BRPI0606623B1 - solução para perfusão, conservação e/ou reperfusão para conservação de órgãos e métodos utilizando a mesma - Google Patents
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Abstract
solução de aspersão e/ou conservação para orgáos. a presente invenção refere-se a uma solução para conservação, aspersão e/ou reperfusão de um órgão, especialmente o coração, para transplante. a solução contém inibidor(es) peptidico(s) da proteína quinase c <225>ll (pck <225>ll) e/ou da proteína quinase c<sym> (pkc<sym>) e/ou ativador(es) peptídico(s) da proteína quinase c (pkc<sym>). também são revelados métodos para uso da solução inventiva, incluindo métodos para conservar um árgão pra transplante, para proteger um árgão isquêmico de danos, para atenuar a disfunção do árgão após a isquemia, para manter a liberação de óxido nítrico e/ou inibir a liberação de superóxido num órgáo isquêmico, e para proteger um órgáo de danos quando isolado do sistema circulatório.
Description
(54) Título: SOLUÇÃO PARA PERFUSÃO, CONSERVAÇÃO E/OU REPERFUSÃO PARA CONSERVAÇÃO DE ÓRGÃOS E MÉTODOS UTILIZANDO A MESMA (73) Titular: PHILADELPHIA COLLEGE OF OSTEOPATHIC MEDICINE. Endereço: 4191 CITY AVENUE, PHILADELPHIA PA 19131, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: LINDON H. YOUNG.
Código de Controle: 72A36ABC75504D57 66E5AEF708EBA9EA
Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 11/12/2018, observadas as condições legais
Expedida em: 11/12/2018
Assinado digitalmente por:
Liane Elizabeth Caldeira Lage
Diretora de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados
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Relatório Descritivo da Patente de Invenção para SOLUÇÃO PARA PERFUSÃO, CONSERVAÇÃO E/OU REPERFUSÃO PARA CONSERVAÇÃO DE ÓRGÃOS E MÉTODOS UTILIZANDO A MESMA.
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a uma solução para a conservação, perfusão e/ou reperfusão de um órgão, especialmente o coração, para transplante. A solução contém inibidor(es) de peptídeo(s) da proteína quinase C beta II (PCK βΠ) e/ou da proteína quinase C zeta (PCK ζ) e/ou de ativador(es) de peptídeo da proteína quinase C delta (PKC δ).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] O transplante de órgãos bem-sucedido é geralmente limitado devido a danos isquêmicos/de reperfusão. Corações humanos isolados despojados de oxigênio por mais de quatro horas perdem progressivamente o vigor e geralmente não sobrevivem em hospedeiros receptores. Outros órgãos, tais como rim, fígado e pulmão, também estão sujeitos a danos teciduais e celulares quando removidos de seus hospedeiros antes do transplante. Esse dano é devido a condições hipóxicas e à falta de circulação, a qual normalmente distribui concentrações farmacológicas de oxigênio e nutrientes e remove os compostos tóxicos produzidos pelas células do órgão. Transplantes de órgãos têm uma freqüência maior de sucesso quando efetuados imediatamente depois da excisão de seus hospedeiros.
[003] Avanços recentes aumentaram a taxa de transplantes de órgãos bem-sucedidos e de cirurgia de órgãos, tais como cirurgia de passagem secundária da coronária. A primeira inclui a conservação do órgão e as soluções de perfusão do órgão. A segunda é de métodos e dispositivos melhorados para a distribuição de soluções de perfusão de órgão para um órgão.
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2/38 [004] A conservação miocardíaca de curto prazo é atualmente efetuada por estocagem a frio depois da interrupção cardioplégica. Uma variedade de processos existe, entretanto diferindo pela composição da solução usada, pela temperatura de conservação e pelo protocolo de administração.
[005] Diferentes soluções para interromper e conservar o coração foram desenvolvidas para proteger o miocárdio na cirurgia cardíaca. Exemplos dessas soluções incluem a solução de Krebs-Henseleit, a solução de UW, a solução de St. Thomas, a solução de Collins e a solução de Stanford. (Ver, por exemplo, as Patentes U. S. N°s 4.798.824 e 4.938.961; Southard e Belzer, Ann. Rev. Med. 46:235-247 (1995); e Donnelly e Djuric, Am. J. Hosp. Pharm. 48:2444-2460 (1991)). Não obstante, rejeições de órgãos ainda permanecem devido à deterioração na condição do órgão transplantado entre o tempo de remoção e a restauração do fluxo sanguíneo no receptor.
[006] A restauração do fluxo sanguíneo é o objetivo primário para o tratamento de tecido de órgão experimentando isquemia prolongada, por exemplo, durante o transplante. Entretanto, a reperfusão do fluxo sanguíneo induz danos ao endotélio e ao miócito, resultando na disfunção do órgão (Buerke et al, Am J Physiol 266: H128-136, 1994; Lucchesi e Mullane, Ann Rev Pharmacol Toxicol 26: 2011-2024, 1986; e Lucchesi et al., J Mol Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989). Os eventos seqüenciais associados com danos por reperfusão são iniciados pela disfunção endotelial a qual é caracterizada por uma redução da liberação celular endotelial basal de óxido nítrico (NO) nos primeiros 2,5 - 5 min após a reperfusão (Tsao e Lefer, Am J Phyiol 259: H1660-1666, 1990). O decréscimo no NO derivado endotelial está associado com a suprarregulação da molécula de adesão nas membranas celulares de leucócito polimorfonuclear (PMN) e endotelial (Ma et al., Circ Res 72: 403- 412, 1993; e Weyrich et al., J Leuko Biol 57: 45-55, 1995). Esse
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3/38 evento promove a interação PMN/endotelial, a qual ocorre por 10 a 20 minutos após a reperfusão, e a subseqüente infiltração do PMN no miocárdio é observada por 30 min após a reperfusão (Lefer e Hayward, In The Role of Nitric Oxide in Ischemia - Reperfusion: Contemporary Cardiology, Loscalzo et al. (Eds.), Humana Press, Totowa, NJ, pp. 357-380, 2000; Lefer e Lefer, Cardiovasc Res 32: 743-751, 1996; Tsao et al., Circulation 82. 1402 - 1412, 1990; e Weyrich et al., J Leuko Biol 57: 45 - 55, 1995).
[007] Substâncias quimiotáticas liberadas de tecido reperfundido e PMNs ativados por fatores de plasma ativam PMNs que aumentam a liberação de PMN de substâncias citotóxicas (isto é, ânion superóxido) e contribuem para a disfunção do órgão após a isquemia/reperfusão (Lucchesi et al. J Mol Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989; Ma et al., Circ Res 69: 95-106, 1991; Tsao et al., Circulation 82: 1402-1412, 1990; e Tsao et al., Am Heart J 123: 1464- 1471, 1992). Superóxido se combina com NO para produzir o ânion peroxinitrito, reduzindo dessa forma a biodisponibilidade do NO e promovendo a disfunção endotelial e a infiltração de PMN após a isquemia/reperfusão miocardial (Clancey et al., J Clin Invest 90: 1116-1121, 1992; Hansen, Circulation 91: 187285, 1995; Lucchesi et al., J Mol Cell Cardiol 21: 1241-1251, 1989; Rubanyi e Vanhoutte, Am J Physiol 250: H815-821, 1986; Tsao et al, Am Heart J 123: 1464-1471, 1992; e Weiss, New Eng J Med 320: 365-375, 1989).
[008] Conseqüentemente, ainda permanece uma necessidade por uma solução de qualidade melhorada que possa aumentar o tempo de conservação de um órgão para transplante e proteger o órgão de danos de reperfusão após a isquemia, de forma que o órgão possa retomar a função própria após a restauração do fluxo sanguíneo. SUMÁRIO DA INVENÇÃO [009] A presente invenção fornece uma solução para a conserva
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4/38 ção, perfusão e/ou reperfusão de um órgão, especialmente o coração, contendo inibidor(es) de peptídeo da proteína quinase C βΠ (PKC βΠ) e/ou da proteína quinase C ζ (PKC ζ) e/ou ativador(es) de peptídeo da proteína quinase C δ (PCK δ). A solução protege tecidos de órgãos e células de danos enquanto o órgão é isolado do sistema circulatório ou está experimentando um fluxo sanguíneo diminuído (isquemia). O presente inventor descobriu que os inibidores de peptídeos da PKC βΠ e/ou da PKC ζ, e/ou ativador(es) de peptídeo da PCK δ aumentam a liberação de NO ou inibem a liberação da PMN superóxido/endotelial, a qual pode exercer efeito protetor em órgãos sofrendo isquemia/reperfusão.
[0010] Em uma modalidade, a solução contém cerca de 5 - 10 μΜ do inibidor de peptídeo da PKC βΙΙ e/ou cerca de 2,5 - 5 μΜ do inibidor de peptídeo da PKC ζ e/ou 5 - 10 μΜ do ativador de peptídeo da PKC δ dissolvido em uma solução salina.
[0011] A solução da presente invenção pode ser usada como uma solução de perfusão ou como uma solução de conservação. Como uma solução de perfusão, ela é bombeada para dentro da vasculatura do órgão para proteger os tecidos e as células do órgão. Como uma solução de conservação, ela serve como uma solução de banho na qual o órgão é submergido. Preferivelmente, o órgão é perfundido com e submergido na presente solução. Além disso, a presente invenção também serve como uma solução de reperfusão na restauração do fluxo sanguíneo para o órgão após a isquemia.
[0012] A presente invenção também inclui métodos de uso da solução da presente invenção. Esses incluem métodos para conservar um órgão para transplante, para proteger um órgão isquêmico de danos, para atenuar a disfunção do órgão após a isquemia, para manter a liberação de óxido nítrico num órgão isquêmico e para proteger um órgão de danos quando isolado do sistema circulatório.
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BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0013] Figura 1. Curso de tempo da LVDP (pressão desenvolvida ventricular esquerda = pressão sistólica final ventricular esquerda pressão diastólica final ventricular esquerda) em corações de ratos perfundidos Sham, I/R, I/R + PMNs e I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKCZ (5 mM). Os dados de LVDP iniciais (linha de base) e de reperfusão de 0 a 45 minutos após os 20 minutos de isquemia. O grupo Sham (n = 6) manteve o mesmo LVDP durante o protocolo de 80 min. O grupo I/R (n = 6) recuperou para os valores delinha de base iniciais. O grupo I/R + PMN (n = 6) exibiu uma redução significativa e sustentada no LVDP em comparação com um grupo de inibidor de peptídeo I/R + PMN + PKCZ (n = 6). Todos os valores são expressos como média ± SEM. *p < 0,05 e **p < 0,01, grupo de inibidor de peptídeo I/R + PMN + PKCZ do I/R + PMNs.
