BRPI0606840A2 - método para o diagnóstico in vitro de esteatose hepática ou de um soro ou amostra de soro de um paciente, e, kit para o diagnóstico de esteatose hepática em um paciente - Google Patents
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Abstract
MéTODO PARA O DIAGNóSTICO IN VI TR O DE ESTEATOSE HEPáTICA OU DE UM SORO OU AMOSTRA DE SORO DE UM PACIENTE, E, KIT PARA O DIAGNóSTICO DE ESTEATOSE HEPáTICA EM UM PACIENTE. A presente invenção é dirigida a um novo método de diagnóstico para detectar a extensão de esteatose hepática em um paciente, que sofre de uma doença que envolve esteatose hepática, ou que já possui um teste de diagnóstico positivo de fibrose do figado e/ ou presença de lesões necroinflamatórias no figado, através do uso de uma concentração no soro de marcadores biológicos facilmente detectáveis. A invenção é também dirigida a kits de diagnóstico para a implementação do método.
Description
"MÉTODO PARA O DIAGNÓSTICO IN VITRO DE ESTEATOSEHEPÁTICA OU DE UM SORO OU AMOSTRA DE SORO DE UMPACIENTE, E, KIT PARA O DIAGNÓSTICO DE ESTEATOSEHEPÁTICA EM UM PACIENTE"CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção é dirigida a um novo método dediagnóstico para detectar a extensão de esteatose hepática em um paciente, emparticular em um paciente, que sofre de uma doença que envolve esteatosehepática, ou que já possui um teste de diagnóstico positivo de fibrose dofígado e/ ou a presença de lesões necroinflamatórias no fígado, através do usode uma concentração de soro de marcadores biológicos facilmente detectável.A invenção é também dirigida a kits de diagnóstico para a implementação dométodo.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O fígado graxo, também denominado esteatose, é definidocomo um acúmulo excessivo de gordura em hepatócitos (Bravo AA, et al. N.Engl. J. Med. 2001: 495- 500; Angulo P. N. Engl. J. Med. 2002, Apr. 18; 346(.16): 1221- 31). A doença do fígado graxo envolve o acúmulo detriglicerídeos em hepatócitos, a necrose de hepatócitos, a inflamação (DayCP. Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. 2002; 16: 663- 78; Browning JD,Horton JD, J. Clin. Invest. 2004; 114: 147- 52), a obliteração de pequenasveias hepáticas e, de modo freqüente, a fibrose com algumas vezes progressãopara cirrose, câncer hepatocelular e morte relacionada ao fígado (El- SeragHB, et al., Gastroenterology, 2004; 126: 460- 468, Dam - Larsen S. et al. Gut2004; 53 : 750-5).
Em todo o mundo, a prevalência da esteatose hepática é muitoalta, associada com vários fatores, tais que o álcool, diabetes, excesso de peso,hiperlipidemia, resistência à insulina, Hepatite C genótipo 3,abetalipoproteinemia e algumas drogas (Bellentani S., et al. Ann. Intern. Med.2000; 132 : 112- 7; Levitsky J. Mailliard ME Semin. Liver Dis., 2004; 24:233 -47).
A doença do fígado graxo não- alcoólica (NAFLD), é umaresposta de adaptação do fígado à resistência à insulina, que pode provocar aesteatoepatite não- alcoólica (NASH), que pode, em si mesma, induzir aresposta fibrogênica, o que pode resultar em cirrose (Day CP, Best Pract. Res.Clin. Gastroenterol. 2002; 16: 663 -78).
Em pacientes com a doença do fígado alcoólica (Sorensen TI,et al., Lancet, 1984; 2: 241-4, hepatite crônica C (Fabris P., et al. J. Hepatol.2004, 41: 644-51) e talvez em hepatite B (Phillips MJ, et al. Am. J. Pathol.,1992; 140 : 1295- 308), a presença de esteatose hepática está tambémassociada com a progressão da fibrose, com ou sem lesões necroinflamatóriasassociadas (hepatite alcoólica ou viral).
Não existe recomendação padrão para o diagnóstico deesteatose hepática. A recomendação usual é a de medir GGT e ALT e deexecutar a biópsia do fígado para a classificação e a graduação em estágios(Bellentani S., et al. Ann. Intern. Med. 2000; 132 : 112- 7; Levitsky J.,Mailliard ME, Semin. Liver Dis. 2004; 24 : 233 -47; Bravo AA, et al. N.Engl. J. Med. 2001: 344; 495- 500). Como a biópsia do fígado é ainda umprocedimento invasivo e muito caro, com um potencial de erro deamostragem, seria vantajoso que houvesse um teste de execução rápida efácil, que fornecesse um bom valor de prognóstico do nível de esteatosehepática no paciente.
Para o diagnóstico da fibrose, o FibroTest (FT(não- invasivo(Biopredictive, Paris France, Número de Patente US 6. 631. 33) tem sidovalidado como um marcador substituto em hepatite C crônica (Poynard T., etal. Comp. Hepatol. 2004; 3: 8) e B (Myers RP, et al. J. Hepatol. 3003; 39:222- 30) e recentemente em doença do fígado alcoólica (Callewaert N, et al.Nature Med. 2004; 10; 1-6; Naveau S., et al. Clin. Gastroenterol. Hepatol., emprensa).
Até o momento, no entanto, nenhum estudo demonstrou queum único ou um conjunto de biomarcadores podem ser usados como umaalternativa para a biópsia do fígado, para o diagnóstico de esteatose hepáticanas causas mais comuns: álcool, hepatite viral e NAFLD.
Existe portanto uma necessidade de que seja desenvolvido ummétodo de diagnóstico, que iria fornecer um bom valor previsível quanto àextensão de esteatose hepática em um paciente, e que fosse suficientementeconfiável, de modo a reduzir a necessidade quanto à biópsia do fígado. Estemétodo seria, de modo particular, vantajoso para um paciente, que sofresse deuma doença que envolvesse esteatose hepática, ou que já tivesse um teste dediagnóstico positivo de fibrose ou de lesões necroinflamatórias do fígado, demodo a adaptar o tratamento a esta doença específica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção prove um método de diagnóstico, queavalia, de modo prospectivo, o valor previsível de uma combinação demarcadores bioquímicos do soro simples para o diagnóstico de esteatosehepática, em particular no fígado de um paciente, que sofra de uma doençaque envolve a esteatose hepática, ou que já recebeu um teste de diagnósticopositivo de fibrose do fígado e/ ou a presença de lesões necroinflamatórias.Com o alcance de valores previsíveis altamente positivos (a previsão deesteatose hepática significativa) de valores previsíveis negativos, o número deindicações de biópsias poderia ser reduzido. Isto poderia ser útil parapacientes e para a sociedade, de modo a reduzir o custo e o risco de biópsiasdo fígado.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A figura 1 é um fluxograma de pacientes analisados eincluídos em grupos de treinamento e validação.
