BRPI0606839A2 - uso de uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor irreversìvel de receptor de fator de crescimento epidérmico (egfr) - Google Patents

Abstract

USO DE UMA COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO UM INIBIDOR IRREVERSìVEL DE RECEPTOR DE FATOR DE CRESCIMENTO EPIDéRMICO (EGFR). A presente invenção é dirigida a métodos para o tratamento de câncer resistente a gefitinib e/ou erlotinib. Um indivíduo com câncer é monitorado para a progressão do câncer após tratamento com gefitinib e/ou erlotinib. A progressão do câncer é indicativa de que o câncer é resistente a gefitinib e/ou erlotinib. Uma vez que a progressão do câncer é notada, o indivíduo é administrado com uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor irreversível de receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR). Em formas de realização preferidas, o inibidor irreversível de EGFR é EKB-569, HKI-272 e HKI-357.

Description

"MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE CÂNCER"

ANTECEDENTES

Cânceres de células epiteliais, por exemplo, câncer da próstata,câncer da mama, câncer de cólon, câncer de pulmão, câncer pancreático,câncer ovariano, câncer do baço, câncer testicular, câncer do timo, etc, sãodoenças caracterizadas por crescimento anormal, acelerado, de célulasepiteliais. Este crescimento acelerado inicialmente causa a formação dotumor. Eventualmente, metástase em diferentes sítios de órgãos tambémpodem ocorrer. Apesar de progressos terem sido obtidos no diagnóstico etratamento de vários cânceres, estas doenças ainda resultam em significantemortalidade .

Câncer de pulmão permanece a causa líder por morte decâncer em países industrializados. Os cânceres que começam nos pulmões sãodivididos em dois tipos principais, câncer de pulmão de célula não pequena ecâncer de pulmão de célula pequena, dependendo de como as célulasaparecem no microscópio. Câncer de pulmão de célula não pequena(carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma, e carcinoma de célulagrande) geralmente se espalha para outros membros mais lentamente do que ocâncer de pulmão de célula pequena. Cerca de 75 por cento de casos decâncer de pulmão são categorizados como câncer de pulmão de célula nãopequena (por exemplo, adenocarcinomas), e os outros 25 por cento são câncerde pulmão de célula pequena. Câncer de pulmão de célula não pequena(NSCLC) é a causa líder de mortes por câncer nos Estados Unidos, Japão, eEuropa Ocidental. Para pacientes com doença avançada, quimioterapia proveum modesto benefício na sobrevivência, mas ao custo de uma significantetoxicidade, ressaltando a necessidade para agentes terapêuticos que sãoespecificamente marcados para as lesões genéticas que dirigem o crescimentodo tumor (Schiller JH et ai, N Engl J Med, 346: 92-98, 2002).

Receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFR) é umaproteína ligada a membrana de 170 kilodaltons (kDa) expressada sobre asuperfície de células epiteliais. EGFR é um membro da família de receptor defator de crescimento de proteína tirosina quinases, uma classe de moléculasreguladoras do ciclo celular. (W. J. Gullick et al., 1986, Câncer Res., 46:285-292). EGFR é ativado quando seu ligando (ou EGF ou TGF-a) liga aodomínio extracelular, resultando em autofosforilação do domínio de tirosinaquinase intracelular do receptor (S. Cohen et al., 1980, J. Biol. Chem.,255:4834-4842; A. B. Schreiber et al., 1983, J. Biol. Chem., 258:846-853).

EGFR é o produto de proteína de um oncogene promotor docrescimento, erbB ou ErbBl, que é apenas um membro de uma família, isto é,a família ERBB de proto-oncogenes, que se acredita desempenha papéispivotantes no desenvolvimento e progressão de muitos cânceres humanos. Emparticular, expressão aumentada de EGFR foi observada em câncer de mama,bexiga, pulmão, cabeça, pescoço e estômago assim como glioblastomas. Afamília ERBB de oncogenes codifica quatro, receptores de transmembranaestruturalmente aparentados , ou seja, EGFR, HER-2/neu (erbB2), HER-3(erbB3) e HER-4 (erbB4). Clinicamente, amplificação e/ou sobrexpressão doreceptor do oncogene ERBB em tumores foram registrados comocorrelacionados com recorrência da doença e prognose fraca do paciente,assim como com responsividade em terapia. (L. Harris et al, 1999, Int. J. Biol.Markers, 14:8-15; e J. Mendelsohn e J. Baselga, 2000, Oncogene, 19:6550-6565).

EGFR é composto de três domínios principais, ou seja, odomínio extracelular (ECD), que é glicosilado e contém a bolsa de ligação aligando com duas regiões ricas em cisteína; um domínio de transmembranacurto, e um domínio intracelular que tem atividade de tirosina quinaseintrínseca. A região de transmembrana une domínio de ligação a ligando aodomínio intracelular. Análise de seqüência de aminoácidos e de DNA, assimcomo estudos de formas não glicosiladas de EGFR, indicam que a estruturadorsal da proteína de EGFR tem uma massa de 132 kDa, com 1186 resíduosde aminoácidos (A. L. Ullrich et al., 1984, Nature, 307:418-425; J. Downwardet al., 1984, Nature, 307:521-527; C. R. Carlin et al., 1986, MoI. Cell. BioL,6:257-264; e F. L. V. Mayes e M. D. Waterfield, 1984, The EMBO J., 3:531-537).

A ligação de EGF ou TGF-a a EGFR ativa uma via detransdução de sinal e resulta em proliferação celular. A dimerização,mudanças conformacionais e internalização de moléculas de EGFRfuncionam para transmitir sinais intracelulares levando a regulação docrescimento de células (G. Carpenter e S. Cohen, 1979, Ann. Rev. Biochem.,48:193-216). Alterações genéticas que afetam a regulação de função doreceptor de fator de crescimento, ou levam a sobrexpressão de receptor e/ouligando, resultam em proliferação celular. Além disso, EGFR foi determinadocomo desempenhando um papel em diferenciação de células, melhora damotilidade de células, secreção de proteínas, neovascularização, invasão,metástase e resistência de células de câncer a agentes quimioterapêuticos eradiação. (M.-J. Oh et al., 2000, Clin. Câncer Res., 6:4760- 4763).

Vários inibidores de EGFR foram identificados, incluindovários já sofrendo experiências clínicas para o tratamento de vários cânceres.

Para um recente sumário, ver de Bono, J. S. e Rowinsky, E. K. (2002), "TheErbB Receptor Family: A Therapeutic Target For Câncer", Trends inMolecular Medicine, 8, S 19-26.

Um conjunto promissor de marcações para intervençãoterapêutica no tratamento de câncer inclui os membros do eixo HER-quinâse.

Eles são com freqüência regulados de modo positivo em tumores epiteliaissólidos de, a título de exemplo, a próstata, pulmão e mama, e são tambémregulados de modo positivo em tumores de glioblastoma. Receptor de fator decrescimento epidérmico (EGFR) é um membro do eixo HER-quinase, e foi amarcação de escolha para o desenvolvimento de várias diferentes terapiaspara câncer. Os inibidores de EGFR tirosina quinase (EGFR-TKIs) estãodentro destas terapias, devido à fosforilação reversível de resíduos de tirosinaé requerida para a ativação da via EGFR. Em outras palavras, EGFR-TKIsbloqueia um receptor de superfície celular responsável por disparar e/oumanter a via de sinalização celular que induz o crescimento e divisão decélulas de tumor. Especificamente, acredita-se que estes inibidores interferemcom o domínio de EGFR quinase, referido como HER-I . Dentre os maispromissores EGFR-TKIs, estão três séries de compostos: quinazolinas,piridopirimidinas e pirrolopirimidinas.

Dois dos compostos mais avançados em desenvolvimentoclínico incluem Gefitinib (composto ZD 1839 desenvolvido por AstraZenecaUK Ltd.; disponível sob o nome comercial IRESSA; abaixo "IRESSA") eErlotinib (composto OSI-774 desenvolvido por Genentech, Inc. e OSIPharmaceuticals, Inc.; disponível sob o nome comercial TARCEVA; abaixo"TARCEVA"); ambos tem gerado resultados clínicos encorajadores. Otratamento de câncer convencional com tanto IRESSA como TARCEVAenvolve a administração oral diária de não mais do que 500 mg dosrespectivos compostos. Em Maio, 2003, IRESSA se tornou o primeiro destesprodutos a alcançar o mercado americano, quando ele foi aprovado para otratamento de pacientes com câncer de pulmão de célula não pequenaavançado.

IRESSA é uma quinazolina oralmente ativa que funciona aoinibir diretamente a fosforilação de tirosina quinase na molécula de EGFR.Ele compete para o sítio de ligação de adenosina trifosfato (ATP), levando asupressão do eixo HER-quinase. O exato mecanismo de resposta de IRESSAnão é completamente entendido, no entanto, estudos sugerem que a presençade EGFR é um pré-requisito necessário para sua ação.

Uma limitação significante no uso destes compostos é que seusrecipientes podem desenvolver uma resistência a seus efeitos terapêuticosapós terem inicialmente responder à terapia, ou eles podem não responder aEGFR-TKIs em qualquer grau mensurável de todo. A taxa de resposta aEGFR-TKIs varia entre diferentes grupos étnicos. Na extremidade inferiordos respondentes a EGFR-TKI, em algumas populações, somente 10-15 porcento dos pacientes com câncer de pulmão de célula não pequena avançadorespondem a inibidores de EGFR quinase. Assim, uma melhor compreensãodos mecanismos moleculares subjacentes à sensibilidade a IRESSA eTARCEVA devem se beneficiar extremamente em uma terapia alvo para osindivíduos que irão provavelmente mais se beneficiar desta terapia.

Existe uma necessidade signiflcante na arte para umtratamento de câncer satisfatório, e especificamente cânceres de célulasepiteliais como câncer de pulmão, ovariano, mama, cérebro, cólon e dapróstata, que incorpore os benefícios da terapia TKI e supere a nãoresponsividade demonstrada pelos pacientes. Este tratamento deve ter umimpacto dramático na saúde dos indivíduos, e especialmente indivíduos maisvelhos, dentre os quais o câncer é especialmente comum.

SUMÁRIO

Os inventores da presente invenção descobriram de modosurpreendente que inibidores de EGFR irreversíveis são efetivos notratamento de câncer em indivíduos que não estão mais respondendo aterapias com gefitinib e/ou erlotinib. Assim, em uma forma de realização, apresente invenção prove um método para o tratamento de câncer resistente agefitinib/ erlotinib. Nesta forma de realização, a progressão de câncer em umindivíduo é monitorada em um ponto no tempo após o indivíduo ter iniciadotratamento com gefitinib e/ou erlotinib. Progressão do câncer é indicativa decâncer que é resistente a tratamento com gefitinib e/ou erlotinib e o indivíduoé administrado com uma composição farmacêutica compreendendo uminibidor de receptor de fator de crescimento epidérmico irreversível (EGFR).

Em formas de realização preferidas, o inibidor de EGFRirreversível é EKB-569, HKI-272 ou HKI-357. Alternativamente, o inibidorde EGFR irreversível pode ser qualquer composto que liga a cisteína 773 deEGFR (SEQ ID NO: 1).

A progressão de câncer pode ser monitorada por métodos bemconhecidos dos versados. Por exemplo, a progressão pode ser monitorada pormeio de inspeção visual do câncer, como, por meio de raio-X, varredura porCT ou MRI. Alternativamente, a progressão pode ser monitorada por meio dedetecção de biomarcador de tumor.