[0014] Figura 2. LVDP inicial e final em mmHg de corações de ratos perfundidos isolados antes da isquemia (I) (inicial) e depois de 45 min após a reperfusão (R) (final). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pelo inibidor do peptídeo PKCZ, mas foi significativamente bloqueada pelo éster NG-nitro-L-arginina metílico (L-NAME). Todos os valores são expressos como média ± SEM. A quantidade de corações examinados está na parte inferior das barras. **p < 0,01, a partir do I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0015] Figura 3. Taxa máxima inicial e final de LVDP (+dP/dt max) expressa em mmHg/s em corações de ratos perfundidos isolados antes de isquemia (I) e depois da reperfusão (R). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada por um inibidor do peptídeo da PKCZ, mas foi bloqueada pelo L-NAME. Todos os valores são expressos como média ± SEM. As quantidades de corações estão
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6/38 na parte inferior das barras. **P < 0,01, a partir de I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0016] Figura 4A. Avaliação histológica de PMNs total intravascular e infiltrado em amostras de coração de ratos perfundidos isolados tomados a partir de 3 ratos por grupo e 10 áreas por coração. As quantidades de PMNs infiltrado e intravascular total em tecido cardíaco pós-reperfusão e aderentes na vasculatura coronária foi significativamente atenuada pelo inibidor de peptídeo PKCZ. As caixas riscadas com traços finos e paralelos representam corações perfundidos sem PMN e as caixas pretas representam corações perfundidos com PMN. **P < 0,01, de I/R + PMNs.
[0017] Figura 4b. Avaliação histológica de PMNs intravasculares que aderiram na vasculatura coronária em amostras de coração de rato perfundidos isolados tomados de 3 ratos por grupo e 10 áreas por coração. As quantidades de PMNs aderidos na vasculatura coronária não foi significativamente diferentes do I/R + PMNs. As caixas riscadas com traços finos e paralelos representam corações perfundidos sem PMN e as caixas pretas representam corações perfundidos com PMN. Todos os valores são números médios de PMNs/mm2 de área cardíaca ± SEM.
[0018] Figura 5. Medição da liberação de NO a partir de segmentos aórticos de rato. A liberação de NO endotelial foi significativamente aumentada a partir da liberação de NO basal em segmentos tratados com inibidor de peptídeo PKCZ (2,5 - 15 mM) assim como acetilcolina (Ach, 200 nM). A liberação de NO foi significativamente reduzida em ambos os grupos dado 400 mM de L-NAME, e em segmentos removidos de endotélio (desnudados). Todos os valores são expressos como médias ± SEM. Os números na parte inferior das barras são números de experimentos separados por grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, a partir de valores basais.
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7/38 [0019] Figura 6. Liberação de superóxido a partir de PMNs de ratos. A liberação de superóxido foi medida a partir de 5 x106 PMNs depois de estimulação com forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (15 nM). A superóxido desmutase (SOD) (10 mg/ml) foi empregada como um controle positivo. A mudança na absorvância (Δ) foi medida 360 segundos depois da adição de PMA (resposta de pico). A liberação de superóxido foi significativamente inibida pelo inibidor do peptídeo PKCz (**p < 0,01, 2,5, 5 e 15 mM). Todos os valores são médias ± SEM. Os números embaixo das barras mostram os números de experimentos separados por grupo.
[0020] Figura 7. Curso de tempo da LVDP em corações de rato perfundidos Sham I/R, I/R, I/R + PMNs e I/R + PMN + inibidor de peptídeo de βΠ (10 mM). Dados de LVDP iniciais (linha de base) e de reperfusão de 0 a 45 min após 20 min de isquemia. O grupo sham (n = 6) manteve o mesmo LVDP durante o protocolo de 80 min. O grupo I/R + PMN (n = 9) exibiu uma redução significativa e sustentada no LVDP em comparação com os grupos de inibidores de peptídeos I/R (n = 6) e I/R + PMN + bII (n = 7). Todos os valores são expressos como média ± SEM. *p < 0,05 e **p < 0,01, de I/R + PMNs.
[0021] Figura 8. LVDP inicial e final expresso em mmHg de corações de rato perfundidos isolados antes da isquemia (I) (inicial) e depois de 45 min depois da reperfusão (R) (final). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pelo inibidor de peptídeo PKC βΠ, mas foi significativamente bloqueada pela presença de L-NAME. Todos os valores estão expressos como média ± SEM. O número de corações examinados está na parte inferior das barras. *p < 0,05 e **p < 0,01, de I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0022] Figura 9. +dP/dt max inicial e final expresso em mmHg/s em corações de rato perfundidos isolados antes de isquemia (I) e depois
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8/38 da reperfusão (R). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pelo inibidor de peptídeo da PKC pII, mas foi bloqueada pelo L-NAME. Todos os valores estão expressos como médias ± SEM. Os números de corações examinados estão na parte inferior das barras. *p < 0,05 e **P < 0,01, a partir de I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0023] Figura 10. Medição da liberação de NO de segmentos aórticos de ratos. A liberação de NO endotelial foi significativamente aumentada da liberação de NO basal em segmentos tratados com inibidor de peptídeo PKC βΠ (1, 2,5, 5 e 10 mM), assim como acetilcolina (Ach, 500 nM). A liberação de NO foi significativamente reduzida em ambos os grupos dados 400 mM de L-NAME. Todos os valores estão expressos como médias ± SEM. Os números na parte inferior das barras são números de experimentos separados por grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, dos valores basais.
[0024] Figura 11. Liberação de superóxido de PMNs de rato. A liberação de superóxido foi medida a partir de 5 x 106 PMNs depois da estimulação com formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (200 nM). SOD (10 mg/ml) foi empregada como um controle positivo. A alteração na absorvância (Δ) foi medida 90 segundos depois da adição de fMLP (resposta do pico). A liberação de superóxido foi significativamente inibida pelo inibidor de peptídeo PKC βΠ (**p < 0,01, 5, 10 e 20 mM). Todos os valores são médias ± SEM. Os números na parte inferior das barras são os números de experimentos separados por grupo.
[0025] Figura 12. Curso de tempo da LVDP em corações de ratos perfundidos Sham, I/R, I/R + PMNs e I/R + PMN + PKC bII (10 mM) + PKC ζ (5 mM). Dados de LVDP iniciais (linha de base) e de reperfusão de 0 a 45 minutos após os 20 minutos de isquemia. O grupo Sham (n = 6) manteve o mesmo LVDP durante o protocolo de 80 min. O grupo
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I/R (n = 6) recuperou parcialmente para os valores de linha de base iniciais. O grupo I/R + PMN (n = 11) exibiu uma redução significativa e sustentada no LVDP em comparação com um grupo de inibidores de peptídeo I/R + PMN + PKC βϋ (10 mM) + PKCZ (5 mM) (n = 7). Todos os valores são expressos como média ± SEM. *p < 0,05 de I/R + PMNs.
[0026] Figura 13. LVDP inicial e final expressos em mmHg de corações de ratos perfundidos isolados antes de isquemia (I) (inicial) e depois de 45 min após a reperfusão (R) (final). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. Os PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pela presença de inibidores de peptídeos da PKC bII e PKCZ. Esse efeito protetor foi bloqueado pelo L-NAME. Todos os valores estão expressos como média ± SEM. Os números de corações examinados estão na parte inferior das barras. *p < 0,05 de I/R + PMNs final. NS = não significativo.
[0027] Figura 14. +dP/dt max inicial e final expresso em mmHg/s em corações de rato perfundidos isolados antes de isquemia (I) e depois da reperfusão (R). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pelos inibidores de peptídeo PKC bII e PKCZ. Esse efeito protetor foi bloqueado pelo L-NAME. Todos os valores estão expressos como médias ± SEM. Os números de corações examinados estão na parte inferior das barras. *P < 0,05 a partir de I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0028] Figura 15. Avaliação histológica de PMNs total intravascular e infiltrado em amostras de coração de ratos perfundidos isolados tomados a partir de 3 ratos por grupo e 10 áreas por coração. As quantidades de PMNs infiltrado e intravascular total em tecido cardíaco pósreperfusão e aderentes na vasculatura coronária foi significativamente atenuada pelos inibidores de peptídeo PKC bII e PKCZ. As caixas risPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 15/73
10/38 cadas com traços finos e paralelos representam corações perfundidos sem PMN e as caixas pretas representam corações perfundidos com PMN. **P < 0,01, de I/R + PMNs.
[0029] Figura 16. Avaliação histológica de PMNs intravasculares que aderiram na vasculatura coronária em coração de rato perfundido isolado. As quantidades de PMNs aderidos na vasculatura coronária em corações tratados com inibidores de peptídeo PKC βΠ e PKCZ foi menor do que em corações I/R + PMN. As caixas riscadas com traços finos e paralelos representam corações perfundidos sem PMN e as caixas pretas representam corações perfundidos com PMN. Todos os valores são números médios de PMNs/mm2 de área cardíaca ± SEM. **P < 0,01, de I/R + PMNs.
[0030] Figura 17. Medição da liberação de NO a partir de segmentos aórticos de rato. A liberação de NO endotelial foi significativamente aumentada a partir da liberação de NO basal em segmentos tratados com inibidores de peptídeo da PKC βΠ e PKCZ, assim como com acetilcolina (Ach, 500 nM). A liberação de NO foi significativamente reduzida em ambos os grupos dados 400 mM de L-NAME. Todos os valores são expressos como médias ± SEM. Os números na parte inferior das barras são números de experimentos separados por grupo. **p < 0,01, a partir de valores basais.