A figura 2 é a relação entre o SteatoTest, GGT (IU/ L) e ALT(IU/L) e o grau de esteatose do fígado.
Gráficos de caixa entalhada, que mostram a relação no grupode treinamento (FIG. 2A); no grupo de validação 1, pacientes de HCV antesdo tratamento (FIG. 2B); no grupo de validação 2, pacientes de HCV curados(FIG. 2C); no grupo de validação 3, a doença do fígado alcoólica (FIG. 2D);enos controles, voluntários saudáveis em jejum e sem jejum e doadores desangue em jejum (FIG. 2E).
A linha horizontal dentro de cada caixa representa a mediana ea largura de cada caixa, a mediana na faixa interquartil ± 1,57/vn para avaliar95% de nível de significação entre as medianas do grupo. A falha das caixassombreadas para a sobreposição significa a significância estatística (P < 0,05).
As linhas horizontais, acima e abaixo de cada caixa, abrangema faixa interquartil (de 25 a 75 percentil), e as linhas verticais a partir dasextremidades da caixa abrangem os valores adjacentes (superior: 75 percentilmais 1, 5 vezes a faixa interquartil, inferior 25 percentil menos 1,5 vezes afaixa interquartil). No grupo de validação 3, todos os pacientes tinhamestenose e o grupo S0 e S1 foram combinados.
A figura 3 é uma relação entre o EsteatoTest, GGT (IU/ L) eALT (IU/ L) e o grau de esteatose do fígado nos controles de combinação de base de dados integrados e em grupos de validação.
A falha das caixas sombreadas para a sobreposição significa asignificação estatística entre as medianas (P < 0,05). Existe uma diferençasignificativa entre todos os graus através do teste de comparação múltiploTukey- Kramer para todas as diferenças emparelhadas entre os meios (P<0,05).
Para GGT e ALT não houve diferença significativa entreSem esteatose" e < 5%" e entre "5- 33%" e "33-100". Para ALT, houvetambém diferença significativa entre "Sem esteatose" e "5-33", "< 5%" e "5-33%".DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERIDAS
A presente invenção é portanto dirigida a um método para odiagnóstico de esteatose hepática em um paciente ou a partir de uma amostrade plasma ou soro de um paciente, que compreende os estágios de:
a) estudar 5 marcadores bioquímicos através da medição dosvalores de sua concentração no soro ou plasma do referido paciente, em queos marcadores são:
- aApoAl (apolipoproteína Al),alfa-2- macroglobulina,
- ALT (alanina aminotransferase),GGT (gamaglutamil transpeptidase), etriglicerídeos.
b) através do estudo de um marcador clínico, selecionado apartir do grupo constituído pelo índice de massa corpórea (Peso/ Altura 2), amedição da cintura, e a razão (medição de cintura/ medição do quadril);
c) combinar os referidos valores através de uma funçãologística, que inclui os referidos marcadores, de modo a obter um valor final,em que a referida função logística é obtida através do método que se segue:
i) classificação de uma coorte de pacientes em diferentesgrupos de acordo com a extensão de sua doença;
ii) identificação de fatores, que diferem significativamenteentre aqueles grupos através de análise unidimensional;
iii) análise de regressão logística, de modo a determinar ovalor discriminativo independente de marcadores para o diagnóstico deesteatose hepática;
iv) construção da função logística através da combinação destefatores independentes identificados; e
d) análise do referido valor final da referida função logística,de modo a determinar a presença de esteatose hepática no referido paciente.A esteatose hepática pode estar associada com vários fatores,tais que o álcool, o diabetes, o excesso de peso, hiperlipidemia, resistência àinsulina hepatite C genótipo 3, abetalipoproteinemia e algumas drogas. Demodo particular, a presente invenção é dirigida ao diagnósticos, tanto de esteatose alcoólica, como não- alcoólica.
Através da definição do melhor índice ("Grau de Esteatose")em termos de discriminação foi determinada a função de regressão logística,combinando os fatores independentes.
A função logística é obtida através da combinação do pesorelativo de cada parâmetro, tal como individualmente determinado naregressão logística, com um sinal negativo quando os marcadores apresentamuma correlação negativa com o estágio de esteatose hepática. Os logaritmossão usados para os marcadores cujos valores apresentam uma faixa muitoampla.
A qualidade da função logística é analisada com o auxílio dacurva Característica de Operação do Receptor (ROC), que é obtidadependendo do limiar desejado para o diagnóstico. O modo de obtenção dacurva ROC é descrito nos exemplos. Na presente invenção, a classificaçãodos pacientes foi efetuada de acordo com diferentes graus de esteatose hepática (nenhuma = 0%, branda = 1-5%, moderada = 6-32%, e (acentuada esevera) = 33 - 100%, em que cada percentual refere-se ao percentual dehepatócitos envolvido na esteatose), mas este poderia ser alterado se fosseintencionado o diagnóstico do paciente apenas com um grau acentuado ousevero. Isto poderia conduzir a outra curva ROC.
O diagnóstico quanto à presença ou ausência de esteatosehepática no paciente pode ser ainda refinado pelos dados que se referem àprevalência esperada de esteatose hepática na população.
A função logística pode ainda compreender outros marcadoresclínicos ou bioquímicos. Em uma modalidade preferida, a função logísticatambém compreende a idade ou o gênero do paciente. Em outra modalidade, afunção logística pode também compreender outros marcadores bioquímicos,tais que bilirubina, haptoglobina, AST (aspartato aminotransferase), glicose, e(colesterol ou HDL- colesterol). De modo preferido, a função logística irácompreendem pelo menos 1 ou 2, de modo mais preferido de 3 a 5 destesoutros marcadores bioquímicos. De modo mais preferido, a função logísticapode também compreender bilirubina total, haptoglobina, glicose e colesterol.
Os marcadores bioquímicos, que são dosados no estágio a) dométodo de acordo com a presente invenção, são marcadores bioquímicos"simples, o que significa que eles são facilmente dosados com os métodos jáconhecidos na técnica (cromatografia, eletroforese, ensaio ELISA...).
Os diferentes coeficientes usados para os valores obtidos paraos diferentes marcadores na função logística podem ser calculados através deanálise estatística, tal como descrito nos exemplos.