Em uma forma de realização, o paciente é monitorado emvários pontos no tempo durante todo o tratamento do câncer. Por exemplo, aprogressão de um câncer pode ser monitorada por análise a progressão decâncer em um segundo ponto no tempo e comparando esta análise com umaanálise em um primeiro ponto no tempo. O primeiro ponto no tempo pode serantes ou após iniciar o tratamento com gefitinib e/ou erlotinib e o segundoponto no tempo é após o primeiro. Um crescimento aumentado do câncerindica progressão do câncer.

Em uma forma de realização, a progressão de câncer émonitorada por análise do tamanho do câncer. Em uma forma de realização, otamanho do câncer é analisado via inspeção visual do câncer por meio deraio-X, varredura por CT ou MRI. Em uma forma de realização, o tamanho docâncer é monitorado por meio de detecção de biomarcador de tumor.

Em uma forma de realização, o câncer é câncer de célulaepitelial. Em uma forma de realização, o câncer é câncer gastrointestinal,câncer da próstata, câncer ovariano, câncer da mama, câncer de cabeça epescoço, câncer do esôfago, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célulanão pequena, câncer do sistema nervoso, câncer do rim, câncer da retina,câncer da pele, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer genito-urinário ecâncer da bexiga.

Em uma forma de realização, o tamanho do câncer émonitorado em pontos no tempo adicionais, e os pontos no tempo adicionaissão após o segundo ponto no tempo.

Em uma forma de realização, o último ponto no tempo é pelomenos 2 meses após o ponto no tempo precedente. Em uma forma derealização, o último ponto no tempo é pelo menos 6 meses após ponto notempo precedente. Em uma forma de realização, o último ponto no tempo épelo menos 10 meses após os pontos no tempo precedentes. Em uma forma derealização, o último ponto no tempo é pelo menos um ano após ponto notempo precedente.

Em outra forma de realização, a presente invenção prove ummétodo para tratamento câncer, compreendendo administrar a um indivíduotendo a mutação em EGFR, ou seja, a substituição de uma metionina por umatreonina na posição 790 (T790M) de SEQ ID. No. 1, uma composiçãofarmacêutica compreendendo um inibidor de EGFR irreversível. A mutaçãode T790M confere resistência a tratamento com gefitinib e/ou erlotinib.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figuras 1 A-IB mostram análise EGFR de seqüência em lesõesmetastáticas recorrente de dois pacientes NSCLC com resistência adquirida agefitinib. Figura IA mostra análise de seqüência para caso 1. A mutação deT790M em EGFR está presente em uma lesão no fígado recorrente após odesenvolvimento de resistência clinica a gefitinib. (Esquerda) A mutação nãofoi detectada no lesão primária do pulmão no momento da diagnose. (Direita)Tanto a tumor primaria do pulmão e como a lesão recorrente no fígadoabrigam a mutação de sensibilização de L858R gefitinib. Deve-se notar, que amutação L858R está presente na relação esperada para uma mutaçãoheterozigótica em tanto lesões primarias como recorrentes, enquanto T790M édetectável em níveis baixos comparados com o alelo tipo selvagem. Umpolimorfismo (G/ A) é mostrado na mesma trilha para demonstrarrepresentação equivalente de dois alelos no produto PCR não clonado. FiguraEB mostra análise de seqüência para caso 2. A mutação T790M está presentede uma minoria pequena de células resistentes a gefítinib. (Esquerda) Amutação T790M não foi detectável nem no tumor primário do pulmão comoem oito lesões recorrentes no fígado deste caso por seqüenciamento deprodutos PCR não clonados. Heterozigosidade em um polimorfismo adjacente(G/ A) confirma amplificação de ambos alelos EGFR destas amostras. Amutação de sensibilização a gefítinib-, L861Q, foi detectada na relaçãoesperada dentro do tumor primário de pulmão assim como de cada uma dasoitos lesões recorrentes do fígado.

Figuras 2A-2C mostram resistência adquirida a gefítinib emlinhagens de células de câncer broncoalveolar e sensitividade persistente ainibidores de família ERBB irreversíveis. Figura 2A mostra inibição porinibidores de tirosina quinase de proliferação de linhagens de células decâncer broncoalveolar com EGFR tipo selvagem (NCI-H1 666), a mutaçãoativante delE746-A750 em EGFR (NCI-H1 650), ou dois subclonesrepresentativos resistentes a gefítinib de NCI-H1 650 (G7 e Cl 1). O efeito doinibidor de gefítinib reversível é comparado com que o do inibidorirreversível HKI-357. Comparáveis resultados foram observados com osoutros inibidores irreversíveis . Números de células foram medidos porcoloração de violeta cristal, após cultura em 5% FCS, com 100 ng/ml EGFR,a 72 h após exposição às indicadas concentrações de fármacos. Cada ponto dedados representa a média de quatro amostras. Figura 2B mostra a estruturaquímica de gefítinib, um inibidor reversível de EGFR; EKB- 569, um inibidorirreversível de EGFR; e HKI-272 e HKI-357, dois inibidores irreversíveisduais de EGFR e ERBB2. Figura 2C mostra geração de células NCI- HI650resistentes a fármacos após tratamento com variadas concentrações degefítinib ou o inibidor EKB-569 irreversível de ERBB. Colônias foramcoloridas após 12 dias em cultura na presença de inibidores.

Figuras 3A-3D mostram dependência persistente emsinalização de EGFR e ERBB2 em células resistentes a gefitinib, e passagemde tráfico alterada de receptor. Figura 3 A mostra viabilidade de células apósabate mediado por siRNA de EGFR e ERBB2 em linhagens de célulasbroncoalveolares com EGFR tipo selvagem (NCI-H1 666), comparado comcélulas com a ativação de mutação de 1E746-A750 em EGFR (NCI-H1 650) edois derivados resistentes a gefitinib-(G7 e Cl 1). Células viáveis foramcontadas 72 h após tratamento com RNA filamento duplo são mostradascomo uma fração relativa a células tratadas com siRNA não específico , comdesvios padrões com base em amostras em triplicata. Figura 3 B mostrainibição de autofosforilação de EGFR (Yl 068) e fosforilação de efetoresAKT e MAPK a jusante (ERK) em células tratadas com concentraçõescrescentes de gefitinib ou o inibidor irreversível HKI-357, seguido por umpulso de 2-h com EGF. A linhagem parental de células NCI-H1 650 écomparada com uma linhagem resistente a gefitinib representativa, G7. TotaisAKT e MAPK são mostrados como controles; tubulina é usada como controlede carga para os níveis de EGFR total, que estão no limite inferior dedetecção nestas células. Figura 3 C mostra internalização de EGFR alteradaem células NCI-H 1650 (G7) resistentes a gefitinib, comparado com alinhagem parental de células NCI-H1 650 sensível. EGF etiquetado comrodamina é usado para rotular EGFR a 5 e 20 min, após adição de ligando. Ainternalização aumentada de EGFR em células NCI-H1 650 (G7) é m aisevidente a 20 min. (microscópio Zeiss, ampliação x63). Figura 3D mostraimunoblotting de EGFR internalizado de células parentais NCI-FD 650 e o

Derivado G7 resistente após rotulação com pulso de proteínasde superfície de células por biotinilação e busca durante 20 min. O EGFRintracelular aumentado em células NCI-F£1 650 (G7) é comparado com ainternalização de receptor (TR) de transferrina não alterado.

Figuras 4A-4B mostram eficácia de inibidores de ERBBirreversíveis em supressão de mutante T790M EGFR. Figura 4A mostracomparação de gefitinib e dois inibidores irreversíveis, HKI-357 e HKI-272,em sua capacidade para suprimir autofosforilação de EGFR (Yl 068) efosforilação de efetores AKT e MAPK (ERK) a jusante na linhagem decélulas broncoalveolares NCI-H1 975, abrigando tanto uma mutação desensibilização (L858R) como uma mutação associada com resistência(T790M). EGFR, AKT, e MAPK totais são mostrados como controles decarga . Figura 4B mostra supressão de proliferação em células NCI-H1 975abrigando as mutações L858R e T790M por os três inibidores irreversíveis dafamília de ERBB, comparado com gefitinib.

Figura 5 mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 2) ea seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de EGFR.

Figura 6 mostra que, como gefitinib, HKI 357 e EKB 569(rotulados "Wyeth") demonstraram aumentado extermínio de células decélulas NSCLC abrigando uma mutação de EGFR, mas diferente de gefitinib,clones resistentes estes fármacos não foram prontamente gerados in vitro eeles retém sua eficácia contra clones resistentes a gefitinib.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Cânceres resistentes a gefitinib e erlotinib

Gefitinib (composto ZD1 839 desenvolvido por AstraZenecaUK Ltd.; disponível sob o nome comercial IRESSA) e erlotinib (compostoOSI-774 desenvolvido por Genentech, Inc. e OSI Pharmaceuticals, Inc.;disponível sob o nome comercial TARCEVA) induzem respostas clínicasdramáticas em casos de cânceres de pulmão de célula não pequena (NSCLCs)abrigando mutações ativantes no receptor EGF (EGFR) (1-3), que é marcadopor estes inibidores competitivos de ligação de ATP (4, 5).A eficácia destesinibidores de tirosina quinase pode resultar tanto de alterações na fissura deATP associada com estas mutações, que levam a uma melhorada inibição daquinase mutante por estes fármacos, e de dependência biológica destas célulasde câncer nos sinais de sobrevivência aumentada transduzidos para osreceptores mutantes, um fenômeno descrito como "vício de oncogene " (6, 7).

Apesar de respostas terapêuticas a tanto gefitinib comoerlotinib poderem persistir durante tanto como 2-3 anos, a duração média deresposta na maior parte dos casos de NSCLC é somente de 6-8 meses (8-10).

Os mecanismos subjacentes à resistência adquirida ao fármaco não são bementendidos. Por analogia com imatinib (GLEEVEC), que inibe a BCR-ABLquinase envolvida em leucemias mielóides crônicas (CMLs), a C-KIT quinaseimplicada em tumores estromais gastrointestinais (GISTs), e a FEP1L1 -PDGFR-a quinase em síndrome hipereosinofílica idiopática (HES), mutaçõessecundárias de domínio de quinase podem potencialmente suprimir a ligaçãodo fármaco (11-16). No entanto, NSCLC recorrente não é prontamentesubmetida a biópsia, assim, somente amostras clínicas limitadas sãodisponíveis para análise. Recentemente, uma única mutação secundária,T790M, dentro do domínio de EGFR quinase foi registrada em três de seiscasos com doença recorrente após terapia com gefitinib ou erlotinib (17, 18).Códon 315 de BCR- ABL, que é análogo a códon 790 de EGFR, é comfreqüência mudado em CML resistente a imatinib (11, 12), e mutação docorrespondente resíduo em C-XJr(COdOn 670) e FIPILl-PDGFR-a (codon674) é associado com GIST e HES resistentes a imatinib, respectivamente(15, 16). A moldagem prematura in vitro de resistência a inibidores de EGFRindica que a mutação de codon 790 dentro de receptor de tipo selvagemdeveria similarmente suprimir a inibição por um inibidor de tirosina quinasede EGFR (19). Recentemente, proteínas EGFR transfectadas contendomutações ativantes junto com a substituição T790M foram mostradas comodemonstrando inibição reduzida por gefitinib e erlotinib (17, 18). Apesar damutação T790M parecer contribuir para a resistência adquirida em algunscasos de NSCLC, os mecanismos subjacentes à falha do tratamento em casosfaltando mutações de EGFR secundárias permanecem não explicados.

Em contraste com a quinase BCR-ABL citoplásmica,sinalização por EGFR ligado a membrana envolve uma via complexa deligação a ligando, homodimerização de receptor, e heterodimerização comERBB2 e outros membros da família, seguido por internalização e reciclagemda do receptor ligado a ligando ou degradação do receptor mediada porubiquitina (20). Significante sinalização dependente de EGF ocorre, como sepensa, durante o processo de internalização, que é também associado com adissociação de complexos de EGFR no pH baixo de vesículas intracelulares .Como tal, fatores múltiplos modulam a resistência e qualidade do sinaltransduzido pelo receptor, e alterações em passagem de tráfico de EGFRforam intimamente ligadas com a regulação de respostas celularesdependentes de EGF (20).