[0031] Figura 18. Liberação de superóxido a partir de PMNs de ratos. A liberação de superóxido foi medida a partir de 5 x106 PMNs depois de estimulação com PMA (15 nM). SOD (10 mg/ml) foi empregada como um controle positivo. A mudança na absorvância (Δ) foi medida 360 seguntos depois da adição de PMA (resposta de pico). A liberação de superóxido foi significativamente inibida pela presença dos inibidores de peptídeo PKC βΠ e PKCZ (*p < 0,05, **p < 0,01). Todos os valores são médias ± SEM. Os números embaixo das barras mostram os números de experimentos separados por grupo.
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11/38 [0032] Figura 19. Curso de tempo da LVDP em corações de rato perfundidos com Sham, I/R, I/R + PMNs e ativador de peptídeo da PKCô (10 mM). Dados de LVDP iniciais (linha de base) e de reperfusão de 0 a 45 min após 20 min de isquemia. O grupo sham (n = 6) manteve o mesmo LVDP durante o protocolo de 80 min. O grupo I/R (n = 6) se recuperou para os valores de linha de base iniciais. O grupo I/R + PMN (n = 6) exibiu uma redução significativa e sustentada na LVDP em comparação com o grupo I/R + PMN + ativador de peptídeo da PKCô (n = 6). Todos os valores são expressos como média ± SEM. **p < 0,01, de I/R + PMNs.
[0033] Figura 20. LVDP inicial e final expresso em mmHg de corações de rato perfundidos isolados antes da isquemia (I) (inicial) e depois de 45 min depois da reperfusão (R) (final). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pelo ativador de peptídeo da PKCô. Todos os valores estão expressos como média ± SEM. O número de corações examinados está na parte inferior das barras. *p < 0,05 e **p < 0,01, de I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0034] Figura 21. +dP/dt max inicial e final expressa em mmHg/s em corações de rato perfundidos isolados antes de isquemia (I) e depois da reperfusão (R). Os corações foram perfundidos na presença ou ausência de PMNs. PMNs induziram uma disfunção contrátil significativa, a qual foi atenuada pelo ativador de peptídeo PKC ô. Todos os valores estão expressos como médias ± SEM. Os números de corações examinados estão na parte inferior das barras. **P < 0,01, a partir de I/R + PMNs final; NS = não significativo.
[0035] Figura 22. Liberação de superóxido de PMNs de rato. A liberação de superóxido foi medida a partir de 5 x 106 PMNs depois da estimulação com PMA (15 nM). A alteração na absorvância (Δ) foi mePetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 17/73
12/38 dida 360 segundos depois da adição de PMA (resposta do pico). A liberação de superóxido foi significativamente inibida pelo ativador de peptídeo da PKCô (**p < 0,01, 5 e 10 mM). Todos os valores são médias ± SEM. Os números na parte inferior das barras mostram os números de experimentos separados por grupo.
[0036] Figura 23a. Avaliação histológica de PMNs total intravascular e infiltrado em amostras de coração de ratos perfundidos isolados tomados de 3 ratos por grupo e 10 áreas por coração. As quantidades de PMNs infiltrado e intravascular total em tecido cardíaco pósreperfusão e aderentes na vasculatura coronária foram atenuadas pelo ativador de peptídeo PKCô. As caixas riscadas com traços finos e paralelos representam corações perfundidos sem PMN e as caixas pretas representam corações perfundidos com PMN.
[0037] Figura 23b. Avaliação histológica de PMNs intravasculares que aderiram na vasculatura coronária em amostras de coração de rato perfundido isoladas tomadas de 3 ratos por grupo e 10 áreas por coração. As quantidades de PMNs aderidos na vasculatura coronária foram atenuadas pelo ativador de peptídeo PCKô. As caixas riscadas com traços finos e paralelos representam corações perfundidos sem PMN e as caixas pretas representam corações perfundidos com PMN. Todos os valores são números médios de PMNs/mm2 de área cardíaca ± SEM.
[0038] Figura 24. Curso de tempo da pressão diastólica final ventricular esquerda (LVEDP) em corações de rato perfundidos Sham, I/R, I/R + PMNs e ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM). Dados de LVEDP iniciais (linha de base) e de reperfusão de 0 a 45 min após 20 min de isquemia. O grupo Sham (n = 6) manteve o mesmo LVEDP durante o protocolo de 80 min. O grupo I/R (n = 6) recuperou para os valores de linha de base iniciais. O grupo I/R + PMN (n = 6) exibiu uma elevação significativa e sustentada na LVEDP em comparação com o
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13/38 grupo ativador de peptídeo I/R + PMN + PKCô (n = 6). Todos os valores são expressos como média ± SEM. *p < 0,05 e **p < 0,01, de I/R + PMNs.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA MODALIDADE PREFERIDA [0039] A presente invenção fornece uma solução para a conservação, perfusão e/ou reperfusão de um órgão, especialmente do coração. A solução contém inibidor(es) de peptídeo da proteína quinase C bII (PKC bII) e/ou da proteína quinase C ζ (PKC ζ) e/ou ativador(es) de peptídeo da PKCô. Preferivelmente, o inibidor de peptídeo da PKC βΠ ou o ativador de peptídeo da PKC δ está presente na solução em uma quantidade de cerca de 5 - 10 μΜ; e o inibidor de peptídeo da PKC ζ está presente em uma quantidade de cerca de 2,5 - 5 μΜ.
[0040] Em uma modalidade preferida, o inibidor de peptídeo da PKC bII tem uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1; o inibidor de peptídeo da PKC ζ tem uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; e o ativador de peptídeo tem uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Também, em outras modalidades, é preferível que o inibidor/ativador de peptídeo seja miristoilado para facilitar a absorção nas células do órgão.
[0041] Em uma modalidade preferida, o(s) inibidor(es) de peptídeo ou o(s) ativador(es) de peptídeo são dissolvidos em uma solução salina, preferivelmente salina normal (NaCl 0,9%). O(s) inibidor(es) de peptídeo também pode ser dissolvido em solução de conservação comum, tal como solução de Krebs-Henseleit, solução UW, solução de St. Thomas II, solução de Collins, solução de Stanford e semelhantes. A solução também pode conter um ou mais dentre sódio (Na+), potássio (K+), cálcio (Ca2+), magnésio (Mg2+), glutamato, arginina, adenosina, manitol, alopurinol, glutationa, rafinose e ácido lactobiônico em concentrações de cerca de 4-7 mM, cerca de 0,2-0,3 mM, cerca de 108-132 mM, cerca de 13-16 mM, cerca de 18-22 mM, cerca de 2-4
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14/38 mM, cerca de 0,5-1 mM, cerca de 27-33 mM, cerca de 0,9-1,1 mM, cerca de 2,7- 3,3 mM, cerca de 25-35 mM e de cerca de 80-120 mM, respectivamente. Na+ pode estar na forma de NaOH; K+ pode estar na forma de KCl e/ou de KH2PO4, mais preferivelmente na proporção de cerca de 2 - 3,5 mM de KCl e de cerca de 2 - 3,5 mM de KH2PO4. Ca2+ pode estar na forma de CaCl2; e Mg2+ pode estar na forma de MgCl2. A solução é preferivelmente mantida em pH fisiológico de cerca de 7,2 - 7,4.
[0042] A solução da presente invenção pode ser usada durante todas as fases de um órgão, especialmente o coração, transplante, incluindo, mas sem se limitar, ao 1) isolamento do órgão do doador (solução cardioplégica); 2) conservação do órgão (estocagem hipotérmica/transporte); e 3) reimplantação do órgão no receptor (solução de reperfusão).
[0043] Durante a perfusão ou a reperfusão, especialmente para o coração, é preferível que o órgão possa ser perfundido em uma taxa de cerca de 1 ml/min por cerca de 5 min. A taxa de perfusão pode ser variada, mas ela não deve exceder cerca de 25 ml/min. De um modo global, a taxa de perfusão não deve ser tão alta para impor uma pressão imprópria na vasculatura do órgão.
[0044] A solução da presente invenção pode ser preparada pela 1) dissolução e diluição do(s) inibidor(es) de peptídeo e dos diferentes constituintes em água destilada; 2) ajuste do pH até cerca de 7,2 - 7,4, por exemplo, com NaOH; e 3) esterilização da solução, por exemplo, por filtração com um filtro de 0,2 mm. A solução esterilizada é, a seguir, mantida isolada dos contaminantes no ambiente.
[0045] Sem descrição adicional, acredita-se que uma pessoa normalmente versada na técnica pode, usando a descrição precedente e os seguintes exemplos ilustrativos, fazer e utilizar os compostos da presente invenção e praticar os métodos reivindicados. O seguinte
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15/38 exemplo é dado para ilustrar a presente invenção. Deve ser entendido que a invenção não é para ser limitada a condições específicas ou detalhes descritos nesse exemplo.
EXEMPLO 1 - EFEITOS DO INIBIDOR DE PEPTÍDEO DA PKC Z [0046] Ratos machos Sprague Dawley (275 - 325 g, Animais Ace, Boyertown, PA) foram anestesiados com 60 mg/Kg de pentobarbital sódico intraperiotonealmente (i. p.). Heparina sódica (1.000 U) também foi administrada i. p. Os corações foram rapidamente extirpados, as aortas ascendentes foram canuladas e a perfusão retrógrada do coração foi iniciada com um tampão de Krebs modificado mantido a 37 °C em uma pressão constante de 80 mmHg. O tampão de Krebs tinha a seguinte composição (em mmol/l): dextrose 17, NaCl 120, NaHCO3 25, CaCl2 2,5, EDTA 0,5, KCl 5,9 e MgCl2 1,2. O perfusato foi aerado com 95% de O2 e 5% de CO2 e equilibrado num pH de 7,3 - 7,4. Os dois braços laterais na linha de perfusão proximal à cânula de influxo cardíaco permitiram aos PMNs, ao plasma sem inibidor de peptídeo da PKC z (corações de controle) ou plasma contendo diferentes concentrações de inibidor de peptídeo da PKCZ (1, 2,5 ou 5 μΜ) serem diretamente infundidos na linha de influxo coronariana. O fluxo coronário foi monitorado por um medidor de fluxo (T106, Transonic System, Inc., Ithaca, NY). LVDP e +dP/dtmax foram monitoradas usando um transdutor de pressão (SPR-524, Millar Instruments, Inc., Houston, TX), o qual foi posicionado na cavidade ventricular esquerda. Os corações foram imersos num reservatório com camisa de água contendo 160 ml de tampão de Krebs mantido a 37 °C. O fluxo coronário, LVDP e a +dP/dtmax foram registradas usando um sistema de aquisição Powerlab Station (ADInstruments, Grand Junction, CO) juntamente com um computador.
