0 ml de fosfato trisódico 12H_{2}O 0,125 M. Se preparó una muestra ciega sin incubación.
Se añadieron 2,0 ml de una disolución de ferricianuro (1,60 g de ferricianuro potásico y 14,0 g de fosfato trisódico
12H_{2}O en 1 litro de agua desionizada) a una muestra de ensayo así como a una muestra ciega, lo que fue inmediatamente seguido de inmersión en agua hirviendo e incubación durante 10 minutos. Después de la incubación, las muestras fueron enfriadas con agua del grifo. Se midió la absorbancia a 420 nm y se preparó una curva patrón con disolución de glucosa.
una unidad de CMCasa (CMCU; del inglés, CMCase Unit) es definida como la cantidad de enzima que, bajo las condiciones anteriormente especificadas, forma una cantidad de carbohidratos reductores que corresponde a 1 \mumol de glucosa por minuto.
Resultados
La estabilidad en almacenamiento de la endoglucanasa del invento fue determinada como su actividad residual (en % de CMCU) bajo las condiciones anteriormente indicadas.
9
Estos resultados indican que la estabilidad en almacenamiento de la endoglucanasa del invento en detergente líquido es mejorada cuando en la composición detergente se incluye una proteasa con un mayor grado de especificidad que Savinase.
Ejemplo 6 Uso de la endoglucanasa de \sim 43 kD de Humicola para proporcionar una variación localizada en el color del mahón
Se sometieron pantalones vaqueros a tratamiento con la endoglucanasa de \sim 43 kD en una centrifugadora de ropa de 12 kg, "Wascator" FL120, con vistas a impartir una variación localizada en el color superficial de los pantalones vaqueros que se aproximara a un aspecto de "lavado a la piedra".
Se utilizaron cuatro pares de pantalones vaqueros por carga de máquina. Las condiciones experimentales fueron las siguientes.
Desapresto
40 l de agua
100 ml de amilasa* de B. amyloliquefaciens, 120 L
70 g de KH_{2}PO_{4}
30 g de Na_{2}HPO_{4}
55ºC
10 minutos
pH 6,8
* asequible de Novo Nordisk A/S.
El proceso de desapresto fue seguido de drenaje.
Abrasión
40 l de agua
120 g de la mezcla de celulasa de H. insolens o x g de la endoglucanasa de \sim 43 kD
70 g de KH_{2}PO_{4}
30 g de Na_{2}HPO_{4}
55ºC
75 minutos
pH 6,6
El proceso de abrasión fue seguido de drenaje, aclarado, poslavado y aclarado.
Los resultados fueron evaluados juzgando visualmente el aspecto de los pantalones vaqueros.
Se utilizaron diferentes dosificaciones de la endoglucanasa de \sim 43 kD para obtener un nivel de abrasión que fuera equivalente al obtenido con 120 g de la mezcla de celulasa de H. insolens. Dicho nivel equivalente fue obtenido con 1,0-1,25 g de la endoglucanasa de \sim 43 kD. Las mediciones de la resistencia al desgarramiento de la ropa tratada no mostraron ninguna diferencia significativa entre los dos tratamientos enzimáticos.
Ejemplo 7 Uso de la endoglucanasa de \sim 43 kD de Humicola para eliminar la pelusa de la superficie de las telas
Se trató una tela de algodón al 100%, tejida en telar, con la endoglucanasa de \sim 43 kD en una centrifugadora de ropa de 12 kg, "Wascator" FL120, con vistas a investigar la capacidad de la enzima para impartir un mayor grado de suavidad a una nueva tela.
Las condiciones experimentales fueron las siguientes.
Tela
Tela de algodón al 100%, tejida en telar, obtenida de Nordisk Textil, blanqueada (NT2116-b) o no blanqueada (NT2116-ub). Se utilizaron 400 g de tela por carga de máquina.
Desapresto
40 l de agua
200 ml de amilasa de B. amyloliquefaciens, 120 L
60 g de KH_{2}PO_{4}
20 g de Na_{2}HPO_{4}
60ºC
10 minutos
pH 6,4
El proceso de desapresto fue seguido de drenaje.
Lavado principal
40 l de agua
0-600 g de la mezcla de celulasa de H. insolens o x g de la endoglucanasa de \sim 43 kD
60 g de KH_{2}PO_{4}
40 g de Na_{2}HPO_{4}
60ºC
60 minutos
pH 6,7
La operación de abrasión fue seguida de drenaje.