A presente invenção é baseada na descoberta de que cânceresresistentes a gefitinib podem incluir os em que a mutação de EGFR T790Mestá somente presente em um subconjunto de células de tumor resistentes e asem que a mutação T790M não é observada, mas internalização de EGFRaumentada é observada. A invenção é ainda baseada na descoberta de queinibidores de EGFR irreversíveis, que covalentemente reticulam o receptor,são efetivos para inibir cânceres com a mutação T790M e em cânceres compassagem de tráfico de EGFR alterado que podem tornar estes cânceresresistentes ao tratamento com gefitinib e/ou erlotinib. Assim, a presenteinvenção prove um método para tratamento de cânceres resistentes a gefitinibe/ou erlotinib compreendendo administrar inibidores de EGFR irreversíveis.

Método para tratamento de um paciente

Em uma forma de realização, a invenção prove um métodopara tratamento de câncer resistente a gefitinib/ erlotinib. Método compreendeadministrar a um paciente em necessidade deste tratamento uma quantidadeefetiva de alguns inibidores de EGFR irreversíveis, incluindo EKB-569 (4-anilinoquinolina-3-carbonitrila; Greenberger et al., 11* NCI- EORTC-AACRSymposium on New Drugs in Câncer Therapy, Amsterdam, November 7- 10,2000, resumo 388; Wyeth), HKI-357 (um derivado de 4-anilinoquinolina-3-carbonitrila; Tsou et al. J. Med. Chem. 2005, 48: 1107-1131; Wyeth) e/ouHKI-272 (um derivado de 4-anilinoquinolina-3-carbonitrila; Rabindran et al.,Câncer Res. 2004, 64, 3958-3965; Wyeth). Em uma forma de realizaçãopreferida, a invenção prove um método compreendendo administrar a umpaciente em necessidade deste tratamento uma quantidade efetiva de EKB-569. Em uma forma de realização preferida, a invenção prove um métodocompreendendo administrar a um paciente em necessidade deste tratamentouma quantidade efetiva de HKI-357.

O tratamento também pode envolver uma combinação detratamentos, incluindo, mas não limitados a inibidor de tirosina quinase emcombinação com outros inibidores de tirosina quinase, quimioterapia,radiação, etc.

Os cânceres podem ser inicialmente diagnosticados comosensíveis a gefitinib/ erlotinib ou previstos como sendo sensíveis a gefitinib/erlotinib por meio de métodos descritos em Lynch et al., 2004; 350:2129-2139. A sensibilidade a gefitinib/ erlotinib pode ser prevista pela presença notumor de mutações de EGFR incluindo, por exemplo, deleção de resíduos 747(lisina) a 749 (ácido glutâmico) combinada com a mutação em 750 (alanina), deleção de resíduos 747 (lisina) a 750 (alanina), substituição de arginina porleucina em resíduo 858, substituição de glutamina por leucina em resíduo861.

Cânceres podem ser diagnosticados como resistentes agefitinib/ erlotinib após tratamento com gefitinib e/ou erlotinib ter começado. Alternativamente, cânceres podem ser diagnosticados como resistentes agefitinib/ erlotinib antes da iniciação de tratamento com estes compostos. Aresistência a gefitinib e/ou erlotinib no tumor pode ocorrer após, por exemplo,6 meses ou mais de tratamento com gefitinib e/ou erlotinib. Alternativamente,resistência a gefitinib e/ou erlotinib do tumor pode ser diagnostica menos de 6meses após tratamento com gefitinib e/ou erlotinib ter começado. Diagnose deresistência a gefitinib e/ou erlotinib pode ser obtida por meio de monitoraçãoda progressão do tumor durante tratamento com gefitinib e/ou erlotinib.Progressão do tumor pode ser determinada por comparação do estado dotumor entre pontos no tempo após tratamento ter começado ou porcomparação do estado do tumor entre um ponto no tempo após tratamento tercomeçado a um ponto no tempo antes da iniciação de tratamento comgefitinib e/ou erlotinib. Progressão do tumor pode ser monitorada durantetratamento com gefitinib e/ou erlotinib visualmente, por exemplo, por meio deradiografia, por exemplo, raio-X, varredura por CT, ou outros métodos demonitoração conhecidos do versado, incluindo palpitação do câncer oumétodos para monitor com biomarcador os níveis do tumor. Progressão docâncer durante tratamento com gefitinib e/ou erlotinib indica resistência agefitinib e/ou erlotinib. Um aumento no nível dos biomarcadores de tumores indica progressão do tumor . Assim, um aumento nos níveis de biomarcadoresde tumor durante tratamento com gefitinib e/ou erlotinib indica resistência agefitinib e/ou erlotinib. Detecção de novos tumores ou detecção de metástaseindica progressão do tumor . Cessação do encolhimento do tumor indicaprogressão do tumor . Crescimento do câncer é indicado por, por exemplo,aumento no tamanho do tumor, metástase ou detecção de um novo câncer,e/ou um aumento nos níveis de biomarcador de tumor.

O desenvolvimento de resistência a gefitinib e/ou erlotinibpode ser monitorada por meio de teste pela presença de uma mutaçãoassociada com a resistência a gefitinib e/ou erlotinib em células de tumor circulantes obtidas da circulação, ou outro fluido corporal, do indivíduo.Presença de mutações associadas com a resistência a gefitinib e/ou erlotinibem células de tumor do indivíduo é indicativa de um tumor resistente agefitinib e/ou erlotinib.

Em uma forma de realização, o tumor do indivíduo abrigamutações indicativas de sensibilidade a gefitinib e/ou erlotinib, ainda ele éresistente a tratamento com gefitinib e/ou erlotinib. Em uma forma derealização, o tumor do indivíduo abriga mutações indicativas de sensibilidadea gefitinib e/ou erlotinib e abriga mutações indicativas de resistência agefitinib e/ou erlotinib, por exemplo, a mutação T790M, isto é, onde umresíduo metionina é substituído pelo resíduo de treonina nativo, em EGFR,por exemplo internalização de EGFR aumentada. Em uma forma derealização, O tumor do indivíduo não abriga mutações indicativas desensibilidade a gefitinib e/ou erlotinib e de fato abriga mutações indicativasde resistência a gefitinib e/ou erlotinib, por exemplo, a mutação de T790M emEGFR, por exemplo, internalização de EGFR aumentada.

Em conexão com a administração do fármaco, uma"quantidade efetiva" indica uma quantidade que resulta em um efeito benéficopara pelo menos uma fração estatisticamente significante de pacientes, como a melhora dos sintomas, uma cura, uma redução na carga da doença, reduçãoda massa de massa de tumor ou números de células, extensão de vida,melhorada na qualidade de vida ou outro efeito geralmente reconhecido comopositivo por doutores médicos familiarizados com o tratamento de um tipoparticular de doença ou condição.

A dosagem efetiva de ingrediente ativo empregado pode variardependendo do particular composto empregado, o modo de administração e aseveridade da condição sendo tratada. O versado na arte conhece a doseefetiva para cada paciente, que pode variar com a severidade da doença,variação genética individual, ou taxa metabólica. No entanto, em geral, resultados satisfatórios são obtidos quando os compostos da invenção sãoadministrados em um dosagem diária de cerca de 0,5 a cerca de 1000 mg/kgde peso corporal, opcionalmente dado em doses divididas duas a quatro vezespor dia, ou em uma forma de liberação prolongada. A dosagem diária total éprojetada para ser de cerca de 1 a 1000 mg, preferivelmente de cerca de 2 a500 mg. Formas de dosagem apropriadas para uso interno compreendem decerca de 0,5 a 1000 mg do composto ativo em mistura íntima com um veículofarmaceuticamente aceitável sólido ou líquido. Este regime de dosagem podeser ajustado para prover a resposta terapêutica ótima. Por exemplo, variasdoses divididas podem ser administradas diariamente ou a dose pode serproporcionalmente reduzida como indicado pelas exigências da situaçãoterapêutica.

A via de administração pode ser intravenosa (I. V.),intramuscular (I.M.), subcutânea (S. C), intradérmica (I.D.), intraperitoneal(I.P.), intratecal (I.T.), intrapleural, intrauterina, retal, vaginal, tópica,intratumor e semelhantes. Os compostos da invenção podem seradministrados parenteralmente por injeção ou por infusão gradual com otempo e pode ser distribuída por meios peristálticos.

Administração pode ser por meios transmucosais outransdérmicos. Para administração transmucosal ou transdérmica, os agentespenetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são usados naformulação. Estes agentes penetrantes são geralmente conhecidos na arte eincluem, por exemplo, para administração transmucosal, sais de bile ederivado de ácido fusídico. Além disso, detergentes podem ser usados parafacilitar a permeação. Administração transmucosal pode ser através depulverização nasal, por exemplo, ou usando supositórios. Para administraçãooral, os compostos da invenção são formulados em formas de administraçãooral o convencionais como cápsulas, tabletes e tônicos.

Para administração tópica, a composição farmacêutica(inibidor de atividade quinase) é formulado em ungüentos, pomadas, géis oucremes, como é geralmente conhecido na arte.

As composições terapêuticas desta invenção, por exemploinibidores de EGFR irreversíveis, são convencionalmente administradasintravenosamente, como por injeção em uma dose unitária, por exemplo. Otermo " dose unitária" quando usado em referência a uma composiçãoterapêutica da presente invenção refere-se unidades fisicamente discretasapropriadas como dosagem unitária para o indivíduo, cada unidade contendouma quantidade predeterminada de material ativo calculada para produzir odesejado efeito terapêutico em associação com os diluentes requerido; isto é,carreador, ou veículo.

As composições são administradas em um modo compatívelcom a formulação da dosagem , e em uma quantidade terapeuticamenteefetiva. A quantidade a ser administrado e a escolha do tempo depende doindivíduo a ser tratado, a capacidade do sistema do indivíduo de utilizar oingrediente ativo, e o grau de efeito terapêutico desejado. As quantidadesprecisas de ingrediente ativo requerido a ser administrado dependem dojulgamento do médico clínico e são peculiares a cada indivíduo.

A composição terapêutica utilizável para praticar os métodosda presente invenção, por exemplo inibidores de EGFR irreversíveis, édescrita aqui. Qualquer formulação ou sistema de liberação de fármacoscontendo os ingredientes ativos, que é apropriada para o uso pretendido, comosão geralmente conhecidos dos versados, pode ser usada. Apropriadosveículos farmaceuticamente aceitáveis para administração oral, retal, tópicaou parenteral (incluindo inalação, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular eintravenosa) são conhecidos dos versados. O veículo deve serfarmaceuticamente aceitável no sentido de ser compatível com os outrosingredientes da formulação e não deletérios para o seu recipiente.

Como usado aqui, os termos "farmaceuticamente aceitável ","fisiologicamente tolerável" e suas variações gramaticais, como elas sereferem às composições, veículos, diluentes e reagentes, são usadosinterpermutavelmente e representam que os materiais são capazes deadministração a ou sobre um mamífero sem a produção de efeitos fisiológicosindesejáveis.Formulações apropriadas para administração parenteralconvenientemente incluem preparação aquosa estéril do composto ativo que épreferivelmente isotônico com o sangue do recipiente. Assim, estasformulações podem convenientemente conter água destilada, 5% dextrose em água destilada ou solução salina. As formulações utilizáveis também incluemsoluções concentradas ou sólidos contendo o composto que quando dediluição com um solvente apropriado dá uma solução apropriada paraadministração parental acima.