[0047] LVDP, +dP/dtmax e o fluxo coronário foram medidos a cada 5 min por 15 min para equilibrar os corações e obter uma medição de
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16/38 linha de base. LVDP foi definida como a pressão sistólica final ventricular esquerda menos a pressão diastólica final ventricular esquerda. Depois de 15 min, o fluxo do tampão de Krebs foi reduzido para zero por 20 min para induzir a isquemia global. Na reperfusão, os corações foram infundidos por 5 min com 200 x 106 PMN ressuspensos em 5 ml de tampão de Krebs mais 5 min de plasma em uma taxa de 1 ml/min. Em alguns experimentos, o inibidor de peptídeo da PKCZ (Genemed Synthesis, Inc., São Francisco, CA) foi adicionado ao plasma em uma concentração final de 1, 2,5 ou 5 mM. Ratos Sham I/R não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs.
[0048] Os seguintes grupos de corações de ratos perfundidos foram usados:
[0049] Grupo 1: Corações de Sham isquemia/reperfusão (I/R) não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs, mas foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) a 35 min em perfusão (o mesmo ponto de tempo que os corações I/R poderia ser dado 5 ml de plasma, 15 min de registros de linha de base mais 20 minutos de isquemia). Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se o coração de rato isolado pode manter a LVDP e a +dP/dtmax durante o protocolo de 80 min (n = 6).
[0050] Grupo 2: Corações de inibidor de peptídeo da PKCZ (5 mM) + Sham I/R não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs. A esses corações foi administrado o inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM, dissolvido em plasma a partir de um estoque 5 mM em H2O) por 35 minutos em perfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se o inibidor de peptídeo da PKC ζ causa um efeito cardiotônico ou cardiodepressor (n = 6).
[0051] Grupo 3: Corações I/R foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) durante os primeiros 5 min de reperfusão, mas não foram perfundidos com PMNs.
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Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia, seguido por reperfusão atordoa o coração, mas a LVDP e a +dP/dtmax irão se recuperar para os valores de linha de base (iniciais) no término do período de reperfusão de 45 minutos (n = 6).
[0052] Grupo 4: Corações I/R + inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM, dissolvido em plasma) foram submetidos a 20 min de isquemia e não foram perfundidos com PMNs. Esses corações foram perfundidos com 5 ml de plasma + inibidor da PKC ζ durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se o inibidor de peptídeo PKC ζ causou um efeito cardiodepressor no ajuste de I/R sem PMNs (n = 6).
[0053] Grupo 5: Corações I/R + PMNs foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) e PMNs (ressuspensos em 5 ml de tampão de Krebs) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia seguidos por 45 min de reperfusão na presença de PMNs (200 x 106) resultaria em uma disfunção contrátil cardíaca sustentada durante os 45 min de reperfusão em comparação com os valores de linha de base iniciais (n = 6).
[0054] Grupo 6: Corações I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC ζ foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo PKC ζ 1 mM (dissolvidos em plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC ζ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6). [0055] Grupo 7: Corações I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC ζ (2,5 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC ζ 2,5 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses
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18/38 corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC ζ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6).
[0056] Grupo 8. Corações I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo de PKC ζ 5 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC ζ em uma concentração mais elevada do inibidor de peptídeo PKC ζ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6).
[0057] Grupo 9: Corações I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM) + NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 50 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC ζ 5 mM (dissolvido em 5 ml de plasma) e 50 mM de LNAME (dissolvido em tampão de Krebs a partir de um estoque de 50 mM em H2O) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC ζ em uma concentração mais elevada do inibidor de peptídeo PKC ζ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6). O L-NAME (50 mM) foi continuamente infundido no coração durante o período de reperfusão de 45 min. Esses corações representam um grupo para determinar se o efeito cardioprotetor da inibição do peptídeo da PKC ζ poderia ser bloqueado com um inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME) (n = 5).
[0058] Os dados foram registrados a cada 5 min para os 45 min após a reperfusão. Depois de cada experimento, o ventrículo esquerdo foi isolado, fixado em paraformaldeído a 4% e estocado a 4 °C para análise histológica posterior.
[0059] Figura 1 mostrou o curso de tempo da função contrátil carPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 24/73
19/38 díaca (isto é, LVDP). Os dados do dos grupos Sham I/R, I/R, I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM) e I/R + PMN ilustraram as alterações relativas no LVDP durante o período de perfusão de 80 min. Conforme mostrado, o Sham I/R permaneceu próximo ou acima de 100% dos valores de linha de base iniciais de LVDP para o período de perfusão inteiro. Os corações I/R experimentaram um abaixamento da LVDP no início da reperfusão, mas recuperaram para 95 ± 7% dos valores de linha de base iniciais pelo fim da reperfusão. Ao contrário, os corações I/R + PMN sofreram severa disfunção contrátil cardíaca, recuperando para somente 47 ± 7% dos valores de linha de base iniciais por 45 min após a reperfusão. Ao contrário, os corações de inibidor de peptídeo I/R + PMN + PKC ζ (5 mm) recuperaram para 84 ± 4% em 45 min após a reperfusão.
[0060] Para determinar se o inibidor de peptídeo da PKC ζ produziu efeitos inotrópicos diretos na função contrátil cardíaca, corações Sham I/R não-isquêmicos foram perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM). O tratamento dos corações Sham I/R com inibidor de peptídeo da PKC ζ não resultaram em qualquer alteração significativa na LVDP (figura 2) ou na +dP/dtmax (figura 3) durante o período de perfusão de 80 min, demonstrando que o inibidor de peptídeo da PKC ζ em 5 mM não exerce efeito direto na função contrátil cardíaca. Uma concentração de inibidor de peptídeo da PKC ζ de 15 mM foi inicialmente testada, uma vez que essa concentração correspondeu com uma inibição de 82% de liberação da PMN superóxido. Entretanto, 15 mM produziram um efeito cardiodepressor (redução de 50% na LVDP dos corações Sham I/R) e não pode ser usada nesses experimentos (dados não apresentados).
[0061] Figuras 2 e 3 mostraram os valores inicial e final para a LVDP e +dP/dtmax a partir de corações de rato perfundidos isolados. As linhas de base iniciais foram semelhantes para todos os grupos. EntrePetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 25/73
20/38 tanto, a +dP/dtmax e a LVDP final (45 min após a reperfusão) foi significativamente diminuída (p < 0,01) por 47 ± 7% e 41 ± 7%, respectivamente para os corações I/R reperfundidos com PMNs em comparação com a sua linha de base inicial. O inibidor de peptídeo da PKC ζ (concentrações de 2,5 mMe 5 mM) atenuou significativamente o decréscimo na LVDP e na +dP/dtmax associado com a reperfusão pós-isquêmica com os PMNs. No grupo recebendo 5 mM de fármaco, os corações recuperaram para 84 ± 4% e 76 ± 5% para a +dP/dtmax e LVDP final em comparação com a sua linha de base inicial. A dose efetiva mais baixa foi observada a 2,5 mM; e esses corações recuperaram até 83 ± 4% para a LVDP e 75 ± 5% para a dP/dtmax em comparação com os valores de linha de base iniciais. Os efeitos cardioprotetores do inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM) foram bloqueados na presença do L-NAME (50 mM). Esses corações somente recuperaram até 58 ± 7% e 54 ± 9 % para a LVDP e dP/dtmax, respectivamente, em 45 min após a reperfusão em comparação com a sua linha de base inicial. Esses corações foram semelhantes ao grupo IR + PMN (47 ± 7% e 41 ± 7% da LVDP. +dP/dtmax). Em 1 mM, corações tratados com inibidor de peptídeo da PKC ζ expostos a I/R + PMNs somente recuperaram até 57 ± 10% e 46 ± 6% para a LVDP e +dP/dtmax, respectivamente, em 45 min após a reperfusão em comparação com a sua linha de base inicial. Esses corações não foram significativamente diferentes dos corações de controle I/R + PMN em 45 min após a reperfusão nessa dose mais baixa.
[0062] O dano cardíaco associado com I/R nesse modelo foi intimamente correlacionado com a quantidade substancial de PMNs se infiltrando no miocárdio no período de reperfusão de 45 min. Durante a reperfusão, uma quantidade significativa de PMNs transmigraram para dentro do miocárdio, aumentando de menos de 25 PMN/mm2 em corações Sham I/R para mais de 180 PMN/mm2 em corações I/R + PMN no fim do período de reperfusão (figura 4a). Ao contrário, corações traPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 26/73
21/38 tados com I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC ζ experimentaram uma redução significativa de 20 ± 6%, 46 ± 4% e 48 ± 3% na infiltração de PMN no tecido cardíaco pós-reperfundido em 1, 2,5 e 5 mM (p < 0,01), respectivamente; e esse efeito foi bloqueado na presença do LNAME. Além disso, os corações tratados com 2,5 e 5 mM tiveram PMNs significativamente menos infiltrados em comparação com corações tratados com 1 mM (p < 0,01) (figura 4a).
[0063] A aderência do PMN ao endotélio vascular coronário também foi avaliada na avaliação dos PMNs infiltrados e intravasculares totais. Conforme visto na figura 4b, a quantidade de PMNs aderentes ao endotélio coronário não foi significativamente reduzida em corações I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM) (43 ± 10%, p < 0,06) (figura 4b). A liberação de NO do endotélio aórtico de rato foi medida para determinar se o inibidor de peptídeo da PKC ζ proporciona cardioproteção por um mecanismo envolvendo a liberação de NO endotelial aumentada. Na figura 5, o endotélio tratado com inibidor de peptídeo da PKC ζ gerou significativamente mais NO por 47 ± 2% (2,5 mM, p < 0,05), 54 ± 5% (5 mM, p < 0,01) e 91 ± 15% (15 mM, p < 0,01) em comparação com a liberação de NO basal. Em 1 mM, a liberação de NO não foi significativamente diferente da liberação de NO basal. Acetilcolina (200 nM) foi usada como um controle positivo no ensaio de NO, e aumentou significativamente a liberação de NO por 67 ± 4% (p < 0,01) em comparação com a liberação de NO basal. O inibidor da eNOS, LNAME, foi usado como outro controle para diminuir a liberação basal de NO até zero. Tanto a acetilcolina quanto a produção de NO induzida pelo inibidor de peptídeo da PKC ζ foram completamente inibidas pelo tratamento do endotélio com L-NAME (400 mM). Para atribuir a fonte do NO ao endotélio, experimentos com segmentos aórticos de rato (desnudados) com endotélio removido foram incubados com inibidor de peptídeo da PKC ζ (5 mM) e não foram diferentes dos segmenPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 27/73
22/38 tos tratados com L-NAME.