Poslavado
40 l de agua
40 g de Na_{2}CO_{3}
10 g de Berol 08
80ºC
15 minutos
pH 10,1
El poslavado fue seguido de aclarado.
En el lavado principal se añadieron tres concentraciones diferentes de la endoglucanasa de \sim 43 kD.
El peso de las muestras de tela fue medido antes y después del tratamiento. La pérdida de peso se expresa en % con respecto a la tela desaprestada.
El grosor de la tela fue medido por medio de un aparato medidor de grosores, L&W tipo 22/1. Se midieron 2 muestras de la tela (10 x 6 cm), y para cada muestra de tela se registraron 5 mediciones en \mum. La muestra de tela fue medida a una presión de 98,07 kPa. El grosor retenido se expresa en % con respecto a la tela desaprestada.
Se midió la resistencia de la tela por medio de un aparato (Elmendorf 09) para pruebas de desgarramiento. Se cortaron 6 muestras de tela (10 x 6 cm) en la dirección de la urdimbre y 6 muestras de tela (10 x 6 cm) en la dirección de la trama. La resistencia al desgarramiento fue medida en mN de acuerdo con la norma ASTM D 1424. La resistencia de la tela enzimáticamente tratada se expresa en % con respecto a la tela desaprestada.
Se midió la rigidez de la tela por medio de un aparato King para pruebas de rigidez de telas. Se cortan 4 muestras de tela (10 x 20 cm; 10 cm en la dirección de la urdimbre), y cada muestra de tela es plegada dorso contra dorso (10 x 10 cm) y colocada en una mesa provista de un círculo abierto en el medio. Un pistón empuja la tela a través del círculo utilizando una cierta potencia expresada en gramos. La determinación se hace de acuerdo con la norma ASTM D 4032, Método de Ensayo del Pliegue Circular (Circular Bend Test Method). La rigidez retenida de la tela se expresa en % con respecto a la tela desaprestada.
Los resultados de estos ensayos aparecen en la tabla siguiente:
Dosificación de la enzima Pérdida de peso Grosor retenido Resistencia retenida Rigidez retenida
EUG/l % % % %
0 0 100 100 100
13 4,0 95,3 85,4 88,6
50 5,1 94,5 73,3 85,0
150 7,7 91,9 70,7 79,3
Ejemplo 8 Uso de la endoglucanasa de \sim 43 kD de Humicola para el tratamiento de pasta de papel
La endoglucanasa de \sim 43 kD fue utilizada para el tratamiento de diversos tipos de pasta de papel con vistas a investigar el efecto de la enzima sobre el drenaje de la pasta.
Las condiciones experimentales fueron las siguientes.
Pastas
1. Mezcla de papeles de desecho: compuesta de 33% de papel de periódico, 33% de revistas y 33% de papel para ordenador; con o sin productos químicos para extraer la tinta (PDQ o PD, respectivamente).
2. Recipientes de cartón reciclado (RCR).
3. Kraft blanqueada: hecha de pino (KB)
4. Termomecánica no blanqueada: hecha de abeto (PTM).
Determinación de la actividad celulasa (CEVU)
Se prepara una disolución de sustrato que contiene 33,3 g/l de CMC (Hercules 7 LFD) en tampón de Tris, pH 9,0. En el mismo tampón se disuelve la muestra de enzima que se va a analizar. Se mezclan 10 ml de la disolución de sustrato y 0,5 ml de la disolución de enzima y se transfiere la mezcla a un viscosímetro (Haake VT 181, sensor NV, 181 rpm) termostatizado a 40ºC. Una Unidad de Viscosidad de Celulasa (CEVU; del inglés, Cellulase Viscosity Unit) se define en el Método Analítico nº AF 253 de Novo Nordisk (asequible de Novo Nordisk).
Determinación del drenaje de la pasta (Schopper-Riegler)
El índice Schopper-Riegler (SR) es determinado de acuerdo con la norma ISO 5267 (parte 1) en una pasta homogénea con una consistencia de 2 g/l. Un volumen conocido de pasta es dejado drenar a través de un tamiz metálico en un embudo. El embudo está provisto de un agujero axial y un agujero lateral. El volumen de filtrado que atraviesa el agujero lateral es medido en un recipiente graduado en unidades Schopper-Riegler.