Para administração enteral, um composto pode ser incorporado em um veículo inerte em unidades discretas, como cápsulas, pílulas, tabletesou pastilhas, cada contendo uma quantidade predeterminado do compostoativo; como um pó ou grânulos, ou uma suspensão ou solução em líquidoaquoso ou líquido não aquoso, por exemplo, um xarope, um elixir, umaemulsão ou uma inalação. Os veículos apropriados podem ser amidos ouaçúcares e incluem lubrificantes, aromatizantes, aglutinantes, e outrosmateriais da mesma natureza.

Um tablete pode ser feito por compressão ou moldagem,opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os tabletescomprimidos podem ser preparados por compressão em uma máquinaapropriada do composto ativo em uma forma de livre escoamento, porexemplo, um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com ingredientesacessórios, por exemplo, aglutinantes, lubrificantes, diluentes inertes, agentestensoativos ou dispersantes. Os tabletes moldados podem ser feitos pormoldagem em uma máquina apropriada, uma mistura do composto ativo em pó com qualquer veículo apropriado.

Um xarope ou suspensão pode ser feito pela adição docomposto ativo a um concentrado, solução aquosa de um açúcar, porexemplo, sacarose, ao qual também pode ser adicionado quaisqueringredientes adicionais. Estes ingredientes adicionais podem incluir,aromatizante, um agente para retardar cristalização do açúcar ou um agentepara aumentar a solubilidade de qualquer outro ingrediente, por exemplo,como um álcool poliídrico, por exemplo, glicerol ou sorbitol.

As formulações para administração retal podem serapresentadas como um supositório com um veículo convencional, porexemplo, manteiga de cacau ou Witepsol S55 (marca registrada de DynamiteNobel Chemical, Germany), para uma base de supositório.

Formulações para administração oral podem ser apresentadascomo um melhorador. Os melhoradores de absorção oralmente aceitáveisincluem tensoativos como lauril sulfato de sódio, palmitoil carnitina, Lauret-9, fosfatidilcolina, ciclodextrina e seus derivados, sais de bile comodeoxicolato de sódio, taurocolato de sódio, glicoclato de sódio, e fusidato desódio; agentes quelantes incluindo EDTA, ácido cítrico e salicilatos; e ácidosgraxos (por exemplo, ácido oleico, ácido laurico, acilcarnitinas, mono- ediglicetídeos). Outros melhoradores de absorção oral incluem cloretobenzalcônio, cloreto de benzetônio, CHAPS (3- (3-colamidopropil)-dimetilamonio-l-propanossulfonato), Big-CHAPS (N, N-bis(3-D-gluconamidopropil)-colamida), clorobutanol, octoxinol-9, álcool benzílico,fenóis, cresóis e álcoois de alquila. Um melhorador de absorção preferidopara a presente invenção é lauril sulfato de sódio.

Alternativamente, o composto pode ser administrado emlipossomas ou microesferas (ou micropartículas). Métodos para prepararlipossomas e microesferas para administração a um paciente são bemconhecidos dos versados. Patente U.S. 4,789,734, cujos conteúdos são aquiincorporados por referência, descreve métodos para encapsular materiaisbiológicos em lipossomas. Essencialmente, o material é dissolvido em umasolução aquosa, os fosfolipídeos e lipídeos apropriados adicionados, juntocom tensoativos se requerido, e o material dialisado ou sonicado, comonecessário. Um estudo dos métodos conhecidos é provido por G. Gregoriadis,Cap. 14, "Liposomes," Drug Carriers in Biology and Medicine, pp. 287-341(Academic Press, 1979).

Microesferas formadas de polímeros ou proteínas são bemconhecidas dos versados na arte, e pode ser adequadas para passagem atravésdo trato gastrointestinal diretamente na corrente sangüínea. Alternativamente,o composto pode ser incorporado e as microesferas, ou compósito demicroesferas, implantadas para uma liberação lenta durante um período detempo na faixa de dias a meses. Ver, por exemplo, Patentes U.S. 4.906.474,4.925.673 e 3.625.214, e Jein, TIPS 19:155-157 (1998), cujos conteúdos sãoaqui incorporados por referência.

Em uma forma de realização, o inibidor de tirosina quinase dapresente invenção pode ser formulado em um lipossoma ou micropartículaque é dimensionada de modo apropriado para se alojar nos leitos capilaresapós administração intravenosa. Quando o lipossoma ou micropartícula éalojado nos leitos capilares circundando o tecido isquêmico, os agentespodem ser administrados localmente no sítio em que eles podem ser maisefetivos. Os lipossomas apropriados para marcação do tecido isquêmico sãogeralmente menos que cerca de 200 nanômetros e são também tipicamentevesículas unilamelares, como descrito, por exemplo, em Patente U.S.5.593.688 para Baldescliweiler, "Liposomal targeting of ischemic tissue,"cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.

As micropartículas preferidas são as preparadas a partir depolímeros biodegradáveis, como poliglicolídeos, polilactídeos e seuscopolímero. Os versados na arte podem prontamente determinar um sistemaveículo apropriado dependendo de vários fatores, incluindo a taxa desejada deliberação de fármaco e a dosagem desejada.

Em uma forma de realização, as formulações sãoadministradas via cateter diretamente no interior dos vasos sangüíneos. Aadministração pode ocorrer, por exemplo, através de furos no cateter. Nestasformas de realização em que os compostos ativos tem uma meia vida relaçãolonga (da ordem de 1 dia a uma semana ou mais), as formulações podem serincluídas em hidrogéis poliméricos biodegradáveis, como os descritos emPatente U.S. 5.410.016 para Hubbell et ai. Estes hidrogéis poliméricos podem ser liberados no interior de um lúmen de tecido e os compostos ativosliberados com o tempo à medida que o polímero degrada. Se desejável, oshidrogéis poliméricos podem ter micropartículas ou lipossomas que incluemos compostos dispersos no mesmo, provendo outromecanismo para a liberação controlada dos compostos ativos.

As formulações podem ser convenientemente apresentadas emuma forma de dosagem unitária e podem ser preparados por qualquer dosmétodos bem conhecidos na arte de farmácia. Todos os métodos incluem aetapa de levar o composto ativo em associação com um veículo r que constituium ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas por levando de modo uniforme e íntima do composto ativo em associaçãocom um veículo líquido ou um veículo sólido finamente dividido e então, senecessário, moldando o produto na forma de dosagem unitária desejada.

As formulações podem ainda incluir um ou mais ingrediente(s)acessório(s) usados na arte de formulações farmacêuticas, por exemplo,diluente, tampões, agentes aromatizantes, aglutinantes, agentes tensoativos,espessantes, lubrificantes, agentes de suspensão, conservantes (incluindoantioxidantes) e semelhantes.

Compostos dos presentes métodos (isto é inibidores de EGFRirreversíveis) podem ser apresentados para administração ao trato respiratóriocomo uma baforada ou um aerossol ou solução para um nebulizador, ou comoum pó microfino para insuflação, sozinho ou em combinação com veículoinerte como lactose. Em tal caso, as partículas de composto ativo tem demodo apropriado diâmetros de menos que 50 mícrons, preferivelmente menosque 10 mícrons, mais preferivelmente entre 2 e 5 mícrons.Geralmente, para administração nasal, um pH suavementeácido será preferidos. Preferivelmente, as composições da invenção tem umpH de cerca de 3 a 5, mais preferivelmente de cerca de 3.5 a cerca de 3.9 emais preferivelmente 3.7. O ajuste do pH é obtido por adição de um ácido apropriado, como ácido clorídrico.

A preparação de uma composição farmacológica que contémingredientes ativos dissolvidos ou dispersos nos mesmos é bem conhecida naarte e não precisada ser limitada com base em formulação. Tipicamente estascomposições são preparadas como injetáveis ou como soluções líquidas oususpensões, no entanto, formas sólidas apropriadas para solução, oususpensões, em líquido antes do uso também podem ser preparadas. Apreparação também pode ser emulsificada.

O ingrediente ativo pode ser misturado com excipientes quesão farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo e em quantidades apropriadas para uso nos métodos terapêuticos descritos aqui .Excipientes apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose,glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Além disso, se desejado,a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliarescomo agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tampão de pH esemelhantes que melhoram a eficácia do ingrediente ativo.

Os inibidores de quinase irreversíveis da presente invençãopodem incluir sais farmaceuticamente aceitáveis dos componentes aquiapresentados. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adiçãode ácido (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo), que são formados com ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídrico oufosfórico, ou como ácidos orgânicos, como acético, tartárico, mandélico esemelhantes. Sais formados com os grupos carboxila livres podem sertambém derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos desódio, potássio, amônio, cálcio ou férrico, e como bases orgânicas comoisopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina esemelhantes.

Os veículos fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos naarte. Exemplos de veículos líquidos são soluções aquosas estéreis que nãocontém materiais além dos ingredientes ativos e água, ou contém um tampãocomo fosfato de sódio em valor de pH fisiológico, solução salina fisiológicaou ambos, como solução salina tamponada com fosfato. Ainda mais, osveículos aquosos podem conter mais de um sal tampão, assim como saiscomo cloretos de sódio e potássio, dextrose, polietileno glicol e outrossolutos..

As composições líquidas também podem conter fases líquidasalém de e em exclusão de água. Exemplos destas fases de líquido adicionaissão glicerina, óleos vegetais como óleo de semente de algodão, e emulsõeságua-óleo.

Definições:

Os termos "ErbB 1 ", "receptor de fator de crescimentoepidérmico" e "EGFR" são usados interpermutavelmente aqui e referem-se aEGFR de seqüência nativa, como descrito, por exemplo, em Carpenter et al.Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluindo suas variantes (porexemplo a EGFR mutante de deleção como em Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbBl refere-se ao gene codificando o produtode proteína EGFR. Como usado aqui, a proteína EGFR é descrita comoGenBank número de acesso. NP_005219 (SEQ ID NO: 1) que é codificadopor gene erbBl, GenBank número de acesso. NM_005228 (SEQ ID NO: 2).

Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos de erbBl /EGFR podem serencontradas na Figura 5.

O termo " atividade de quinase aumentando a variância deácido nucleico" como usado aqui refere-se a uma variância (isto é mutação)em uma seqüência de nucleotídeos de um gene que resulta em uma aumentadaatividade de quinase. A aumentada atividade de quinase é um resultado diretoda variância no ácido nucleico e está associada com a proteína para a qual ogene codifica.

O termo "fármaco " ou "composto" como usado aqui refere-sea uma entidade química ou produto biológico, ou combinação de entidadesquímicas ou produtos biológicos, administrados a uma pessoa para tratar ouevitar ou controlar a doença ou condição. A entidade química ou produtobiológico é preferivelmente, mas não necessariamente um composto de baixopeso molecular, mas também pode ser um composto maior, por exemplo, um oligômero de ácidos nucleicos, aminoácidos, ou carboidratos, incluindo semlimitação, proteínas, oligonucleotídeos, ribozimas, DNAzimas, glicoproteínas,siRNAs, lipoproteínas, aptâmeros, e suas modificações e combinações.

Como usado aqui, os termos "efetivo" e "eficácia 11 incluemtanto eficácia farmacológica como segurança fisiológica. A eficáciafarmacológica refere-se a capacidade do tratamento resultar em um efeitobiológico desejado no paciente. A segurança fisiológica refere-se ao nível detoxicidade, ou outros efeitos fisiológicos adversos em nível celular, órgãoe/ou organismo (com freqüência referidos como efeitos laterais) resultando daadministração do tratamento. "Menos efetivo" significa que os resultados de tratamento em um nível menor terapeuticamente significante de eficáciafarmacológica e/ou um nível terapeuticamente maior de efeitos fisiológicosadversos.