[0064] Outro mecanismo de efeitos cardioprotetores do inibidor de peptídeo da PKC ζ pode estar relacionado com a inibição da liberação de superóxido. O inibidor de peptídeo da PKC ζ inibiu significativamente a liberação da superóxido por 33 - 82% (2,5 - 15 μΜ, p < 0,01), exceto em 1 μΜ onde não houve diferença das suspensões de PMNs de rato estimulados por PMA (figura 6). SOD (10 mg/ml) foi usado como um controle positivo nos ensaios de superóxido, e liberou superóxido degradado produzido pelos PMNs de rato estimulados por PMA em 99% (p < 0,01; figura 6).
EXEMPLO 2 - EFEITOS DO INIBIDOR DE PEPTÍDEO DA PKC bII [0065] Experimentos com inibidor de peptídeo da PKCb II foram efetuados substancialmente conforme descrito no Exemplo 1 para os inibidores de peptídeo da PKCZ.
[0066] Os seguintes grupos de corações de rato perfundidos isolados foram usados:
[0067] Grupo 1: Corações de Sham I/R não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs, mas foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) por 35 min em perfusão (o mesmo ponto de tempo que poderia ser dado aos corações I/R 5 ml de plasma, 15 min de registros de linha de base mais 20 minutos de isquemia). Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se o coração de rato isolado pode manter a LVDP e a +dP/dtmax durante o protocolo de 80 min (n = 6).
[0068] Grupo 2: Corações de inibidor de peptídeo da PKC βΠ + Sham I/R (10 mM) não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs. A esses corações foi administrado o inibidor de peptídeo da PKC bII (10 mM, dissolvido em plasma a partir de um estoque 5 mM em H2O) por 35 minutos em perfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se o inibidor de peptídeo da PKC bII causa
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23/38 um efeito cardiotônico ou cardiodepressor (n = 6).
[0069] Grupo 3: Corações I/R foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) durante os primeiros 5 min de reperfusão, mas não foram perfundidos com PMNs. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia, seguido por reperfusão atordoou o coração, mas a LVDP e a +dP/dtmax irão se recuperar para os valores de linha de base (iniciais) no término do período de reperfusão de 45 minutos (n = 6).
[0070] Grupo 4: Corações com I/R + inibidor de peptídeo da PKC bII (10 mM, dissolvido em plasma) foram submetidos a 20 min de isquemia e não foram perfundidos com PMNs. Esses corações foram perfundidos com 5 ml de plasma + inibidor de peptídeo da PKC βΠ durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se o inibidor de peptídeo da PKC bII causou um efeito cardiodepressor no ajuste de I/R sem PMNs (n = 6).
[0071] Grupo 5: Corações I/R + PMNs foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) e PMNs (ressuspensos em 5 ml de tampão de Krebs) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia seguidos por 45 min de reperfusão na presença de PMNs (200 x 106) resultou em uma disfunção contrátil cardíaca sustentada durante os 45 min de reperfusão em comparação com os valores de linha de base iniciais (n = 9).
[0072] Grupo 6: Corações com I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC bII (1 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo PKC βΠ 1 mM (dissolvido em plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC βΠ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 29/73
24/38 zida (n = 6).
[0073] Grupo 7: Corações com I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC bII (5 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo de PKC bII 5 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC bII em uma concentração mais alta do inibidor de peptídeo da PKC bII na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 7).
[0074] Grupo 8. Corações com I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC bII (10 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC bII 10 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC bII em uma concentração mais elevada do inibidor de peptídeo da PKC bII na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 7).
[0075] Grupo 9: Corações com I/R + PMNs + inibidor de peptídeo da PKC bII (10 mM) + NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 50 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo de PKC bII 10 mM (dissolvido em 5 ml de plasma) e 50 mM de L-NAME (dissolvido em tampão de Krebs a partir de um estoque de 50 mM em H2O) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. O L-NAME (50 mM) foi continuamente infundido no coração através do período de reperfusão de 45 min. Esses corações representaram um grupo para determinar se o efeito cardioprotetor da inibição do peptídeo da PKC bII poderia ser bloqueado com um inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME) (n = 6).
[0076] Estudos anteriores mostraram que corações Sham I/R dados com PMNs não exibiram alterações a partir dos valores de controPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 30/73
25/38 le iniciais (Lefer et al., Circulation 100: 178-184, 1999). Os dados foram recuperados a cada 5 min por 45 min após a reperfusão. Depois de cada experimento, o ventrículo esquerdo foi isolado, fixado em paraformaldeído 4% e estocado a 4°C para posterior análise histológica. [0077] Figura 7 mostrou o curso de tempo da função contrátil cardíaca (LVDP) para os grupos Sham I/R, I/R, I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC βΙΙ (10 μΜ) e I/R + PMN, e ilustrou as alterações na LVDP durante o período de perfusão de 80 min. Os corações no grupo Sham I/R permaneceram em 103 ± 4% dos valores de linha de base iniciais da LVDP para a duração inteira do período de perfusão. Os corações no grupo I/R experimentaram uma diminuição na LVDP durante os estágios iniciais de reperfusão, mas pelo fim da reperfusão eles recuperaram para 94% ± 6% os valores de linha de base iniciais. Entretanto, os corações no grupo I/R + PMN exibiram severa disfunção contrátil cardíaca, somente recuperando até 43 ± 5% dos valores de linha de base iniciais pelo fim da reperfusão. Ao contrário, os corações no I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC bII (10 μΜ), embora apresentando inicialmente uma depressão na LVDP de 61 ± 10% dos valores de linha de base iniciais em 15 min na reperfusão, recuperaram até 82 ± 9% da linha de base.
[0078] Para estabelecer se o inibidor de peptídeo da PKC bII produziu quaisquer efeitos inotrópicos diretos na função contrátil cardíaca, corações Sham I/R foram perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC bII (10 mM). Esse grupo serviu como um dos controles para o estudo. Esses corações não mostraram qualquer alteração significativa na LVDP (figura 8) ou +dP/dtmax (figura 9). no fim do período de reperfusão de 80 min, conseqüentemente, indicando que nessa dose o inibidor de peptídeo da PKC bII não teve efeito direto na função contrátil cardíaca. Uma dose de 20 mM do inibidor de peptídeo da PKC bII foi testada num coração Sham I/R e não houve efeitos cardiodepressores
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26/38 percebidos nessa dose.
[0079] Figuras 8 e 9 mostraram os valores inicial e final para a LVDP e a +dP/dtmax respectivos corações perfundidos isolados. Não houve diferença significativa entre os valores de linha de base de todos os grupos estudados. Também não houve diferença significativa entre os valores inicial e final da LVDP e da dP/dtmax para os grupos Sham I/R, I/R, Sham I/R + inibidor de peptídeo da PKC βΠ (5 mM), e I/R + inibidor de peptídeo da PKC βΠ (10 mM). Entretanto, houve uma diferença significativa entre os valores inicial e final da LVDP e da +dP/dtmax para o grupo I/R + PMN. Um decréscimo significativo (p < 0,01) da linha de base inicial de 43 ± 5% na LVDP e de 42 ± 6% na +dP/dtmax aos 45 minutos após a reperfusão foi observado.
[0080] A presença do inibidor de peptídeo da PKC βΠ em uma dose de 5 mM e de 10 mM atenuou o decréscimo na LVDP e na +dP/dtmax associado com a perfusão pós-isquêmica com PMNs. A dose de 10 mM foi a mais cardioprotetora, uma vez que os corações no I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC βΠ (10 mM) recuperaram até 82 ± 9%e 79 ± 10% da linha de base inicial aos 45 minutos após a reperfusão para a LVPD e a +dP/dtmax, respectivamente. Esses valores foram significativamente diferentes do I/R + PMN aos 45 minutos após a reperfusão (p < 0,01). A dose de 5 mM também foi cardioprotetora, embora não na mesma extensão que a dose de10 mM, uma vez que os corações no I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC βΠ (5 mM) recuperaram até 69 ± 7% e 63 ± 7% para a LVDP e para a +dP/dtmax da linha de base inicial aos 45 min após a reperfusão, respectivamente. Os valores de LVDP para a dose de 5 mM foram significativamente diferentes do I/R + PMN aos 45 minutos após a reperfusão (p < 0,05). A dose de 1 mM do inibidor de peptídeo da PKC βΠ não foi cardioprotetora, uma vez que os corações no grupo I/R + PMN + inibidor de peptídeo da PKC βΠ (1 mM) somente recuperaram até 57 ± 4% e 53 ± 6% para a
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LVDP e +dP/dtmax respectivamente. Os valores finais da LVDP e da +dP/dtmax no grupo de dose de 1 mM não foram significativamente diferentes dos valores finais do grupo I/R + PMN.
[0081] Os efeitos cardioprotetores do inibidor de peptídeo da PKC bII (10 mM) foram bloqueados pela presença do L-NAME (50 mM) no grupo IR + PMN + inibidor de peptídeo da PKC βΠ (10 mM) + L-NAME (50 mM), uma vez que os valores de LVDP e de +dP/dt no final do período de reperfusão de 45 min foram de somente 56 ± 2% e de 53 ± 5% dos valores de linha de base iniciais, respectivamente, e não foram significativamente diferentes dos valores finais do grupo IR + PMN (figuras 3 e 4).
[0082] A liberação de NO do endotélio aórtico de rato foi medida para determinar se o inibidor de peptídeo da PKC βΠ fornece cardioproteção por um mecanismo envolvendo a liberação de NO endotelial aumentada. figura 10 mostrou que segmentos do endotélio tratado com inibidor de peptídeo da PKC βΠ geraram significativamente mais NO em comparação com a liberação de NO basal em 5 mM (p < 0,05) e 10 mM (p < 0,01). O valor basal de liberação de NO foi medido em 1,85 ± 0,18 pmols de NO/mg de tecido. Houve um efeito de doseresposta definido no estímulo do endotélio com inibidor de peptídeo da PKC bII, uma vez que o 1 mM, 2,5 mM, 5 mM e 10 mM produziram um aumento na liberação de NO acima da basal de 0,75 ± 0,19, 1,91 ± 0,44, 2,54 ± 0,29 e 3,49 ± 0,62 pmols de NO/mg de tecido, respectivamente.