De modo particular, uma função logística adequada, que podeser usada para a implementação do método da invenção é a que se segue:
f = al-a2 [Idade(anos)] + a3 [ApoAl (g/l)] -a4 [índice deMassa Corpóreo (Peso/ Altura2) + a5.Log [llfa.2 -macroglobulina (g/l) -aó.Log [ALT (alanina aminotransferase) (IU/ L)]- a7. Log [bilirubina total(umol/ L) - a8. [colesterol (mmol/L)] - a9. Log [GGT (gamaglutamiltranspeptidase)(IU/L) - alO. [glicose (mmol/L) - ali. Log [haptoglobina(g/L)] - al2 [triglicerídeos (mmol/L)] + al3. [Gênero (feminino = 0,masculino =1), em que
al está compreendido no intervalo de [6.68805- x%; 6. 68805 + x%],
a2 está compreendido no intervalo de [1.5533E-02- x%; 1,55337E - 02 + x%],
a3 está compreendido no intervalo de [1,161531 -x%;1,161531 +x%],a4 está compreendido no intervalo de [0,11889 -x%; 0,11889 + x%],
a5 está compreendido no intervalo de [1,74791 -x%; 1, 74791+ x%],
a6 está compreendido no intervalo de [0, 96453 - x%; 0, 96453+ x%];
a7 está compreendido no intervalo de [0,11958 -x%; 0,11958 +x%],
a8 está compreendido no intervalo de [0,68125 - x%; 0,68125 +x%]
a9 está compreendido no intervalo de [1,17922 - x%; 1, 17922+ x%],
a1O está compreendido no intervalo de [1,46963 -x%; 1, 46963+ x%],
a11 está compreendido no intervalo de [0,34512-x%; 0, 34512+ x%],
a12 está compreendido no intervalo de [l,17926-x%; 1,17926 + x%], e
a13 está compreendido no intervalo de [0,35052-x%; 0,35052 + x%].
Um "intervalo de [a- x%; a +x %]" significa um intervalo de[(100-x) / lOO.a; (100 + x) / 100.a]. De modo preferido, x é, no máximo, 90,80 ou 70, de modo mais preferido no máximo 60, 50 ou 40, de modo aindamais preferido no máximo e 30, 20, 10 ou 5. Todos os coeficientes sãotruncados em um número de 5 decimais. Por exemplo, para x igual a 90, al3está compreendido no intervalo de [0,03505; 0, 66 598].
De fato, as definições numéricas para os coeficientes nasdiferentes funções pode variar dependendo do número e das característicasdos pacientes estudados. Portanto, o valor fornecido para os coeficientes dodiferentes marcadores têm que ser interpretados como capazes de seremligeiramente diferentes, sem que seja reduzido o escopo da invenção.
Uma função específica, que pode ser utilizada, quando x é
igual a zero, é:
f = 6, 68805 - l,55337E-02 {Idade (anos)] + 1,161531 [ApoAl
(f/ L)] - 0,11889 [índice de Massa Corpórea (Altura/ Peso2) + 1, 74791. Log[alfa.2-macroglobulina (g/L)] -0, 96453 Log [ALT (alanina aminotransferase)(IU/ L)] - 0,11958. Log [bilirubina total (umol/ L)_ 0,68125. Log [colesterol(mmol/ L) - 1, 17922. Log [GGT (gamaglutamil transpeptidase) (IU/ L)] - 1,46963. Log/ glicose (mmol/ L)] -0,34512.Log[haptoglobina (g/ L)] - 1,17926. Log [triglicerídeos (mmol/ L) + 0,35052 [Gênero (feminino =0,masculino =1)].
Dependendo do valor final obtido través da análise de valoresde marcadores com a função logística, é possível extrair conclusões sobre a presença ou ausência de esteatose hepática para o paciente. É tambémpossível concluir sobre o grau de esteatose hepática, tomando-se o referidograu como o limite no desenho da curva de ROC.
Em certas modalidades, a invenção refere-se, deste modo, aum método tal como previamente descrito, em que o valor final da funçãologística é adicionalmente usado para o diagnóstico do grau de esteatosehepática. Os diferentes graus de esteatose hepática são definidos de acordocom as características histológicas de biópsias do fígado. Um definição maisprecisa de graus de esteatose hepática é provida no Exemplo 1.
O método de acordo com a invenção pode ainda compreendeum estágio de previsão da evolução da doença, com base no grau de esteatosehepática deduzido a partir do valor final da função logística. Em particular,um grau de esteatose no corte 0,30 possui uma faixa de sensibilidade muitoalta, de 85% a 100%, de acordo com diferentes grupos (Tabela 4) e um graude esteatose no corte 0,70 possui uma faixa especificamente muito alta, de83% a 100%. Além disso, como já demonstrado para o Fibrotest (Poynard2004, Clin. Chem. 2004), muitos dos distúrbios entre o grau Esteato e abiópsia são decorrentes de erro da biópsia (tamanho de amostra pequeno). Eesperado que o método da invenção possa reduzir a necessidade de biópsia dofígado em mais do que 80%. Pela primeira vez, um clínico pode Ter umaestimativa de características histológicas principais, que conduzem à cirrose,ou que explicam anormalidades de testes de fígado : o grau de Esteatose paraa estetose, o grau de Fibrose (FibroTest, Biopredictive, Paris, France) para afibrose, o grau de Atividade (ActTeste, Biopredictive, Paris, France) para ascaracterísticas necrótico- inflamatórias da hepatite crônica C e B. A biópsiadeve ser indicada apenas em uma segunda linha, no caso de componentes quenão possam ser interpretados, tal como descrito para o grau de Fibrose(FibroTest), isto é, inflamação aguda, síndrome de Gilbert ou hemólise(Poynard, Clin. Chem, 2004).
De acordo com a invenção, o grau de esteatose hepáticareduzido a partir do valor final da função logística pode ser muito valioso paraque o médico possa selecionar um tratamento adequado para o paciente, deacordo com o estágio da doença.
Além disso, o grau de esteatose hepática pode ser usado pelomédico para decidir se deve efetuar uma biópsia de fígado no paciente, ounão.
Dependendo da prevalência da esteatose hepática na populaçãode pacientes que está em consulta, os dados obtidos com o método dainvenção podem ser usados para determinar a necessidade de que sejaefetuada uma biópsia de fígado no paciente. E esperado que o método dainvenção venha a reduzir a necessidade da biópsia de fígado em torno de80%.
O método de acordo com a intenção é destinado a ser usadopara pacientes, que sofrem de qualquer doença que envolva a esteatosehepática, que poderia ser desenvolvida para cirrose. Por uma "doença queenvolve esteatose hepática", é compreendida qualquer doença, que possaconduzir ao desenvolvimento de esteatose hepática. Em particular, o métododa invenção é efetuado, de modo vantajoso, para detectar esteatose hepática em pacientes, que sofram de uma doença incluída no grupo, que consiste dehepatite B e C, alcoolismo, hemocromatose, doença metabólica, diabetes,obesidade, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, déficit de alfa 1-antitripsina, mal de Wilson.