Moléculas de ácido nucleico podem ser isoladas de umaamostra biológica particular, usando qualquer um dentre váriosprocedimentos, que são bem conhecidos na arte, o procedimento deisolamento particular selecionado sendo apropriado para a amostra biológicaparticular. Por exemplo, procedimentos de congelamento descongelamento elise alcalina podem ser utilizáveis para obter moléculas de ácido nucleico apartir de materiais sólidos; procedimentos de calor e lise alcalina podem serutilizáveis para obter moléculas de ácido nucléico a partir de urina; e extraçãode proteinase K pode ser usada para obter ácido nucleico a partir de sangue(Rolff, A et al. PCR: Clinicai Diagnostics and Research, Springer (1994).

Como usado aqui, um "câncer" em um indivíduo ou pacienterefere-se a presença de células possuindo características de células típicascausadoras de câncer, como proliferação descontrolada, imortalidade,potencial metastático, crescimento rápido e taxa de proliferação, e algunsaspectos morfológicos característicos. Em algumas circunstâncias, as célulasde câncer não terão a forma de um tumor, ou estas células podem existirlocalmente dentro de um animal, ou circular na corrente sangüínea comocélulas independentes.

EXEMPLOS

Compostos. Compostos usados aqui, incluindo EKB-569, HK1-357, e HK1-272 como descritos em Patente U.S. 6,002,008; Greenberger etal, Proc. 11* NCI EORTC-AACR Symposium on New Drugs in CâncerTherapy, Clinicai Câncer Res. Vol. 6 Supplement, Nov. 2000, ISSN 1078-0432; em Rabindran et al., Câncer Res. 64: 3958- 3965 (2004); Holbro eHynes, Ann. Rev. Pharm. Tox. 44:195-217 (2004); e Tejpar et al., J. Clin.Oncol. ASCO Annual Meeting Proc. Vol. 22, No. 14S: 3579 (2004).

Análise de NSCLC Recorrente e Geração de Células NCI-Hl 650 Resistentes a Gefitinib. Amostras clínicas de NSCLC recorrenteforam obtidas após autópsia após aprovação apropriada. Todo o domínioquinase de EGFR foi seqüenciado após análise de produtos PCR nãoclonados. Múltiplos clones de exon 20 foram seqüenciados para examinarcodon 790. Análise mutacional de EGFR (exons 1-28), ERBB2 (exons 1-24),PTEN(Qxons 1-9), Kras (codons 12, 13, e 61), e p53 (exons 5-8) em clonesresistentes a gefitinib assim como a linhagem de células parental NCI-H1650foi realizada por seqüenciamento automatizado de exons individuais eflanqueamento da seqüência intrônica (condições PCR disponíveis emsolicitação) com seqüenciamento bidirecional por uso de química determinador de corante (BIGDYE versão 1.1, Applied Biosystems). Reaçõesde seqüenciamento foram cicladas em um sequenciador ABI3100 (AppliedBiosystems), e electroferogramas foram analisados usando software SEQUENCE NAVIGATOR e FACTURA (Applied Biosystems).

Para gerar subclones resistentes de células NCI-H1 650, estasforam tratadas com etil metano sulfonato (EMS; 600 ug/ml), deixadasrecuperar durante 72 h, e então semeadas em uma densidade de 6 x IO4células por disco de 10-cm2 em 20 uM gefitinib. Resistência relativa destascélulas a gefitinib, comparado com os inibidores irreversíveis, foi obtida porsemeadura de 5 x IO4 células em placas de seis cavidades em 5% FCS e 100ng/ml EGF (Sigma), na presença de concentrações variadas de fármacos,seguido após 72 h por fixação das células com 4% formaldeído, coloraçãocom 0,1% violeta cristal, e quantificação da massa de células usando oSistema de formação de imagem infra-vermelho Odyssey (LI-CORBiosciences, Lincoln, NE). Para experimentos de abate de RNA interferênciapequeno (siRNA), células foram transfectadas com oligonucleotídeos de RNAfilamento duplo marcando EGFR, ERBB2 (ambos SMARTpool deDharmacon, Lafayette, CO), ou controle não específico (LRT1B), usandoreagente de transfecção X-treme GENE (Roche Applied Science). Após 72 h,células foram coloridas com violeta cristal e analisadas no varredor de infra-vermelho Odyssey.

Estudos de Immunoblotting e Sinalização. Inibição desinalização de EGFR por concentrações crescentes de gefitinib ou osinibidores irreversíveis foi determinada por semeadura de 9 x 10 células emplacas de 24 cavidades, adicionando os fármacos ao meio contendo 5% FCSdurante 15 min, seguido por um pulso de 2 horas com 100 ng/ml EGF, ecoletando os lisados. Os lisados foram preparados em tampão de carga 2x gel,sonicados, fervidos e então separados por 10% SDS/PAGE, seguido poreletrotransferência a membranas de fluoreto de polivinilideno (PVDF), eimunoblotting. Anticorpos usados foram fosfo-EGFR Yl 068 e proteínaquinase ativada por fosfo-mitogênio (MAPK) (Cell sinalling Technology,Beverly, MA), fosfo-AKT (BioSource International, Camarillo, CA), eEGFR, MAPK, AKT, e tubulina totais (Santa Cruz Biotechnology).

Análise de Internalização de EGFR. Para demonstrar ainternalização de EGFR por microscopia de fluorescência, células foramcultivadas em tampas e incubadas com 1 ng/ml (rh) EGF humanorecombinante (Molecular Probes, Eugene, OR) para vários intervalos antes defixar em 4% paraformaldeído durante 10 min. As tampas foram lavadas emPBS e montadas com reagente anti-desbotamento ProLong Gold (MolecularProbes). Para quantificar a internalização de EGFR por biotinilação desuperfície de células, células foram cultivadas até confluência, pré-tratadascom ciclo-hexamida, incubadas em gelo durante 1 h com 1,5 mg/mlsulfossuccinimidil-2-(biotinamido)etil-l,3-ditiopropionato (sulfo-NHS-SS-biotina; Pierce), e lavados com tampão de bloqueio (50 nM NH4CL/I raMMgCl2A).l mM CaCl2 em PBS) para extinguir sulfo-NHS-SS-biotina livre,seguido por várias outras lavagens com PBS. As células foram entãoincubadas em meio de cultura a 37°C por vários intervalos para permitir ainternalização das moléculas biotiniladas, lavadas duas vezes durante 20 minem uma solução de glutationa (50 mM glutationa/75 mM NaCl/75 mMNaOH/1% BSA) em gelo para extrair todos os grupos biotinila da superfícieda célula, e então raspados e Usados em 500 uM tampão de teste deradioimunoprecipitação (RIPA) (25 mM Tris-HCl, pH 7.4, com 150 mMNaCL/0,1% SDS/1% Triton X-100) suplementado com NaF, Na-ortovanadato, e inibidores de protease. Extratos de células foram centrifugados, eos sobrenadantes foram incubados com contas de estreptavidina (Sigma) paracoletar as proteínas biotiniladas, que foram então analisadas por SDS/PAGE eimunoblotting com anticorpo anti-EGFR (SC-03, Santa Cruz Biotechnology)ou anticorpo contra receptor de transferrina (Santa Cruz Biotechnology).Resultados e Discussão

Análise de cânceres recorrentes de pulmão com resistênciaadquirida a gefitinib. NSCLC resistente a gefitinib recorrente desenvolvidoem dois pacientes cujos tumores tinham abrigado uma mutação ativante deEGFR quinase no momento do diagnóstico e que tinham mostrado umaresposta clínica inicial dramática ao fármaco (1). Em ambos os casos, doençametastático progressiva no fígado levou à morte dos pacientes, 1-2 anos apósiniciação de tratamento. Em caso 1, análise da metástase principal do fígadoobtida no momento da autópsia indicou persistência da mutação EGFRsensibilizante (L858R), assim como a presença de uma mutação T790Mrecentemente adquirida (Fig. IA). De modo interessante, análise de produtosPCR não clonados mostrou a mutação L858R inicial como estando presenteem uma abundância consistente com uma mutação heterozigótica que estápresente em todas as células de tumor, enquanto a mutação T790M secundáriafoi vista em aproximadamente um quinto da abundância do alelo de tiposelvagem correspondente. Assim, esta mutação associada com resistênciaparece estar presente em somente a fração de células dentro do tumorrecorrente.

Caso 2 envolveu oito distintas metástases recorrentes nofígado após a falha da terapia com gefitinib. Em todas estas lesõesindependentes, a mutação de EGFR L861Q sensibilizante estava presente narelação esperada para uma mutação heterozigótica. Não foi detectável umamutação EGFR secundária por análise de produtos PCR não clonados de qualquer uma destas metástases. No entanto, após subclonagem dos produtosPCR, a mutação T790M foi verificada como estando presente em umafreqüência muito baixa em dois dos quatro tumores metastático analisados(T790M, 2 de 50 clones seqüenciados da lesão 1 e 1 de 56 da lesão 2), masnão das duas outras metástases recorrentes (0 de 55 clones da lesão 3 e 0 de59 da lesão 4), ou o tumor primário (0 de 75 clones) (Fig. W e Tabela 1).Tomados juntos, estes resultados são consistentes com relatos anteriores deque a mutação T790M está presente em alguns, mas não todos, os casos deresistência adquirida a gefítinib (três de sete tumores; ver refs. 17, 18, e 21). Além disso, como previamente notado (18), mesmo em alguns casos com estamutação associada a resistência, ela parece estar presente em somente umapequena fração de células de tumor dentro de uma lesão recorrente. Estasobservações sugerem que adicionais mecanismos de resistência estãoenvolvidos em casos sem uma mutação EGFR secundária e que estes mecanismos coexistem com a mutação T790M em outros casos.

Geração de linhagens de células resistentes a gefítinib comsusceptibilidade a inibidores irreversíveis. Dada a excelente correlaçãoentre a responsividade clinica de NSCLC mutante de EGFR e a melhoradasensibilidade a gefítinib de linhagens de células NSCLC com estas mutações (2, 6, 22, 23), e a limitada disponibilidade de amostras clinicas dos pacientescom relapso, os requerentes modelaram a resistência a gefítinib in vitro. Osrequerentes cultivaram a linhagem de células de câncer broncoalveolar NCI-Hl 650, que tem uma deleção in-frame de quinase EGFR (delE746-A750), em20 uM gefítinib, com ou sem exposição anterior ao mutagene etil metanosulfonato. Esta linhagem de células demonstra um aumento de 100 vezes nasensibilidade a gefítinib, comparado com algumas linhagens de NSCLCexpressando EGFR tipo selvagem (6). Apesar da vasta maioria destas célulasserem efetivamente mortas por 20 uM gefítinib, colônias resistentes aofármaco foram prontamente observadas em uma freqüência de ~10~5, sem levar em contra o tratamento com o mutagene. Quarenta e nove clonesresistentes ao fármaco independentes foram isolados, mostrando umadiminuição média de 50 vezes em sensibilidade a gefítinib (Fig. 2A). Todosestes mostraram uma persistência da mutação sensibilizante sem expressãoalterada de EGFR, e nenhum tinha adquirido uma mutação EGFR secundáriaou novas mutações em ERBB2, p53, Kras, ou PTEN. Clones resistentes agefitinib demonstraram comparável resistência a inibidores relacionados daclasse de anilinoquinazolina. Notavelmente, no entanto, eles mostraram umapersistente sensibilidade a três inibidores de família ERBB (Fig. 2A): HKI-272 (24) e HKI-357 (composto 7f em ref. 25), que são inibidores duais deEGFR e ERBB2 (valores IC50 de 92 e 34 nM, respectivamente, para EGFR e59 e 33 nM, respectivamente, para ERBB2), e EKB-569 (26), um inibidorseletivo de EGFR (valores IC50 de 39 nM para EGFR e 1,3 uM para ERBB2)(Wyeth) (Fig. 2B). Todos os três fármacos são inibidores irreversíveis, maisprovavelmente via uma ligação covalente com o resíduo cys773 dentro dodomínio catalítico de EGFR ou o cys805 de ERBB2. Como gefitinib, estescompostos demonstram aumentada morte de células NSCLC abrigando umamutação EGFR, comparado com células expressando receptor tipo selvagem(Fig. 2A). No entanto, em contraste com gefitinib, contra o qual os clonesresistentes são prontamente gerados, mesmo em concentrações elevadas dofármaco, os requerentes foram incapazes de estabelecer clones de células queforam resistentes aos inibidores irreversíveis em concentrações acima de 10uM, mesmo após a mutagenese com etil metano sulfonato (Fig. 2C).