[0083] Acetilcolina (Ach, 500 nM) foi usada como controle positivo nesse ensaio e estimulou o endotélio, causando um aumento de 3,75 ± 0,58 pmols de NO/mg de tecido, acima do valor basal da linha de base. L-NAME foi usado como outro controle para diminuir a liberação basal do NO até zero. Tanto a produção de acetilcolina quanto a produção de inibidor de peptídeo da PKC βΠ de NO foram completamente
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28/38 inibidas pelo tratamento do endotélio com L-NAME (400 μΜ).
[0084] Outro mecanismo que pode contribuir com os efeitos cardioprotetores (isto é, LVDP) do inibidor de peptídeo da PKC βΠ pode ser a inibição da liberação do PMN superóxido. O inibidor de peptídeo da PKC βΠ inibiu significativamente a liberação de superóxido (isto é, absorvância) das suspensões de PMNS de rato estimulado por fMLP de 0,13 ± 0,01 até 0,05 ± 0,009 (p < 0,01), 0,02 ± 0,004 (p < 0,01), e 0,02 ± 0,007 (p < 0,01) para 5 pM, 10 pM e 20 pM respectivamente (figura 11). Não houve inibição significativa do superóxido na dose de 1 mM. SOD (10 mg/ml) foi usada como um controle positivo e ela retirou o superóxido liberado pelos PMNs de rato estimulados por fMLP, reduzindo a resposta para 0,0016 ± 0,0006.
EXEMPLO 3 - EFEITOS DOS INIBIDORES DE PEPTÍDEOS DA PKC bII E DA PKC ζ EM COMBINAÇÃO [0085] Experimentos com os inibidores de peptídeos da PKC βΠ e da PKC ζ foram efetuados substancialmente conforme descrito nos Exemplos 1 e 2.
[0086] Os seguintes grupos de corações de rato perfundidos isolados foram usados:
[0087] Grupo 1: Corações de Sham I/R não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs, mas foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) a 35 min em perfusão (o mesmo ponto de tempo que os corações I/R poderia ser dado 5 ml de plasma, 15 min de registros de linha de base mais 20 minutos de isquemia). Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se o coração de rato isolado pode manter a LVDP e a +dP/dtmax durante o protocolo de 80 min (n = 6).
[0088] Grupo 2: Corações de Sham I/R + inibidores de peptídeo de PKC bII (10 mM) + PKC ζ (5 mM) não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs. A esses corações foi administrado
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29/38 os inibidores de peptídeo da PKC βΙΙ e da PKC ζ (10 μΜ e 5 μΜ, dissolvido em plasma a partir de um estoque 5 mM em H2O) por 35 minutos em perfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se os inibidores de peptídeo causam um efeito cardiotônico ou cardiodepressor (n = 6).
[0089] Grupo 3: Corações I/R foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) durante os primeiros 5 min de reperfusão, mas não foram perfundidos com PMNs. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia, seguido por reperfusão atordoou o coração, mas a LVDP e a +dP/dtmax irão se recuperar para os valores de linha de base (iniciais) no término do período de reperfusão de 45 minutos (n = 6).
[0090] Grupo 4: Corações com I/R + inibidores de peptídeo PKC bII (10 mM) + PKC ζ (5 mM) (dissolvido em plasma) foram submetidos a 20 min de isquemia e não foram perfundidos com PMNs. Esses corações foram perfundidos com 5 ml de plasma + inibidores de peptídeo da PKC bII + PKC ζ durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se os inibidores de peptídeo causam um efeito cardiodepressor no ajuste de I/R sem PMNs (n = 6).
[0091] Grupo 5: Corações I/R + PMNs foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) e PMNs (ressuspensos em 5 ml de tampão de Krebs) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia seguidos por 45 min de reperfusão na presença de PMNs (200 x 106) resultou em uma disfunção contrátil cardíaca sustentada durante os 45 min do período de reperfusão em comparação com os valores de linha de base iniciais (n = 11).
[0092] Grupo 6: Corações I/R + PMNs + inibidores de peptídeo
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PKC bII (5 μΜ) + PKC ζ (2,5 μΜ) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo PKC βΠ 1 mM (dissolvido em plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC bII na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 7).
[0093] Grupo 7: Corações com I/R + PMNs + inibidores de peptídeo da PKC bII (10 mM) + PKC ζ (2,5 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo de PKC bII 5 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC bII em uma concentração mais alta do inibidor de peptídeo da PKC bII na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6).
[0094] Grupo 8. Corações com I/R + PMNs + inibidores de peptídeo da PKC bII (10 mM) + PKC ζ (5 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC bII 10 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da inibição da PKC bII em uma concentração mais elevada do inibidor de peptídeo PKC bII na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 7).
[0095] Grupo 9: Corações com I/R + PMNs + inibidores de peptídeo da PKC bII (10 mM) + PKC ζ (5 mM) + NG-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME, 50 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo de PKC bII 10 mM e PKC 5 mM (dissolvido em 5 ml de plasma) e 50 mM de L-NAME (dissolvido em tampão de Krebs a partir de um estoque de 50 mM em H2O) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. O L-NAME (50
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31/38 μΜ) foi continuamente infundido no coração através do período de reperfusão de 45 min. Esses corações representaram um grupo para determinar se o efeito cardioprotetor dos inibidores de peptídeo poderia ser bloqueado com um inibidor da óxido nítrico sintase (L-NAME) (n = 5).
[0096] Do curso de tempo da figura 12 a combinação de inibidores de peptídeo da PKC bII (10 mM) e da PKC ζ (5 mM) resultou em uma taxa de recuperação parelhando aquela do coração I/R. Esse resultado não foi observado quando qualquer um dos inibidores de peptídeo da PKC bII (10 mM) ou PKC ζ (5 mM) foi usado sozinho (Exemplos 1 e 2), onde a taxa de recuperação do coração tratado com inibidor de peptídeo foi mais baixa do que aquela do coração I/R.
[0097] Figuras 13 e 14 mostraram os valores inicial e final para a LVDP e a +dP/dtmax a partir de corações perfundidos isolados, respectivamente. Conforme esperado e semelhantemente aos Exemplos 1 e 2, os valores inicial e final da LVDP e da +dP/dt para o grupo I/R + PMN mudaram significativamente, diminuindo (p < 0,01) da linha de base inicial em cerca de 50% na LVDP e em cerca de 45% na +dP/dtmax em 45 min de pós-reperfusão.
[0098] A presença de inibidores de peptídeo da PKC bII e da PKC ζ atenuaram o decréscimo na LVDP e na +dP/dt associado com a perfusão pós-isquêmica com PMNs. A dose dos inibidores de peptídeo de PKC bII 10 mM e de PKC ζ 5 mM foi a mais cardioprotetora. O aumento da dosagem dos inibidores de peptídeo da PKC bII de 5 mM para 10 mM não resultou em uma alteração significativa no efeito cardioprotetor. Por outro lado, o aumento da dosagem dos inibidores de peptídeo da PKC ζ de 2,5 mM para 5 mM resultou num acréscimo marginal no efeito cardioprotetor.
[0099] Os efeitos cardioprotetores da combinação dos inibidores de peptídeo da PKC bII e da PKC ζ foram bloqueados pela presença
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32/38 de L-NAME (50 μΜ) no grupo I/R + PMNs + inibidores de peptídeo PKC bII (10 mM) + PKC ζ (5 mM) + L-NAME (50 mM), uma vez que os valores de LVDP e de +dP/dtmax no fim do período de reperfusão de 45 min foram somente de 50% e de 40% dos valores de linha de base iniciais, respectivamente, e não foram significativamente diferentes dos valores finais do grupo IR + PMN (figuras 13 e 14).
[00100] O dano cardíaco associado com I/R nesse modelo foi intimamente correlacionado com a quantidade substancial de PMNs infiltrados no miocárdio no período de reperfusão de 45 min. Durante a reperfusão, um número significativo de PMNs transmigraram para dentro do miocárdio, aumentando de menos de 25 PMN/mm2 em corações Sham I/R até mais de 175 PMN/mm2 em corações I/R + PMN no final do período de reperfusão (figura 15). Ao contrário, os corações tratados com I/R + PMN + inibidores de peptídeos PKC bII + PKC ζ experimentaram uma redução significativa na infiltração de PMN no tecido cardíaco pós-reperfundido. Esse efeito foi bloqueado na presença de L-NAME. Além disso, a duplicação da dosagem do inibidor de peptídeo PKC bII de 5 mM para 10 mM, durante a manutenção da dosagem do inibidor de peptídeo da PKC ζ em 2,5 mM, não diminuiu significativamente a infiltração de PMN. Por outro lado, a duplicação da dosagem do inibidor de peptídeo de 2,5 mM para 5 mM, durante a manutenção da dosagem do inibidor de peptídeo da PKC bII em 10 mM, diminuiu marginalmente a infiltração de PMN (figura 15).
[00101] A aderência de PMN ao endotélio vascular coronário também foi avaliada com a avaliação dos PMNs intravascular e infiltrado total. Conforme visto na figura 16, a quantidade de PMNs aderentes no endotélio coronário foi reduzida nos corações I/R + PMN + inibidores de peptídeo PKC bII + PKC ζ. Esse efeito protetor foi revertido na presença do L-NAME.
[00102] Na figura 17, o endotélio dos corações tratados com inibidoPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 38/73
33/38 res de peptídeo da PKC βΙΙ e da PKC ζ gerou significativamente mais liberação de NO, particularmente em uma dosagem de inibidores de peptídeo da PKC bII de 10 mM e da PKC ζ de 5 mM, em comparação com a liberação de NO basal.
[00103] Acetilcolina (500 nM) foi usada como um controle positivo no ensaio de NO, e aumentou significativamente a liberação de NO em comparação com a liberação de NO basal. L-NAME foi usado como outro controle para diminuir a liberação basal de NO para zero. A produção de NO induzida tanto por acetilcolina quanto por inibidores peptídicos foi completamente inibida pelo tratamento do endotélio com LNAME (400 mM).