O método da invenção destina-se, de modo particular, a ser usado para um paciente, que já tenha sido submetido a um teste dediagnóstico de fibrose do fígado e/ ou presença de lesões necroinflamatóriasno fígado.
De modo mais preferido, o método da invenção destina-se aser usado para um paciente, que já tenha sido submetido a um teste de diagnóstico FibroTest/ Acti-Test, conforme descrito na Patente U. S. 6.631.330, que é incorporada a este a título referencial.
A invenção é também dirigida a um kit de diagnóstico deesteatose hepática em um paciente, que compreende instruções que permitemdeterminar a presença ou a ausência de esteatose hepática no referido pacientes, após a dosagem de marcadores bioquímicos.
As instruções podem compreender a função logística, que temque ser usada após a determinação da dosagem dos marcadores bioquímicos.Pode parecer como um suporte impresso, assim como um suporte que possaser utilizado por computador, tal que um software. As instruções podemtambém compreendem a curva ROC, dependendo do limiar que é buscado, demodo a permitir a análise dos dados finais, obtidos a partir da funçãologística. Elas podem também compreender diferentes tabelas, que permitemobter os valores previsíveis, dependendo da prevalência esperada de esteatosehepática na população de pacientes.O kit de diagnóstico de acordo com a presente invenção podetambém conter elementos, que permitem a dosagem dos marcadoresbiológicos de interesse.
O referido kit de diagnóstico pode também conter instruçõespara a quantificação de graus diferentes de esteatose hepática (nenhum = 0%,brando = 1-5%, moderado = 6-32%, acentuado = 33- 66% e severo = 67 -100%)), e outros graus intermediários.
O método da invenção pode ser facilmente automatizado, adosagem dos marcadores sendo executada automaticamente, os dados sendoenviados a um computador ou calculador, que irá calcular o valor da funçãologística e analisá-los com o auxílio da curva ROC, e eventualmente aprevalência da esteatose hepática na população de pacientes. Os dados obtidospelo médico são, deste modo, mais facilmente interpretáveis, e irão permitirum aperfeiçoamento no processo para a decisão da necessidade de umabiópsia ou o tratamento adequado a ser prescrito.
Os exemplos que se seguem tem a intenção de descrever umaspecto da invenção, e fornecer a metodologia, de modo a repetir o método dainvenção, mas não devem limitar a invenção.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Pacientes e Métodos
1.1 Pacientes
Pacientes consecutivos com soro disponível, uma biópsia defígado consistente e uma duração de tempo entre o soro e a biópsia inferior a3 meses foram incluídos (Figura 1). Os critérios de não- inclusão incluíramsoro não- disponível, e biópsias e pacientes não disponíveis, devido ao fato deque a biópsia e o soro foram coletados com mais do que 3 meses de diferença.A análise foi executada em um primeiro grupo (grupo de treinamento) evalidade em 3 grupos diferentes (grupos de validação).Os pacientes do grupo de treinamento foram respectivamenteincluídos para esta análise específica, mas foram analisados em estudos devalidação prospectivos prévios de Fibrotest entre setembro de 2000 e agostode 2004 (Poynard T. et al., Comp. Hepatol., 2004, 3: 8; Myers RP, et al., J.Hepatol., 2003, 39: 222- 30; Ratzin V. et al., Hepatology 2003, 38: 510A).Todos eram pacientes internos, hospitalizados no Departamento de Hepato-Gastroenterology of Groupe Hospitalier Pitié- Salêtrière para NAFLD,hepatite C, B, e doença do fígado alcoólica.
Pacientes do grupo de validação 1 (pacientes de hepatite C)foram analisados, de modo retrospectivo, a partir de um estudo de esteatosehepática com hepatite C crônica (Poynard T. et al., Hepatology, 2003, 38: 75-85). Para este propósito, pacientes previamente não tratados de um ensaioaleatório de multicentro prospectivo de PEG-IFN e Ribavirina foramincluídos. Os biomarcadores e os resultados da biópsia em linha de referência foram usados.
Pacientes do grupo de validação 2 (pacientes anteriores comHCV não- detectável) eram pacientes do mesmo ensaio aleatório que nogrupo de validação 1 (Poynard T., et al., Hepatology, 2003, 38: 75- 85),queforam "curados" com resposta virológica sustentada, significando que o RNAde HCV não é detectável 24 semanas após o final do tratamento. Osbiomarcadores e os resultados da biópsia efetuada 24 semanas após o final dotratamento foram usados. Este grupo foi considerado como um grupo devalidação de NAFLD, porque a esteatose viral possível havia sido curada pelotratamento (Poynard T., et al. Hepatology, 2003, 38:75 - 85).
Pacientes do grupo de validação 3 (pacientes de doença dofígado alcoólica) foram retrospectivamente incluídos para esta análiseespecífica, mas foram incluídos, de modo prospectivo, entre 1998 e 2000, emuma coorte de pacientes alcoólicos, para os quais um ponto terminal primáriofoi a identificação de marcadores bioquímicos. Os detalhes desta coorte foramrecentemente publicados em um estudo de validação de FibroTest (Naveau S.,et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol, 2005, em prensa). Todos eram pacienteshospitalizados no Hepato-Gastroenterology Department of Hôpital AntoineBéelère devido a composições de doença do fígado alcoólica.
As características dos pacientes dos diferentes grupos estãorelacionadas na Tabela 1.
<table>table see original document page 15</column></row><table>Bilirubina total (1-2)
GGT IU/ L (7-32 fêmeas; 11-49machos)
2 Macroglobulina g/ L (fêmeas 16 -40,machos 14- 33)
Apo Al g/L(12-17)
Haptoglobina g/ L (0,35 -2,00)
Glicose (mmol/ L)
Colesterol (mmol/ L)
Triglicerídeos (mmol/ L)
FibroTeste
EsteatoTeste
14,8 (26,2) 11,1 (4,8) 8,8 (4,6) 21,5(19,6)
112(183) 84 (96) 21(18) 323 (443)
2,4 (1,0) 3,1 (1,2) 2,0 (0,8) 1,8 (0,5)
1.4 (0,3) 0,95 (0,57) 5.5 (3,2) 4,9(1,3) 1,5(1,4) 0,42 (0,28) 0,49 (0,25) 1.3 (0,3) 0,78 (0,45) 5.4 (1,2) 4.5 (1,0) 1,4 (0,8) 0,47 (0,26) 0,53 (0,22) 1.2 (0,3) 0,86 (0,43) 5.3 (1,0) 5,0 (1,0) 1,6(1,0) 0,29 (0,20) 0,36 (0,22) 1,5 (0,5) 1,39 (0,63) 5,8(1,6) 5,4(1,9) 1,9 (3,1) 0,43 (0,28) 0,58 (0,25)
Os dados estão em média (SD) ou proporção. AST = aspartato aminotransferase. ALT = alaninaaminotransferase. GGT = glutamil transpeptidase. ApoAl = apolipoproteína al.