Dependência de células resistentes a gefitinib em expressãode EGFR e ERBB2. Para adquirir um esclarecimento sobre os mecanismossubjacentes à aquisição de resistência a gefitinib e a sensibilidade persistenteaos inibidores irreversíveis, os requerentes primeiro determinaram se aslinhagens de células resistentes permanecem dependentes de EGFR para suaviabilidade. Os requerentes mostraram previamente que o abate mediado porsiRNA de EGFR dispara a apoptose em células abrigando EGFRs mutantes,mas não nos alelos de tipo selvagem (6). Significantemente, células NCI-FH650 parentais, assim como seus derivados resistentes a gefitinib mostraramuma redução comparável em viabilidade de células após transfecção comEGFR marcando siRNA (Fig. 3A). Assim, a aquisição de resistência agefitinib não envolve a ativação independente de EGFR de efetores amontante. Porque HKI-272 e HKI-357 marcam tanto EGFR como ERBB2, osrequerentes também testaram a supressão deste receptor relacionado. O abatede ERBB2 em NCI-H1 650 e seus derivados resistentes a gefitinib tambémcausaram perda de viabilidade (Fig. 3A), sugerindo um papel paraheterodímeros EGFR-ERBB2 na transdução dos sinais de sobrevivênciaessenciais em células de tumor abrigando mutações EGFR. Inibição de EGFRsozinho por um inibidor irreversível parece ser suficiente para induzirapoptose em células resistentes a gefitinib, como demonstrado pela eficáciade EKB-569, que primariamente marca EGFR (26). No entanto, dados osefeitos potencialmente complementares de marcação tanto de EGFR como deERBB2 por uso de siRNA e a disponibilidade de inibidores irreversíveis quemarcam ambos estes membros da família, o benefício potencial da inibiçãodual certifica esta consideração.

Os requerentes compararam a capacidade de gefitinib einibidores irreversíveis da família ERBB como suprimindo a sinalização viaefetores a montante de EGFR que mediam suas vias proliferativas e desobrevivência. HKI-357 foi 10 vezes mais efetivo do que gefitinib nasupressão de autofosforilação de EGFR (medido em resíduo Y 1068), efosforilação de AKT e MAPK em células NCI-H1 650 parentais abrigando amutação de EGFR delE746-A750 (Fig. 3B). Em um derivado resistente agefitinib, NCI-H1650(G7), gefitinib demonstrou uma eficáciaconsideravelmente reduzida na supressão da fosforilação de AKT, um efetorde sinalização de EGFR chave, ligado a responsividade a gefitinib (6), enquanto HKI-357 demonstrou uma atividade persistente (Fig. 3B).

Internalização de EGFR alterada em genes resistentes aGefitinib. Dada a ausência de mutações secundárias em EGFR e a persistentesusceptibilidade de células resistentes a gefitinib para a supressão mediadapor siRNA de EGFR, os requerentes testaram se os mecanismos subjacentes àinibição diferencial de sinalização de EGFR em células resistentes a gefitinibpor inibidores reversíveis e irreversíveis podem estar correlacionados comalterações em tráfico de receptores, a um modulador bem documentado desinalização dependente de EGFR (20). De fato , análise de tráfico de EGFRem células resistentes derivadas de NCI-H1 650- demonstrou um consistenteaumento em internalização de EGFR, comparado com as células parentaissensíveis a fármaco, como medido tanto por internalização de EGF rotuladocom fluoresceína (fig. 3C) como quantificação de EGFR citoplásmicobiotinilado (Fig. 3D). Não foi observado tal efeito com o receptor de transferrrina, sugerindo que isto não resulta de uma alteração generalizada emtodo o processamento do receptor. Apesar de outro trabalho ser requerido paradefinir o mecanismo preciso para esta alteração do tráfico de EGFR, umprocesso complexo em numerosas proteínas regulatórias foram implicadas,estes resultados sugerem que a capacidade de gefitinib para inibir a ativação de EGFR está comprometida nestas células , enquanto a ação dos inibidoresirreversíveis não foi afetada de modo detectável.

Inibição de sinalização de EGFR T790M e melhoradoextermínio de células por inibidores irreversíveis. A melhorada supressãode sinalização EGFR por ERBB inibidores irreversíveis criou a possibilidade de que estes fármacos também podem demonstrar persistente atividade nocontexto de células abrigando a mutação secundária T790M em EGFR. Osrequerentes assim testaram os efeitos destes inibidores em linhagem decélulas NCI-H1 975 de câncer broncoalveolar, que abriga tanto mutaçõesL858R como T790M em EGFR (18). Significantemente, testa linhagem de células foi derivada de um paciente que não tinha sido tratado com uminibidor de EGFR, indicando que esta mutação não é apenas associada comresistência adquirida ao fármaco. Tanto HKI-357 como HKI-272 foramconsideravelmente mais efetivos do que gefitinib em supressão deautofosforilação de EGFR induzida por ligando e sua sinalização a montante,como determinado por fosforilação de AKT e MAPK (Fig. AA).Similarmente, todos os três inibidores irreversíveis suprimiram proliferaçãonesta linhagem de células sob condições onde é resistente a gefltinib (Fig.4B). Assim, inibidores irreversíveis de ERBB parecem ser efetivos em célulasabrigando o EGFR T790M assim como em células com tráfico alterado doreceptor de tipo selvagem.

Os resultados dos requerentes confirmam o relato de mutaçõesde T790M em EGFR como mutações secundárias que surgem em NSCLCspreviamente sensíveis abrigando uma mutação ativante, associado com aemergência de resistência adquirida (17, 18). No entanto, esta mutação épresente somente em um subconjunto de casos, e mesmo tumores queabrigam a mutação T790M podem conter somente uma fração pequena decélulas com esta mutação. Estas observações implicam que os mecanismos deresistência múltipla podem coexistir em tumores recorrentes após umaresposta inicial a gefltinib ou inibidores reversíveis similares de EGFRs.Além disso, estas descobertas sugerem que mecanismos de resistênciaindependentes de T790M podem ser igualmente, se não mais, efetivos do quea própria substituição de T790M para conferir resistência ao fármaco e podemexplicar porque os tumores recorrentes raramente demonstram clonalidadepara T790M (17, 18). Mecanismos in vitro de resistência adquirida a gefltinibnão envolvem mutações de EGFR secundárias em uma freqüênciasignificante, mas ao contrário estão correlacionados com alterada passagemde tráfico do receptor. No entanto, deve ser notado que os requerentes nãoexaminaram a passagem de tráfico de EGFR em todos os clones resistentesque os requerentes estabeleceram in vitro, e permanece possível quemecanismos adicionais podem contribuir para a resistência a gefltinib emalguns dos clones. Mesmo assim, virtualmente todos os clones resistentes agefltinib demonstraram uma sensibilidade comparável aos inibidores deERBB irreversíveis.Os resultados dos requerentes indicam diferenças marcantesentres os inibidores competitivos de EGFR como gefitinib, cuja eficácia élimitada para o desenvolvimento rápido de resistência ao fármaco in vitro, einibidores irreversíveis, em que resistência adquirida parece ser rara (Fig. 2C). Os requerentes especulam que a internalização aumentada de EGFR ligado aligando em células resistentes pode estar ligada à dissociação do complexogefitinib— EGFR no pH baixo de vesículas intracelulares. Em contraste,reticulação irreversível do receptor não deve ser afetada por estas alteraçõesna passagem do tráfico de receptor. Resistência adquirida a gefitinib é estavelmente mantida após passagem de células por até 20 gerações naausência do fármaco, sugerindo que alterações genéticas ou epigenéticas emgenes que modulam virada de EGFR podem estar subjacentes a estefenômeno. Porque a passagem de tráfico do receptor não pode serprontamente estudada por uso de amostras clínicas disponíveis, a identificação destas alterações genômicas pode ser requerida antes dascorrelações clinicas serem possíveis. Mesmo assim, este mecanismo podecontribuir para a resistência a gefitinib adquirida in vivo em pacientes comdoença recorrente que não apresentam mutações secundárias em EGFR.

Inibidores de ERBB irreversíveis também parecem ser efetivos para superar resistência a gefitinib mediada pela mutação T790M, umefeito que provavelmente resulta da preservação de ligação do inibidor apesarda alteração deste resíduo crítico.. Apesar deste trabalho estar em progresso,outro inibidor irreversível de EGFR [CL-387,785, Calbiochem (27)]foimostrado como inibindo a atividade quinase de mutante de EGFR T790M(17). A eficácia de CL-387,785 no contexto de T790M foi proposta pararesultar da ausência de um cloreto na posição 3 do grupo anilina, que estápresente em gefitinib e foi postulada como interferindo estéreo-quimicamentecom a ligação ao mutante metionina em codon 790. No entanto, EKB-569,HKI-272, e HKI-357 tem, todos, porções cloreto na posição no anel anilina,sugerindo que sua capacidade compartilhada para ligar irreversivelmente aEGFR é provavelmente para explicar sua eficácia, em vez da ausência de umainteração estéreo-química específica com T790M (24-26). Assim, estesinibidores irreversíveis podem demonstrar ser amplamente efetivos para evitarvários mecanismos de resistência, além da mutação T790M.

Tabela 1. Presença de mutação EGFR T790M em uma freqüência muitobaixa em tumores recorrentes do caso 2

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O seqüenciamento de números grandes de produtos PCRclonados revelou que uma minoria de alelos dentro de duas de quatro lesõesno fígado contém a mutação T790M.

As referências citadas em todo o pedido são incorporadas aquipor referência em sua totalidade.