[00104] Outro mecanismo de efeitos cardioprotetores dos inibidores de peptídeo da PKC bII e da PKC ζ pode estar relacionado com a inibição da liberação de superóxido. Conforme visto a partir da figura 18, a combinação de inibidores de peptídeos da PKC bII e da PKC ζ inibiu significativamente a liberação de superóxido em comparação com suspensões de PMNs de rato estimulados por PMA ou em comparação com inibidor de peptídeo da PKC bII ou da PKC ζ usado sozinho. SOD (10 mg/ml) foi usado como um controle positivo nos ensaios de superóxido, e diminuiu a liberação de superóxido produzido por PMNs de rato estimulados por PMA em 99% (figura 18).
[00105] Todos os exemplos mostraram que a presença de uma quantidade suficiente de inibidor de peptídeo da PKC bII e/ou de inibidor de peptídeo da PKC ζ proporcionou um efeito cardioprotetor significativo pela atenuação da disfunção cardíaca induzida por PMN. EXEMPLO 4 - EFEITOS DO ATIVADOR DE PEPTÍDEO DA PKCd [00106] Experimentos com ativadores de peptídeo da PKCô foram efetuados substancialmente conforme descrito no Exemplo 1 para o inibidor de peptídeo da PKCZ.
[00107] Os seguintes grupos de corações de rato perfundidos isolaPetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 39/73
34/38 dos foram usados:
[00108] Grupo 1: Corações Sham I/R não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs, mas foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) por 35 min em perfusão (o mesmo ponto de tempo que poderia ser dado aos corações I/R 5 ml de plasma, 15 min de registros de linha de base mais 20 minutos de isquemia). Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se o coração de rato isolado pode manter a LVDP e a +dP/dtmax durante o protocolo de 80 min (n = 6).
[00109] Grupo 2: Corações de ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM) + Sham I/R não foram submetidos à isquemia e não foram perfundidos com PMNs. A esses corações foi administrado o ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM, dissolvido em plasma a partir de um estoque 5 mM em H2O) por 35 minutos em perfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se o ativador de peptídeo da PKC δ causa um efeito cardiotônico ou cardiodepressor (n = 6).
[00110] Grupo 3: Corações I/R foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) durante os primeiros 5 min de reperfusão, mas não foram perfundidos com PMNs. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia, seguido por reperfusão atordoou o coração, mas a LVDP e a +dP/dtmax irão se recuperar para os valores de linha de base (iniciais) no término do período de reperfusão de 45 minutos (n = 6).
[00111] Grupo 4: Corações com I/R + ativador de peptídeo PKC δ (10 mM, dissolvido em plasma) foram submetidos a 20 min de isquemia e não foram perfundidos com PMNs. Esses corações foram perfundidos com 5 ml de plasma + ativador de peptídeo da PKC δ durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esse grupo foi empregado para determinar se o ativador de peptídeo da PKC δ causou um efeito cardiodePetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 40/73
35/38 pressor no ajuste de I/R sem PMNs (n = 6).
[00112] Grupo 5: Corações I/R + PMNs foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com 5 ml de plasma (1 ml/min) e PMNs (ressuspensos em 5 ml de tampão de Krebs) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo de controle para determinar se 20 min de isquemia seguidos por 45 min de reperfusão na presença de PMNs (200 x 106) resultou em uma disfunção contrátil cardíaca sustentada durante os 45 min de reperfusão em comparação com os valores de linha de base iniciais (n = 10).
[00113] Grupo 6: Corações com I/R + PMNs + ativador de peptídeo da PKC δ (1 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com inibidor de peptídeo da PKC bII 1 mM (dissolvido em plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 min de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da ativação da PKC δ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6).
[00114] Grupo 7: Corações com I/R + PMNs + ativador de peptídeo da PKC δ (5 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e perfundidos com inibidor de peptídeo de PKC bII 5 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da ativação da PKC δ em uma concentração mais alta do ativador de peptídeo da PKC δ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6).
[00115] Grupo 8. Corações com I/R + PMNs + ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM) foram submetidos a 20 min de isquemia e foram perfundidos com ativador de peptídeo da PKC δ 10 mM (dissolvido no plasma) e PMNs (200 x 106) durante os primeiros 5 minutos de reperfusão. Esses corações representaram um grupo para determinar o efeito da ativação da PKC δ em uma concentração mais elevada do
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36/38 ativador de peptídeo da PKC δ na atenuação da disfunção contrátil cardíaca induzida por PMN (n = 6).
[00116] Estudos anteriores mostraram que corações sham I/R dados com PMNs não exibiram alterações a partir dos valores de controle iniciais (Lefer et al., Circulation 100: 178-184, 1999). Os dados foram recuperados a cada 5 min por 45 min após a reperfusão. Depois de cada experimento, o ventrículo esquerdo foi isolado, fixado em paraformaldeído 4% e estocado a 4 °C para posterior análise histológica. [00117] Figura 19 mostrou o curso de tempo da função contrátil cardíaca (LVDP) para os grupos Sham I/R, I/R, I/R + PMN + ativador de peptídeo PKCd (10 μΜ) e I/R + PMN, e ilustrou as alterações na LVDP durante o período de perfusão de 80 min. Os corações no grupo Sham I/R permaneceram em 103 ± 4% dos valores de linha de base iniciais da LVDP para a duração inteira do período de perfusão. Os corações no grupo I/R experimentaram uma diminuição no LVDP durante os estágios iniciais da reperfusão, mas no fim da reperfusão eles recuperaram até 82 ± 3% dos valores de linha de base iniciais. Entretanto, os corações no grupo I/R + PMN exibiram severa disfunção contrátil cardíaca, somente recuperando 46 ± 9% dos valores da linha de base inicial no fim da reperfusão. Ao contrário, os corações no I/R + PMN + ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM), embora apresentando inicialmente uma depressão na LVDP de 58 ± 8% dos valores de linha de base iniciais aos 15 min na reperfusão, recuperaram para 83 ± 3% da linha de base.
[00118] Para estabelecer se o ativador de peptídeo da PKC δ produziu quaisquer efeitos inotrópicos diretos na função contrátil cardíaca, corações Sham I/R foram perfundidos com ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM). Esse grupo serviu como um dos controles para o estudo. Esses corações não apresentaram qualquer alteração significativa na LVDP (figura 20) ou +dP/dtmax (figura 21) no final do período de rePetição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 42/73
37/38 perfusão de 80 min, dessa forma, indicando que nessa dose o ativador de peptídeo da PKC δ não teve efeito direto na função contrátil cardíaca.
[00119] Figuras 20 e 21 mostraram os valores inicial e final para a LVDP e para a dP/dtmax a partir de corações perfundidos isolados, respectivamente. Não houve diferença significativa entre os valores de linha de base iniciais de todos os grupos estudados. Também não houve diferença significativa entre os valores inicial e final da LVDP e da +dP/dtmax para os grupos Sahm I/R, I/R, Sham I/R + ativador de peptídeo da PKC δ I/R + ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM). Entretanto, houve uma diferença significativa entre os valores inicial e final da LVDP e da +dP/dtmax para o grupo I/R + PMN. Um decréscimo significativo (p < 0,01) da linha de base inicial de 46 ± 9% na LVDP e de 45 ± 8% na +dP/dtmax foi observado 45 min após a reperfusão.
[00120] A presença do ativador de peptídeo da PKC δ em uma dose de 5 mM e de 10 mM atenuou o decréscimo na LVDP e na +dP/dtmax associado com a perfusão pós-isquêmica com PMNs. A dose de 10 mM foi a mais cardioprotetora, uma vez que os corações no I/R + PMN + ativador de peptídeo da PKC δ (10 mM) recuperaram até 83 ± 3% e 79 ± 5% da linha de base inicial em 45 min após a reperfusão para a LVDP e a +dP/dmax, respectivamente. Esses valores foram significativamente diferentes do I/R + PMN em 45 min após a reperfusão (p < 0,01). A dose de 5 mM também foi cardioprotetora, embora não na mesma extensão que a dose de 10 mM, uma vez que os corações no I/R + PMN + ativador de peptídeo da PKC δ (5 mM) recuperaram até 80 ± 9% e 67 ± 7% para a LVDP e a +dP/dtmax da linha de base inicial aos 45 min após a reperfusão, respectivamente. Os valores de VLDP para a dose de 5 mM foram significativamente diferentes do I/R + PMN aos 45 min após a reperfusão (p < 0,05). A dose de1 mM do ativador de peptídeo da PKC δ não foi cardioprotetora, uma vez que os corações
Petição 870180007064, de 26/01/2018, pág. 43/73
38/38 no grupo I/R + PMN + ativador de peptídeo da PKC δ (1 μΜ) somente recuperaram para 60 ± 13% e 51 ± 5% para a LVDP e para a +dP/dtmax, respectivamente. Os valores finais da LVDP e da +dP/dtmax no grupo de dose de 1 mM não foram significativamente diferentes dos valores finais do grupo I/R + PMN.
[00121] Um mecanismo que pode contribuir aos efeitos cardioprotetores (isto é, LVDP) do ativador de peptídeo da PKC δ pode ser a inibição da liberação da PMN superóxido. O ativador de peptídeo da PKC δ inibiu significativamente a liberação de superóxido (isto é, absorvância) das suspensões de PMNS de rato estimulado por PMA de 0,49 ± 0,03 até 0,32 ± 0,03 (p < 0,01), 0,32 ± 0,02 (p < 0,01), para 5 mM e 10 mM, respectivamente (figura 22). Não houve inibição significativa do superóxido na dose de 1 mM.
[00122] Embora certas modalidades preferidas da invenção tenham sido especificamente descritas aqui, será aparente para os indivíduos versados na técnica aos quais a invenção pertence que variações e modificações das várias modalidades mostradas e aqui descritas podem ser feitas sem sair do espírito e escopo da invenção. Concordantemente, é tencionado que a invenção seja somente limitada na extensão necessária pelas reivindicações em anexo e pelas regras aplicáveis da lei.