Tratamiento enzimático
Una preparación de la endoglucanasa de \sim 43 kD fue diluida hasta 7 CEVU/ml y añadida a cada una de las pastas anteriormente indicadas (50 g de DS, 3% de consistencia). La dosis de enzima fue 2.400 CEVU/kg de pasta seca. El tratamiento enzimático fue llevado a cabo a un pH de 7,5 y a 40ºC con agitación suave durante 60 minutos. Después de 30 minutos, se tomó una muestra para comprobar el progreso de la reacción. Después de 60 minutos, se diluyó la pasta con agua fría (+4ºC) hasta una consistencia del 0,5% con objeto de detener la reacción.
Se determinó el drenaje de la pasta húmeda del modo anteriormente descrito y se asignaron los valores de Schopper-Riegler (SR). También se determinó el tiempo de drenaje (TD) bajo vacío.
Los resultados se resumen en la tabla siguiente.
TABLA 3 Resultados de las mediciones de drenaje y de resistencia 
\vskip1.000000\baselineskip
Papel de desecho + productos químicos
Testigo Enzima
SR (3%) 61 55
Tiempo de drenaje (s) 150 g/m^{2} 18,2 17
Masa, g/m^{2} 65,6 66,4
Volumen, cm^{3}/g 1,65 1,66
Longitud de rotura, m 3.650 3.970
Índice de estallido 2,19 2,47 
\vskip1.000000\baselineskip
Papel de desecho
Testigo Enzima
SR (3%) 59 51
Tiempo de drenaje (s) 150 g/m^{2} 18,2 12,7
Masa, g/m^{2} 68,0 67,9
Volumen, cm^{3}/g 1,68 1,64
Longitud de rotura, m 3.810 3.790
Índice de estallido 2,25 2,33
Recipientes de cartón reciclado
Testigo Enzima
SR (3%) 45 33
Tiempo de drenaje (s) 150 g/m^{2} 6,8 5,3
Masa, g/m^{2} 70,2 67,3
Volumen, cm^{3}/g 1,91 1,99
Longitud de rotura, m 3.640 3.530
Índice de estallido 2,25 2,22 
\vskip1.000000\baselineskip
Kraft
Testigo Enzima
SR (3%) 42 31
Tiempo de drenaje (s) 150 g/m^{2} 10,7 6
Masa, g/m^{2} 67,5 69,1
Volumen, cm^{3}/g 1,44 1,42
Longitud de rotura, m 7.010 7.190
Índice de estallido 5,14 4,96 
\vskip1.000000\baselineskip
PTM
Testigo Enzima
SR (3%) 68 60
Tiempo de drenaje (s) 150 g/m^{2} 13,8 11,3
Masa, g/m^{2} 68,7 70,2
Volumen, cm^{3}/g 2,13 2,04
Longitud de rotura, m 3.630 3.620
Índice de estallido 1,95 1,91
Experimentos testigo: iguales condiciones que en el tratamiento enzimático.
A partir de la tabla parece que el tratamiento con la endoglucanasa de \sim 43 kD causa una disminución significativa de los valores SR y mejora significativamente el drenaje de las pastas utilizadas en la fabricación de papel.
Se hicieron hojas de papel a partir de las diversas pastas en un dispositivo Rapid Köthen y se hicieron mediciones de resistencia de acuerdo con diferentes parámetros (incluyendo la longitud de rotura). No se observó ninguna disminución de las propiedades de resistencia debido a la acción enzimática.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: NOVO NORDISK A/S, N N
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DEL INVENTO: Una preparación de celulasa
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TITULAR: NOVO NORDISK A/S, Patent Department
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Novo Alle
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Bagsvaerd
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: DINAMARCA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO: DK-2880
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA DE LECTURA DEL ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DEL MEDIO: DISQUETE
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: ordenador personal compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Thalsoe-Madsen, Birgit
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIÓN
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: +45 4444 8888
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: +45 4449 3256
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX: 37304
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID Nº 1 DE SECUENCIA
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.060 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CALIDAD DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Humicola insolens 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM 1800
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 73..927
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: sig_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 10..72
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 10..927
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
10
11 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID Nº 2 DE SECUENCIA
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 305 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 2:
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID Nº 3 DE SECUENCIA
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1.473 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CALIDAD DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Fusarium oxysporum 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: DSM 2672
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 97..1224
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
14
15 
\vskip1.000000\baselineskip
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN SOBRE LA ID Nº 4 DE SECUENCIA
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 376 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
17
18

Claims (25)

1. Una preparación de celulasa que consiste esencialmente en una enzima homogénea que exhibe actividad endoglucanasa, enzima que tiene la secuencia de aminoácidos ID nº 2 o ID nº 4 mostrada en la Lista de Secuencias adjunta o que es un derivado de cualquiera de ellas.