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<150> 60/671,989<151> 2005-04-15

<160> 5

<170> Patentln Ver. 3.3

<210> 1

<211> 3878

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220><221> CDS

<222> (246) .. (3875)c400>- 1

cccggcgcag cgçggccgca gcagcctccg ccccccgcac ggtgtgagcg cccgacgcgg 60

ccgaggcggc cggagtcccg agctagcccc ggcggccgcc gccgcccaga ccggacgaca 120

ggccacctcg tcggcgtccg cccgagtccc cgcctcgccg ccaacgccac aaccaccgcg 180

cacggccccc tgactccgtc cagtattgat cgggagagcc ggagcgagct cttcggggag 240

cagcg atg cga ccc tcc ggg acg gcc ggg gca gcg etc ctg gcg ctg ctg 290Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu1 5 10 15

gct gcg etc tgc ceg gcg agt cgg gct ctg gag gaa aag aaa gtt tgc 338Ala Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Vai Cys20 25 30

caa ggc acg agt aac aag etc acg cag ttg ggc act ttt gaa gat cat 386Gln Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His35 40 45

ttt etc age etc cag agg atg ttc aat aac tgt gag gtg gtc ctfggg 434Phe Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Vai Vai Leu Gly50 55 60aat ttg gaa att acc tat gtg cag agg sat tat gat ctt tcc ttc tta 482Asn Xeu Glu lie Thr Tyr Vai Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu6S 70 75

aag acc ate cag gag gtg gct ggt tat gtc etc att gcc etc aac aca 530Lys Thr lie Gln Glu Vai Ala Gly Tyr Vai Leu lie Ala Leu Asn Thr80 '85 90 55

gtg gag cga att cet ttg gaa aac ctg cag ate ate aga gga aat atg 578Vai Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu Gln lie lie Arg Gly Asn Met100 105 110

tac tac gaa aat tcc tat gcc tta gea gtc tta tet aac tat gat gea 626Tyr Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Vai Leu Ser Asn Tyr Asp Ala115 120 125

aat aaa acc gga ctg aag gag ctg cec atg aga aat tta cag gaa ate 674Asn Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu lie130 135 140

ctg cat ggc gcc gtg cgg ttc age aac aac cet gcc ctg tgc aac gtg 722 *Leu His Gly Ala Vai Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Vai145 150 155

gag age ate cag tgg.cgg gac ata gtc age agt gac ttt etc age aac 770Glu Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Vai Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn160 I 165 170 .175

atg tcg atg gac ttc cag aac cac ctg ggc age tgc caa aag tgt gat 818Met Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp180 185 190

cca age tgt cec aat ggg age tgc tgg ggt gea gga gag gag aac tgc 866Pro Ser Cys Pro Asn Gly Ser.Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys195 200 205

cag aaa ctg acc aaa ate ate tgt gcc cag cãg tgc tcc ggg cgc tgc 914Gln Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys210 215 220

cgt ggc- aag tcc cec agt gac tgc tgc cac aac cag tgt gct gça ggc 962Arg Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly225 230 ( 235

tgc aca ggc.cec cgg gag age gac tgc ctg gtc tgc cgc aaa ttc cga 1010Cys Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Vai Cys Arg Lys Phe Arg240 - 245 250 " ' 255

gac gaa gcc acg tgc aag gac- acc tgc cec cca etc atg etc tac aac 1058Asp Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn260 265 270

cec acc acg tac cag atg gat gtg aac cec gag ggc aaa tac age ttt 1106Pro Thr Thr Tyr Gln. Met Asp Vai Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe275 280 285ggt gcc acc tgc gtg aag aag tgt ccc cgt aat tat gtg gtg aca gat 1154

Gly Ala Thr Cys Vai Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Vai Vai Thr Asp

290 295 300

cac ggc tcg tgc gtc cga gcc tgt ggg gcc gac age tat gag atg gag 1202

His Gly Ser Cys Vai Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu305 310 315

gaa gac ggc gtc cgc aag tgt aag aag tgc gaa ggg cet tgc cgc aaaGlu Asp Gly Vai Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pr o Cys Arg Lys320 325 330 335

1250

gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca etc tec ata" 1298Vai Cys Asn Gly lie Gly lie' Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu. Ser lie340 345 350

aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tec ate agt ggc 1346Asn Ala Thr. Asn lie Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser lie Ser Gly355 360 365

gat etc cac ate ctg ceg gtg gea ttt agg ggt gac tec ttc aca cat 1394Asp Leu His lie Leu "Pro Vai Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His370 375 380

act cet cet ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 1442Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp lie Leu Lys Thr Vai Lys385 390 395

gaa ate aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cet gaa aac agg acg 1490Glu lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr400 405 410 415

gac etc cat gcc ttt gag aac cta gaa ate ata cgc ggc agg acc aag 1538

Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu lie lie Arg Gly Arg Thr Lys420 425 430

✓

caa cat ggt cag ttt tet ctt gea gtc gtc age ctg aac ata aca tec 1586

Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Vai Vai Ser Leu Asn lie Thr Ser435 440 445

ttg ggà tta cgc tec etc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 1634Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Vai lie lie450 455 460 v .

tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gea aat aca ata aac tgg aaa aaa 1682Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys465 470 475

ctg ttt ggg acc tec ggt cag aaa acc aaa att ata age aac aga ggt 1730Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys lie lie Ser Asn Arg <31y480 485 490 495_

gaa aac age tgc aág gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tec 1778Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Vai Cys His Ala Leu Cys Ser500 505 510ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg 1826Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Vai Ser Cys Arg515 520 525

aat gtc age cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 1874Asn Vai Ser Arg Gly Arg Glu Cys Vai Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu530 535 540

ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac 1922Gly Glu Pro Arg Glu Phe Vai Glu Asn Ser Glu Cys lie Gln Cys His545 550 555

cca gag tgc ctg cet cag gcc atg aac ate acc tgc aca gga cgg gga' 1970Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn lie Thr Cys Thr Gly Arg Gly560 565 570 575

cca gac aac.tgt ate cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc 2018Pro Asp Asn Cys lie Gln Cys Ala His Tyr lie Asp Gly Pro His Cys* 580 585 590 -

gtc aag acc tgc ccg gea gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc 2066Vai Lys Thr Cys Pro Ala Gly Vai Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Vai595 ' 600 605

tgg aag tac gea gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac 2114Trp Lys Tyr Ala Asp Ala GÍy His Vai Cys His Leu Cys His Pro Asn610 615 620

tgc acc tac gga -tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat 2162Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly- Cys Pro Thr Asn625 630 635

ggg cet aag ate ccg tec ate gcc act ggg atg gtg ggg gcc etc etcGly Pro Lys lie Pro Ser lie Ala Thr Gly Met Vai Gly Ala Leu Leu*"640 645 650 655

2210

ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg ate ggc etc ttc atg cga agg cgc 2258Leu Leu Leu Vai Vai Ala Leu GÍy lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg660 665 670

cac ate gtt cgg aag cgc acg ctg cgg agg ctg ctg cag gag agg gag 2306His lie Vai Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu675 68Ò 685

ctt gtg gag cet ctt aca ccc agt gga gaa gct ccc aac caa gct etc 2354Leu Vai Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu690 695 700

ttg agg ate ttg aag gaa act gaa ttc aaa aag ate aaa gtg ctg ggc 2402Leu Arg lie Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys Vai Leu Gly705 710 715

tec ggt gcg ttc ggc acg gtg tat aag gga etc tgg ate cca gaa ggt 2450Ser Gly Ala Phe Gly Thr Vai Tyr Lys Gly Leu Trp lie Pro Glu Gly720 725 730 735gag aaa gtt aaa att ccc gtc gct ate aag gaa tta aga gaa gea aca 2498Glu Lys Vai Lys lie Pro Vai Ala lie Lys Glu,Leu Arg Glu Ala Thr740 745" 750

tet ceg aaa gcc aac aag gaa ate etc gat gaa gcc tac gtg atg gcc 2546Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyr Vai Met Ala755 760 765

age gtg gac aac ccc cac gtg tgc cgc ctg ctg ggc ate tgc etc acc 2594Ser Vai Asp Asn Pro His Vai Cys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr770 775 780

tec acc gtg cag etc ate acg cag etc atg ccc ttc ggc tgc etc ctg 2642Ser Thr Vai Gln Leu lie Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu785 790 795

gac tat gtc cgg "gaa cac aaa gac aat att ggc tec cag tac ctg etc 2690Asp Tyr Vai Arg Glu His Lys Asp Asn lie Gly Ser Gln Tyr Leu Leu800 805 810 815

aac tgg tgt gtg cag ate gea aag ggc atg aac tac ttg gag gac cgt 2738Asn Trp Cys Vai Gln IIe Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg820 825 830

cgc ttg gtg cac cgc gac ctg gea gcc agg aac gta ctg gtg aaa aca 2786Arg Leu Vai Kis Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Vai Leu Vai Lys Thr835 840 845

ceg cag cat gtc aag ate aca gat ttt ggg ctg gcc aaa ctg ctg ggt 2834Pro Gln His Vai Lys lie Thr Asp Phe Gly Leu Ala. Lys Leu Leu Gly850 855 ,860

gcg gaa gag aaa gaa tac cat gea gaa gga ggc aaa gtg cet ate aag 2682Ala Glu Glu Lys Glu Tyr His Ala Glu Gly Gly Lys Vai Pro lie Lys865 870 875

tgg atg gea ttg gaa tca att tta cac aga ate tat acc cac cag agt 2930Trp Met Ala Leu Glu Ser lie Leu His Arg lie Tyr Thr His Gln Ser880 885 890 895

gat gtc tgg age tac ggg gtg acc gtt tgg gag ttg atg acc ttt gga 2978Asp Vai Trp Ser Tyr Gly Vai Thr Vai Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly900 905 910

tec aag cca tat gac gga ate cet gcc age gag ate tec tec ate ctg 3026Ser Lys Pro Tyr Asp Gly lie Pro Ala Ser Glu lie Ser Ser lie Leu915 920 925

gag aaa gga gaa cgc etc cet cag cca ccc ata tgt acc ate gat gtc 3074Glu Lys Gly Glu Ãrg Leu Pro Gln Pro Pro lie Cys Thr lie Asp Vai930 935 940

■tac atg ate atg gtc aag tgc tgg atg ata gac gea.-gat agt cgc cca 3122Tyr Met lie Met Vai Lys Cys Trp Met lie Asp Ala Asp Ser Arg Pro945 950 955aag ttc cgt gag ctg ate ate caa ttc tec aaa atg gcc cga gac cec 3170Lys Phe Arg Glu Leu lie lie Glu Phe Ser Lys Met Ala Arg Asp Pro960 965 970 975

cag cgc tac ctt gtc att cag ggg gat gaa aga atg cat ttg cca agt 3218Gln Arg Tyr Leu Vai lie Gln Gly Asp Glu Arg Met His Leu Pro Ser980 935 990

cet aca gac tec aac ttc tac cgt gcc ctg atg gat gaa gaa gac atg 3266Pro Thr Asp Ser Asn Phe Tyr Arg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met995 1000 1005

gac gac gtg gtg gat gcc gac gag tac etc ate cça cag cag ggc ttc 3314Asp Asp Vai Vai Asp Ala Asp Glu Tyr Leu lie Pro Gln Gln Gly Phe1010 1015 1020

ttc age age cec tçc acg tca cgg act cec etc ctg age tet ctg agt 3362Phe Ser ,Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser1025 ' 1030 1035

gea acc age aac aat tec acc gtg gct tgc att gat aga aat ggg ctg 3410Ala Thr Ser Asn Asn Ser Thr Vai Ala Cys lie Asp Arg Asn Gly Leu1040 1045 1050 1055

caa age tgt cec ate aag gaa gac age ttc.ttg cag cga tac age tca 3458Gln Ser Cys Pro lie Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser1060 1065 1070

gac cec aca ggc gcc ttg act gag gac age ata gac gac acc ttc etc 3506Asp Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser lie Asp Asp Thr Phe Leu1075 1080 1085

cca gtg cet gaa tac ata aac cag tec gtt cec aaa agg cec gct ggc 3554Pro Vai Pro Glu Tyr lie Asn Gln Ser Vai Pro Lys Arg Pro Ala Gly1090 1095 1100

tet gtg cag aat cet gtc tat cac àat cag cet ctg aac cec gcg cec 3602Ser Vai Gln. Asn Pro Vai Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro1105 1110 1115

age aga gac cca cac tac cag gac cec cac age act gea gtg ggc aac 3650Ser Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Vai Gly Asn1120 1125 1130 1135

cec gag tat etc aac act gtc cag cec acc tgt gtc aac age aca ttc 3698Pro Glu Tyr Leu Asn Thr Vai Gln Pro Thr Cys Vai Asn Ser Thr Phe1140 1145 1150

gac age cet gcc cac tgg gcc cag aaa ggc age cac caa att age ctg 3746Asp Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln lie Ser Leu1155 1160 1165

gac aac cet gac tac cag cag gac ttc ttt cec aag gaa gcc aag cca 3794Asp Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Ásp Phe Phe Pro Lys Glu Ala Lys Pro1170 1175 1180aat ggc ate ttt aag ggc tec aca gct gaa aat gea gaa tac cta agg 3842Asn Gly lie Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr Leu Arg1185 1190 1195

gtc gcg cca caa age agt gaa ttt att gga gea tga 3878Vai Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe lie Gly Ala1200 1205 1210