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Claims (103)
- REIVINDICAÇÕES1. Solução para perfusão, conservação e/ou reperfusão para conservação de órgão, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um inibidor peptídico da proteína quinase C bII (PKCbII) e/ou pelo menos um inibidor peptídico da proteína quinase C ζ (PKCZ) e/ou pelo menos um ativador peptídico da PKCô, exceto quando o inibidor peptídico da PCKZ é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2 e GÕ6983 .
- 2. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os inibidores peptídicos são dissolvidos em solução salina.
- 3. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda cloreto de potássio.
- 4. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é a SEQ ID NO: 1.
- 5. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um ativador peptídico da PKCô é a SEQ ID NO: 3.
- 6. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é de cerca de 5 a 10 μΜ.
- 7. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração do pelo menos um ativador peptídico da PKCô é de cerca de 5 a 10 μΜ.
- 8. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCZ é de cerca de 2,5 a 5 μΜ.
- 9. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o órgão é o coração.Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 4/172/10
- 10. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o órgão é um órgão de mamífero.
- 11. Solução de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o mamífero é humano.
- 12. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o órgão é conservado para transplante.
- 13. Solução de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os inibidores/ativadores peptídicos são miristolados.
- 14. Método para conservação de um órgão para transplante, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de perfundir o órgão com a solução como definida na reivindicação 1.
- 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativador peptídico são dissolvidos em solução salina.
- 16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cloreto de potássio.
- 17. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é a SEQ ID NO: 1.
- 18. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um ativador peptídico da PKCd é a SEQ ID NO: 3.
- 19. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é de cerca de 5 a 10 mM.
- 20. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um ativador peptídico da PKCd é de cerca de 5 a 10 mM.
- 21. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico daPetição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 5/173/10ΡΚΟζ é de cerca de 2,5 a 5 μΜ.
- 22. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o órgão é o coração.
- 23. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o órgão é um órgão de mamífero.
- 24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o mamífero é humano.
- 25. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o órgão é conservado para transplante.
- 26. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativadores peptídicos são miristolados.
- 27. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de submergir o órgão na solução como definida na reivindicação 1.
- 28. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de menos do que cerca de 20 mL/minuto.
- 29. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de cerca de 1 mL/minuto.
- 30. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão é uma perfusão retrógrada.
- 31. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão dura cerca de 5 minutos.
- 32. Método para proteger um órgão isquêmico de dano, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de perfundir o órgão com a solução, como definida na reivindicação 1.
- 33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativadores peptídicos são dissolvidos em solução salina.Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 6/174/10
- 34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cloreto de potássio.
- 35. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é a SEQ ID NO: 1.
- 36. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um ativador peptídico da PKCô é a SEQ ID NO: 3.
- 37. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é de cerca de 5 a 10 mM.
- 38. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um ativador peptídico da PKCô é de cerca de 5 a 10 mM.
- 39. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCZ é de cerca de 2,5 a 5 mM.
- 40. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o órgão é o coração.
- 41. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o órgão é um órgão de mamífero.
- 42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o mamífero é humano.
- 43. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o órgão é conservado para transplante.
- 44. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativadores peptídicos são miristolados.
- 45. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de submergir o órgão em uma solução, como definida na reivindicação 1.Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 7/175/10
- 46. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de menos do que cerca de 20 mL/minuto.
- 47. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de cerca de 1 mL/minuto.
- 48. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão é uma perfusão retrógrada.
- 49. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão dura cerca de 5 minutos.
- 50. Método para atenuar a disfunção de órgão depois de isquemia, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de perfundir o órgão com a solução como definida na reivindicação 1.
- 51. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativador peptídico estão dissolvidos em solução salina.
- 52. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cloreto de potássio.
- 53. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é a SEQ ID NO: 1.
- 54. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um ativador peptídico da PKCô é a SEQ ID NO: 3.
- 55. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é de cerca de 5 a 10 mM.
- 56. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um ativador peptídico da PKCô é de cerca de 5 a 10 mM.Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 8/176/10
- 57. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCZ é de cerca de 2,5 a 5 mM.
- 58. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o órgão é o coração.
- 59. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o órgão é um órgão de mamífero.
- 60. Método de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o mamífero é humano.
- 61. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o órgão é conservado para transplante.
- 62. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativadores peptídicos são miristolados.
- 63. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de submergir o órgão na solução, como definida da reivindicação 1.
- 64. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de menos do que cerca de 20 mL/minuto.
- 65. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de cerca de 1 mL/minuto.
- 66. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão é uma perfusão retrógrada.
- 67. Método de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão dura cerca de 5 minutos.
- 68. Método para manter a liberação de óxido nítrico em um órgão isquêmico, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de perfundir o órgão com a solução como definida na reivindicação 1.
- 69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizadoPetição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 9/177/10 pelo fato de que os inibidores/ativador peptídico são dissolvidos em solução salina.
- 70. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cloreto de potássio.
- 71. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é a SEQ ID NO: 1.
- 72. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCô é a SEQ ID NO: 3.
- 73. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é de cerca de 5 a 10 mM.
- 74. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um ativador peptídico da PKCô é de cerca de 5 a 10 mM.
- 75. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCZ é de cerca de 2,5 a 5 mM.
- 76. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o órgão é o coração.
- 77. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o órgão é um órgão de mamífero.
- 78. Método de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o mamífero é humano.
- 79. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que o órgão é conservado para transplante.
- 80. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativador peptídicos são miristolados.
- 81. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizadoPetição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 10/178/10 pelo fato de que compreende ainda a etapa de submergir o órgão na solução, como definida na reivindicação 1.
- 82. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de menos do que cerca de 20 mL/minuto.
- 83. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de cerca de 1 mL/minuto.
- 84. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão é uma perfusão retrógrada.
- 85. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão dura cerca de 5 minutos.
- 86. Método para proteger um órgão de danos após o isolamento do sistema circulatório, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de perfundir o órgão com a solução como definida na reivindicação 1.
- 87. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativador peptídicos são dissolvidos em solução salina.
- 88. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cloreto de potássio.
- 89. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é a SEQ ID NO: 1.
- 90. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um ativador peptídico da PKCô é a SEQ ID NO: 3.
- 91. 86Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCbII é de cerca de 5 a 10 mM.Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 11/179/10
- 92. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um ativador peptídico da PKCô é de cerca de 5 a 10 mM.
- 93. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a concentração do pelo menos um inibidor peptídico da PKCZ é de cerca de 2,5 a 5 mM.
- 94. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que o órgão é o coração.
- 95. Método de acordo com a reivindicação86, caracterizado pelo fato de que o órgão é um órgão de mamífero.
- 96. Método de acordo com a reivindicação95, caracterizado pelo fato de que o mamífero é humano.
- 97. Método de acordo com a reivindicação86, caracterizado pelo fato de que o órgão é conservado para transplante.
- 98. Método de acordo com a reivindicação86, caracterizado pelo fato de que os inibidores/ativadores peptídicos são miristolados.
- 99. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de submergir o órgão em uma solução, como definida na reivindicação 1.
- 100. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de menos do que cerca de 20 mL/minuto.
- 101. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão ocorre em uma taxa de cerca de 1 mL/minuto.
- 102. Método de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão é uma perfusão retrógrada.
- 103. Método de acordo com a reivindicação 86,Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 12/1710/10 caracterizado pelo fato de que a etapa de perfusão dura cerca de 5 minutos.Petição 870180140241, de 11/10/2018, pág. 13/17
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| US20070148628A1 (en) * | 2005-12-09 | 2007-06-28 | Philadelphia College Of Osteopathic Medicine | Organ preservation and/or perfusion |
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| US20090156488A1 (en) * | 2007-09-12 | 2009-06-18 | Zensun (Shanghai) Science & Technology Limited | Use of neuregulin for organ preservation |
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| US20130011823A1 (en) | 2011-04-14 | 2013-01-10 | Hassanein Waleed H | Organ care solution for ex-vivo machine perfusion of donor lungs |
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| RU2535036C1 (ru) * | 2013-09-26 | 2014-12-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний" Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ФГБУ "НИИ КПССЗ" СО РАМН) | Способ презервирования миокарда при трансплантации |
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|---|---|---|---|---|
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| FR2785501B1 (fr) * | 1998-11-10 | 2001-01-05 | Centre Nat Rech Scient | Solution de perfusion et/ou de conservation et/ou de reperfusion lors de la transplantation d'organes |
| GB9905503D0 (en) * | 1999-03-10 | 1999-05-05 | Adprotech Plc | Novel compound formulations and methods of delivery |
| JP5230042B2 (ja) * | 1999-06-02 | 2013-07-10 | 株式会社ビーエムジー | 動物の細胞または臓器の保存剤およびその保存方法。 |
| JP2002060346A (ja) * | 2000-05-19 | 2002-02-26 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | 新規な虚血・再灌流障害抑制剤 |
| JP2002060301A (ja) * | 2000-08-17 | 2002-02-26 | Seikagaku Kogyo Co Ltd | 臓器保存液 |
| GB0028414D0 (en) * | 2000-11-22 | 2001-01-03 | Univ Leeds | Flush preservation solution |
| WO2002057413A2 (en) * | 2001-01-18 | 2002-07-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptides for activation and inhibition of delta pkc |
| US6664266B2 (en) * | 2002-03-14 | 2003-12-16 | Children's Medical Center Corporation | Axon regeneration with PKC inhibitiors |
| JP2005527209A (ja) * | 2002-04-22 | 2005-09-15 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 疼痛管理のためのプロテインキナーゼＣγのペプチドインヒビター |
| EP2386310B1 (en) * | 2002-08-28 | 2018-11-07 | Dyax Corp. | Methods for preserving organs and tissues |
| BRPI0410071A (pt) * | 2003-05-08 | 2006-05-23 | Wyeth Corp | métodos para usar no diagnóstico e prognóstico da artrite em um paciente, para usar no monitoramento do curso da artrite em um paciente, para avaliar a eficácia de um tratamento para artrite em um paciente, para triar um composto capaz de inibir a artrite em um paciente e para tratar artrite em um paciente, e, molécula de sirna |
| US7265092B2 (en) * | 2004-09-30 | 2007-09-04 | Kai Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical formulation |
| DK2056851T3 (da) * | 2005-12-09 | 2013-10-14 | Philadelphia College Of Osteopathic Medicine | Organkonservering og/eller -perfusion |
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