Tabela 1: Características de pacientes inclusos
Um grupo de controle foi também analisado. Ele foiconstituído por voluntários aparentemente saudáveis em jejum e sem jejumpreviamente incluídos em uma validação de FibroTest (Muntcanu M. et al.Comp. Hepatol. 2004; 3,3 e doadores de sangue sem jejum adicionais.1.2. Marcadores de Soro
Os 10 marcadores bioquímicos que se seguem foram avaliadospara os diferentes grupos : ApoAj, ALT (alanina aminotransferase), AST(aspartato aminotransferase), alfa-2-macroglobulina, GGT (gama glutamiltranspeptidase), bilirubina total, colesteral, glicose, e triglicerídeos.
Os 10 marcadores bioquímicos incluem 6 componentes doFibro Teste - Acti Test ajustados pela idade e seco (algoritmo de inteligênciaartificial patenteado USPTO, 6 631. 330), além de AST, colesterol, glicose, emarcadores de triglicerídeo e BMI.
FibroTest (Biopredictive, Paris, France; FibroSURE LabCorp,Burlington, NC, USA) foi determinado como previamente publicado(Poynard T., et al. Comp. Hepatol. 2004, 3: 8; Myers RP et al. J. Hepatol.2003, 39: 222- 30; Callewaert N., et al. Nture Med. 2004; 10, 1-6; Naveau S.,et al. Clin. Gastroenterol. Hepatol, em prensa; Imbert- Bismut F., et al., Clin.
Chem. Lab. Med. 2004; 42: 323-33; Munteanu M. et al. Comp. Hepatol.2004: 3,3).
Os procedimentos pré- analíticos e analíticos recomendadospublicados foram usados (Poynard T., et al. Comp. Hepatol. 2004, 3: 8; MyersRP, et al. J. Hepatol. 2003; 39: 222- 30; Callewaert N., et al. Nature Med.2004; 10; 1-6; Naveau S., et al. Clin. Gastroenterol. Hepatol. em prensa;Imbert- Bismut F. et al. Clin. Chem. Lab. Med. 2004; 42: 323-33; MunteanuM., et al. Comp. Hepatol. 2004; 3: 3).
Nos grupos de controle e treinamento GGT, ALT, glicose dosoro, triglicerídeos, colesterol e bilirubina total foram medidos pelo analisadorHitachi 917 ou analisadores Modular DP (ambos da Roche), DiagnosticsMannheim, Alemanha) usando os reagentes do fabricante. Alfa 2-macroglobulina, apolipoproteína Al e haptoglobina foram medidos usandoum nefelômetro automático BNII (Dade Behring; Marburg, Alemanha).
Nos grupos de validação 1 e 2, GGT, Alt, glicose do soro,triglicerídeos, colesterol e bilirubina totais foram medidos usando Hitachi 747ou 911 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) usando os reagentes dofabricante. Apolipoproteína Al, alfa2- macroglobilina, e haptoglobina foramdeterminados em amostras de soro usando um nefelômetro automático BNII(Dade Behring, Marburg, Alemanha.
Todos os coeficientes dos ensaios de variação foram inferioresa 10%.
1.2. Graduação histológica
A graduação histológica foi executada com base em biópsiasde fígado. Regras comuns foram aplicadas em diferentes grupos e um únicopatologista por grupo, sem conhecimento das características do paciente,analisou as características histológicas. Amostras de biópsia do fígado foramprocessadas usando técnicas convencionais.
A esteatose hepática foi classificada em de 0 a 4 com quatrograus de sistema de graduação: 0 = sem estenose, de 1 a 5% = suave, de 6 a32 % = moderada, de 33 A 66%= acentuada, de 67 - 100% = severa, todos ospercentuais se referindo ao percentual de hepatócitos envolvido na esteatose(Poynard T. et al. Hepatology, 2003; 38: 75 - 85). O critério histológicoprincipal foi a presença do grau de esteatose 2- 4 (entre 6 a 100%).
Exemplo 2
Análise Estatística
A análise estatística usou o teste exato de Fisher, o teste dequi-quadrado, o teste de Student, o teste de Mann-Whitney e a análise devariância usando os testes de comparação múltipla de Tukey- kramer e depares de Bonferroni para levar em consideração as comparações múltiplas e aregressão logística para a análise multivariada (Hintze JL. NCSS 2033 UserGuide, Number Cruncher Statistical Systems 2003, software NCSS,Kaysville, utah). A análise foi efetuada em um primeiro grupo (grupo detreinamento) e validade em 3 grupos diferentes (grupos de validação 1, 2 e 3),em coortes de pacientes, tal como na Tabela 1.
De acordo com o sistema de graduação de esteatose hepática,os pacientes foram divididos em vários grupos.
O resultado primário foi a identificação de pacientes com graude esteatose hepática de 2, 3 ou 4 (moderado, acentuado ou severo).
Em uma análise secundária, os pacientes foram classificadosde acordo um com um sistema de graduação de escala 4.
O primeiro estágio consistiu de fatores de identificação, quediferiram, de modo significativo, entre aquelas grupos através de análiseunidimensional usando o teste de qui -quadrado, o teste de Student ou o testede Mann- Whitney.
O segundo estágio consistiu de análise de regressão logística,de modo a determinar o valor discriminativo independente de marcadorespara o diagnóstico de fibrose.
O terceiro estágio foi o de construir um índice, que combinaestes fatores independentes identificados. Através da definição do melhoríndice ("grau de esteatose") em termos de discriminação foi a função deregressão logística que combina os fatores independentes. Em todos osexemplos que se seguem, o grau de esteatose é adicionalmente referido comoao "Grau de Teste Esteato". O grau de Teste Esteato está na faixa de zero a1,00, graus mais altos indicando ma maior probabilidade de lesõessignificativas.
Os valores de diagnóstico dos marcadores foram avaliadosusando sensibilidades, especificidades, valores previsíveis positivos (PPV) enegativos NPV), e as áreas sob as curvas de Característica de Operação doReceptor (ROC) (Hintze JL NCSS, 2003, User Guide. Number Cruncher Statistical Systems, 2003, Software NCSS, Kaysville, Utah).