<210> 2•<211> 1210<212> PRT<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Vai Cys Gln20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Vai Vai Leu Gly Asn50 55 60

Leu Glu lie Thr Tyr Vai Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys65 70 75 80

Thr lie Gln Glu Vai Ala Gly Tyr Vai Leu lie Ala Leu Asn Thr Vai85 90 95

Glu Arg lie Pro Leu Glu Asn Leu Gln lie lie Arg Gly Asn Met Tyr100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Vai Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu lie Leu130 1Í35 140

His Gly Ala Vai Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Vai Glu145 150 155 160

Ser lie Gln Trp Arg Asp lie Vai Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

i

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln195 ' 200 205

Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg210 215 220Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Vai Cys Arg Lys Phe Arg Asp245 250 255

Glu Ala Thr Cys- I.ys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Vai Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly275 280 285

Ala Thr Cys Vai Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Vai Vai Thr Asp His290 295 300

Gly Ser Cys Vai Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu305 310 315 320

Asp Gly Vai Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Vai325 330 335

pys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser lie Asn340 345 350

Ala Thr Asn IleLys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ilè Ser Gly Asp355 360 365

Leu His lie Leu Pro Vai Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp lie Leu Lys Thr Vai Lys Glu385 . 390 395 400

lie Thr Gly Phe Leu Leu lie Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp405 410 415

•Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu lie lie Arg Gly Arg Thr Lys Gln420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Vai Vai Ser Leu Asn lie Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu lie Ser Asp Gly Asp Vai lie lie Ser450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys lie lie Ser Asn Arg Gly Glu485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Vai Cys His Ala Leu Cys Ser Pro500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Vai Ser Cys Arg Asn515 520 525Vai Ser Arg Gly530

Glu Pro Arg Glu545

Clü Cys Leu Pro

Asp Asn Cys lie580

Lys Thr Cys Pro595

Lys Tyr Ala Asp610

Thr Tyr Gly Cys625

Pro Lys lie Pro

Arg Glu Cys Vai535

Phe Vai Glu Asn550

Gln Ala Met Asn565

Gln Cys Ala His

Ala Gly Vai Met600

Ala Gly His Vai615

Thr Gly Pro Gly630

Ser lie Ala Thr645

Asp Lys Cys Asn540

Ser Glu Cys lie555

lie Thr Cys Thr570

Tyr lie Asp Gly585

Gly Glu Asn Asn

Cys His Leu Cys620

Leu Glu Gly Cys635

Gly Met Vai Gly650

Leu Leu Glu Gly

Gln Cys His Pro560

Gly Arg Gly Pro575

Pro His Cys Vai590

Thr Leu Vai Trp605

His Pro Asn Cys

Pro Thr Asn Gly640

Ala Leu Leu Leu655

Leu Leu Vai Vai Ala Leu Gly lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His660 665' 670

lie Vai Arg. Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln Glu Arg Glu Leu675 680 685

Vai Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly Glu Ala Pro Asn Gln Ala Leu Leu690 695 700

Arg lie Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys-Vai Leu Gly Ser705 710 715 720

Gly Ala Phe Gly Thr Vai Tyr Lys Gly Leu Trp lie Pro Glu Gly Glu725 ' 730 ^ 735

Lys Vai Lys lie Pro Vai Ala lie Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser740 745 750

Pro Lys Ala Asn Lys Glu lie Leu Asp Glu Ala Tyr Vai Met Ala Ser755 760 765

Vai Asp Asn Pro His Vai Cys Arg Leu Leu Gly lie Cys Leu Thr Ser770 775 780

Thr Vai Gln Leu lie Thr Gln Leu Met Pro Phe Gly Cys Leu Leu Asp785 790 795 800

Tyr Vai Arg Glu His Lys Asp Asn lie Gly Ser Gln Tyr Leu Leu Asn805 810 815

Trp Cys Vai Gln lie Ala Lys Gly Met Asn Tyr Leu Glu Asp Arg Arg820 825 830Leu Vai His Arg835

Gln His Vai Lys850

Glu Glu Lys Glu865

Met Ala Leu Glu

Vai Trp Ser Tyr900

Lys Pro Tyr Asp915

Lys Gly Glu Arg930

Met lie Met Vai945

Phe Arg G~Iu Leu

Asp Leu Ala Ala840

lie Thr Asp Phe855

Tyr His Ala Glu870

Ser lie Leu His885

Gly Vai Thr Vai

Gly lie Pro Ala920

Leu Pro Gln Pro935

Lys Cys Trp Met950

lie lie Glu Phe965

Arg Asn Vai Leu

Gly Leu Ala Lys860

Gly Gly Lys Vai875

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Trp Glu Leu Met905

Ser Glu lie Ser

Pro IIe Cys Thr940

lie Asp Ala Asp955

Ser Lys Met Ala970

Vai Lys Thr Pro845

Leu Leu Gly Ala

?rn tle T;y*t Trp880

His Gln Ser Asp895

Thr Phe Gly Ser910

Ser lie Leu Glu925

lie Asp Vai Tyr

Ser Arg Pro Lys960

Arg Asp. Pro Gln975

Arg Tyr Leu Vai lie Gln Gly Asp Glu Arg Mèt His Leu Pro Ser Pro980 985 990

Thr Asp Ser Asn Phe Tyr &rg Ala Leu Met Asp Glu Glu Asp Met Asp995 1000 1005

Asp Vai Vai Asp Ala Asp Glu Tyr Leu lie Pro Gln Gln Gly Phe Phe

x 1010 1015 1020

Ser Ser Pro Ser Thr Ser Arg Thr Pro Leu Leu Ser Ser Leu Ser Ala

1025 1030 1035 1040

Thr Ser Asn Asn Ser Thr Vai Ala Cys lie Asp Arg Asn Gly Leu Gln1045 1050 1055

Ser Cys Pro lie Lys Glu Asp Ser Phe Leu Gln Arg Tyr Ser Ser Asp1060 1065 1070

Pro Thr Gly Ala Leu Thr Glu Asp Ser lie Asp Asp Thr Phe Leu Pro1075 1080 1085

Vai Pro Glu Tyr lie Asn Gln Ser Vai Pro Lys Arg Pro Ala Gly Ser1090 1095 1100

Vai Gln Asn Pro Vai Tyr His Asn Gln Pro Leu Asn Pro Ala Pro Ser1105 * 1110 1115 1120

Arg Asp Pro His Tyr Gln Asp Pro His Ser Thr Ala Vai Gly Asn Pro1125 1130 1135Glu Tyr Leu Asn Thr Vai Gln Pro Thr Cys Vai Asn Ser Thr Phe Asp1140 1145 1150

Ser Pro Ala His Trp Ala Gln Lys Gly Ser His Gln lie Ser Leu Asp1155 1160 1165

Asn Pro Asp Tyr Gln Gln Asp Phe Phe Pro Lys Clü Ala Lys Pro Asn1170 1175 1180

Gly lie Phe Lys Gly Ser Thr Ala Glu Asn Ala Glu Tyr LeuArg Vai1185 1190 1195 1200

Ala Pro Gln Ser Ser Glu Phe lie Gly Ala1205 1210

<210> 3<211> 1S<212> DNA<213> seqüência artificial

<220> <223> Description of Artificial Sequence: Syntheticoligonucleotide

<400> 3tgcarctcat cacgca

<210> 4<211> 16<212> DNA

<2i3> seqüência artificial

<220>

<223> Descrição de seqüência artificial de nucleotideossintético

c400> 4

tgcarctcat caygca

<210> 5<211> 16

<212> DNA ^

<213> seqüência artificial

<220> ' -

<223> Descrição de seqüência artificial de nucleotideossintético

<400> 5

tgcãactcat catgca

Claims (27)

1. Método para tratamento de câncer resistente a gefitinib e/ou erlotinib, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:a. monitorar progressão de um câncer em um indivíduo em um ponto no tempo após o indivíduo ter iniciado tratamento com gefitinib e/ouerlotinib, em que progressão do câncer é indicativa de câncer que é resistente a tratamento com gefitinib e/ou erlotinib; eb. administrar ao indivíduo tendo um câncer que é resistente a tratamento com gefitinib e/ou erlotinib uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de receptor de fator de crescimento epidérmico irreversível (EGFR).

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR irreversível é selecionado dentre o grupo consistindo de EKB-569, HKI-272 e HKI-357.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR irreversível liga a cisteína 773 de EGFR (SEQ IDNO:l).

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que progressão do câncer é monitorada por meio de inspeção visual do câncer.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que inspeção visual do câncer é por meio de raio-X, varredura por CT ou MRI.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a progressão do câncer é monitorada por meio de detecção de biomarcador de tumor.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que monitorar a progressão de um câncer compreende comparar o câncer em um segundo ponto no tempo com o câncer em um primeiro pontono tempo, em que o segundo ponto no tempo é após o primeiro ponto no tempo, em que o primeiro ponto no tempo é antes ou após iniciação de tratamento com gefítinib e/ou erlotinib, em que um crescimento aumentado do câncer indica progressão do câncer.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que nos pontos no tempo adicionais o câncer é comparado com pontos no tempo precedentes.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de célula epitelial.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o câncer é câncer gastrointestinal, câncer da próstata, câncer ovariano, câncer da mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer do esôfago, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer do sistema nervoso, câncer do rim, câncer da retina, câncer da pele, câncer do fígado,câncer pancreático, câncer genito-urinário e câncer da bexiga.

11. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:a. administrar gefítinib e/ou erlotinib a um indivíduo com câncer;b. monitorar progressão do câncer do indivíduo; ec. administrar ao indivíduo um inibidor de EGFR irreversível quando de indicação de progressão do câncer.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR irreversível é selecionado dentre o grupo consistindo de EKB-569, HKI-272 e HKI-357.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR irreversível liga a cisteína 773 de EGFR (SEQIDNO: 1).

14. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a progressão do câncer é monitorada por meio de inspeção visual do câncer.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que inspeção visual do câncer é por meio de raio-X, varredura por CT ou MRI.

16. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a progressão do câncer é monitorada por meio de detecção de biomarcador de tumor.

17. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que monitorar a progressão de um câncer compreende comparar o câncer em um segundo ponto no tempo com o câncer em um primeiro ponto no tempo, em que o segundo ponto no tempo é após o primeiro ponto no tempo, em que o primeiro ponto no tempo é antes ou após iniciação de tratamento com gefitinib e/ou erlotinib, em que o crescimento aumentado do câncer indica progressão do câncer.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que nos pontos no tempo adicionais o câncer é comparado com pontos no tempo precedentes.

19. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de célula epitelial.

20. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer gastrointestinal, câncer da próstata, câncer ovariano, câncer da mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer do esôfago, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer do sistema nervoso, câncer do rim, câncer da retina, câncer da pele, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer genito-urinário e câncer da bexiga.

21. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR irreversível é administrado simultaneamente com um inibidor de EGFR reversível.

22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR reversível é gefitinib ou erlotinib.

23. Método para tratamento de câncer, caracterizado pelo fato de compreender administrar a um indivíduo com um câncer tendo uma mutação em EGFR (SEQ ID NO: 1), que a mutação é substituição de uma metionina por uma treonina na posição 790, uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor de EGFR irreversível.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR é selecionado dentre o grupo consistindo de EKB-569, HKI-272 e HKI-357.

25. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o inibidor de EGFR irreversível liga a cisteína 773

26. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de célula epitelial.

27. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer gastrointestinal, câncer da próstata, câncer ovariano, câncer da mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer do esôfago, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena, câncer do sistema nervoso, câncer do rim, câncer da retina, câncer da pele, câncer do fígado, câncer pancreático, câncer genito-urinário e câncer da bexiga.