2. Una preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, que es producible por una especie de Humicola, por ejemplo Humicola insolens.
3. Una preparación de celulasa de acuerdo con la reivindicación 1, que es producible por una especie de Fusarium, por ejemplo Fusarium oxysporum.
4. Una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una enzima endoglucanasa, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. Una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la secuencia de ADN es como la mostrada en la ID nº 1 o la ID nº 3 de la Lista de Secuencias adjunta o una modificación de las mismas.
6. Un vector de expresión que porta una secuencia de ADN inserta, de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.
7. Una célula que está transformada con una construcción de ADN de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5 o con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula de acuerdo con la reivindicación 7, que es una célula fúngica perteneciente, por ejemplo, a una cepa de Trichoderma o Aspergillus, en particular Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una célula de levadura perteneciente, por ejemplo, a una cepa de Hansenula o Saccharomyces; por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae.
9. Un procedimiento para producir una enzima endoglucanasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, procedimiento que comprende cultivar una célula de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 en un medio adecuado de cultivo en condiciones que permitan la expresión de la enzima endoglucanasa, y recuperar l enzima endoglucanasa del cultivo.
10. Un aditivo detergente que contiene una preparación de celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, preferiblemente en forma de granulado no pulverulento, un líquido estabilizado o una enzima protegida.
11. Un aditivo detergente de acuerdo con la reivindicación 10, que contiene 1-500, preferiblemente 5-250, con la máxima preferencia 10-100 mg de proteína enzimática por gramo del aditivo.
12. Un aditivo detergente de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende además otra enzima tal como una proteasa, lipasa, peroxidasa y/o amilasa.
13. Un aditivo detergente de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la proteasa es una que tiene un mayor grado de especificidad que la serina-proteasa de Bacillus lentus.
14. Un aditivo detergente de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la proteasa es subtilisina Novo o una variante de la misma, una proteasa obtenible de Nocardia dassonvillei NRRL 18133, una serina-proteasa específica para el ácido glutámico y el ácido aspártico, producible por Bacillus licheniformis, o una proteasa semejante a la tripsina, producible por Fusarium sp. DSM 2672.
15. Una composición detergente que comprende una preparación de celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
16. Una composición detergente de acuerdo con la reivindicación 15, que comprende además otra enzima tal como una proteasa, lipasa, peroxidasa y/o amilasa.
17. Una composición detergente de acuerdo con la reivindicación 16, en la que la proteasa es una que tiene un mayor grado de especificidad que la serina-proteasa de Bacillus lentus.
18. Una composición detergente de acuerdo con la reivindicación 17, en la que la proteasa es subtilisina Novo o una variante de la misma, una proteasa obtenible de Nocardia dassonvillei NRRL 18133, una serina-proteasa específica para el ácido glutámico y el ácido aspártico, producible por Bacillus licheniformis, o una proteasa semejante a la tripsina, producible por Fusarium sp. DSM 2672.
19. Una composición detergente de acuerdo con la reivindicación 18, en la que la enzima endoglucanasa está presente en una concentración que corresponde a 0,01-100, preferiblemente 0,05-60, y con la máxima preferencia 0,1-20, mg de proteína enzimática por litro de disolución de lavado.
20. Una composición detergente que comprende un aditivo detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10-14.
21. Un método para reducir la velocidad a la que las telas que contienen celulosa se vuelven ásperas o para reducir la aspereza de las telas que contienen celulosa, método que comprende tratar telas que contienen celulosa con una preparación de celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
22. Un método para proporcionar clarificación de colores a telas que contienen celulosa coloreada, método que comprende tratar telas que contienen algodón coloreado con una preparación de celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
23. Un método para proporcionar una variación localizada en el color de las telas que contienen celulosa coloreada, método que comprende tratar telas que contienen algodón coloreado con una preparación de celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
24. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21, 22 ó 23, en el que el tratamiento de las telas con la preparación de celulasa es llevado a cabo durante el remojo, el lavado o el aclarado de las telas.
25. Un método para mejorar las propiedades de drenaje de la pasta de papel, método que comprende tratar la pasta de papel con una preparación de celulasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
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