Os valores de diagnóstico total respectivos foram comparadospela área sob as curvas ROC. A curva ROC é traçada pela representaçãográfica da sensibilidade contra (1- especificidade), após a classificação dospacientes, de acordo com o valor obtido para a função logística, paradiferentes limiares (de 0 a 1). É usualmente reconhecido que uma curva ROC,que possua uma área sob a mesma com um valor superior a 0,7 seja uma boacurva de previsão para o diagnóstico. A curva ROC tem que ser reconhecidacomo uma curva, que permite predizer a qualidade de um método dediagnóstico.
As áreas sob as curvas ROC foram calculadas usando ummétodo não- paramétrico empírico. Uma análise de sensibilidade foi tambémexecutada, de modo a determinar a acurácia dos marcadores para osresultados primários, de acordo com o tamanho da amostra de biópsia. Paratodas as análises, testes estatísticos de dois lados foram usados; um valor P de0,05 ou menos foi considerado significativo. O software Number CruncherStatistical Systems (NCSS, Kaysville, Utah) foi usado para todas as análises(Hintze JL, NCSS 2003, User Guide, Number Cruncher Statistical Systems2003, Software NCSS, Kaysville, Utah).
Estas análises estatísticas foram executadas separadamentepara os diferentes grupos, tal como previamente definido.
Exemplo 3
Determinação da Função Logística
O "grau do SteatoTest" é definido como a função de regressãologística, que combina fatores independentes, que retorna o melhor índice emtermos de discriminação entre a presença ou ausência de esteatose hepática.
A Tabela 2, são fornecidas características de pacientes deacordo com a presença de esteatose hepática para cada um dos 10 marcadoresbioquímicos, a graduação do FibroTest e a graduação do SteatoTest, assimcomo a sua associação independente com fibrose (valor P).
No grupo de treinamento, os componentes mais significativos,associados com a presença de esteatose de grau 2-4 em análise de variávelúnica foram BMI, idade, ALT, AST, GGT, glicose, e triglicerídeos.
Na análise de regressão logística, os componentes maissignificativos foram BMI (OR= 0,89, P= 0,0002), GGT (OR= 0,31, P =0,002), apolipoproteína Al (OR = 3,20, P = 0,01), alfa 2-macroglobulina (OR= 5, 74, P = 0,02, ALT (OR = 0, 38, P=0,03) e triglicerídeos (OR = 0,31, P =0,04.
No grupo de validação foram observadas diferenças similares,de modo mais significativo para BMI, GGT, ALT e triglicerídeos (Tabela 2).<table>table see original document page 21</column></row><table>A melhor função logística (graduação de Steato Test)combinando 9 marcadores e idade, gênero e BMI foi determinada no grupo detreinamento para que seja como se segue:
f= 6,68805 - 1, 55337E-02 [Idade (anos)] + 1,161531 [ApoAl (g/ L)] - 0,11889 [índice de Massa Corpórea (peso/ Altura2)] + 1, 7479].Log.alfa. 2-macroglobulina (g/ L)] - 0,96453. Log ALT (alaninaaminotransferase) (RJ/ L)] - 0,11958. Log[bilirubina total (ummol/ L)] -0,68125. Log [colesterol (mmol/ L)] - 1,17922. Log [GGT (gamaglutamiltranspeptidase) (IU/ L)] - 1, 46963. Log [glicose (mmol/ L) - 0,34512. Log[Haptoglobina (g/ L)] - 1,17926. Log[triglicerídeos (mmol/ L)] +0,35052[gênero feminino = 0, masculino = 1)].
Esta função foi obtida no grupo de treinamento através dacombinação do peso relativo de cada parâmetro, tal como individualmentedeterminado na regressão logística, com um sinal negativo quando osmarcadores apresentam uma correlação negativa com o estágio de esteatosehepática. Os logaritmos foram usados para marcadores, cujos valoresapresentam uma faixa muito ampla.
O valor da graduação do SteatoTest, que combina 9marcadores (alfa 2- macroglobulina, ALT, apo Al, haptoglobina, GGT, e bilirubina total), ajustado por idade, gênero e BMI, possuía uma altacorrelação com a presença ou ausência de esteatose hepática, quando dotreinamento da amostra, assim como em amostras de validação (Tabela 2).
Um das principais descobertas do presente trabalho é oaperfeiçoamento muito significativo no valor de diagnóstico de esteatosequando da combinação de marcadores, contra o teste de rotina clássico,previamente recomendado, tal que GGT e ALT. Os marcadores simples deresistência a insulina, tais que BMI, glicose, e triglicerídeos aumentaram ovalor de diagnóstico de ALT e GGT. Isto não havia sido previamentedemonstrado nas diferentes causas de esteatose do fígado. Além disso, foidemonstrado pela primeira vez que o valor de diagnóstico de ALT foi muitomaior do que o de GGT para o diagnóstico de esteatose. De modointeressante, além disso, o valor de GGT não aumentou de acordo com aseveridade de esteatose, em comparação com ALT.
Exemplo 4
Análise dos Dados
4.1. Confiabilidade da graduação do SteatoTest para o diagnóstico deesteatose hepática
Valores de diagnóstico (áreas sob as curas ROC) da graduaçãodo SteatoTest para os diferentes grupos de pacientes são expostos na Tabela3. A sensibilidade, a especificidade e os valores previsíveis positivos enegativos da graduação do SteatoTest com um corte de 0,30, 0, 50 e 0,70 sãoexibidos na Tabela 4.
<table>table see original document page 23</column></row><table>
Tabela 3: Valores [Área sob as curvas ROC (AUROCs) de graduação deesteatose, GGT e ALT para o diagnóstico de esteatose, em grupos detreinamento e validação.<table>table see original document page 24</column></row><table>
Tabela 4: Valor de diagnóstico de graduação de Esteatose para aprevisão de esteatose hepática superior a 5%
Todos os estudos mostram que a graduação do SteatoTest podem alcançar valores de diagnóstico muito altos (área sob a curva ROC,vide Tabela 3), e alta especificidade, sensibilidade e valores previsíveispositivos ou negativos para o diagnóstico de esteatose hepática (vide Tabela 4).
O valor de diagnóstico (área sob a curva ROC) da graduaçãodo SteatoTest foi altamente reprodutível entre o grupo de treinamento e osgrupos de validação 1, 2 e 3 (Tabela 3). A sensibilidade foi também bastantereprodutível entre o grupo de treinamento e os grupos de validação 1, 2 e 3(Tabela 4). Em adição, as sensibilidades e especificidades da graduação doSteatoTest, observadas nas diferentes populações estudadas, iráprovavelmente aumentar em uma população mais geral, devido à excelenteespecificidade observada em voluntários e doadores de sangue (Figura 2 E), edevido ao fato de que os presentes estudos incluíram um número limitado depacientes fatores de risco metabólico diversos, tais que a obesidade mórbida.
Para alguns pacientes, os diagnósticos da presença de esteatosehepática pela biópsia e pela graduação do SteatoTest foram discordantes. Acausa da discordância entre a presença de > 5% de esteatose hepática previstapelos marcadores químicos e pela biópsia foi atribuída, de acordo com osrespectivos fatores de risco ou falhas, tal como previamente detalhado(Poynard T, et al., Clin. Chem. 2004; 50; 1344-55). A discordânciasignificativa foi definida como a discordância na previsão de > 5% deesteatose hepática (graus 2- 4) e uma diferença de 30% ou maior em p > 5%no percentual de esteatose heptática, tal como previsto pela graduação doSteatoTest, ou como observado na amostra da biópsia. Os fatores de risco dafalha de graduação do SteatoTest foram hemólise, mal de Gilbert, inflamaçãoaguda e colestase hepática extra. Os fatores de risco de falha da biópsia foramo tamanho da biópsia (menos do que 25 mm) e a fragmentação (mais do queum fragmento). A falha atribuível à biópsia (falha negativa) foi suspeitadaquando a biópsia foi inferior a 15 mm e fragmentada, além da presença depelo menos um fator de risco metabólico.
No grupo de treinamento haviam 56 casos (18%) dediscordância significativa entre o percentual de esteatose como previsto porST e aquele observado nas amostras de biópsia. A falha atribuível ao ST(falha positiva de ST) foi suspeita em um caso, que apresentou hepatite dedroga aguda associada com hepatite crônica B. A falha atribuível à biópsia(negativos falsos da biópsia) foi suspeitada em 16 casos, com amostras debiópsia de qualidade deficiente (comprimento mediano 13 mm, 2 fragmentos)e pelo menos um fator de risco metabólico.
Para os grupos de validação, discordância significativa foiobservada em 17 casos (16%) no grupo 1, 20 casos (10%) no grupo 2 e 13casos (21%) no grupo 3. A discordância significativa foi observada com maisfreqüência em pacientes com fibrose extensiva (estágio F3 ou F4). 38 casosde 135 (28%) contra 91 casos de 609 (15 P= 0,001).
Comparado com o diagnóstico invasivo e de biópsia de altocusto, é muito importante notar que o método da invenção não conduz a umgrande número de tratamentos indevidos de pacientes ou à exclusão depacientes, que estejam em necessidade de um tratamento. Os dadosapresentados neste pedido reforçam a confiabilidade do método dediagnóstico de acordo com a presente invenção.
4.2. Comparação do SteatoTest com outros testes de diagnóstico nãoinvasivos (FibroTest, GGT 50 IU e ALT 50 IU/L)
Os resultados obtidos com a graduação do Steato Test (usando9 parâmetros bioquímicos ajustados por idade, gênero e BMI) foramcomparados àqueles obtidos com o uso de marcadores isolados, tais que GGTe ALT, que são usualmente considerados como sendo marcadores úteis, demodo a indicar a presença ou a ausência de esteatose hepática. O mesmopadrão de valor de corte é usado para GGT e ALT: 50 IU/L. Abaixo doreferido valor de corte, o diagnóstico de esteatose hepática é consideradocomo sendo negativo, acima, é considerado como sendo positivo.
As características dos pacientes de acordo com a presença deesteatose hepática quando a marcadores bioquímicos individuais, o FibroTest,e a graduação do SteatoTest são exibidos na Tabela 2.
Comparada com a do FibroTest, a graduação do SteatoTestpossibilita uma discriminação muito melhor entre a presença ou a ausência deesteatose hepática em todos os grupos analisados, em particular para o grupode treinamento e o grupo de validação 2 (Tabela 2).
Valores de diagnóstico (áreas sob as curvas ROC) degraduação do SteatoTest, GGT 50 IU/L e ALT 50 IU/L para o diagnóstico doponto terminal principal (ou seja, esteatose hepática de grau 2-4), são exibidosna Tabela 3. A graduação do SteatoTest possui áreas mais altas sob as curvasROC do que GGT 50 IU/ L em todos os grupos analisados, e do que ALT 50IU/ L no grupo de treinamento e no grupo de validação 1 (Tabela 3).
A sensibilidade, a especificidade e os valores previsíveispositivos e negativos da graduação do SteatoTest com um corte de 0,30, 0,50ou 0,70 e de GGT 50 IU/L e ALT 50 IU/L são exibidas na Tabela 4. Para odiagnóstico de esteatose de grau 2-4, uma graduação de SteatoTest com umcorte de 0,50 alcançou uma boa sensibilidade (0, 69, 0,89, 0,68 e 0,62) e umaboa especificidade (0,74, 0,58, 0, 79, 1,00) de acordo com os grupos detreinamento e validação, respectivamente. Além disso, uma tal graduação deSteatoTest com um corte de 0,50 exibe valores positivos e negativos maisaltos do que GGT 50 IU/L e A1T 50 IU/L em todos os grupos analisados,exceto quanto ao valor previsível negativo de ALT 50IU/L no grupo devalidação 1.
Em adição, com referência à discriminação entre diferentesgraus de esteatose hepática, isto é melhor alcançado através da graduação doSteatoTest, comparado a GGT 50 IU/ L e ALT 50IU/L em todos os gruposanalisados (Figura 2).
A discriminação entre diferentes graus de esteatose hepáticafoi também analisada em uma base integrada, constituída de todos ospacientes incluídos no grupo de treinamento, nos três grupos de validação eno grupo de controle (884 pacientes).
Houve uma correlação geral muito significativa entre agraduação do SteatoTest e os graus de esteatose a partir dos controles para"33-100%" (graus 3-4, vide Figura 3). Para a graduação do SteatoTest, houveuma diferença significativa entre todos os graus através do teste decomparação múltipla Tukey -Kramer para todas as diferenças emparelhadasentre médias (P < 0,05). Em contraste, para GGT e ALT, não houve diferençasignificativa entre "Sem esteatose" (grau 0) e "< 5%" (grau 1). Para ALT, nãohouve até mesmo diferença significativa entre "Sem estenose" (grau 0) e de"6-32%" (grau 2), "< 5%" (grau 1) e "6-32%" (grau 2), e de "6-32" (grau 2) ede "33-66" (grau 3).
Em conclusão, a presente invenção apresenta uma combinaçãode pelo menos 5, de modo preferido 9, marcadores bioquímicos, ajustados poridade, gênero e BMI, a serem usados para a detecção da presença ou ausênciade esteatose hepática. Os marcadores usados na presente invenção nuncaforam combinados de um tal modo, em particular com a idade, gênero, e BMIdos pacientes, de modo a fornecer um tal bom valor de previsão, tal comoilustrado pela área sob a curva ROC.
O método de diagnóstico da invenção pode ser analisado demodo automático, após uma mediação automática dos valores dosmarcadores, e pode, de modo vantajoso, ser aplicado para pacientes com umaesteatose hepática, que envolva doença, de modo a reduzir a indicação debiópsia do fígado.
Claims (14)
1. Método para o diagnóstico in vitro de esteatose hepática oude um soro ou amostra de soro de um paciente, caracterizado pelo fato decompreender os estágios dea) estudar 5 marcadores bioquímicos através da medição dosvalores de sua concentração no soro ou plasma do referido paciente, em queos referidos marcadores são:- ApoAl (apolipoproteína Al),- alfa.2-macroglobulina,- ALT (alanina aminotransferase),- GGT (gamaglutamil transpeptidase), e- triglicerídeos;b) estudar um marcador clínico, selecionado a partir do grupoconstituído pelo índice de massa corpórea (Peso/ altura2), mediação dacintura, e a razão de (Medição da cintura/medição do quadril);c) combinar os referidos valores através de uma funçãologística, que inclui os referidos marcadores, de modo a obter um valor final,em que a referida função logística é obtida através do método que se segue:i) classificação de um coorte de pacientes em diferentes gruposde acordo com a extensão de sua doença;ii) identificação de fatores, que diferem significativamenteentre estes grupos através de análise unidimensional;iii) análise de regressão logística, de modo a determinar ovalor discriminativo independente dos marcadores para o diagnóstico deesteatose hepática;iv) construção da função logística através da combinaçãodestes fatores independentes identificados.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a referida função logística leva ainda em consideração a idade e ogênero do paciente.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que a referida função logística compreende ainda pelo menos ummarcador bioquímico, selecionado a partir do gruo constituído por bilirubinatotal, haptoglobina, AST (aspartato aminotransferase), glicose, e (colesterolou HDL- colesterol).
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelofato de que a referida função logística compreende bilirubina total,haptoglobina, glicose, e colesterol.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que a referida função logística é:f = a1-a2 [Idade(anos)] + a3 [ApoAl (g/l)] -a4 [índice deMassa Corpóreo (Peso/ Altura2) + a5.Log [alfa.2 -macroglobulina (g/l) -aó.Log [ALT (alanina aminotransferase) (IU/ L)]- a7. Log [bilirubina total(|imol/ L) - a8. [colesterol (mmol/L)] - a9. Log [GGT (gamaglutamiltranspeptidase)(IU/L) - alO. [glicose (mmol/L) - a11. Log [haptoglobina(g/L)] - a12 [triglicerídeos (mmol/L)] + a13. [Gênero (feminino = 0,masculino =1), em quea1 está compreendido no intervalo de [6,68805- 90%; 6,68805 + 90%],a2 está compreendido no intervalo de [l,5533E-02- 90%; l,55337E-02 + 90%],a3 está compreendido no intervalo de [1,161531 -90%; 1,161531 +90%],a4 está compreendido no intervalo de [0,11889 -90%; 0,11889 + 90%],a5 está compreendido no intervalo de [1,74791 -90%; 1, 74791 + 90%],a6 está compreendido no intervalo de [0, 96453 - 90%; 0,-96453 + 90%];-a7 está compreendido no intervalo de [0,11958 -90%; 0,11958 + 90%],-a8 está compreendido no intervalo de [0,68125 - 90%; 0,68125 + 90%]-a9 está compreendido no intervalo de [1,17922 - 90%; 1,17922 + 90%],-alO está compreendido no intervalo de [1,46963 -90%; 1,46963 + 90%],-ali está compreendido no intervalo de [0,34512-90%; 0,34512 + 90%],-al2 está compreendido no intervalo de [1,17926-90%; 1,17926 + 90%], e-al3 está compreendido no intervalo de [0,35052-90%; 0,35052 +90%].
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que a referida função logística é :f= 6,68805 - l,55337E-02 {Idade (anos)] + 1,161531 [ApoAl(f/ L)] - 0,11889 [índice de Massa Corpórea (Altura/ Peso2) + 1, 74791. Log[alfa.2-macroglobulina (g/L)] -0, 96453 Log [ALT (alanina aminotransferase)(IU/ L)] - 0,11958. Log [bilirubina total (|imol/ L)-0,68125. Log [colesterol(mrnol/ L) - 1, 17922. Log [GGT (gamaglutamil transpeptidase) (IU/ L)] - 1,-46963. Log/ glicose (mmol/ L)] -0,34512.Log[haptoglobina (g/ L)] - 1,-17926. Log [triglicerídeos (mmol/ L) + 0,35052 [Gênero (feminino =0, masculino =1)].
7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido paciente sofre de uma doença que envolve esteatose.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que a referida doença está incluída no grupo, que consiste de hepatiteB e C, alcoolismo, hemocromatose, doença metabólica, diabetes, obesidade,doença do fígado autoimune, cirrose biliar primária, déficit de alfa.l-antitripsina e mal de Wilson.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o referido paciente já foi submetido a um este de diagnóstico defibrose do fígado e /ou presença de lesões necroinflamatórias no fígado.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que o referido teste de diagnóstico foi o FibroTest / Acti-Test.
11. Kit para o diagnóstico de esteatose hepática em umpaciente, caracterizado pelo fato de que compreende:a) instruções para determinar a presença de esteatose hepáticano referido paciente;b) reagentes para a medição dos valores de soro dasconcentrações de 5 marcadores bioquímicos, em que os referidos marcadoressão:- ApoAl (apolipoproteína Al),- alfa.2-macroglobulina,- ALT (alanina aminotransferase),- GGT (gamaglutamil transpeptidase), e- triglicerídeos.c) opcionalmente, pelo menos um reagente para a medição dosvalores de soros das concentrações de bilirubina total haptoglobina, AST(aspartato aminotransferase), glicose, ou (colesterol ou HDL- colesterol)d) instruções para o uso de uma função logística, que é usadapara combinar os referidos valores com um marcador clínico, selecionado apartir do grupo constituído pelo índice de massa corpórea (Peso/ Altura2),medição da cintura, e a razão de (medição da cintura/ medição do quadril, demodo a obter um valor final.
12. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de compreender ainda uma curva ROC.
13. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de compreender ainda tabelas, que mostram como obter os valores deprevisão, dependendo da prevalência esperada de esteatose hepática napopulação de pacientes.
14. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelofato de compreender ainda instruções para a quantificação de diferentes grausde esteatose hepática (nenhuma = 0%, branda = 1-5%, moderada = 6-32%,acentuada = 33- 66%, e severa = 67- 100%, e outros graus intermediários.
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